KR20200011456A - 미생물 및 기타 분석물을 검출, 정량화, 및/또는 추적하기 위한 진단 검정법 - Google Patents

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폴 조너
에릭 제이. 매써
조쉬 콜린스
하워드 벨
스캇 앨런 시바타
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로커스 애그리컬쳐 아이피 컴퍼니 엘엘씨
인텔리전트 머테리얼 솔루션즈 아이엔씨.
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Abstract

본 발명은, 이들의 고유 광학 특징에 기초하여 형태, 크기, 및 조성이 균일한 나노 결정(nanocrystal)을 사용하여 분석물(analytes)을 다중화 검출(multiplexed detection)하기 위한 방법과 검정법(assay)을 제공한다. 기술된 방법과 검정법은 복합 환경 샘플에서 미생물 및/또는 미생물 기반 작용제(microbe-based agents)를 검출하기 위해 특히 유용하다.

Description

미생물 및 기타 분석물을 검출, 정량화, 및/또는 추적하기 위한 진단 검정법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2018년 5월 18일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 제62/507,895호의 이점을 주장하고, 이는 본원에 완전히 참조로 포함되어 있다.
농업, 임업, 및 식품, 영양 첨가제, 섬유 및 천연 재료를 생산하는 다른 수단은 수 많은 환경 과제로 인해 점점 어려워지고 있다. 이러한 과제는 해충 내성, 극한 온도, 및 해충을 포함한다.
수확량을 올리고 병원체, 해충, 및 질병으로부터 작물을 보호하기 위해, 농업인은 합성 화학물질과 화학 비료의 사용에 크게 의존했지만, 과도하게 사용되거나 적절하지 않게 적용될 경우, 이러한 물질은 지표수로 흘러 들어, 지하수 안으로 용해되고, 공기 중으로 증발할 수 있다. 대기 및 수질 오염의 원인으로서, 이들 물질은 점점 더 자세히 조사되어, 이들의 책임 있는 사용이 생태적 및 상업적인 의무가 되도록 한다. 적합하게 사용되는 경우에도, 특정한 화학 비료와 농약의 과도한 의존과 장기간의 사용은 토양 생태계를 해롭게 변화시키고, 스트레스 내성을 감소시키며, 해충 내성을 증가시키고, 식물과 동물의 성장 및 생명력을 방해한다.
전세계적으로 농업인들이 지속적으로 더 많은 식량과 영양 보충제를 재배할 수 있게 할 뿐만 아니라, 임업인들이 지속적으로 더 많은 섬유와 구조 재료를 생산할 수 있게 하기 위해서, 미생물이 점점 더 사용된다. 박테리아, 효모 및 균류와 같은 미생물과, 이들의 부산물은 농업, 축산업 및 임업을 포함하는 많은 환경(setting)과, 토양, 물 및 기타 천연 자원의 복원에서 유용하다.
농업인들은 살아 있는 미생물, 이들 미생물에서 유래된 바이오 제품, 및 이들의 조합물과 같은 생물학적 제제를, 예를 들어, 농약으로 사용하는 것을 점차적으로 환영하고 있다. 이러한 생물학적 제제는 다른 통상적인 농약보다 중요한 이점을 갖는다. 이점은: 1) 통상적인 화학 농약에 비해서 덜 해롭고; 2) 더 효율적이고 특이적이며; 3) 흔히 빠르게 생분해되어, 환경 오염을 덜 일으키는 것을 포함한다.
미생물과 미생물 기반 작용제(microbe-based agent)의 사용에 대해 엄청난 잠재력이 존재하지만, 환경에서 이러한 미생물과 미생물 기반 작용제를 검출 및/또는 추적하는 능력은 제한되었다. 미생물과 미생물 기반 작용제를 검출 또는 추적하는 능력은, 작물, 관상용 식물, 잔디, 수목, 및 동물을 키우는 데 적용하는 것을 포함해서, 농업에 대해서 특히 유리할 것이다.
따라서, 유익한 미생물 또는 미생물 기반 작용제뿐만 아니라 병원체를 포함하는 미생물의 검출은 현장에서 환경의 변화를 반영하고 식물 건강을 개선하기 위해 적절한 조치를 취하는 것을 촉진할 것이다. 또한, 환경에서 미생물 병원체를 검출하고 모니터링하는 것은 인간 건강을 증진시키는 데 또한 유리할 수 있다.
미생물을 검출하기 위해 사용되는 종래의 절차는 전형적으로 시료를 배양하는 단계와 미생물 활성을 검출하는 단계를 수반한다. 일반적으로, 표적 미생물은 이러한 표적 미생물에 특이적인 배양 배지(culture medium)에서 접종되고, 이는 이들의 성장을 위한 모든 영양소를 제공한다. 시료는 처리되지 않은 천연 샘플일 수 있거나, 또는 예를 들어, 막 여과에 의해서 전처리된 샘플일 수 있다.
검출 방법은 일반적으로 특정 표적에 결합하고 검출 가능한 신호를 생성하는 적어도 하나의 분석 시약을 사용한다. 이들 분석 시약은 전형적으로 높은 정도의 특이성과 친화도로 표적에 결합할 수 있는 항체 또는 올리고뉴클레오티드와 같은 프로브(probe) 분자와, 적합한 장비에 의해 검출될 수 있는 공유 결합된 형광 염료 분자와 같은 검출 가능한 표지를 포함한다. 전형적으로, 프로브 분자의 결합 특성은 검출 방법의 특이성을 정의하고, 관련된 표지의 검출 가능성은 검출 방법의 감도를 결정한다.
형광 염료를 사용한 검출 방법이 높은 감도, 낮은 배경, 및 정확한 측정과 같은 상당한 이점을 갖고, 흔히 생물 의학 연구에서 유용한 결과를 제공하지만, 농업 산업에 대해서는 미생물과 미생물 기반 작용제를 검출하고 추적하는 데 적합하지 않다. 그 이유는, 1) 가장 일반적인 형광단이 스펙트럼의 UV/가시 부분에 위치한 흡수와 방출 밴드 모두를 갖는 방향족 유기 분자이고; 2) 형광 방출의 수명이 약 1 내지 100 ns 정도로 일반적으로 짧으며; 3) 광퇴색(photobleaching)으로 인해 긴 검출 시간 동안 형광 신호를 적분하는 것이 흔히 가능하지 않으며; 4) 형광단의 검출이 정교한 장비를 필요로 한다는 것을 포함한다.
따라서, 정확한 진단 정보를 산출하기 위해서는, 상당한 샘플 준비 단계를 필요로 하지 않으면서, 환경에서 유익한 미생물, 미생물 기반 작용제, 및 병원체를 신속하고 용이하게 검출 및/또는 추적하기 위한 장치와 방법에 대한 필요성이 남아 있다.
본 발명은 환경 및 식품 샘플에서 미생물, 미생물 기반 작용제, 및/또는 다른 분석물을 효율적이고 정확하게 검출, 정량 및/또는 추적하기 위한 방법과 장치를 제공한다. 샘플은, 예를 들어, 토양, 물, 기름, 폐기물, 식품, 나뭇잎, 및/또는 가축 또는 다른 동물로부터의 생물학적 샘플일 수 있다.
분석물은 미생물의 존재 또는 활동으로 인해 발생하는 미생물, 미생물 기반 작용제 및/또는 분석물일 수 있다. 미생물은 농업 병원체를 포함하는 유익한 미생물 또는 병원체일 수 있다.
바람직한 실시예에서, 본 발명은 해당 분석물을 신속하고 효율적이며 정확하게 검출, 정량, 및/또는 추적하기 위한 현장 진단 검정법(in-field diagnostic assay)을 제공한다. 유리하게는, 다수의 분석물이 동시에 검출될 수 있다. 또한, 분석물은 복합 샘플에서, 그리고 무시할 만한 샘플 준비로, 또는 샘플 준비 없이 낮은 농도로 검출될 수 있다.
유리하게는, 본 발명의 검정법은 하나 이상의 해당 분석물(예를 들어, 유익한 미생물, 미생물 기반 작용제 및/또는 병원체)의 존재를 확인 및/또는 정량하기 위해 검출 표지로서 조정 가능한 나노 결정을 사용한다. 이러한 조정 가능성(tunability)은, 예를 들어, 샘플의 발색단으로부터, 배경 간섭(background interference)을 걸러내는 것을 용이하게 한다. 이러한 조정 가능성은 또한 다수의 분석물을 동시에 검출할 수 있도록 한다. 검정법은, 예를 들어, 단일 샘플로부터 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 또는 20개, 또는 그 이상의 분석물을 동시에 검출할 수 있다.
나노 결정은 균일한 형태와 균일한 크기를 특징으로 한다. 또한, 나노 결정은 광 방출 스펙트럼 프로파일, 광 흡수 스펙트럼 프로파일, 광 출력 의존성 프로파일, 광 수명 시그니처(optical lifetime signature)(상승 및 붕괴 시간), 및 표면 기능성(surface functionality)과 같은 이들 자체의 고유 광학 및 자기 특성을 가질 수 있다. 예를 들어, 나노 결정은 해당 분석물(들)에 특이적으로 결합할 수 있도록 하기 위해 표면 변성될 수 있다. 표면 변성(surface modification)은, 예를 들어, 나노 결정을 항체, 단백질, 앱타머(aptamer), 뉴클레오티드, 및/또는 다른 화합물에 연결시킴으로써 이루어질 수 있다.
일 실시예에서, 나노 결정은 이들에 작용하는 에너지를 흡수하고 그 후에 흡수된 에너지를 방출하는 무기 발광 또는 전자기적으로 활성인 재료이다. 일 실시예에서, 나노 결정은 스톡스(stokes){하향-변환(down-converting)} 인광체이다. 광자 형태의 에너지를 흡수하고 더 낮은 주파수(더 낮은 에너지, 더 긴 파장) 대역 광자를 방출하는 인광체는 하향 변환 인광체이다.
다른 실시예에서, 나노 결정은 안티 스톡스(anti-stokes){상향 변환(up-converting)} 인광체이다. 낮은 주파수에서 둘 이상의 광자 형태의 에너지를 흡수하고 더 높은 주파수(더 높은 에너지, 더 짧은 파장) 대역에서 방출하는 인광체는 상향 변환 인광체이다.
일 실시예에서, 나노 결정은 희토류(rare earth, RE) 함유 입자이다. RE 원소는 이트륨 및 란탄족(Ln) 계열의 원소, 즉, 란탄(La), 세륨(Ce), 프라세오디뮴(Pr), 네오디뮴(Ne), 프로메튬(Pm), 사마륨(Sm), 유로퓸(Eu), 가돌리늄(Gd), 테르븀(Tb), 디스프로슘(Dy), 홀뮴(Ho), 에르븀(Er), 툴륨(Tm), 이테르븀(Yb), 및 루테튬(Lu)을 포함한다.
단일 검정법에서 하나보다 많은 분석물을 검출하기 위해, 상이한 여기 및/또는 방출 파장, 및/또는 상이한 상승 및 붕괴 속도를 갖는 나노 결정을 사용하는 것이 유리하다.
이 방법은, 해당 분석물을 갖는 것으로 의심되는 환경 또는 식품 샘플을 제공하는 단계, 샘플을 복수의 나노 결정과 접촉시키는 단계, 및 분석물에 결합하는 나노 결정을 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에 따라 검출, 정량 및/또는 추적될 수 있는 미생물은, 박테리아, 고세균(archaea), 효모, 균류, 바이러스, 원생동물(protozoa), 및 다세포 유기체를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명에 따른 분석물일 수 있는 미생물 기반 작용제는 미생물, 미생물 대사물질 및 다른 미생물 성장 부산물을 함유하는 조성물을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 일 실시예에서, 본 발명은 미생물 및/또는 미생물 기반 작용제에 반응하여 개체(entity)(동물 또는 식물과 같은)에 의해 생산된 생성물을 검출하기 위한 방법을 추가로 제공한다.
유리하게는, 본 발명의 검정법은 환경 또는 먹이 사슬(food chain)에서 분석물의 추적을 용이하게 하도록 사용될 수 있다.
본 발명의 검정법은, 농작물, 가축, 임업(forestry), 잔디 관리, 관상용 식물(ornamentals), 목초지, 수경 재배, 폐기물 처리, 먹이 사슬, 및 동물 건강을 포함하지만 이에 제한되지 않는 광범위한 환경에서 사용될 수 있다.
특정 실시예에서, 본 발명의 방법은 분석 검정법(analytical assay)을 수행하는 것을 용이하게 하도록 기판(substrate)에 샘플을 도포하는 단계를 포함한다. 기판의 표면은, 예를 들어, 항체, 단백질, 앱타머, 뉴클레오티드, 및/또는 분석물에 특이적으로 결합하거나, 또는 이와 다르게 분석물과 결합하는 다른 화합물과 결합할 수 있다. 검정법은, 예를 들어, 측방 유동 방식(lateral flow format), 다중-웰 배열(multi-well array), 또는 미세 유체 공학(microfluidics)을 사용할 수 있다.
특정 실시예에서, 본 발명은 검출 가능한 표지의 나노 결정이 상향 변환 인광체(UCP)일 수 있는 측방 유동 또는 미세 유체 검정법 방식을 제공한다. 일 실시예에서, 검출 장치는 상향 변환 방출 파장을 검출한다. 다른 실시예에서, 검출 장치는 인광체 수명 시그니처를 검출한다.
상향 변환 나노 결정(UCNC) 또는 서브 미크론(submicron) 인광체 입자와 같은 인광체 입자의 크기, 형태, 흡수, 방출, 상승 시간, 붕괴 시간, 출력 밀도(power density), 및 다른 특성을 조절하는 능력은, 방대한 배열의 변별적 시그니처(distinctive signatures)를 갖는 재료의 형성을 가능하게 한다. 희토류 UCNC 플랫폼의 범용성(versatility)은 단일 판독기 시스템을 사용하여 광범위한 검출 기능을 갖는 능력을 크게 증가시킨다. 또한, 희토류 나노 입자 또는 서브 미크론 입자 고유의 스펙트럼 핑거 프린트(fingerprint)를 광학적으로 조정하는 능력은 매우 유리한 다중화 기능을 제공한다.
본 발명의 방법은 복합 샘플에서 해당 미생물 및/또는 미생물 기반 작용제의 신속하고, 민감하며, 저렴한 검출 및/또는 정량을 용이하게 한다. 본 발명에 따른 표지로서 나노 결정을 사용하는 것은, 예를 들어, 식품, 농업 및 가축 샘플의 경우에서와 같은, 복합 환경 및 식품 샘플에서 낮은 수준의 분석물 표적(target)을 검출할 수 있는 신속하고, 다중화된, 특이적인 검정법 플랫폼을 제공한다.
본 발명은 미생물, 미생물 기반 작용제, 및/또는 다른 분석물을 효율적이고 정확하게 검출, 정량, 및/또는 추적하기 위한 방법과 장치를 제공한다. 분석물은 토양, 물, 식품, 폐기물, 기름, 식물, 및 동물로부터의 생물학적 샘플에서와 같은, 환경 또는 식품 샘플에서 검출될 수 있다. 미생물은, 예를 들어, 농업 병원체와 동물 병원체를 포함하는 유익한 미생물 또는 병원체일 수 있다.
본 발명의 방법은 하나 이상의 해당 분석물(예를 들어, 유익한 미생물, 미생물 기반 작용제, 및/또는 병원체)을 검출하기 위한 검출 표지로서 나노 결정을 사용한다. 유리하게는, 다수의 분석물이 단일 검정법에서 동시에 검출될 수 있다.
본 발명에 따라, 나노 결정은 조정 가능한 물리적 특성을 나타내고, 유리하게는, 제어된 크기 균일성, 형상 선택성 및 표면 기능성을 갖는다. 예를 들어, 나노 결정은 해당 분석물(들)에 특이적으로 결합할 수 있도록 하기 위해 표면 변성될 수 있다. 표면 변성은 나노 결정을, 예를 들어, 항체, 단백질, 앱타머, 뉴클레오티드, 및/또는 다른 화합물에 연결시킴으로써 이루어질 수 있다.
일 실시예에서, 본 발명은:
샘플을 복수의 나노 결정과 접촉시키는 단계로서, 나노 결정은 표적 분석물에 특이적으로 결합하는 개체로 표면 변성된, 단계,
분석물에 결합된 나노 결정을 결합되지 않은 나노 결정으로부터 분리하는 단계, 및
분석물에 결합하는 나노 결정을 검출하는 단계를
포함하는, 샘플에서 분석물을 검출하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명에 따라 검출, 정량 및/또는 추적된 미생물은, 박테리아{예를 들어, 포자(spore) 또는 영양(vegetative), 그램 양성(Gram positive) 또는 그램 음성(Gram negative)}, 고세균, 효모, 균류(예를 들어, 사상성 진균과 진균 포자), 바이러스, 원생동물, 및 다세포 유기체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 임의의 원핵(prokaryotic) 또는 진핵(eukaryotic) 미생물일 수 있다. 일부 경우에, 특히 해당되는 미생물은 병원성인 미생물이다. "병원체"라는 용어는 임의의 병원성 미생물을 나타내기 위해 사용된다. 다른 경우에는, 미생물이 유리하다.
특정 실시예에서, 선택적으로 복합 환경 샘플에서, 감귤 녹화병(citrus greening disease)을 일으키는 병원체를 검출하기 위해 방법이 사용된다. 황롱빙(Huanglongbing, HLB)으로도 알려진 감귤 녹화병은, 체관부(phloem)가 제한된 까다로운(fastidious) 원핵성 α-프로테오박테리윰 칸디다투스 리베리박터 종(proteobacterium Candidatus Liberibacter spp.), 칸디다투스 아프리카누스(Ca. africanus), 및 칸디다투스 리베리박터 아메리카누스(Ca. L. americanus)에 의해 일어난다.
본원에 기술된 방법은 감귤 녹화병에 감염되거나 또는 감염될 수 있는 임의의 나무 또는 다른 식물에 사용하기에 적합하다. 예시적인 식물은, 시트러스 시넨시스(Citrus sinensis)(네이블 오렌지), 레몬{시트러스 리몬(C. limon)}, 라임{시트러스 라티폴리아(C. latifolia)}, 그레이프프루트{시트러스 파라다이스(C. paradise)}, 광귤{시트러스 아우란티윰(C. aurantium)}, 및 만다린 귤{시트러스 레티큘라타(C. reticulata)}를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 시트러스 속(genus　Citrus)의 임의의 품종을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
다른 특정 실시예에서, 본 발명의 검정법은 감자 역병(Potato Late Blight), 포도 백분병(Grape Powdery Mildew), 붉은 반점(Red Blotch), 담배 모자이크 바이러스(Tobacco Mosaic Virus), 화상병(Fire blight) 및/또는 피어스 질병(Pierce's Disease)을 일으키는 식물 병원체를 검출, 정량 및/또는 추적하기 위해 사용된다.
샘플은 물, 토양, 식품, 식물, 공기, 폐기물, 동물로부터의 생물학적 샘플, 먼지, 및 표면에서 수집된 샘플일 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다.
수집은 스폰지, 와이프(wipe), 면봉(예를 들어, 감긴 섬유 제품), 필름, 브러시(예를 들어, 단단하거나 또는 변형 가능한 강모를 갖는) 등, 및 이들의 조합물의 사용을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 임의의 다양한 방법에 의해서 이루어질 수 있다.
일 실시예에서, 분석물은 미생물 기반 작용제이다. 본 발명에 따른 미생물 기반 작용제는 미생물, 미생물 대사물질 및 다른 미생물 성장 부산물을 함유하는 조성물을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시예에서, 미생물 기반 작용제는 미생물 생물 계면활성제(microbial biosurfactant) 또는 마이코톡신(mycotoxin)이다.
본 발명의 검정법은 환경 또는 먹이 사슬에서 미생물, 미생물 기반 작용제, 및 다른 분석물의 추적을 용이하게 하도록 사용될 수 있다.
바람직한 실시예에서, 나노 결정은 희토류 함유 격자, 균일한 3차원 크기, 및 균일한 다면체 형태를 갖는 결정 형태의 단분산 입자이다. 바람직하게는, 단분산 입자는 이들의 균일한 크기와 형상으로 인해 초격자(superlattice)로 자체 조립될 수 있다.
일 실시예에서, 나노 결정은 이들에 작용하는 에너지를 흡수하고 그 후에 흡수된 에너지를 방출하는 무기 발광 또는 전자기적으로 활성인 재료이다. 이러한 나노 결정은 흡수된 광을 제거한 후 10-8 초를 초과하는 동안 계속해서 광을 방출하는 인광체로서 작용할 수 있다. 인광체의 잔광(afterglow) 또는 인광(phosphorescence)의 반감기는 전형적으로 약 10-6 초 내지 수일의 범위이다.
특정 실시예에서, 본 발명에 따른 나노 결정은 스톡스(하향-변환) 인광체이다. 광자 형태의 에너지를 흡수하고 더 낮은 주파수(더 낮은 에너지, 더 긴 파장) 대역 광자를 방출하는 인광체는 하향 변환 인광체이다.
다른 실시예에서, 나노 결정은 안티 스톡스(상향 변환) 인광체이다. 낮은 주파수에서 둘 이상의 광자 형태의 에너지를 흡수하고 더 높은 주파수(더 높은 에너지, 더 짧은 파장) 대역에서 방출하는 인광체는 상향 변환 인광체이다. 상향 변환 인광체는, 예를 들어, 근적외선, 더 낮은 에너지, 더 긴 파장의 광에 의해 조사될 수 있고, 더 높은 에너지 및 더 짧은 파장인 가시광을 방출할 수 있다.
일 실시예에서, 나노 결정은 희토류(RE) 함유 입자이다. RE 원소는 이트륨 및 란탄족(Ln) 계열의 원소, 즉, 란탄(La), 세륨(Ce), 프라세오디뮴(Pr), 네오디뮴(Ne), 프로메튬(Pm), 사마륨(Sm), 유로퓸(Eu), 가돌리늄(Gd), 테르븀(Tb), 디스프로슘(Dy), 홀뮴(Ho), 에르븀(Er), 툴륨(Tm), 이테르븀(Yb), 및 루테튬(Lu)을 포함한다.
특정 실시예에서, 본 발명의 하향 변환 나노 결정은 1 nm 내지 400 nm, 바람직하게는, 10 nm 내지 400 nm의 파장에서 여기될 수 있다.
다른 실시예에서, 본 발명의 상향 변환 나노 결정은 700 nm 내지 2000 nm, 바람직하게는, 800 nm 내지 1500 nm, 더 바람직하게는, 900 nm 내지 1000 nm의 파장에서 여기될 수 있다. 특정 실시예에서, 상향 변환 나노 결정은 960 nm 내지 980 nm의 파장에서 여기될 수 있다.
일 실시예에서, 본 발명의 나노 결정은 400 nm 내지 12,000 nm의 파장에서 광을 방출한다.
일 실시예에서, 본 검정법에 사용된 나노 결정은 양자점(quantum dot), 탄소 나노 튜브뿐만 아니라, 자기 및 염료 도핑된 나노 입자와 같은 제2 리포터(reporter)와 결합될 수 있다. 나노 결정을 다른 파 이동(waveshifting) 및 흡수 재료와 결합시키는 것은 추가 다중화 및 기능성을 허용한다. 상향 변환 나노 결정 및 동일한 포획 항체로 상향 변환 나노 결정의 방출을 흡수하는 하향 변환 양자점과 같은 2개의 상보적인 입자가 표적에 결합할 것이다. 980 nm 광으로 활성화되면 양자점은 그 자체로 방출하지는 않지만, 상향 변환 나노 결정에 근접하면 나노 결정은 양자점을 활성화하는 데 필요한 에너지를 전달할 것이다. 두 입자가 충분히 가까운 유일한 순간은 이들이 특정 표적에 결합하는 경우이다. 미세 유체 시스템에서, 결합 효과는 실시간으로 정량될 수 있다.
나노 결정에 자기 특성을 추가하는 것은, 입자가 자석을 이용하여 검정법에 유입될 수 있기 때문에, 분석 전에 더욱 빠른 처리 시간을 허용한다. 검출하는 동안 자기 특성이 또한 판독될 수 있다. 다른 금속과 결합된 희토류 결정은 상자성(paramagnetic) 및 강자성(ferromagnetic)과 같은 상이한 특성을 나타낸다.
나노 결정 위에 코팅된 유기 염료는 필터를 형성하고, 스펙트럼 간섭에 유리할 수 있다. 란탄족 선은 때때로 중첩되고, 유기 재료를 첨가하는 것은 스펙트럼에서 특정 영역의 차단을 허용하여 단일 방출을 생성한다.
개별 크기, 수명 및/또는 형태를 갖는 다수의 나노 결정이 결합되고 복합 환경 샘플 안으로 또는 그 위에 도입되어, 다수의 분석물 검출을 위해 사용될 수 있는 다수의 고유 검출 가능 표지를 제공할 수 있다. 희토류 나노 결정은, 예를 들어, 3가 희토류(또는 란탄족) 금속으로 인한 이들의 비교적 긴 인광 수명 붕괴 때문에 유리하다.
특정 표적을 확인하기 위해 상이한 표지를 사용함으로써 단일 검정법에서 하나보다 많은 분석물을 검출하기 위해 상이한 여기 및/또는 방출 파장을 갖는 나노 결정을 사용하는 것이 유리하다. 예를 들어, 적외선(IR), 자외선(UV), 또는 전자 여기에 의해 다수의 스펙트럼으로 분리된 색(예를 들어, 청색, 녹색, 및 적색)을 생성하여, 인광체 방출 파장, 강도 진폭, 및 분석물의 수를 동시에 측정하는 것이 가능하다. 특히, 포획 분자와 함께 나노 결정 컨쥬게이트(conjugate)의 면역 세포 화학적 사용(immunocytochemical use)은 환경 샘플에서 소량의 분석물의 민감한 검출을 허용한다.
유리하게는, 나노 결정을 사용하는 검정법의 다중화 특성은 샘플 성분으로부터 간섭되지 않으면서 복합 환경 또는 식품 샘플에서 해당 분석물을 검출할 수 있도록 한다. 예를 들어, 조정 가능한 특성을 갖는 나노 결정은 토양 또는 식물 샘플에 존재하는 간섭 발색단으로부터 해당 분석물의 정량을 허용한다.
일 실시예에서, 본 발명은 또한 나노 결정을 제조하기 위한 방법을 제공한다. 이 방법은: 반응 용기에서, 용매에 적어도 하나의 전구체 금속 염을 용해시켜 용액을 형성하는 단계; 적어도 약 340℃의 온도를 갖는 가열된 염욕(salt bath)에 반응 용기를 놓는 단계; 염욕에 열을 가하여 용액 내의 전구체 금속 염을 신속하게 분해하여 단분산 입자를 형성하는 단계; 단분산 입자의 크기를 증가시키기에 충분한 시간 동안 반응 용기를 염욕에서 유지하는 단계; 염욕으로부터 반응 용기를 제거하는 단계; 및 주위 온도 용매로 반응을 켄칭(quenching)하는 단계를 사용한다.
유리하게는, 본 발명은 103 CFU/mL 이하에서 미생물에 대한 검출 감도를 갖는 민감한 검정법을 제공한다. 바람직한 실시예에서, 감도는 102 CFU/mL, 더 바람직하게는, 101 CFU/mL이다. 따라서, 검정법은 101 CFU/mL 내지 109 CFU/mL 이상의 범위에 있는 복합 샘플에서 미생물을 검출할 수 있다.
본 발명은 또한 0.001 ng/mL 정도로 낮은 미생물 기반 작용제에 대한 검출 감도를 갖는 민감한 검정법을 제공한다.
유리하게는, 검정법은 현장에서 수행될 수 있다. 특정 실시예에서, 검정법은 샘플이 얻어진 1000, 500, 250, 100, 50, 20, 10, 5 또는 심지어 1 야드 이하 이내에서 수행된다. 또한, 검정법은, 예를 들어, 샘플이 채취된 60, 45, 30, 20, 10, 5, 또는 심지어 1분 이하 이내에 수행될 수 있다.
일 실시예에서, 방법은 복합 환경 샘플에서 하나 이상의 분석물을 동시에 검출하기 위해 사용될 수 있다. 검출은 60분 이하, 50분 이하, 40분 이하, 30분 이하, 20분 이하, 10분 이하, 또는 5분 이하에 이루어질 수 있다. 바람직한 실시예에서, 검정법은 PCR 또는 표준 ELISA를 이용하는 검정법보다 더 신속하고/신속하거나 더 적은 샘플 제조로 수행된다. 결과는 검정법이 완료되는 즉시 판독될 수 있고/있거나 저장되고/되거나 다른 위치로 전송될 수 있다. 예를 들어, 결과는 저장 및/또는 추가 분석을 위해 전자적으로 전송될 수 있다. 결과는, 예를 들어, 전자 스토리지 클라우드(storage cloud) 또는 다른 저장된 데이터베이스로 전송될 수 있다.
이들 도구는 생산 직후뿐만 아니라 적용 직전 농부의 농장에서 모두 품질 관리를 수행하고 제품 사양을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 이는, 다른 현행 방법보다 더 빠르고, 더 저렴하며, 더 정확하기 때문에, 임의의 시스템에서 뿐만 아니라 로컬 미생물 발효 시스템에서도 매우 유리한 신속한 제품 방출을 용이하게 한다.
본 발명의 검정법은 또한 소비자가 구매한 미생물 제품의 특징을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 이러한 측면은, 많은 생물학적 제제(biologicals)가 시간이 지남에 따라 효능을 상실하고 이들이 구입되거나 또는 사용될 때까지 기재된 효능보다 훨씬 못하게 되기 때문에, 상당한 가치를 갖는다. 이러한 측면은 또한 재고를 관리하고, 단일 미생물을 갖는 제품 또는 여러 미생물을 함유한 제품에 대해서 어떤 제품이 사양을 벗어났는지 결정하는 데 도움을 준다.
식물의 영양, 성장, 및 적절한 작용은 천연 미생물상(microflora)의 활발한 모집단의 양과 분포에 의존하고, 이는 다시, 토양 비옥도, 경작지(tillage), 수분, 온도, 통기(aeration), 유기물, 및 많은 다른 요인에 의해서 영향을 받는다. 장기간의 가뭄, 변덕스러운 강우, 및 선충류 및 다른 해충의 증식을 포함하는 다른 환경적인 변화가 이러한 요인에 영향을 미치고, 토양 다양성과 식물 건강에 영향을 미친다. 이러한 환경적인 변수는 지형, 주어진 연도의 계절성, 및 연도간 차이를 포함하는 다양한 차원으로 이들 자체를 나타낸다. 이들은 또한 특정 농장 내에 존재하고, 심지어 에이커(acre) 이하 또는 동물 종 사이 또는 심지어 종 내의 개별 동물 사이와 같은 작은 영역 내에 존재한다. 메타(meta) 및 마이크로 환경 내에서 미생물(유익하고 병원성인) 존재와 생태학을 신속하고 정확하게 분석하기 위해서 본 발명의 검정법을 사용하는 것은, 농업인, 규제 관리, 특별 감사 관리, 기본 생산자, 공급망의 유통 에이전트 및 이들의 자산을 더 증가시키고, 병원체를 관리하며, 이들 사업의 효율성과 경제적인 성과를 최적화하고자 하는 다른 조직이나 개인에게 훨씬 더 큰 힘을 제공한다.
나노 결정
본 발명에 따라 유용한 나노 결정은, 이들에 작용하는 에너지를 흡수하고 그 후에 흡수된 에너지를 방출하는 무기 발광 또는 전자기적으로 활성인 재료이다. 이러한 나노 결정은 흡수된 광을 제거한 후 10-8 초를 초과하는 동안 계속해서 광을 방출하는 인광체로서 작용할 수 있다. 인광체의 잔광 또는 인광의 반감기는 전형적으로 약 10-6 초 내지 수일의 범위이다.
본 발명의 나노 결정은 이들의 조성, 이들의 크기, 및/또는 이들의 형태(또는 형상)에 기초하여 상이한 광학 특성을 가질 수 있다. 일 실시예에서, 본 발명은 적어도 두 가지 유형의 나노 결정의 조합물에 관한 것으로, 여기에서 각각의 유형은 희토류 함유 격자, 균일한 3차원 크기, 및 균일한 다면체 형태의 단일 순수한 결정질 상을 갖는 복수의 단분산 입자이고; 여기에서 단분산 입자의 유형은 조성, 크기, 또는 형태에 의해 서로 상이하다. 바람직한 실시예에서, 단분산 입자의 유형은 동일한 조성이지만 상이한 형태를 갖는다.
일 실시예에서, 본 발명에 따른 나노 결정은 스톡스(하향-변환) 인광체이다. 광자 형태의 에너지를 흡수하고 더 낮은 주파수(더 낮은 에너지, 더 긴 파장) 대역 광자를 방출하는 인광체는 하향 변환 인광체이다.
다른 실시예에서, 나노 결정은 안티 스톡스(상향 변환) 인광체이다. 낮은 주파수에서 둘 이상의 광자 형태의 에너지를 흡수하고 더 높은 주파수(더 높은 에너지, 더 짧은 파장) 대역에서 방출하는 인광체는 상향 변환 인광체이다. 상향 변환 인광체는, 예를 들어, 근적외선, 더 낮은 에너지, 더 긴 파장의 광에 의해 조사되고, 더 높은 에너지 및 더 짧은 파장인 가시광을 방출한다.
일 실시예에서, 나노 결정은 희토류(RE) 함유 입자이다. RE 원소는 이트륨 및 란탄족(Ln) 계열의 원소, 즉, 란탄(La), 세륨(Ce), 프라세오디뮴(Pr), 네오디뮴(Ne), 프로메튬(Pm), 사마륨(Sm), 유로퓸(Eu), 가돌리늄(Gd), 테르븀(Tb), 디스프로슘(Dy), 홀뮴(Ho), 에르븀(Er), 툴륨(Tm), 이테르븀(Yb), 및 루테튬(Lu)을 포함한다.
특정 실시예에서, 본 발명의 나노 결정은 이트륨 함유 격자 또는 란탄족 함유 격자일 수 있는 희토류 함유 격자를 갖는다. 격자는 그것의 +3 산화 상태인 이트륨(Y) 또는 란탄족(Ln)을 함유한다. 할로겐화물{플루오르화물(fluoride), F-이 바람직함}, 산화물, 옥시황화물(oxysulfide), 옥시할로겐화물(oxyhalide)(예를 들어, OCl), 황화물 등과 같은 음이온의 존재에 의해 격자에서 전하의 균형이 맞추어진다. 알칼리 금속, 즉, 리튬(Li), 나트륨(Na), 칼륨(K), 루비듐(Rb), 및 세슘(Cs) 및/또는 알칼리 토금속인 베릴륨(Be), 마그네슘(Mg), 칼슘(Ca), 스트론튬(Sr), 및 바륨(Ba)이 또한 호스트 격자의 성분일 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속은 흔히 "격자 변성제(lattice modifier)"로 불린다.
나노 결정은 크기가 다양할 수 있다. 일 실시예에서, 본 발명의 결정은 크기가 약 1 nm 내지 1,000 nm, 바람직하게는, 5 nm 내지 750 nm, 더 바람직하게는, 10 nm 내지 500 nm, 가장 바람직하게는, 20 nm 내지 400 nm의 범위에 있는 이들의 가장 큰 치수를 갖는 나노 결정으로서 기술될 수 있다. 약 1 ㎛ 내지 400 ㎛의 적어도 하나의 치수를 갖는 큰 결정은 본 발명의 다른 실시예를 나타낸다. 결정의 크기는, 결정을 만드는 원소들의 화학량론 비(stoichiometric ratio) 또는 입자를 제조하기 위해 사용된 전구체의 화학량론 비뿐만 아니라, 반응 시간의 길이에 의존한다.
본 발명에 따라 사용된 나노 결정은 바람직하게는 RE 함유 격자의 단일 순수한 결정질 상을 갖는다. 일 실시예에서, 나노 결정은 α, β, 또는 입방정계(cubic) 상 결정이다. 바람직한 실시예에서, 나노 결정은 육방정계(hexagonal)(β) 상 입자이다.
본 발명의 단분산 입자를 합성하기 위해, 격자에 존재하는 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속은, 입자에 대한 형태학적 제어뿐만 아니라, 발광 입자의 광학 특성과 같은 입자의 다른 특성의 독립적인 조정 가능성을 제공하는 결정 대칭(crystal symmetry)을 결정할 수 있다. 예를 들어, LiYF4, NaYF4, 및 KYF4의 결정 대칭은 각각 정방정계(tetragonal), 육방정계, 및 삼방정계(trigonal)이다.
본 발명의 입자의 화학 조성은 고유의 다면체 형태를 제공한다. 대표적인 이트륨 함유 격자는, LiYF4, BaYF5, BaY2F8NaYF4, KYF4, Y2O2S, Y2O3 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 란탄족 함유 격자는 란탄족 계열의 임의의 원소를 갖는 것일 수 있다. 대표적인 란탄족 함유 격자는, LaF3, CeF3, PrF3, NeF3, PmF3, SmF3, EuF3, GdF3, TbF3, DyF3, HoF3, ErF3, TmF3, YbF3LuF3, NaGdF4, Gd2OS2, LiHoF4, LiErF4, CeO, SrS, CaS, GdOCl 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
일 실시예에서, 입자의 화학 조성은 조성물에 고유의 특성을 부여하는 도펀트(dopant) 및 격자 변성제를 함유할 수 있다.
나노 결정의 형태는 구형, 육각형, 입방형, 막대형, 다이아몬드형, 버섯 또는 아령과 같은 특이한 형상일 수 있다. 유리하게는, UCNC는 광퇴색되지 않고 동시 신호 적분(signal integration)으로 장기간의 노출에 걸쳐 높은 출력 밀도 여기를 허용한다. 이들은 발광 효율의 감소 없이 무기한 저장될 수 있고, 이에 따라 반복적인 조사와 분석을 허용한다. 과거의 이전 무기 마커(inorganic marker)와 달리, 나노 결정은 균일하고 이들의 농도에 기초하여 일정한 신호를 제공한다. 결정이 비결정질인 경우 원자의 분포는 일정하지 않고, 구조에 결함이 있으며 방출된 광학 신호는 정량화될 수 없다. 본 발명은 결정의 균일한 형태를 이용한다. 원격 제어와 유사하게, 적외선 펄스 광이 시험 중에 결정으로부터 방출된다. 이러한 특성은 복합 환경 샘플에서 해당 분석물의 정량을 용이하게 한다.
A. 하향 변환 인광체
하향 변환 인광체 재료는 RE 원소 도핑된 산화물, RE 원소 도핑된 옥시황화물, RE 원소 도핑된 플루오르화물을 포함한다. 하향 변환 인광체의 예는, Y2O3:Gd, Y2O3:Dy, Y2O3:Tb, Y2O3:Ho, Y2O3:Er, Y2O3:Tm, Gd2O3:Eu, Y2O2S:Pr, Y2O2S:Sm, Y2O2S:Eu, Y2O2S:Tb, Y2O2S:Ho, Y2O2S:Er, Y2O2S:Dy, Y2O2S:Tm, Y2O2S:Eu(적색), Y2O3:Eu(적색), 및 YVO4:Eu(적색)를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 하향 변환 인광체의 다른 예는 다른 란탄족으로 도핑된 가돌리늄 플루오르화 나트륨, 예를 들어, NaGdF4:Tb로서, 여기에서 Tb는 Eu, Dy, Pr, Ce 등으로 대체될 수 있다. 란탄족 플루오르화물은 하향 변환 플루오르화물, 예를 들어, TbF3, EuF3, PrF3, 및 DyF3으로도 알려져 있다.
B. 상향 변환 인광체
상술한 바와 같이, RE 함유 호스트 격자로부터 유도된 상향 변환 인광체는 증감제(sensitizer)(흡수체로도 알려져 있는)와 방사체(emitter)를 포함하는 적어도 하나의 활성화제 커플(activator couple)로 도핑된다. 적합한 상향 변환 인광체 호스트 격자는, 이트륨 플루오르화 나트륨(NaYF4), 플루오르화 란타늄(LaF3), 란타늄 옥시황화물, RE 옥시황화물(RE2O2S), RE 옥시플루오르화물(RE4O3F6), RE 옥시염화물(REOCl), 플루오르화 이트륨(YF3), 갈산 이트륨, 플루오르화 가돌리늄(GdF3), 이트륨 플루오르화 바륨(BaYF5, BaY2F8), 및 가돌리늄 옥시황화물을 포함하고, 여기에서 RE는 Y, Gd, La, 또는 다른 란탄족 원소일 수 있다. 적합한 활성화제 커플은 이테르븀/에르븀, 이테르븀/툴륨, 및 이테르븀/홀뮴으로부터 선택된다. 상향 변환에 적합한 다른 활성화제 커플이 또한 사용될 수 있다.
단지 이들 3개의 활성화제 커플과 RE 함유 호스트 격자의 결합에 의해, 적어도 3개의 상이한 방출 스펙트럼(적색, 녹색, 및 청색 가시광)을 갖는 적어도 3개의 인광체가 제공된다. 일반적으로, 흡수체는 이테르븀이고 방출 중심(emitting center)은 에르븀, 홀뮴, 테르븀, 및 툴륨으로부터 선택될 수 있지만; 본 발명의 다른 상향 변환 인광체 입자는 다른 흡수체 및/또는 방사체를 함유할 수 있다. 다양한 비(ratio)가 전문가에 의해서 원하는 특징(예를 들어, 화학 특성, 제조 효율, 여기 및 방출 파장, 양자 효율, 또는 기타 고려사항)을 기초로 하여 선택될 수 있지만, 흡수체:방출 중심의 몰비는 전형적으로 적어도 약 1:1, 더 일반적으로는 적어도 약 3:1 내지 5:1, 바람직하게는 적어도 약 8:1 내지 10:1, 더 바람직하게는 적어도 약 11:1 내지 20:1이고, 전형적으로 약 250:1 미만, 일반적으로 약 100:1 미만, 및 더 일반적으로는 약 50:1 내지 25:1 미만이다. 예를 들어, Yb 농도를 증가시키면 흡수 특성이 약간 변하고, 이는 생물 의학 응용에 유용하다. 또한, 다른 희토류와 전이 금속 도펀트의 도입, 도핑 농도의 변화, 및 호스트 격자 변성은 모두 상승 및 붕괴 시간뿐만 아니라 스펙트럼 프로파일에 대한 추가 조정 가능성을 제공한다.
흡수체(예를 들어, 이테르븀) 대 방출 중심(예를 들어, 에르븀, 툴륨, 또는 홀뮴)의 최적 비는, 특정한 흡수체/방사체 커플 및 원하는 스펙트럼 프로파일과 수명에 따라 변화한다. 예를 들어, Yb:Er 커플에 대한 흡수체:방사체 비는 전형적으로 약 1:1 내지 약 100:1의 범위에 있는 반면, Yb:Tm 및 Yb:Ho 커플에 대한 흡수체:방사체 비는 전형적으로 약 500:1 내지 약 2000:1의 범위에 있다. 이들 상이한 비는 결정에서 Yb 레벨에 대한 Er, Tm, 또는 Ho의 상이한 매칭 에너지 레벨에 기인한다. 대부분의 응용에 대해서, 다른 제제가 사용될 수 있지만, 상향 변환 인광체는 최적의 양자 효율을 위해서 편리하게는 약 10 ~ 30% Yb 및 또한; 약 1 ~ 2% Er, 약 0.1 ~ 0.05% Ho, 또는 약 0.1 ~ 0.05% Tm을 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 무기 인광체는 약 900 내지 1000 nm, 바람직하게는 약 960 내지 980 nm의 적외선에 의해 최적으로 여기된다. 예를 들어, 식 YF3:Yb0.10Er0.01의 미세 결정질 무기 인광체는 약 980 nm의 여기 파장에서 최대 발광 강도를 나타낸다. 본 발명의 상향 변환 인광체는 전형적으로 가시 내지 근적외선 범위에 있는 방출 최대값을 갖는다. 예를 들어, 특정 활성화제 커플은 특징적인 방출 스펙트럼을 갖고: 이테르븀-에르븀 커플은 인광체 호스트에 따라 가시 스펙트럼의 적색(660 nm) 또는 녹색(540 nm) 부분에서 방출 최대값을 가지며; 이테르븀-홀뮴(535 nm) 커플은 일반적으로 녹색 부분에서 최대로 방출하고, 이테르븀-툴륨은 전형적으로 청색(480 nm), 적색(635 nm) 및 적외선(800 nm) 범위에서 방출 최대값을 가지며, 이테르븀-테르븀은 일반적으로 녹색(545 nm) 범위에서 최대로 방출한다. 예를 들어, Y0.80 　Yb0.19 　Er0.01F2는 스펙트럼의 녹색 부분에서 최대로 방출한다.
본 발명의 인광체 입자는 수분 흡수가 훨씬 더 높고 더 많은 조직 가열이 발생하는 980 nm 대신 915 nm에서 여기될 수 있다. 선택된 비(들)는 일반적으로 선택된 특정 흡수체-방사체 커플(들)에 또한 의존할 것이고, 원하는 특징에 따라 기준 값으로부터 계산될 수 있다. 대부분의 비에 대해서 방출 특성을 급격하게 바꾸지 않고 활성화제의 비를 변경함으로써 입자 형태를 제어하는 것이 또한 가능하지만, 어떤 시점에는 켄칭이 발생할 수 있다.
C. 조성, 형태, 및 크기에 기초한 입자 특성
단분산 입자의 특성은 다양한 방식으로 조정될 수 있다. 단분산 입자의 특성, 특징적인 흡수 및 방출 스펙트럼은 이들의 조성을 조절함으로써, 예를 들어, 호스트 격자를 선택하고/하거나 도핑함으로써 조정될 수 있다. 유리하게는, 이들의 균일한 다면체 형태가 주어지면, 단분산 입자는 이방성 특성을 나타낸다. 동일한 조성이지만 상이한 형상의 입자는 이들의 형상 및/또는 크기로 인해 상이한 광학 특성을 나타낸다.
일 실시예에서, 단분산 입자는 상이한 붕괴 수명을 제공하도록 조성 및/또는 형상이 다양하다. 상이한 스펙트럼 붕괴 수명을 갖는 것은 고유의 인광체 입자가 서로 구별되도록 허용한다. 본 발명에 따라 동일한 조성이지만 상이한 형태의 단분산 입자를 갖는 능력은 하나의 조성(특히, 의약품 또는 의료 장치와 같은 규제 산업에서)의 사용을 허용하지만, 이들의 고유한 광학 특성을 통해 그 형태를 구별하도록 한다.
따라서, 얻어질 수 있는 특징적인 흡수 및 방출 스펙트럼 외에, 본 발명의 단분산 입자의 상승 및 붕괴 시간은 입자 크기와 형태에 의해 또한 조정될 수 있다. 상승 시간은 제1 방출 광자가 관찰될 때 제1 여기 광자가 흡수되는 순간부터 측정된다. 붕괴 시간은 방출 붕괴의 기울기, 또는 여기 소스(excitation source)가 꺼지면 인광체가 방출을 멈추기 위해 걸리는 시간으로 측정된다. 이것은 또한 여기된 에너지 레벨로부터 전자가 고갈되는 데 걸리는 시간으로도 기술된다. 도펀트 비를 변화시킴으로써, 상승 및 붕괴 시간이 확실하게 변할 수 있다.
전형적으로, 여기 상태 모집단은 붕괴 법칙(decay law), I(t) = I0 exp (-t/τ)를 따라 1차 동역학에 의해 여기 펄스를 끈 후에 지수 함수적으로 붕괴하고, 이에 의해, 단일 지수 붕괴 I(t) = 시간 의존 강도, I0 = 시간 0에서의 강도(또는 진폭), 및 τ = 인광체(또는 형광단)가 여기 상태에 머무르는 평균 시간(또는 <t>)이고, 수명과 동일하다. {수명 τ는 총 붕괴율(decay rate)의 역수이고, τ = (T + knr)-1, 상기 식에서, 여기 후 시간 t에서, T는 방사율(emissive rate)이고 knr은 비방사성 붕괴율이다}. 일반적으로, 수명의 역수는 여기된 상태를 과소(depopulate)시키는 비율의 합이다. 발광 수명은 lnl(t) 대 t의 플롯(plot)의 기울기(l/τ와 동일)로부터 간단히 결정될 수 있다. 이것은 또한 강도가 그 원래 값(시간 0)의 위치로 감소하기 위해 필요한 시간일 수 있다. 따라서, 임의의 주어진 공지된 방출 파장에 대해서, 지수 붕괴 법칙에 맞는 다수의 파라미터를 모니터링하여 특정 인광체 또는 인광체 그룹을 확인함으로써, 예를 들어, 고유의 위조 방지 코드, 시그니처, 또는 표지/태건트(taggant)를 개발하는 데, 이들의 사용을 허용할 수 있다.
대부분의 경우, 수명은 결정 조성이나 또는 전체적인 입자 크기의 변화에 의해 제어된다. 그러나, 본 발명의 단분산 입자와 같이 입자 형태와 균일성을 제어함으로써, 다양한 형태 중에서 동일한 화학 조성은 유지하면서 그 형태에 고유한 수명을 갖는 시각적으로 구별되는 형태의 입자를 생성할 수 있다. 이 특징은 매우 복합적인 광학 시그니처 또는 태건트를 허용하고, 이는 보안 및 인증에서의 사용뿐만 아니라, 예를 들어, 검정법, 생물 의학, 광학 컴퓨팅과 같은 다양한 분야에서 직렬화(serialization) 및 다중화 검정법 또는 분석에 사용될 수 있다.
입자 크기와 형태는 화학량론 전구체 금속 염 비, 염욕의 가열 속도, 및 반응 시간과 같은 반응 조건을 변화시켜 제어될 수 있다. 염욕에서 초기 가열 속도는 어떤 결정 평면이 가장 빠른 성장을 거칠 것인지 선택함으로써 형태를 결정하는 데 중요하다. 최종 입자 크기는 전구체 비뿐만 아니라 염욕에서의 총 반응 시간에 의해서 결정된다. 반응 용기가 염욕의 온도에 도달한 후, 용기가 염욕에 머무르는 시간이 더 길수록 입자가 더 크게 성장할 수 있다.
D. 초격자 조립체
크기와 형태에서 이들의 균일성으로 인해, 본 발명의 단분산 입자는 초격자 구조로 자체 조립될 수 있다. 이러한 초격자 구조는 조립을 위해 가장 낮은 자유 에너지 입체구조(conformation)를 나타낸다. 이 균일한 빌드업은 본 발명에 따른 균일한 크기와 형태의 단분산 입자로 이루어진다. 초격자는 계면 자체 조립을 통해 형성되어, 상이한 길이 스케일로 순서를 갖는 계층 구조(hierarchical structures)를 형성한다.
본 발명의 단분산 입자의 초격자는 입자를 용매에 현탁시킨 다음 이들을 표면 위에 드롭 캐스팅(drop-casting)함으로써 형성될 수 있다. 용매가 천천히 증발함에 따라, 입자는 위치와 배향 순서 모두를 갖고 초격자로 이들 자체를 배열한다. 벤젠, 사염화탄소, 클로로벤젠, 클로로포름, 시클로헥산, 디메틸-포름아미드, 디메틸설폭시드, 에탄올, 헵탄, 헥산, 펜탄, 테트라하이드로푸란, 톨루엔과 같지만, 이에 제한되지 않는, 입자를 분산시키는 임의의 용매가 사용될 수 있고, 헥산과 같은 비극성 유기 용매가 바람직하다.
본 발명의 초격자는 본 발명의 단분산 입자, 특히, 본 발명의 단분산 나노 입자의 투명한 필름일 수 있다. 초격자를 형성하기 위해, 구성 입자는 크기와 형상이 동일하거나 또는 거의 동일해야만 한다. 양쪽 조건이 충족되었을 때, 입자의 균일하고, 패턴화된 단일 층이 형성된다. 유리하게는, 본 발명의 단분산 입자는 균일한 크기와 균일한 형태를 위한 이러한 기준을 충족시킨다. 본 발명의 입자의 작은 크기와 균일성으로 인해, 광의 산란이 없고, 그 결과 투명한 필름이 얻어진다.
나노 결정의 기능화(functionalization)
일 실시예에서, 나노 결정은 하나 이상의 포획 분자로 기능화되었다. 이는, 예를 들어, 나노 결정을 항체, 단백질, 폴리펩티드, 앱타머, 뉴클레오티드, 및/또는 표적 미생물 또는 미생물 기반 작용제와 같은 분석물에 특이적으로 결합하는 다른 화합물에 연결시킴으로써 이루어질 수 있다. 다른 실시예에서, 분석물 표적은 또한 병원성 미생물에 의한 감염에 반응하여 발현하도록 유도된 임의의 범위의 호스트 생체 분자일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "특정(specific)"은, 비특이적인 분자에 대한 결합과 비교해서, 특이적이거나 또는 특이적인 표적에 대해 상당히 더 높은 결합 친화성을 갖는 표적만을 인식하는 항체 또는 이와 다른 개체를 가리킨다. 결합 친화성은 에피토프(epitope)와 항체 항원 결합 부위 사이의 상호 작용의 강도를 측정한다. 친화성이 더 높은 항체는 친화성이 낮은 항체보다 더 짧은 시간에 훨씬 더 많은 양의 항원을 결합할 것이다. 따라서, 결합 친화성 상수는 105 mol-1 미만부터 1012 mol-1 이상까지 크게 변할 수 있다.
바람직한 실시예에서, 항체는 전장 중쇄와 경쇄 또는 이의 단편을 갖는 완전한 항체 분자를 포함할 수 있고, Fab, 변성 Fab, Fab', 변성 Fab', F(ab')2, Fv, 단일 영역 항체(예를 들어, VH 또는 VL 또는 VHH), scFv, 2가, 3가, 또는 4가 항체, 비스(Bis)-scFv, 이중 특이성 항체(diabodies), 삼중 특이성 항체(triabodies), 사중 특이성 항체(tetrabodies) 및 상기 임의의 것의 에피토프-결합 단편일 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다 (예를 들어, Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9):1126-1136; Adair and Lawson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2(3), 209-217 참조). 항체는, 예를 들어, 표적 미생물의 표면에서 발현되는 단백질, 또는 단백질의 에피토프에 특이적일 수 있다.
키메라 항체(chimeric antibodies)를 포함하는 항체는 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 키메라 항체는 경쇄 및 중쇄 유전자가 상이한 종에 속하는 면역 글로불린 유전자 세그먼트로 구성되도록 유전자 조작된 면역 글로불린 유전자에 의해 암호화된 항체이다. 이들 키메라 항체는 덜 항원성일 수 있다. 다가 항체는 다중 특이성(multiple specificities)을 포함하거나 또는 단일 특이성일 수 있다.
본 발명에 사용하기 위한 항체는 구입될 수 있거나, 또는 이 기술분야에 공지된 파지 디스플레이(phage display) 방법을 포함하는 다양한 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 또한, 쥐, 또는 다른 포유동물을 포함하는 다른 유기체가 항체를 발현시키기 위해 사용될 수 있다.
항체는 면역 글로불린 분자의 임의의 강(class)(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD 및 IgA) 또는 아강(subclass)일 수 있다. 일 실시예에서, 본 발명에 사용하기 위한 항체는 IgG 강이고, IgG 아강 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 중 임의의 것으로부터 선택될 수 있다.
본 발명에 사용하기 위한 항체는 항체의 활성을 바꾸기 위해 하나 이상의 변이를 포함할 수 있다.
항원의 예는, 말초, 외인성, 분비성, 내재성, 또는 막 관통 분자를 포함하는 안정되거나 일시적인 원형질 막 성분인 세포 표면 분자를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시예에서, 분자는 세포의 원형질 막의 외부에서 노출된다. 다른 실시예에서, 항원 결정기(antigenic determinant)는 표면 노출되지 않지만, 그 대신, 예를 들어, 세포 용해시 노출된다. 특정 실시예에서, 항원은 당 단백질, 지질 단백질, 및 세포벽 고정 단백질을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 공지된 구조의 공지되거나 기술된 기능을 갖는 분자이고; 항원의 에피토프는 또한 비단백질 기반 생체 분자일 수 있다.
다른 실시예에서, 표면 항원 및/또는 표면 항원의 에피토프는 게놈 서열 정보에 기초하여 선택될 수 있다. 항원의 확인은 해당하는 특정 모티프의 서열 정보에 기초하여 이 기술분야에 공지된 생물학적 소프트웨어를 필요로 할 수 있다(예를 들어, Bioinformatics Approach for Cell Surface Antigen Search of Helicobacter pylori, Ragini Tiwari et al., Journal of Pharmacy Research 2012, 5(11), 5184-5187 참고). 예를 들어, SignalP, LipoP, PSORTb, 및 TMHMMS와 같은 프로그램을 사용하여 해당 항원을 여과하고 선택할 수 있다.
구체적으로, SignalP 4.1 서버는 상이한 유기체: 그램 양성 원핵 생물, 그램 음성 원핵 생물, 및 진핵 생물로부터의 아미노산 서열에서 신호 펩티드 절단 부위의 존재와 위치를 예측한다. 이 방법은 여러 인공 신경망의 조합에 기초한 절단 부위의 예측과 신호 펩티드/비신호 펩티드 예측을 통합한다. 웹 사이트 주소는: www.cbs.dtu.dk/services/SignalP이다.
TMHMM 서버는 소수성 아미노산을 검색하여 단백질에서 막 스패닝 헬릭스(membrane spanning helices)를 예측하였다. 알고리즘은 헬릭스의 수를 예측하고 펩티드의 길이를 스패닝하는 것을 강조하였다. 웹 주소는: www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM이다. lipoP 서버는 이용 가능한 지질 단백질 신호 펩티드에 의해 지질 단백질을 예측하였다. 웹 주소는: www.cbs.dtu.dk/services/LipoP이다.
PSORTb는 국소화 부위(localization site) 및 관련 확률을 예측한다. 단백질의 세포 이하 국소화(subcellular localization)는 아미노산 서열 정보에 기초하여 수행되었다. 단백질 세포 이하 국소화는 신호 펩티드 또는 막 스패닝 알파 헬릭스의 존재와 같은 단백질의 1차 구조 내에 존재하는 여러 특징에 의해 영향을 받았다. 웹 주소는: http://www.psort.org/psortb/이다.
유리하게는, 본 발명의 방법은 배양액에서 성장하기 어렵거나 불가능하고, 또는 배양액에서 매우 느리게만 성장할 수 있는 미생물을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 매우 낮은 수의 미생물을 검출할 수 있기 때문에, 본 발명의 검정법을 수행하기 전에 배양액 내의 샘플로부터 미생물을 성장시켜 이들의 수를 증가시킬 필요가 없다. 따라서, 본 발명의 검정법은 표준 실험실 조건 하에서 배양을 위해 수정될 수 없거나, 또는 배양액에서 수를 두배로 하기 위해 1, 2, 5, 10, 24, 72 시간 이상이 걸리거나, 또는 배양액에서 전혀 성장할 수 없는 미생물을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 검정법은 감귤 녹화병 및 지브라 칩 질병(zebra chip disease)을 일으키는 병원체뿐만 아니라, 파스테리아(pasteuria)와 같은 유익한 미생물을 검출, 정량, 및/또는 추적하기 위해 사용될 수 있다. 바이러스 또한 검출될 수 있다.
이러한 배양하기 어려운 미생물에 대한 포획 분자는 메타게놈 시퀀싱(metagenome sequencing)을 통해서 뿐만 아니라, 상기 기술된 바와 같이 확인된 항원을 기초로 할 수 있다. 메타게놈 해석(Metagenomics)은 환경 샘플에서 직접 회수된 유전 재료의 연구이다. 통상적인 시퀀싱은 DNA의 공급원으로서 동일한 세포의 배양을 필요로 한다. 그러나, 환경 샘플에서 많은 미생물이 배양될 수 없으므로, 시퀀싱될 수 없다. 생물 정보학의 발전, DNA 증폭의 개선, 및 계산 출력의 증가는 환경 샘플에서 회수된 DNA 서열의 분석을 크게 도와서, 메타게놈 샘플에 샷건 시퀀싱(shotgun sequencing)을 적응시켰다. 샷건 시퀀싱의 무작위 성질은, 그렇지 않으면 전통적인 배양 기술을 사용하여 눈에 띄지 않을 이러한 많은 유기체가 적어도 일부 서열 세그먼트로 표시될 것임을 보장한다.
병원성 미생물의 게놈은 수평 유전자 전달을 통해 획득한 병원성 아일랜드(pathogenicity island)를 흔히 함유한다. 이들 유전자 아일랜드는 병원성 유기체의 게놈에 통합되지만, 전형적으로 비병원성 관련 종이 없다. 병원성 아일랜드 DNA 서열은 흔히 특정 항체에 대해서 우수한 표적인 독성 인자(virulence factor)를 암호화한다. 이들 병원성 아일랜드 서열은 생물 정보 분석을 통해 확인되고, 서브 클로닝되며, 발현되고, 항체를 생성하기 위한 순수한 항원으로서 사용될 수 있다.
메타게놈 데이터 분석의 첫 번째 단계는, 중복되는 낮은 품질의 서열과 가능한 진핵 생물 기원(eukaryotic origin)의 서열의 제거를 포함하는 특정한 사전 여과 단계의 실행을 흔히 수반한다. 다음으로, 메타게놈 분석은 전형적으로는 조립된 콘틱(contig)에서 암호 영역의 주석(annotation)에 두 가지 접근법을 사용한다. 첫 번째 방법은, 간단한 BLAST 검색에 의해, 서열 데이터베이스에서 이미 공개적으로 이용 가능한 유전자와의 상동(homology)을 기초로 하여 유전자를 확인하는 것이다. 두 번째 방법은, 처음부터, 관련 유기체의 유전자 훈련 세트(gene training set)를 기초로 암호 영역을 예측하기 위해 서열의 고유 특징을 사용한다. 이것은 GeneMark 및 GLIMMER와 같은 프로그램이 채택하는 접근법이다. 이 접근법은 서열 데이터베이스에서 상동하는 것이 부족한 암호 영역의 검출을 용이하게 한다.
메타게놈 시퀀싱은 바이러스성 군집(viral community)의 연구에 특히 유용하다. 바이러스는 공유된 보편적인 계통 발생적 마커(phylogenetic marker)(박테리아와 고세균류에 대해서는 16S RNA, 진핵 생물에 대해서는 18S RNA와 같이)가 부족하기 때문에, 환경 샘플에서 바이러스 군집의 유전적인 다양성에 접근하는 유일한 방법은 메타게놈 해석을 통하는 것이다.
본 발명에 따라, 메타게놈 시퀀싱은, 예를 들어, 미생물의 복합 혼합물을 갖는 나뭇잎 샘플에서 수행될 수 있다. 메타게놈 시퀀싱은 DNA 암호 서열(coding sequence)을 확인하기 위해 사용될 수 있고, 이는 그 다음에 클로닝 및 조작되어 펩티드 및/또는 전체 단백질을 발현할 수 있으며, 이는 그 다음에 배양할 수 없는 미생물을 검출, 정량, 및/또는 추적하기 위해 측방 유동 검정법(또는 이와 다른 검정법)에 사용할 항체를 생성하는 데 사용될 수 있다.
일 실시예에서, 나노 결정의 표면은 표면 변성제, 예를 들어, 폴리아크릴산과 같은 중합체와 말레산/폴리아크릴산과 같은 공중합체 및 블록 공중합체, 또는 불활성 실리카 층으로 코팅되어, 입자 표면에 대한 포획 분자의 컨쥬게이션을 허용하거나 향상시킬 수 있다. 각 유형의 포획 분자에 컨쥬게이트된 나노 결정은 고유하고 균일한 형태, 크기, 및/또는 조성을 가져서, 고유한 광학 수명 시그니처를 생성한다.
일 실시예에서, 포획 분자의 컨쥬게이션은 이 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 이루어진다. 일반적으로, 컨쥬게이션은 친핵체에 커플링하기 위한 카르복시산 활성화 시약을 사용하여 이루어진다. 특정 실시예에서, 포획 분자의 컨쥬게이션은 화학 표지(chemical labeling), 가교, 및 고체상 고정화를 위해 카르복시레이트 기의 아민 반응성 에스테르를 제조하기 위한 N-히드록시숙신이미드(NHS) 및/또는 설포-NHS를 통해 이루어진다. NHS 에스테르와 티올 외에, 이미도 에스테르는 단백질 가교와 표지를 위한 시약에 혼입되는 아민 특정 작용기로 또한 사용될 수 있다.
검정법 포맷
특정 실시예에서, 본 발명의 방법은 환경 샘플에서 표적 미생물 및/또는 미생물 기반 작용제가 기판에 부착되거나, 또는 이와 다르게 결합되는 단계를 포함한다. 이 단계는, 예를 들어, 포획 분자, 예를 들어, 항체, 단백질, 뉴클레오티드, 및 표적 미생물 및/또는 미생물 기반 작용제를 특이적으로 인식하는 다른 화합물로 기판의 표면을 처리함으로써 이루어질 수 있다. 포획 분자는 해당 표적을 특이적으로 포획하기 위해 나노 결정의 표면을 기능화하는 데 사용된 동일하거나 상이한 분자일 수 있다.
본 발명에 따른 분리 단계는 이 기술분야에 공지된 방법을 통해 이루어질 수 있다. 분리 방법은 세척, 관류(perfusion), 및 투석을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다.
일반적으로 필요하지는 않지만, 본 발명의 특정 실시예에서 상자성 UCNC의 사용과 같은 농축 기술을 사용하여 샘플을 농축함으로써, 감도 및/또는 선택성을 추가 향상시킬 수 있다.
A. 측방 유동 검정법
바람직한 실시예에서, 본 발명은 샘플에서 해당 분석물의 존재, 부재, 및/또는 양을 시험하기 위해 사용되는 측방 유동 검정법을 사용한다. 일 실시예에서, "샌드위치(sandwich)" 검정법이 사용되고, 이에 의해 항체(또는 다른 결합 액체)가 고형 지지체 위에 고정되어 표적 분석물을 포획함으로써, 결합된 분석물을 관찰하여 검출 및/또는 정량화를 용이하게 한다.
일 실시예에서, 본 발명의 검정법은 측방 유동 시험편에서 수행된다. 측방 유동 시험편은 샘플 수용 영역과 표적 포획 구역(들)이 위치하는 고형 지지체를 갖는다. 고형 지지체는 또한 측방 유동 시험편이 샘플의 적절한 운반체 액체에 노출된 경우 샘플 수용 영역으로부터 표적 포획 구역(들)으로 샘플의 모세관 유동을 제공한다. 이러한 고형 지지체의 재료는, 예를 들어, 유기 또는 무기 중합체, 및 천연 및 합성 중합체일 수 있다. 적합한 고형 지지체의 보다 구체적인 예는, 유리 섬유, 셀룰로오스, 나일론, 가교 덱스트란, 다양한 크로마토그래피 종이, DiomatTM 및 니트로셀룰로오스를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 바람직한 실시예에서, 고형 지지체의 재료는 니트로셀룰로오스이다. 추가 실시예에서, 측방 유동 시험편은 하나 이상의 표적 포획 구역을 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 측방 유동 시험편은 특정 파장의 광, 예를 들어, 적외선, 가시광, UV 광, 또는 전자 빔을 지향시키는 장치와 사용하도록 구성되고, 이는 다시 자극시 나노 결정에 의해 방출된 복귀 파장(return wavelength)을 포획한다. 이러한 장치는 바람직하게는 핸드헬드 형태이다.
추가 실시예에서, 본 발명은, 예를 들어, 휴대 전화 카메라로 판독될 수 있는 올리고뉴클레오티드 또는 항체에 결합된 희토류 나노 결정을 갖는 측방 유동 검정법을 이용하는 매우 민감하고, 특이적이며, 정량 가능한 진단 플랫폼을 제공한다.
이 검정법은 DNA 증폭을 필요로 하지 않고, 광범위한 농업 병원체를 검출하기 위해 적용될 수 있다. 특정한 예에서, 검정법은 카사바(cassava)에서 잔토모나스 액소노포디스 pv. 마니호티스(Xanthomonas axonopodis pv. manihotis)(세균성 마름병)를 검출하기 위해 사용될 수 있다.
농업 질병의 검출 방법은 역사적으로 실험실 분석을 필요로 하여, 자원이 제한된 환경에서 이들을 사용하는 것을 제한한다. 종래의 측방 유동 검정법은, 현장 환경에서 사용하기가 더 용이하지만, PCR과 같은 실험실 기반 방법보다 전형적으로 덜 민감한다. 광학 판독기가 측방 유동 검정법과 결합되는 경우, 시각적인 판독에 비해 여러 자릿수의 개선이 이루어지지만; 광학 판독기는 고르게 사용하기 위해서는 엄청난 비용이 든다.
일 실시예에서, 본 발명의 검정법은 올리고뉴클레오티드에 컨쥬게이트된 나노 결정을 사용하여 이러한 문제를 해결한 다음, 측방 유동 검정법 포맷으로 사용된다. 나노 결정의 높은 효율과 감도는 DNA 증폭 단계에 대한 필요성과 광학 판독기의 사용을 배제한다. 오히려, 판독기는 LED 플래시 및 카메라와 같은 비복합 기술을 사용할 수 있다. 플래시와 카메라는, 예를 들어, 표준 휴대 전화에 전형적으로 통합된 것일 수 있다.
유리하게는, 휴대 전화(또는 유사한 장치)를 통해 결과를 기록하는 것은 데이터의 전송과 수집을 용이하게 한다. 이는 더 균형된 데이터 세트를 생성하기 위해 사용될 수 있고, 이로부터, 예를 들어, 농업 질병의 발생을 더 잘 예측하기 위해 기계 학습이 적용될 수 있다.
특정 실시예에서, 본 발명은 검출 가능한 표지의 나노 결정이 상향 변환 인광체 리포터를 구성하는 측방 유동 검정법 포맷을 제공한다. 연속 유동 기술은 포획 분자로 덮인 나노 결정과 같은 리포터의 사용을 허용한다. 특정 실시예에서, 종래의 검정법과 비교하여 유속은 더 빠르고 유동 시간은 더 짧을 수 있다.
고형 지지체는 측방 유동 시험편이 샘플의 적절한 운반체 액체에 노출된 경우 샘플 수용 영역으로부터 표적 포획 구역으로 샘플의 모세관 유동을 제공한다.
일 실시예에서, 측방 유동 시험편 또는 미세 유체 장치는 하나 이상의 샘플 수용 영역/채널을 포함할 수 있고, 이는 다수의 샘플의 적용을 가능하게 한다. 각각의 샘플은 상이한 분석물을 함유할 수 있거나, 또는 동일한 분석물을 함유할 수 있다. 다른 실시예에서, 샘플 수용 영역은 샘플을 검출 시스템과 상호 작용에 적합하게 하는 완충 염과 계면 활성제로 포화될 수 있는 흡수 패드를 포함한다.
추가 실시예에서, 측방 유동 시험편은 하나 이상의 표적 포획 구역을 포함할 수 있다. 포획 구역의 표면은 해당 분석물, 예를 들어, 환경 샘플에서 미생물 또는 미생물 기반 작용제에 특이적으로 결합하는 개체로 변성된다. 포획 구역의 표면의 변성은 고형 지지체를, 예를 들어, 항체, 단백질, 뉴클레오티드, 및/또는 다른 화합물에 연결함으로써 이루어질 수 있다. 이러한 변성은 나노 결정에 적용되는 동일하거나 상이한 변성일 수 있다. 각각의 분석물 포획 구역은 상이한 종의 분석물을 결합시키거나, 또는 동일한 종의 분석물을 결합시킬 수 있다. 각각의 분석물 포획 구역이 동일한 종의 분석물을 결합시키는 측방 유동 시험편에서, 결합은 다양한 농도의 분석물에서 일어날 수 있다. 포획 구역은, 분석물 포획 구역을 통해 샘플 수용 영역으로부터 샘플과 용매 유동을 끌어 당기는 한, 임의의 형상일 수 있다.
일 실시예에서, 측방 유동 시험편은 pH(예를 들어, pH 2~12), 이온 강도, 점도, 및 생물학적 매트릭스의 변화에 대한 내성을 나타내고, 존재할 경우, 거짓 양성(false positive)과 거짓 음성(false negative) 결과에는 거의 기여하지 않는다.
상향 변환 발광은 나노 결정에 의한 둘 이상의 낮은 에너지(더 긴 파장, 전형적으로 적외선) 광자의 흡수에 이은, 단일의 더 높은 에너지(더 짧은 파장) 광자의 방출에 기초한다. UCP를 이용하는 측방 유동 검정법의 일부 측면은, Corstjens et al. (2014), Feasibility of Lateral Flow Test for Neurocysticercosis Using Novel Up-Converting Nanomaterials and a Lightweight Strip Analyzer, PloS Negl. Trop. Dis. 8(7):e2944에 기술되었고, 이는 본원에 완전히 참조로 포함되어 있다.
B. PCR 검정법
다른 실시예에서, 본 발명의 재료와 방법은 PCR 절차와 조합되어 매우 민감한 검정법을 생성한다. 올리고뉴클레오티드 프라이머의 5' 말단에서 나노 결정에 결합된 하나(또는 양쪽) PCR 프라이머(들)를 사용하는 증폭을 통해 생성된 PCR 생성물에 균일한 크기의 나노 결정 UCP를 통합하는 것은, 검출을 위해 사용된 표준 리포터 분자와 비교했을 때, 우수한 검정법 특징을 제공한다.
유리하게는, 일반적으로 사용된 리포터 분자(예를 들어, 알칼리성 인산염 및 겨자무 페록시다아제)와 달리, 나노 결정으로부터 생성된 신호는 배경 형광이 없고 다른 생물학적 분자와의 간섭이 없다. 또한, UCP 신호는 최대 20년 동안 지속되기 때문에, 검정법의 감도를 증가시키기 위해 신호가 일시적으로 통합될 수 있다. 유리하게는, 나노 결정 크기와 형태의 균일성은 올리고뉴클레오티드에 대한 UCP의 화학량론적 커플링을 가능하게 하고, 이는 검정법의 감도, 정량 및 동적 범위를 향상시킨다.
또한, 상보적인 광학 특성을 갖는 나노 결정 리포터 쌍은 단일 서열, 단백질, 세포 등에서 특정 표적 마커의 공동-국소화(co-localization)를 결정하도록 설계된 다양한 균질계 시스템(homogeneous based system)과 검정법에서 사용될 수 있다. 상보적인 나노 결정 쌍은 서로 근접할 때 나노 결정 A로부터의 방출이 나노 결정 B를 활성화시킬 수 있도록 고유의 광학 특성을 나타낸다. 특정 예에서, 980 nm 여기와 800 nm 방출을 갖는 NaYF4:YbTm 조성물은 808 nm 여기와 980 nm 부근의 방출 시그니처를 갖는 NaYF4:YbTmNd 조성물을 여기시킬 수 있다.
광학적으로 상보적인 나노 결정 리포터는, (1) 공동-국소화된 표적의 확인, (2) 균질 혼합물에서 특정한 결합 이벤트(분리 없는)의 확인, 및 (3) 공동-국소화뿐만 아니라 특정 올리고뉴클레오티드 서열을 따른 마커의 존재의 다중화된 확인을 가능하게 한다. 표적 수가 적을 것으로 예상되는 검정법 표적에 대해서, 예를 들어, 잘 알려진 자기 비드 기반 기술을 사용하여 표적 종의 저렴한 농도(inexpensive concentration)가 용이하게 구현될 수 있다.
C. 다중-웰 검정법
다른 실시예에서, 본 발명의 검정법은 높은 처리량 환경(high-throughput setting)에서 다중-웰 배열, 예를 들어, 8, 12, 24, 48, 96, 192, 384-웰 배열에서 수행될 수 있다.
분석물
본 발명은 환경 샘플에서 미생물, 미생물 기반 작용제, 및/또는 다른 분석물을 효율적이고 정확하게 검출, 정량 및/또는 추적하기 위한 방법과 장치를 제공한다.
분석물은 미생물의 존재 또는 활성으로 생기는 미생물, 미생물 기반 작용제 및/또는 분석물일 수 있다. 미생물은 농업 병원체를 포함해서 유익한 미생물 또는 병원체일 수 있다.
본 발명에 따라 검출, 정량 및/또는 추적될 수 있는 미생물은 박테리아, 고세균, 효모, 균류, 바이러스, 원생동물, 및 다세포 유기체를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명에 따른 분석물일 수 있는 미생물 기반 작용제는 미생물, 미생물 대사물질 및 다른 미생물 성장 부산물을 함유하는 조성물을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 일 실시예에서, 본 발명은 미생물 및/또는 미생물 기반 작용제에 반응하여 개체(동물 또는 식물과 같은)에 의해 생산된 생성물을 검출하기 위한 방법을 추가로 제공한다.
일 실시예에서, 본 발명은 미생물 및/또는 미생물 기반 작용제에 반응하여 개체(동물 또는 식물과 같은)에 의해 생산된 생성물을 검출하기 위한 방법을 추가로 제공한다.
일 실시예에서, 방법은 농업 병원체에 의해 감염된 개체에 의해서 생산된 생성물을 검출한다. 개체는 식물이거나 또는 잎, 줄기, 뿌리, 및 꽃을 포함하는 식물의 일부일 수 있다. 환경 샘플은 용해성 식물 추출물과 불용성 식물 추출물을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다.
특정 실시예에서, 미생물 및/또는 미생물 기반 작용제에 반응하여 개체에 의해 생산된 생성물은 단백질, 폴리펩티드, 뉴클레오티드 및/또는 다른 분자일 수 있다. 생성물은 환경 또는 식품 샘플 안으로 분비될 수 있다.
A. 유익한 미생물
본 발명에 따라 검출될 수 있는 미생물은 박테리아, 고세균, 효모, 균류, 바이러스, 원생동물, 또는 다세포 유기체를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
일 실시예에서, 미생물은 그램 양성 및 그램 음성 박테리아를 포함하는 박테리아이다. 이러한 박테리아는, 예를 들어, 대장균(Escherichia coli), 리조븀(Rhizobium){예를 들어, 리조븀 제포니큠(Rhizobium japonicum), 시노리조븀 멜릴로티(Sinorhizobium meliloti), 시노리조븀 프레디(Sinorhizobium fredii), 리조븀 레구미노사룸 바이오바 트리폴리(Rhizobium leguminosarum biovar trifolii), 및 리조븀 에틀리(Rhizobium etli)}, 브래디리조븀(Bradyrhizobium){예를 들어, 브래디리조븀 제패니큠(Bradyrhizobium japanicum), 및 브래디리조븀 파라스포니아(B. parasponia)}, 바실러스(Bacillus){예를 들어, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 피르무스(Bacillus firmus), 바실러스 라테로스포루스(Bacillus laterosporus), 바실러스 메가테륨(Bacillus megaterium), 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquifaciens)}, 아조박터(Azobacter){예를 들어, 아조박터 비네란디(Azobacter vinelandii) 및 아조박터 크로코쿰(Azobacter chroococcum)}, 아로박터(Arhrobacter){예를 들어, 아그로박테륨 라디오박터(Agrobacterium radiobacter)}, 슈도모나스(Pseudomonas){예를 들어, 슈도모나스 클로로라피스 아종 아우레오파시엔스(Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens)(클루이버)}, 아조스피릴륨(Azospirillium){예를 들어, 아조스피릴륨 브라실리엔시스(Azospirillumbrasiliensis)}, 아조모나스, 데르시아(Derxia), 베이어린키아(Beijerinckia), 노카르디아(Nocardia), 클레브시엘라(Klebsiella), 클라비박터(Clavibacter){예를 들어, 클라비박터 자일리 아종 자일리(C. xyli subsp. xyli) 및 클라비박터 자일리 아종 시노돈티스(C. xyli subsp. cynodontis)}, 시아노박테리아, 판토에아(Pantoea){예를 들어, 판토에아 아글로메란스(Pantoea agglomerans)}, 스핑고모나스(Sphingomonas){예를 들어, 스핑고모나스 파우시모빌리스(Sphingomonas paucimobilis)}, 스트렙토마이세스(Streptomyces){예를 들어, 스트렙토마이세스 그리세오크로모지네스(Streptomyces griseochromogenes), 스트렙토마이세스 크리세우스(Streptomyces qriseus), 스트렙토마이세스 카카오이(Streptomyces cacaoi), 스트렙토마이세스 아우레우스(Streptomyces aureus), 및 스트렙토마이세스 카수개니스(Streptomyces kasugaenis)}, 스트렙토베르티실륨(Streptoverticillium){예를 들어, 스트렙토베르티실륨 리모파시엔스(Streptoverticillium rimofaciens)}, 랄슬로니아(Ralslonia){예를 들어, 랄슬로니아 율로파(Ralslonia eulropha)}, 로도스피릴륨(Rhodospirillum){예를 들어, 로도스피릴륨 루브룸(Rhodospirillum rubrum)}, 잔토모나스(Xanthomonas){예를 들어, 잔토모나스 캄페스트리스(Xanthomonas campestris)}, 에르위니아(Erwinia){예를 들어, 에르위니아 카로토보라(Erwinia carotovora)}, 클로스트리듐(Clostridium){예를 들어, 클로스트리듐 브라비다시엔스(Clostridium bravidaciens)와 클로스트리듐 말라쿠소매(Clostridium malacusomae)}, 및 이들의 조합물일 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다.
특정 실시예에서, 방법은 환경에서 바실러스 서브틸리스를 검출 및/또는 추적하기 위해 사용된다. 일 실시예에서, 미생물은 바실러스 서브틸리스 균주(strains), 예를 들어, 바실러스 서브틸리스 변종 로쿠세스(B. subtilis var. locuses) 균주 B1과 B2를 포함하고, 이들은 표면활성물질(surfactin)의 효과적인 생산자이다.
일 실시예에서, 미생물은, 예를 들어, 스타르메렐라(Starmerella), 마이코리자(균근)(Mycorrhiza ){예를 들어, 소낭성 수지상 균근(vesicular-arbuscular mycorrhizae)(VAM), 수지상 균근(arbuscular mycorrhizae)(AM)}, 모르티에렐라(Mortierella), 피코마이세스(조균)(Phycomyces), 블라케스레아(Blakeslea), 스라우스토키트륨(Thraustochytrium), 페니실리움(Penicillium), 피튬(Phythium), 엔토모프토라(Entomophthora), 아우레오바시듐 풀루란스(Aureobasidium pullulans), 푸사리움 베네날룸(Fusarium venenalum), 아스페르길루스(Aspergillus), 트리코데르마(Trichoderma){예를 들어, 트리코데르마 레세이(Trichoderma reesei), 트리코데르마 하르지아눔(T. harzianum), 트리코데르마 비리데(T. viride) 및 트리코데르마 하마툼(T. hamatum)}, 리조푸스 종 식물내생 균류(Rhizopus spp, endophytic fungi){예를 들어, 피리포르미스 인디카(Piriformis indica)}, 사카로마이세스(Saccharomyces){예를 들어, 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 불라르디 세쿠에라(Saccharomyces boulardii sequela) 및 사카로마이세스 토룰라(Saccharomyces torula)}, 데바로마이세스(Debaromyces), 이살켄키아(Issalchenkia), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces){예를 들어, 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 클루이베로마이세스 프라질리스(Kluyveromyces fragilis)}, 피치아 종(Pichia spp){예를 들어, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)}, 킬러 효모(killer yeast), 예를 들어, 비케르하모마이세스(Wickerhamomyces){예를 들어, 비케르하모마이세스 아모말루스(Wickerhamomyces anomalus)} 및 이들의 조합물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 균류(효모 포함)이다.
보다 구체적으로, 이 방법은 해충, 생물 환경 정화, 기름 회수 향상, 및 기타 유용한 목적을 제어할 수 있는 하나 이상의 생균 균류 균주(viable fungal strains), 예를 들어, 스타르메렐라 봄비콜라(Starmerella bombicola), 칸디다 아피콜라(Candida apicola), 칸디다 바티스태(Candida batistae), 칸디다 플로리콜라(Candida floricola), 칸디다 리오도센시스(Candida riodocensis), 칸디다 스텔라테(Candida stellate), 칸디다 쿠오이(Candida kuoi), 칸디다 종(Candida sp.) NRRL Y-27208, 로도토룰라 보고리엔시스 종(Rhodotorula bogoriensis sp.), 비케르하미엘라 도메리키애(Wickerhamiella domericqiae)뿐만 아니라, 스타르메렐라 클레이드(Starmerella clade)의 임의의 다른 소포로리피드(sophorolipid) 생성 균주를 검출하기 위해 사용될 수 있다.
다른 실시예에서, 미생물은 효모이다. 사카로마이세스(예를 들어, 사카로마이세스 세레비시애, 사카로마이세스 불라르디 세쿠에라, 및 사카로마이세스 토룰라), 데바로마이세스, 이살켄키아, 클루이베로마이세스(예를 들어, 클루이베로마이세스 락티스, 클루이베로마이세스 프라질리스), 피치아 종(예를 들어, 피치아 파스토리스), 및 이들의 조합물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 다수의 효모 종이 본 발명에 따른 생산을 위해 적합하다.
특정 실시예에서, 미생물은 킬러 효모의 균주로부터 선택될 수 있다. 다른 실시예에서, 미생물은 비케르하모마이세스 아노말루스(Wickerhamomyces anomalus) 균주이다.
피치아 아노말라(Pichia anomala) 및 한세눌라 아노말라(Hansenula anomala)로도 알려져 있는 비케르하모마이세스 아노말루스는 흔히 식품 및 곡물 생산과 관련되어 있다. 이것은 낮은 pH에서, 높은 삼투압 하에서, 산소가 거의 없거나 전혀없이 광범위한 탄소 공급원 상에서 성장하여, 광범위한 환경에서 그것의 생존을 허용할 수 있다.
특정 실시예에서, 본 발명은 환경에서 비케르하모마이세스 아노말루스 효모 균주와 그 변종을 검출하는 방법을 제공한다. 변종을 제조하는 절차는 미생물학 기술분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 자외선과 니트로소구아니딘이 이 목적을 향해 광범위하게 사용된다. 일 실시예에서, 미생물은 스타르메렐라 봄비콜라와 같은 스타르메렐라 효모 클레이드이다.
일 실시예에서, 미생물은, 메타노박테리아(Methanobacteria), 메타노코치(Methanococci), 메타노마이크로비아(Methanomicrobia), 메타노피리(Methanopyri), 할로박테리아(Halobacteria), 할로코치(Halococci), 테르모코치(Thermococci), 테르모플라스마타(Thermoplasmata), 테르모프로테이(Thermoproetei), 사이크로박터(Psychrobacter), 아트로박터(Arthrobacter), 할로모나스(Halomonas), 슈도모나스, 히포모나스(Hyphomonas), 스핀고모나스(Sphingomonas), 아르케오글로비(Archaeoglobi), 나노 호염성 고세균(Nanohaloarchaea), 호극성 고세균(extremophilic archaea), 예를 들어, 호열성 미생물(thermophiles), 호염성 미생물(halophiles), 호산성 미생물(acidophiles), 및 호저온성 미생물(psychrophiles), 및 이들의 조합물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 고세균, 또는 진정세균(eubacteria)이다.
일 실시예에서, 미생물은 아데노 바이러스, 사이토메갈로 바이러스, 헤르페스과 바이러스, 수두 대상포진, 인플루엔자, 리노 바이러스, 홍역, 볼거리, 엔테로 바이러스 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 바이러스이다.
특정 실시예에서, SLP를 생산하기 위한 미생물은 칸디다 종, 크립토콕쿠스 종(Cryptococcus sp.), 사이버린드네라 사무트프라카르넨시스(Cyberlindnera samutprakarnensis) JP52 (T), 피치아 아노말라, 로도토룰라 종(Rhodotorula sp.), 또는 비케르하미엘라 종(Wickerhamiella sp.)일 수 있다.
추가 특정 실시예에서, MEL을 생산하기 위한 미생물은 슈도지마 종(Pseudozyma sp.), 칸디다 종, 우스틸라고 종(Ustilago sp.), 쉬조넬라 종(Schizonella sp.), 또는 쿠르츠마노마이세스 종(Kurtzmanomyces sp.)일 수 있다.
예를 들어, 중합체를 소화시킬 수 있거나 또는 상당량의, 예를 들어, 당지질-생물계면활성제, 효소, 용매, 또는 다른 유용한 대사물질을 축적할 수 있는 다른 미생물 균주를 포함하는 다른 미생물 균주가 또한 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 유용한 대사물질은 만노 단백질(mannoprotein), 베타-글루칸, 및 생체 에멀션화와 표면/계면 장력 감소 특성을 갖는 다른 대사물질을 포함한다.
B. 병원체
일 실시예에서, 본 발명은 환경 샘플에서 병원체를 검출하기 위한 방법을 제공한다. 병원체는, 속(genera) 에르시니아(Yersinia), 클레브시엘라(Klebsiella), 프로비덴시아(Providencia), 에르비니아(Erwinia), 엔테로박터(Enterobacter), 살로넬라(Salmonella), 세라티아(Serratia), 에어로박터(Aerobacter), 대장균, 슈도모나스, 시겔라(Shigella), 비브리오(Vibrio), 에어로모나스(Aeromonas), 스트렙토콕쿠스(Streptococcus), 포도상구균, 마이크로콕쿠스(Micrococcus), 모락셀라(Moraxella), 바실러스, 클로스트리듐(Clostridium), 코리네박테륨(Corynebacterium), 에버텔라(Eberthella), 프란시셀라(Francisella), 헤모필루스(Haemophilus), 박테로이드(Bacteroides), 리스테리아(Listeria), 에리시펠로트릭스(Erysipelothrix), 아시네토박터(Acinetobacter), 브루셀라(Brucella), 파스퇴렐라(Pasteurella), 플라보박테륨(Flavobacterium), 푸소박테륨(Fusobacterium), 스트렙토바실루스(Streptobacillus), 칼리마토박테륨(Calymmatobacterium), 레지오넬라(Legionella), 트레포네마(Treponema), 보렐리아(Borrelia), 렙토스피라(Leptospira), 악티노마이세스(Actinomyces), 노카르디아(Nocardia), 리케치아(Rickettsia), 마이크로콕쿠스(Micrococcus), 미코박테륨(Mycobacterium), 나이세리아(Neisseria), 또는 캄필로박터(Campylobacter) 중 하나의 요소를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다.
병원체는 유두종 바이러스, 파르보 바이러스, 아데노 바이러스, 헤르페스 바이러스, 백신 바이러스, 아레나 바이러스, 코로나 바이러스, 리노 바이러스, 호흡기 세포 융합 바이러스(Respiratory syncytial viruses), 인플루엔자 바이러스, 피코나 바이러스, 파라믹소 바이러스(Paramyxovirus), 레오 바이러스, 레트로 바이러스, 랍도 바이러스(Rhabdovirus), 또는 인간 면역 결핍 바이러스(HIV) 요소와 같은 병원성 바이러스를 또한 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다.
병원체는 속　테니아(Taenia), 히메놀렙시스(Hymenolepsis), 디필로보트리윰(Diphyllobothrium), 에키노콕쿠스(Echinococcus), 파시올롭시스(Fasciolopsis), 헤테로피에스(Heterophyes), 메타고니무스(Metagonimus), 클로노르키스(Clonorchis), 파시올라(Fasciola), 파라고니무스(Paragonimus), 쉬스토소마(Schistosoma), 엔테로비우스(Enterobius), 트리쿠리스(Trichuris), 아스카리스(Ascaris), 안시로스토마(Ancylostoma), 네카토(Necator), 부케레리아(Wuchereria), 브루기(Brugi), 로아(Loa), 온코세르카(Onchocerca), 드라쿤쿨루스(Dracunculus), 네글레리아(Naegleria), 아칸타모에바(Acanthamoeba), 플라스모디윰(Plasmodium), 트리파노소마(Trypanosoma), 리슈마니아(Leishmania), 톡소플라스마(Toxoplasma), 엔타모에바(Entamoeba), 기아르디아(Giardia), 이소스포라(Isospora), 크립토스포리디윰(Cryptosporidium), 엔테로시토조아(Enterocytozoa), 스트롱길로이드(Strongyloides), 또는 트리키넬라(Trichinella) 중 하나의 요소를 추가로 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에 따라, 병원체는, 예를 들어, 백선, 히스토플라스마증(Histoplasmosis), 분아균증(Blastomycosis), 아스페르길루스증(Aspergillosis), 효모균증(Cryptococcosis), 스포로트릭스증(Sporotrichosis), 콕시디오도마이코시스(Coccidiodomycosis), 파라콕시디오이데스 진균증(Paracoccidioidomycosis), 뮤코마이코시스(Mucomycosis), 칸디다증(Candidiasis), 피부사상균증(Dermatophytosis), 프로토테카증(Protothecosis), 비강진(Pityriasis), 균종(Mycetoma), 파라콕시디오도마이코시스(Paracoccidiodomycosis), 페옵포마이코시스(Phaeohphomycosis), 슈달레세리아증(Pseudallescheriasis), 트리코스포론증(Trichosporosis), 또는 뉴모시스티스(Pneumocystis)와 같은 균류(fungus)를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다.
일 실시예에서, 본 발명에 따른 병원체는 소의 구진성 스토마티투스 바이러스(bovine papular stomatitus virus)(BPSV), 소의 헤르페스 바이러스(BVH), 소의 바이러스성 설사(BVD), 구제역(foot-and-mouth disease) 바이러스(FMDV), 청설(blue tongue) 바이러스(BTV), 돼지 수포병 바이러스(SVD), 돼지의 호흡기 생식 증후군 바이러스(PRRS), 소포성 구내염 바이러스(VSV), 및 돼지 수포성 발진 바이러스(VESV)를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다.
특정 실시예에서, 본 발명에 따른 병원체는 수막염균(Neisseria meningitides), 폐렴연쇄상구균(Streptococcus agalactiae), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 진지발리스균(Porphyromonas gingivalis), 폐렴 클라미디아(Chlamydia pneumoniae), 탄저균(Bacillus anthracis), 연쇄상구균 수이스(Streptococcus suis), 에키노콕쿠스 그라눌로수스(Echinococcus granulosus), 연쇄상구균 상귀니스(Streptococcus sanguinis), 및 헬리코박터 파일로리균(Helicobacter pylori)일 수 있다.
일 실시예에서, 본 발명에 따른 병원체는 인간 건강과 작물 성장에 위협이 되는 독성 분자를 생성할 수 있다. 예를 들어, 아스페르길루스 플라부스(Aspergillus flavus)와 아스페르길루스 파라시티쿠스(Aspergillus parasiticus)는 독성이 높은 아플라톡신인 아플라톡신 B1(AFB1)을 생성하고, 이는 곡물 및 땅콩, 옥수수, 쌀, 및 콩과 같은 다른 작물을 오염시킬 수 있다. 병원체에 의해 생성된 다른 독소는 오크라톡신(ochratoxin) A, 보툴리눔 독소(botulinum toxin), 시가 독소(shiga toxin) 1, 시가 독소 2, 및 포도상구균 장독소(staphylococcal enterotoxin) B를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
식물
본 발명의 방법에 따라 시험될 수 있는 식물은: 줄뿌림 작물(예를 들어, 옥수수, 콩, 수수, 땅콩, 감자 등), 농작물(예를 들어, 알팔파, 밀, 곡류 등), 나무 작물(예를 들어, 호두, 아몬드, 피칸, 헤이즐넛, 피스타치오 등), 감귤류(예를 들어, 오렌지, 레몬, 자몽 등), 과일 작물(예를 들어, 사과, 배 등), 잔디 작물, 관상용 작물(예를 들어, 꽃, 덩굴 등), 야채(예를 들어, 토마토, 당근 등), 포도나무 작물(예를 들어, 포도, 딸기, 블루베리, 블랙베리 등), 임업(예를 들어, 소나무, 가문비 나무, 유칼립투스, 포플러 등), 관리된 목초(방목 동물을 먹이기 위해 사용된 임의의 식물 혼합물)를 포함한다.
본 발명의 생성물과 방법으로부터 이익을 얻을 수 있는 추가 식물은, 녹색식물 상과(superfamily Viridiplantae)에 속하는 모든 식물, 특히, 그 중에서도, 아세르 종(Acer spp.), 악티니디아 종(Actinidia spp.), 아벨모쉬우스 종(Abelmoschus spp.), 아가베 시살라나(Agave sisalana), 아그로파이론 종(Agropyron spp.), 아그로스티스 스톨로니페라(Agrostis stolonifera), 알리움 종(Allium spp.), 아마란투스 종(Amaranthus spp.), 암모필라 아레나리아(Ammophila arenaria), 파인애플(Ananas comosus), 아노나 종(Annona spp.), 아피움 그라베오렌스(Apium graveolens), 아라키스 종(Arachis spp.), 아르토카르푸스 종(Artocarpus spp.), 아스파라거스 오피시날리스(Asparagus officinalis), 아베나 종(Avena spp.){예를 들어, 아베나 사티바(Avena sativa), 아베나 파투아(Avena fatua), 아베나 비잔티나(Avena byzantina), 아베나 파투아 변종 사티바(Avena fatua var. sativa), 아베나 하이브리다(Avena hybrida)}, 아베르호아 카람볼라(Averrhoa carambola), 밤부사 종(Bambusa sp.), 베닌카사 히스피다(Benincasa hispida), 베르톨렛티아 엑셀세아(Bertholletia excelsea), 사탕 무(Beta vulgaris), 브라시카 종(Brassica spp.){예를 들어, 브라시카 나푸스(Brassica napus), 브라시카 라파 종(Brassica rapa ssp.)[카놀라, 유채(oilseed rape), 순무 평지(turnip rape)]}, 카다바 파리노사(Cadaba farinosa), 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis), 칸나 인디카(Canna indica), 삼(Cannabis sativa), 캡시쿰 종(Capsicum spp.), 카렉스 엘라타(Carex elata), 카리카 파파야(Carica papaya), 카리사 마크로카르파(Carissa macrocarpa), 카리아 종(Carya spp.), 홍화(Carthamus tinctorius), 카스타네아 종(Castanea spp.), 세이바 펜탄드라(Ceiba pentandra), 시코리움 엔디비아(Cichorium endivia), 신나모뭄 종(Cinnamomum spp.), 수박(Citrullus lanatus), 시트러스 종(Citrus spp.), 코코스 종(Cocos spp.), 코페아 종(Coffea spp.), 토란(Colocasia esculenta), 콜라 종(Cola spp.), 코르코러스 종(Corchorus sp.), 고수(Coriandrum sativum), 코릴러스 종(Corylus spp.), 크라테구스 종(Crataegus spp.), 샤프란(Crocus sativus), 쿠쿠르비타 종(Cucurbita spp.), 쿠쿠미스 종(Cucumis spp.), 시나라 종(Cynara spp.), 당근(Daucus carota), 데스모디움 종(Desmodium spp.), 디모카르푸스 론간(Dimocarpus longan), 디오스코레아 종(Dioscorea spp.), 디오스파이로스 종(Diospyros spp.), 에키노클로아 종(Echinochloa spp.), 엘라에이스(Elaeis){예를 들어, 오일 야자(Elaeis guineensis), 엘라에이스 올레이페라(Elaeis oleifera)}, 엘류시네 코라카나(Eleusine coracana), 에라그로스티스 테프(Eragrostis tef), 에리안투스 종(Erianthus sp.), 비파 나무(Eriobotrya japonica), 유칼립투스 종(Eucalyptus sp.), 유게니아 유니플로라(Eugenia uniflora), 파고피룸 종(Fagopyrum spp.), 파구스 종(Fagus spp.), 페스투카 아룬디나세아(Festuca arundinacea), 무화과나무(Ficus carica), 포르투넬라 종(Fortunella spp.), 프라가리아 종(Fragaria spp.), 은행나무(Ginkgo biloba), 글리신 종(Glycine spp.){예를 들어, 대두(Glycine max), 소자 히스피다(Soja hispida) 또는 소자 막스(Soja max)}, 목화(Gossypium hirsutum), 헬리안투스 종(Helianthus spp.){예를 들어, 헬리안투스 안누스(Helianthus annuus)}, 원추리(Hemerocallis fulva), 히비스쿠스 종(Hibiscus spp.), 호르데움 종(Hordeum spp.){예를 들어, 호르데움 불가레(Hordeum vulgare)}, 고구마(Ipomoea batatas), 유그란스 종(Juglans spp.), 상추(Lactuca sativa), 라티루스 종(Lathyrus spp.), 렌즈콩(Lens culinaris), 아마(Linum usitatissimum), 리치(Litchi chinensis), 로투스 종(Lotus spp.), 비단 단호박(Luffa acutangula), 루피누스 종(Lupinus spp.), 루주라 실바티카(Luzula sylvatica), 라이코페르시콘 종(Lycopersicon spp.){예를 들어, 토마토(Lycopersicon esculentum), 라이코페르시콘 라이코페르시쿰(Lycopersicon lycopersicum), 라이코페르시콘 피리포르메(Lycopersicon pyriforme)}, 마크로틸로마 종(Macrotyloma spp.), 말루스 종(Malus spp.), 말피기아 에마르기나타(Malpighia emarginata), 맘메아 아메리카나(Mammea americana), 망고(Mangifera indica), 마니호트 종(Manihot spp.), 마닐카라 자포타(Manilkara zapota), 알팔파(Medicago sativa), 멜리로투스 종(Melilotus spp.), 멘타 종(Mentha spp.), 억새(Miscanthus sinensis), 모모르디카 종(Momordica spp.), 검은 뽕나무(Morus nigra), 무사 종(Musa spp.), 니코티아나 종(Nicotiana spp.), 올레나 종(Olea spp.), 오푼티아 종(Opuntia spp.), 오르니토푸스 종(Ornithopus spp.), 오리자 종(Oryza spp.){예를 들어, 벼(Oryza sativa), 오리자 라티폴리아(Oryza latifolia)}, 기장(Panicum miliaceum), 지팽이풀(Panicum virgatum), 패션 프루트(Passiflora edulis), 파스닙(Pastinaca sativa), 페니세툼 종(Pennisetum sp.), 페르세아 종(Persea spp.), 페트로셀리눔 크리스품(Petroselinum crispum), 갈풀(Phalaris arundinacea), 파세오루스 종(Phaseolus spp.), 큰조아재비(Phleum pratense), 페닉스 종(Phoenix spp.), 갈대(Phragmites australis), 피살리스 종(Physalis spp.), 피누스 종(Pinus spp.), 피스타치오(Pistacia vera), 피숨 종(Pisum spp.), 포아 종(Poa spp.), 포푸러스 종(Populus spp.), 프로소피스 종(Prosopis spp.), 프루누스 종(Prunus spp.), 프시디움 종(Psidium spp.), 석류나무(Punica granatum), 서양배나무(Pyrus communis), 쿠에르쿠스 종(Quercus spp.), 무(Raphanus sativus), 레움 라바르바룸(Rheum rhabarbarum), 리베스 종(Ribes spp.), 피마자(Ricinus communis), 루부스 종(Rubus spp.), 사카룸 종(Saccharum spp.), 살릭스 종(Salix sp.), 삼부쿠스 종(Sambucus spp.), 호밀(Secale cereale), 세사뭄 종(Sesamum spp.), 시나피스 종(Sinapis sp.), 솔라눔 종(Solanum spp.){예를 들어, 감자(Solanum tuberosum), 솔라눔 인테그리폴리움(Solanum integrifolium) 또는 솔라눔 라이코페르시쿰(Solanum lycopersicum)}, 수수(Sorghum bicolor), 스피나시아 종(Spinacia spp.), 시지기움 종(Syzygium spp.), 타게테스 종(Tagetes spp.), 타마린두스 인디카(Tamarindus indica), 테오브로마 카카오(Theobroma cacao), 트리폴리움 종(Trifolium spp.), 트립사쿰 닥틸로이데스(Tripsacum dactyloides), 트리티코세칼레 림파우이(Triticosecale rimpaui), 트리티쿰 종(Triticum spp.){예를 들어, 밀(Triticum aestivum), 듀럼밀(Triticum durum), 트리티쿰 투르기둠(Triticum turgidum), 트리티쿰 히베르눔(Triticum hybernum), 트리티쿰 마카(Triticum macha), 트리티쿰 사티붐(Triticum sativum), 트리티쿰 모노코쿰(Triticum monococcum) 또는 트리티쿰 불가레(Triticum vulgare)}, 트로페오룸 미누스(Tropaeolum minus), 한련(Tropaeolum majus), 바키니움 종(Vaccinium spp.), 비시아 종(Vicia spp.), 비그나 종(Vigna spp.), 향기 제비꽃(Viola odorata), 비티스 종(Vitis spp.), 옥수수(Zea mays), 지자니아 팔루스트리스(Zizania palustris), 지지푸스 종(Ziziphus spp.)으로부터 선택되는, 사료(fodder) 또는 콩과 목초(forage legume), 관상용 식물, 식용 작물, 나무 또는 관목을 포함하는 외떡잎 및 쌍떡잎 식물을 포함한다.
해당 식물의 추가적인 예는, 옥수수(Zea mays), 브라시카 종(예를 들어, 브라시카 나푸스, 브라시카 라파, 브라시카 준세아), 특히, 종자 기름(seed oil)의 공급원으로 유용한 브라시카 종, 알팔파(Medicago sativa), 벼(Oryza sativa), 호밀(Secale cereale), 수수(Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), 밀렛(millet){예를 들어, 펄 밀렛(Pennisetum glaucum), 기장(Panicum miliaceum), 조(Setaria italica), 손가락 조(finger millet)(Eleusine coracana)}, 해바라기(Helianthus annuus), 홍화(Carthamus tinctorius), 밀(Triticum aestivum), 대두(Glycine max), 담배(Nicotiana tabacum), 감자(Solanum tuberosum), 땅콩(Arachis hypogaea), 목화(Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), 고구마(Ipomoea batatus), 카사바(Manihot esculenta), 커피(Coffea spp.), 코코넛(Cocos nucifera), 파인애플(Ananas comosus), 감귤 나무(Citrus spp.), 코코아(Theobroma cacao), 차(tea)(Camellia sinensis), 바나나(Musa spp.), 아보카도(Persea americana), 무화과(Ficus casica), 구아바(Psidium guajava), 망고(Mangifera indica), 올리브(Olea europaea), 파파야(Carica papaya), 캐슈(Anacardium occidentale), 마카다미아(Macadamia integrifolia), 아몬드(Prunus amygdalus), 사탕 무(Beta vulgaris), 사탕수수(Saccharum spp.), 귀리, 보리, 야채, 관상용 식물, 및 구과 식물(conifer)을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
야채는 토마토(Lycopersicon esculentum), 상추(예를 들어, Lactuca sativa), 강낭콩(Phaseolus vulgaris), 리마콩(Phaseolus limensis), 완두(Lathyrus spp.), 및 오이(C. sativus), 칸타루프(C. cantalupensis), 및 머스크 멜론(C. melo)과 같은 오이속(genus Cucumis)의 요소를 포함한다. 관상용 식물은 진달래(Rhododendron spp.), 수국(Macrophylla hydrangea), 하비스쿠스(Hibiscus rosasanensis), 장미(Rosa spp.), 튤립(Tulipa spp.), 수선화(Narcissus spp.), 피튜니아(Petunia hybrida), 카네이션(Dianthus caryophyllus), 포인세티아(Euphorbia pulcherrima), 및 국화를 포함한다. 실시예를 실시하는 데 사용될 수 있는 구과 식물은, 예를 들어, 테다 소나무(Pinus taeda), 슬래시 소나무(Pinus elliotii), 폰데로사 소나무(Pinus ponderosa), 로지폴 소나무(Pinus contorta), 및 몬테레이 소나무(Pinus radiata)와 같은 소나무; 미송(Pseudotsuga menziesii); 미국 솔송나무(Tsuga canadensis); 시트카 스프루스(Picea glauca); 미국 삼나무(Sequoia sempervirens); 전나무(Abies amabilis) 및 발삼 전나무(Abies balsamea)와 같은 트루 퍼(true fir); 및 미국 삼나무(Thuja plicata) 및 알래스카 측백나무(Chamaecyparis nootkatensis)와 같은 삼나무를 포함한다. 실시예의 식물은 옥수수 및 대두 식물과 같은, 작물 식물(예를 들어, 옥수수, 알팔파, 해바라기, 브라시카, 대두, 목화, 홍화, 땅콩, 수수, 밀, 밀렛, 담배 등)을 포함한다.
잔디는: 일년생 블루그라스(annual bluegrass)(Poa annua); 일년생 라이그라스(annual ryegrass)(Lolium multiflorum); 캐나다 블루그라스(Canada bluegrass)(Poa compressa); 츄잉스 훼스큐(Chewings fescue)(Festuca rubra); 콜로니얼 벤트그라스(colonial bentgrass)(Agrostis tenuis); 크리핑 벤트그라스(creeping bentgrass)(Agrostis palustris); 크레스티드 위트그라스(crested wheatgrass)(Agropyron desertorum); 페어웨이 위트그라스(fairway wheatgrass)(Agropyron cristatum); 하드 훼스큐(hard fescue)(Festuca longifolia); 켄터키 블루그라스(Kentucky bluegrass)(Poa pratensis); 오처드그라스(orchardgrass)(Dactylis glomerate); 다년생 라이그라스(perennial ryegrass)(Lolium perenne); 레드 훼스큐(red fescue)(Festuca rubra); 흰겨이삭(redtop)(Agrostis alba); 러프 블루그라스(rough bluegrass)(Poa trivialis); 쉽 훼스큐(sheep fescue)(Festuca ovine); 스무드 브롬그라스(smooth bromegrass)(Bromus inermis); 톨 훼스큐(tall fescue)(Festuca arundinacea); 티모시(timothy)(Phleum pretense); 벨벳 벤트그라스(velvet bentgrass)(Agrostis canine); 위핑 알칼리그라스(weeping alkaligrass)(Puccinellia distans); 웨스턴 위트그라스(western wheatgrass)(Agropyron smithii); 버뮤다 그라스(Bermuda grass)(Cynodon spp.); 세인트 어거스틴 그라스(St. Augustine grass)(Stenotaphrum secundatum); 조이시아 그라스(zoysia grass)(Zoysia spp.); 바이아 그라스(Bahia grass)(Paspalum notatum); 카펫 그라스(carpet grass)(Axonopus affinis); 센티피드 그라스(centipede grass)(Eremochloa ophiuroides); 키쿠유 그라스(kikuyu grass)(Pennisetum clandesinum); 씨쇼어 파스팔룸(seashore paspalum)(Paspalum vaginatum); 블루 그래마(blue gramma)(Bouteloua gracilis); 버팔로 그라스(buffalo grass)(Buchloe dactyloids); 사이드오츠 그래마(sideoats gramma)(Bouteloua curtipendula)를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
해당 식물은 해당 종자, 지방 종자 식물(oil-seed plant), 및 콩과 식물을 제공하는 곡물 식물을 추가로 포함한다. 해당 종자는 옥수수, 밀, 보리, 쌀, 수수, 호밀, 기장 등과 같은 곡물 종자를 포함한다. 지방 종자 식물은 목화, 대두, 홍화, 해바라기, 브라시카, 옥수수, 알팔파, 야자, 코코넛, 아마, 피마자, 올리브 등을 포함한다. 콩과 식물은 콩과 완두콩을 포함한다. 콩은 구아, 로커스트 콩, 페뉴그리크(fenugreek), 대두, 강낭콩, 광저기(cowpea), 녹두, 리마 콩, 파바 콩(favabean), 렌즈 콩, 병아리 콩 등을 포함한다.
식물 질병
본 발명에 따라 검출될 수 있는 식물 질병의 예는 다음을 포함한다:
밀 질병: 푸사리움 이삭마름병(Fusarium head blight){푸사리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum), 푸사리움 아베나세룸(F. avenacerum), 푸사리움 쿨모룸(F. culmorum), 미크로도키움 니발레(Microdochium nivale)}, 타이풀라 눈마름병(Typhula snow blight){타이풀라 종(Typhula sp.), 미크로넥트리엘라 니발리스(Micronectriella nivalis)}, 겉깜부기병(loose smut){우스틸라고 트리티키(Ustilago tritici), 우스틸라고 누다(U. nuda)}, 깜부기병(bunt){틸레티아 카리에스(Tilletia caries)}, 잎마름병(leaf blotch){마이코스페렐라 그래미니콜라(Mycosphaerella graminicola)}, 및 밀껍질마름병(glume blotch){렙토스페리아 노도룸(Leptosphaeria nodorum)};
옥수수 질병: 깜부기병(smut){우스틸라고 메이디스(Ustilago maydis)} 및 갈반병(brown spot){코크리오볼루스 헤테로스트로푸스(Cochliobolus heterostrophus)};
감귤류 질병: 감귤수지병(melanose){디아포르테 시트리(Diaporthe citri)}, 더뎅이병(scab){엘시노에 파우세티(Elsinoe fawcetti)}, 페니실리움 부패병(penicillium rot){페니실리움 디기타툼(Penicillium digitatum), 페니실리움 이탈리쿰(P. italicum)}, 및 감귤 녹화병(Citrus Greening){칸디다투스 리베리박터 종(Candidatus Liberibacter spp.)};
사과 질병: 꽃부패병(blossom blight){모닐리니아 말리(Monilinia mali)}, 백분병(powdery mildew){포도스페라 류코트리카(Podosphaera leucotricha)}, 사과나무 반점 낙엽병(Alternaria leaf spot){알테르나리아 알테르나타 사과 병원형(Alternaria alternata apple pathotype)}, 검은별무늬병(scab){벤투리아 이네쿠알리스(Venturia inaequalis)}, 사과나무 탄저병(bitter rot){콜레토트리쿰 아쿠타툼(Colletotrichum acutatum)}, 및 관부 썩음병(crown rot){피토프토라 칵토룸(Phytophtora cactorum)};
배 질병: 검은별무늬병(scab){벤투리아 나시콜라(Venturia nashicola), 벤투리아 피리나(V. pirina)}, 검은 무늬병(black spot){알테르나리아 알테르나타 일본 배 병원형(Alternaria alternata Japanese pear pathotype)}, 녹병{김노스포란기움 하레아눔(Gymnosporangium haraeanum)}, 및 파이토프토라 과일 썩음병(phytophthora fruit rot ){파이토프토라 칵토룸(Phytophtora cactorum)};
복숭아 질병: 복숭아나무 잿빛무늬병(brown rot){모닐리니아 프룩티콜라(Monilinia fructicola)}, 검은별 무늬병{클라도스포리움 카르포필룸(Cladosporium carpophilum)}, 및 포몹시스 썩음병(phomopsis rot){포몹시스 종(Phomopsis sp.)};
포도 질병: 탄저병(anthracnose){엘시노에 암펠리나(Elsinoe ampelina)}, 만부병(ripe rot){글로메렐라 신구라타(Glomerella cingulata)}, 검은 썩음병(black rot){구이그나르디아 비드웰리(Guignardia bidwellii)}, 노균병(downy mildew){플라스모파라 비티콜라(Plasmopara viticola)}, 및 잿빛곰팡이병(gray mold){보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea)};
감나무 질병: 탄저병{글로에오스포리움(Gloeosporium kaki)} 및 점무늬병(leaf spot){세르코스포라 카키(Cercospora kaki), 마이코스페렐라 나베(Mycosphaerella nawae)};
박(gourd) 질병: 탄저병{콜레토트리쿰 라게나리움(Colletotrichum lagenarium)}, 표적 점무늬병(Target leaf spot){코리네스포라 카시콜라(Corynespora cassiicola)}, 덩굴마름병(gummy stem blight){마이코스페렐라 멜로니스(Mycosphaerella melonis)}, 덩굴쪼김병(Fusarium wilt){푸사림 옥시스포룸(Fusarium oxysporum)}, 노균병{슈도페로노스포라 쿠벤시스(Pseudoperonospora cubensis)}, 및 역병(Phytophthora rot){파이토프토라 종(Phytophthora sp.)};
토마토 질병: 겹무늬병(early blight){알테르나리아 솔라니(Alternaria solani)}, 잎곰팡이병(leaf mold){클라도스포리움 플루붐(Cladosporium fulvum)}, 및 잎마름역병(late blight){파이토프토라 인페스탄스(Phytophthora infestans)};
십자화과 채소류(cruciferous vegetables) 질병: 점무늬 낙엽병(Alternaria leaf spot){알테르나리아 자포니카(Alternaria japonica)}, 흰무늬병(white spot){세르코스포렐라 브라시케(Cercosporella brassicae)}, 및 노균병{페로노스포라 파라시티카(Peronospora parasitica)};
유채 질병: 균핵병(sclerotinia rot){스클레로티니아 스클레로티오룸(Sclerotinia sclerotiorum)} 및 회색 점무늬병(gray leaf spot){알테르나리아 브라시케(Alternaria brassicae)};
대두 질병: 자주무늬병(purple seed stain){세르코스포라 키쿠치(Cercospora kikuchii)}, 스파셀로마 스카드(sphaceloma scad){엘시노에 글리시네스(Elsinoe glycines)}, 꼬투리와 줄기 마름병(pod and stem blight){디아포르테 파세오로룸 변종 소제(Diaporthe phaseolorum var. sojae)}, 녹병{파콥소라 파키르히지(Phakopsora pachyrhizi)}, 및 갈색 줄기 부패병(brown stem rot){파이토프토라 소제(Phytophthora sojae)};
팥 질병: 잿빛곰팡이병(보트리티스 시네레아) 및 균핵병(스클레로티니아 스클레로티오룸);
강낭콩 질병: 잿빛곰팡이병(보트리티스 시네레아), 스클레로티니아 종자 썩음병(sclerotinia seed rot)(스클레로티니아 스클레로티오룸), 및 강낭콩 탄저병{콜레토트리쿰 린뎀티아눔(Colletotrichum lindemthianum)};
땅콩 질병: 점무늬병{세르코스포라 페르소나타(Cercospora personata)}, 갈색 점무늬병{세르코스포라 아라키디콜라(Cercospora arachidicola)}, 및 백견병(southern blight){스클레로티움 롤프시(Sclerotium rolfsii)};
감자 질병: 겹무늬병{알테르나리아 솔라니(Alternaria solani)} 및 역병(파이토프토라 인페스탄스);
목화 질병: 덩굴쪼김병(푸사림 옥시스포룸);
담배 질병: 갈반병{알테르나리아 론기페스(Alternaria longipes)}, 탄저병{콜레토트리쿰 타바쿰(Colletotrichum tabacum)}, 노균병{페로노스포라 타바시나(Peronospora tabacina)}, 및 역병(black shank){파이토프토라 니코티아네(Phytophthora nicotianae)};
사탕 무 질병: 세르코스포라 점무늬병(Cercospora leaf spot){세르코스포라 베티콜라(Cercospora beticola)}, 잎마름병(leaf blight){타나테포루스 쿠쿠메리스(Thanatephorus cucumeris)}, 뿌리 썩음병(타나테포루스 쿠쿠메리스), 및 아파노마이세스 뿌리 썩음병)(Aphanomyces root rot{아파니데르마툼 코클리오이데스(Aphanidermatum cochlioides)};
장미 질병: 검은 무늬병{디플로카르폰 로제(Diplocarpon rosae)} 및 백분병{스페로테카 파노사(Sphaerotheca pannosa)};
국화 및 엉거시과 식물의 질병: 노균병{브레미아 락투케(Bremia lactucae)} 및 잎마름병{셉토리아-크리산테미-인디시(Septoria chrysanthemi-indici)};
다양한 식물의 질병: 피티움 종(Pythium spp.){피티움 아파니데르마툼(Pythium aphanidermatum), 피티움 데바리아눔(Pythium debarianum), 피티움 그라미니콜라(Pythium graminicola), 피티움 이레굴라레(Pythium irregulare), 피티움 울티뭄(Pythium ultimum)}에 의해 발생한 질병, 잿빛곰팡이병(보트리티스 시네레아), 균핵병(스클레로티니아 스클레로티오룸), 및 리족토니아 종(Rhizoctonia spp.)에 의해 발생한 잘록병(Damping-off){리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)};
왜무(Japanese radish) 질병: 점무늬 낙엽병{알테르나리아 브라시키콜라(Alternaria brassicicola)};
잔디풀(turfgrass) 질병: 달러 스폿(dollar spot){스클레로티니아 호메오카르파(Sclerotinia homeocarpa)}, 갈색 엽부병(brown patch), 및 갈색퍼짐병(large patch){리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)};
바나나 질병: 시가토카(sigatoka){마이코스페렐라 피지엔시스(Mycosphaerella fijiensis), 마이코스페렐라 무시콜라(Mycosphaerella musicola), 슈도세르코스포라 무세(Pseudocercospora musae)}; 및
아스페르길루스 속, 페니실리움 속, 푸사리움 속, 트리코데르마 속, 티엘라비옵시스 속, 리조푸스 속, 뮤코 속, 포마 속, 및 디플로디아 속의 박테리아에 의해 발생한 다양한 식물의 성장 초기 단계에서의 종자 질병 또는 질병.
이 질병은 뿌리, 잎에 있을 수 있고, 식물의 관다발계에 존재하거나 또는 곤충에 의해 옮겨질 수 있으며, 식물의 모든 박테리아, 바이러스성, 및 균류 병원체를 포함할 수 있다.
본원에 참조되거나 인용된 모든 특허, 특허 출원, 가출원, 및 공보는, 이 명세서의 명백한 교시와 상반되지 않는 정도까지, 모든 도면과 표를 포함하여 완전히 참조로 포함된다.
본원에 기술된 예와 실시예는 단지 예시적인 목적을 위한 것이고, 이를 고려하여 다양한 수정 또는 변경이 이 기술분야의 당업자에게 제안될 것이며, 이 출원의 사상과 범위 내에 포함되어야 하는 것으로 이해해야 한다.

Claims (79)

  1. 환경 또는 식품 샘플에서 표적 분석물(target analyte)을 검출하는 방법에 있어서,
    상기 샘플을 복수의 나노 결정(nanocrystal)과 접촉시키는 단계로서, 상기 나노 결정은 상기 샘플 내의 상기 분석물에 특이적으로 결합하는 개체(entity)로 표면 변성된, 단계,
    상기 샘플 내의 상기 분석물에 결합된 상기 나노 결정을 결합되지 않은 나노 결정으로부터 분리하는 단계, 및
    상기 분석물에 결합하는 상기 나노 결정을 검출하는 단계를
    포함하는, 표적 분석물을 검출하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 나노 결정은 고유하고 균일한 형태, 크기, 및/또는 조성을 가져서, 고유한 광학 시그니처(optical signature)를 생성하는, 표적 분석물을 검출하는 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 고유한 광학 시그니처는 상승(rise) 및/또는 붕괴(decay) 시간으로 표시되는, 표적 분석물을 검출하는 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 나노 결정은 상향 변환 인광체(up-converting phosphor) 입자인, 표적 분석물을 검출하는 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 나노 결정은 란탄(La), 세륨(Ce), 프라세오디뮴(Pr), 네오디뮴(Ne), 프로메튬(Pm), 사마륨(Sm), 유로퓸(Eu), 가돌리늄(Gd), 테르븀(Tb), 디스프로슘(Dy), 홀뮴(Ho), 에르븀(Er), 툴륨(Tm), 이테르븀(Yb), 및 루테튬(Lu)으로부터 선택된 적어도 하나의 희토류 원소를 포함하는, 표적 분석물을 검출하는 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 나노 결정은 4 nm 내지 400 nm 범위의 크기를 갖는, 표적 분석물을 검출하는 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 나노 결정은 10-8 초를 초과하는 동안 광을 방출하는, 표적 분석물을 검출하는 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 나노 결정은 900 nm 내지 1000 nm의 파장에서 여기될 수 있는, 표적 분석물을 검출하는 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 나노 결정은 960 nm 내지 980 nm의 파장에서 여기되는, 표적 분석물을 검출하는 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 나노 결정은 400 nm 내지 12,000 nm의 파장에서 광을 방출하는, 표적 분석물을 검출하는 방법.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 나노 결정은 β-상 입자인, 표적 분석물을 검출하는 방법.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 나노 결정은 양자점(quantum dot), 탄소 나노 튜브, 금 입자, 은 입자, 및 자기 또는 염료 도핑된 입자로부터 선택된 제2 리포터(reporter)와 결합되는, 표적 분석물을 검출하는 방법.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 분석물에 특이적으로 결합하는 상기 개체는 항체, 단백질, 앱타머(aptamer), 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드인, 표적 분석물을 검출하는 방법.
  14. 제1항에 있어서,
    게놈 분석은 배양될 수 없는 미생물 또는 미생물의 혼합 모집단의 유전자 서열 정보로부터 특정 에피토프(epitope)를 확인하기 위해 사용되고, 상기 배양될 수 없는 미생물에 특이적으로 결합하는 상기 유전자 확인 에피토프에 대한 결합제가 생성되는, 표적 분석물을 검출하는 방법.
  15. 제1항에 있어서,
    상기 분석물은 박테리아, 효모, 균류, 또는 바이러스인, 표적 분석물을 검출하는 방법.
  16. 제1항에 있어서,
    상기 분석물은 농업 병원체인, 표적 분석물을 검출하는 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 농업 병원체는 감귤 녹화병(citrus greening disease), 감자 역병(potato late blight), 포도 백분병(grape powdery mildew), 붉은 반점(red blotch), 담배 모자이크 바이러스(tobacco mosaic virus), 화상병(fire blight) 및/또는 피어스 질병(Pierce's Disease)을 일으키는 병원체로부터 선택되는, 표적 분석물을 검출하는 방법.
  18. 제1항에 있어서,
    상기 샘플은 토양 또는 식물 재료인, 표적 분석물을 검출하는 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 샘플은 식물 조직인, 표적 분석물을 검출하는 방법.
  20. 제1항에 있어서,
    상기 분석물은 미생물 기반 작용제(microbe-based agent)인, 표적 분석물을 검출하는 방법.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 미생물 기반 작용제는 미생물 생물 계면활성제(microbial biosurfactant) 또는 마이코톡신(mycotoxin)인, 표적 분석물을 검출하는 방법.
  22. 제1항에 있어서,
    상기 샘플은 식품이고 상기 분석물은 마이코톡신인, 표적 분석물을 검출하는 방법.
  23. 제1항에 있어서,
    상기 샘플은 동물의 생물학적 샘플인, 표적 분석물을 검출하는 방법.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 생물학적 샘플은 혈액, 분변, 점액, 타액, 또는 조직 샘플인, 표적 분석물을 검출하는 방법.
  25. 제1항에 있어서,
    상기 샘플은 물 샘플인, 표적 분석물을 검출하는 방법.
  26. 제25항에 있어서,
    상기 물 샘플은 음용수, 지하수, 지표수 및 폐수로부터 선택되는, 표적 분석물을 검출하는 방법.
  27. 제1항에 있어서,
    상기 샘플은 미생물을 함유하는 상업용 제품인, 표적 분석물을 검출하는 방법.
  28. 제27항에 있어서,
    상기 제품은 농업에서 사용하기 위한, 표적 분석물을 검출하는 방법.
  29. 제27항에 있어서,
    상기 제품은 식품인, 표적 분석물을 검출하는 방법.
  30. 제29항에 있어서,
    상기 미생물은 프로바이오틱스(probiotics)인, 표적 분석물을 검출하는 방법.
  31. 제29항에 있어서,
    상기 미생물은 병원성(pathogenic)인, 표적 분석물을 검출하는 방법.
  32. 제1항에 있어서,
    상기 분석물은 미생물이고 상기 분석물에 대한 검출 감도는 101 CFU/mL 이하인, 표적 분석물을 검출하는 방법.
  33. 제1항에 있어서,
    상기 나노 결정은 샘플에서 자연 발생하는 발색단(chromophore)으로부터 배경 간섭(background interference)을 피하기 위해 조정되는, 표적 분석물을 검출하는 방법.
  34. 제1항에 있어서,
    다수의 독립적으로 조정된 나노 결정은 단일 지지체 위에 다중화된 배열(multiplexed array)로 위치하여 단일 샘플로부터 다수의 분석물의 분석을 용이하게 하는, 표적 분석물을 검출하는 방법.
  35. 제1항에 있어서,
    5개 이상의 분석물이 동시에 분석되는, 표적 분석물을 검출하는 방법.
  36. 제1항에 있어서,
    상기 방법은 샘플이 얻어진 100 야드 이내에서 수행되는, 표적 분석물을 검출하는 방법.
  37. 제1항에 있어서,
    상기 방법은 샘플이 얻어진 10분 이내에 수행되는, 표적 분석물을 검출하는 방법.
  38. 제1항에 있어서,
    상기 검출 단계는 단일 판독으로 수행되는, 표적 분석물을 검출하는 방법.
  39. 제1항에 있어서,
    상기 검출은 20분 미만 내에 이루어질 수 있는, 표적 분석물을 검출하는 방법.
  40. 제1항에 있어서,
    상기 분석물의 검출, 정량화, 및/또는 추적은 농업인, 규제 관리, 특별 감사 관리, 또는 유통업자에 의해 수행되는, 표적 분석물을 검출하는 방법.
  41. 제1항에 있어서,
    검정법(assay)은 상업용 제품의 생산 직후부터 상기 제품의 사용 직전까지 공급망의 임의의 지점에서 수행되는, 표적 분석물을 검출하는 방법.
  42. 제1항에 있어서,
    개별 시험의 데이터는, 시험이 수행된 위치에서 떨어져 있는 위치로부터 접근될 수 있는 데이터베이스로 전송되는, 표적 분석물을 검출하는 방법.
  43. 제42항에 있어서,
    상기 데이터는 유익한 미생물의 성능을 평가하거나 또는 병원체의 운동을 평가하기 위해 사용되는, 표적 분석물을 검출하는 방법.
  44. 제1항에 있어서,
    측방 유동(lateral flow) 또는 미세 유체 검정법(microfluidic assay)을 사용하여 이루어지는, 표적 분석물을 검출하는 방법.
  45. 제44항에 있어서,
    상기 측방 유동 또는 미세 유체 검정법은 면역 검정법(immunoassay)인, 표적 분석물을 검출하는 방법.
  46. 제44항에 있어서,
    상기 검정법은 휴대용 검출 장치를 사용하여 수행되는, 표적 분석물을 검출하는 방법.
  47. 제46항에 있어서,
    상기 휴대용 검출 장치는 LED와 카메라를 포함하는, 표적 분석물을 검출하는 방법.
  48. 제47항에 있어서,
    상기 휴대용 검출 장치는 휴대 전화인, 표적 분석물을 검출하는 방법.
  49. 제44항에 있어서,
    상기 검정법은 다중 유동 기술을 사용하여 실행되는, 표적 분석물을 검출하는 방법.
  50. 제44항에 있어서,
    측방 유동 시험편(test strip)은 하나 이상의 샘플 수용 영역과 하나 이상의 표적 포획 구역(target capture zones)을 포함하는 고형 지지체를 갖는, 표적 분석물을 검출하는 방법.
  51. 제50항에 있어서,
    상기 고형 지지체는 니트로셀룰로오스이거나 또는 미세 유체 채널(microfluidic channel)이 플라스틱 또는 유리 기판에 에칭되거나 성형되도록 가공된, 표적 분석물을 검출하는 방법.
  52. 제48항에 있어서,
    상기 표적 포획 구역은 상기 환경 샘플에서 미생물 또는 미생물 기반 작용제에 특이적으로 결합하도록 표면 변성된, 표적 분석물을 검출하는 방법.
  53. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항의 검정법을 수행하는 장치.
  54. 제53항에 있어서,
    상기 표적 분석물에 특이적으로 결합하는 개체로 표면 변성된 나노 결정을 포함하는, 장치.
  55. 제54항에 있어서,
    상기 나노 결정은 고유하고 균일한 형태, 크기, 및/또는 조성을 가져서, 고유한 광학 시그니처를 생성하는, 장치.
  56. 제55항에 있어서,
    상기 고유한 광학 시그니처는 상승 및/또는 붕괴 시간으로 표시되는, 장치.
  57. 제54항에 있어서,
    상기 나노 결정은 상향 변환 인광체 입자인, 장치.
  58. 제54항에 있어서,
    상기 나노 결정은 란탄(La), 세륨(Ce), 프라세오디뮴(Pr), 네오디뮴(Ne), 프로메튬(Pm), 사마륨(Sm), 유로퓸(Eu), 가돌리늄(Gd), 테르븀(Tb), 디스프로슘(Dy), 홀뮴(Ho), 에르븀(Er), 툴륨(Tm), 이테르븀(Yb), 및 루테튬(Lu)으로부터 선택된 적어도 하나의 희토류 원소를 포함하는, 장치.
  59. 제54항에 있어서,
    상기 나노 결정은 4 nm 내지 400 nm 범위의 크기를 갖는, 장치.
  60. 제54항에 있어서,
    상기 나노 결정은 10-8 초를 초과하는 동안 광을 방출하는, 장치.
  61. 제54항에 있어서,
    상기 나노 결정은 900 nm 내지 1000 nm의 파장에서 여기될 수 있는, 장치.
  62. 제61항에 있어서,
    상기 나노 결정은 960 nm 내지 980 nm의 파장에서 여기되는, 장치.
  63. 제54항에 있어서,
    상기 나노 결정은 400 nm 내지 12,000 nm의 파장에서 광을 방출하는, 장치.
  64. 제54항에 있어서,
    상기 나노 결정은 β-상 입자인, 장치.
  65. 제54항에 있어서,
    상기 나노 결정은 양자점, 탄소 나노 튜브, 금 입자, 은 입자, 및 자기 또는 염료 도핑된 입자로부터 선택된 제2 리포터와 결합되는, 장치.
  66. 제54항에 있어서,
    상기 분석물에 특이적으로 결합하는 상기 개체는 항체, 단백질, 앱타머, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드인, 장치.
  67. 제54항에 있어서,
    상기 나노 결정은 샘플에서 자연 발생하는 발색단으로부터 배경 간섭을 피하기 위해 조정되는, 장치.
  68. 제54항에 있어서,
    다수의 독립적으로 조정된 나노 결정은 단일 지지체 위에 다중화된 배열로 위치하여 단일 샘플로부터 다수의 분석물의 분석을 용이하게 하는, 장치.
  69. 제54항에 있어서,
    상기 장치는 개별 시험의 데이터를 시험이 수행된 위치에서 떨어져 있는 위치로부터 접근될 수 있는 데이터베이스로 전송할 수 있는, 장치.
  70. 제54항에 있어서,
    측방 유동 또는 미세 유체 검정법인, 장치.
  71. 제70항에 있어서,
    상기 측방 유동 또는 미세 유체 검정법은 면역 검정법인, 장치.
  72. 제54항에 있어서,
    상기 장치의 하나의 구성 요소로서, 휴대용 검출 유닛을 포함하는, 장치.
  73. 제72항에 있어서,
    상기 휴대용 검출 유닛은 LED와 카메라를 포함하는, 장치.
  74. 제73항에 있어서,
    상기 휴대용 검출 유닛은 휴대 전화인, 장치.
  75. 제54항에 있어서,
    상기 검정법은 다중 유동 기술을 사용하여 실행되는, 장치.
  76. 제54항에 있어서,
    측방 유동 시험편은 하나 이상의 샘플 수용 영역과 하나 이상의 표적 포획 구역을 포함하는 고형 지지체를 갖는, 장치.
  77. 제76항에 있어서,
    상기 고형 지지체는 니트로셀룰로오스이거나 또는 미세 유체 채널이 플라스틱 또는 유리 기판에 에칭되거나 성형되도록 가공된, 장치.
  78. 제76항에 있어서,
    상기 표적 포획 구역은 상기 환경 샘플에서 미생물 또는 미생물 기반 작용제에 특이적으로 결합하도록 표면 변성된, 장치.
  79. PCR을 사용하여 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 검출하는 검정법에 있어서,
    상기 방법은 상기 표적 폴리뉴클레오타이드 서열을 증폭시키기 위해 프라이머 서열(primer sequence)을 사용하는 것을 포함하고, 상기 프라이머 서열 중 적어도 하나는 나노 결정에 결합되는, 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 검출하는 검정법.
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