CN112794884B - 新型冠状病毒蛋白、制备方法及中和抗体检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种新型冠状病毒蛋白、制备方法及中和抗体检测试剂盒，通过将SARS‑CoV2 WH01病毒株S蛋白的RBD序列串联后连接到pCAGGS载体，5’端加入Kozac序列及信号肽序列，3’端加入6个组氨酸标签(His6‑tag)的编码序列和翻译终止密码子，构建好的表达载体通过质粒大量提取获得高纯度质粒，形成新型冠状病毒S‑RBD二聚体蛋白；以上述二聚体蛋白为标记探针制备试剂盒，灵敏度高、特异性好，是定性检测人血中新型冠状病毒中和抗体的胶体金检测试剂盒，对新冠病毒疫苗的效用评估、接种人群的筛查和随访以及康复人群中和抗体水平评估具有重要意义。

Description

新型冠状病毒蛋白、制备方法及中和抗体检测试剂盒
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种新型冠状病毒蛋白、制备方法及中和抗体检测试剂盒。
背景技术
新型冠状病毒（2019-nCoV，SARS-CoV-2），2020年1月12日被世界卫生组织命名。新型冠状病毒是以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株。临床表现为发热、乏力等全身症状，伴有干咳，呼吸困难等，可迅速发展为重症肺炎、呼吸衰竭、急性呼吸窘迫综合征，脓毒性休克，多器官功能衰竭，严重酸碱代谢紊乱等，甚至危及生命。2020年1月20日，国家卫健委发布2020年1号公告，将新型冠状病毒感染的肺炎纳入《中华人民共和国传染病防治法》规定的乙类传染病，并采取甲类传染病的预防、控制措施。将新型冠状病毒感染的肺炎纳入《中华人民共和国国境卫生检疫法》规定的检疫传染病管理。
该病毒囊膜表面的刺突蛋白(S蛋白)是病毒的主要中和抗原。S蛋白的受体结合区(Receptor Binding Domain, RBD)被发现是与宿主细胞受体hACE2结合而进入细胞的结构域，并被认为是诱导机体产生中和抗体的最主要的抗原靶区域。靶向RBD的中和抗体，是自然感染人群清除病毒感染的关键因素，也成为治疗性抗体的首选，并且也是疫苗研发中最希望诱导的强效中和抗体。
近期，全世界的科研人员在新型冠状病毒疫苗研发方面都做了大量的研究工作，并迅速有mRNA、灭活疫苗、腺病毒疫苗、亚单位疫苗等进入临床三期试验。英国更是成为全球首个批准新型冠状病毒疫苗的国家，德国生物新技术公司（BioNTech）和美国辉瑞制药有限公司合作开发的mRNA疫苗率先获得紧急使用授权。这些不同管线的疫苗，皆包含有RBD区，其诱导产生的靶向RBD的中和抗体效价成为疫苗评价的关键指标。疫苗是否成功取决于中和抗体的是否被免疫产生，因此中和抗体的检测对于评估疫苗的有效性至关重要。随着疫苗即将大量应用，如何有效进行筛查待接种人群以及高效监测已接种人群的免疫效果，是亟待解决的重要问题。一个快速、准确的中和抗体检测方法，无论是对新冠肺炎治疗，还是对疫苗有效性的评估，都是十分重要的。
鉴于以上原因，特提出本发明。
发明内容
为了解决现有技术存在的以上问题，本发明提供了一种新型冠状病毒S-RBD二聚体蛋白及其制备方法、含有该蛋白的试剂盒及检测方法，制得的试剂盒是具有灵敏度高、特异性好的定性检测人血中新型冠状病毒中和抗体胶体金检测试剂盒，对新冠病毒疫苗的效用评估、接种人群的筛查和随访以及康复人群中和抗体水平评估具有重要意义。
本发明的第一目的是提供了一种新型冠状病毒S-RBD二聚体蛋白；
本发明的另一目的是提供一种上述新型冠状病毒S-RBD二聚体蛋白的制备方法；
本发明的再一目的是提供一种包括上述的新型冠状病毒S-RBD二聚体蛋白的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒；
本发明的再一目的是提供一种包括上述试剂盒的检测方法。
所述新型冠状病毒S-RBD二聚体蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.1所示。
SEQ ID No.1的序列为：
AtgatacactcagtgtttctactgatgttcttgttaacacctacagaaagtCgggtgcagcctacagagtctattgtgcggttcccaaacatcacaaacctgtgccctttcggcgaggtgttcaacgccacccggttcgcctctgtgtacgcctggaaccggaagcggatctctaactgcgtggccgactactccgtgctgtacaactccgcctctttctctacattcaagtgctacggcgtgtcccctacaaagctgaacgacctgtgcttcaccaacgtgtacgccgactctttcgtgattagaggcgacgaggtgaggcagattgcccccggccagacaggcaagatcgccgactacaactacaagctgcccgacgacttcacaggctgcgtgatcgcctggaactctaacaacctggactctaaggtgggcggcaactacaactacctgtacagactgttccggaagtctaacctgaagccattcgagagggacattagcaccgagatttaccaggccggctctaccccatgcaacggcgtggagggcttcaactgctacttcccactgcagtcctacggcttccagcctacaaacggcgtgggctaccagccttaccgggtggtggtgctgtctttcgagctgctccacgcccccgccacagtgtgcggcccaaagaagagcacaaacctcgtgaagaacaagCgggtgcagcctacagagtctattgtgcggttcccaaacatcacaaacctgtgccctttcggcgaggtgttcaacgccacccggttcgcctctgtgtacgcctggaaccggaagcggatctctaactgcgtggccgactactccgtgctgtacaactccgcctctttctctacattcaagtgctacggcgtgtcccctacaaagctgaacgacctgtgcttcaccaacgtgtacgccgactctttcgtgattagaggcgacgaggtgaggcagattgcccccggccagacaggcaagatcgccgactacaactacaagctgcccgacgacttcacaggctgcgtgatcgcctggaactctaacaacctggactctaaggtgggcggcaactacaactacctgtacagactgttccggaagtctaacctgaagccattcgagagggacattagcaccgagatttaccaggccggctctaccccatgcaacggcgtggagggcttcaactgctacttcccactgcagtcctacggcttccagcctacaaacggcgtgggctaccagccttaccgggtggtggtgctgtctttcgagctgctccacgcccccgccacagtgtgcggcccaaagaagagcacaaacctcgtgaagaacaagCatcaccaccatcaccactga。
优选的，所述新型冠状病毒S-RBD二聚体蛋白的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示。
SEQ ID No.2的序列为：
MIHSVFLLMFLLTPTESRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKHHHHHH。
制备所述的新型冠状病毒S-RBD二聚体蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：
（1）将SARS-CoV2 WH01病毒株S蛋白的RBD（R319-K537）序列串联后连接到pCAGGS载体上, 5’端加入Kozac序列及信号肽序列，3’端加入6个组氨酸标签（His6-tag）的编码序列和翻译终止密码子；
（2）构建好的表达载体通过质粒提取获得高纯度质粒，将质粒瞬时转染悬浮细胞293F细胞，于3天和7天分别收获细胞培养液的上清液；将所有的细胞上清液混合后通过滤膜过滤，除去细胞碎片，得到滤过液；
（3）使用镍离子亲和层析纯化细胞上清液的滤过液，以缓冲液A洗涤亲和柱，以除去非特异结合蛋白，然后目的蛋白以缓冲液B从亲和柱上洗脱下来，将洗脱液浓缩，再通过凝胶过滤层析进一步纯化即可。
进一步的，步骤（1）中，所述SARS-CoV2 WH01病毒株登录号为EPI_ISL_402119。
进一步的，步骤（1）中，所述Kozac序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
SEQ ID NO:3的序列为：GCCACC。
进一步的，步骤（1）中，所述信号肽序列为MIHSVFLLMFLLTPTES。
进一步的，步骤（2）中，采用0.22μm的滤膜进行过滤；
进一步的，步骤（3）中，所述缓冲液A为20mM Tris，150mM NaCl，pH8.0；所述缓冲液B为20mM Tris，150mM NaCl ，pH 8.0 ，300mM咪唑；
进一步的，步骤（3）中，以10KD截留浓缩管将洗脱液浓缩。
进一步的，步骤（3）中，镍离子亲和层析柱为HisTrapTM HP（GE）。
进一步的，步骤（3）中，凝胶过滤层析柱为Superdex200 10/300 GL（GE）。
进一步的，步骤（3）后，采用SDS-PAGE鉴定蛋白纯度。
一种包括所述的新型冠状病毒S-RBD二聚体蛋白的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒，所述试剂盒以所述的新型冠状病毒S-RBD二聚体蛋白为检测探针。
优选的，所述试剂盒包括检测卡，
所述的检测卡包括PVC底板、样品垫、滤血垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述的样品垫、滤血垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸依次互相交错搭接后粘贴在所述的PVC底板上，形成试纸板，切割，得到所述的检测卡；
结合垫处理液为10mM Tris缓冲液(pH8.0)，含1%BSA、0.9% NaCl、0.5% Triton X-100；
所述的结合垫喷10%浓缩的胶体金，胶体金上标记有鼠IgG、与待测物结合的抗原，所述抗原为所述的新型冠状病毒S-RBD二聚体蛋白，置于鼓风干燥箱中，37℃烘干过夜；
所述的硝酸纤维素膜上依次划有相互平行的检测线T线和质控线C线，检测线T线和质控线C线间隔距离为3-5mm，所述的检测线T线靠近滤血垫，所述的质控线C线靠近吸水纸。
更优选的，试纸板切割成3-4mm宽的试纸条，加干燥剂于常温下密封保存。
胶体金的保存液为含0.05-2％BSA、1-30％蔗糖、0.1% Tween-20的pH 8.5 20mMTris-HCl缓冲液。
具体的，所述的检测线T线为鼠抗人IgG，稀释至1.0-2.0mg/mL进行划线，划液量为0.1-5μL/cm，划膜速度为5-100mm/s；所述的质控线C线为羊抗鼠IgG，稀释至1.5～2.0 mg/mL进行划线，划液量为0.1-5μL/cm，划膜速度为5-100mm/s。
优选的，所述的检测卡还包括外壳，所述的外壳由上壳和下壳扣合而成，所述的上壳将样品垫、滤血垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸压紧在PVC板上；优选的，所述的上壳与样品垫对应的位置处设置有加样孔，所述的上壳与硝酸纤维素膜对应的位置处设置有观察窗。
一种利用所述的试剂盒检测新型冠状病毒中和抗体的方法，取8-12μL待测血清样本加入到检测卡的加样孔中，再加入2-3滴样本稀释液中室温反应10-15min，开启胶体金免疫分析读数仪，初始化自检完毕后，将检测卡插入仪器对应的插口中，运行仪器读取结果；优选的，取10μL待测血清样本加入到检测卡的加样孔中，再加入2滴样本稀释液中室温反应15min。
具体的，所述的样本稀释液为含0.05-5% NaCl、0.05-5%BSA和0.1-5%Tween-20的pH 7.0的磷酸盐缓冲液。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
（1）本发明制备的试剂盒灵敏度高、特异性好，是定性检测人血中新型冠状病毒中和抗体的胶体金检测试剂盒，对新冠病毒疫苗的效用评估、接种人群的筛查和随访以及康复人群中和抗体水平评估具有重要意义。
（2）本发明的试剂盒以标记的新型冠状病毒S-RBD二聚体蛋白为标记探针，可用于新型冠状病毒中和抗体的快速准确筛查，以及疫苗接种人群免疫效果评价，从而指导个人及群体疫苗接种策略。
（3）试验证明，本发明的试剂盒能快速精准筛查康复人群的中和抗体水平，并且普遍适用于各类型的疫苗接种后，接种人群的中和抗体水平的评估。
（4）操作简单，适合现场快速检测，结果直观，可以准确测定待测物的含量，15min内出结果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明经凝胶过滤层析进一步纯化得到的新型冠状病毒S-RBD二聚体蛋白的凝胶过滤层析图；
图2为采用SDS-PAGE鉴定蛋白纯度的电泳图；
图3是本发明的一种新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒的侧面图；
图4是本发明的一种新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒的正面图；
图5新型冠状病毒S-RBD二聚体蛋白和S-RBD单体蛋白为标记探针制备检测试剂盒对于人源化抗新型冠状病毒抗体的检测性能比较。
附图标记
1-吸水纸、2-硝酸纤维素膜、3-结合垫、4-滤血垫、5-样品垫、6-PVC底板。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
图1为本发明经凝胶过滤层析进一步纯化得到的新型冠状病毒S-RBD二聚体蛋白的凝胶过滤层析图；图2为采用SDS-PAGE鉴定蛋白纯度的电泳图；
如图3和4所示为本发明的一种新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒的侧面图和正面图。
在一些较为具体的实施例中，所述新型冠状病毒S-RBD二聚体蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.1所示；
制备新型冠状病毒S-RBD二聚体蛋白的方法，包括以下步骤：
（1）将SARS-CoV2 WH01病毒株S蛋白的RBD（R319-K537）序列串联后连接到pCAGGS载体上, 5’端加入Kozac序列及信号肽序列，3’端加入6个组氨酸标签的编码序列和翻译终止密码子；
（2）构建好的表达载体通过质粒提取获得高纯度质粒，将质粒瞬时转染悬浮细胞293F细胞，于3天和7天分别收获细胞培养液的上清液；将所有的细胞上清液混合后通过0.22μm的滤膜过滤，除去细胞碎片，得到滤过液；
（3）使用镍离子亲和层析纯化细胞上清液的滤过液，以缓冲液A洗涤亲和柱，以除去非特异结合蛋白，然后目的蛋白以缓冲液B从亲和柱上洗脱下来，并以10KD截留浓缩管将洗脱液浓缩，再通过凝胶过滤层析进一步纯化即可；
一种包括新型冠状病毒S-RBD二聚体蛋白的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒，以所述的新型冠状病毒S-RBD二聚体蛋白为检测探针；优选的，所述试剂盒包括检测卡，
所述的检测卡包括PVC底板、样品垫、滤血垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述的样品垫、滤血垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸依次互相交错搭接后粘贴在所述的PVC底板上，形成试纸板，切割，得到所述的检测卡；
结合垫处理液为10mM Tris缓冲液(pH8.0)，含1%BSA、0.9% NaCl、0.5% Triton X-100；
所述的结合垫喷10%浓缩的胶体金，胶体金上标记有鼠IgG、与待测物结合的抗原，所述抗原为所述的新型冠状病毒S-RBD二聚体蛋白，置于鼓风干燥箱中，37℃烘干过夜；
所述的硝酸纤维素膜上依次划有相互平行的检测线T线和质控线C线，检测线T线和质控线C线间隔距离为3-5mm，所述的检测线T线靠近滤血垫，所述的质控线C线靠近吸水纸。
实施例1
本实施例提供了一种新型冠状病毒S-RBD二聚体蛋白，所述新型冠状病毒S-RBD二聚体蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.1所示；所述新型冠状病毒S-RBD二聚体蛋白的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示。
实施例2
本实施例提供了一种新型冠状病毒S-RBD二聚体蛋白，所述新型冠状病毒S-RBD二聚体蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.1所示；所述新型冠状病毒S-RBD二聚体蛋白的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示；
制备新型冠状病毒S-RBD二聚体蛋白的方法，包括以下步骤：
（1）将SARS-CoV2 WH01病毒株S蛋白的RBD（R319-K537）序列串联后连接到pCAGGS载体上, 5’端加入Kozac序列及信号肽序列，3’端加入6个组氨酸标签的编码序列和翻译终止密码子；
（2）构建好的表达载体通过质粒提取获得高纯度质粒，将质粒瞬时转染悬浮细胞293F细胞，于3天和7天分别收获细胞培养液的上清液；将所有的细胞上清液混合后通过0.22μm的滤膜过滤，除去细胞碎片，得到滤过液；
（3）使用镍离子亲和层析纯化细胞上清液的滤过液，以缓冲液A洗涤亲和柱，以除去非特异结合蛋白，然后目的蛋白以缓冲液B从亲和柱上洗脱下来，并以10KD截留浓缩管将洗脱液浓缩，再通过凝胶过滤层析进一步纯化即可。
实施例3
本实施例提供了一种新型冠状病毒S-RBD二聚体蛋白，所述新型冠状病毒S-RBD二聚体蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.1所示；所述新型冠状病毒S-RBD二聚体蛋白的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示；
制备新型冠状病毒S-RBD二聚体蛋白的方法，包括以下步骤：
（1）将SARS-CoV2 WH01病毒株S蛋白的RBD（R319-K537）序列串联后连接到pCAGGS载体上, 5’端加入Kozac序列（GCCACC）及信号肽序列（MIHSVFLLMFLLTPTES），3’端加入6个组氨酸标签（His6-tag）的编码序列和翻译终止密码子；Kozac序列的核苷酸序列如SEQ IDNO:3所示；信号肽序列具有如SEQ ID No.4中显示的氨基酸序列；SARS-CoV2 WH01病毒株登录号为EPI_ISL_402119；
（2）构建好的表达载体通过质粒提取获得高纯度质粒，将质粒瞬时转染悬浮细胞293F细胞，于3天和7天分别收获细胞培养液的上清液；将所有的细胞上清液混合后通过0.22μm的滤膜过滤，除去细胞碎片，得到滤过液；
（3）使用镍离子亲和层析（HisTrapTM HP（GE））纯化细胞上清液的滤过液，以缓冲液A（20mM Tris，150mM NaCl，pH8.0）洗涤亲和柱，以除去非特异结合蛋白，然后目的蛋白以缓冲液B（20mM Tris，150mM NaCl ，pH 8.0 ，300mM咪唑）从亲和柱上洗脱下来，并以10KD截留浓缩管将洗脱液浓缩，再通过GE公司AKAT purifier蛋白纯化系统以Superdex200 10/300 GL凝胶过滤预装柱进一步纯化，以缓冲液A平衡预装柱，上述蛋白4℃ 13000 rpm/min离心10min后，上清用 1ml loop 环上样，将收集的蛋白制样结果如图1所示，图1为凝胶过滤层析图；采用SDS-PAGE鉴定蛋白纯度，结果如图2所示。
由图1和图2可知，经亲和层析和凝胶过滤层析后可获得单一峰型、纯度较高的目的蛋白。
实施例4
采用实施例3得到的新型冠状病毒S-RBD二聚体蛋白为标记探针制备新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒如图3和4所示，所述试剂盒包括检测卡，所述的检测卡包括PVC底板6、样品垫5、滤血垫4、结合垫3、硝酸纤维素膜2和吸水纸1，所述的样品垫5、滤血垫4、结合垫3、硝酸纤维素膜2和吸水纸1依次互相交错搭接后粘贴在所述的PVC底板6上，互相交错搭接的尺寸为2mm，PVC底板6的尺寸为80-300mm，形成试纸板，切割成3-4mm宽的试纸条，加干燥剂于常温下在铝箔袋中密封保存，得到所述的检测卡；
其中，样品垫5，尺寸为20*300mm；滤血垫4，尺寸为30*300mm；吸水纸1，尺寸为28*300mm；
结合垫3为玻璃纤维材质，喷涂抗原标记的胶体金，胶体金上标记有鼠IgG、与待测物结合的抗原新型冠状病毒的S-RBD二聚体蛋白，胶体金的保存液为含0.5％BSA、15％蔗糖、0.1% Tween-20的pH 8.5 20mM Tris-HCl缓冲液；
试纸板的具体制备方法如下：
（1）结合垫3浸泡在10mM Tris缓冲液(pH8.0)，含1%BSA、0.9% NaCl、0.5% TritonX-100，室温下0.5h，60℃烘干1小时，将标记的胶体金均匀喷在结合垫3上，置于鼓风干燥箱中，37℃烘干过夜；
（2）T线划线液配制：用缓冲液将鼠抗人IgG稀释至1.0～2.0mg/mL，所述划膜缓冲液为0.01mol/L PBS（含10g/L蔗糖），pH7.0～7.4；（3）C线划线液配制：用缓冲液将羊抗鼠IgG稀释至1.5～2.0mg/mL，所述划膜稀释液为0.01 mol/L PBS（含10 g/L蔗糖），pH7.0～7.4；
（4）采用喷金划膜仪，将C线抗体、T线抗体分别包被在固定于底板上的硝酸纤维素膜2上，划液量：1μL/cm；划膜速度：50mm/s；
（5）将划好的试纸板置于鼓风干燥箱中，37℃烘干4h，加入干燥剂封存备用。
所述的检测卡还包括外壳，切割的试纸条组装在由塑料制成的上壳和塑料制成的下壳扣合而成的塑料外壳中，塑料上壳上设置有加样孔和观察窗，加样孔对应于样品垫5，观察窗对应于检测线T线和质控线C线。
实施例5
本实施例的一种利用实施例4制备的试剂盒检测新型冠状病毒中和抗体的方法，包括如下步骤：
（1）将待检测样本和试剂盒恢复至室温；
（2）取8-12μL待测血清样本加入到检测卡的加样孔(S)中，再加入2~3滴样本稀释液中(所述的样本稀释液为含0.9% NaCl、0.5%BSA和1%Tween-20的pH 7.0的磷酸盐缓冲液，分装成5mL/管)，室温反应5~15min；
（3）开启胶体金免疫分析读数仪，初始化自检完毕后，将检测卡插入仪器对应的插口中；
（4）运行仪器读取检测结果。
经多次比较发现，取10μL待测血清样本加入到检测卡的加样孔中，再加入2滴样本稀释液中室温反应15min，开启胶体金免疫分析读数仪，初始化自检完毕后，将检测卡插入仪器对应的插口中，运行仪器读取结果，用量更少，成本更低，结果也准确。
试验例1
按实施例5的制备方法制备新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒，使用人源化抗新型冠状病毒抗体（江苏省疾病预防控制中心）作为质控品，进行抗体检测性能评估，加样体积10微升，滴加两滴稀释液，15分钟后判读结果，试验例中调整S-RBD二聚体蛋白的添加浓度，分别为8µg/ml、4µg/ml、2µg/ml、1µg/ml、500ng/ml、250ng/ml、125ng/ml、62.5ng/ml、31.3ng/ml、15.6ng/ml和空白对照；对比试验中采用新型冠状病毒S-RBD单体蛋白为标记探针的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒，添加浓度分别为8µg/ml、4µg/ml、2µg/ml、1µg/ml、500ng/ml、250ng/ml、125ng/ml、62.5ng/ml、31.3ng/ml、15.6ng/ml和空白对照；结果如图5所示。
由图5可知，相同工艺下，新型冠状病毒S-RBD二聚体蛋白对于人源化抗新型冠状病毒抗体的最低检测浓度为31.3ng/m，而S-RBD单体只有250ng/mL。S-RBD二聚体蛋白最为标记探针具有更强的灵敏度。
试验例2
采用实施例5制备的试剂盒对康复人群和疫苗接种人群的测试进行对比：
选取相同康复患者血清、腺病毒疫苗、灭活病毒疫苗、mRNA疫苗接种血清样本加样10微升，滴加两滴稀释液，15分钟判读结果，对比结果统计表如下表1-4：
表1 康复患者血清样本10例：
编号 S-RBD S-RBD二聚体
A1 ++ ++++
A2 +++ ++++
A3 ++++ ++++
A4 ++++ ++++
A5 + +++
A6 ++ ++++
A7 ++ ++++
A8 +++ ++++
A9 +++ ++++
A10 ++++ ++++
表2 腺病毒疫苗接种血清样本10例：
编号 S-RBD S-RBD二聚体
B1 ++ ++++
B2 ++++ ++++
B3 ++++ ++++
B4 ++ ++++
B5 +++ ++++
B6 +-- ++
B7 ++ ++++
B8 + +++
B9 ++ ++++
B10 ++ ++++
表3 灭活病毒疫苗接种血清样本10例：
编号 S-RBD S-RBD二聚体
C1 + +++
C2 ++++ ++++
C3 + ++
C4 + +++
C5 ++ +++
C6 +-- +
C7 + +++
C8 + +++
C9 + +++
C10 + ++
表4 mRNA疫苗接种血清样本10例：
编号 S-RBD S-RBD二聚体
D1 ++++ ++++
D2 ++++ ++++
D3 ++++ ++++
D4 ++ ++++
D5 ++++ ++++
D6 + +++
D7 ++++ ++++
D8 +++ ++++
D9 +++ ++++
D10 +++ ++++
注：显色强度标识由强到弱为：++++、+++、++、+、+-、-，其中正常显色强度为+或++，强阳性为+++、++++；弱阳可见条带+-；极弱条带+--；阴性为-。
由以上试验结果可知：本发明以新型冠状病毒S-RBD二聚体蛋白作为标记探针的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒能快速精准筛查康复人群的中和抗体水平，并且普遍适用于各类型的疫苗接种后，接种人群的中和抗体水平的评估。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院微生物研究所江苏美克医学技术有限公司
<120> 新型冠状病毒蛋白、制备方法及中和抗体检测试剂盒
<130> 2020
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1386
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
atgatacact cagtgtttct actgatgttc ttgttaacac ctacagaaag tcgggtgcag 60
cctacagagt ctattgtgcg gttcccaaac atcacaaacc tgtgcccttt cggcgaggtg 120
ttcaacgcca cccggttcgc ctctgtgtac gcctggaacc ggaagcggat ctctaactgc 180
gtggccgact actccgtgct gtacaactcc gcctctttct ctacattcaa gtgctacggc 240
gtgtccccta caaagctgaa cgacctgtgc ttcaccaacg tgtacgccga ctctttcgtg 300
attagaggcg acgaggtgag gcagattgcc cccggccaga caggcaagat cgccgactac 360
aactacaagc tgcccgacga cttcacaggc tgcgtgatcg cctggaactc taacaacctg 420
gactctaagg tgggcggcaa ctacaactac ctgtacagac tgttccggaa gtctaacctg 480
aagccattcg agagggacat tagcaccgag atttaccagg ccggctctac cccatgcaac 540
ggcgtggagg gcttcaactg ctacttccca ctgcagtcct acggcttcca gcctacaaac 600
ggcgtgggct accagcctta ccgggtggtg gtgctgtctt tcgagctgct ccacgccccc 660
gccacagtgt gcggcccaaa gaagagcaca aacctcgtga agaacaagcg ggtgcagcct 720
acagagtcta ttgtgcggtt cccaaacatc acaaacctgt gccctttcgg cgaggtgttc 780
aacgccaccc ggttcgcctc tgtgtacgcc tggaaccgga agcggatctc taactgcgtg 840
gccgactact ccgtgctgta caactccgcc tctttctcta cattcaagtg ctacggcgtg 900
tcccctacaa agctgaacga cctgtgcttc accaacgtgt acgccgactc tttcgtgatt 960
agaggcgacg aggtgaggca gattgccccc ggccagacag gcaagatcgc cgactacaac 1020
tacaagctgc ccgacgactt cacaggctgc gtgatcgcct ggaactctaa caacctggac 1080
tctaaggtgg gcggcaacta caactacctg tacagactgt tccggaagtc taacctgaag 1140
ccattcgaga gggacattag caccgagatt taccaggccg gctctacccc atgcaacggc 1200
gtggagggct tcaactgcta cttcccactg cagtcctacg gcttccagcc tacaaacggc 1260
gtgggctacc agccttaccg ggtggtggtg ctgtctttcg agctgctcca cgcccccgcc 1320
acagtgtgcg gcccaaagaa gagcacaaac ctcgtgaaga acaagcatca ccaccatcac 1380
cactga 1386
<210> 2
<211> 461
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 2
Met Ile His Ser Val Phe Leu Leu Met Phe Leu Leu Thr Pro Thr Glu
1 5 10 15
Ser Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr
20 25 30
Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser
35 40 45
Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr
50 55 60
Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly
65 70 75 80
Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala
85 90 95
Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly
100 105 110
Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe
115 120 125
Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val
130 135 140
Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu
145 150 155 160
Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser
165 170 175
Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln
180 185 190
Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg
195 200 205
Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys
210 215 220
Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Arg Val Gln Pro
225 230 235 240
Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe
245 250 255
Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn
260 265 270
Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn
275 280 285
Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys
290 295 300
Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile
305 310 315 320
Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile
325 330 335
Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile
340 345 350
Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn
355 360 365
Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg
370 375 380
Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly
385 390 395 400
Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln
405 410 415
Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser
420 425 430
Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser
435 440 445
Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys His His His His His His
450 455 460
<210> 3
<211> 6
<212> DNA
<213> 未知
<400> 3
gccacc 6
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院微生物研究所 江苏美克医学技术有限公司
<120> 新型冠状病毒蛋白、制备方法及中和抗体检测试剂盒
<130> 2020
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1386
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
atgatacact cagtgtttct actgatgttc ttgttaacac ctacagaaag tcgggtgcag 60
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ttcaacgcca cccggttcgc ctctgtgtac gcctggaacc ggaagcggat ctctaactgc 180
gtggccgact actccgtgct gtacaactcc gcctctttct ctacattcaa gtgctacggc 240
gtgtccccta caaagctgaa cgacctgtgc ttcaccaacg tgtacgccga ctctttcgtg 300
attagaggcg acgaggtgag gcagattgcc cccggccaga caggcaagat cgccgactac 360
aactacaagc tgcccgacga cttcacaggc tgcgtgatcg cctggaactc taacaacctg 420
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aagccattcg agagggacat tagcaccgag atttaccagg ccggctctac cccatgcaac 540
ggcgtggagg gcttcaactg ctacttccca ctgcagtcct acggcttcca gcctacaaac 600
ggcgtgggct accagcctta ccgggtggtg gtgctgtctt tcgagctgct ccacgccccc 660
gccacagtgt gcggcccaaa gaagagcaca aacctcgtga agaacaagcg ggtgcagcct 720
acagagtcta ttgtgcggtt cccaaacatc acaaacctgt gccctttcgg cgaggtgttc 780
aacgccaccc ggttcgcctc tgtgtacgcc tggaaccgga agcggatctc taactgcgtg 840
gccgactact ccgtgctgta caactccgcc tctttctcta cattcaagtg ctacggcgtg 900
tcccctacaa agctgaacga cctgtgcttc accaacgtgt acgccgactc tttcgtgatt 960
agaggcgacg aggtgaggca gattgccccc ggccagacag gcaagatcgc cgactacaac 1020
tacaagctgc ccgacgactt cacaggctgc gtgatcgcct ggaactctaa caacctggac 1080
tctaaggtgg gcggcaacta caactacctg tacagactgt tccggaagtc taacctgaag 1140
ccattcgaga gggacattag caccgagatt taccaggccg gctctacccc atgcaacggc 1200
gtggagggct tcaactgcta cttcccactg cagtcctacg gcttccagcc tacaaacggc 1260
gtgggctacc agccttaccg ggtggtggtg ctgtctttcg agctgctcca cgcccccgcc 1320
acagtgtgcg gcccaaagaa gagcacaaac ctcgtgaaga acaagcatca ccaccatcac 1380
cactga 1386
<210> 2
<211> 461
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 2
Met Ile His Ser Val Phe Leu Leu Met Phe Leu Leu Thr Pro Thr Glu
1 5 10 15
Ser Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr
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Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser
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Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser
165 170 175
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Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys
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Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe
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325 330 335
Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile
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Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg
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Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly
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gccacc 6

Claims (7)

1.一种新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒以一种新型冠状病毒S-RBD二聚体蛋白为检测探针；
所述的新型冠状病毒S-RBD二聚体蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示；所述新型冠状病毒S-RBD二聚体蛋白的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示；
所述试剂盒包括检测卡，所述的检测卡包括PVC底板、样品垫、滤血垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述的样品垫、滤血垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸依次互相交错搭接后粘贴在所述的PVC底板上，形成试纸板，切割，得到所述的检测卡；
所述的结合垫喷胶体金，胶体金上标记有鼠IgG、与待测物结合的抗原，所述抗原为所述的新型冠状病毒S-RBD二聚体蛋白，置于鼓风干燥箱中，37℃烘干过夜；
所述的硝酸纤维素膜上依次划有相互平行的检测线T线和质控线C线，检测线T线和质控线C线间隔距离为3-5mm，所述的检测线T线靠近滤血垫，所述的质控线C线靠近吸水纸；
所述的检测线T线为鼠抗人IgG，稀释至1.0-2.0mg/mL进行划线，划液量为0.1-5μL/cm，划膜速度为5-100mm/s；所述的质控线C线为羊抗鼠IgG，稀释至1.5～2.0mg/mL进行划线，划液量为0.1-5μL/cm，划膜速度为5-100mm/s。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，制备所述的新型冠状病毒S-RBD二聚体蛋白的方法，包括以下步骤：
(1)将SARS-CoV2 WH01病毒株S蛋白的RBD序列串联后连接到pCAGGS载体上,5’端加入Kozac序列及信号肽序列，3’端加入6个组氨酸标签的编码序列和翻译终止密码子；
(2)构建好的表达载体通过质粒提取获得高纯度质粒，将质粒瞬时转染悬浮细胞293F细胞，于3天和7天分别收获细胞培养液的上清液；将所有的细胞上清液混合后通过滤膜过滤，除去细胞碎片，得到滤过液；
(3)使用镍离子亲和层析纯化细胞上清液的滤过液，以缓冲液A洗涤亲和柱，以除去非特异结合蛋白，然后目的蛋白以缓冲液B从亲和柱上洗脱下来，将洗脱液浓缩，再通过凝胶过滤层析进一步纯化即可。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，步骤(1)中，所述SARS-CoV2 WH01病毒株登录号为EPI_ISL_402119；所述Kozac序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，步骤(2)中，采用0.22μm的滤膜进行过滤；
步骤(3)中，所述缓冲液A为20mM Tris，150mM NaCl，pH8.0；所述缓冲液B为20mM Tris，150mM NaCl，pH 8.0，300mM咪唑；以10KD截留浓缩管将洗脱液浓缩；
步骤(3)后，采用SDS-PAGE鉴定蛋白纯度。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，结合垫处理液为10mM Tris缓冲液，pH8.0，含1％BSA、0.9％NaCl、0.5％Triton X-100。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，切割成3-4mm宽的试纸条，加干燥剂于常温下密封保存；胶体金的保存液为含0.05-2％BSA、1-30％蔗糖、0.1％Tween-20的pH 8.520mM Tris-HCl缓冲液。
7.根据权利要求1-6任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述的检测卡还包括外壳，所述的外壳由上壳和下壳扣合而成，所述的上壳将样品垫、滤血垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸压紧在PVC板上；所述的上壳与样品垫对应的位置处设置有加样孔，所述的上壳与硝酸纤维素膜对应的位置处设置有观察窗。
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