CN112710845B

CN112710845B - 用于检测新冠状病毒中和抗体的试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN112710845B
Application number: CN202011487826.7A
Authority: CN
Inventors: 闵微; 李艳召; 高琦; 徐磊; 郄霜; 张军; 柳晓利; 余韶华; 孙志伟; 林长青
Original assignee: Beijing Keygen Gene Technology Co ltd; Beijing Hotgen Biotech Co ltd
Current assignee: Beijing Keygen Gene Technology Co ltd; Beijing Hotgen Biotech Co ltd
Priority date: 2020-12-16
Filing date: 2020-12-16
Publication date: 2023-07-07
Anticipated expiration: 2040-12-16
Also published as: CN112710845A

Abstract

本发明涉及抗体检测领域，具体涉及一种用于检测新冠状病毒中和抗体的试剂盒及检测方法，包括竞争法试剂盒和双夹心法试剂盒。竞争法试剂盒包括含有上转换发光颗粒标记的重组S‑RBD‑C抗原的检测卡，双夹心法试剂盒包含内含有上转换发光颗粒标记的重组S‑RBD‑C抗原或上转发光颗粒标记的S1抗原的检测卡，重组S‑RBD‑C抗原中含有至少一段附加氨基酸序列，用于与S‑RBD抗原中的游离的半胱氨酸形成二硫键。本发明可对接种新型冠状病毒疫苗后的受试者或感染新型冠状病毒后人体内的中和抗体进行检测，并可进行定量评价，操作简单，准确率高。

Description

用于检测新冠状病毒中和抗体的试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及抗体检测领域，具体涉及一种用于检测新冠状病毒中和抗体的试剂盒及检测方法。

背景技术

上转换发光材料(UCP颗粒)是由稀土金属元素掺杂于晶体的晶格中构成的，具有三种主要的成分：主基质(host matrix)、吸收子(absorber)和发射子(emitter)。作为主基质的晶体材料有：氧硫化物(如Y₂O₂S、GdO₂S、La₂O₂S等)、氟化物(如YF₃、GdF₃、LaF₃等)、镓酸盐(如YGaO₃、Y₃Ga₅O₁₂等)以及硅酸盐(如YSi₂O₅、YSi₃O₇等)等；常用作吸收子的稀土金属离子有：镱离子(Yb³⁺)、铒离子(Er³⁺)、钐离子(Sm³⁺)等；常用作发射子的稀土金属离子有：铒离子(Er³⁺)、钬离子(Ho³⁺)、铥离子(Tm³⁺)、铽离子(Tb³⁺)等。吸收子和发射子这一离子对在主基质晶格内适宜的空间取向和距离，是产生上转发光的基础。上转发光的产生是一个涉及多个光子(至少两个)的光学过程，在这个过程中，上转发光材料内的吸收子(如Yb³⁺)至少要吸收两个低能量光子(红外光区，如970nm)，而后经过一系列内部能量转换，以非辐射的形式(A1→A2，A2→A3)将这两个光子的能量连续传递给发射子(如Er³⁺)，以使其处于激发态(A3)。后者接着发生一个返回基态能级的跃迁，释放一个高能光子(可见光区，如525nm或540nm)完成能量上转。

冠状病毒分为α、β、γ、δ等4个属，新型冠状病毒(SARS-CoV-2)属于β属，可引起严重呼吸系统相关疾病。新型冠状病毒(SARS-CoV-2)表面棘突蛋白(S蛋白)是冠状病毒最重要的表面膜蛋白，包含S1、S2两个亚基，其中S1蛋白亚基包含S蛋白受体结合区(S-RBD蛋白)，S-RBD蛋白与人细胞表面的ACE2相互作用，致使新型冠状病毒(SARS-CoV-2)进入人细胞并导致感染，S-RBD蛋白是新型冠状病毒中和抗体的重要作用位点以及疫苗设计的关键靶点。

新型冠状病毒中和抗体是接种新型冠状病毒疫苗或感染新型冠状病毒后人体产生的一种具有保护作用的抗体，中和抗体具有识别新型冠状病毒的表面S-RBD蛋白、阻断S-RBD与细胞表面特异性受体(ACE2)结合的功能，发挥抗病毒作用。中和抗体是否产生及其产生数量或效价是接种新冠疫苗后一项重要免疫保护效果指标，也是疫苗评估和质控的重要依据，同时也可以用于评估新型冠状病毒感染后的治疗效果及其治愈评价的重要指标之一。

目前中和抗体检测主要方法为中和抗体病毒滴度试验，该方法操作复杂，检测周期长，生物安全等级要求高；不适用于疫苗接种后大范围人群进行接种疫苗后的定量评价。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的首要发明目的在于提供一种用于检测新冠状病毒中和抗体的试剂盒。

本发明的第二发明目的在于提供一种用于检测接种新冠状病毒疫苗后新冠状病毒中和抗体的方法。

为了实现本发明的发明目的，采用的技术方案为：

本发明涉及一种用于检测新冠状病毒中和抗体的竞争法试剂盒，所述试剂盒包括：新型冠状病毒中和性抗体竞争法检测卡、样品稀释液和标准曲线；

所述新型冠状病毒中和性抗体竞争法检测卡内含有上转换发光颗粒标记的重组S-RBD-C抗原，

所述重组S-RBD-C抗原中含有至少一段附加氨基酸序列，所述附加氨基酸序列用于与S-RBD抗原中的游离的半胱氨酸形成二硫键；

优选的，所述附加氨基酸序列中含有奇数个半胱氨酸，进一步优选的，所述附加氨基酸序列中含有1个半胱氨酸。、

可选的，所述新型冠状病毒中和性抗体竞争法检测卡包括冻干试剂垫、包被硝酸纤维素膜、吸水纸、空白玻璃纤维和底板，所述冻干试剂垫上标记有所述上转换发光颗粒标记的重组S-RBD-C抗原。

可选的，所述包被硝酸纤维素膜上的T线包被有人源重组可溶性ACE2，所述包被的浓度优选为0.8～1.2mg/mL，进一步优选为1.0mg/mL；所述包被硝酸纤维素膜上的C线包被有羊多克隆抗体，所述包被的浓度优选为0.8～1.2mg/mL，进一步优选为1.0mg/mL。

本发明还涉及一种用于检测新冠状病毒中和抗体的双夹心法试剂盒，所述试剂盒包括：新型冠状病毒中和性抗体双夹心法检测卡、样品稀释液和标准曲线；

所述新型冠状病毒中和性抗体双夹心法检测卡内含有上转换发光颗粒标记的重组S-RBD-C抗原或上转发光颗粒标记的S1抗原，所述重组S-RBD-C抗原中含有至少一段附加氨基酸序列，所述附加氨基酸序列用于与S-RBD抗原中的游离的半胱氨酸形成二硫键；

优选的，所述附加氨基酸序列中含有奇数个半胱氨酸，进一步优选的，所述附加氨基酸序列中含有1个半胱氨酸。

可选的，所述新型冠状病毒中和性抗体双夹心法检测卡包括冻干试剂垫、包被硝酸纤维素膜、吸水纸、空白玻璃纤维和底板，所述冻干试剂垫上标记有所述上转换发光颗粒标记的重组S-RBD-C抗原或上转发光颗粒标记的S1抗原。

可选的，当所述试剂盒为双抗原夹心法试剂盒时，所述包被硝酸纤维素膜上的T线包被有重组新型冠状病毒S1抗原或重组S-RBD-C抗原，

所述包被的浓度优选为0.8～1.2mg/mL，进一步优选为1.0mg/mL；所述包被硝酸纤维素膜上的C线包被有羊多克隆抗体，所述包被的浓度优选为0.8～1.2mg/mL，进一步优选为1.0mg/mL。

可选的，所述重组S-RBD-C抗原的氨基酸序列包括SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。

可选的，所述重组S-RBD-C抗原的氨基酸序列还包括Fc标签序列和/或FP信号肽结合位点序列，

和/或，Fc标签序列的氨基酸序列选自SEQ ID No.4所示的氨基酸序列，

和/或，FP信号肽结合位点序列的氨基酸序列选自SEQ ID No.5所示的氨基酸序列；

和/或，所述重组S-RBD-C抗原的氨基酸序列包括SEQ ID No.3所示的氨基酸序列。

可选的，所述样品稀释液的组成为磷酸二氢钾0.2～0.3g/L、磷酸氢二钠1.4～0.15g/L、氯化钠7～9g/L、氯化钾0.1～0.3g/L、吐温-20的添加量为所述样品稀释液重量的0.08～0.16％；所述样品稀释液的优选为磷酸二氢钾0.24g/L、磷酸氢二钠1.44g/L、氯化钠8g/L、氯化钾0.2g/L、吐温-20的添加量为所述样品稀释液重量的0.1％。

可选的，所述标准曲线为记载有标准曲线的载体，或者用于制备标准曲线的试剂。

可选的，所述试剂盒的检测样本为接种新冠状病毒疫苗后的人体血液样本和/或感染新冠状病毒后的人体血液样本。

可选的，所述试剂盒对新型冠状病毒中和性抗体的检测范围为0.01～100U，参考区间cutoff值为0.25U。

本发明还涉及一种用于检测接种新冠状病毒疫苗后新冠状病毒中和抗体的方法，上述试剂盒进行检测。

本发明至少具有以下有益的效果：

本发明可广泛用于监测接种新型冠状病毒疫苗后的受试者或感染新型冠状病毒后人体内是否产生中和抗体，并对产生的中和抗体效价进行定量评价，操作简单，准确率高，检测时间仅需15min。

附图说明

一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。

图1为重组S-RBD-C-hFc抗原和重组S-RBD-hFc抗原的SDS-PAGE电泳图；

图2为重组S-RBD-C-hFc抗原与人源重组可溶性ACE2的亲和力检测结果；

图3为重组S-RBD-hFc抗原与人源重组可溶性ACE2的亲和力检测结果；

图4为上转发光竞争法新型冠状病毒中和性抗体检测结果

图5为上转发光双抗原夹心法新型冠状病毒中和性抗体检测结果

图6为上转发光竞争法和上转发光双抗原夹心法中和抗体检测结果对比结果。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。另外，为了更好的说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的原料、元件、方法、手段等未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。

除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。

针对现有技术的不足，本发明实施例提供了一种用于检测新冠状病毒中和抗体的试剂盒，本发明的试剂盒基于上转发光法进行设计。本发明应用可广泛用于监测接种新型冠状病毒疫苗后的受试者或感染新型冠状病毒后人体内是否产生中和抗体，并对产生的中和抗体效价进行定量评价。

本发明实施例涉及一种用于检测新冠状病毒中和抗体的竞争法试剂盒，包括：新型冠状病毒中和性抗体竞争法检测卡、样品稀释液和标准曲线；新型冠状病毒中和性抗体竞争法检测卡内含有上转换发光颗粒标记的重组S-RBD-C抗原。

本发明实施例还涉及一种用于检测新冠状病毒中和抗体的双夹心法试剂盒，包括：新型冠状病毒中和性抗体双夹心法检测卡、样品稀释液和标准曲线；所述新型冠状病毒中和性抗体双夹心法检测卡内含有上转换发光颗粒标记的重组S-RBD-C抗原或上转发光颗粒标记的S1抗原。

已公开S-RBD的全序列中包含9个半胱氨酸形成的9个二硫键，无法形成完整的配对，容易在后期重组抗原表达过程中形成二聚体，影响重组抗原的检测效果。S-RBD全序列如SEQ ID No.2所示：

SEQ ID No.2：

NITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLE。

为此，本发明实施例的重组S-RBD-C抗原中含有至少一段附加氨基酸序列，该附加氨基酸序列用于与S-RBD抗原中的游离的半胱氨酸形成二硫键，优选的，附加氨基酸序列中含有奇数个半胱氨酸。

进一步优选含有1个半胱氨酸，从而使重组S-RBD-C抗原氨基酸序列具备10个半胱氨酸，形成5对二硫键，减少二聚体的产生。

进一步可选的，重组S-RBD-C抗原包含SEQ ID No.1所示的氨基酸序列：

SEQ ID No.1：

NITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCS。

为增加重组S-RBD-C抗原的表达和可溶性，重组S-RBD-C抗原的氨基酸序列还可以进一步包括Fc标签序列和/或FP信号肽结合位点序列，优选的，Fc标签序列的氨基酸序列选自SEQ ID No.4所示的氨基酸序列，更优选的，FP信号肽结合位点序列的氨基酸序列选自SEQ ID No.5所示的氨基酸序列。

Fc标签序列SEQ ID No.4：

MDFGLSLVFLVLILKGVQCRVQPTESIVRFP

FP信号肽结合位点序列SEQ ID No.5：

ASEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGV EVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHY TQKSLSLSPGKZGS

进一步可选的，重组S-RBD-C抗原包含SEQ ID No.3所示的氨基酸序列：

SEQ ID No.3序列：

MDFGLSLVFLVLILKGVQCRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSASEP KSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP GKZGS。

在用于检测新冠状病毒中和抗体的竞争法试剂盒中，新型冠状病毒中和性抗体竞争法检测卡包括冻干试剂垫、包被硝酸纤维素膜、吸水纸、空白玻璃纤维和底板，冻干试剂垫上标记有上转换发光颗粒标记的重组S-RBD-C抗原。包被硝酸纤维素膜上的T线包被有人源重组可溶性ACE2，包被的浓度优选为0.8～1.2mg/mL，进一步优选为1.0mg/mL；C线包被有羊多克隆抗体，包被的浓度优选为0.8～1.2mg/mL，进一步优选为1.0mg/mL。

在用于检测新冠状病毒中和抗体的双夹心法试剂盒中，新型冠状病毒中和性抗体双夹心法检测卡包括冻干试剂垫、包被硝酸纤维素膜、吸水纸、空白玻璃纤维和底板，冻干试剂垫上标记有所述上转换发光颗粒标记的重组S-RBD-C抗原或上转发光颗粒标记的S1抗原，包被的浓度优选为0.8～1.2mg/mL，进一步优选为1.0mg/mL；C线包被有羊多抗，包被的浓度优选为0.8～1.2mg/mL，进一步优选为1.0mg/mL。

本发明实施例的试剂盒中的样品稀释液的组成为磷酸二氢钾0.2～0.3g/L、磷酸氢二钠1.4～0.15g/L、氯化钠7～9g/L、氯化钾0.1～0.3g/L、吐温-20的添加量为样品稀释液重量的0.08～0.16％。

其中，重组新型冠状病毒S1抗原为市售抗原，羊多抗为羊抗鼠IgG多抗。

样品稀释液的组成优选为：磷酸二氢钾0.24g/L、磷酸氢二钠1.44g/L、氯化钠8g/L、氯化钾0.2g/L、吐温-20的添加量为样品稀释液重量的0.1％。

可选的，标准曲线为记载有标准曲线的载体，或者用于制备标准曲线的试剂。

本发明实施例的试剂盒的检测样本为接种新冠状病毒疫苗后的人体血液样本和/或感染新冠状病毒后的人体血液样本。

本发明实施例的试剂盒对新型冠状病毒中和性抗体的检测范围为0.01～100U，参考区间cutoff值为0.25U。

本发明实施例试剂盒的使用步骤包括：

取10μL血清或血浆样品、或25μL全血样品加入新型冠状病毒中和性抗体检测卡的样品孔中，加入100μL样本稀释液，10～30℃静置孵育15分钟，采用上转发光免疫分析仪读取定量检测结果。

实施例1重组S-RBD-C抗原制备

采用商品化293T细胞系转染、表达氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的重组S-RBD-C-hFc抗原，并在细胞培养箱内培养48h-96h后，收集细胞培养上清，分离纯化，SDS-PAGE检测蛋白纯度≥90％，蛋白浓度≥1mg/mL，抗原效价≥1:10000。

采用同样的方法转染、表达氨基酸序列如SEQ ID No.6所示，未增加半胱氨酸的重组S-RBD-hFc抗原。

SEQ ID No.6所示：

MDFGLSLVFLVLILKGVQCRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEASEPKSCDKTHT CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKZGS。

取20μg上述表达后的重组抗原，采用通用SDS-PAGE电泳步骤检测重组S-RBD-C-hFc抗原和重组S-RBD-hFc抗原，如图1所示，重组S-RBD-C-hFc抗原基本无明显二聚体表达，而重组S-RBD-hFc抗原存在明显二聚体表达导致蛋白纯度较低。

采用Fortebio Octet全自动检测技术平台，利用BLI生物膜干涉技术分别检测重组S-RBD-C-hFc抗原、重组S-RBD-hFc抗原与人源重组可溶性ACE2的亲和力，结果如图2、图3所示：

重组S-RBD-C-hFc抗原与人源重组可溶性ACE2的亲和力检测指标的平衡解离常数K_D＝6.52×10^-9M(图2)；

重组S-RBD-hFc抗原与人源重组可溶性ACE2的亲和力检测指标的平衡解离常数K_D＝1.36×10^-8M(图3)；

平衡解离常数K_D越小，说明两者解离越少，代表两者的亲和力越强。

依据平衡解离常数K_D数值分析，重组S-RBD-C-hFc抗原与人源重组可溶性ACE2的亲和力超过重组S-RBD-hFc抗原与人源重组可溶性ACE2的亲和力10倍。

实施例2中和性抗体检测卡制备

1、上转发光竞争法新型冠状病毒中和性抗体检测卡制备

1)包被硝酸纤维素膜制备：

包被缓冲液：0.01mol/L的磷酸盐缓冲液，pH7.0-7.5；T线包被商品化的人源重组可溶性ACE2，购自于SinoBiological，包被浓度为1.0mg/mL；C线为商品化的羊抗鼠IgG多抗(购自于Invitrogen)，包被浓度为1.0mg/mL。采用全自动三维划膜仪在硝酸纤维素膜上包被质控线和检测线，18-25℃干燥30-60min，使用含2％BSA浓度的0.01mol/L的PBST缓冲溶液浸泡封闭硝酸纤维素膜30-60min，37℃干燥30-60min，室温干燥保存备用。

2)上转换发光颗粒标记冻干试剂垫制备：

称取50mg上转换发光颗粒(购自于西安齐岳生物科技有限公司)置于锥形瓶中，加入pH＝7.2的0.20M PBS溶液50mL重悬上转换发光颗粒，加入重组新型冠状病毒S-RBD-C抗原至终浓度为10μg/mL，混匀，加入无水戊二醛至终浓度0.1％，搅拌12h以上；12000rpm，4℃离心15min，去除上清，加入pH＝7.2的0.20M PBS溶液50mL，混匀；12000rpm，4℃离心30min，去除上清，加入50mL的含2％BSA、5％蔗糖，pH＝7.2的0.20M PB溶液作为冻干保护液重新悬浮上转换发光颗粒标记的重组新型冠状病毒S-RBD-C抗原，按照每mL重新悬浮上转换发光颗粒溶液约铺浇5-6cm²玻璃纤维，将重新悬浮上转换发光颗粒溶液均匀铺浇在玻璃纤维上，放入超低温冰箱进行预冷冻，再放入真空冷冻干燥机中冻干，冻干时间10h以上，冻干后上转换发光颗粒标记冻干试剂垫在室温干燥保存备用。

3)检测卡制备

将冻干后上转换发光颗粒标记冻干试剂垫裁切成约1.0cm宽度长条，将裁切后的上转换发光颗粒标记冻干试剂垫、包被后的硝酸纤维素膜、吸水纸、空白玻璃纤维按顺序贴在底板上，组装成胶体金检测卡大板，按照3-4mm宽度裁切，装入塑料卡壳，与干燥剂一起装入铝箔袋密封，制备成上转发光竞争法的新型冠状病毒中和性抗体检测卡。

2、上转发光双抗原夹心法新型冠状病毒中和性抗体检测卡制备

1)包被硝酸纤维素膜制备：

包被缓冲液：0.01mol/L的磷酸盐缓冲液，pH 7.0-7.5；T线包被抗原为重组S-RBD-C抗原，包被浓度为1.0mg/mL；C线为商品化的羊抗鼠IgG多抗(购自于Invitrogen)，包被浓度为1.0mg/mL。采用全自动三维划膜仪在硝酸纤维素膜上包被质控线和检测线，18-25℃干燥30-60min，使用含2％BSA浓度的0.01mol/L的PBST缓冲溶液浸泡封闭硝酸纤维素膜30-60min，37℃干燥30-60min，室温干燥保存备用。

2)上转换发光颗粒标记冻干试剂垫制备：

称取50mg上转换发光颗粒置于锥形瓶中，加入pH＝7.2的0.20M PBS溶液50mL重悬上转换发光颗粒，加入重组新型冠状病毒S1抗原(重组S1抗原，购自于SinoBiological)至终浓度为10μg/mL，混匀，加入无水戊二醛至终浓度0.1％，搅拌12h以上；12000rpm，4℃离心15min，去除上清，加入pH＝7.2的0.20M PBS溶液50mL，混匀；12000rpm，4℃离心30min，去除上清，加入50mL的含2％BSA、5％蔗糖，pH＝7.2的0.20M PB溶液作为冻干保护液重新悬浮上转换发光颗粒标记的重组新型冠状病毒S1抗原，按照每mL重新悬浮上转换发光颗粒溶液约铺浇5-6cm²玻璃纤维，将重新悬浮上转换发光颗粒溶液均匀铺浇在玻璃纤维上，放入超低温冰箱进行预冷冻，再放入真空冷冻干燥机中冻干，冻干时间10h以上，冻干后上转换发光颗粒标记冻干试剂垫在室温干燥保存备用。

3)检测卡制备

将冻干后上转换发光颗粒标记冻干试剂垫裁切成约1.0cm宽度长条，将裁切后的上转换发光颗粒标记冻干试剂垫、包被后的硝酸纤维素膜、吸水纸、空白玻璃纤维按顺序贴在底板上，组装成胶体金检测卡大板，按照3-4mm宽度裁切，装入塑料卡壳，与干燥剂一起装入铝箔袋密封，制备成上转发光双抗原夹心法的新型冠状病毒中和性抗体检测卡。

在本实施例的上转发光双抗原夹心法新型冠状病毒中和性抗体检测卡制备中包被用重组S-RBD抗原、标记用重组S1抗原可以相互替换为包被抗原为重组S1抗原，标记抗原为重组S-RBD抗原，对结果实现无实质影响。

实施例3样本稀释液和新冠状病毒中和抗体参数卡制备

1、样本稀释液为pH 7.4的PBS-T缓冲液，配方如下：

磷酸二氢钾(KH₂PO₄)：0.24g/L；

磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)：1.44g/L；

氯化钠(NaCl)：8g/L；

氯化钾(KCl)：0.2g/L；

吐温-20：0.1％。

2、新冠状病毒中和抗体参数卡

新冠状病毒中和抗体参数卡中包含试剂批号、生产日期、有效期，标准曲线参数等试剂盒信息；标准曲线参数通过采用常规中和抗体滴度试验方法确定对标标准样本抗体效价、稀释度并与上转发光竞争法检测新型冠状病毒中和抗体的检测信号数据进行比较拟合得到，或与上转发光双抗原夹心法检测新型冠状病毒中和抗体的检测信号数据进行比较拟合得到。

实施例4使用步骤及结果判定

将新冠状病毒中和抗体参数卡信息通过上转发光免疫分析仪读取，录入到上转发光免疫分析仪中；取10μL血清或血浆样品、或25μL全血样品加入新型冠状病毒中和性抗体检测卡的样品孔中，加入100μL样本稀释液，10～30℃静置孵育15分钟，采用配套上转发光免疫分析仪直接读取检测结果。将样品与样本稀释液按照上述比例混匀后，取100μL混合液直接加入新型冠状病毒中和性抗体检测卡的样品孔中进行后续检测，检测性能会更优。

实验例1

按照实施案例4的步骤检测浓度100U、50U、25U、10U、5U、2.5U、1U、0.5U、0.25U、0.1U、0.01U的参考标准样本，标准样本检测结果如下：

上转发光竞争法新型冠状病毒中和性抗体检测结果如图4所述，R²＝0.9922，检测结果与理论结果符合性良好；

上转发光双抗原夹心法新型冠状病毒中和性抗体检测结果如图5所述，R²＝0.9966，检测结果与理论结果符合性良好。

实验例2

按照实施例4的步骤，采用上转发光竞争法新型冠状病毒中和性抗体检测试剂盒、上转发光双抗原夹心法新型冠状病毒中和性抗体检测试剂盒分别检测20例正常人血液样本，20例流感、肺炎支原体、腺病毒、呼吸道合胞病毒等呼吸道感染或肺炎患者样本，20例新型冠状病毒肺炎确诊患者样本和新型冠状病毒无症状感染者样本，结果如下：

两种检测试剂盒检测20例正常人血液样本，20例流感、肺炎支原体、腺病毒、呼吸道合胞病毒等呼吸道感染或肺炎患者样本，上述40例样本检测值均小于0.25，检测结果均为阴性，试剂特异性良好。

两种检测试剂盒检测20例新型冠状病毒肺炎确诊患者样本和新型冠状病毒无症状感染者样本，检测结果如表1所示：

表1：上转发光竞争法和上转发光双抗原夹心法中和抗体检测结果

由表1可知，两种试剂盒检测样本的线性相关性好，R²＝0.9932，20例样本中仅有1例中和抗体检测＜0.25U；两种检测试剂盒的临床评价效果符合临床预期，均具有较高的临床应用价值。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 北京热景生物技术股份有限公司

<120> 用于检测新冠状病毒中和抗体的试剂盒及检测方法

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 261

<212> PRT

<213> 2019-nCoV

<400> 1

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145 150 155 160

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225 230 235 240

Asp Thr Thr Asp Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp

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260

<210> 2

<211> 253

<212> PRT

<213> 2019-nCoV

<400> 2

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<212> PRT

<213> 2019-nCoV

<400> 3

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Ser

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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1 5 10 15

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<210> 5

<211> 237

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Ala Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

1 5 10 15

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

20 25 30

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

35 40 45

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

100 105 110

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115 120 125

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

130 135 140

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

145 150 155 160

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

165 170 175

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

180 185 190

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195 200 205

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

210 215 220

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Glx Gly Ser

225 230 235

Claims

1.一种用于检测新冠状病毒中和抗体的竞争法试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：新型冠状病毒中和性抗体竞争法检测卡、样品稀释液和标准曲线；

所述重组S-RBD-C抗原的氨基酸序列包括SEQ ID No.3所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述新型冠状病毒中和性抗体竞争法检测卡包括冻干试剂垫、包被硝酸纤维素膜、吸水纸、空白玻璃纤维和底板，所述冻干试剂垫上标记有所述上转换发光颗粒标记的重组S-RBD-C抗原。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述包被硝酸纤维素膜上的T线包被有人源重组可溶性ACE2；所述包被硝酸纤维素膜上的C线包被有羊多克隆抗体。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述包被硝酸纤维素膜上的T线包被人源重组可溶性ACE2的浓度为0.8～1.2mg/mL。

5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述包被硝酸纤维素膜上的T线包被人源重组可溶性ACE2的浓度为1.0mg/mL。

6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述包被硝酸纤维素膜上的C线包被羊多克隆抗体的浓度为0.8～1.2mg/mL。

7.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述包被硝酸纤维素膜上的C线包被羊多克隆抗体的浓度为1.0mg/mL。

8.一种用于检测新冠状病毒中和抗体的双夹心法试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：新型冠状病毒中和性抗体双夹心法检测卡、样品稀释液和标准曲线；

所述新型冠状病毒中和性抗体双夹心法检测卡内含有上转换发光颗粒标记的重组S-RBD-C抗原，所述重组S-RBD-C抗原的氨基酸序列包括SEQ ID No.3所示的氨基酸序列。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述新型冠状病毒中和性抗体双夹心法检测卡包括冻干试剂垫、包被硝酸纤维素膜、吸水纸、空白玻璃纤维和底板，所述冻干试剂垫上标记有所述上转换发光颗粒标记的重组S-RBD-C抗原。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述包被硝酸纤维素膜上的T线包被有重组S-RBD-C抗原；所述包被硝酸纤维素膜上的C线包被有羊多克隆抗体。

11.根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，所述包被硝酸纤维素膜上的T线包被重组S-RBD-C抗原的浓度为0.8～1.2mg/mL。

12.根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，所述包被硝酸纤维素膜上的T线包被重组S-RBD-C抗原的浓度为1.0mg/mL。

13.根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，所述包被硝酸纤维素膜上的C线包被羊多克隆抗体的浓度为0.8～1.2mg/mL。

14.根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，所述包被硝酸纤维素膜上的C线包被羊多克隆抗体的浓度为1.0mg/mL。

15.根据权利要求1～14任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液的组成为磷酸二氢钾0.2～0.3g/L、磷酸氢二钠1.4～0.15g/L、氯化钠7～9g/L、氯化钾0.1～0.3g/L、吐温-20的添加量为所述样品稀释液重量的0.08～0.16％。

16.根据权利要求15所述的试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液的组成为磷酸二氢钾0.24g/L、磷酸氢二钠1.44g/L、氯化钠8g/L、氯化钾0.2g/L、吐温-20的添加量为所述样品稀释液重量的0.1％。

17.根据权利要求1～14任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述标准曲线为记载有标准曲线的载体，或者用于制备标准曲线的试剂。

18.根据权利要求1～14任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的检测样本为接种新冠状病毒疫苗后的人体血液样本和/或感染新冠状病毒后的人体血液样本。

19.根据权利要求1～14任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒对新型冠状病毒中和性抗体的检测范围为0.01～100U，参考区间cutoff值为0.25U。

20.一种用于检测接种新冠状病毒疫苗后新冠状病毒中和抗体的方法，其特征在于，采用权利要求1～19任一项所述的试剂盒进行检测。