CN111518175B

CN111518175B - Sars-cov-2抗原多肽及其重组腺相关病毒和在制备疫苗中的应用

Info

Publication number: CN111518175B
Application number: CN202010392553.1A
Authority: CN
Inventors: 周泽鑫; 刘中秋; 廖国超; 李华鹏; 张超; 戚笑笑; 陈君霖; 杨德盈
Original assignee: Guangdong Hengda Biomedical Technology Co Ltd
Current assignee: Guangdong keguanda Pharmaceutical Technology Co.,Ltd.
Priority date: 2020-05-11
Filing date: 2020-05-11
Publication date: 2021-02-26
Anticipated expiration: 2040-05-11
Also published as: CN112695057A; CN111518175A; WO2021227401A1; CN112695057B

Abstract

本发明公开了SARS‑COV‑2抗原多肽及其重组腺相关病毒和在制备疫苗中的应用，所述的抗原多肽序列如SEQ.ID.NO.1和SEQ.ID.NO.2所示。所述的重组腺相关病毒是将将pHelper、pRep2Cap5和抗原多肽的表达载体共孵育，在转染试剂聚乙烯亚胺存在的条件下转染细胞，培育细胞后，经过裂解和纯化，得到含有重组腺相关病毒的纯化液。本发明的重组腺相关病毒在体内递送表达产生融合抗原多肽，诱导产生血清中和抗体，对SARS‑COV‑2新冠病毒具有中和效价，并持续表达，可用于对人进行针对COVID‑19新冠肺炎的免疫接种。

Description

SARS-COV-2抗原多肽及其重组腺相关病毒和在制备疫苗中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及SARS-COV-2抗原多肽及其重组腺相关病毒和在制备疫苗中的应用。

背景技术

冠状病毒（Coronavirus）是自然界中广泛存在的一大类RNA病毒，仅可感染脊椎动物。在人类中，冠状病毒可引起感冒、严重急性呼吸综合征（SARS）和中东呼吸综合征（MERS）等严重呼吸道疾病。

新型冠状病毒SARS-COV-2隐匿性和传染性很强，既可引起无症状感染，也可引起病毒性肺炎、严重呼吸综合征、肾衰竭及死亡，研制COVID-19预防性疫苗的工作极为重要和紧迫。

SARS-COV-2新冠病毒突刺（Spike）糖蛋白通过结合人体内细胞人血管紧张素转化酶2（ACE2）受体入侵机体，因此突刺（Spike）糖蛋白是研发疫苗的关键靶标。

野生型腺相关病毒（AAV）是直径为22nm左右的DNA病毒，对人不具有致病性。对野生型AAV进行基因工程改造，重组AAV已成为基因治疗中安全有效的递送载体。目前已有多款基于AAV载体的基因药物在国外上市。AAV载体广泛应用于疫苗、肿瘤药物、遗传病药物的开发。采用AAV载体来递送抗原基因的优势在于其具有极低的自身免疫原性和遗传毒性，高效递送、表达时间长。采用AAV载体疫苗可以实现内生抗原诱导抗体产生，抗体的产生具有持续性、稳定性。

发明内容

本发明的首要目的在于提供新冠病毒（SARS-COV-2）抗原多肽。

本发明的另一目的在于提供一种表达上述抗原多肽的重组腺相关病毒。

本发明的再一目的在于提供上述重组腺相关病毒在制备新冠肺炎疫苗中的应用。

本发明的目的由以下技术方案实现：

新冠病毒（SARS-COV-2）抗原多肽，为以下氨基酸序列中的一种：

①、预测发现SARS-COV-2的基因序列（GenBank accession no. NC_045512.2）的第331-583的氨基酸序列为刺突蛋白受体结构域，是诱导产生抗体、制备疫苗的靶标；

②、在①中序列的C端延长一段附加氨基酸，所述附加氨基酸的序列如SEQ. ID.NO.3所示，得到序列SEQ. ID. NO.1；目的是让C端更富含有原序列自有的半胱氨酸，有利于抗原的聚体化；

③、SEQ. ID. NO.2；预测发现SARS-COV-2的基因序列（GenBank accession no.NC_045512.2）的第319-541的氨基酸序列为刺突蛋白受体结构域，是诱导产生抗体、制备疫苗的靶标；

④、与①、②或③具有至少90%序列相似性的氨基酸序列，进一步优选与①或②具有95%、98%相似性的氨基酸序列。

上述抗原多肽的表达载体，含有腺相关病毒反向末端重复序列（ITR序列）、编码信号肽的核苷酸序列，以及编码上述抗原多肽的核苷酸序列；

所述的表达载体还含有必须的表达调控元件，比如启动子序列、上游调节区域、编码区、转录调控元件、终止子等；

所述编码抗原多肽的核苷酸序列经过人源密码子优化；

所述的ITR序列来自血清型AAV2。

所述的信号肽优选IgE信号肽。

一种表达上述抗原多肽的重组腺相关病毒（rAAV），其制备方法包括以下步骤：

将pHelper、pRep2Cap5和抗原多肽的表达载体共孵育，在转染试剂聚乙烯亚胺存在的条件下转染细胞，培育细胞后，离心收集细胞，经过裂解和纯化，得到含有重组腺相关病毒的纯化液；

所述的pRep2Cap5对应的是血清型AAV5。

rAAV载体的生产有本领域专业人员通用认知的工艺方法。本领域人员可以使用已知的技术基于HEK293的三质粒系统进行生产，例如中国发明专利ZL201710553164.0。

本领域人员还可以基于SF9细胞系的昆虫系统构建表达质粒和血清型质粒生产rAAV，例如中国专利申请CN108699567A。此外还有基于疱疹病毒辅助或者腺病毒辅助病毒的包装系统等。

rAAV病毒生产后可用多种常规的纯化方法如物理裂解、化学裂解、过滤澄清、切向流超滤、柱层析、CsCl梯度离心、碘克沙醇离心等从宿主细胞中纯化。以上纯化方式的具体描述可见Nass S, Mattingly M, Woodcock D, et al. Universal Method for thePurification of Recombinant AAV Vectors of Differing Serotypes[J]. Moleculartherapy. Methods & clinical development, 2018: 33-46.

上述的重组腺相关病毒可用于制备预防新冠病毒肺炎的疫苗；

所述的疫苗还包含药学上可接受的稀释剂和/或赋形剂；

所述的疫苗可制成注射剂，用于鼻内、肌肉注射。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1、在蛋白大分子抗原携带的多种特异性的抗原决定簇中，只有少量抗原部位对保护性免疫应答起作用。免疫原性取决于该物质自身的性质，如分子量、化学数学、分子结构以及分子构象等。本发明预测的SARS-COV-2的抗原多肽序列，经试验证实具有以下优点：a、相对于完整的S蛋白或者S1亚基作为抗原，截断的结构域序列由于序列更短、分子量更小、结构更明确从而更具有特异性；b、血清抗体中和试验显示，本发明的抗原多肽具有很高的免疫原性，可产生强大的保护性中和抗体；c、第一次报道了SARS-COV-2的抗原多肽核酸序列在AAV5型重组腺相关病毒上通过肌肉注射实现基因的递送，并有效持续的表达抗原序列。

2、本发明的rAAV组合物在体内递送表达产生融合抗原多肽，诱导产生血清中和抗体，对SARS-COV-2新冠病毒具有中和效价，并持续表达，可用于对人进行针对COVID-19新冠肺炎的免疫接种。

附图说明

图1是pAAV-NS001构建完成的载体图谱示意图；示意图中各关键元件描述如下：ITR是指AAV2的反向末端重复序列；CAG promoter是指强组合人工启动子，包含巨细胞病毒（CMV）的增强子，鸡beta actin启动子和兔的beta-globin剪接受体；NS001是指SEQ. ID.NO.1序列；WPRE是指土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件；SV40polyA是指猴空泡病毒40（SV40）多聚腺苷酸序列。

图2是pAAV-NS002构建完成的载体图谱示意图；示意图中NS002是指SEQ. ID.NO.2序列；其他关键元件同图1。

图3是2×10¹¹个基因组颗粒重组腺相关病毒制剂NS001免疫BaLb/c小鼠后，采用ELISA检测对体内抗体表达的影响；其中，a是对IgM抗体表达的影响，b是对IgG抗体表达的影响。

图4是2×10¹¹个基因组颗粒重组腺相关病毒制剂NS001免疫BaLb/c小鼠后30天进行血清病毒中和试验的结果。

图5是2×10¹¹个基因组颗粒重组腺相关病毒制剂NS002免疫BaLb/c小鼠后，采用ELISA检测对体内抗体表达的影响；其中，a是对IgM抗体表达的影响，b是对IgG抗体表达的影响。

图6是2×10¹¹个基因组颗粒重组腺相关病毒制剂NS001免疫BaLb/c小鼠后30天进行血清病毒中和试验的结果。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

在本发明的描述中，将使用以下术语，简要说明定义如下：

S蛋白，也称为Spike蛋白或刺突蛋白，是冠状病毒的衣壳表面糖蛋白。新冠病毒SARS-COV-2通过S蛋白与人ACE2受体结合并侵入细胞。S蛋白截短体为通过预测并截取S蛋白的部分区域作为抗原。

载体是指遗传物质的递送工具或元件，例如质粒、病毒、病毒类似颗粒、噬菌体等，该术语还经常根据应用类型或场景称为克隆载体、表达载体或骨架载体，以及病毒载体。

“rAAV载体”是指重组非复制型的腺相关病毒，rAAV载体包括血清型蛋白衣壳，并封装着重组的基因组，基因组包括功能性的5’和3’反向末端重复序列（ITR序列），并侧接外源核苷酸序列替代野生型AAV的rep或者cap基因。ITR序列提供对rAAV功能性拯救、复制、包装。在一些实施例中，ITR序列来自AAV2。外源核苷酸序列通常由一系列表达调控元件和编码区组成。

AAV血清型质粒pREPCAP包括两个开放阅读框（ORF），编码Rep和Cap表达产物。Cap是指本领域技术人员熟悉的AAV的衣壳蛋白，编码衣壳蛋白VP1、VP2和VP3及AAP等功能性蛋白，不同血清型的AAV有不同的衣壳蛋白序列。

AAV辅助质粒pHelper通常包括腺相关病毒VA RNA、E4 ORF6、E2A、E1B 等编码区域提供AAV复制必须的功能。

表达调控元件通常为启动子序列、上游调节区域、编码区、转录调控元件等的集合，共同实现在受体细胞中编码区序列的复制、转录和翻译。启动子是RNA 聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA 序列，它含有RNA 聚合酶特异性结合和转录起始所需的保守序列，多数位于结构基因转录起始点的上游,启动子本身不被转录。在一些案例里，启动子序列选用CAG启动子，合适的启动子还包括本领域技术人员已知的启动子，例如人巨细胞病毒（CMV）启动子，泛素C启动子（UbC）、EF1α启动子等，任选地，可以选择作为表达调控序列mRNA的转录。在一些案例中选用SV40polyA作为转录终止子。合适的polyA序列包括不限于本领域已知的SV40、BGH、合成polyA等。一些案例里还包括增强转录的调控元件土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件（WPRE），增强翻译效率的序列（Kozak序列）。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press ,1989）中所述的条件，或按照制造厂商提供说明书条件。

实施例中用到的材料如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、AAV表达载体质粒pAAV-NS001的构建

通过NCBI数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank）获取SARS-COV-2的基因序列（GenBank accession no. NC_045512.2），用NCBI Conserved Domain Search（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）预测序列内的保守结构域。

预测结果显示Spike receptor binding domain（即刺突蛋白受体结构域）为第331-583的氨基酸序列。基于自有技术认知，将该结构域C端序列延长10个氨基酸（ILDITPCSFG，SEQ. ID. NO.3）得到序列SEQ. ID. NO.1，目的是让C端更富含有原序列自有的半胱氨酸以有利于抗原的聚体化。

将获取的序列拼接在IgE信号肽之后，通过GenSmart Optimization (VersionBeta 1.0)进行人源密码子优化，并使用DNAWorks (v3.2.4)（https://hpcwebapps.cit.nih.gov/dnaworks/）设计引物，使用PrimeSTAR® HS DNA Polymerase（Takarabio）扩增合成序列，利用内切酶FastDigest™EcoRI和FastDigest™HindIII(ThermoFisher)酶切腺相关病毒骨架载体pAAV-CAG-MCS-WPRE-SV40polyA，采用的ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit重组试剂盒（南京诺唯赞）进行同源重组连接反应，经转化大肠杆菌DH5ɑ，涂于氨苄抗性的培养皿，16小时后挑取菌落检测，将阳性克隆送至测序公司（苏州金唯智）进行测序（SEQ. ID. NO.4），将测序结果正确的质粒命名为pAAV-NS001载体，其各元件组成见图1。

实施例2、AAV表达载体质粒pAAV-NS002的构建

通过NCBI数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank）获取SARS-COV-2的基因序列（GenBank accession no. NC_045512.2），用Uniprot blast（https://www.uniprot.org/blast/）通过uniprotkb_refprotswissprot数据库预测序列内的保守结构域。预测结果显示Spike receptor binding domain（即刺突蛋白受体结构域）为第319-541的氨基酸序列。将获取的序列拼接在IgE信号肽之后，通过GenSmart Optimization(Version Beta 1.0)进行人源密码子优化，并使用DNAWorks (v3.2.4)（https://hpcwebapps.cit.nih.gov/dnaworks/）设计引物使用PrimeSTAR® HS DNA Polymerase（Takarabio）扩增合成序列，利用内切酶FastDigest™EcoRI和FastDigest™HindIII(ThermoFisher)酶切腺相关病毒骨架载体pAAV-CAG-MCS-WPRE-SV40polyA，采用的ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit重组试剂盒（南京诺唯赞）进行同源重组连接反应，经转化大肠杆菌DH5ɑ，涂于氨苄抗性的培养皿，16小时后挑取菌落检测，将阳性克隆送至测序公司（苏州金唯智）进行测序（SEQ. ID. NO.5），将测序结果正确的质粒命名为pAAV-NS002载体，其各元件组成见图2。

实施例3、重组腺相关病毒rAAV-NS001、rAAV-NS002的制备

293T细胞在转染前24小时以每培养皿1×10⁷个细胞的密度在150mm培养皿中接种，并加入12μg pHelper、8μg pRep2Cap5、5μg pAAV-NS001（或者5μg pAAV-NS002）和10μg转染试剂聚乙烯亚胺（25kD）孵育转染，转染72小时后，在4℃以500×g离心收获细胞5min。细胞重悬在含有50mM Tris-HCl（pH值8.0）、150mM NaCl的裂解缓冲液中。收获裂解液在干冰/乙醇和37℃水浴中进行三次冻融循环。然后加入1unit/mL核酸酶和0.5%脱氧胆酸钠，细胞悬液在37℃下孵育1小时。在5000×g下离心20分钟，在4℃收集rAAV上清粗裂解液。粗裂解液用10mM Tris-HCl(pH8.0)缓冲液稀释至10毫升的最终体积，然后在39毫升超速离心管中加入按照15%、25%、40%、60%质量体积比梯度加载碘克沙醇。在18℃下用350，000×g离心1小时，收集3ml的40%下层组分和0.5ml的60%上层组分即为纯化液，用100kDa截止超滤管(Millipore)进行超滤置换为病毒保存液。重组病毒保存液为PBS磷酸缓冲液（pH值7.4），0.05%普洛沙姆188。将纯化的rAAV标记为NS001、NS002，采用SYBRGreenI qPCR测定病毒滴度。使用前在-80℃冰箱保存。

实施例4、NS001免疫BALB/c小鼠

随机选取5只5-6周龄BALB/c小鼠进行肌肉注射NS001（滴度为1×10¹²GC/mL，注射体积为200 μL）。取免疫前小鼠血清作为阴性对照，随机选取5只5-6周龄BALB/c小鼠以重组绿色荧光蛋白腺相关载体免疫作为载体空白对照。

采用一次初始免疫和二次增强免疫方案，分别在第0和30天进行注射；第30天和第40天取血，每只小鼠取血0.1 mL-0.2 mL，在0℃放置60分钟，4000转/分钟离心15分钟，取上层血清用于ELISA检测分析和抗体中和实验。

将第30天小鼠血清免疫效果ELISA检测：

用0.1 M 碳酸盐缓冲液（pH 9.6）溶解重组刺突蛋白RBD-His，配制成1 µg/mL溶液，以每孔100 µL的量加入96孔板，放入4℃孵育过夜；第二天37℃培养箱孵育一小时；用PBST（PBS+0.1%吐温-20）洗板3次（300 µL/孔/次）。洗板后，加入2% 脱脂奶粉；每孔加入250µL；常温孵育一小时，用PBST洗板3次。同组5只小鼠血清样品分别用PBS稀释300倍；将稀释好的血清以每孔100 µL加入96孔板，每个稀释梯度平行做三个副孔；放置在37℃培养箱孵育两个小时，洗板3次。分别将HRP（辣根过氧化物酶）标记的 IgG二抗和IgM二抗稀释5000倍，每孔加入100 µL，室温孵育一小时；洗板3次。加入TMB溶液，每孔加入100 µL，室温避光显色20分钟。加入0.5 M H₂SO₄溶液，每孔加100 µL。立即用酶标仪检测吸光度，检测波长为450 nm，570 nm作为背景波长。稀释300倍血清时IgG和IgM 表达结果以抗体吸光度（OD）值为纵坐标，不同血清组别为横坐标作柱状图，如图3a和图3b所示。

相对于AAV-GFP对照组（OD_IgM平均值=0.211±0.020），本发明实施例NS001疫苗，NS001组稀释300倍血清IgM抗体的OD_IgM平均值为1.494±0.024，证明小鼠体内产生高滴度的IgM抗体，呈阳性，通常在产生自适应性高亲和力IgG反应之前，IgM抗体在病毒感染期间提供了第一道防线，在短期免疫中起到重要的作用。

相对于AAV-GFP对照组（OD_IgG平均值=0.230±0.018），本发明实施例NS001疫苗，NS001组稀释300倍血清IgG抗体的OD_IgG平均值为2.910±0.083，呈阳性，证明小鼠体内产生高滴度的IgG抗体，说明疫苗在小鼠体内诱导了强大的免疫应答，在长期免疫和免疫记忆中起着重要作用。

实施例5、NS001免疫BALB/c小鼠血清中和试验

实验动物分组、免疫方案及血清获取方法均同实施例4。

以免疫前血清、AAV-GFP感染后血清为对照，以NS001血清组为测试组。将Vero E6细胞以2×10⁴细胞/孔接种到96孔板中，在37°C和5 % CO₂下培养过夜。第二天将血清样品在56°C加热30分钟灭活，并用含2%FBS的DMEM培养基进行4倍梯度稀释，形成一系列稀释梯度的待测血清。将100TCID50的SARS-CoV-2（毒株编号：2020XN4276，广东省疾病预防控制中心三级生物安全实验室提供并进行实验）分别与一系列连续4倍梯度稀释的待测血清混合，在37°C孵育1小时，随后加入培养中的Vero E6细胞。在每种测定中，感染了100TCID50 SARS-CoV-2的细胞为阳性质控孔，而0.1TCID50的病毒加入的细胞为阴性质控孔，在感染后第3天记录CPE（细胞病变效应）。第三天阳性质控孔出现病变，阴性质控孔无病变，该实验的适用性条件成立。观察计算各实验组病变孔，通过Reed-Muench法计算了完全抑制孔的50%CPE的用各组血清的中和效价。

如图4所示，中和试验显示中和抗体效价ND50为1/128，说明了NS001制剂可产生针对SARS-COV-2的中和抗体活性，并保护细胞免受SARS-CoV-2感染。体液免疫应答，具有强大的中和活性，并保护细胞免受SARS-CoV-2感染。

实施例6、NS002免疫BALB/c小鼠及免疫检测

实验动物分组、免疫方案、血清获取方法及免疫效果检测方法均同实施例4。

选取5只5-6周龄BALB/c小鼠进行免疫获取血清用于免疫效果的检测。同实施例4检测方法，将第30天小鼠血清免疫效果进行ELISA检测：

IgG和IgM 表达结果OD值柱状图，如图5a和图5b所示。相对于AAV-GFP对照组（OD_IgM平均值=0.211±0.020；OD_IgG平均值=0.230±0.018），本发明实施例NS002疫苗，NS002组稀释300倍血清IgG抗体的OD_IgG平均值为2.340±0.205，IgM抗体的OD_IgM平均值为1.794±0.045，IgG抗体和IgM抗体皆呈阳性，说明疫苗在小鼠体内诱导了强大的免疫应答。

实施例7、NS002免疫BALB/c小鼠血清中和试验

实验动物分组、免疫方案及血清获取方法均同实施例4。

同实施例5方法进行血清中和试验，结果如图6所示，中和试验显示中和抗体效价ND50为1/64，说明了NS002疫苗可产生体液免疫应答，具有强大的中和活性，并保护细胞免受SARS-CoV-2感染。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 广州派真生物技术有限公司

广州中医药大学

<120> SARS-COV-2抗原多肽及其重组腺相关病毒和在制备疫苗中的应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 263

<212> PRT

<213> 冠状病毒SARS-COV-2(Coronavirus)

<400> 1

Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg

1 5 10 15

Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val

20 25 30

Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys

35 40 45

Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn

50 55 60

Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile

65 70 75 80

Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro

85 90 95

Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp

100 105 110

Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys

115 120 125

Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln

130 135 140

Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe

145 150 155 160

Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln

165 170 175

Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala

180 185 190

Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys

195 200 205

Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu

210 215 220

Ser Asn Lys Lys Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala

225 230 235 240

Asp Thr Thr Asp Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp

245 250 255

Ile Thr Pro Cys Ser Phe Gly

260

<210> 2

<211> 223

<212> PRT

<213> 冠状病毒SARS-COV-2(Coronavirus)

<400> 2

Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn

1 5 10 15

Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val

20 25 30

Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser

35 40 45

Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val

50 55 60

Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp

65 70 75 80

Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln

85 90 95

Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr

100 105 110

Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly

115 120 125

Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys

130 135 140

Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr

145 150 155 160

Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser

165 170 175

Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val

180 185 190

Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly

195 200 205

Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe

210 215 220

<210> 3

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe Gly

1 5 10

<210> 4

<211> 5023

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120

aggggttcct gcggccattc ggtacaattc acgcgtcgac attgattatt gactagctct 180

ggtcgttaca taacttacgg taaatggccc gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc 240

attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca atagggactt tccattgacg 300

tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat 360

gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca 420

gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc tactcgaggc cacgttctgc 480

ttcactctcc ccatctcccc cccctcccca cccccaattt tgtatttatt tattttttaa 540

ttattttgtg cagcgatggg ggcggggggg gggggggggg gggcgcgcgc caggcggggc 600

ggggcggggc gaggggcggg gcggggcgag gcggagaggt gcggcggcag ccaatcagag 660

cggcgcgctc cgaaagtttc cttttatggc gaggcggcgg cggcggcggc cctataaaaa 720

gcgaagcgcg cggcgggcgg gagcgggatc agccaccgcg gtggcggccc tagagtcgat 780

cgaggaactg aaaaaccaga aagttaactg gtaagtttag tctttttgtc ttttatttca 840

ggtcccggat ccggtggtgg tgcaaatcaa agaactgctc ctcagtggat gttgccttta 900

cttctaggcc tgtacggaag tgttacttct gctctaaaag ctgcggaatt gtacccgcgg 960

ccgatccacc ggggtaccaa gcttgccacc atggactgga cctggatcct gttcctggtg 1020

gccgccgcta caagagtgca cagcaatatc accaacctgt gccccttcgg cgaagtgttc 1080

aacgccacaa gattcgcctc tgtgtacgcc tggaacagga agcggatctc taactgcgtc 1140

gccgactaca gcgtgctgta caacagcgcc agcttctcca cctttaagtg ttacggcgtg 1200

tcccctacca agctgaacga cctgtgcttc accaacgtgt acgccgattc tttcgtgatc 1260

agaggcgacg aggtgcggca gatcgcccct ggccagacag gaaagatcgc tgattacaac 1320

tacaagctgc cagacgactt caccggatgt gtgatcgcct ggaatagcaa caacctggac 1380

agcaaggtgg gcggcaacta taactacctg tatagactgt tcagaaagtc caacctgaaa 1440

cctttcgaga gagatatcag caccgagatc taccaggccg gatctacccc atgtaatggc 1500

gtggaaggat ttaattgcta cttccccctg cagagctacg gctttcagcc tacaaatggc 1560

gtgggctacc aaccttacag agtggtggtc ctgagcttcg agctgctgca cgcccctgct 1620

acagtgtgcg gccctaagaa aagcacaaac ctggtgaaga acaaatgcgt gaacttcaac 1680

ttcaacggcc tgaccggtac aggcgttctc accgagagca acaagaagtt cctgcccttc 1740

cagcagttcg gcagagacat tgctgacacc accgatgccg tgcgggaccc ccagaccctg 1800

gaaatcctgg atatcacacc ttgcagcttt ggctaggaat tccgctcgag ataatcaacc 1860

tctggattac aaaatttgtg aaagattgac tggtattctt aactatgttg ctccttttac 1920

gctatgtgga tacgctgctt taatgccttt gtatcatgct attgcttccc gtatggcttt 1980

cattttctcc tccttgtata aatcctggtt agttcttgcc acggcggaac tcatcgccgc 2040

ctgccttgcc cgctgctgga caggggctcg gctgttgggc actgacaatt ccgtggtgtt 2100

tatttgtgaa atttgtgatg ctattgcttt atttgtaacc atctagcttt atttgtgaaa 2160

tttgtgatgc tattgcttta tttgtaacca ttataagctg caataaacaa gttaacaaca 2220

acaattgcat tcattttatg tttcaggttc agggggagat gtgggaggtt ttttaaagcg 2280

gccgcaggaa cccctagtga tggagttggc cactccctct ctgcgcgctc gctcgctcac 2340

tgaggccggg cgaccaaagg tcgcccgacg cccgggcttt gcccgggcgg cctcagtgag 2400

cgagcgagcg cgcagctgcc tgcaggggcg cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct 2460

gtgcggtatt tcacaccgca tacgtcaaag caaccatagt acgcgccctg tagcggcgca 2520

ttaagcgcgg cgggtgtggt ggttacgcgc agcgtgaccg ctacacttgc cagcgcccta 2580

gcgcccgctc ctttcgcttt cttcccttcc tttctcgcca cgttcgccgg ctttccccgt 2640

caagctctaa atcgggggct ccctttaggg ttccgattta gtgctttacg gcacctcgac 2700

cccaaaaaac ttgatttggg tgatggttca cgtagtgggc catcgccctg atagacggtt 2760

tttcgccctt tgacgttgga gtccacgttc tttaatagtg gactcttgtt ccaaactgga 2820

acaacactca accctatctc gggctattct tttgatttat aagggatttt gccgatttcg 2880

gcctattggt taaaaaatga gctgatttaa caaaaattta acgcgaattt taacaaaata 2940

ttaacgttta caattttatg gtgcactctc agtacaatct gctctgatgc cgcatagtta 3000

agccagcccc gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct gacgggcttg tctgctcccg 3060

gcatccgctt acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct gcatgtgtca gaggttttca 3120

ccgtcatcac cgaaacgcgc gagacgaaag ggcctcgtga tacgcctatt tttataggtt 3180

aatgtcatga taataatggt ttcttagacg tcaggtggca cttttcgggg aaatgtgcgc 3240

ggaaccccta tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct catgagacaa 3300

taaccctgat aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat tcaacatttc 3360

cgtgtcgccc ttattccctt ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa 3420

acgctggtga aagtaaaaga tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg ttacatcgaa 3480

ctggatctca acagcggtaa gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg ttttccaatg 3540

atgagcactt ttaaagttct gctatgtggc gcggtattat cccgtattga cgccgggcaa 3600

gagcaactcg gtcgccgcat acactattct cagaatgact tggttgagta ctcaccagtc 3660

acagaaaagc atcttacgga tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc tgccataacc 3720

atgagtgata acactgcggc caacttactt ctgacaacga tcggaggacc gaaggagcta 3780

accgcttttt tgcacaacat gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg ggaaccggag 3840

ctgaatgaag ccataccaaa cgacgagcgt gacaccacga tgcctgtagc aatggcaaca 3900

acgttgcgca aactattaac tggcgaacta cttactctag cttcccggca acaattaata 3960

gactggatgg aggcggataa agttgcagga ccacttctgc gctcggccct tccggctggc 4020

tggtttattg ctgataaatc tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggtat cattgcagca 4080

ctggggccag atggtaagcc ctcccgtatc gtagttatct acacgacggg gagtcaggca 4140

actatggatg aacgaaatag acagatcgct gagataggtg cctcactgat taagcattgg 4200

taactgtcag accaagttta ctcatatata ctttagattg atttaaaact tcatttttaa 4260

tttaaaagga tctaggtgaa gatccttttt gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt 4320

gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat 4380

cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg 4440

gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga 4500

gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg tagccgtagt taggccacca cttcaagaac 4560

tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt 4620

ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag 4680

cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac gacctacacc 4740

gaactgagat acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag 4800

gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca 4860

gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt 4920

cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc 4980

tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca tgt 5023

<210> 5

<211> 4903

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120

aggggttcct gcggccattc ggtacaattc acgcgtcgac attgattatt gactagctct 180

ggtcgttaca taacttacgg taaatggccc gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc 240

attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca atagggactt tccattgacg 300

tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat 360

gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca 420

gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc tactcgaggc cacgttctgc 480

ttcactctcc ccatctcccc cccctcccca cccccaattt tgtatttatt tattttttaa 540

ttattttgtg cagcgatggg ggcggggggg gggggggggg gggcgcgcgc caggcggggc 600

ggggcggggc gaggggcggg gcggggcgag gcggagaggt gcggcggcag ccaatcagag 660

cggcgcgctc cgaaagtttc cttttatggc gaggcggcgg cggcggcggc cctataaaaa 720

gcgaagcgcg cggcgggcgg gagcgggatc agccaccgcg gtggcggccc tagagtcgat 780

cgaggaactg aaaaaccaga aagttaactg gtaagtttag tctttttgtc ttttatttca 840

ggtcccggat ccggtggtgg tgcaaatcaa agaactgctc ctcagtggat gttgccttta 900

cttctaggcc tgtacggaag tgttacttct gctctaaaag ctgcggaatt gtacccgcgg 960

ccgatccacc ggggtaccaa gcttgccacc atggactgga cctggatcct gttcctggtg 1020

gccgccgcta caagagtgca cagccgcgtg cagcccaccg agagcatcgt gcggtttcca 1080

aacatcacca atctctgtcc tttcggcgag gtctttaacg ccaccagatt cgccagcgtg 1140

tacgcctgga atagaaaaag aatcagcaat tgcgtggccg actacagcgt gctgtacaac 1200

tccgcctctt tcagcacatt caagtgctac ggcgtgtccc ctacaaagct gaacgacctg 1260

tgcttcacca acgtgtacgc tgatagcttc gtgattagag gagatgaggt gcggcagatc 1320

gctcctggcc agacaggcaa gatcgccgat tacaactaca agctgcctga cgacttcacc 1380

ggctgtgtga tcgcctggaa ctctaacaac ctggacagca aggtgggcgg aaattacaac 1440

tacctgtata gactgttcag aaagtccaac ctgaagccct tcgaacggga catctctaca 1500

gaaatctacc aggccggcag caccccttgt aatggcgtgg aaggcttcaa ctgctacttc 1560

cccctgcaga gctacggctt tcagcctacc aacggcgttg gatatcaacc atacagagtg 1620

gtggtcctga gctttgagct gctgcacgcc cctgctacag tgtgcggccc caagaaaagc 1680

accaacctgg tgaagaacaa atgcgtgaac ttctaggaat tccgctcgag ataatcaacc 1740

tctggattac aaaatttgtg aaagattgac tggtattctt aactatgttg ctccttttac 1800

gctatgtgga tacgctgctt taatgccttt gtatcatgct attgcttccc gtatggcttt 1860

cattttctcc tccttgtata aatcctggtt agttcttgcc acggcggaac tcatcgccgc 1920

ctgccttgcc cgctgctgga caggggctcg gctgttgggc actgacaatt ccgtggtgtt 1980

tatttgtgaa atttgtgatg ctattgcttt atttgtaacc atctagcttt atttgtgaaa 2040

tttgtgatgc tattgcttta tttgtaacca ttataagctg caataaacaa gttaacaaca 2100

acaattgcat tcattttatg tttcaggttc agggggagat gtgggaggtt ttttaaagcg 2160

gccgcaggaa cccctagtga tggagttggc cactccctct ctgcgcgctc gctcgctcac 2220

tgaggccggg cgaccaaagg tcgcccgacg cccgggcttt gcccgggcgg cctcagtgag 2280

cgagcgagcg cgcagctgcc tgcaggggcg cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct 2340

gtgcggtatt tcacaccgca tacgtcaaag caaccatagt acgcgccctg tagcggcgca 2400

ttaagcgcgg cgggtgtggt ggttacgcgc agcgtgaccg ctacacttgc cagcgcccta 2460

gcgcccgctc ctttcgcttt cttcccttcc tttctcgcca cgttcgccgg ctttccccgt 2520

caagctctaa atcgggggct ccctttaggg ttccgattta gtgctttacg gcacctcgac 2580

cccaaaaaac ttgatttggg tgatggttca cgtagtgggc catcgccctg atagacggtt 2640

tttcgccctt tgacgttgga gtccacgttc tttaatagtg gactcttgtt ccaaactgga 2700

acaacactca accctatctc gggctattct tttgatttat aagggatttt gccgatttcg 2760

gcctattggt taaaaaatga gctgatttaa caaaaattta acgcgaattt taacaaaata 2820

ttaacgttta caattttatg gtgcactctc agtacaatct gctctgatgc cgcatagtta 2880

agccagcccc gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct gacgggcttg tctgctcccg 2940

gcatccgctt acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct gcatgtgtca gaggttttca 3000

ccgtcatcac cgaaacgcgc gagacgaaag ggcctcgtga tacgcctatt tttataggtt 3060

aatgtcatga taataatggt ttcttagacg tcaggtggca cttttcgggg aaatgtgcgc 3120

ggaaccccta tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct catgagacaa 3180

taaccctgat aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat tcaacatttc 3240

cgtgtcgccc ttattccctt ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa 3300

acgctggtga aagtaaaaga tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg ttacatcgaa 3360

ctggatctca acagcggtaa gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg ttttccaatg 3420

atgagcactt ttaaagttct gctatgtggc gcggtattat cccgtattga cgccgggcaa 3480

gagcaactcg gtcgccgcat acactattct cagaatgact tggttgagta ctcaccagtc 3540

acagaaaagc atcttacgga tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc tgccataacc 3600

atgagtgata acactgcggc caacttactt ctgacaacga tcggaggacc gaaggagcta 3660

accgcttttt tgcacaacat gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg ggaaccggag 3720

ctgaatgaag ccataccaaa cgacgagcgt gacaccacga tgcctgtagc aatggcaaca 3780

acgttgcgca aactattaac tggcgaacta cttactctag cttcccggca acaattaata 3840

gactggatgg aggcggataa agttgcagga ccacttctgc gctcggccct tccggctggc 3900

tggtttattg ctgataaatc tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggtat cattgcagca 3960

ctggggccag atggtaagcc ctcccgtatc gtagttatct acacgacggg gagtcaggca 4020

actatggatg aacgaaatag acagatcgct gagataggtg cctcactgat taagcattgg 4080

taactgtcag accaagttta ctcatatata ctttagattg atttaaaact tcatttttaa 4140

tttaaaagga tctaggtgaa gatccttttt gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt 4200

gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat 4260

cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg 4320

gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga 4380

gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg tagccgtagt taggccacca cttcaagaac 4440

tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt 4500

ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag 4560

cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac gacctacacc 4620

gaactgagat acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag 4680

gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca 4740

gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt 4800

cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc 4860

tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca tgt 4903

Claims

1.SARS-COV-2抗原多肽，其特征在于，所述抗原多肽的氨基酸序列如SEQ. ID. NO.1所示。

2.编码权利要求1所述抗原多肽的核酸。

3.表达权利要求1所述抗原多肽的表达载体。

4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于：含有腺相关病毒反向末端重复序列、编码信号肽的核苷酸序列，以及编码权利要求1所述抗原多肽的核苷酸序列。

5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于：所述编码抗原多肽的核苷酸序列经过人源密码子优化。

6.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于：所述的腺相关病毒反向末端重复序列来自血清型AAV2。

7.一种表达权利要求1所述抗原多肽的重组腺相关病毒。

8.一种表达权利要求1所述抗原多肽的重组腺相关病毒的制备方法，其特征在于：

将pHelper、pRep2Cap5和权利要求3-6任一项所述的表达载体共孵育，在转染试剂聚乙烯亚胺存在的条件下转染细胞，培育细胞后，离心收集细胞，经过裂解和纯化，得到含有重组腺相关病毒的纯化液。

9.权利要求7所述的重组腺相关病毒在制备预防COVID-19新型冠状病毒肺炎疫苗中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述的疫苗还包含药学上可接受的稀释剂和/或赋形剂。