CN112359063A - 新冠重组rbd蛋白在昆虫细胞中的生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了新冠重组RBD蛋白在昆虫细胞中的生产方法，具体包括如下步骤：载体构建，DH10Bac感受态细胞制备，转座以及杆粒的抽提与验证。该新冠重组RBD蛋白在昆虫细胞中的生产方法，通过构建RBD重组质粒时，未加任何标签，因此后期蛋白表达时不会有任何氨基酸残留，从而减少了其他氨基酸残基对后期该蛋白的研究造成的干扰，使用昆虫HF细胞代替昆虫SF9细胞，可以在一定程度上增加了该蛋白的分泌表达质量，在最终放大过程中，48h后立即收集细胞上清进行纯化，缩短了收样时间，纯化时在上清中添加蛋白酶抑制剂且全程低温操作，大大减少了该蛋白的降解可能性，使用Biacore检测目的蛋白活性，确保了目的蛋白活性。

Description

新冠重组RBD蛋白在昆虫细胞中的生产方法
技术领域
本发明涉及重组RBD蛋白生产技术领域，具体为新冠重组RBD蛋白在昆虫细胞中的生产方法。
背景技术
2019新型冠状病毒，2020年1月12日，世界卫生组织正式将其命名为2019-nCoV。冠状病毒是一个大型病毒家族，已知可引起感冒以及中东呼吸综合征和严重急性呼吸综合征等较严重疾病。新型冠状病毒是以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株。中东呼吸综合征冠状病毒是2012年出现的新型冠状病毒，该病毒能够引发严重的人类呼吸系统的疾病，其致死率高达36％，目前还没有针对该病毒特异性治疗的药物和手段。MERS-CoV通过表面刺突蛋白识别并结合受体DPP4，其表面刺突蛋白N端S1亚基上的受体识别结合域主要负责与受体的结合。
利用昆虫细胞表达2019-nCoV的棘突蛋白受体结合结构域的重组杆状病毒2019-nCoV RBD，为2019-nCoV免疫抗体的制备和体外检测及后续疫苗的研究开发奠定了基础，本发明提供了新冠重组RBD蛋白在昆虫细胞中的生产方法，解决了重组RBD蛋白在昆虫细胞中进行生产的过程中其他氨基酸残基对后期该蛋白的研究造成干扰以及蛋白的降解程度和蛋白的活性问题。
发明内容
(一解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了新冠重组RBD蛋白在昆虫细胞中的生产方法，解决了重组RBD蛋白在昆虫细胞中进行生产的过程中其他氨基酸残基对后期该蛋白的研究造成干扰以及蛋白的降解程度和蛋白的活性问题。
(二技术方案
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：新冠重组RBD蛋白在昆虫细胞中的生产方法，具体包括如下步骤：
步骤一、载体构建：密码子优化后通过基因合成技术将重组RBD基因亚克隆克隆到pFastbac1中；
步骤二、DH10Bac感受态细胞制备：取DH10Bac菌株，对DH10Bac菌株平板划线至双抗LB平板中，双抗LB平板中含有浓度为50μg/mg K和10μg/mg T；
步骤三、转座：准备含三抗显色LB平板，其中三抗显色LB平板中含有50μg/mgkanamycin sulfate、10μg/mg tetracycline hydrochloride、7μg/mg gentamicinsulphate、40μg/mg IPTG与100μg/mg X-Gal，将三抗显色LB平板转座至DH10Bac感受态中，进行蓝白斑筛选，PCR技术筛选出阳性单克隆菌落后制备Bacmid质粒；
步骤四、杆粒的抽提与验证：在无菌的24孔摇菌板中加入4mL三抗LB培养基，在培养后的三抗显色板中挑取白色单克隆菌落数个分别放入摇菌板中，在温度为37℃转速为220rpm的条件下培养过夜，拿出摇菌板，取2mL的培养物分别加至2.0mL离心管中，向离心管中加入50μL无菌ddH2O，充分溶解沉淀，即为昆虫杆状病毒质粒溶液，简称杆粒，得到新冠重组RBD蛋白。
优选的，所述RBD基因表达的序列：
MKLCILLAVVAFVGLSLGRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTN*。
优选的，所述DH10Bac感受态细胞制备的具体步骤如下：将双抗LB平板放置在温度为37℃条件下培养过夜，取3支含4mL无菌LB的试管，向3支试管中统一加入终浓度50μg/mgkanamycin sulfate、10μg/mg tetracycline hydrochloride，分别将3支试管内部的溶液进行混匀，挑取3个单克隆分别转接至3支试管中，对3支试管均放置在温度为37℃转速为220rpm的条件下培养过夜，取1个含400mL无菌LB的三角瓶，向三角瓶中加入终浓度50μL/mgkanamycin sulfate、10μL/mg tetracycline hydrochloride，混匀，取出3支试管培养物，比较每支长势，取1支长势正常的培养物，全部接种至三角瓶中，在温度为37℃转速为220rpm的条件下培养至OD600＝0.4-0.6，立即将三角瓶放入冰水混合物中静置30min，以停止细菌的生长，对离心机进行预冷至4℃，在温度为4℃转速为3000rpm的条件下离心10min，弃上清，加100mL预冷的0.2M CaCl2重悬沉淀，立即放入冰水混合物中静置30min，接着重复上一步骤一次，离心机预冷至4℃，在温度为4℃转速为3000rpm的条件下离心10min，弃上清，加10mL预冷的感受态储存液0.2M CaCl2和20％Glycerol，在重悬沉淀后分装至预冷的无菌1.5mL离心管中，在100μL/vial，-80℃条件下保存待用。
优选的，所述转座具体步骤如下：从超低温冰箱中取出DH10Bac菌株感受态细胞置于冰上融化，取2μL重组质粒加至感受态细胞中，轻柔混匀，冰浴30min，热激90s，再冰浴5min，加入500μL LB混匀后，37℃220rpm培养1h，取100μL培养物涂布于三抗显色LB平板中，37℃正置培养30min后，37℃倒置培养48h，转座至DH10Bac感受态中，进行蓝白斑筛选，PCR技术筛选出阳性单克隆菌落后制备Bacmid质粒。
优选的，所述杆粒的抽提与验证具体步骤如下：拿出摇菌板，取2mL的培养物分别加至2.0mL离心管中，在转速为12000rpm的条件下离心5min，弃去上清，加入250μL S1重悬沉淀，S1在使用前加入适量的RNase A，加入250μL S2轻柔混匀，再加入300μL S3混匀，在温度为4℃转速为12000rpm的条件下离心5min，吸取全部上清加入至1.5mL离心管，在转速为12000rpm的条件下离心5min，吸取500μL上清加入至新的1.5mL离心管，向离心管中加入500μL异丙醇剧烈震荡，在转速为12000rpm的条件下离心10min，弃去上清，向离心管中加入1mL75％乙醇剧烈震荡，在转速为12000rpm的条件下离心5min，弃去上清，向离心管中加入1mL75％乙醇剧烈震荡，将离心管拿到细胞房内，在转速为12000rpm的条件下离心5min，无菌操作台中弃去上清，在转速为12000rpm的条件下离心2min，无菌操作台中再次弃去上清后，在无菌操作台中风干多余的乙醇，向离心管中加入50μL无菌ddH2O，充分溶解沉淀，即为昆虫杆状病毒质粒溶液，简称杆粒。
优选的，所述杆粒的处理方法包括如下步骤：取出10μL杆粒加至新的1.5mL离心管，并将离心管拿出细胞房，用Nanodrop ONE测定杆粒浓度，并记录浓度与A260/A280，合成引物A，并将引物A稀释至10μM待用，将杆粒稀释至约100ng/μL，配制总体积25μL的PCR反应体系待用，将反应体系放入PCR仪中，设置反应程序进行实验，采用1％琼脂糖凝胶电泳检测，挑选2个结果最好的杆粒待用。
P1病毒生产及检测方法：取2mL密度为0.5×106/mL的SF9细胞接种至六孔板中，27℃静置使细胞贴壁，将足量的质粒与转染试剂充分反应后，用培养基补至1mL混匀，再轻轻加至SF9细胞中，在27℃静置培养至细胞出现病毒感染迹象。将其余培养物离心后转移至无菌2.0mL EP管中，作为P1病毒需置于4℃避光保存，并用Western Blot检测表达情况。
P2病毒扩增及纯化测试方法：首先进行P2病毒扩增，取30mL密度为2.0×106/mL的SF9细胞接种至250mL三角瓶中，再向三角瓶中加入适量的P1病毒以扩增P2病毒，27℃120rpm培养4天，接着进行纯化尝试，将培养物收集离心，将含病毒的上清液转移到另一个无菌50mL管中，取5mL进行离子交换层析测试并利用SDS-PAGE与Western Blot检测纯化情况，其余上清作为P2病毒置于4℃避光保存。
细胞放大纯化的方法：取200mL密度为2.0×106/mL的SF9细胞接种至1L三角瓶中，再向三角瓶中加入适量的P2病毒以放大表达，27℃120rpm培养2天，将培养物移至离心杯中，离心后取全部上清进行离子交换层析并利用SDS-PAGE检测纯化情况。
对重组RBD蛋白进行活性测定：采用Biacore检测目的蛋白活性。
(三有益效果
本发明提供了新冠重组RBD蛋白在昆虫细胞中的生产方法。与现有技术相比具备以下有益效果：
该新冠重组RBD蛋白在昆虫细胞中的生产方法，通过构建RBD重组质粒时，未加任何标签，因此后期蛋白表达时不会有任何氨基酸残留，从而减少了其他氨基酸残基对后期该蛋白的研究造成的干扰，在最终放大过程中，使用昆虫HF细胞代替昆虫SF9细胞，可以在一定程度上增加了该蛋白的分泌表达质量，在最终放大过程中，48h后立即收集细胞上清进行纯化，缩短了收样时间，纯化时在上清中添加蛋白酶抑制剂且全程低温操作，大大减少了该蛋白的降解可能性，使用Biacore检测目的蛋白活性，确保了目的蛋白活性。
附图说明
图1为本发明引物A序列的示意图；
图2为本发明PCR反应体系的示意图；
图3为本发明PCR反应程序的示意图；
图4为本发明重组RBD Biacore检测的方法图；
图5为本发明重组RBD Biacore检测的数据图；
图6为本发明重组RBD Biacore检测结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1-6所示，本发明提供一种技术方案：新冠重组RBD蛋白在昆虫细胞中的生产方法，具体包括如下步骤：
步骤一、载体构建：密码子优化后通过基因合成技术将重组RBD基因亚克隆克隆到pFastbac1中；
步骤二、DH10Bac感受态细胞制备：取DH10Bac菌株，对DH10Bac菌株平板划线至双抗LB平板中，将双抗LB平板放置在温度为37℃条件下培养过夜，取3支含4mL无菌LB的试管，向3支试管中统一加入终浓度50μg/mg kanamycin sulfate、10μg/mg tetracyclinehydrochloride，分别将3支试管内部的溶液进行混匀，挑取3个单克隆分别转接至3支试管中，对3支试管均放置在温度为37℃转速为220rpm的条件下培养过夜，取1个含400mL无菌LB的三角瓶，向三角瓶中加入终浓度50μL/mg kanamycin sulfate、10μL/mg tetracyclinehydrochloride，混匀，取出3支试管培养物，比较每支长势，取1支长势正常的培养物，全部接种至三角瓶中，在温度为37℃转速为220rpm的条件下培养至OD600＝0.4-0.6，立即将三角瓶放入冰水混合物中静置30min，以停止细菌的生长；
步骤三、转座：准备含三抗显色LB平板，其中三抗显色LB平板中含有50μg/mgkanamycin sulfate、10μg/mg tetracycline hydrochloride、7μg/mg gentamicinsulphate、40μg/mg IPTG与100μg/mg X-Gal，从超低温冰箱中取出DH10Bac菌株感受态细胞置于冰上融化，取2μL重组质粒加至感受态细胞中，轻柔混匀，冰浴30min，热激90s，再冰浴5min，加入500μL LB混匀后，37℃220rpm培养1h，取100μL培养物涂布于三抗显色LB平板中，37℃正置培养30min后，37℃倒置培养48h，转座至DH10Bac感受态中，进行蓝白斑筛选，PCR技术筛选出阳性单克隆菌落后制备Bacmid质粒；
步骤四、杆粒的抽提与验证：在无菌的24孔摇菌板中加入4mL三抗LB培养基，在培养后的三抗显色板中挑取白色单克隆菌落数个分别放入摇菌板中，在温度为37℃转速为220rpm的条件下培养过夜，拿出摇菌板，取2mL的培养物分别加至2.0mL离心管中，在转速为12000rpm的条件下离心5min，弃去上清，加入250μL S1重悬沉淀，S1在使用前加入适量的RNase A，加入250μL S2轻柔混匀，再加入300μL S3混匀，在温度为4℃转速为12000rpm的条件下离心5min，吸取全部上清加入至1.5mL离心管，在转速为12000rpm的条件下离心5min，吸取500μL上清加入至新的1.5mL离心管，向离心管中加入500μL异丙醇剧烈震荡，在转速为12000rpm的条件下离心10min，弃去上清，向离心管中加入1mL 75％乙醇剧烈震荡，在转速为12000rpm的条件下离心5min，弃去上清，向离心管中加入1mL 75％乙醇剧烈震荡，将离心管拿到细胞房内，在转速为12000rpm的条件下离心5min，无菌操作台中弃去上清，在转速为12000rpm的条件下离心2min，无菌操作台中再次弃去上清后，在无菌操作台中风干多余的乙醇，向离心管中加入50μL无菌ddH2O，充分溶解沉淀，即为昆虫杆状病毒质粒溶液，简称杆粒，取出10μL杆粒加至新的1.5mL离心管，并将离心管拿出细胞房，用Nanodrop ONE测定杆粒浓度，并记录浓度与A260/A280，合成引物A，并将引物A稀释至10μM待用，将杆粒稀释至约100ng/μL，配制总体积25μL的PCR反应体系待用，将反应体系放入PCR仪中，设置反应程序进行实验，采用1％琼脂糖凝胶电泳检测，挑选2个结果最好的杆粒待用。
RBD基因表达的序列：
MKLCILLAVVAFVGLSLGRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTN*。
P1病毒生产及检测方法：取2mL密度为0.5×106/mL的SF9细胞接种至六孔板中，27℃静置使细胞贴壁，将足量的质粒与转染试剂充分反应后，用培养基补至1mL混匀，再轻轻加至SF9细胞中，在27℃静置培养至细胞出现病毒感染迹象。将其余培养物离心后转移至无菌2.0mL EP管中，作为P1病毒需置于4℃避光保存，并用Western Blot检测表达情况。
P2病毒扩增及纯化测试方法：首先进行P2病毒扩增，取30mL密度为2.0×106/mL的SF9细胞接种至250mL三角瓶中，再向三角瓶中加入适量的P1病毒以扩增P2病毒，27℃120rpm培养4天，接着进行纯化尝试，将培养物收集离心，将含病毒的上清液转移到另一个无菌50mL管中，取5mL进行离子交换层析测试并利用SDS-PAGE与Western Blot检测纯化情况，其余上清作为P2病毒置于4℃避光保存。
细胞放大纯化的方法：取200mL密度为2.0×106/mL的SF9细胞接种至1L三角瓶中，再向三角瓶中加入适量的P2病毒以放大表达，27℃120rpm培养2天，将培养物移至离心杯中，离心后取全部上清进行离子交换层析并利用SDS-PAGE检测纯化情况。
请参阅图4、图5和图6，对重组RBD蛋白进行活性测定：采用Biacore检测目的蛋白活性。
同时本说明书中未作详细描述的内容均属于本领域技术人员公知的现有技术。
工作原理，新冠重组RBD蛋白在昆虫细胞中的生产首先通过载体构建，密码子优化后通过基因合成技术将重组RBD基因亚克隆克隆到pFastbac1中，接着进行DH10Bac感受态细胞制备，取DH10Bac菌株，对DH10Bac菌株平板划线至双抗LB平板中，将双抗LB平板放置在温度为37℃条件下培养过夜，取3支含4mL无菌LB的试管，向3支试管中统一加入终浓度50μg/mg kanamycin sulfate、10μg/mg tetracycline hydrochloride，分别将3支试管内部的溶液进行混匀，挑取3个单克隆分别转接至3支试管中，对3支试管均放置在温度为37℃转速为220rpm的条件下培养过夜，取1个含400mL无菌LB的三角瓶，向三角瓶中加入终浓度50μL/mg kanamycin sulfate、10μL/mg tetracycline hydrochloride，混匀，取出3支试管培养物，比较每支长势，取1支长势正常的培养物，全部接种至三角瓶中，在温度为37℃转速为220rpm的条件下培养至OD600＝0.4-0.6，立即将三角瓶放入冰水混合物中静置30min，以停止细菌的生长，进行转座，准备含三抗显色LB平板，其中三抗显色LB平板中含有50μg/mgkanamycin sulfate、10μg/mg tetracycline hydrochloride、7μg/mg G、40μg/mg I与100μg/mg X-Gal，从超低温冰箱中取出DH10Bac菌株感受态细胞置于冰上融化，取2μL重组质粒加至感受态细胞中，轻柔混匀，冰浴30min，热激90s，再冰浴5min，加入500μL LB混匀后，37℃220rpm培养1h，取100μL培养物涂布于三抗显色LB平板中，37℃正置培养30min后，37℃倒置培养48h，转座至DH10Bac感受态中，进行蓝白斑筛选，PCR技术筛选出阳性单克隆菌落后制备Bacmid质粒，最后进行杆粒的抽提与验证，在无菌的24孔摇菌板中加入4mL三抗LB培养基，在培养后的三抗显色板中挑取白色单克隆菌落数个分别放入摇菌板中，在温度为37℃转速为220rpm的条件下培养过夜，拿出摇菌板，取2mL的培养物分别加至2.0mL离心管中，在转速为12000rpm的条件下离心5min，弃去上清，加入250μL S1重悬沉淀，S1在使用前加入适量的RNase A，加入250μL S2轻柔混匀，再加入300μL S3混匀，在温度为4℃转速为12000rpm的条件下离心5min，吸取全部上清加入至1.5mL离心管，在转速为12000rpm的条件下离心5min，吸取500μL上清加入至新的1.5mL离心管，向离心管中加入500μL异丙醇剧烈震荡，在转速为12000rpm的条件下离心10min，弃去上清，向离心管中加入1mL 75％乙醇剧烈震荡，在转速为12000rpm的条件下离心5min，弃去上清，向离心管中加入1mL 75％乙醇剧烈震荡，将离心管拿到细胞房内，在转速为12000rpm的条件下离心5min，无菌操作台中弃去上清，在转速为12000rpm的条件下离心2min，无菌操作台中再次弃去上清后，在无菌操作台中风干多余的乙醇，向离心管中加入50μL无菌ddH2O，充分溶解沉淀，即为昆虫杆状病毒质粒溶液，简称杆粒，取出10μL杆粒加至新的1.5mL离心管，并将离心管拿出细胞房，用Nanodrop ONE测定杆粒浓度，并记录浓度与A260/A280，合成引物A，并将引物A稀释至10μM待用，将杆粒稀释至约100ng/μL，配制总体积25μL的PCR反应体系待用，将反应体系放入PCR仪中，设置反应程序进行实验，采用1％琼脂糖凝胶电泳检测，挑选2个结果最好的杆粒待用。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
序列表
<110> 安徽环球基因科技有限公司
<120> 新冠重组RBD蛋白在昆虫细胞中的生产方法
<140> 202011216438.5
<141> 2020-11-04
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 232
<212> PRT
<213> 新冠病毒(2019-nCoV sp.)
<400> 1
Met Lys Leu Cys Ile Leu Leu Ala Val Val Ala Phe Val Gly Leu Ser
1 5 10 15
Leu Gly Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile
20 25 30
Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala
35 40 45
Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp
50 55 60
Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr
65 70 75 80
Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr
85 90 95
Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro
100 105 110
Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp
115 120 125
Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys
130 135 140
Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn
145 150 155 160
Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly
165 170 175
Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu
180 185 190
Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr
195 200 205
Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val
210 215 220
Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn
225 230

Claims (6)

1.新冠重组RBD蛋白在昆虫细胞中的生产方法，其特征在于：具体包括如下步骤：
步骤一、载体构建：密码子优化后通过基因合成技术将重组RBD基因亚克隆克隆到pFastbac1中；
步骤二、DH10Bac感受态细胞制备：取DH10Bac菌株，对DH10Bac菌株平板划线至双抗LB平板中，双抗LB平板中含有浓度为50μg/mg kanamycin sulfate和10μg/mg tetracyclinehydrochloride；
步骤三、转座：准备含三抗显色LB平板，其中三抗显色LB平板中含有50μg/mgkanamycin sulfate、10μg/mg tetracycline hydrochloride、7μg/mg gentamicinsulphate、40μg/mg IPTG与100μg/mg X-Gal，将三抗显色LB平板转座至DH10Bac感受态中，进行蓝白斑筛选，PCR技术筛选出阳性单克隆菌落后制备Bacmid质粒；
步骤四、杆粒的抽提与验证：在无菌的24孔摇菌板中加入4mL三抗LB培养基，在培养后的三抗显色板中挑取白色单克隆菌落数个分别放入摇菌板中，在温度为37℃转速为220rpm的条件下培养过夜，拿出摇菌板，取2mL的培养物分别加至2.0mL离心管中，向离心管中加入50μL无菌ddH2O，充分溶解沉淀，即为昆虫杆状病毒质粒溶液，简称杆粒，得到新冠重组RBD蛋白。
2.根据权利要求1所述的新冠重组RBD蛋白在昆虫细胞中的生产方法，其特征在于：所述RBD基因表达的序列：
MKLCILLAVVAFVGLSLGRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTN*。
3.根据权利要求1所述的新冠重组RBD蛋白在昆虫细胞中的生产方法，其特征在于：所述DH10Bac感受态细胞制备的具体步骤如下：将双抗LB平板放置在温度为37℃条件下培养过夜，取3支含4mL无菌LB的试管，向3支试管中统一加入终浓度50μg/mg kanamycinsulfate、10μg/mg tetracycline hydrochloride，分别将3支试管内部的溶液进行混匀，挑取3个单克隆分别转接至3支试管中，对3支试管均放置在温度为37℃转速为220rpm的条件下培养过夜，取1个含400mL无菌LB的三角瓶，向三角瓶中加入终浓度50μL/mg kanamycinsulfate、10μL/mg tetracycline hydrochloride，混匀，取出3支试管培养物，比较每支长势，取1支长势正常的培养物，全部接种至三角瓶中，在温度为37℃转速为220rpm的条件下培养至OD600＝0.4-0.6，立即将三角瓶放入冰水混合物中静置30min，以停止细菌的生长，对离心机进行预冷至4℃，在温度为4℃转速为3000rpm的条件下离心10min，弃上清，加100mL预冷的0.2M CaCl2重悬沉淀，立即放入冰水混合物中静置30min，接着重复上一步骤一次，离心机预冷至4℃，在温度为4℃转速为3000rpm的条件下离心10min，弃上清，加10mL预冷的感受态储存液0.2M CaCl2和20％Glycerol，在重悬沉淀后分装至预冷的无菌1.5mL离心管中，在100μL/vial，-80℃条件下保存待用。
4.根据权利要求1所述的新冠重组RBD蛋白在昆虫细胞中的生产方法，其特征在于：所述转座具体步骤如下：从超低温冰箱中取出DH10Bac菌株感受态细胞置于冰上融化，取2μL重组质粒加至感受态细胞中，轻柔混匀，冰浴30min，热激90s，再冰浴5min，加入500μL LB混匀后，37℃220rpm培养1h，取100μL培养物涂布于三抗显色LB平板中，37℃正置培养30min后，37℃倒置培养48h，转座至DH10Bac感受态中，进行蓝白斑筛选，PCR技术筛选出阳性单克隆菌落后制备Bacmid质粒。
5.根据权利要求1所述的新冠重组RBD蛋白在昆虫细胞中的生产方法，其特征在于：所述杆粒的抽提与验证具体步骤如下：拿出摇菌板，取2mL的培养物分别加至2.0mL离心管中，在转速为12000rpm的条件下离心5min，弃去上清，加入250μL S1重悬沉淀，S1在使用前加入适量的RNase A，加入250μL S2轻柔混匀，再加入300μL S3混匀，在温度为4℃转速为12000rpm的条件下离心5min，吸取全部上清加入至1.5mL离心管，在转速为12000rpm的条件下离心5min，吸取500μL上清加入至新的1.5mL离心管，向离心管中加入500μL异丙醇剧烈震荡，在转速为12000rpm的条件下离心10min，弃去上清，向离心管中加入1mL 75％乙醇剧烈震荡，在转速为12000rpm的条件下离心5min，弃去上清，向离心管中加入1mL 75％乙醇剧烈震荡，将离心管拿到细胞房内，在转速为12000rpm的条件下离心5min，无菌操作台中弃去上清，在转速为12000rpm的条件下离心2min，无菌操作台中再次弃去上清后，在无菌操作台中风干多余的乙醇，向离心管中加入50μL无菌ddH2O，充分溶解沉淀，即为昆虫杆状病毒质粒溶液，简称杆粒。
6.根据权利要求1所述的新冠重组RBD蛋白在昆虫细胞中的生产方法，其特征在于：所述杆粒的处理方法包括如下步骤：取出10μL杆粒加至新的1.5mL离心管，并将离心管拿出细胞房，用Nanodrop ONE测定杆粒浓度，并记录浓度与A260/A280，合成引物A，并将引物A稀释至10μM待用，将杆粒稀释至约100ng/μL，配制总体积25μL的PCR反应体系待用，将反应体系放入PCR仪中，设置反应程序进行实验，采用1％琼脂糖凝胶电泳检测，挑选2个结果最好的杆粒待用。
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