CN110655572A - 一种抗丝状病毒gp蛋白的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种抗丝状病毒GP蛋白的单克隆抗体及其应用，所述单克隆抗体的抗原结合片段的重链可变区包括如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；所述抗原结合片段的轻链可变区包括如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。本发明的抗原结合片段从成年中国猕猴体内获得，经人源化后对丝状病毒科的扎依尔型GP蛋白、苏丹型GP蛋白和马尔堡病毒GP蛋白均具有结合活性，得到的单克隆抗体与人基因的同源性高，实现了抗体的人源化，稳定性好，对GP蛋白具有较强的亲和力，所述单克隆抗体可潜在地应用于丝状病毒包括埃博拉病毒及马尔堡病毒的抗原检测、丝状病毒感染临床样本的检测与鉴定以及丝状病毒抑制剂研发等。

Description

一种抗丝状病毒GP蛋白的单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种抗丝状病毒GP蛋白的单克隆抗体及其应用。
背景技术
丝状病毒为单股负链RNA病毒，主要分为埃博拉病毒属、马尔堡病毒属和奎瓦病毒属。埃博拉病毒属包括扎依尔型(ZEBOV)、苏丹型(SUDV)、莱斯顿型(RESTV)、塔伊森林型(TAFV)和本迪布焦型(BDBV)5个种，其中，扎依尔型、苏丹型和本迪布焦型病毒的致死率高达90％。马尔堡病毒属包括马尔堡病毒(MARAV)一个种，致死率高达83-90％。2014年，扎依尔型病毒在西非大爆发，截止2016年共造成11372死亡病例。截止2019年3月10日，在刚果爆发的第10轮埃博拉出血热疫情已造成603例死亡。目前国际上还未有特异性的上市治疗药物，因此对丝状病毒的诊断与治疗的研究显得尤其重要。
近年来，通过对丝状病毒的致病机制进行深入研究，发现GP蛋白是病毒囊膜表面唯一的蛋白质，在病毒入侵、胞膜融合等方面发挥重要的作用。因此，在疫苗设计和药物研发方面主要将GP蛋白作为主要的抗原靶标。目前，针对丝状病毒单个种属的单克隆或组合抗体在动物模型上得到了验证或进入临床阶段。但尚无对于丝状病毒家族多个致病株的单克隆抗体的报道。
CN107922939A公开了中和全部种类埃博拉病毒的感染性的单克隆抗体，所述单克隆抗体能够识别埃博拉病毒的GP的内部膜融合环并具有中和埃博拉病毒的生物活性，但所述单克隆抗体对马尔堡病毒属和奎瓦病毒属不具有生物活性。
CN104168903A公开了用于治疗由包膜病毒导致的疾病的方法和组合物，通过抑制包含在病毒包膜神经节甘酯中的唾液乳糖分子至CD169/唾液酸粘附素受体的结合来预防病毒进入表达CD169/唾液酸粘附素表面受体的细胞的方法和组合物，所述包膜病毒选自由逆转录酶病毒和丝状病毒科的病毒组成的组，所述逆转录病毒优选为HIV，对丝状病毒的靶向效果较弱。
因此，提供一种针对丝状病毒家族多个致病株的单克隆抗体，在丝状病毒的诊断与治疗领域具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种抗丝状病毒GP蛋白的单克隆抗体及其应用，所述单克隆抗体基于猕猴实验技术平台制备得到，解决了丝状病毒单克隆抗体在实际诊断和治疗方面的问题，为建立丝状病毒检测、诊断、预防和治疗提供了新的方案。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种抗原结合片段，所述抗原结合片段的重链可变区包括如SEQ ID NO:1所示的重链CDR3；
所述抗原结合片段的轻链可变区包括如SEQ ID NO:4所示的轻链CDR3；
SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列为：AMRYSNYRTWFNV；
SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列为：QLWDSSSDYPL.
优选地，所述抗原结合片段的重链可变区还包括如SEQ ID NO:2所示的重链CDR2、如SEQ ID NO:3所示的重链CDR1；
所述抗原结合片段的轻链可变区还包括如SEQ ID NO:5所示的轻链CDR2、如SEQID NO:6所示的轻链CDR1；
SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列为：IDLSDSET；
SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列为：GYSFPTYW；
SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列为：YNR；
SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列为：NIGSEA.
优选地，所述抗原结合片段的重链可变区包括如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；
所述抗原结合片段的轻链可变区包括如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；
SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列为：
EVQLVQSGAEVKRPGESLKISCKTSGYSFPTYWITWVRQMPGKGLEWMGTIDLSDSETKYSPSFDGQVTISADKSINTAYLQWSSLKASDSATYYCAMRYSNYRTWFNVWGPGVLVTVSS；
SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列为：
SYDLTQPPSVSVSPGQTARITCGGDNIGSEAVHWYQQQPPQAPVLVIYYNRERPSGIPERFSGSKSGNTATLTISGVEAGDEADYYCQLWDSSSDYPLFGGGTRLTVL.
本发明中，选择成年中国猕猴作为实验动物，以扎依尔型GP蛋白、苏丹型GP蛋白和马尔堡病毒GP蛋白作为抗原进行免疫，得到的单克隆抗体与人基因的同源性高。
第二方面，本发明提供了一种抗丝状病毒GP蛋白的单克隆抗体，所述单克隆抗体包括如第一方面所述的抗原结合片段。
优选地，所述单克隆抗体还包括人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定区中的任意一种或至少两种的组合，优选为人源IgG1恒定区。
本发明中，通过同源重组将可变区基因与人源IgG1恒定区序列进行连接构建抗体表达载体，实现了抗体的人源化。
第三方面，本发明提供了一种核酸分子，所述核酸分子包括编码如第一方面所述的抗原结合片段和/或如第二方面所述的单克隆抗体的重链可变区和/或轻链可变区的DNA片段。
优选地，所述单克隆抗体的重链可变区包括如SEQ ID NO:9所示的核酸分子；
SEQ ID NO:9所示的核酸分子为：
GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCAGAGGTGAAGAGGCCCGGGGAGTCTCTGAAGATCTCCTGTAAGACTTCTGGATACAGCTTTCCCACCTACTGGATCACCTGGGTGCGCCAGATGCCCGGGAAAGGCCTGGAGTGGATGGGAACAATTGATCTTAGTGATTCTGAAACCAAATACAGCCCGTCCTTCGATGGCCAGGTCACCATCTCAGCCGACAAGTCCATCAACACCGCCTACCTGCAGTGGAGCAGCCTGAAGGCCTCGGACTCCGCCACGTATTACTGTGCGATGAGGTACAGTAATTACCGGACCTGGTTCAATGTCTGGGGCCCGGGAGTCCTGGTCACCGTCTCCTCAG.
优选地，所述单克隆抗体的轻链可变区包括如SEQ ID NO:10所示的核酸分子；
SEQ ID NO:10所示的核酸分子为：
TCCTATGATCTGACTCAGCCACCCTCGGTGTCAGTGTCCCCAGGACAGACGGCCAGGATCACCTGTGGGGGAGACAATATTGGAAGTGAAGCTGTACACTGGTACCAGCAGCAGCCACCGCAGGCCCCTGTGTTGGTCATCTATTATAATAGGGAACGGCCCTCAGGGATCCCTGAGCGATTCTCTGGCTCCAAATCAGGGAACACCGCCACCCTGACCATCAGCGGGGTCGAGGCCGGGGATGAGGCTGACTATTACTGTCAGCTGTGGGATAGTAGTAGTGATTATCCGCTTTTCGGAGGAGGGACCCGGCTCACCGTCCTAG.
第四方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体包括如第三方面所述的核酸分子。
优选地，所述表达载体还包括编码人源IgG1恒定区的核酸分子。
优选地，所述表达载体为pCMV。
第五方面，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞转染有如第三方面所述的核酸分子和/或如第四方面所述的表达载体。
优选地，所述宿主细胞包括293T细胞或CHO细胞。
第六方面，本发明提供了一种制备如第一方面所述的抗原结合片段和/或如第二方面所述的单克隆抗体的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将获取的B细胞进行RT-PCR，获得抗体重链可变区的核酸分子和轻链可变区的核酸分子；
(2)分别将步骤(1)所述的重链可变区的核酸分子和轻链可变区的核酸分子连接入表达载体，转入感受态细胞，培养后挑取单克隆细胞进行筛选；
(3)将筛选后的表达载体转入宿主细胞，培养并收集上清液，分离纯化得到所述单克隆抗体。
优选地，步骤(1)所述B细胞来源于猕猴。
本发明中，利用猕猴实验技术平台，制备单克隆抗体，克服了小鼠与人基因同源性较低的缺陷，通过对抗体的人源化过程解决了丝状病毒单克隆抗体在实际诊断和治疗方面的问题。
优选地，步骤(1)所述B细胞的获取方法包括以下步骤：
(1’)采用扎依尔型GP蛋白、苏丹型GP蛋白和马尔堡病毒GP蛋白的混合物作为抗原，对猕猴进行免疫；
(2’)获取免疫后猕猴的外周血单个核细胞，对B细胞进行抗体标记，利用流式细胞分选术，分选得到所述B细胞。
本发明中，采用丝状病毒扎依尔型、苏丹型(GenBank：KT878488.1)和马尔堡型病毒(GenBank：JX458858.1)的GP蛋白作为抗原，利用免疫学和分子生物学技术，通过多次免疫，从中国猕猴体内分离得到亲和成熟的抗体基因，构建得到稳定的人源化抗GP蛋白的单克隆抗体表达载体。
优选地，步骤(1’)所述扎依尔型GP蛋白、苏丹型GP蛋白和马尔堡病毒GP蛋白的摩尔比为(0.5～1):(0.5～1):(0.8～1)，例如可以是0.5:0.5:0.8、0.5:0.5:1、0.5:1:0.8、0.5:1:1、1:0.5:0.8、1:0.5:1、1:1:0.8或1:1:1，优选为1:1:1。
优选地，步骤(2’)所述抗体标记采用CD3抗体、CD20抗体、CD27抗体、IgG抗体和抗组氨酸抗体进行。
本发明中，RT-PCR采用Premega公司的逆转录试剂盒(cat：A5000/A5001)进行。
第七方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括如第一方面的所述抗原结合片段、如第二方面所述的单克隆抗体、如第三方面所述的核酸分子、如第四方面所述的表达载体或如第五方面所述的宿主细胞中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。
第八方面，本发明提供了一种试剂盒，所示试剂盒包括如第一方面所述的抗原结合片段、如第二方面所述的单克隆抗体、如第三方面所述的核酸分子、如第四方面所述的表达载体或如第五方面所述的宿主细胞中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所示试剂盒还包括洗涤液。
第九方面，本发明提供了一种如第一方面所述的抗原结合片段、如第二方面所述的单克隆抗体、如第三方面所述的核酸分子、如第四方面所述的表达载体或如第五方面所述的宿主细胞在制备丝状病毒治疗药物和/或检测试剂中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明选择猕猴为实验动物，制备单克隆抗体，克服了小鼠与人基因同源性较低的缺陷；
(2)本发明以扎依尔型GP蛋白、苏丹型GP蛋白和马尔堡病毒GP蛋白作为抗原进行免疫，将得到的可变区基因与人源IgG1恒定区序列进行连接构建抗体表达载体，得到的单克隆抗体与人基因的同源性高，实现了抗体的人源化；
(3)本发明制备的单克隆抗体稳定性好，对扎依尔型GP蛋白(Zaire GP)、苏丹型GP蛋白(Sudan GP)、马尔堡病毒GP蛋白(Marburg GP)三种GP蛋白均具有较强的亲和性；
(4)本发明制备的单克隆抗体对Zaire型、Sudan型和Marburg型三种假病毒均具有很好的中和效果，对三种假病毒的最大半数抑制浓度(IC50)分别为25.276μg/mL、3.115μg/mL和14.477μg/mL；
(5)本发明制备的单克隆抗体可潜在地应用于丝状病毒包括埃博拉病毒及马尔堡病毒的抗原检测、丝状病毒感染临床样本的检测与鉴定以及丝状病毒抑制剂研发等。
附图说明
图1为第3次加强免疫后血清ELISA检测单克隆抗体对GP蛋白的结合力；
图2(A)为所有细胞的物理数据，如图2(B)为分选出的淋巴细胞群，图2(C)为分选出的单个细胞群，图2(D)为分选出的活细胞群，图2(E)为分选出的B细胞群，如图2(F)为分选出的能够分泌IgG的记忆B细胞群，图2(G)为分选出的能够与抗原特异性结合的记忆B细胞；
图3为巢式PCR扩增抗体重、轻链可变区基因，其中，泳道1为抗体重链可变区基因，泳道2为抗体轻链可变区基因，泳道3为DNA分子量(DL2000)；
图4(A)为单克隆抗体重链人源化质粒图谱，图4(B)为单克隆抗体Lambda链人源化质粒图谱；
图5为制备的单克隆抗体40C1L对3种GP蛋白的结合活性检测结果；
图6为制备的单克隆抗体40C1L对3种假病毒的中和活性检测结果。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1猕猴免疫和外周血单个核细胞的获取
本实施例选择成年中国猕猴，以扎依尔型GP蛋白、苏丹型GP蛋白和马尔堡病毒GP蛋白的混合物作为抗原，对猕猴进行3次免疫：第1天第一次在猕猴前肢肌肉注射各200μg扎依尔型GP蛋白(ZEBOV-GP)、苏丹型GP蛋白(SUDV-GP)、马尔堡病毒GP蛋白(MARV-GP)和铝佐剂的混合物；第14天第二次注射同等剂量的抗原蛋白和铝佐剂的混合物；第28天第三次注射同等剂量的抗原蛋白和铝佐剂的混合物，随后在第35天和第42天分别取猕猴抗凝血。如图1所示，将血清进行梯度稀释进行ELISA实验，检测血清中抗体对抗原的结合活性，说明血清中存在对抗原具有结合能力的抗体。
将猕猴抗凝血进行密度梯度离心，初步得到猕猴外周血单个核细胞(PBMC)，利用红细胞吸水涨破原理，裂解PBMC中的红细胞，通过多次清洗，去除PBMC中的杂质，得到纯化的PBMC，具体步骤如下：
(1)向15mL离心管加入5mL淋巴细胞分离液，并将9mL抗凝血缓慢轻柔加入到淋巴细胞分离液液面上，室温1000×g离心30min；
(2)将离心后的样品的中间白色层加入到新的离心管中，并加入1640培养基至8mL；
(3)向离心管中加入8mL PBS缓冲液清洗去除杂质，300×g离心5min，用吸泵吸取液体，加入1.5mL PBS进行重悬，得到纯化的PBMC；
(4)向1.5mL EP管加入300μL PBMC，加入终浓度为10μg/mL的ZEBOV-GP；向1.5mLEP管加入300μL PBMC，加入终浓度为10μg/ml的SUDV-GP；向1.5mL EP管加入300μL PBMC，加入终浓度为10μg/ml的MARV-GP；将加入GP蛋白的PBMC在37℃下孵育30min，剩余PBMC液氮冻存。
实施例2抗原特异性B细胞的标记与分选
将得到的猕猴PBMC利用抗体标记技术，采用CD3抗体、CD20抗体、CD27抗体、IgG抗体和抗组氨酸抗体进行标记，利用流式细胞分选术，分选单个GP蛋白特异性B细胞，具体步骤如下：
(1)将制备的PBMC离心弃孵育上清，加入1mL PBS缓冲液，400×g离心5min，弃上清；
(2)先加入1μL Aqua，4℃孵育20min，随后加入1mL PBS，400×g离心5min，弃上清；
(3)加入如表1所示的荧光标记抗体，4℃染色30min，染色结束加入1mL PBS，400×g离心5min，最后加入300μL PBS重悬，4℃冰箱孵育，进行上机分选。
表1抗体标记体系
Figure BDA0002229537610000101
如图2(A)所示，首先通过流式细胞仪采集所有细胞的物理数据；如图2(B)和2(C)所示，分选出淋巴细胞和单个细胞群；如图2(D)所示，通过死细胞荧光标记抗体分选出活细胞群；如图2(E)所示，利用CD3-CD20+分选出B细胞群；如图2(F)所示，通过CD27+IgG+分选出能够分泌IgG的记忆B细胞群；最后，如图2(G)所示，通过抗His标签的抗体分选出能够与抗原特异性结合的记忆B细胞。
实施例3利用RT-PCR从单个B细胞中分离抗体可变区基因
采用Promega公司生产的逆转录试剂盒配置细胞裂解液，分装至96孔板后，将细胞离心，加入反转试剂后反转成cDNA，反转录完成后置于-80℃冻存；
利用猕猴特异性引物通过巢式PCR，以B细胞cDNA为模板，扩增抗体的重、轻链可变区基因，50μL体系中含有5μL cDNA、HotStarTaq Plus酶、dNTPs、和0.5μM特异性引物，按以下条件进行PCR扩增：预变性94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃50s，35个循环；72℃7min；获得的PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图3所示。
回收目的片段，送样测序，测序结果与IMGT数据库(http://www.imgt.org/IMGT_vquest/vquest)进行比对，得到如SEQ ID NO:9-10的抗体可变区基因片段。
实施例4构建单克隆抗体的表达载体
利用同源重组引物分别在抗体重链可变区基因的两端和轻可变区基因的两端加入同源重组臂，使用双酶将含有人抗体重、轻链IgG1恒定区的表达质粒线性化，产生同源重组臂；将加入同源重组臂的可变区基因片段和线性化的质粒通过同源重组的方式连接起来，构成完整的表达载体，其中，单克隆抗体重链人源化质粒图谱如图4(A)所示，轻链人源化质粒图谱如图4(B)所示，将重组产物转化进TOP10大肠杆菌感受态中，扩增质粒。
实施例5单克隆抗体的表达与纯化
将实施例4得到的单克隆抗体重、轻链表达质粒按照1:1比例加入到Opti-Mem转染培养基中，充分混合后加入DNA 4倍质量的转染试剂PEI，混合后，室温避光放置30min，随后加入到293T细胞中；
孵育6h后去除转染体系，加入FreeStyleTM2 93表达培养基，使用AKTA蛋白纯化系统，采用亲和纯化(Protein A)的方法纯化表达的抗体上清，得到单克隆抗体40C1L，具体步骤为：
(1)将表达的抗体上清以2500×g室温离心10min，去除沉淀物；
(2)将装有Protein A的亲和纯化柱用10倍体积的结合缓冲液(Binding Buffer)充分流洗；
(3)将表达上清以5mL/min的流速通过纯化柱；
(4)使用20倍纯化柱体积的结合缓冲液(Binding Buffer)充分洗涤纯化柱；
(5)用0.1M pH＝3.0-3.5的柠檬酸缓冲液洗脱纯化柱，直至洗脱峰降至平衡状态，用1M pH＝9.0的Tris-HCl缓冲液调节pH为7.0；
(6)使用浓缩离心柱浓缩纯化后的单克隆抗体，用PBS作为抗体保存的缓冲液，最后用BSA蛋白浓度检测方法测定浓缩后的抗体浓度。
实施例6单克隆抗体亲和活性检测
采用ELISA方法检测单克隆抗体40C1L对扎依尔型GP蛋白(Zaire GP)、苏丹型GP蛋白(Sudan GP)、马尔堡病毒GP蛋白(Marburg GP)三种GP蛋白的亲和活性，主要步骤如下：
(1)将3种GP蛋白用PBS稀释成1ng/μL，以每孔100μL加入到96孔酶标板中，4℃封闭过夜；
(2)弃上清，用0.01M的PBST洗板3次，用PBST配制含5％脱脂奶粉的封闭液，每孔加入100μL室温封闭2h；
(3)倒弃牛奶，用PBST清洗5遍，将纯化浓缩后的抗体进行梯度稀释，浓度从10μg/mL 5倍稀释至0.016μg/mL，100μg/孔，室温放置2h；
(4)弃抗体稀释液，用PBST清洗6遍，用1:5000封闭液稀释山羊抗人IgG-HRP，每孔加入100μL，室温放置2h；
(5)弃二抗稀释液，用PBST清洗6遍，加入TMB，100μL/孔，避光室温放置5min；
(6)每孔加入100μL1M稀硫酸终止反应，在450nm处测定吸光度，以P/N>2.1为阳性。
结果如图5所示，筛选的单克隆抗体40C1L对Zaire GP、Sudan GP和Marburg GP均具有较强的结合能力，对三种抗原的最大半数结合浓度(EC50)分别达到0.6973μg/mL、2.093μg/mL、0.3422μg/mL。
实施例7单克隆抗体中和活性检测
采用微量中和的方法检测单克隆抗体40C1L对扎依尔型、苏丹型和马尔堡型三种丝状病毒的荧光报告假病毒感染的中和活性，主要步骤如下：
(1)第一天下午铺96孔Huh-7细胞，细胞数为5×104/100μl/孔，培养过夜；
(2)第二天培养36h后，稀释抗体和病毒，感染细胞；
(3)用PBS稀释抗体至浓度为100μg/mL，取100μL PBS加到96孔板的第二排至第6排中；取200μL稀释抗体加到96孔板的第一排中，随后取第一排的100μL稀释抗体至第二排中，吹打混匀后取100μL加入下一排孔中，每个稀释度设置三个复孔，依次稀释至最后一排孔后吸掉多余的100μL；
(4)病毒用DMEM培养基稀释，每孔加入100TCID50/20μL的假病毒，放入37℃培养箱中孵育30min，孵育结束后，取出铺有Huh-7细胞的96孔板，吸掉培养基；
(5)每孔加入200μL PBS洗去孔中的培养基，随后吸掉PBS；
(6)按照顺序吸取100μL中和后混合液到铺有Huh-7细胞的96孔板中，放入37℃细胞培养箱中，6h后吸掉液体，加入含10％FBS的DMEM培养基；放入培养箱，48h后检测；
(7)检测时，吸掉培养基，每孔加入50μL的Promega公司的Luciferase(E2620)检测试剂，混匀室温放置30min，随后将96孔板置于Turner BioSystems VeritusTM读值。
结果如图6所示，单克隆抗体40C1L对Zaire型、Sudan型和Marburg型三种假病毒均具有很好的中和效果，对三种假病毒的最大半数抑制浓度(IC50)分别为25.276μg/mL、3.115μg/mL和14.477μg/mL。
综上所述，本发明选择猕猴为实验动物，以扎依尔型GP蛋白、苏丹型GP蛋白和马尔堡病毒GP蛋白作为抗原进行免疫，将得到的可变区基因与人源IgG1恒定区序列进行连接构建抗体表达载体，得到的单克隆抗体与人基因的同源性高，实现了抗体的人源化；所述单克隆抗体稳定性好，对扎依尔型GP蛋白(Zaire GP)、苏丹型GP蛋白(Sudan GP)、马尔堡病毒GP蛋白(Marburg GP)三种GP蛋白均具有较强的亲和性，对三种抗原的最大半数结合浓度(EC50)分别达到0.6973μg/mL、2.093μg/mL和0.3422μg/mL；对扎依尔型、苏丹型和马尔堡型三种假病毒的最大半数抑制浓度(IC50)分别为25.276μg/mL、3.115μg/mL和14.477μg/mL；本发明的单克隆抗体的制备方法简便、重复性好。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院广州生物医药与健康研究院
<120> 一种抗丝状病毒GP蛋白的单克隆抗体及其应用
<130> 20190927
<160> 10
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 1
Ala Met Arg Tyr Ser Asn Tyr Arg Thr Trp Phe Asn Val
1 5 10
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 2
Ile Asp Leu Ser Asp Ser Glu Thr
1 5
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 3
Gly Tyr Ser Phe Pro Thr Tyr Trp
1 5
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 4
Gln Leu Trp Asp Ser Ser Ser Asp Tyr Pro Leu
1 5 10
<210> 5
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 5
Tyr Asn Arg
1
<210> 6
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 6
Asn Ile Gly Ser Glu Ala
1 5
<210> 7
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 7
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Arg Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ser Phe Pro Thr Tyr
20 25 30
Trp Ile Thr Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Thr Ile Asp Leu Ser Asp Ser Glu Thr Lys Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Asp Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Met Arg Tyr Ser Asn Tyr Arg Thr Trp Phe Asn Val Trp Gly Pro
100 105 110
Gly Val Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 8
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 8
Ser Tyr Asp Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asp Asn Ile Gly Ser Glu Ala Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Pro Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Tyr Asn Arg Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Lys Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Glu Ala Gly
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Leu Trp Asp Ser Ser Ser Asp Tyr
85 90 95
Pro Leu Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 9
<211> 361
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 9
gaggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaagaggc ccggggagtc tctgaagatc 60
tcctgtaaga cttctggata cagctttccc acctactgga tcacctgggt gcgccagatg 120
cccgggaaag gcctggagtg gatgggaaca attgatctta gtgattctga aaccaaatac 180
agcccgtcct tcgatggcca ggtcaccatc tcagccgaca agtccatcaa caccgcctac 240
ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac tccgccacgt attactgtgc gatgaggtac 300
agtaattacc ggacctggtt caatgtctgg ggcccgggag tcctggtcac cgtctcctca 360
g 361
<210> 10
<211> 325
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 10
tcctatgatc tgactcagcc accctcggtg tcagtgtccc caggacagac ggccaggatc 60
acctgtgggg gagacaatat tggaagtgaa gctgtacact ggtaccagca gcagccaccg 120
caggcccctg tgttggtcat ctattataat agggaacggc cctcagggat ccctgagcga 180
ttctctggct ccaaatcagg gaacaccgcc accctgacca tcagcggggt cgaggccggg 240
gatgaggctg actattactg tcagctgtgg gatagtagta gtgattatcc gcttttcgga 300
ggagggaccc ggctcaccgt cctag 325

Claims (10)

1.一种抗原结合片段，其特征在于，所述抗原结合片段的重链可变区包括如SEQ IDNO:1所示的重链CDR3；
所述抗原结合片段的轻链可变区包括如SEQ ID NO:4所示的轻链CDR3。
2.根据权利要求1所述的抗原结合片段，其特征在于，所述抗原结合片段的重链可变区还包括如SEQ ID NO:2所示的重链CDR2、如SEQ ID NO:3所示的重链CDR1；
所述抗原结合片段的轻链可变区还包括如SEQ ID NO:5所示的轻链CDR2、如SEQ IDNO:6所示的轻链CDR1。
3.根据权利要求1或2所述的抗原结合片段，其特征在于，所述抗原结合片段的重链可变区包括如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；
所述抗原结合片段的轻链可变区包括如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
4.一种抗丝状病毒GP蛋白的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体包括如权利要求1-3任一项所述的抗原结合片段；
优选地，所述单克隆抗体还包括人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定区中的任意一种或至少两种的组合，优选为人源IgG1恒定区。
5.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括编码如权利要求1-3任一项所述的抗原结合片段和/或如权利要求4所述的单克隆抗体的重链可变区和/或轻链可变区的DNA片段；
优选地，所述单克隆抗体的重链可变区包括如SEQ ID NO:9所示的核酸分子；
优选地，所述单克隆抗体的轻链可变区包括如SEQ ID NO:10所示的核酸分子。
6.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括如权利要求5所述的核酸分子；
优选地，所述表达载体还包括编码人源IgG1恒定区的核酸分子；
优选地，所述表达载体为pCMV。
7.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞转染有如权利要求5所述的核酸分子和/或如权利要求6所述的表达载体；
优选地，所述宿主细胞包括293T细胞或CHO细胞。
8.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括如权利要求1-3任一项所述的抗原结合片段、如权利要求4所述的单克隆抗体、如权利要求5所述的核酸分子、如权利要求6所述的表达载体或如权利要求7所述的宿主细胞中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。
9.一种试剂盒，其特征在于，所示试剂盒包括如权利要求1-3任一项所述的抗原结合片段、如权利要求4所述的单克隆抗体、如权利要求5所述的核酸分子、如权利要求6所述的表达载体或如权利要求7所述的宿主细胞中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所示试剂盒还包括洗涤液。
10.一种如权利要求1-3任一项所述的抗原结合片段、如权利要求4所述的单克隆抗体、如权利要求5所述的核酸分子、如权利要求6所述的表达载体或如权利要求7所述的宿主细胞在制备丝状病毒治疗药物和/或检测试剂中的应用。
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