JP2020521127A - 微生物及びその他分析物の検出、定量及び/又は追跡のための診断アッセイ - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2017年5月18日出願の米国仮出願第62/507,895号の優先権を主張するものであり、内容を参照することにより援用される。
該サンプルを、標的分析物に特異的に結合するエンティティにより表面変性しておいた複数のナノ結晶と接触させる工程と、
該分析物に結合した該ナノ結晶を、未結合のナノ結晶から分離する工程と、
該分析物に結合した該ナノ結晶を検出する工程とを含む。
本発明に有用なナノ結晶は、作用するエネルギーを吸収したのち、吸収したエネルギーを放出する無機ルミネッセント又は電磁活性材料である。かかるナノ結晶は、吸収光の除去後、10−8秒以上発光し続ける蛍光体として作用しうる。蛍光体の残光又は燐光の半減期は、典型的に、約10−6秒〜数日である。
ダウンコンバージョン蛍光体材料としては、RE元素ドープ酸化物、RE元素ドープオキシ硫化物、RE元素ドープフッ化物が挙げられる。ダウンコンバージョン蛍光体としては、Y2O3:Gd、Y2O3:Dy、Y2O3:Tb、Y2O3:Ho、Y2O3:Er、Y2O3:Tm、Gd2O3:Eu、Y2O2S:Pr、Y2O2S:Sm、Y2O2S:Eu、Y2O2S:Tb、Y2O2S:Ho、Y2O2S:Er、Y2O2S:Dy、Y2O2S:Tm、Y2O2S:Eu(赤色)、Y2O3:Eu(赤色)及びYVO4:Eu(赤色)が例示される。ダウンコンバージョン蛍光体のその他の例としては、他のランタノイドでドープされたフッ化ナトリウムガドリニウム、例えば、NaGdF4:Tbがあり、Tbは、Eu、Dy、Pr、Ce等で置換できる。ランタノイドフッ化物もまた、ダウンコンバージョンフッ化物として知られており、例えば、TbF3、EuF3、PrF3及びDyF3がある。
少なくとも1つの活性剤対でドープされた上述したようなRE含有母格子から誘導された蛍光体は、増感剤(吸収剤としても知られている)とエミッターを含む。好適なアップコンバージョン蛍光体母格子としては、フッ化ナトリウムイットリウム(NaYF4)、フッ化ランタン(LaF3)、オキシ硫化ランタン、オキシ硫化RE(RE2O2S)、オキシフッ化RE(RE4O3F6)、オキシ塩化RE(REOCl)、フッ化イットリウム(YF3)、没食子酸イットリウム、フッ化ガドリニウム(GdF3)、フッ化バリウムイットリウム(BaYF5、BaY2F8)及びオキシ硫化ガドリニウム(式中、REは、Y、Gd、La又はその他ランタノイド元素である)が挙げられる。好適な活性剤対は、イッテルビウム/エルビウム、イッテルビウム/ツリウム及びイッテルビウム/ホルミウムから選択される。アップコンバージョンに好適なその他活性剤対を用いてもよい。
単分散粒子の特性は、様々なやり方で調整することができる。単分散粒子の特性、特性吸収及び放出スペクトルは、組成を調節する、例えば、母格子を選択したり、ドーピングにより、調整される。利点として、均一な多面体モルホロジーを与えると、単分散粒子は、異方性を示すことである。同じ組成であるが、異なる形状の粒子は、その形状及び/又はサイズのために、異なる光学特性を示す。
サイズ及びモルホロジーが均一なため、本発明の単分散粒子は、超格子構造へ自己集合することができる。超格子構造は、集合体における最低自由エネルギー配座を表す。この均一性は、本発明による均一なサイズ及びモルホロジーをもつ単分散粒子により得られるものである。超格子は、界面自己重合により形成され、異なる長さスケールによる階層構造が構築される。
一実施形態において、ナノ結晶は、1つ以上の捕捉原子により機能化されている。これは、例えば、ナノ結晶を、抗体、タンパク質、ポリペプチド、アプタマー、ヌクレオチド及び/又は標的微生物や微生物ベースの薬剤といった分析物に特異的に結合するその他化合物に結合することによる。他の実施形態において、分析物標的はまた、病原体微生物による感染に応じて発現される任意のホスト生体分子とすることもできる。
特定の実施形態において、本発明の方法は、環境サンプル中の標的微生物及び/又は微生物ベースの薬剤が、担体に固定その他結び付く工程を含む。この工程は、担体の表面を、捕捉分子、例えば、抗体、タンパク質、ヌクレオチド及び/又は標的微生物や微生物ベースの薬剤を特異的に認識するその他化合物により処理することによりなされる。捕捉分子は、当該標的を特異的に捕捉するナノ結晶の表面を官能化させるのに用いられる同一又は異なる分子であってよい。
好ましい実施形態において、本発明は、サンプル中の当該分析物の有無や量を試験するのに用いるラテラルフローアッセイを用いる。一実施形態において、抗体(又はその他結合液)が、固体担体に固定されて、標的分析物を捕捉することによって、固定された分析物を観察することにより、検出や定量を促す「サンドイッチ」アッセイを用いる。
他の実施形態において、本発明の材料及び方法をPCR手順と組み合わせて、高感度アッセイを行う。均一なサイズのナノ結晶UCPを、オリゴヌクレオチドプライマーの5'末端のナノ結晶に結合した1つの(又は両方の)PCRプライマーを用いた増幅により生成されたPCR生成物へ組み込むと、検出に用いられる標準レポーター分子に比べて、優れたアッセイ特性が与えられる。
他の実施形態において、本発明のアッセイは、高処理量設定で、マルチウェルアレイ、例えば、8、12、24、48、96、192、384ウェルアレイで実施される。
本発明は、環境サンプルにおいて、微生物、微生物ベースの薬剤及び/又はその他分析物を効率的かつ正確に、検出、定量及び/又は追跡する方法及びデバイスを提供する。
本発明に従って検出可能な微生物としては、これらに限られるものではないが、古細菌、酵母、菌類、ウイルス、原生動物、又は多細胞生物が挙げられる。
一実施形態において、本発明は、環境サンプルにおいて病原体を検出する方法を提供する。病原体としては、これらに限られるものではないが、Yersinia、Klebsiella、Providencia、Erwinia、Enterobacter、Salmonella、Serratia、Aerobacter、Escherichia、Pseudomonas、Shigella、Vibrio、Aeromonas、Streptococcus、Staphylococcus、Micrococcus、Moraxella、Bacillus、Clostridium、Corynebacterium、Eberthella、Francisella、Haemophilus、Bacteroides、Listeria、Erysipelothrix、Acinetobacter、Brucella、Pasteurella、Flavobacterium、Fusobacterium、Streptobacillus、Calymmatobacterium、Legionella、Treponema、Borrelia、Leptospira、Actinomyces、Nocardia、Rickettsia、Micrococcus、Mycobacterium、Neisseria又はCampylobacter属のものが挙げられる。
本発明の方法により試験できる植物としては、列作物(例えば、コーン、大豆、モロコシ、ピーナツ、ジャガイモ等)、農作物(例えば、アルファルファ、小麦、穀類等)、樹木作物(例えば、ウォールナッツ、アーモンド、ペカン、ヘーゼルナッツ、ピスタチオ等)、柑橘作物(例えば、オレンジ、レモン、グレープフルーツ等)、果物作物(例えば、リンゴ、ナシ等)、芝作物、花き作物(例えば、花、ブドウ等)、野菜(例えば、トマト、ニンジン等)、つる作物(例えば、グレープ、イチゴ、ブルーベリー、ブラックベリー等)、林業(例えば、マツ、トウヒ、ユーカリ、ポプラ等)、牧草管理(牧草家畜をサポートするのに用いられる混合植物)が挙げられる。
本発明に従って、検出可能な植物疾病としては、以下のものが例示される。
小麦の疾病:赤カビ病(Fusarium graminearum、F. avenacerum、F. culmorum、Microdochium nivale)、雪腐病(Typhula sp.、Micronectriella nivalis)、裸黒穂病(Ustilago tritici、U. nuda)、黒粒病(Tilletia caries)、葉枯病(Mycosphaerella graminicola)及びコムギいもち病(Leptosphaeria nodorum)、
コーンの疾病:黒穂病(Ustilago maydis)及び褐斑病(Cochliobolus heterostrophus)、
柑橘類の疾病:黒点病(Diaporthe citri)、赤カビ病(Elsinoe fawcetti)、青かび病(Penicillium digitatum、P. italicum)及びカンキツグリーニング病(Candidatus Liberibacter spp.)、
リンゴの疾病:花腐れ(Monilinia mali)、うどんこ病(Podosphaera leucotricha)、黒斑病(Alternaria alternata apple pathotype)、赤カビ病(Venturia inaequalis)、苦腐れ(Colletotrichum acutatum)及び根頭腐敗(Phytophtora cactorum)、
ナシの疾病:赤カビ病(Venturia nashicola、V. pirina)、黒斑病(Alternaria alternata Japanese pear pathotype)、赤星病(Gymnosporangium haraeanum)及び果実腐敗症(Phytophtora cactorum)、
モモの疾病:赤腐れ(Monilinia fructicola)、赤カビ病(Cladosporium carpophilum)及びホモプシス腐敗病(Phomopsis sp.)、
ブドウの疾病:炭疽病(Elsinoe ampelina)、晩腐病(Glomerella cingulata)、黒斑病(Guignardia bidwellii)、べと病(Plasmopara viticola)及び灰色カビ病(Botrytis cinerea)、
柿の疾病:炭疽病(Gloeosporium kaki)及び斑点病(Cercospora kaki、Mycosphaerella nawae)、
ゴードの疾病:炭疽病(Colletotrichum lagenarium)、標的斑点病(Corynespora cassiicola)、つる枯病(Mycosphaerella melonis)、つる割病(Fusarium oxysporum)、べと病(Pseudoperonospora cubensis)及び疫病(Phytophthora sp.)、
トマトの疾病:夏疫病(Alternaria solani)、トマト半身萎ちょう病(Cladosporium fulvum)、及び疫病(Phytophthora infestans)、
アブラナ科野菜の疾病:黒斑病(Alternaria japonica)、白斑(Cercosporella brassicae)及びべと病(Peronospora parasitica)、
菜種の疾病:菌核病(Sclerotinia sclerotiorum)及び灰斑病(Alternaria brassicae)、
大豆の疾病:紫斑病(Cercospora kikuchii)、黒とう病(Elsinoe glycines)、ダイズ黒とう病(Diaporthe phaseolorum var. sojae)、さび病(Phakopsora pachyrhizi)及び落葉病(Phytophthora sojae)、
小豆の疾病:灰色カビ病(Botrytis cinerea)及び菌核病(Sclerotinia sclerotiorum)、
インゲン豆の疾病:灰色カビ病(Botrytis cinerea)、菌核病(Sclerotinia sclerotiorum)及びインゲン豆炭疽病(Colletotrichum lindemthianum)、
ピーナツの疾病:斑点病(Cercospora personata)、褐色葉枯病(Cercospora arachidicola)及び白絹病(Sclerotium rolfsii)、
ジャガイモの疾病:夏疫病(Alternaria solani)及び葉枯れ病(Phytophthora infestans)、
綿の疾病:つる割病(Fusarium oxysporum)、
タバコの疾病:褐斑病(Alternaria longipes)、炭疽病(Colletotrichum tabacum)、べと病(Peronospora tabacina)及びタバコ疫病(Phytophthora nicotianae)、
テンサイの疾病:セルコスポラ斑点病(Cercospora beticola)、葉枯れ(Thanatephorus cucumeris)、根腐れ(Thanatephorus cucumeris)及び黒根病(Aphanidermatum cochlioides)、
バラの疾病:黒斑病(Diplocarpon rosae)及びうどんこ病(Sphaerotheca pannosa)、
キク及びキク科植物の疾病:べと病(Bremia lactucae)及び葉枯れ(Septoria chrysanthemi-indici)、
様々な植物の疾病: Pythium spp.により生じる疾病(Pythium aphanidermatum、Pythium debarianum、Pythium graminicola、Pythium irregulare、Pythium ultimum)、灰色カビ病(Botrytis cinerea)、菌核病(Sclerotinia sclerotiorum)及びRhizoctonia spp.により生じる立枯れ(Rhizoctonia solani)、
ダイコンの疾病:黒斑病(Alternaria brassicicola)、
芝の疾病:ドラースポット(Sclerotinia homeocarpa)、褐色斑及びラージパッチ、
バナナの疾病:シガトーカ病(Mycosphaerella fijiensis、Mycosphaerella musicola、Pseudocercospora musae)、
並びに、コウジカビ属、ペニシリウム属、フザリウム属、トリコデルマ属、ティエラビオプシス属、クロカビ属、ムコール属、フォーマ属及びディプロディア属のバクテリアにより生じる種子の疾病又は様々な植物の成長の初期段階における疾病が例示される。
Claims (79)
- 環境又は食品サンプル中の標的分析物を検出する方法であって、
前記サンプルを、前記サンプル中の前記分析物に特異的に結合するエンティティにより表面変性しておいた複数のナノ結晶と接触させる工程と、
前記サンプル中の前記分析物に結合した前記ナノ結晶を、未結合のナノ結晶から分離する工程と、
前記分析物に結合した前記ナノ結晶を検出する工程とを含む、方法。 - 前記ナノ結晶は、独特な光学的サインを生成する、独特で均一なモルホロジー、サイズ及び/又は組成物を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記独特な光学的サインは、立ち上がり及び/又は減衰時間で発現される、請求項2に記載の方法。
- 前記ナノ結晶は、アップコンバージョン蛍光体粒子である、請求項1に記載の方法。
- 前記ナノ結晶は、ランタン(La)、セリウム(Ce)、プラセオジム(Pr)、ネオジミウム(Ne)、プロメチウム(Pm)、サマリウム(Sm)、ユーロピウム(Eu)、ガドリニウム(Gd)、テルビウム(Tb)、ジスプロシウム(Dy)、ホルミウム(Ho)、エルビウム(Er)、ツリウム(Tm)、イッテルビウム(Yb)及びルテチウム(Lu)から選択される少なくとも1つの希土類元素を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ナノ結晶は、4nm〜400nmのサイズを有する、請求項1に記載の方法。
- 前記ナノ結晶は、10−8秒以上発光する、請求項1に記載の方法。
- 前記ナノ結晶は、900nm〜1000nmの波長で励起し得る、請求項1に記載の方法。
- 前記ナノ結晶は、960nm〜980nmの波長で励起する、請求項8に記載の方法。
- 前記ナノ結晶は、400nm〜12,000nmの波長で発光する、請求項1に記載の方法。
- 前記ナノ結晶は、β相粒子である、請求項1に記載の方法。
- 前記ナノ結晶は、量子ドット、カーボンナノチューブ、金粒子、銀粒子及び磁気又は染料ドープ粒子から選択される第2のレポーターと組み合わせられる、請求項1に記載の方法。
- 前記分析物に特異的に結合する前記エンティティは、抗体、タンパク質、アプタマーポリペプチド、又はポリヌクレオチドである、請求項1に記載の方法。
- ゲノム分析を用いて、培養できない微生物又は微生物の混合集団の遺伝子配列情報から特異的エピトープを識別し、前記培養できない微生物に特異的に結合する遺伝学的に同一のエピトープに対する結合剤を生成する、請求項1に記載の方法。
- 前記分析物は、バクテリア、酵母、菌類、又はウイルスである、請求項1に記載の方法。
- 前記分析物は、農業病原体である、請求項1に記載の方法。
- 前記農業病原体は、カンキツグリーニング病、ジャガイモ疫病、うどんこ病、赤色斑、タバコモザイクウイルス、火傷病及び/又はピアス病の原因となる病原体から選択される、請求項16に記載の方法。
- 前記サンプルは、土壌又は植物材料である、請求項1に記載の方法。
- 前記サンプルは、植物組織である、請求項18に記載の方法。
- 前記分析物は、微生物ベースの薬剤である、請求項1に記載の方法。
- 前記微生物ベースの薬剤は、微生物バイオサーファクタント又はマイコトキシンである、請求項20に記載の方法。
- 前記サンプルは、食品であり、前記分析物は、マイコトキシンである、請求項1に記載の方法。
- 前記サンプルは、動物からの生物学的サンプルである、請求項1に記載の方法。
- 前記生物学的サンプルは、血液、糞便、粘液、唾液又は組織サンプルである、請求項23に記載の方法。
- 前記サンプルは、水サンプルである、請求項1に記載の方法。
- 前記水サンプルは、飲料水、地下水、地表水及び廃水から選択される、請求項25に記載の方法。
- 前記サンプルは、微生物を含有する市販品である、請求項1に記載の方法。
- 前記市販品は、農業に用いられる、請求項27に記載の方法。
- 前記市販品は、食品である、請求項27に記載の方法。
- 前記微生物は、プロバイオティクスである、請求項29に記載の方法。
- 前記微生物は、病原体である、請求項29に記載の方法。
- 前記分析物は、微生物であり、前記分析物の検出感度は、101CFU/mL以下である、請求項1に記載の方法。
- 前記ナノ結晶を調整して、サンプル中の自然発生発色団からのバックグラウンド干渉を排除する、請求項1に記載の方法。
- 多数の独立調整ナノ結晶が、単一サンプルから多数の分析物の分析を促進するために、単一担体に多重アレイで配置される、請求項1に記載の方法。
- 5以上の分析物が、同時に分析される、請求項1に記載の方法。
- 前記方法は、サンプルが得られた100ヤード以内で行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記方法は、サンプルが得られた10分以内で行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記検出工程は、一回の読み出しで行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記検出は、20分未満で実施される、請求項1に記載の方法。
- 前記分析物の前記検出、定量化及び/又は追跡は、農家、取締官、コンプライアンス係官又は流通業者によりなされる、請求項1に記載の方法。
- 前記分析は、商品の製造直後から前記商品の使用直前までのサプライチェーンの任意の点で実施される、請求項1に記載の方法。
- 個々の試験からのデータは、前記試験を行った場所から離れた場所からアクセス可能なデータベースに転送される、請求項1に記載の方法。
- 前記データを用いて、有益な微生物の性能を評価する、又は病原体の動きを評価する、請求項42に記載の方法。
- ラテラルフロー又はマイクロ流体アッセイを用いて実施される、請求項1に記載の方法。
- 前記ラテラルフロー又はマイクロ流体アッセイは、イムノアッセイである、請求項44に記載の方法。
- 前記アッセイは、ポータブル検出デバイスを用いて実施される、請求項44に記載の方法。
- 前記ポータブル検出デバイスは、LED及びカメラを含む、請求項46に記載の方法。
- 前記ポータブル検出デバイスは、携帯電話である、請求項47に記載の方法。
- 前記アッセイは、複数フロー技術を用いて実施される、請求項44に記載の方法。
- ラテラルフロー試験片は、1つ以上のサンプル受入領域及び1つ以上の標的捕捉ゾーンを含む固体担体を有する、請求項44に記載の方法。
- 前記固体担体は、プラスチック又はガラス基材へとエッチング又は成形されたニトロセルロース又は工学マイクロ流体チャネルである、請求項50に記載の方法。
- 前記標的捕捉ゾーンは、表面変性されて、前記環境サンプルにおいて、微生物又は微生物ベースの薬剤に特異的に結合する、請求項48に記載の方法。
- 請求項1〜52の前記アッセイを実施するためのデバイス。
- 前記標的分析物に特異的に結合するエンティティにより表面変性されたナノ結晶を含む、請求項53に記載のデバイス。
- 前記ナノ結晶は、独特な光学的サインを生成する、独特で均一なモルホロジー、サイズ及び/又は組成物を有する、請求項54に記載のデバイス。
- 前記独特な光学的サインは、立ち上がり及び/又は減衰時間で発現される、請求項55に記載のデバイス。
- 前記ナノ結晶は、アップコンバージョン蛍光体粒子である、請求項54に記載のデバイス。
- 前記ナノ結晶は、ランタン(La)、セリウム(Ce)、プラセオジム(Pr)、ネオジミウム(Ne)、プロメチウム(Pm)、サマリウム(Sm)、ユーロピウム(Eu)、ガドリニウム(Gd)、テルビウム(Tb)、ジスプロシウム(Dy)、ホルミウム(Ho)、エルビウム(Er)、ツリウム(Tm)、イッテルビウム(Yb)及びルテチウム(Lu)から選択される少なくとも1つの希土類元素を含む、請求項54に記載のデバイス。
- 前記ナノ結晶は、4nm〜400nmのサイズを有する、請求項54に記載のデバイス。
- 前記ナノ結晶は、10−8秒以上発光する、請求項54に記載のデバイス。
- 前記ナノ結晶は、900nm〜1000nmの波長で励起し得る、請求項54に記載のデバイス。
- 前記ナノ結晶は、960nm〜980nmの波長で励起する、請求項61に記載のデバイス。
- 前記ナノ結晶は、400nm〜12,000nmの波長で発光する、請求項54に記載のデバイス。
- 前記ナノ結晶は、β相粒子である、請求項54に記載のデバイス。
- 前記ナノ結晶は、量子ドット、カーボンナノチューブ、金粒子、銀粒子及び磁気又は染料ドープ粒子から選択される第2のレポーターと組み合わせられる、請求項54に記載のデバイス。
- 前記分析物に特異的に結合する前記エンティティは、抗体、タンパク質、アプタマーポリペプチド、又はポリヌクレオチドである、請求項54に記載のデバイス。
- 前記ナノ結晶を調整して、サンプル中の自然発生発色団からのバックグラウンド干渉を排除する、請求項54に記載のデバイス。
- 多数の独立調整ナノ結晶が、単一サンプルから多数の分析物の分析を促進するために、単一担体に多重アレイで配置される、請求項54に記載のデバイス。
- 個々の試験からのデータは、前記試験を行った場所から離れた場所からアクセス可能なデータベースに転送される、請求項54に記載のデバイス。
- ラテラルフロー又はマイクロ流体アッセイである、請求項54に記載のデバイス。
- 前記ラテラルフロー又はマイクロ流体アッセイは、イムノアッセイである、請求項70に記載のデバイス。
- 前記デバイスの一コンポーネントとして、ポータブル検出ユニットを含む、請求項54に記載のデバイス。
- 前記ポータブル検出ユニットは、LED及びカメラを含む、請求項72に記載のデバイス。
- 前記ポータブル検出ユニットは、携帯電話である、請求項73に記載のデバイス。
- 前記アッセイは、複数フロー技術を用いて実施される、請求項54に記載のデバイス。
- ラテラルフロー試験片は、1つ以上のサンプル受入領域及び1つ以上の標的捕捉ゾーンを含む固体担体を有する、請求項54に記載のデバイス。
- 前記固体担体は、プラスチック又はガラス基材へとエッチング又は成形されたニトロセルロース又は工学マイクロ流体チャネルである、請求項76に記載のデバイス。
- 前記標的捕捉ゾーンは、表面変性されて、前記環境サンプルにおいて、微生物又は微生物ベースの薬剤に特異的に結合する、請求項76に記載のデバイス。
- PCRを用いて標的ポリヌクレオチド配列を検出するアッセイであって、
プライマー配列を用いて、前記標的ポリヌクレオチド配列を増幅し、前記プライマー配列の少なくとも1つが、ナノ結晶に結合している、アッセイ。
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