CN114560931B - 抗SARS-CoV-2的中和抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及抗SARS‑CoV‑2的中和抗体及其应用。本发明提供了一种抗SARS‑CoV‑2的中和抗体或其抗原结合片段，其具有包含VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3的重链可变区和包含VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3的轻链可变区，其中VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3分别包含SEQ ID No.3中的第26‑33位、第51‑58位和第97‑111位的氨基酸序列，且VLCDR1、VLCDR2、VLCDR3分别包含SEQ ID No.4中的第27‑32位、第50‑52位和第89‑97位的氨基酸序列。本发明的中和抗体具有高效的中和活性并且可以广谱中和SARS‑CoV‑2的变异株。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及抗新型冠状病毒的中和抗体及其应用。
背景技术
新型冠状病毒(SARS-CoV-2)自2019年底首次报道以来，对公共卫生和社会生活的产生了巨大的挑战和影响。现有的疫苗能有效预防野生型毒株的感染，但是随着SARS-CoV-2全球大流行的持续，不断出现的突变株引起了突破性感染。尤其Omicron突变株(B.1.1.529)在重要靶位的大量突变，极大的降低了免疫血清的中和活性，对疫苗的保护效果构成了威胁。因此，急需高效广谱的预防和治疗手段来控制SARS-CoV-2的流行。抗SARS-CoV-2的广谱中和抗体可阻断病毒感染靶细胞，还可通过其Fc段发挥CDC、ADCC和ADCP等作用清除被感染的细胞。但随着SARS-CoV-2全球大流行的蔓延和持续，不断出现新的突变株对中和抗体的保护效果提出来很大的挑战。研究显示S蛋白417、484和501位氨基酸残基的突变，可以使部分中和抗体的活性显著降低甚至全部耐药。因此需要分选更多的中和抗体来应对已经出现或今后可能会出现的突变毒株。
广谱中和可通过多种途径获得，包括杂交瘤技术、EBV转化、噬菌体展示、流式分选、10X Genomics和beacon以及以上技术的联合使用等。样本也可有多种来源，如免疫后的动物、感染者和疫苗免疫后的志愿者等。其中单个特异性记忆性B细胞的流式分选可以快速且高效的获得与特定病原体靶抗原结合的B细胞，联合分子克隆技术以及高通量的结合和中和实验筛选技术，可在短期内获得大量的天然候选抗体。同时，使用新型冠状病毒疫苗免疫后的健康人群样本进行分选，可避免如感染者样本可能产生的生物安全风险，以及如动物源性的抗体需要进行人源化改造带来的耗时、耗力。总之，从疫苗免疫后的人群中分离抗病毒广谱中和抗体不失为一种安全高效的单克隆抗体制备方法。
发明内容
本申请旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本申请的主要目的在于提供一种高效广谱的抗SARS-CoV-2的中和抗体及其应用。
在一方面，本发明提供了一种抗SARS-CoV-2的中和抗体或其抗原结合片段，所述中和抗体或其抗原结合片段具有包含VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3的重链可变区和包含VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3的轻链可变区，其中VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3分别包含SEQ ID No.3中的第26-33位、第51-58位和第97-111位的氨基酸序列，且VLCDR1、VLCDR2、VLCDR3分别包含SEQ ID No. 4中的第27-32位、第50-52位和第89-97位的氨基酸序列。
在另一方面，本发明提供了一种分离的多核苷酸，该多核苷酸编码根据本发明的抗SARS-CoV-2病毒的中和抗体或其抗原结合片段。
在再一方面，本发明提供了一种重组表达载体，该重组表达载体包含根据本发明的多核苷酸。
在又一方面，本发明提供了一种重组细胞，该重组细胞包含根据本发明的多核苷酸或者包含根据本发明的重组表达载体。
在另一方面，本发明提供了一种制备根据本发明的抗SARS-CoV-2病毒的中和抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括培养根据本发明的重组细胞，并且回收得到所述广谱中和抗体或其抗原结合片段。
在再一方面，本发明提供了一种药物组合物，该药物组合物包含根据本发明的抗SARS-CoV-2病毒的中和抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体。
在又一方面，本发明提供了一种试剂盒，该试剂盒包含根据本发明的抗SARS-CoV-2病毒的中和抗体或其抗原结合片段。
在另一方面，本发明提供了根据本发明的抗SARS-CoV-2病毒的中和抗体或其抗原结合片段、多核苷酸、重组表达载体、重组细胞、或药物组合物在制备预防和/或治疗新型冠状病毒感染的药物中的应用。
在本发明中，通过运用RBD和RBDsa (K417T, E484K, N501Y)蛋白对新型冠状灭活疫苗免疫后的志愿者进行特异性单个记忆B细胞的分选，获得了配对的抗体重链和轻链基因，并筛选得到抗SARS-CoV-2的中和抗体。该抗体具有高效的中和活性并且可以广谱中和SARS-CoV-2的变异株。该中和抗体的发现不仅为SARS-CoV-2感染的预防和治疗提供了备选药物，也为抗病毒感染的单抗药物研发提供了技术参考。
附图说明
图1是28个样本对SARS-CoV-2野生型和不同突变株的中和滴度(ID50)的图。
图2是本申请的实施例中流式细胞分选的结果。依次为，从全部计数中圈出淋巴细胞，从淋巴细胞中圈出单细胞，再次从单细胞中圈出单细胞，从单细胞中圈出CD3-CD8-CD14-DAPI-CD19+的B细胞，从B细胞中圈出CD19+CD27+的记忆性B细胞，最后为记忆性B细胞中圈出RBD+或RBDsa+的B细胞。
图3是本申请的实施例中单个特异性记忆性B细胞的第二轮巢式PCR产物的凝胶电泳结果。从上到下分别为重链可变区IgH、轻链(κ)可变区Igκ和轻链(λ)可变区Igλ的结果。
图4是本申请的实施例中筛选出的抗体序列的参数。其中，A中从左到右依次为重链可变区胚系基因占比、轻链κ链可变区胚系基因占比、轻链λ链可变区胚系基因占比的统计结果；B中从左到右依次为重链CDR3的长度和轻链CDR3的长度统计结果；C为重链可变区和轻链可变区的突变率的统计结果。
图5是本申请的实施例中293T细胞系统中抗体表达的Western印迹结果，上方为重链，下方为轻链。
图6是本申请的实施例中抗体表达上清对不同抗原的结合活性筛选结果。分别是以新型冠状病毒野生型RBD蛋白、野生型spike蛋、Alpha突变株的S1蛋白、Beta突变株的S1蛋白和Delta突变株的S1蛋白作为筛选抗原的结果，横坐标为倒数上清稀释度(reciprocalsupernatants dilutions)，纵坐标为OD值(OD450-OD630)。
图7是本申请的实施例中抗体表达上清的中和活性筛选结果。待测毒株分别为SARS-CoV-2野生型、Alpha突变株、Beta突变株和Delta突变株。
图8是本申请的实施例中抗体6-2C亲和层析纯化后产物的电泳检测结果。
图9是本申请的实施例中抗体6-2C的亲和力检测结果。
图10是本申请的实施例中抗体6-2C的假病毒中和试验结果。
图11为本申请的实施例中抗体6-2C的活病毒中和结果。
具体实施方式
在下文中，将更详细地描述本发明的实施方式以帮助理解本发明。应当理解，对于这些实施方式的描述仅出于说明性目的，而并非意在以任何方式对本发明所要求的保护范围进行限制。
如本发明所用，“抗体”是指能够与特定抗原结合的任何免疫球蛋白、单克隆抗体、多克隆抗体、多价抗体、二价抗体、一价抗体、多特异性抗体或双特异性抗体。完整抗体通常由两对多肽链组成，每对包含一条轻(L)链和一条重(H)链，轻链可以分为Kappa (κ)型或Lambda (λ)型，而根据重链的类型分别为μ、δ、γ、α和ε可以将抗体定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。重链包含重链恒定区(CH)和重链可变区(VH)。不同类型的重链的CH含有3到4个不等的结构域(CH1、CH2、CH3和CH4)。轻链包含轻链恒定区(CL)和轻链可变区(VL)。VH和VL中各自包含具有高度可变性的互补决定区(CDR)以及散布其间的构架区(FR)，各VH和VL由氨基末端至羧基末端包含依次的FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
如本发明所用，“抗原结合片段”是指抗体中保持有特异性结合抗原能力的一个或多个片段，具体而言，包括但不限于Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fv片段、sc-Fv和双体中的至少一种。
如本发明所用，“Fab片段”包含一条轻链以及一条重链的CH1和可变区。Fab分子的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。
如本发明所用，“Fab’片段”含有一条轻链以及一条重链的部分或片段，所述部分或片段含有VH结构域和CH1结构域以及在CH1和CH2结构域之间的区域。
如本发明所用，“F(ab’)2片段”含有两条轻链和两条重链，所述重链含有在CH1和CH2结构域之间的恒定区的一部分，使得在两条重链之间形成链间二硫键。F(ab’)2片段因而由两个Fab’片段组成，而两个Fab’片段通过两条重链之间的二硫键连接在一起。
如本发明所用，“Fv片段”包含来自重链和轻链的可变区，但是缺少恒定区。
如本发明所用，“单链Fv”或“scFv”，是指包含抗体的VH结构域和VL结构域的抗体片段，其中这些结构域以单一多肽链形式存在。通常，Fv多肽还包含VH结构域和VL结构域之间的多肽接头，所述接头使scFv能够形成期望的结构以进行抗原结合。
如本发明所用，“双体”指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，所述片段在同一多肽链中包含重链可变结构域(VH)和与之连接的轻链可变结构域(VL)(VH-VL或VL-VH)。通过使用短得不能让同一链上的两个结构域之间发生配对的接头，各结构域被迫与另一条链的互补结构域发生配对，从而产生两个抗原结合位点。
如本发明所用，“同一性”是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列或核苷酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost、Per residuegap cost和Lambda ratio分别设置为11、1和0.85 (缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(%)。
在一方面，本发明提供了一种抗SARS-CoV-2病毒的中和抗体或其抗原结合片段。所述抗体或其抗原结合片段具有重链可变区和轻链可变区，两者分别由决定簇互补区和框架区组成，其中重链可变区包含决定簇互补区VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，轻链可变区包含决定簇互补区VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3。在根据本发明的中和抗体或其抗原结合片段中，VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3分别包含SEQ ID No. 3中的第26-33位、第51-58位和第97-111位的氨基酸序列，且VLCDR1、VLCDR2、VLCDR3分别包含SEQ ID No. 4中的第27-32位、第50-52位和第89-97位的氨基酸序列。优选地，VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3的氨基酸序列分别是SEQ IDNo. 3中的第26-33位、第51-58位和第97-111位的氨基酸序列，且VLCDR1、VLCDR2、VLCDR3的氨基酸序列分别是SEQ ID No. 4中的第27-32位、第50-52位和第89-97位的氨基酸序列。
根据本发明的特定实施方式，所述中和抗体或其抗原结合片段选自Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、双体、单链抗体、融合抗体和完整抗体。
在另一方面，本发明提供了一种分离的多核苷酸，该多核苷酸编码根据本发明的抗SARS-CoV-2病毒的中和抗体或其抗原结合片段。
根据本发明的特定实施方式，本发明的多核苷酸的多核苷酸序列包含：
包含SEQ ID No. 1中的第76-99位的序列的编码VHCDR1的核苷酸序列；
包含SEQ ID No. 1中的第151-174位的序列的编码VHCDR2的核苷酸序列；
包含SEQ ID No. 1中的第289-333位的序列的编码VHCDR3的核苷酸序列；
包含SEQ ID No. 2中的第79-96位的序列的编码VLCDR1的核苷酸序列；
包含SEQ ID No. 2中的第148-156位的序列的编码VLCDR2的核苷酸序列；和
包含SEQ ID No. 2中的第265-291位的序列的编码VLCDR3的核苷酸序列。
根据本发明的特定实施方式，本发明的多核苷酸的序列与上述多核苷酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的同一性。
根据本发明的一个具体实施方式，本发明的多核苷酸的序列包含：
编码所述VHCDR1的核苷酸序列，其具有与SEQ ID No. 1中的第76-99位的序列的同一性为90%以上的序列；
编码所述VHCDR2的核苷酸序列，其具有与SEQ ID No. 1中的第151-174位的序列的同一性为90%以上的序列；
编码所述VHCDR3的核苷酸序列，其具有与SEQ ID No. 1中的第289-333位的序列的同一性为90%以上的序列；
编码所述VLCDR1的核苷酸序列，其具有与SEQ ID No. 2中的第79-96位的序列的同一性为90%以上的序列；
编码所述VLCDR2的核苷酸序列，其具有与SEQ ID No. 2中的第148-156位的序列的同一性为90%以上的序列；和
编码所述VLCDR3的核苷酸序列，其具有与SEQ ID No. 2中的第265-291位的序列的同一性为90%以上的序列。
在再一方面，本发明提供了一种重组表达载体，该重组表达载体包含根据本发明的多核苷酸。
如本发明所用，“表达载体”是指通过转化、转导、转染等方式导入宿主细胞后，插入的多核苷酸所编码的蛋白能够表达的核酸运载工具。表达载体包括但不限于质粒、噬菌体、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒等。可以理解的是，在载体还可以含有控制表达的元件如启动子序列、转录起始序列、增强子序列、报告基因。
在又一方面，本发明提供了一种重组细胞，该重组细胞包含根据本发明的多核苷酸或者包含根据本发明的重组表达载体。
在另一方面，本发明提供了一种制备根据本发明的抗SARS-CoV-2病毒的中和抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括培养根据本发明的重组细胞，并且回收得到所述广谱中和抗体或其抗原结合片段。优选地，所述药学上可接受的载体包括但不限于液相载体、固相载体等成分，例如溶剂、悬浮剂、分散剂、稀释剂、赋形剂等。
在再一方面，本发明提供了一种药物组合物，该药物组合物包含根据本发明的抗SARS-CoV-2病毒的中和抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体。
在又一方面，本发明提供了一种试剂盒，该试剂盒包含根据本发明的抗SARS-CoV-2病毒的中和抗体或其抗原结合片段。
在另一方面，本发明提供了根据本发明的抗SARS-CoV-2病毒的中和抗体或其抗原结合片段、多核苷酸、重组表达载体、重组细胞、或药物组合物在制备预防和/或治疗新型冠状病毒感染的药物中的应用。
在本发明中，通过运用RBD和RBDsa (K417T, E484K, N501Y)蛋白对新型冠状灭活疫苗免疫后的志愿者进行特异性单个记忆B细胞的分选，获得了配对的抗体重链和轻链基因，并筛选得到抗SARS-CoV-2的中和抗体。该抗体具有高效的中和活性并且可以广谱中和SARS-CoV-2的变异株。该中和抗体的发现不仅为SARS-CoV-2感染的预防和治疗提供了备选药物，也为抗病毒感染的单抗药物研发提供了技术参考。
在下文中，将通过实施例更详细地说明本发明。然而，提供以下实施例仅出于说明性目的，而非意在限制本发明的保护范围。本领域技术人员可以在不脱离本发明的范围和精神的情况下可以进行各种修改和变化，并且所述修改和变化也落在本发明的范围之内。
实施例
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
SARS-CoV-2 野生型以及突变株(Alpha, Beta v1, Beta v2, Beta v3, Gamma,Delta, Lambda, Kappa, Epsilon, Zeta, Eta, Iota v1, Iota v2, Mu, Omicron BA.1和Omicron BA.2)假病毒：参考以下文献自制得到：
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SARS-CoV-2活病毒(WIV04)：野生型 (IME-BJ01 strain, Genbank No.MT291831)；Beta (CSTR: 16698.06.NPRC2.062100001); Delta(CSTR.16698.06.NPRC6.CCPM-B-V-049-2105-6) , Omicron (SARS-CoV-2strainOmicronCoV/human/CHN_CVRI-01/2022)。
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HeLa-hACE2：由清华大学丁强教授馈赠，记载于PLoS Pathog. 2021 Nov 8;17(11):e1010053。
Vero细胞：(ATCC:CCL81)
Bright-LiteTM检测试剂：Vazyme, DD1204。
RPMI 1640培养基：Thermo, C22400500BT(+10%FBS)。
细胞染色缓冲液：PBS (biosharp) + 2%FBS。
生物素化SARS-CoV-2 RBD：Acrobiosystems, SPD-C82E9。
生物素化RBDsa蛋白：Acrobiosystems, SPD-C82E7。
新型冠状病毒野生型RBD蛋白：Acrobiosystems, SPD-C52H1。
新型冠状病毒野生型spike蛋白：Acrobiosystems, SPN-C52H9。
新型冠状病毒Alpha突变株的S1蛋白：Sino Biological，40591-V08H12。
新型冠状病毒Beta突变株的S1蛋白：Sino Biological，40591-V08H15。
新型冠状病毒Delta突变株的S1蛋白：Acrobiosystems, S1N-C52Hu。
荧光素标记的抗体：CD3-Pacific Blue (Biolegend, 300431), CD8a-PacificBlue (Biolegend, 301023), CD14-Pacific Blue (Biolegend, 325616), CD19-FITC(Biolegend, 302206 ), CD27-PerCP-Cy5.5 (Biolegend, 356408), PE 链霉亲和素(Biolegend, 405203), APC 链霉亲和素(Biolegend, 405207)
裂解液：0.5×PBS, 10 mM DTT (Invitrogen, 18064022), 10 U RNA酶抑制剂(NEB, M0307L)。
重链和轻链的表达载体CMV：由清华大学张林琦教授实验室馈赠，记载于Nature.2020 Aug;584 (7819):115-119。
实施例1. 抗SARS-CoV-2中和抗体的筛选
(一)、血浆中和活性检测
1. 样本：新型冠状灭活疫苗(BBIBP-CorV)免疫两次后的志愿者的血浆。
2. 中和活性检测：检测28个样本对SARS-CoV-2 野生型以及突变株(Alpha, Betav1, Beta v2, Beta v3, Gamma, Delta, Lambda, Kappa, Epsilon, Zeta)假病毒的中和滴度。方法如下：
(1)血浆样本(命名为1号-28号血浆)在56℃热灭活30 min，短暂离心去除不溶物。
(2)在96孔细胞培养板中，细胞对照(第1列)加150 µl GM (DEME+10%FBS+1%双抗)，其余各孔加100 µl GM，另加30µl GM到3A-3H和8A-8H (1-12为第1-12列，A-H为第A-H行，例如，3A即为96孔板中第3列第A行的处理孔)。
(3)取22.5 µl 1号血浆加入3A-3B，2号血浆加入3C-3D，依次，即血浆初始稀释度为1:10。
(4)充分混匀血浆样本，取50 µl移入后一列的处理孔，依次3倍系列稀释直至第7列或第12列。
(5)解冻SARS-CoV-2假病毒，用GM稀释至4000 TCID50/ml ，取50 µl (200 TCID50)加入第2-12列。
(6) 37℃孵育1 h。
(7)消化HeLa-hACE2细胞，用GM重悬，细胞浓度为1.3×105个/ml。
(8)取100 µl 步骤(7)获得的HeLa-hACE2细胞悬液(即每1.3×104个细胞)加到细胞板每个处理孔中。
(9)将细胞板放置在温度为37℃，CO2浓度为5%的培养箱培养48 h。
(10)读数：48 h后弃去细胞培养液，用200 μl PBS清洗一次，拍干；每孔加100 μlBright-LiteTM检测试剂，室温放置2 min后，用酶标仪读板。
(11)计算血浆的中和滴度(ID50)，血浆各稀释度的病毒抑制比例(%)=(V-T)/(V-C), T为血浆样本的酶标仪读数，C为细胞对照的酶标仪读数，V为病毒对照的酶标仪读数；通过GraphPad Prism的log(抑制剂) vs. 响应（可变斜率）计算ID50。
结果分析：经过活性筛选，中和滴度(ID50)的几何平均值(GMT)大于30，并且中和(滴度大于检测下限(10)即认为有中和)一半以上毒株(> 5个)的样本为7个，分别为1、2、3、4、11、17、25号血浆可以作为中和抗体分选的候选样本，具体参见图1，ID50为50%抑制稀释度，GMT为几何平均滴度。
(二)、SARS-CoV-2特异性单个记忆B细胞的分选
(1) PBMC复苏：将冻存的上述步骤(一)获得的候选样本的PBMC (约1×107个)在37℃水浴中迅速复苏，并用10 ml 37˚C预热的RPMI 1640培养基(+10%FBS)重悬，400×g离心5 min。
(2)标记：弃去培养基，将细胞用 10 ml 预冷的细胞染色缓冲液重悬，400×g离心5 min，弃上清，100 µl细胞染色缓冲液重悬细胞；取0.2 µg SARS-CoV-2 RBD或RBDsa蛋白加入细胞，充分混匀后4℃孵育1 h；2 ml预冷的细胞染色缓冲液洗两次，95 µl 细胞染色缓冲液重悬细胞；将荧光素标记的抗体(CD3-Pacific Blue, CD8a-Pacific Blue, CD14-Pacific Blue, CD19-FITC, CD27-PerCP-Cy5.5, PE 链霉亲和素, APC 链霉亲和素)混合加入细胞悬液中，4℃孵育30 min；2 ml预冷的细胞染色缓冲液洗两次，500 µl 细胞染色缓冲液重悬获得标记的PBMC。
(3)分选：将标记的PBMC在Sony MA900 Cell Sorter 流式细胞仪上进行分析和分选，分选出CD3−CD8−CD14−CD19+CD27+RBD+/RBDsa+B细胞(见图2)，即为抗原特异性的记忆性B细胞，每个样本获得3-15个细胞。抗原特异性的记忆性B细胞以单个分入含有4 µl 裂解液(0.5×PBS, 10 mM DTT，10 U RNA酶抑制剂)的96孔PCR 板中。
(4)冻存：迅速置于干冰中，直接用于逆转录或移至-80˚C冰箱冻存。
(三)、单个B细胞基因克隆
1. 逆转录
将上述冻存的抗原特异性的记忆性B细胞解冻后，按照High Capacity cDNA逆转录试剂盒(Thermo，4368813)的说明，加入试剂进行逆转录，步骤如下：
(1)每孔加入
2 μl 10X随机六聚体,
0.8 μl 25X dNTP混合物，各为10mM,
1 μl 10% v/v Igepal CA-630 (Sigma)
8.95 μl 无核酸酶H2O
(2) 65℃加热5 min，冰上放置至少2 min。
(3)加2 μl 10X RT缓冲液，0.25 μl RNA酶抑制剂(40 U/μl)和1 μl MultiScribe™ 逆转录酶。
(4)反应条件：25℃ 10 min, 37℃ 120 min，然后 85℃灭活5 min。
2. 巢氏PCR
第一轮PCR模板(Template)采用上述步骤1逆转录获得的cDNA，第二轮PCR模板采用第一轮PCR产物。
(1)重链可变区巢氏PCR
引物如表1所示。
抗体重链基因的第一轮巢式PCR反应体系为：PrimerSTAR Max Premix(2×) 10 μl；引物混合物：5′引物 0.6 μl；3′ Cγ CH1 0.6 μl；模板5 μl；灭菌蒸馏水3.8 μl；总体积20 μl。
PCR反应条件：预变性 98℃ 2 min；98℃ 10 s，56℃ 5 s，72℃ 10 s，35个循环；终延伸72℃ 5 min。
抗体的重链基因第二轮巢式PCR反应体系为：PrimerSTAR Max Premix (2×) 10μl；引物混合物：5′引物0.6 μl；引物混合物：3′引物0.6 μl；模板2 μl；灭菌蒸馏水6.8 μl；总体积20 μl。
PCR反应条件：预变性 98℃ 2 min；98℃ 10 s，58℃ 5 s，72℃ 10 s，35个循环；延伸72℃ 5 min。
(2)轻链(kappa)可变区巢氏PCR
引物如表2所示。
抗体轻链(kappa)基因第一轮巢式PCR反应体系为：PrimerSTAR Max Premix(2×)10 μl；引物混合物：5′引物0.6 μl；3′ Cκ 5430.6 μl；模板5 μl；灭菌蒸馏水3.8 μl；总体积 20 μl。
PCR反应条件：预变性 98℃ 2 min；98℃ 10 s，56℃ 5 s，72℃ 10 s，35个循环；终延伸72℃ 5 min。
抗体的轻链(kappa)基因第二轮巢式PCR反应体系为：PrimerSTAR Max Premix(2×)10 μl；引物混合物：5′引物0.6 μl；引物混合物：3′引物 0.6 μl；模板2 μl；灭菌蒸馏水6.8 μl；总体积 20 μl。
PCR反应条件：预变性 98℃ 2 min；98℃ 10 s，58℃ 5 s，72℃ 10 s，35个循环；延伸72℃ 5 min。
(3)轻链(Lambda)可变区巢式PCR
引物如表3所示。
抗体的轻链Lambda基因第一轮巢式PCR反应体系为：PrimerSTAR Max Premix(2×)10 μl；引物混合物：5′引物0.6 μl；3′ Cλ 0.6 μl；模板5 μl；灭菌蒸馏水3.8 μl；总体积20 μl。
PCR反应条件：预变性 98℃ 2 min；98℃ 10 s，58℃ 5 s，72℃ 10 s，35个循环；终延伸72℃ 5 min。
抗体的轻链(Lambda)基因第二轮巢式PCR反应体系为：PrimerSTAR Max Premix(2×)10 μl；引物混合物：5′引物0.6 μl；3′C l0.6 μl；模板2 μl；灭菌蒸馏水6.8 μl；总体积20 μl。
PCR反应条件：预变性 98℃ 2 min；98℃ 10 s，60℃ 5 s，72℃ 10 s，35个循环；延伸72℃ 5 min。
结果分析：使用1%琼脂糖凝胶电泳对最后一轮的PCR产物进行检测(电泳结果见图3)，其中，每一列电泳结果为同一个记忆性B细胞进行重链可变区巢氏PCR和轻链可变区巢氏PCR的PCR产物电泳结果，并对大小在300bp-400bp处有阳性片段且重链和轻链配对(即重链可变区巢氏和轻链可变区巢氏PCR产物电泳均有300bp-400bp阳性片段)的PCR产物进行胶回收。
3. PCR产物胶回收纯化
采用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根，DP209)进行PCR产物胶回收纯化。
具体方法如下。
(1)柱平衡步骤：向吸附柱CB2中(吸附柱放入收集管中)加入500 μl平衡液BL，12,000 rpm离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
(2)将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下放入干净的离心管中，称取重量。
(3)向胶块中加入等倍体积溶液PC(如果凝胶重为0.1 g，其体积可视为100 µl，则加入100 µl PC溶液)，50℃ 水浴放置10 min左右，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。
(4)将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB2中(吸附柱放入收集管中)，12,000 rpm离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。
(5)向吸附柱CB2中加入600 μl漂洗液PW(已加入无水乙醇)，12,000 rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中；重复操作步骤。
(6)将吸附柱CB2放入收集管中， 12,000 rpm离心2 min，尽量除去漂洗液。 将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底晾干。
(7)将吸附柱CB2放入一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量预热的纯水，室温放置2 min。12,000 rpm离心2 min，收集DNA溶液；将收集DNA溶液滴加在吸附膜中上，室温放置2 min；12,000 rpm离心2 min，再次收集DNA溶液以提高DNA的回收量。
纯化的DNA片段浓度使用Nanodrop测定其浓度。
(四)、可变区基因连接载体
将重链和轻链的表达载体CMV分别用限制性内切酶双酶切获得酶切产物，反应体系如下：
反应条件：37℃反应20min。
酶切结束后进行琼脂糖凝胶电泳和胶回收纯化，方法同上。
将重链和轻链的PCR胶回收产物分别与双酶切的表达载体进行同源重组获得连接产物，反应体系如下：
分别混匀上述反应液，50℃连接反应20 min获得CMV-H、CMV-k和CMV-λ连接产物。
3. 连接产物转化感受态细胞DH5α
(1)在冰浴上融化感受态细胞DH5α (100 μl)，分别加入CMV-H、CMV-k或CMV-λ连接产物(10 μl)，轻轻混匀，冰上静置30 min。
(2)放入温度为42℃的水浴中热激45 s，迅速转移至冰浴中，静置2 min。
(3)向离心管中加入500 μl不含抗生素的无菌培养基LB，混匀后在温度为37℃、转速为180 rmp的摇床中复苏1 h。
(4)将复苏的菌液均匀涂布到含氨苄霉素的LB培养基上，待菌液吸收后，将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。
4. 接种
挑取上述LB平板中生长的单个菌落，加入至3 ml氨苄抗性的液体LB培养基中，在温度为37℃转速为220 rmp的摇床中培养6 h-7 h。每个平板挑取2个菌落。
5. 阳性克隆的鉴定
将菌液送生物技术公司进行测序鉴定。将测序获得的序列进行Ig BLAST比对分析，筛选出成功配对的抗体序列。成功配对的标准具体为：1)抗体序列具有CDR区域；2)抗体序列不含有终止子；3)抗体序列在阅读框内。
结果如图4所示，获得116对抗体序列。图中A依次为重链可变区胚系基因占比统计，轻链kappa链可变区胚系基因占比统计，轻链lambda链可变区胚系基因占比统计；图中B依次为重链互补决定区的长度和轻链互补决定区的长度统计，图中C为重链可变区和轻链可变区的突变统计。重链可变区分别来自26个不同的胚系基因，IGHV3-30, IGHV4-39和IGHV3-53占比最高；与胚系基因相比，重链可变区的突变频率在0%-13.7%之间；互补决定区(CDR) CDR3 loop的长度分析显示，重链可变区有11 aa-25 aa。轻链以kappa链居多，为76个，lambda链为40个，V基因序列以IGKV1-16、IGKV1-39和IGLV2-14、IGLV3-21为主；与胚系基因相比，轻链可变区的突变频率在0 %-9.5%之间；互补决定区(CDR) CDR3 loop的长度分析显示，轻链可变区有5 aa-20 aa。
其中，成功配对的抗体6-2C序列具体如下。
中和抗体6-2C的重链可变区编码基因序列如SEQ ID No.1所示，其中，第76-99位为CDR1编码序列，第151-174位为CDR2编码序列，第289-333位为CDR3编码序列，表达的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，其中，第26-33位为CDR1序列，第51-58位为CDR2序列，第97-111位为CDR3序列。
中和抗体6-2C的轻链可变区编码基因序列如SEQ ID No.2所示，其中，第79-96位为CDR1编码序列，第148-156位为CDR2编码序列，第265-291位为CDR3编码序列，表达的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID No. 4所示，其中，第27-32位为CDR1序列，第50-52位为CDR2序列，第89-97位为CDR3序列。
上述抗体序列的DNA片段也可通过人工合成制备。
实施例2. 中和抗体的制备
（一）、抗体活性初筛
1. 293T细胞系统的抗体表达
将成功配对的抗体重链和轻链基因表达载体瞬时转染293T细胞：
（1） 转染前24 h在12孔板中，每孔铺 5×105个293T细胞。
（2） 转染当天观察细胞的汇合程度，以70%-80%为宜。
（3） 各取1 μg通过质粒小提试剂盒（天根，DP103）提取的质粒DNA用60 μl Opti-MEM培养基稀释。
（4） 取4 μl Lipofectamine® 2000 Reagent用60 μl Opti-MEM培养基稀释。
（5） 将上述稀释的DNA和Lipofectamine® 2000以1:1体积混合获得混合液，室温孵育5 min。
（6） 取120 μl混合液轻轻加入293T细胞中，5% CO2 37℃培养。
（7） 培养48 h后，收集细胞和上清，12,000 rmp离心2 min，收集细胞培养上清和细胞沉淀，细胞培养上清在-20℃保存。取1 ml预冷的PBS加入装有细胞沉淀的离心管中，吹打混匀细胞沉淀，12,000 rmp离心2 min，弃上清，洗涤两次，再加入100 μl细胞裂解液(Promega，E1531)，冰浴10 min，12,000 rmp离心5 min，收获上清。将细胞培养上清及裂解沉淀后收获的上清分别进行Western印迹（使用抗体为辣根酶标记山羊抗人IgG (H+L)，ZSGB-BIO, ZB-2304）检测。
部分结果如图5所示，多数抗体都能表达且分泌到细胞上清中。
2. 抗体结合活性初筛
（1） 包被：将新型冠状病毒野生型RBD蛋白、野生型spike蛋白、Alpha突变株的S1蛋白、Beta突变株的S1蛋白和Delta突变株的S1蛋白用PBS稀释为0.5 µg/ml，分别在96孔ELISA板中加入100 µl/孔，4℃包被过夜。
（2） 封闭：弃去包被液，每孔加入200 µl 封闭液（PBST+3%BSA）， 37℃封闭1h。
（3） 洗涤：弃去封闭液，用PBST洗涤3次。
（4） 样品：将前述抗体的表达上清样本2倍和10倍稀释，100 μl/孔分别加至完成步骤（3）的96孔ELISA板，此外等量阴性对照（未转染的293T细胞上清）分别加至完成步骤（3）的96孔ELISA板，37℃孵育2 h。
（5） 洗涤：弃去样品，用PBST洗涤5次。
（6） 二抗：将羊抗人IgG抗体用稀释液(PBST+1%BSA) 1:50000稀释，每孔加100 µl，37℃孵育30 min。
（7） 洗涤：弃去样品，用PBST洗涤5次。
（8） 显色：每孔加显色液100 µl，室温避光孵育15 min。
（9） 终止：每孔加50 µl终止液。
（10）读数：用酶标仪读取450 nm和630 nm出的吸光度，结果为450 nm读数值减去630 nm读数值。
（11）结果分析：2倍稀释的数值大于阴性对照数值的2.5倍且大于0.1判断为有结合活性，可结合五种抗原之一或以上的样品即为有结合活性的样本（参见图6）。 结果表明，有20个抗体表达上清具有结合活性。
3. 抗体中和活性初筛
（1） 将具有结合活性的抗体进行中和活性的初筛。
（2） 在96孔细胞培养板中，细胞对照（第1列）加150 µl GM (DMEM+10%FBS +1%双抗)，样品起始稀释孔（第3列以及第8列）加130 µl GM，其余各孔加100 µl GM。
（3） 在样品起始稀释孔加入22.5 µl抗体表达上清，充分混匀，取50 µl移入后一列处理孔，起始稀释度为10，依次系列3倍稀释。
（4） 解冻新型冠状病毒假病毒（SARS-CoV-2 野生型、Alpha、Beta、Delta假病毒），用GM稀释至4000 TCID50/ml ，取50 µl (200 TCID50) 加入2-12列。
（5） 37℃孵育1 h。
（6） 消化HeLa-hACE2细胞，用GM重悬，细胞浓度为1.3×105个/ml。
（7） 取100 µl细胞悬液（即每1.3×104个细胞）加到细胞板中，37℃ 5%CO2培养48h。
（8） 读数：48 h后弃去细胞培养液，用200 μl PBS清洗一次，拍干；每孔加100 μlBright-LiteTM检测试剂，室温放置2 min后，用酶标仪读板。
（9） 计算抗体的50%抑制滴度(ID50)：抑制率（即中和百分比）=(V-T)/(V-C) ×100%，T为待测抗体的酶标仪读数，C为细胞对照的酶标仪读数，V为病毒对照的酶标仪读数；通过GraphPad Prism的log(抑制剂) vs. 响应（可变斜率）计算ID50。
（10）结果分析：起始稀释度时，对病毒的抑制率大于50%即认为有中和。其中6-2C可中和4个待测假毒株（见图7）。
（二）、抗体大量表达和纯化
1. 293F细胞系统的抗体表达
（1） 转染前一天，将处在对数生长期且活率高于90%的293F细胞以1.5×106 个/ml的密度接种到新鲜培养基中,置于37℃，5% CO2，150 rmp转速的恒温摇床中培养（125 ml摇瓶）。
（2） 转染当天，取样计数细胞密度和活率。细胞密度为2×106至3×106个/ml，活率高于90%。调整细胞密度至2×106个/ml，每瓶细胞液体积为 30 ml。
（3） 转染液的配制：用150mM的NaCl溶液稀释60µg 用无内毒素质粒大提试剂盒（天根，DP117-T）提取的DNA（重链和轻链摩尔比1：1）至总体积为0.75ml，温和混匀；用150mM的NaCl稀释120 µl Sinofection转染试剂至总体积为0.75 ml，温和混匀；将稀释好的DNA和转染试剂同时单独静置约5min后温和混匀，总体积1.5 ml，之后室温静置10min获得转染液。
（4） 将转染液逐滴加入到步骤（2）获得的细胞液中，滴加的同时轻轻摇动培养瓶，摇匀后放回摇床继续培养。
（5） 在转染后第 24 h加入体积百分比2% SMS 293-SUPI加料液(SinoBiological, M293-SUPI)，此后每隔 48 h添加一次加料液（体积百分比2%），在转染后5天收样。
2. 亲和层析纯化抗体
（1） 缓冲液的准备：所用水和缓冲液用0.45 μm滤膜过滤，结合/洗杂缓冲液(0.15M NaCl，20 mM Na2HPO4，pH 7.0)，洗脱缓冲液（0.1 M甘氨酸，pH 3.0），中和液（1 M Tris-HCl，pH 8.5）。
（2） 样品准备：细胞上清用0.45 μm 滤膜过滤，减少杂质，提高蛋白纯化效率和防止堵塞柱子。
（3） 样品纯化
1) 将rProtein G Beads(Solarbio，R8300)与“（一）、不同细胞系的抗体表达”获得的细胞上清混合，在摇床上缓慢摇动孵育2h。
2) 在层析柱中装入适量rProtein G Beads，层析用5倍柱体积的结合缓冲液进行平衡。
3) 将孵育好的细胞上清加到平衡好的rProtein G Beads中，收集流出液；将流出液加回层析柱中，收集流出液。
4) 用10倍柱体积的洗杂缓冲液进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白。
5) 使用10倍柱体积的洗脱缓冲液，收集洗脱液，即目的蛋白组分。
6) 依次使用3倍柱体积的结合缓冲液和5倍柱体积的去离子水平衡填料，最后再用5倍柱体积的20%的乙醇平衡，然后保存在等体积的20%的乙醇中，置于4℃保存。
7) 使用BCA法对纯化抗体进行蛋白定量。定量结果显示，纯化抗体的浓度为1mg/ml至2mg/ml。抗体6-2C的浓度为1.98 mg/ml。
8) 采用SDS-PAGE对纯化抗体进行电泳检测，6-2C结果见图8中所示，SDS-PAGE显示，亲和层析后的蛋白纯度较高，提示该目标抗体可用于体外活性分析。
实施例3. 抗体6-2C亲和力和中和活性分析
采用实施例2制备出的中和抗体6-2C进行如下实验。
(一)、中和抗体的亲和力分析
1. BLI检测中和抗体6-2C与SARS-CoV-2 RBD的结合能力
(1)配体偶联：在高通量分子间相互作用仪Octet RED 384，将生物素标记的10µg/ml RBD蛋白(Acrobiosystems, SPD-C82E9)偶联到SA传感器(SARTORIUS, 18-0009)上。
(2)将抗体6-2C用PBS以320 nM起2倍系列稀释6个梯度。
(3)按如下表4设置从低浓度到高浓度进样分析。
(4)数据分析：在分析软件中进行如下表5设置，并进行曲线拟合。
2. 结果分析：6-2C与野生型RBD的亲和力Kd为7.67 nM (见图9)。图为6-2C在不同浓度时与野生型RBD蛋白的结合与解离曲线。
(二)、中和抗体的中和活性分析
1. 中和试验检测中和抗体的中和活性
(1)在96孔细胞培养板中，细胞对照(第1列)加150 µl GM (DMEM+10%FBS +1%双抗)，其余各孔加100 µl GM。
(2) 3A-3H和8A-8H中加入抗体(即①号抗体加入3A-B，②号抗体加入3C-D，依次)，抗体初始浓度为10 µg/ml，补加GM使总体积为150 µl。
(3)充分混匀抗体，取50 µl移入后一列处理孔，依次3倍系列稀释。
(4)解冻SARS-CoV-2假病毒，用GM稀释至4000 TCID50/ml ，取50 µl (200 TCID50)加入2-12列。
(5) 37℃孵育1 h。
(6)消化HeLa-hACE2细胞，用GM重悬，细胞浓度为1.3×105个/ml。
(7)取100 µl细胞悬液(即每1.3×104个细胞)加到细胞板中，37℃ 5%CO2培养48h。
(8)读数：48 h后弃去细胞培养液，用200 μl PBS清洗一次，拍干；每孔加100μlBright-LiteTM检测试剂，室温放置2 min后，用酶标仪读板。
(9)计算抗体的50%抑制浓度(IC50)：抑制率=(V-T)/(V-C)，T为待测抗体的酶标仪读数，C为细胞对照亲和力，V为病毒对照亲和力；通过GraphPad Prism的log(抑制剂) vs.响应（可变斜率）计算IC50。
2. 结果分析：如图10所示，6-2C高效中和SARS-CoV-2的野生型毒株以及13个突变株，IC50均小于1 µg/ml (见表6)。
实施例4. 中和抗体6-2C用于抑制SARS-CoV-2感染
采用实施例2制备出的中和抗体6-2C进行如下实验。
1. 病毒抑制实验
(1)细胞准备：实验前一天，将Vero细胞以5×103/孔接种到96孔板中。
(2)将50 µl (100 TCID50) SARS-CoV-2 野生型 (IME-BJ01株, Genbank No.MT291831)、Beta (CSTR: 16698.06.NPRC2.062100001)、Delta (CSTR.16698.06.NPRC6.CCPM-B-V-049-2105-6) 或Omicron (SARS-CoV-2 strain Omicron CoV/human/CHN_CVRI-01/2022)活病毒与等体积不同浓度(2 µg/ml, 1 µg/ml, 0.5 µg/ml, 0.25 µg/ml, 0.125µg/ml, 0.0625 µg/ml, 0.03125 µg/ml, 0.015625 µg/ml)的实施例2单抗6-2C在37℃孵育1 h。每个稀释度设置三个复孔。细胞对照为培养基，病毒对照为100 TCID50 SARS-CoV-2活病毒。
(3)将步骤(2)的病毒和抗体的混合液分别加入至步骤(1)的Vero细胞中，37℃孵育3天。
(4)通过显微镜观察细胞病变效应，并对病变程度进行评分（-到+++）（具体参见文献Nature. 2020 Aug;584(7821):450-456）。
(5)将病变评分转换成抑制百分比，通过GraphPad Prism的log(抑制剂) vs. 响应（可变斜率）计算IC50。
如图11所示，从结果可知，单抗6-2C对SARS-CoV-2活毒株也有很好的中和活性，对WT、Beta、Delta和Omicron BA.1的IC50值分别为 0.049 µg/ml、0.042 µg/ml、0.076 µg/ml和0.566 µg/ml。
以上结合实施例对本申请作了详细说明，但是本申请不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本申请宗旨的前提下作出各种修改和变化。此外，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
序列表
抗SARS-CoV-2中和抗体6-2C重链可变区的FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4核苷酸编码序列(SEQ ID No. 1)：
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGCAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCATCCTCTGGATTCACCTTCAGTACCTATCATATGCACTGGGTCCGCCAGCCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCATTTATCTCATATGATGGAAGTAATTATTACTACTCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGGTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTCTTTATTATTGTGCGAGAGATAGCAGTGGCTGGCACTGGGGGGTCCCCTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
抗SARS-CoV-2中和抗体6-2C轻链可变区的FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4核苷酸编码序列(SEQ ID No. 2)：
GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCATCCTCACTGTCTGCATCTGTACAAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAGGTCATTAGCAATTATTTAGCCTGGTTTCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGTTGCTGATCTATGCTGCATCCAATTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCCGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGACTTTGCAACTTATTACTGCCAACAGTATAATATTTACCCCCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAAGTGGATATCAAA
抗SARS-CoV-2中和抗体6-2C重链可变区的FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4氨基酸编码序列(SEQ ID No. 3)：
QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCASSGFTFS TYHMHWVRQP PGKGLEWVAF
ISYDGSNYYY SDSVKGRFTI SRDNSKNTVY LQMNSLRAED TALYYCARDS
SGWHWGVPFD YWGQGTLVTV SS
抗SARS-CoV-2中和抗体6-2C轻链可变区的FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4氨基酸编码序列(SEQ ID No. 4)：
EIVLTQSPSS LSASVQDRVT ITCRASQVIS NYLAWFQQKP GKAPKLLIYA
ASNLQSGVPS RFRGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YNIYPLTFGG
GTKVDIK
序列表
<110> 清华大学
深圳湾实验室
<120> 抗SARS-CoV-2的中和抗体及其应用
<130> GAI22CN2230
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctggcaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcat cctctggatt caccttcagt acctatcata tgcactgggt ccgccagcct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcattt atctcatatg atggaagtaa ttattactac 180
tcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacggtgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctcttt attattgtgc gagagatagc 300
agtggctggc actggggggt cccctttgac tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 360
tcctca 366
<210> 2
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
gaaattgtgt tgacgcagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtacaaga cagagtcacc 60
atcacttgtc gggcgagtca ggtcattagc aattatttag cctggtttca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagttgct gatctatgct gcatccaatt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttccgcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagactttg caacttatta ctgccaacag tataatattt accccctcac tttcggcgga 300
gggaccaaag tggatatcaa a 321
<210> 3
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 3
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ser Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
His Met His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Tyr Tyr Tyr Ser Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Ser Ser Gly Trp His Trp Gly Val Pro Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 4
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 4
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gln
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Val Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Arg Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ile Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100 105
Claims (12)
1.一种抗SARS-CoV-2的中和抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段能够结合SARS-CoV-2的Spike蛋白并且具有重链可变区和轻链可变区，并且其中，所述重链可变区包含：
氨基酸序列为SEQ ID No. 3中第26-33位的VHCDR1；
氨基酸序列为SEQ ID No. 3中第51-58位的VHCDR2；和
氨基酸序列为SEQ ID No. 3中第97-111位的VHCDR3；
所述轻链可变区包含：
氨基酸序列为SEQ ID No. 4中第27-32位的VLCDR1；
氨基酸序列为SEQ ID No. 4中第50-52位的VLCDR2；和
氨基酸序列为SEQ ID No. 4中第89-97位的VLCDR3。
2.如权利要求1所述的抗SARS-CoV-2的中和抗体或其抗原结合片段，其中，所述中和抗体或其抗原结合片段选自Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、双体、融合抗体和完整抗体。
3.如权利要求2所述的抗SARS-CoV-2的中和抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗原结合片段是scFv。
4. 如权利要求1所述的抗SARS-CoV-2的中和抗体或其抗原结合片段，其中，所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.3，且所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.4。
5.一种分离的多核苷酸，该多核苷酸编码权利要求1至4中任一项所述的抗SARS-CoV-2的中和抗体或其抗原结合片段。
6.如权利要求5所述的多核苷酸，其中，该多核苷酸的核苷酸序列包含：
序列为SEQ ID No. 1中的第76-99位的编码所述VHCDR1的核苷酸序列；
序列为SEQ ID No. 1中的第151-174位的编码所述VHCDR2的核苷酸序列；
序列为SEQ ID No. 1中的第289-333位的编码所述VHCDR3的核苷酸序列；
序列为SEQ ID No. 2中的第79-96位的编码所述VLCDR1的核苷酸序列；
序列为SEQ ID No. 2中的第148-156位的编码所述VLCDR2的核苷酸序列；和
序列为SEQ ID No. 2中的第265-291位的序列的编码所述VLCDR3的核苷酸序列。
7.一种重组表达载体，该表达载体包含权利要求5或6所述的多核苷酸。
8.一种重组细胞，该重组细胞包含权利要求5或6所述的多核苷酸，或者包含权利要求7所述的重组表达载体。
9.一种制备权利要求1至4中任一项所述的抗SARS-CoV-2的中和抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括培养权利要求8所述的重组细胞，并且回收得到所述中和抗体或其抗原结合片段。
10.一种药物组合物，该药物组合物包含权利要求1至4中任一项所述的抗SARS-CoV-2的中和抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体。
11.一种试剂盒，该试剂盒包含权利要求1至4中任一项所述的抗SARS-CoV-2的中和抗体或其抗原结合片段。
12.权利要求1至4中任一项所述的抗SARS-CoV-2的中和抗体或其抗原结合片段、权利要求5或6所述的多核苷酸、权利要求7所述的表达载体、权利要求8所述的重组细胞、或权利要求10所述的药物组合物在制备预防和/或治疗新型冠状病毒感染的药物中的应用。
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Applications Claiming Priority (1)
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