KR101973007B1 - 외래 단백질 발현 증가를 위한 재조합 전이 벡터 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 외래 단백질을 순수한 형태로 발현 증가시키기 위한 새로운 재조합 전이 벡터 및 이를 이용한 외래 목적 단백질의 대량 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 재조합 전이 벡터는 치료 및 예방적 가치가 높은 외래 목적 단백질이 곤충 세포에서 대량으로 발현되도록 유도할 수 있으며, 특히 타 단백질과 융합된 형태가 아니라 고유한 형태의 외래 목적 단백질 발현을 증대시킬 수 있는 장점이 있다. 따라서 본 발명에 따른 재조합 전이 벡터를 이용하는 경우 곤충세포에서 항원 등의 유용 단백질 생산을 저비용, 고효율로 할 수 있다.
Description
본 발명은 외래 단백질을 순수한 형태로 발현 증가시키기 위한 새로운 재조합 전이 벡터 및 이를 이용한 외래 목적 단백질의 대량 생산 방법에 관한 것이다.
배큘로바이러스 발현 벡터 시스템(Baculovirus Expression Vector System; BEVS)은 핵다각체병 바이러스(Nucleopolyhedrovirus; NPV) 유전자의 강력한 프로모터(promoter)를 이용하는 발현 벡터 시스템으로 발현 효율이 매우 높을 뿐만 아니라, 고등 진핵세포인 곤충세포를 이용함으로써 발현된 외래 단백질의 생물학적 및 면역학적 활성이 뛰어나기 때문에, 대장균(E. coli), 효모(Yeast), 포유동물세포(Mammal cell) 등을 이용하는 다른 발현벡터 시스템에 비해 여러 가지 면에서 장점을 가지고 있어 크게 주목받고 있다.
곤충세포에서 외래 단백질을 발현시키는 경우, 대장균에서의 발현 시스템과 유사한 정도로 단백질을 대량 생산할 수 있고, 당부가(glycosylation)와 같은 번역 후 수정(posttranslational modification)이 효과적으로 이루어져 대장균과 효모를 숙주세포로 이용한 경우와는 달리 천연형 단백질과 유사한 정도의 생물학적 활성을 갖는 외래 단백질을 대량으로 얻을 수 있어 산업적으로 매우 유용하다.
한편 포유동물세포를 사용하는 재조합 단백질 생산 방법은 치료적 가치가 높은 단백질을 다른 시스템에 비해 비교적 많이 얻을 수 있지만, 포유동물세포의 배양 및 유지에는 포유동물 유래의 각종 호르몬과 생장조절물질이 다량으로 필요하므로 상당한 비용이 요구된다는 문제점이 있다. 그러나 곤충 세포를 이용하는 경우 포유 동물세포와 유사한 번역 후 수식이 이루어짐에도 저비용으로 재조합 단백질을 생산할 수 있어 더욱 경제적인 방법으로 알려져 있다.
현재는 곤충 세포를 이용한 재조합 단백질의 생산에 오토그라파켈리포니카 핵다각체병 바이러스(Autographa californica NPV; AcNPV)와 누에 핵다각체병 바이러스(Bombyx mori NPV; BmNPV)를 이용하는 두 가지 발현벡터 시스템이 널리 이용되고 있다. 그러나 다각체 단백질 유전자(polyhedrin gene)의 프로모터만을 이용하여 곤충세포에서 외래 단백질을 발현할 경우, 목적 단백질의 양이 현저히 낮은 경우가 있어, 기술적 한계점으로 지적되고 있다. 이와 같은 낮은 수준의 발현은 주로 외부 유전자의 시그날 서열이 숙주세포에 의해서 비효율적으로 인식되거나, 바이러스의 감염에 따른 숙주 세포의 단백질 프로세싱(processing) 능력의 감소에 기인하는 것으로 여겨지고 있다. 이외에도 다각체 단백질 코딩 유전자의 강력한 프로모터를 이용하여 외래 단백질을 발현시키지만 원래 다각체 단백질의 발현량 수준과 비교할 때 외래 단백질의 발현량이 그에 미치지 못하는 한계점도 보고된 바 있다.
한편, 한국특허문헌 KR 10-1563583 호는 다각체 단백질 코딩 유전자의 강력한 프로모터를 이용한 외래 단백질 발현 증대 기술을 개시하면서, 외래 목적 단백질을 효과적으로 대량 생산할 수 있는 방법이 개시되어 있다. 그러나 한국특허문헌 KR 10-1563583 호의 기술은 다각체 단백질을 다양한 부분으로 조각내어 외래 단백질과 융합시킴으로써 발현량을 증대시키는 기술에 관한 것으로, 외래 단백질이 반드시 부분 다각체 단백질과 융합 상태로 발현된다. 이와 같이 외래 단백질이 발현되는 경우, 외래 단백질 사용을 위해 반드시 융합된 부분 다각체 영역의 절단이라는 추가적 절단 및 정제공정이 필요하다. 이와 같은 공정에서 외래 목적단백질이 함께 절단되거나 그 활성을 잃게 되는 단점이 있으며, 여전히 외래 목적 단백질을 손쉽게 대량 생산하기 위한 새로운 기술에 대한 필요성이 있다.
이에 본 발명자들은 배큘로바이러스의 다각체 단백질 코딩 유전자의 프로모터와 추가적인 발현 증대 인자의 조합을 통한 외래 목적 단백질 생산 증대 방법을 연구하던 중, 상동지역 5(homologous region 5: hr5) 서열, Burst 서열 및 vp39 프로모터의 조합을 이용하는 경우, 외래 단백질의 발현량이 효과적으로 증대될 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 배큘로바이러스의 다각체 단백질 코딩 유전자의 프로모터, 상기 프로모터와 작동가능하게 연결된 서열번호 2로 표시되는 Burst 서열, 서열번호 1로 표시되는 hr5 (homologous region 5) 서열 및 서열번호 3으로 표시되는 vp39 프로모터의 조합을 포함하는 재조합 전이 벡터 및 이를 이용한 외래 목적 단백질의 대량 생산 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 a) 배큘로바이러스의 다각체 단백질 코딩 유전자의 프로모터; 및 b) 상기 프로모터와 작동가능하게 연결된 서열번호 2로 표시되는 Burst 서열; 을 포함하는 재조합 전이 벡터를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 벡터에 c) 서열번호 1로 표시되는 hr5 (homologous region 5) 서열 및 서열번호 3으로 표시되는 vp39 프로모터로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 전이 벡터를 제공한다.
또한 본 발명은 a) 서열번호 3으로 표시되는 vp39 프로모터; 및 b) 배큘로바이러스의 다각체 단백질 코딩 유전자의 프로모터;를 포함하는 재조합 전이 벡터를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 벡터에 c) 서열번호 1로 표시되는 hr5 (homologous region 5) 서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 전이 벡터를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 재조합 전이 벡터가 도입된 곤충 세포를 제공한다.
또한 본 발명은 a) 상기 재조합 전이 벡터에 외래 목적 단백질 코딩 뉴클레오타이드 서열을 클로닝하는 단계; 및 b) 상기 클로닝된 재조합 전이 벡터 및 백미드(bacmid) 를 곤충 세포에 도입시키는 단계; 를 포함하는, 외래 목적 단백질의 대량 생산 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 재조합 전이 벡터는 치료적 가치가 높은 외래 목적 단백질이 곤충발현계에서 대량으로 발현되도록 유도할 수 있으며, 특히 타 단백질과 융합된 형태가 아니라 고유한 형태의 외래 목적 단백질 발현을 증대시킬 수 있는 장점이 있다. 따라서 본 발명에 따른 재조합 전이 벡터를 이용하는 경우 곤충 및 곤충 세포에서 항원 등의 유용 단백질 생산을 저비용, 고효율로 할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 재조합 전이 벡터 및 비교예인 pPol-EGFP를 모식화하여 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 재조합 전이 벡터가 도입된 재조합 바이러스의 구조를 모식화하여 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 재조합 전이 벡터에 의한 목적 유전자 EGFP 의 발현 증폭 (A) 및 ApGOZA 바이러스에만 존재하는 mini-F 유전자의 발현 여부 (B)를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 재조합 전이 벡터에 의한 목적 유전자 EGFP의 발현을 형광 현미경을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 재조합 전이 벡터가 도입된 재조합 바이러스의 구조를 모식화하여 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 재조합 전이 벡터에 의한 목적 유전자 EGFP 의 발현 증폭 (A) 및 ApGOZA 바이러스에만 존재하는 mini-F 유전자의 발현 여부 (B)를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 재조합 전이 벡터에 의한 목적 유전자 EGFP의 발현을 형광 현미경을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
본 발명은 재조합 전이 벡터, 상기 벡터가 도입된 곤충 세포 및 상기 벡터를 이용한 외래 목적 단백질의 대량 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 재조합 전이 벡터는 배큘로바이러스의 다각체 단백질 코딩 유전자의 프로모터와 상동지역 5(homologous region 5: hr5) 서열, Burst 서열 및 vp39 프로모터의 조합을 포함하며, 외래 목적 단백질을 융합 형태가 아닌 목적 단백질의 고유한 형태로 대량 생산할 수 있다.
이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 발명은 a) 배큘로바이러스의 다각체 단백질 코딩 유전자의 프로모터; 및 b) 상기 프로모터와 작동가능하게 연결된 서열번호 2로 표시되는 Burst 서열; 을 포함하는 재조합 전이 벡터를 제공하며, 상기 재조합 전이 벡터는 본 발명에서 “pPol-5-EGFP” 로 명명될 수 있다.
본 발명에 있어서 "프로모터"는, 전사를 이끌기에 충분한 최소한의 서열을 의미한다.
본 발명에 있어서 "배큘로 바이러스의 다각체 단백질 코딩 유전자의 프로모터"는 서열번호 4 로 표시된 것일 수 있다. 상기 다각체 단백질 코딩 유전자의 프로모터는 외래 목적 단백질의 앞부분에 위치하여, 목적 단백질의 발현 효율을 증가시킬 수 있는 프로모터로, 상기 다각체 단백질의 전사 및 기능적 발현에 필수적인 DNA 서열을 의미한다. 바람직하게는 오토그라파 칼리포니카 핵다각체병 바이러스(Autographa californica NPV; AcNPV) 다각체 단백질의 구조 유전자 상류 약 100 bp 서열 부위, 보다 바람직하게는 상류(upstream) -1 bp 내지 -52 bp 부위를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, “배큘로 바이러스” 는 사람이나 척추 동물에는 병원성이 없으며, 곤충에 대해서만 병원성을 나타내는 곤충 병원성 바이러스를 모두 포함한다. 바람직하게는 핵다각체병 바이러스(Nucleopolyhedrovirus: NPV) 및 과립병 바이러스(Granulovirus: GV)를 포함할 수 있으며, 본 발명에서는 바람직한 일 예로 핵다각체병 바이러스를 의미할 수 있다.
본 발명에 있어서, 용어 "배큘로바이러스의 다각체 단백질"은 감염 말기에 곤충 세포의 핵으로부터 대량 합성되어지는 배큘로 바이러스 다각체의 구조단백질로서 예를 들어, 오토그라파 칼리포니카 핵다각체병 바이러스(Autographa californica Nucleopolyhedrovirus, AcNPV)의 다각체 단백질, 파밤나방(Spodoptera exigua) 핵다각체병 바이러스의 다각체 단백질(Elisabeth et al., 1992, J. Gen. Viral., 13, 2813-2821), 누에(Bombix mori) 핵다각체병 바이러스의 다각체 단백질(Iatrou et al., 1985, J. Virol., 54, 436-445) 등을 들 수 있고, 바람직하게는 상기 오토그라파 칼리포니카 핵다각체병 바이러스(AcNPV)의 다각체 단백질을 의미할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 Burst 서열은 폴리헤드린(Polyhedrin) 프로모터내 존재하는 일부분으로써 번역 개시 부위와 TAAG 사이에 위치한 서열이며, 배큘로바이러스 감염말기에 Vlf-1이 Burst 서열에 특이적으로 결합하여 전사를 촉진시키는 것으로 알려져 있다(Manohar 등 2010). 본 발명의 Burst 서열은 서열번호 2로 표시되는 염기서열 또는 이의 변이체일 수 있다.
본 발명의 배큘로바이러스의 다각체 단백질 코딩 유전자의 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결된 서열번호 2로 표시되는 Burst 서열을 포함하는 재조합 전이 벡터는 외래 목적 단백질의 발현을 가장 효율적으로 증가시킬 수 있는 가장 단순한 형태의 재조합 전이 벡터로 해당 재조합 전이 벡터를 토대로 추가적인 프로모터 또는 촉진 서열을 조합하여 사용할 수 있다.
따라서 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 hr5 (homologous region 5) 서열 및 서열번호 3으로 표시되는 vp39 프로모터로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 전이 벡터를 제공한다.
상기 hr (homologous region) 서열은 배큘로바이러스의 게놈에 존재하는 반복된 염기서열 영역을 의미하고, hr1 , hr2L , hr2R , hr3 , hr4L , hr4R , hr5가 존재한다. 이들 hr 서열의 대부분이 바이러스 DNA복제와 증식에서 중요한 역할을 수행하며 바이러스 또는 비바이러스 유전자의 전사 촉진자로 기능을 가지는 것으로 확인되었다 (Rodems와 Friesen, 1993). 본 발명에서는 hr5 서열을 이용하였으며, 이는 서열번호 1로 표시되는 염기서열 또는 이의 변이체일 수 있다.
또한 상기 vp39 프로모터는 vp39 유전자의 발현을 조절하는 프로모터이며, vp39 유전자는 late 유전자로써 바이러스 입자의 구조 단백질 중 하나이다. 상기 vp39 프로모터는 서열번호 3 로 표시되는 염기서열 또는 이의 변이체일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 배큘로바이러스의 다각체 단백질 코딩 유전자의 프로모터, 서열번호 2로 표시되는 Burst 서열, 서열번호 1로 표시되는 hr5 (homologous region 5) 서열 및 서열번호 3으로 표시되는 vp39 프로모터는 외래 목적 단백질의 발현 증대를 달성할 수 있는 한, 그 순서 및 개수, 방향성을 당 분야의 통상의 기술자의 상식에 따라 적절히 조절하여 사용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 예에서는 서열번호 1로 표시되는 hr5 서열, 배큘로바이러스의 다각체 단백질 코딩 유전자의 프로모터 및 서열번호 2로 표시되는 Burst 서열이 순차적으로 연결된 것을 특징으로 하는, 재조합 전이 벡터; 서열번호 1로 표시되는 hr5 서열, 서열번호 3으로 표시되는 vp39 프로모터, 배큘로바이러스의 다각체 단백질 코딩 유전자의 프로모터 및 서열번호 2로 표시되는 Burst 서열이 순차적으로 연결된 것을 특징으로 하는, 재조합 전이 벡터; 또는 서열번호 3으로 표시되는 vp39 프로모터, 배큘로바이러스의 다각체 단백질 코딩 유전자의 프로모터 및 서열번호 2로 표시되는 Burst 서열이 순차적으로 연결된 것을 특징으로 하는, 재조합 전이 벡터;를 제공하나, 이에 제한되는 것은 아니며, 이 외 추가적인 프로모터 또는 발현 촉진을 위한 서열을 포함할 수 있다.
상기 재조합 전이 벡터는 각각 본 발명에서 "pPol-4-EGFP", “pPol-1-EGFP", "pPol-3-EGFP"로 명명될 수 있다.
또한 본 발명은 a) 서열번호 3으로 표시되는 vp39 프로모터; 및 b) 배큘로바이러스의 다각체 단백질 코딩 유전자의 프로모터;를 포함하는 재조합 전이 벡터를 제공하며, 이는 본 발명에서 "pPol-6-EGFP"으로 명명될 수 있다. pPol-6-EGFP 는 서열번호 2로 표시되는 Burst 서열을 포함하지 않으나, 다각체 단백질 코딩 유전자 프로모터에 의한 외래 목적 단백질의 발현을 더욱 촉진하기 위하여 서열번호 3으로 표시되는 vp39 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 서열번호 3으로 표시되는 vp39 프로모터와 배큘로바이러스의 다각체 단백질 코딩 유전자의 프로모터는 상호 교환적인 순서로 연결될 수 있으며, 바람직하게는 vp39 프로모터와 배큘로바이러스의 다각체 단백질 코딩 유전자의 프로모터 순으로 순차적으로 연결될 수 있다.
또한 본 발명은 상기 재조합 전이 벡터에 서열번호 1로 표시되는 hr5 (homologous region 5) 서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 전이 벡터를 제공하며, 이는 본 발명에서 "pPol-2-EGFP"로 명명될 수 있다.
서열번호 1로 표시되는 hr5 (homologous region 5) 서열, 서열번호 3으로 표시되는 vp39 프로모터 및 배큘로바이러스의 다각체 단백질 코딩 유전자의 프로모터는 외래 목적 단백질의 발현 증대를 달성할 수 있는 한, 그 순서 및 개수, 방향성을 당 분야의 통상의 기술자의 상식에 따라 적절히 조절하여 사용할 수 있으며, 바람직하게는 hr5 (homologous region 5) 서열, vp39 프로모터 및 배큘로바이러스의 다각체 단백질 코딩 유전자의 프로모터가 순차적으로 연결될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 전이 벡터는 도 1에 기재된 개열 지도를 갖는 것일 수 있으며, 본 발명의 외래 목적 단백질의 발현 증대를 달성할 수 있는 벡터의 구성이라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 염기서열의 변이체란 핵산 분자의 작용성 등가물, 예를 들어 일부 염기서열이 결실(deletion), 치환(substitution) 또는 삽입(insertion)에 의해 변형되었지만, 기존의 핵산 분자와 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체(variants)를 포함하는 개념이다. 이와 같은 변이체는 기존의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 "재조합 벡터"는, 발현시키고자 하는 목적 폴리펩타이드의 암호화 유전자가 작동 가능하게 연결될 경우, 적절한 숙주 세포에서 상기 목적 폴리펩타이드를 높은 효율로 발현시킬 수 있는 목적 폴리펩타이드의 발현 벡터로 사용될 수 있으며, 상기 재조합 벡터는 숙주 세포에서 발현 가능할 수 있다.
본 발명에 있어서 "작동 가능하게 연결된(operably linked)"은 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 말한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동 가능하게 연결되어 코딩서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 전이 벡터가 도입된 곤충 세포를 제공한다.
본 발명의 곤충 세포는 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni)의 BT1-Tn-5B1-4 또는Hi5 (High Five ™) 세포, 리만트리아 디스파(Lymantria dispar)의 LD652Y 세포, 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)의 Sf9 세포, 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)의 Sf21 세포, 드로소필라(Drosophila)의 Kc1 세포, 드로소필라(Drosophila)의 SL2 세포, Bm5 (Bombyx mori 5)세포 및 모기(mosquito) 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종인 것을 특징으로 하는 곤충 세포일 수 있으며, 바람직하게는 Sf9, Sf21, Hi5 및 Bm5 로 이루어진 군에서 선택된 1종의 곤충 세포 일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어 곤충 세포는 이를 포함하는 곤충을 모두 포함하는 의미로 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, "도입" 이란 외부로부터 주어진 DNA를 세포 내에 이식하는 것을 의미하며, 즉 생물의 어떤 계통의 세포(바이러스 세포 제외)에서 추출된 핵산의 일종인 DNA를 다른 계통의 살아있는 진핵 세포에 주입하였을 때 DNA가 그 세포에 들어가서 유전형질이 변화하는 현상이다. 즉, "도입"이란 특정 유전자를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 발현시킬 수 있도록 하는 것을 의미한다.
본 발명의 재조합 벡터를 세포주에 도입하는 방법은 본 발명의 재조합 벡터를 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 인산칼슘공침법, DEAE-텍스트란처리법, 전기천공법, 재분포법 등의 공지 방법으로 수행될 수 있다.
또한 본 발명의 곤충 세포는 백미드(bacmid) 가 동시에 도입된 곤충세포 일 수 있다.
용어 "백미드"란, 배큘로바이러스와 플라스미드의 합성어로 baculovirus shuttle vector 를 의미한다. 본 발명에 있어서 백미드는 AcNPV 계열의 bacmid 인 ApGOZA, AcGOZA, BmNPV (Bombyx mori nucleopolyhedrovirus) 계열로 BpGOZA (int J.indust Entomol Vol. 2. No. 2001, pp155~160 참조), BmGOZA (Biotechnology Letters 23: 1809-1817, 2001 참조) 게놈을 모두 제한없이 사용할 수 있으며, 바람직하게는 AcNPV (Autographa califomica nucleopolyhedrovirus)의 백미드를 사용할 수 있다.
또한 본 발명은 a) 본 발명의 재조합 전이 벡터에 외래 목적 단백질 코딩 뉴클레오타이드 서열을 클로닝하는 단계; 및 b) 상기 클로닝된 재조합 전이 벡터 및 백미드(bacmid) 를 곤충 세포에 도입시키는 단계; 를 포함하는, 외래 목적 단백질의 대량 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 외래 목적 단백질의 대량 생산 방법에 따르면 배큘로바이러스의 다각체 단백질 코딩 유전자의 프로모터만을 이용하는 기존 기술 대비, 목적하는 외래 단백질을 곤충 세포에서 약 2 내지 3 배 이상 증가된 양으로 수득할 수 있다.
본 발명에 있어, 목적 단백질은 예를 들어, 호르몬, 호르몬 유사체, 효소, 효소저해제, 신호전달단백질 또는 그 일부분, 항체 또는 그 일부분, 단쇄항체, 결합단백질 또는 그 결합도메인, 항원, 부착단백질, 구조단백질, 조절단백질, 독소단백질, 사이토카인, 전사조절인자, 혈액 응고 인자 또는 백신 단백질을 들 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생락하며, 본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. 발현 효율이 향상된 재조합 전이 벡터의 제작
발현 효율이 향상된 재조합 벡터를 제작하기 위하여, 다각체 단백질 유전자 (polyhedrin gene) 프로모터 (서열번호 4) 에 추가적으로 전사촉진자로 보고된 상동지역 5(homologous region 5: hr5) 서열 (서열번호 1), 단백질 발현량을 증대 시키는 Burst 서열 (서열번호 2)과 또 다른 프로모터로서 발현량을 향상시키는 vp39 프로모터(서열번호 3)를 이용하였다. 다각체 단백질 유전자 프로모터에 의한 단백질 과발현을 판명하기 위한 표지 단백질로는 녹색형광단백질(enhanced green fluorescent protein: EGFP)을 이용하였다. 제조된 다양한 조합의 벡터를 표 1 및 도 1에 나타내었다.
벡터명 | 재조합 서열 |
pPol-1-EGFP | hr5 서열-vp39 프로모터-polyhedrin 프로모터-Burst 서열-EGFP |
pPol-2-EGFP | hr5 서열-vp39 프로모터-polyhedrin 프로모터- EGFP |
pPol-3-EGFP | vp39 프로모터-polyhedrin 프로모터-Burst 서열-EGFP |
pPol-4-EGFP | hr5 서열-polyhedrin 프로모터-Burst 서열-EGFP |
pPol-5-EGFP | polyhedrin 프로모터-Burst 서열-EGFP |
pPol-6-EGFP | vp39 프로모터-polyhedrin 프로모터-EGFP |
pPol-7-EGFP | hr5 서열- polyhedrin 프로모터-EGFP |
pPol-EGFP | polyhedrin 프로모터-EGFP |
표 1 및 도 1에 나타낸 바와 같이, 다각체 단백질 유전자 프로모터를 기반으로 하여 hr5 서열, vp39 프로모터, Burst 서열을 다양하게 조합하였으며, 이들을 pPol-1-EGFP, pPol-2-EGFP, pPol-3-EGFP, pPol-4-EGFP, pPol-5-EGFP, pPol-6-EGFP, pPol-7-EGFP 로 명명하였다. 비교예로는 다각체 단백질 코딩 유전자의 프로모터 하류에 EGFP 유전자만을 발현시키는 pPol-EGFP를 제작하여 이용하였다.
구체적으로 전사증대인자(Transcription enhancer)인 VP39 프로모터, 다각체 단백질 유전자 프로모터(Polyhedrin promoter) 의 조합을 가지는 배큘로바이러스 전이벡터 제작은 pHIP 벡터에 합성된 VP39 프로모터-다각체 단백질 유전자 프로모터-Burst sequence×4를 클로닝을 하여 제작하였다. 전이벡터로는 Clontech (Lonza, USA) (서열번호 9) 를 사용하였으며, 상기 벡터는 ORF603영역과 ORF1629영역 사이에 MCS가 존재하는 벡터이다. 도 1에 표시된 서열들을 MSC에 클로닝하였다. GFP 유전자가 클로닝된 T&A 클로닝 벡터를 이용하여 제한효소 처리에 의해 EGFP를 얻었고, 이를 제작한 벡터에 클로닝하여 pPol-1-EGFP를 제작하였다. EGFP가 클로닝된 전이벡터로부터 제한효소 처리 후 Self ligation을 통해 6가지의 각기 다른 전이벡터를 제작하였다. 모든 전이벡터는 제한효소처리와 염기서열 분석을 통하여 클로닝 여부를 최종 확인하였다.
실시예
2. 벡터가 도입된 재조합 바이러스 제작
상기 실시예 1에서 제조된 재조합 벡터가 도입된 재조합 바이러스를 제작하기 위하여, 실시예 1의 재조합 전이벡터 DNA와 AcNPV의 bacmid 인 ApGOZA DNA ((Je et al., Int. J. Indust. Entomol., 2: 155-160 (2001) 참조) 를 곤충 세포주인 Sf9 (Spodoptera frugiperda 9) (Gibco BRL, USA)에 동시세포전이 시켜 DNA간의 상동재조합에 의해 재조합 바이러스들을 제작하였다. 제작된 재조합 바이러스의 구조는 도 2에 나타내었으며, 각각 rAP-pPol-1-EGFP, rAP-pPol-2-EGFP, rAP-pPol-3-EGFP, rAP-pPol-4-EGFP, rAP-pPol-5-EGFP, rAP-pPol-6-EGFP, rAP-pPol-7-EGFP, rAP-pPol-EGFP 로 나타내었다.
구체적으로 재조합 바이러스(recombinant virus)의 제작을 위해 상기 실시예 1에서 제조된 재조합 전이벡터 500 ng과 bApGOZA DNA 100 ng (Je et al., 2001) 을 100 ul의 Grace's Insect Medium, unsupplemented (Invitrogen, USA)에 혼합하고, transfection reagent인 Cellfectin® II Reagent (Invitrogen, USA) 8 μl를 100 μl의 Grace's Insect Medium, unsupplemented (Invitrogen, USA)에 첨가하여 각각의 혼합액(mixture)은 재혼합하여 27℃에서 30분간 반응시켰으며, 반응이 종료된 혼합액은 1.0 × 106 cells/ml로 분주된 Sf9 세포에 접종(transfection)하였다. 접종 3일 후부터 위상차 현미경을 이용하여 재조합 바이러스의 생성을 확인하였다.
제작된 재조합 바이러스들을 순수 분리한 후 목적 서열의 존재 및 바이러스의 순수성을 PCR 증폭 방법을 통해 확인하였다. 재조합 바이러스의 순화는 plaque assay 방법으로 수행하였다. Sf9 세포를 2.0 × 106 cells/ml로 60mm dish (SPL Co. Ltd., Korea)에 분주하고, 재조합 바이러스의 생성이 확인된 세포배양 배지를 10-3 ∼ 10- 5으로 희석하여 4시간 동안 접종하였다. 이후, agarose의 준비는 5% SeaPlaque Agarose (Lonza, USA)를 멸균하여 녹인 후, 45℃ water bath에서 정치시키고 세포배양 배지와 혼합하여 최종적으로 0.5% agarose가 되도록 준비하였다. 4시간의 바이러스 접종 후, 접종액을 완전히 제거하고 준비한 아가로오스 겔을 감염 세포 위에 3 ml씩 overlay한 뒤 27℃에서 배양하며 3일 후부터 플라크의 생성유무를 관찰하였다. 생성된 플라크는 마이크로피펫(micropipette)을 이용하여 분리한 후 세포배양 배지 100 ul에 첨가하고 볼텍싱하여 혼합액을 Sf9 세포가 1.0 × 104 cells/ml 분주된 24 well plate에 접종하였다. 접종 3일 후, 재조합 바이러스의 생성이 확인된 세포를 수거하여 바이러스 DNA를 추출하고 PCR을 수행하여 재조합 바이러스의 순수성을 확인하였다. 바이러스의 순수성을 확인하기 위한 PCR은 목적 유전자가 전이되는 위치에서 5 말단 상류부위인 ORF603 영역의 특이적 프라이머 5’-GGT ACC ATA TAT AGT TGC TGA TGG GA-3’ (서열번호 5)와 EGFP 유전자 특이적 프라이머 5’-GAG CTC TTA CTT GTA CAG CTC GTC C-3’ (서열번호 6)를 이용하여 삽입(insertion)을 확인하였다. 모바이러스인 bApGOZA의 탈락(deletion)은 ApGOZA 바이러스에만 존재하는 mini-F 유전자의 증폭을 통해 확인하였고, 이는 mini-F 특이적인 F-프라이머 5’-ATG TTC AGA ATG AAA CTC ATG GAA-3’ (서열번호 7) 와 mini-F 특이적인 R-프라이머 5’-TTA TCT AAT CTC CCA GCG TGG TT-3’ (서열번호 8)를 사용하여 확인하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 각 재조합 바이러스는 예측되는 위치에서 목적 서열인 EGFP 의 증폭산물을 보였다(도 3의 (A)). 또한 ApGOZA 바이러스에만 존재하는 mini-F 유전자의 증폭은 일어나지 않아 그 순수성을 확인할 수 있었다 (도 3의 (B)). 즉 본 발명의 재조합 바이러스에 따르면, 목적 유전자만 증폭되고 벡터로 사용된 바이러스의 DNA는 증폭되지 않아 원하는 목적 유전자의 발현만 순수하게 증폭할 수 있다.
실시예
3. 재조합 벡터에 의한 단백질 과발현 검증
재조합 벡터가 도입된 재조합 바이러스에 의해 목적 단백질의 발현 증대라는 목적이 효과적으로 달성되는지 여부를 확인하기 위하여, 리포터 단백질인 EGFP 발현을 형광 현미경으로 관찰하였다. 시간에 따른 재조합 단백질의 발현량 조사를 위하여 1.0 × 106 cells/ml의 Sf21 세포에 재조합 바이러스를 1 MOI (multiplicity of infections)로 접종하여 2 ∼ 5일까지 24시간 간격으로 세포를 수거하여 형광단백질 발현 분석에 사용하였다. 녹색형광단백질 EGFP는 488 ㎚에서 최고의 여기파장과 510 ㎚에서 최고의 방출파장을 나타내며 형광현미경상에서 방출되는 청색광(Max 470 ㎚)이 녹색광(510 ㎚)으로 변환되어 형광을 관찰 할 수 있었다. 형광현미경 관찰 후 INFINITY software Program을 이용하여 발현된 형광사진 및 일반 세포 사진을 촬영하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 재조합 벡터의 종류에 따라 목적 단백질의 발현량은 차이를 보였다. 비교예인 rAp-Pol-EGFP 는 가장 낮은 정도의 형광을 나타내었으며, 다각체단백질 코딩 유전자의 프로모터에 추가적인 프로모터 및 발현 촉진 서열 등을 조합한 벡터에서 더 강한 형광을 나타내었다. 가장 높은 단백질 발현 증가는 rAp-Pol-1-EGFP, rAp-Pol-3-EGFP, rAp-Pol-4-EGFP, rAp-Pol-5-EGFP 에서 확인되었다.
또한 비교예 대비 다양한 형태의 실시예의 발현량 증대 효과를 형광광도계를 이용하여 비교 측정하였으며, 각 재조합 융합단백질의 발현량 비교 조사를 위하여 1.0 × 106cells/ml의 Sf21 세포에 재조합 바이러스를 1 MOI로 접종하여 3일 뒤 세포를 수거하였다. 그 후 1000xg로 5분 동안 4℃ 냉장원심분리하여 수거하고 phosphate buffed saline (PBS)으로 세척하였다. 침전된 세포에 RIPA buffer (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 50 mM NaCl, 5% Glycerol, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 0.1% SDS)를 900 ul 첨가하고 초음파 파쇄기를 이용하여 10 s on, 30 s off, 3반복 과정으로 세포를 파쇄한 후, 100 ul의 1 M sodium carbonate를 첨가하여 37℃에서 1시간 처리하고 2 ml의 PBS를 첨가하였다. 측정시료는 최소 3 ml을 사용하고 450 ㎚의 excitation filter와 510 ㎚의 emission filter에서 K2™ fluorescence spectrometer (ISS Inc., USA)로 형광광도를 측정하였다. 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, rAp-Pol-1-EGFP, rAp-Pol-3-EGFP, rAp-Pol-4-EGFP, rAp-Pol-5-EGFP의 경우 다각체 단백질 프로모터를 단독 이용한 비교예와 비교하여 약 2-3배의 발현량 상승 효과를 보였다. 상기 선별된 벡터는 모두 Burst 서열을 포함하는 것으로, Burst 서열이 단일 인자 중에서는 가장 높은 단백질 발현 효과를 유도하는 것을 확인하였다. 또한 Burst 서열과 vp39 프로모터를 함께 이용한 rAp-Pol-3-EGFP 에서 가장 높은 발현량 상승 효과가 나타났다. 한편 hr 서열과 Burst 서열을 포함하는 rAp-Pol-4-EGFP 에서도 높은 발현량 증가가 확인된 것과 달리 Burst 서열 없이 vp39 프로모터만을 추가로 포함하는 rAp-Pol-7-EGFP 에서는 비교군보다 낮은 정도의 형광 발현이 나타나 목적 단백질의 발현은 전시 촉진자와 프로모터의 조합에 따라 상이하게 나타날 수 있음을 확인하였다.
비록 본 발명이 상기에 언급된 바람직한 실시예로서 설명되었으나, 발명의 요지와 범위로부터 벗어남이 없이 다양한 수정이나 변형을 하는 것이 가능하다. 또한 첨부된 청구 범위는 본 발명의 요지에 속하는 이러한 수정이나 변형을 포함한다.
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exression
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> homologous region 5
<400> 1
cgcgtaaaac acaatcaagt atgagtcata agctgatgtc atgttttgca cacggctcat 60
aaccgaactg gctttacgag tagaattcta cttgtaacgc acgatcagtg gatgatgtca 120
tttgtttttc aaatcgagat gatgtcatgt tttgcacacg gctcataaac tcgctttacg 180
agtagaattc tacgtgtaac gcacgatcga ttgatgagtc atttgttttg caatatgata 240
tcatacaata tgactcattt gtttttcaaa accgaacttg atttacgggt agaattctac 300
ttgtaaagca caatcaaaaa gatgatgtca tttgtttttc aaaactgaac tcgctttacg 360
agtagaattc tacgtgtaaa acacaatcaa gaaatgatgt catttgttat aaaaataaaa 420
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gcg 483
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Burst sequence
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ctgttttcgt aacagttttg taataaaaaa acctataaat 40
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> vp39 promoter sequence
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aaatcgaaat attgttgtgc cagcgaataa ttaggaacaa tataagaatt taaaatttta 240
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> polyhedrin gene promotor sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFP specific promotor sequence
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gagctcttac ttgtacagct cgtcc 25
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mini-F specific forward primer
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<223> mini-F specific reverse primer
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<223> pBacPAK9 vector sequence
<400> 9
aacggctccg cccactatta atgaaattaa aaattccaat tttaaaaaac gcagcaagag 60
aaacatttgt atgaaagaat gcgtagaagg aaagaaaaat gtcgtcgaca tgctgaacaa 120
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tttacagaca attgttgtac gtattttaat aattcattaa atttataatc tttagggtgg 1440
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gtagttgagc tttttggaat tatttctgat tgcgggcgtt tttgggcggg tttcaatcta 1980
actgtgcccg attttaattc agacaacacg ttagaaagcg atggtgcagg cggtggtaac 2040
atttcagacg gcaaatctac taatggcggc ggtggtggag ctgatgataa atctaccatc 2100
ggtggaggcg caggcggggc tggcggcgga ggcggaggcg gaggtggtgg cggtgatgca 2160
gacggcggtt taggctcaaa tgtctcttta ggcaacacag tcggcacctc aactattgta 2220
ctggtttcgg gcgccgtttt tggtttgacc ggtctgagac gagtgcgatt tttttcgttt 2280
ctaatagctt ccaacaattg ttgtctgtcg tctaaaggtg cagcgggttg aggttccgtc 2340
ggcattggtg gagcgggcgg caattcagac atcgatggtg gtggtggtgg tggaggcgct 2400
ggaatgttag gcacgggaga aggtggtggc ggcggtgccg ccggtataat ttgttctggt 2460
ttagtttgtt cgcgcacgat tgtgggcacc ggcgcaggcg ccgctggctg cacaacggaa 2520
ggtcgtctgc ttcgaggcag cgcttggggt ggtggcaatt caatattata attggaatac 2580
aaatcgtaaa aatctgctat aagcattgta atttcgctat cgtttaccgt gccgatattt 2640
aacaaccgct caatgtaagc aattgtattg taaagagatt gtctcaagct cggatcgatc 2700
ccgcacgccg ataacaagcc ttttcatttt tactacagca ttgtagtggc gagacacttc 2760
gctgtcgtcg cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca 2820
tacgtcaaag caaccatagt acgcgccctg tagcggcgca ttaagcgcgg cgggtgtggt 2880
ggttacgcgc agcgtgaccg ctacacttgc cagcgcccta gcgcccgctc ctttcgcttt 2940
cttcccttcc tttctcgcca cgttcgccgg ctttccccgt caagctctaa atcgggggct 3000
ccctttaggg ttccgattta gtgctttacg gcacctcgac cccaaaaaac ttgatttggg 3060
tgatggttca cgtagtgggc catcgccctg atagacggtt tttcgccctt tgacgttgga 3120
gtccacgttc tttaatagtg gactcttgtt ccaaactgga acaacactca accctatctc 3180
gggctattct tttgatttat aagggatttt gccgatttcg gcctattggt taaaaaatga 3240
gctgatttaa caaaaattta acgcgaattt taacaaaata ttaacgttta caattttatg 3300
gtgcactctc agtacaatct gctctgatgc cgcatagtta agccagcccc gacacccgcc 3360
aacacccgct gacgcgccct gacgggcttg tctgctcccg gcatccgctt acagacaagc 3420
tgtgaccgtc tccgggagct gcatgtgtca gaggttttca ccgtcatcac cgaaacgcgc 3480
gagacgaaag ggcctcgtga tacgcctatt tttataggtt aatgtcatga taataatggt 3540
ttcttagacg tcaggtggca cttttcgggg aaatgtgcgc ggaaccccta tttgtttatt 3600
tttctaaata cattcaaata tgtatccgct catgagacaa taaccctgat aaatgcttca 3660
ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat tcaacatttc cgtgtcgccc ttattccctt 3720
ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga aagtaaaaga 3780
tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg ttacatcgaa ctggatctca acagcggtaa 3840
gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg ttttccaatg atgagcactt ttaaagttct 3900
gctatgtggc gcggtattat cccgtattga cgccgggcaa gagcaactcg gtcgccgcat 3960
acactattct cagaatgact tggttgagta ctcaccagtc acagaaaagc atcttacgga 4020
tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc tgccataacc atgagtgata acactgcggc 4080
caacttactt ctgacaacga tcggaggacc gaaggagcta accgcttttt tgcacaacat 4140
gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg ggaaccggag ctgaatgaag ccataccaaa 4200
cgacgagcgt gacaccacga tgcctgtagc aatggcaaca acgttgcgca aactattaac 4260
tggcgaacta cttactctag cttcccggca acaattaata gactggatgg aggcggataa 4320
agttgcagga ccacttctgc gctcggccct tccggctggc tggtttattg ctgataaatc 4380
tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggtat cattgcagca ctggggccag atggtaagcc 4440
ctcccgtatc gtagttatct acacgacggg gagtcaggca actatggatg aacgaaatag 4500
acagatcgct gagataggtg cctcactgat taagcattgg taactgtcag accaagttta 4560
ctcatatata ctttagattg atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa 4620
gatccttttt gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc 4680
gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat 4740
ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga 4800
gctaccaact ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt 4860
tcttctagtg tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata 4920
cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac 4980
cgggttggac tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg 5040
ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg 5100
tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag 5160
cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct 5220
ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc 5280
aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt 5340
ttgctggcct tttgctcaca tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg 5400
tattaccgcc tttgagtgag ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga 5460
gtcagtgagc gaggaagcgg aagagcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg 5520
gccgattcat taatgcag 5538
Claims (14)
- 서열번호 3으로 표시되는 vp39 프로모터, 배큘로바이러스의 다각체 단백질 코딩 유전자의 프로모터 및 상기 다각체 단백질 코딩 유전자의 프로모터에 작동가능하게 연결된 4개의 반복된 서열번호 2로 표시되는 Burst 서열; 을 순차적으로 연결하여 포함하는 Sf9 세포 또는 Sf21 세포 도입용 재조합 전이 벡터.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항의 재조합 전이 벡터가 도입된 곤충세포로, 상기 곤충세포는 Sf9 세포 또는 Sf21 세포인 곤충세포.
- 삭제
- 제10항에 있어서, 백미드(bacmid) 가 동시에 도입된 곤충세포.
- 제12항에 있어서, 상기 백미드(bacmid)는 AcMNPV(Autographa califomica nucleopolyhedrovirus) 또는 BmNPV (Bombyx mori nucleopolyhedrovirus) 의 게놈인 것을 특징으로 하는, 곤충 세포.
- a) 제1항의 재조합 전이 벡터에 외래 목적 단백질 코딩 뉴클레오타이드 서열을 클로닝하는 단계; 및
b) 상기 클로닝된 재조합 전이 벡터 및 백미드(bacmid) 를 Sf9 세포 또는 Sf21 세포에 도입시키는 단계; 를 포함하는, 외래 목적 단백질의 대량 생산 방법.
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Gene (1994) 140:147-153* |
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