CN109563533B - 用于微生物的原位检测的系统和方法 - Google Patents

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Abstract

描述了用于检测在生长基质或水中的致病生物的系统，其包含用于将引诱剂递送到所述生长基质或水中的工具，用于将所述微生物引导至检测器以检测目的微生物的工具，和当检测到目的微生物时提供信号的检测器。还描述了所述系统在农业和园艺学中的用途。

Description

用于微生物的原位检测的系统和方法
本发明涉及检测在生长基质和/或水中的微生物(包括害虫和其他微生物(例如真菌、卵菌、细菌和线虫))。特别地，本发明涉及检测在生长基质和/或水中的植物病原体，特别地涉及在其中正在商业基础上或在其天然环境中栽种着产品的田地或区域中原位检测在植物中引起疾病的害虫和生物。本发明还涉及可以在这样的检测中使用的设备。
虽然本发明主要涉及具有引起对于植物的损害的潜力的微生物的早期检测，但是它也可以用于检测诸如下列的微生物的存在：光合作用细菌(例如，沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)和类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides))、乳酸细菌(例如，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)和干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)，和链球菌属(Streptococcus))、酵母(例如，糖酵母属物种(Saccharomyces spp.))、放线菌(例如，链霉菌属物种(Streptomyces spp.))、固氮细菌(例如，根瘤菌属(Rhizobium)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、剑菌属(Ensifer)和中生根瘤菌属(Mesorhizobium))、菌根和溶解磷酸盐的微生物(例如，细菌(芽孢杆菌属(Bacillus))和真菌(曲霉属(Aspergillus)、青霉属物种(Penicillium spp.)))、促进植物生长的根际细菌和植物益生菌(例如，假单胞菌属(Pseudomonas))。这些微生物可以有益于植物的健康，以向栽种者提供关于需求的信息或者提供材料来增强所讨论的植物的康健。
归因于由微生物(包括病原体，例如真菌、卵菌、细菌、线虫和损害性昆虫)引起的植物疾病的植物产量损失是一个全球关注的问题，不仅在农业和园艺学中，而且在造林、园艺中心、私人花园和观赏植物中。许多有价值的作物和观赏植物对于疾病是非常易感的，并且在没有人工干预的情况下将会难以在自然界中存活。在水中饲养的产品(例如，湖泊中的养鱼场)的损失也值得关注。
栽培植物常常比其野生亲属对于疾病更易感，因为大量的相同物种或品种(其具有一致的遗传背景)紧密地栽种在一起，有时超过数千平方公里。由致病生物引起的疾病可以在这些条件下快速散布。例如，疫霉属(Phytophthora)(一种产生攻击一系列植物、蔬菜和水果的根和茎的孢子的植物病原体)是栽种者们特别关注的，因为它可以污染供水系统并且还可以在植物残骸和土壤中停留许多年而不被觉察到。据估计，疫霉属(被称为“21世纪的植物毁灭者”)单独地在全世界范围内引起20-70亿美元损失/作物/年。(Roy等人,2012Review of Plant Pathology,第6卷)。
存在许多方法来检测植物疾病。例如，在植物致病物种的检测中，农民典型地利用顾问农学家，后者取土壤或植物材料(例如，叶或根)的样品并且就植物病原体的存在来分析该样品。通过使用实验室测试在外部进行分析。此类实验室测试可以包括分子技术例如ELISA、PCR(PCR和实时PCR)、免疫荧光(IF)、流式细胞术、荧光原位杂交(FISH)和DNA微阵列。采用样品的外部实验室测试存在有几个问题。首先，土壤取样仅选择小样品，并且可能未必反映了土壤的真实状况。
在一些情况下，在土壤中的致病生物的水平将会过低而无法检测，因此在对孤立的土壤区域进行取样中，植物病原体的水平将会是无效的，尽管存在损害性量的病原体。外部实验室分析要求将样品运输离开测试场所至实验室，并因此在提供诊断分析的结果方面存在延迟。在检测可以在植物中引起疾病的生物(例如，植物病原体)中的任何延迟可以导致该疾病的散布和更大数目的植物被侵袭。
还可以通过使用现场侧流装置就致病生物的存在来测试样品。此类装置要求农民从植物中取得样品，例如叶。所述装置提取在植物样品中的蛋白质，并且可以检测植物病原体的存在。每个植物样品仅是正被检测的植物的代表。因此，每个样品不是整个植物生长区域的代表。进一步地，经测试对于植物病原体来说阳性的植物样品指示，该植物已经被所述病原体侵袭。这可能对于阻止由于该病原体引起的损害来说太晚了，并且对于阻止该植物病原体散布至周围植物来说也太晚了。
经常地，农民可能根本不对疾病的存在进行测试，而是简单地使用针对常见疾病的预防性喷洒例行程序。并不知道如果让其不进行处理所述植物是否将会被植物病原体作为目标，因此此类喷洒例行程序可能在一些情况下是不必要的，并且涉及不必要地使用具有不利的环境影响的化学品，招致不必要的花费，并且可能导致该病原体变得对于所述处理具有抗性。
植物健康威胁和疾病(例如，害虫，和由微生物(例如真菌、卵菌、细菌和线虫)引起的植物疾病)的早期检测可以有助于通过恰当的作物管理策略(例如，经由杀虫剂施用、杀真菌剂施用和疾病特异性化学品施用以及生物防治的媒介控制)来控制疾病。另外，在苗圃中的早期检测将会使得能够生产和供应无疾病的植物。因此，存在下述需要：提供用于检测在土壤或水中的这些不希望的致病物种的准确且简单的方法和装置，其可以在植物生长或潜在植物生长或者供水系统的场所处使用。
在我们的PCT申请PCT/GB2015054036中，我们描述了一种装置，其用于检测在土壤或水中的植物病原体孢子，特别地用于在病原体影响植物之前进行检测，并且该申请包含病原体列表，并且本发明尤其可应用于在那个申请中所列出的病原体。
美国专利公布2013/0334042描述了在田地中原位检测空气传播的病原体孢子，但是该程序要求相当长的时间用于分析以检测病原体，和进一步地所述检测通常在至少一些植物已被感染后发生。进一步地，该技术不能用于检测在土壤或水中的致病微生物。
一些致病物种(例如，真菌、卵菌和细菌)可以在土壤和水中都存在且长时间处于休眠状态，并且它们可以通过环境变化例如雨、热或其他天气相关的问题而被激活。一旦被激活，它们就可以与植被相接触，典型地与植被的根相接触，从那里它们可以进入到植被中，并且对特定作物造成相当大的损害。所述植被可以包括下列的整个范围：农业和园艺学作物，水果作物(例如，果树和葡萄园)，花卉生产，园艺中心和观赏园圃植物，和在其天然环境中例如在森林中生长的树木。本发明可以用于在其中栽种着植物以用于供应的苗圃中早期检测引起植物疾病的生物，例如致病微生物(真菌、卵菌和细菌)，这使得能够具有更大的信心保证年幼植物是无疾病的。致病生物也可以存在于水系统中，例如用于灌溉的水、蓄水层、水景园、水库、储水池和提供养鱼场的湖泊。
PCT公布WO 94/08042将樟疫霉(Phytophthora cinnamomi rands)描述为在整个热带和温带地区所发现的最重要的植物病原体之一，并且该发明对于疫霉属类型的病原体是特别有用的。这些病原体影响来自各种各样植物科的越来越多样化的物种。宿主包括农业作物例如蔬菜和可耕地作物和还有重要的园艺学作物例如柑橘类水果、鳄梨、菠萝和马卡达姆坚果，观赏物种，以及几种有价值的木材物种。其效应可以是所引入的病原体对于由许多易感物种组成的植物区系的影响的毁灭性例子。对于该病原体的控制和改进的关于其生物学的了解必须部分地基于关于在土壤中接种物的位置和密度的信息。但是，在WO 94/08042中所提出的检测要求吸引孢子，使孢子在实验室中生长以用于随后的检测。因此，所述检测要花几天来完成，并且它不是原位进行的且要求样品操作和具有有资质的人员的实验室。
虽然本发明通常可应用于鉴定在生长基质和/或水中的任何微生物，但是它特别地涉及检测病原体，尤其是检测基于疫霉属的病原体。
因此，本发明提供了在支持或者被设计成支持在其天然环境中的和/或在商业场所处的植被的生长基质和/或水中的微生物，特别是引起疾病的生物例如致病真菌、卵菌、细菌和害虫的检测，所述检测通过在所述生长基质和/或水之内提供用于所述微生物的引诱剂来进行，其中所述引诱剂吸引所述微生物并将它引导至直接提供所述微生物的存在的指示的检测器。
本发明进一步提供了用于检测在生长基质和/或水中的微生物，特别是引起疾病的生物的系统，其包含用于将引诱剂递送到所述生长基质和/或水中的工具，用于将被所述引诱剂吸引的微生物引导至检测器的工具，和当检测到目的微生物时提供信号的检测器。
术语“生长基质”包括任何其中可以栽种植物的天然和合成基质，并且包括土壤、椰壳纤维、泥炭、沙子和其混合物。
如在本文中所使用的，术语“引诱剂”包括任何激励待检测的微生物生长的物质，所述微生物可以是引起植物疾病或疾病的物种或者损害植物的害虫。所述引诱剂可以是所述生长培养基或者所述生长培养基的组分，并且所述引诱剂将会根据目的微生物来进行选择。在一个实施方案中，所述引诱剂为化学引诱剂，特别是植物病原体化学引诱剂。所述引诱剂可以选自氨基酸或醇类，植物提取物或特殊的植物化合物例如植物激素、植物蛋白质或植物信号传导化合物，糖类，有机酸，酚类，或其他蛋白质例如酪蛋白，果胶，并且这些的任何衍生物也可以用作引诱剂。所述吸引也可以是趋电的或离子的吸引，并且我们已经发现二价金属特别是钙是引诱剂的有用组分。引诱剂的选择将会取决于待检测的微生物，例如引起所述疾病或疾病的生物。在能动的致病孢子的检测中，我们偏爱使用两种或更多种化学引诱剂的混合物，虽然在某些实施方案中，一种化学引诱剂就可以有效地进行使用。
用于将所述微生物引导至所述检测器的引诱剂优选地包含用于所述微生物的生长培养基，其以这样的方式来提供，即不仅激励所述微生物的生长而且将所述微生物引导至所述检测器。例如，本发明可以通过这样的装置来实施，所述装置包含被设计成放置在所述生长基质和/或水之内的中空的探针、管或针，其与容纳所述检测器的隔间相连接。所述中空的探针、管或针的内表面的至少一部分可以涂覆有生长培养基例如琼脂培养基，并且涂层的样式可以是这样的，从而使得它激励所述微生物在培养基上生长时朝着所述检测器隔间移动。
例如，在如此设置所述装置从而使得在使用中所述检测器隔间位于所述中空的探针、管或针的顶端而所述中空的探针、管或针的底端被设置成在所述生长基质和/或水之内的情况下，如果作为在所述中空的探针、管或针的内表面上的垂直条带来提供所述生长培养基，那么它将会激励所述微生物沿着所述条带向上移动并进入所述检测器隔间中。
所采用的生长培养基将会取决于待检测的微生物的性质。在某些情况下，它可以包含或含有用于待检测的微生物的化学引诱剂。所述生长培养基还可以包含可以消灭进入所述检测器且不是待检测的微生物的微生物或减少其数量的成分，例如杀真菌剂或抗细菌试剂。
在本发明中所使用的引诱剂生长培养基将会吸引特定的微生物，其然后将会穿过所述中空的探针、管或针而行进至所述检测器。所述引诱剂为帮助所述微生物生长并且可以具有许多不同组成的生长培养基，取决于正被检测的微生物。合适的生长培养基的例子描述在Jeffers和Martin(Plant Disease,1986,第80卷,第11期)以及Guo和Ko(AppliedEnvironmental Microbiology,1993年7月,第59卷,第7期,第2323-2325页)中。
在一个实施方案中，所述生长培养基包含抗生素和/或营养物。抗生素的存在可以防止不希望的细菌的生长。在另一个实施方案中，所述培养基包含杀虫剂或杀真菌剂，并且抗生素、杀虫剂和/或杀真菌剂的存在允许目的微生物的生长而防止非目的微生物(例如，可能已进入所述装置的中空的探针、管或针中的其他真菌和细菌)的生长。在一个实施方案中，所述生长培养基包含硝基苯或异黄酮类化合物。所述生长培养基可以包含琼脂、营养物、醇类、氨基酸、杀真菌剂、杀虫剂、抗生素、硝基苯、植物提取物和/或异黄酮类化合物的任何组合。
在一个实施方案中，在所述中空的管、探针或针中的生长培养基处于比在所述检测器中的生长培养基低的浓度，这激励所述微生物移动到所述检测器中。另外，所述生长培养基可以包含缓冲液，其维持在所述中空的管、探针或针中的培养基的pH。当生长培养基也存在于所述检测器中时，它也可以包含缓冲液，其可以处于比在所述中空的管、探针或针中的培养基之中的缓冲液低的浓度。在所述检测器中更低的缓冲液浓度意味着，可以改变在所述检测器中的培养基的pH水平。在一个实施方案中，在所述中空的管、探针或针中的生长培养基包含缓冲液，而在所述检测器中的生长培养基不包含缓冲液。在所述检测器中不存在缓冲液意味着，可以改变所述培养基的pH水平。当所述检测工具为pH指示剂时，这些实施方案是特别有用的。本领域技术人员将会能够从商购可得的缓冲液中选择合适的缓冲液。在一个实施方案中，所述缓冲液对于疫霉属的生存来说是最佳的。
本领域技术人员将会能够从商购可得的培养基中选择合适的生长培养基。进一步地，本领域技术人员将会能够由标准文献实验方案来合成合适的培养基。
在一个实施方案中，所述生长培养基为琼脂培养基。
如在一个优选的实施方案中所指出的，所述检测器还包括用于所述微生物的生长培养基，其使得所述生物能够进行增殖以提供足够高的浓度用于检测。增殖所需要的时间根据待检测的生物的性质而变动，但是我们发现，通过使用本发明的技术，可以比用目前存在的技术更快地完成它，并且本发明提供了简单的原位检测装置，其不要求样品操作或有资质的人员用于进行检测。
本发明可应用于任何微生物，包括由引起疾病的生物例如真菌、卵菌和细菌所产生的任何类型的孢子，包括细菌孢子和能动孢子例如游动孢子。游动孢子的检测是本发明的用途的一个实施方案。
在一个实施方案中，本发明可应用于检测任何植物病原体，包括疫霉属的至少一个物种。“疫霉属”包括疫霉属的所有物种。
本发明可以应用于的其他病原体包括Magnaporthe，葡萄孢属(Botrytis)，旋孢腔菌属(Cochiliobolus)，柄锈菌属(Puccinia)，胶锈菌属(Gymnosporangium)，驼孢锈菌属(Hemileia)，和镰孢属(Fusarium)的所有物种。
本发明可以应用于的进一步的致病生物包括：赤霉属(Gibberella)、布氏白粉菌属(Blumeria)、球腔菌属(Mycosphaerella)、刺盘孢属(Colletotrichum)、轴黑粉菌属(Sphacelotheca)、Sporisorium、绿核菌属(Ustilaginoidea)、黑粉菌属(Ustilago)、栅锈菌属(Melampsora)、腐霉属(Pythium)(包括腐霉属的所有物种)、绵霉属(Achyla)、丝囊霉属(Aphanomyces)、白锈属(Albugo)、Wilsoniana、圆梗霉属(Basidiophora)、盘梗霉属(Bremia)、链格孢属(Alternaria)、假无柄盘菌属(Pseudopezicula)、尾孢属(Cercospora)、痂囊腔菌属
Figure GDA0004007739460000081
痂圆孢属(Sphaceloma)、假蜜环菌(Armillariamellea)、Rhizomorpha、双壳属(Diplocarpon)、盘二胞菌属(Marssonia)、白粉菌属(Erysiphe)、单轴霉属(Plasmopara)、球座菌属(Guignardia)、刺盘孢属、小丛壳属(Glomerella)、葡柄霉属(Stemphylium)、格孢腔菌属(Pleospora)、单格孢属(Ulocladium)、葡柄霉属、根串珠霉属(Thielaviopsis)、横节霉属(Chalara)、假尾孢属(Pseudocercospora)、壳球孢属(Macrophomina)、大茎点菌属(Macrophoma)、越桔属(Vaccinium)、棘壳孢属(Pyrenochaeta)、亚隔孢壳属(Didymella)、葡柄霉属、葡萄孢盘菌属(Botryotinia)、灰黄霉属(Fulvia)、菌绒孢属(Mycovellosiella)、枝孢属(Cladosporium)、钉孢霉属(Passalora)、茎点霉属(Phoma)、拟粉孢属(Oidiopsis)、内丝白粉菌属(Leveillula)、旋孢腔菌属(Cochliobolus)、弯孢属(Curvularia)、丝核菌属(Rhizoctonia)、平脐蠕孢属(Bipolaris)、Waitea、亡革菌属(Thanatephorus)、伏革菌属(Corticium)、根霉属(Rhizopus)、壳针孢属(Septoria)、地霉属(Geotrichum)、半乳糖霉属(Galactomyces)、核盘菌属(Sclerotinia)、小核菌属(Sclerotium)、阿太菌属(Athelia)、棒孢属(Corynespora)、轮枝孢属(Verticillium)、枝顶孢属(Acremonium)、头孢属(Cephalosporium)、毛双孢属(Lasiodiplodia)、球二孢属(Botryodiplodia)、节壶菌属(Physoderma)、囊孢壳属(Physalospora)、壳色单隔孢属(Diplodia)、葡萄座腔菌属(Botryosphaeria)、Stenocarpella、指疫霉属(Sclerophthora)、指梗霉属(Sclerospora)、霜指霉属(Peronosclerospora)、黑孢属(Nigrospora)、Khuskia、木霉属(Trichoderma)、肉座菌属(Hypocrea)、黑痣菌属(Phyllachora)、葡萄孢盘菌属、小克银汉霉属(Cunninghamella)、矛束霉属(Doratomyces)、头束霉属(Cephalotrichum)、膝葡孢属(Gonatobotrys)、皮斯霉属(Pithomyces)、帚霉属(Scopulariopsis)、麦角菌属(Claviceps)、疽座孢属(Sphacelia)、叶点霉属(Phyllosticta)、球腔菌属、胶尾孢属(Gloeocercospora)、球梗孢属(Kabatiella)、明脐菌属(Exserohilum)、长蠕孢属(Helminthosporium)、毛球腔菌属(Setosphaeria)、透斑菌属(Hyalothyridium)、壳二胞菌属(Ascochyta)、平脐蠕孢属、附球菌属(Epicoccum)、内脐蠕孢属(Drechslera)、粘束孢属(Graphium)、小球腔菌属(Leptosphaeria)、蛇球壳属(Ophiosphaerella)、Scolecosporiella、Paraphaeosphaeria、茎点霉属、壳针孢属、青霉属(Penicillium)、暗色座腔孢属(Phaeocytostroma)、亚球壳属(Sphaerulina)、Dictochaeta、Microdochium、毛霉属(Mucor)、玛利亚霉属(Mariannaea)、黑团孢属(Periconia)、壳锈菌属(Physopella)、褐孢座壳属(Rhopographus)、穗霉属(Spicaria)、包锈菌属(Angiopsora)、丛赤壳属(Nectria)、拟茎点霉属(Phomopsis)、穗霉属、壳月孢属(Selenophoma)、顶囊壳属(Gaeumannomyces)、漆斑菌属(Myrothecium)、红曲属(Monascus)、拟盘梗霉属(Bremiella)、假霜霉属(Pseudoperonospora)、根生壶菌属(Rhizophydium)、集壶菌属(Synchytrium)、油壶菌属(Olpidium)、异粘孢菌属(Ligniera)、根肿菌属(Plasmidiophora)、多粘霉属(Polymixia)、层盘霉属(Sorodiscus)、球壶菌属(Sorosphaera)、粉痂菌属(Spongospora)、四孢菌属(Tetramyxa)和曲霉属(Aspergillus)。
可以在载体上提供所述引诱剂，其中将所述引诱剂吸附在所述载体上。在一个优选的实施方案中，本发明的装置包括插入到所述生长基质或水中的中空的探针、管或针，并且在半凝胶材料上提供所述引诱剂，通过所述半凝胶材料，所述引诱剂粘附至所述装置的中空的管、探针或针的内部，在其上形成疾病的物种进行移殖建群并向上行进。用于所述引诱剂的载体的进一步的例子包括膜或薄膜，例如聚酰胺或硝酸纤维素膜。所述膜或薄膜可以是带静电的薄膜。可以在中空的管、探针或针的内表面上提供所述膜或薄膜，所述中空的管、探针或针延伸入所述生长基质或水中，并且提供用于所述微生物(通常为引起疾病的生物)的从所述生长基质或水至所述检测器的递送机制。在一个实施方案中，所述引诱剂以这样的方式来进行提供，从而使得所述引诱剂中的至少一些从所述中空的管、探针或针中沥滤出而进入所述生长基质或水中，例如所述引诱剂可以为两种或更多种引诱剂的混合物，每种引诱剂具有不同的溶解度或者与所述生长基质或水的可混溶性。以该方式，可以使一些化学引诱剂沥滤出而进入所述生长基质或水中以吸引引起疾病的生物，而一些将会留在所述中空的管、探针或针中并因此将所述引起疾病的生物引导穿过所述中空的管、探针或针而至所述检测器。
所述引诱剂组合物可以执行三重功能：第一，它将所述微生物吸引到所述装置中；第二，它将所述微生物引导到所述检测器中；和第三，它可以促使所述微生物在朝着所述检测器移动时进行生长。在一个进一步的优选的实施方案中，所述引诱剂组合物可以包含执行第四个功能(即消灭除了待检测的那些之外的其他存在的微生物或减少其数量，并因此限制它们进入所述检测器并削弱其功能的能力)的成分。
在要检测植物病原体并且将植物病原体化学引诱剂用作所述引诱剂时，它典型地将会特异于待检测的引起植物疾病的物种，并且如所描述的，可以使用多于一种引诱剂。所述引诱剂可以特异于一种类型的引起疾病的物种(例如，特定的植物病原体)，或者备选地，所述引诱剂可以吸引多于一种类型的引起植物疾病的微生物。在一个实施方案中，使用特异于几种不同的植物病原体的植物病原体引诱剂。备选地，所使用的不同的植物病原体引诱剂可以特异于不同的植物病原体，即可以如此来选择化学引诱剂的特异性，从而使得它们不重叠。合适的植物病原体化学引诱剂是本领域中已知的。但是，我们已发现，某些引诱剂或者引诱剂的混合物允许病原体的更快速的捕获、引导和检测，并且那些材料的使用是本发明的一个进一步的实施方案。典型地，所使用的每种植物病原体引诱剂特异于相同的植物病原体。
在一个其中所述引诱剂为化学引诱剂的实施方案中，至少一种植物病原体化学引诱剂为用于疫霉属的化学引诱剂。用于樟疫霉的化学引诱剂的例子描述在Cahill和Hardman(Phytopathology,第84卷,第2期,第193-200页)中。在一个实施方案中，至少一种植物病原体引诱剂吸引疫霉属的一个或多个物种。在一些实施方案中，至少一种植物病原体化学引诱剂可以吸引多于一种植物病原体。在一个实施方案中，至少一种植物病原体化学引诱剂吸引疫霉属的一个或多个物种以及一种或多种其他植物病原体。
在一个其中在中空的管、探针或针之内提供所述引诱剂制剂的实施方案中，所述管应当在生长基质和水中是稳固的并且耐腐蚀。塑料探针或管是特别有用的。应当以这样的量提供所述引诱剂，所述量使得如果一些所述引诱剂已从所述管或探针中沥滤出而进入所述生长基质或水中是优选的，那么留在所述管或探针中的引诱剂处于浓度梯度，其中所述引诱剂在接近于所述检测器之处以比在将所述引诱剂引入到所述生长基质或水中的工具的末端处高的浓度存在。换言之，当在使用中时，浓度在将会与所述生长基质或水相接触的递送工具的末端处比在将所述微生物递送至所述检测器的末端处低，并且该浓度梯度可以在最初提供或者它可以在所述检测系统的运转期间原位形成。虽然不是必需的，但是这样的梯度可以帮助促使所述微生物沿所述中空的管、探针或针向上运载到所述检测器中。
在一个优选的实施方案中，在被设计成延伸入有关的生长基质或水中以将所述引诱剂引入到所述生长基质或水中的一个或多个中空的探针、管或针的内表面上提供所述引诱剂。可以通过掺入到凝胶样材料之内来将所述引诱剂附着至所述中空的管、探针或针的内部。所述一个或多个中空的管、探针或针可以被削尖以帮助插入到土壤中，并且可以具有这样的内径，从而使得当所述微生物通过与所述引诱剂相接触而生长时，它可以沿着所述探针、管或针的孔洞向上通过。备选地，所述引诱剂可以通过膜而被保持在所述中空的管、探针或针的内部，所述膜可以将至少一些引诱剂释放到所述生长基质或水中。然后，可以在远离所述生长基质或水的所述中空的探针、管或针的末端处提供所述检测器，从而使得在使用中所述引起疾病的物种穿过所述中空的管、探针或针而进入所述检测器系统中。所述引起疾病的物种被所述引诱剂吸引进入所述中空的管、探针或针中并沿其向上，直至它到达所述检测器系统，当鉴别到特定的微生物时，所述检测器系统将会发出信号。在采用几个中空的探针、管或针时，优选地将它们导引至通入单个检测器中或者它们每一个可以具有其自己的检测器。
所述中空的管、探针或针的大小和形状(包括横截面)可以根据待使用的检测装置所处的位置以及还有待检测的微生物的性质来进行选择。在所述中空的管、探针或针的内表面上的引诱剂涂层的厚度、位置和浓度也将会根据待检测的微生物的性质来进行选择。我们已发现，具有0.5至5cm2的横截面面积的长4至10cm的中空的管、探针或针是特别有用的，并且厚度为0.1至1cm，特别地0.2至0.5cm的引诱剂涂层是非常有效的。
当在生长基质中使用时，所述引诱剂不应当被所述生长基质和其中所包含的材料灭活。它还应当在使用它时所处的特定环境中所经历的温度范围之内是稳定的。当在生长基质中使用时，它应当在所述生长基质中所包含的水分之中具有一些溶解度，并且当在水中使用时，应当对它进行选择以在使用它时所处的条件下具有所需要的在水中的溶解度。在作为在中空的探针、管或针的表面上的涂层来提供所述引诱剂(例如，保持在凝胶中或者吸附在与所述中空的探针、管或针的内表面相附着的载体例如膜或膜薄上)时，它可被释放到所述生长基质或水中以吸引所述微生物，而同时还保留在所述管或探针的内表面上以将所述微生物引导至所述检测器。这可以通过下述方式来实现：作为在所述中空的管、探针或针的内表面上的两个或更多个层里来提供所述引诱剂。但是，重要的是，足够的引诱剂留在所述中空的管、探针或针的内表面上。
我们已发现，氨基酸和/或C1-C4一元醇和其混合物以及二价金属特别是钙是特别有用的引诱剂，并且它们还充当化学引诱剂，特别地用于疫霉属的孢子。我们还已发现，可以将它们方便地提供在膜例如尼龙或硝酸纤维素膜上或者在凝胶例如琼脂中。
在用引起疾病的微生物进行的本发明的运行中，一旦是有活性的，在所述生长基质或水之内的引起疾病的生物就将会被所述引诱剂吸引，并且将会朝着所述引诱剂移动或生长，所述引诱剂以然后朝着所述检测器引导所述微生物(典型地，穿过所述中空的管、探针或针)的方式来提供。以这种方式，所述引起疾病的生物的存在可以在它具有显著的与特定植被的相互作用之前被检测到，从而允许在所述引起疾病的生物引起显著的对于植被的损害之前采取补救行动。
本发明的系统的检测器可以是被设置成用于检测任何特定微生物的隔间。例如，在一个实施方案中，它可以包含被设计成允许所讨论的微生物通过和排除其他材料(也许包括其他微生物)的过滤器系统。备选地，它可以为被规划成选择性地检测某些微生物的装置。在本发明的一个实施方案中，在所述检测器系统中也包括用于引起疾病的生物的引诱剂，以确保所述引起疾病的生物不仅被吸引至所述中空的管、探针或针而且被吸引去沿所述中空的管、探针或针向上流动并进入所述检测系统中。在这种情况下，可以在所述中空的管、探针或针之内以及还在所述检测器隔间之内以逐渐增加的量提供所述引诱剂，以确保朝着所述检测器引导所述生物。
虽然是任选的，但是在一个实施方案中，在本发明中所采用的检测器材料包含过滤器和生长培养基，在所述生长培养基中所述微生物可以进行增殖。所述培养基可以是选择性的，根据待检测的特定微生物。当使用过滤器时，它选择性地允许正被检测的微生物到达在所述检测器之内的生长培养基，并且阻止具有不同形状和大小的物种到达在所述检测器中的培养基。通过与用于特定目的微生物的引诱剂相组合地使用选择性的过滤器，所述装置可以检测目的微生物。具有1至100μm的孔的过滤器已被发现对于疫霉属来说是特别有用的。在其他实施方案中，可以省略过滤器，并且这已被发现在一些情况下使得能够进行更快速的检测。在一个优选的实施方案中，存在通过提供抗生素和抗真菌剂来进行的化学或生物学过滤，优选地将抗生素和抗真菌剂提供在所述管、探针或针的内表面上所提供的引诱剂制剂之内和任选地在所述检测器材料之内。
所述检测系统可以包括使得已被递送至所述检测器的微生物能够进行增殖的生长培养基。合适的生长培养基可以包括抗生素和抗真菌剂，其可以杀死除了待检测的那些之外的其他微生物。所述生长培养基还可以包含至少一种用于所述微生物的引诱剂。所述引诱剂将会吸引特定的微生物，从而使得它们将会行进穿过所述过滤器(如果使用)并进入其中所述引诱剂为化学引诱剂的培养基中，这可以通过趋化性来完成。在一些实施方案中，所述生长培养基可以包含额外的化学引诱剂。所述生长培养基刺激所述微生物的增殖，这有助于检测。取决于正被检测的微生物，所述培养基可以具有许多不同的组成，这将会被本领域技术人员充分地理解。在一个实施方案中，所述培养基对于疫霉属的生存来说是任选的。合适的培养基的例子描述在Jeffers和Martin(Plant Disease,1986,第80卷,第11期)以及Guo和Ko(Applied and Environmental Microbiology,1993年7月,第59卷,第7期,第2323-2325页)中。
在一个实施方案中，所述检测器和所述递送管、探针或针包含相同的引诱剂。在一个优选的实施方案中，所述引诱剂的浓度在所述检测器中比在所述中空的管、探针或针吸引系统中的引诱剂浓度高。这产生了浓度梯度，由此被特异性地吸引向所述引诱剂的微生物将会行进至所述检测系统。
所述检测器可以以任何合适的方式指示所述微生物的存在，例如当检测到特定微生物的存在时，它可以发出可听的和/或可视的信号例如闪烁光。备选地，它可以发出被传送至在远距离位置处的农民或者土地或水拥有者(也许经由无人机或卫星)的信号。作为一个进一步的备选方案，在本发明的一个实施方案中所采用的培养基可以具有在当所选微生物正进行生长时指示变化(例如，pH的变化)的材料并且可以包含在当pH发生变化时经历颜色变化的指示剂。备选地或另外地，可以将pH的变化转换成可以用于远距离感测的信号。
如所描述的，可以通过在与正种植于那里的材料邻近的生长基质或水中放置一个或多个本发明的检测器系统来在农业和园艺学中实施本发明。在例如田地中在所述检测器系统之间的最佳距离将会取决于作物的性质、生长基质的类型、盛行的气候等。这些全都可以通过反复试验来确定，虽然初步结果建议装置组，例如每公顷10至20台装置将会是足够的。在另一个实施方案中，可以在新耕作的生长基质或可用的水系统中采用本发明，以测定它们的关于公众消费或使用和关于在农业和园艺学中进行使用的适合性以及对于添加材料例如肥料、杀虫剂、杀昆虫剂、杀真菌剂等的需要。因此，本发明进一步提供了横跨田地或水系统进行分布的本发明的检测器系统的阵列。
附图说明
图1表示用于检测微生物的系统的结构。
通过参考附图1来图解说明本发明，所述附图1显示了中空的探针或管(1)，其在内部携带用于目的微生物的引诱剂层(2)。所述探针或管向下通入到生长基质或水中，所述生长基质或水的表面显示在(3)处。一些所述引诱剂沥滤出而进入所述生长基质或水中以吸引所述微生物(5)，其被引导进入所述中空的管中，如由箭头所指出的，并且沿着所述管向上，如由箭头(4)所显示的。所述微生物在与所述引诱剂相接触期间进行生长，然后通入到包含过滤器(6)和生长培养基(8)的检测器(7)中。当检测到目的微生物时，所述检测器的内容物改变颜色。
通过参考下面的实施例来举例说明本发明。
用恶疫霉(Phytophthora cactorum)接种在基质生长袋中进行生长的十株草莓植物中的一株草莓植物。将在附图中所显示的装置放置在所述生长袋中以监测从感染位点开始至能够检测到阳性结果的距离。所述装置包含具有0.2cm的含有四种引诱剂、抗真菌剂和抗生素的混合物的琼脂生长培养基的内层涂层，并且所述检测器包含相似的生长培养基以及pH指示剂。在24-48小时后，在所述生长袋之内的所有装置都改变了颜色，这表明该疫霉属物种已经从所述基质沿所述管向上转移并进入所述检测器中。

Claims (18)

1.用于检测在生长基质或水中的微生物的系统，其包含用于将引诱剂递送到所述生长基质或水中的工具，用于将被所述引诱剂吸引的微生物引导至检测器的工具，和当检测到目的微生物时提供信号的检测器，其中所述工具包括适合于延伸入所述生长基质或水中的中空的管或中空的针，其中在所述中空的管或中空的针的内表面上涂覆所述引诱剂，并且其中在远离所述生长基质或水的中空的管或中空的针的末端处提供所述检测器。
2.根据权利要求1的系统，其中所述微生物为引起疾病的微生物。
3.根据权利要求1的系统，其中所述引诱剂包含用于所述微生物的生长培养基。
4.根据权利要求1的系统，其中所述引诱剂选自氨基酸，醇类，植物提取物，植物激素，植物信号传导化合物，糖类，有机酸，酚类，蛋白质，和果胶。
5.根据权利要求4的系统，其中所述蛋白质为植物蛋白质。
6.根据权利要求4的系统，其中所述蛋白质为酪蛋白。
7.根据权利要求1的系统，其采用二价金属作为引诱剂。
8.根据权利要求7的系统，其中所述二价金属为钙。
9.根据权利要求1的系统，其中所述检测器包括使得已被递送至所述检测器的微生物能够进行增殖的生长培养基。
10.根据权利要求9的系统，其中所述生长培养基包括抗生素和抗真菌剂以杀死除了待检测的那些之外的其他微生物。
11.根据权利要求1的系统，其中以这样的量提供所述引诱剂，所述量使得当一些所述引诱剂已从所述中空的管或中空的针中沥滤出而进入所述生长基质或水中时，留在所述中空的管或中空的针上的引诱剂处于浓度梯度，其中所述引诱剂在接近于所述检测器之处以比在将所述引诱剂引入到所述生长基质或水中的中空的管或中空的针的末端处高的浓度存在。
12.根据权利要求1的系统，其中所述检测器包含被设计成允许目的微生物通过和排除其他微生物通过的过滤器系统。
13.根据权利要求1的系统，其中当检测到目的微生物的存在时，所述检测器发出被传送至远距离位置的信号。
14.根据权利要求1-13中任一项的系统在新耕作的生长基质中用于测定它们的关于在农业和园艺学中进行使用的适合性的用途。
15.用于检测在生长基质或水中的微生物的方法，所述检测通过用中空的管或中空的针在所述生长基质或水之内提供用于所述微生物的引诱剂来进行，其中所述引诱剂吸引所述微生物并将它引导至直接提供所述微生物的存在的指示的检测器，其中在远离所述生长基质或水的所述中空的管或中空的针的末端处提供所述检测器，从而使得在使用中所述微生物被引导朝着所述检测器沿着所述中空的管或中空的针向上通过，其中在所述中空的管或中空的针的内表面上涂覆所述引诱剂。
16.根据权利要求15的方法，其中所述微生物为引起疾病的微生物。
17.根据权利要求16的方法，其中所述引起疾病的微生物为致病真菌、卵菌、细菌或害虫。
18.根据权利要求15的方法，其中所述检测器包括一种或多种生长培养基，已被递送至所述检测器的微生物在所述生长培养基中进行增殖；并且所述生长培养基包括抗生素和抗真菌剂。
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