CN108530533B - 猪瘟病毒单克隆抗体hk24及医用用途 - Google Patents

猪瘟病毒单克隆抗体hk24及医用用途 Download PDF

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    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL

Abstract

本发明提供了一种猪瘟病毒单克隆抗体HK24及医用用途，可用于制备诊断或检测猪瘟病毒试剂；也可用于制备预防治疗猪瘟生物制剂；对于减少猪瘟病毒给养猪业造成的经济损失具有重要意义。

Description

猪瘟病毒单克隆抗体HK24及医用用途
技术领域
本发明提供了特异性结合、并能有效中和猪瘟病毒的抗体HK24及其序列，属于生物技术和分子免疫学领域。
技术背景
抗体（antibody，Ab）是介导体液免疫的重要效应分子，在病毒感染过程中主要通过与相应抗原特异性结合阻止病原微生物黏附靶细胞受体，对机体起保护作用。抗体的发现不仅在人类疾病诊断、治疗和有害物质的分析检测等领域做出了巨大贡献，而且是生物医药的重要组成部分，继重组蛋白后引领了第二次生物医药产品浪潮。
近年来，smart-seq2技术的出现，实现了单细胞全长cDNA的获得，为抗体基因的获取提供了可能。避免了冗杂的杂交瘤细胞筛选过程，且所产生的抗体不再限制于抗鼠的抗体，为研发抗体药物及疾病的免疫治疗提供了基础。
猪瘟（Classical swine fever, CSF）是由猪瘟病毒（Classical swine fevervirus, CSFV）感染引起猪的一种烈性传染病，具有急性、热性、高度接触性等特点，被世界动物卫生组织（OIE）列为A类传染病，严重威胁养猪业发展。CSFV是一种含有囊膜的单股正链RNA病毒，属于黄病毒科瘟病毒属成员，基因组长约12.3kb，编码4个结构蛋白C（p14）、E0（gp48）、E1（gp33）、E2（gp53）及7个非结构蛋白p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B。其中，糖蛋白 E2是最主要的免疫原性蛋白，可诱导机体产生中和性抗体，保护机体免受病毒的攻击。因此本发明利用合成的E2蛋白中保守表位5-tamra-CTAVSPTTLRTEVVK与FITC-anti-pigIgG同时标记细胞，高效筛选表位特异性抗体分泌细胞，利用smart-seq2技术获得猪瘟病毒特异性抗体基因的序列，成功表达获取了具有中和活性的猪瘟病毒特异性单克隆抗体，为猪瘟病毒血清学的快速诊断，开发猪瘟新型疫苗及猪瘟的防治提供了候选者。
发明内容
本发明公开了一种猪瘟病毒单克隆抗体HK24，该抗体能够结合猪瘟病毒E2蛋白，并且有效中和猪瘟病毒。
本发明所述的一种猪瘟病毒单克隆抗体HK24，包括轻链和重链，其特征在于：
所述单克隆抗体的重链全长氨基酸序列为SEQ ID 1，可变区氨基酸序列为序列表中的SEQ ID 3；
所述单克隆抗体的轻链全长氨基酸序列为SEQ ID 5，可变区氨基酸序列为序列表中的SEQ ID 7；
所述的猪瘟病毒单克隆抗体HK24，其特征在于：
能够编码抗体重链全长核酸序列为SEQ ID 2；所述抗体的重链可变区包含核苷酸序列为SEQ ID 4；
能够编码抗体轻链全长核酸序列为SEQ ID 6；所述抗体的轻链可变区包含核苷酸序列为SEQ ID 8。
所述单克隆抗体或其抗原结合片段选自Fab、Fab’、F (ab’)2、Fd、Fv、Fc、dAb、互补决定区片段、单链抗体。
所述的单克隆抗体包括非CDR区，且所述非CDR区来自不是猪类的物种。
所述的猪瘟病毒单克隆抗体HK24在诊断或检测猪瘟病毒试剂中的用途。
所述的猪瘟病毒单克隆抗体HK24在预防治疗猪瘟生物制剂中的用途。
本发明猪瘟病毒单克隆抗体HK24的制备方法，包括以下步骤：在猪21-30日龄和65日龄时分别注射1次猪瘟疫苗（兔化弱毒株，吉林正业生物制品股份有限公司），间隔一周后加强免疫一次，共免疫三次；
用猪瘟病毒抗体检测试剂盒检测免疫后猪血清中抗体含量，选择抗体含量较高的实验猪，前腔静脉采血获得血样，之后使用淋巴细胞分离液对血样进行密度梯度离心，分离出猪淋巴细胞；
所得淋巴细胞使用FITC标记的抗猪IgG 和5-tamra标记的特异性表位CTAVSPTTLRTEVVK同时标记，利用流式细胞术筛选出抗体分泌细胞群，并使用显微操作技术将所得细胞群分离为单个状态，即为单个抗体分泌细胞。
使用Smart-seq2技术获得单个抗体分泌细胞cDNA，步骤为：将单个细胞放入含有2μl裂解液（1 μl RNase抑制剂和19 μl 0.2% (vol/vol) Triton X-100）1 μl oligo-dT 和1 μl dNTP的0.2-ml PCR 管中进行裂解；
利用SuperScript II 反转录酶获取单个抗体分泌细胞全长cDNA，并使用KAPAHiFi HotStart ReadyMix进行预扩增，之后使用特定引物，以预扩增产物为模版进行巢式PCR，扩增得到抗体重链、轻链基因全长序列，通过表达及鉴定获得了一对能够特异性结合并中和猪瘟病毒的单克隆抗体，命名为HK24。
本发明所述的猪瘟病毒单克隆抗体HK24可在体外高量表达，并有潜力运用于猪瘟病毒的检测，预防及紧急治疗。
本发明的积极效果在于：
提供了一种能够特异性结合并中和猪瘟病毒的猪瘟病毒单克隆抗体HK24，可用于制备诊断或检测猪瘟病毒试剂；也可用于制备预防治疗猪瘟生物制剂；对于减少猪瘟病毒给养猪业造成的经济损失具有重要意义。
附图说明
图1：单克隆抗体HK24表达纯化后SDS-PAGE检测（从左至右3个泳道样品及上样量依次为：Maker，8µl；猪IgG，5µl；猪IgG，15µl；HK24，20µl）；
图2：单克隆抗体HK24表达纯化后Western-blot检测对猪瘟病毒的结合活性（从左至右样品依次为：感染CSFV的PK细胞蛋白样品，正常PK细胞蛋白样品）；
图3：单克隆抗体HK24中和活性检测。
具体实施方式
通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。
实施例1
单克隆抗体的轻链和重链序列的获得
具体实施过程如发明内容所述，大致流程为：流式分选后的单个细胞中加入TritonX-100和RNA酶抑制剂裂解细胞，获取mRNA。按照Invitrogen SuperScript II反转录酶说明书合成cDNA，并进行巢式PCR扩增，。PCR扩增产物进行pLB载体连接，具体操作参考pLB 零背景快速连接试剂盒（VT205）说明书。挑取单克隆菌落测序，并对抗体序列中的可变区进行预测鉴别，结果如下：
抗体重链全长核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；重链全长氨基酸序列如 SEQ IDNO.1所示；
抗体重链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示；重链可变区氨基酸序列如 SEQID NO. 3所示；
轻链全长核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示；轻链全长氨基酸序列如SEQ ID NO. 5所示；
抗体轻链可变区核酸序列如SEQ ID NO. 8所示；抗体轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO. 7所示。
试验例1
HK24抗体的制备和SDS-PAGE电泳检测
将HK24的重链全长序列（SEQ ID NO：2）和轻链全长序列（SEQ ID NO：6）分别克隆到含有启动子EF1α的表达载体中（酶切位点：NdeI和XhoI），共转染293FT细胞。细胞培养4天后，将培养液1000rpm/min离心5min收集上清，0.45µm滤膜过滤后利用ProteinA磁珠纯化获得重组抗体，进行SDS-PAGE电泳检测。结果如图1所示，目标蛋白大约在55kD和24kD处与预期相符。
试验例2
Western-blot检测HK24抗体与猪瘟病毒结合活性
1、猪瘟病毒感染PK-15细胞72h后收集胞内蛋白，以未感染病毒的PK-15细胞做阴性对照；
2、吸取等量的病毒组及非病毒组蛋白，加入SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（1×）补齐至相同体积，100℃水浴5-10 分钟，充分变性蛋白。依照试剂盒配制12%的 SDS-PAGE分离胶和5%的浓缩胶。按照一定顺序上样到SDS-PAGE 胶加样孔中，浓缩胶以 90mV,分离胶以120mV 恒压电泳约 1 个小时，待蓝色染料到达胶的底端处附近停止电泳；
3、电泳后按说明书操作将样品转至NC膜，并用5%脱脂奶粉封闭2h；
4、加入HK24抗体（1：100稀释在封闭液中）4℃孵育过夜；
5、次日，用TBST震荡洗涤 3次，每次10分钟，随后加入辣根过氧化酶标记兔抗猪IgG的二抗（PBST 1：2000稀释），室温摇床中放置1小时，再次充分洗涤；
6、显色；
7、结果如图2所示，病毒组检测到目标蛋白大约在55kD，无病毒组未检测到目标蛋白。
试验例3
病毒中和实验检测HK24抗体的中和活性
1、HK24抗体两倍连续稀释在DMEM中，与等体积的TCID50/ml CSFV 37℃混合，孵育1小时；
2、100ul的抗体-病毒混合物加入到含有PK15细胞的96孔板中，37℃孵育2小时；
弃去培养液，并用PBS清洗三次，加入新鲜含有5%FBS 的完全培养基，37℃孵育72小时；
3、弃去培养液，用PBS清洗3次，每次10分钟，逐孔加入100µl预冷的80%丙酮，-20℃固定过夜；
4、吸出个各培养孔中的固定液，各孔加入100µl PBST，放到摇床上，清洗10min，重复2~3次；
5、用抗体稀释液按1:100的比例稀释一抗，加入到各细胞培养孔中，37℃，孵育1~2小时；
6、各孔加入100µl PBST，放到摇床上，清洗10min，重复2~3次；
7、用抗体稀释液按1:100的比例稀释荧光二抗，加入到各细胞培养孔中，37℃孵育30分钟；
8、各孔加入100µl PBST，放到摇床上，清洗10min，重复2~3次；
9、各孔加入100µlPBST，在倒置荧光显微镜显微镜下进行分析；
10、结果如图3所示。
序列表
<110> 吉林大学
<120> 猪瘟病毒单克隆抗体HK24及医用用途
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 471
<212> PRT
<213> 猪(Sus scrofa)
<400> 1
Met Gly Pro Ala Leu Ala Thr Val Val Leu Pro Ala Leu Leu Gly Gly
1 5 10 15
Val Gly Gly Gly Gly Leu Leu Val Gly Ser Gly Gly Gly Leu Val Gly
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Ala Leu Ser Cys Val Gly Ser Gly Pro Thr Val
35 40 45
Ser Ser Thr Thr Ile His Thr Val Ala Gly Ala Pro Gly Leu Gly Leu
50 55 60
Gly Thr Leu Ala Ala Ile Ser Ser Gly Gly Gly Gly Thr Thr Thr Ala
65 70 75 80
Ala Ser Val Leu Gly Ala Pro Thr Ile Ser Leu Ala Ala Ser Gly Ala
85 90 95
Ser Ala Thr Leu Gly Met Ala Gly Leu Ala Ser Gly Ala Thr Ala Ala
100 105 110
Thr Thr Cys Ala Gly Ser Thr Val Ile Cys Ala Thr Cys Thr Thr Ala
115 120 125
Pro Met Ala Val Thr Gly Pro Gly Val Gly Val Val Val Ser Ser Ala
130 135 140
Pro Leu Thr Ala Pro Ser Val Thr Pro Leu Ala Pro Cys Gly Ala Ala
145 150 155 160
Val Ser Gly Pro Ala Val Ala Leu Gly Cys Leu Ala Ser Ser Thr Pro
165 170 175
Pro Gly Pro Val Thr Val Thr Thr Ala Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
180 185 190
Val His Thr Pro Pro Ser Val Leu Gly Pro Ser Gly Leu Thr Ser Leu
195 200 205
Ser Ser Met Val Thr Val Pro Ala Ser Ser Leu Ser Ser Leu Ser Thr
210 215 220
Thr Cys Ala Val Ala His Pro Ala Thr Thr Thr Leu Val Ala Leu Ala
225 230 235 240
Val Gly Ile His Gly Pro Gly Thr Cys Pro Ile Cys Pro Gly Cys Gly
245 250 255
Val Ala Gly Pro Ser Val Pro Ile Pro Pro Pro Leu Pro Leu Ala Thr
260 265 270
Leu Met Ile Ser Gly Thr Pro Gly Val Thr Cys Val Val Val Ala Val
275 280 285
Ser Leu Gly His Ala Gly Val Gly Pro Ser Thr Thr Val Ala Gly Val
290 295 300
Gly Val His Thr Ala Gly Thr Ala Pro Leu Gly Gly Gly Pro Ala Ser
305 310 315 320
Thr Thr Ala Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gly His Gly Ala Thr Leu
325 330 335
Leu Gly Leu Gly Pro Leu Cys Leu Val Ala Ala Val Ala Leu Pro Ala
340 345 350
Pro Ile Thr Ala Thr Ile Ser Leu Ala Ile Gly Gly Ser Ala Gly Pro
355 360 365
Gly Val Thr Thr Leu Pro Pro Pro Ala Gly Gly Leu Ser Ala Ser Leu
370 375 380
Val Thr Leu Thr Cys Leu Val Ile Gly Pro Thr Pro Pro Ala Ile His
385 390 395 400
Val Gly Thr Leu Ser Ala Gly Gly Pro Gly Pro Gly Ala Thr Thr Ala
405 410 415
Thr Thr Pro Pro Gly Gly Ala Val Ala Gly Thr Pro Pro Leu Thr Ser
420 425 430
Leu Leu Ala Val Ala Leu Ala Ala Thr Ala His Gly Ala Leu Pro Gly
435 440 445
Cys Ala Val Met His Gly Ala Leu His Ala His Thr Thr Gly Leu Ser
450 455 460
Ile Ser Leu Thr Gly Gly Leu
465 470
<210> 2
<211> 1416
<212> DNA
<213> 猪(Sus scrofa)
<400> 2
atggagtttc ggctgaactg ggtggtcttg tttgctctct tacaaggtgt ccagggtgag 60
gagaagctgg tggagtctgg aggaggcctg gtgcagcctg gggggtctct gagactctcc 120
tgtgtcggct ctggattcac cgtcagtagt acctacatcc actgggtccg ccaggctcca 180
gggaaggggc tggagtggct ggcagctatt agtagtggtg gtggtggcac ctactacgca 240
gactctgtga agggccgatt caccatctcc aaagacaact cccagaattc ggcctatctg 300
gaaatgaacg gcctgagatc agaagatacg gcccgctatt actgtgcagg aagtacagtg 360
atttgtaact ggtgttggac tgacccgatg gatgtctggg gcccaggcgt tgaggtcgtc 420
gtgtcctcag cccccaagac ggccccatcg gtctaccctc tggccccctg cggcagggac 480
gtgtctggcc ctaacgtggc cttgggctgc ctggcctcaa gctacttccc cgagccagtg 540
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cagccgtcag ggctctactc cctcagcagc atggtgaccg tgccggccag cagcctgtcc 660
agcaagagct acacctgcaa tgtcaaccac ccggccacca ccaccaaggt ggacaagcgt 720
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gtcacgtgcg tggtggtgga cgtcagcaag gagcacgccg aggtccagtt ctcctggtac 900
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ttcaagtgca aggtcaacaa cgtagacctc ccagccccca tcacgaggac catctccaag 1080
gctatagggc agagccggga gccgcaggtg tacaccctgc ccccacccgc cgaggagctg 1140
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acccagaagt ccatctccaa gactcagggt aaatga 1416
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<212> PRT
<213> 猪(Sus scrofa)
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Gly Gly Leu Leu Val Gly Ser Gly Gly Gly Leu Val Gly Pro Gly Gly
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Thr Ile His Thr Val Ala Gly Ala Pro Gly Leu Gly Leu Gly Thr Leu
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Ala Ala Ile Ser Ser Gly Gly Gly Gly Thr Thr Thr Ala Ala Ser Val
50 55 60
Leu Gly Ala Pro Thr Ile Ser Leu Ala Ala Ser Gly Ala Ser Ala Thr
65 70 75 80
Leu Gly Met Ala Gly Leu Ala Ser Gly Ala Thr Ala Ala Thr Thr Cys
85 90 95
Ala Gly Ser Thr Val Ile Cys Ala Thr Cys Thr Thr Ala Pro Met Ala
100 105 110
Val Thr Gly Pro Gly Val Gly Val Val Val Ser Ser
115 120
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<213> 猪(Sus scrofa)
<400> 4
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ccagggaagg ggctggagtg gctggcagct attagtagtg gtggtggtgg cacctactac 180
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gtgatttgta actggtgttg gactgacccg atggatgtct ggggcccagg cgttgaggtc 360
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<211> 238
<212> PRT
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35 40 45
Gly Ser Ile Ser Ser Thr Leu Gly Thr Thr Gly Gly Gly Pro Gly Leu
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Ala Pro Leu Leu Leu Ile Thr Pro Ala Ser Ser Leu Gly Ser Gly Val
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Pro Ser Ala Pro Leu Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Pro Thr Leu Thr
85 90 95
Ile Ser Gly Leu Gly Ala Gly Ala Val Ala Thr Thr Thr Cys Leu Gly
100 105 110
Ala Ser Ser Leu Pro Thr Gly Pro Gly Ala Gly Thr Leu Leu Gly Leu
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Leu Ala Ala Ala Ala Leu Pro Ser Val Pro Ile Pro Pro Pro Ser Leu
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Pro Pro Pro Ala Gly Val Ala Val Leu Thr Leu Val Ala Gly Val Val
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Gly Ser Ser Gly Ile Leu Ala Ser Val Thr Gly Gly Ala Ser Leu Ala
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ccatcccggt tcaagggcag tggatctggc accgatttca ccctcaccat cagtggcctg 300
caggctgaag atgttgcaac ttattactgt ttgcaggata gcagtttacc gtatggtttc 360
ggcgcgggga ccaagctgga gctcaaacgg gctgatgcca agccatccgt cttcatcttc 420
ccgccatcga aggagcagtt agagacccaa actgtctctg tggtgtgctt gctcaatagc 480
ttcttcccca gagaagtcaa tgtcaagtgg aaagtggatg gggtggtcca aagcagtggc 540
atcctggata gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct cagcagcacc 600
ctctcgctgc ccacgtcaca gtacctaagt cataatttat attcctgtga ggtcacccac 660
aagaccctgg cctcccctct ggtcaaaagc ttcaacagga acgagtgtga ggcttag 717
<210> 7
<211> 127
<212> PRT
<213> 猪(Sus scrofa)
<400> 7
Met Ala Met Ala Ala Pro Met Gly Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Thr
1 5 10 15
Leu Pro Gly Ala Ala Ser Ala Ile Gly Leu Thr Gly Ser Pro Ala Ser
20 25 30
Leu Ala Ala Ser Leu Gly Ala Thr Val Ser Ile Thr Cys Ala Ala Ser
35 40 45
Gly Ser Ile Ser Ser Thr Leu Gly Thr Thr Gly Gly Gly Pro Gly Leu
50 55 60
Ala Pro Leu Leu Leu Ile Thr Pro Ala Ser Ser Leu Gly Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Ser Ala Pro Leu Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Pro Thr Leu Thr
85 90 95
Ile Ser Gly Leu Gly Ala Gly Ala Val Ala Thr Thr Thr Cys Leu Gly
100 105 110
Ala Ser Ser Leu Pro Thr Gly Pro Gly Ala Gly Thr Leu Leu Gly
115 120 125
<210> 8
<211> 381
<212> DNA
<213> 猪(Sus scrofa)
<400> 8
atggacatga gggcccccat gcagctcctt ggtctcctgc tgctctggct cccaggtgcc 60
aggagtgcca tccagctgac ccagtctcca gcctccctgg ctgcatctct aggagacacg 120
gtctccatca cttgccgggc cagtcagagc attagcagtt atttaggctg gtatcaacaa 180
caaccaggga aggctcctaa actcttgatc tatcctgcat ccagtttgca aagtggggtc 240
ccatcccggt tcaagggcag tggatctggc accgatttca ccctcaccat cagtggcctg 300
caggctgaag atgttgcaac ttattactgt ttgcaggata gcagtttacc gtatggtttc 360
ggcgcgggga ccaagctgga g 381

Claims (3)

1.一种猪瘟病毒单克隆抗体HK24的制备方法，包括以下步骤：
在猪21-30日龄和65日龄时分别注射1次猪瘟疫苗，间隔一周后加强免疫一次，共免疫三次；
用猪瘟病毒抗体检测试剂盒检测免疫后猪血清中抗体含量，选择抗体含量较高的实验猪，前腔静脉采血获得血样，之后使用淋巴细胞分离液对血样进行密度梯度离心，分离出猪淋巴细胞；
所得淋巴细胞使用FITC标记的抗猪IgG 和5-tamra标记的特异性表位CTAVSPTTLRTEVVK同时标记，利用流式细胞术筛选出抗体分泌细胞群，并使用显微操作技术将所得细胞群分离为单个状态，即为单个抗体分泌细胞；
使用Smart-seq2技术获得单个抗体分泌细胞cDNA，步骤为：将单个细胞放入含有2μl裂解液，即0.1 μl RNase抑制剂和1.9 μl 体积分数为0.2% 的Triton X-100、1 μl oligo-dT和 1 μl dNTP的0.2-ml PCR 管中进行裂解；
利用SuperScript II 反转录酶获取单个抗体分泌细胞全长cDNA，并使用KAPA HiFiHotStart ReadyMix进行预扩增，之后使用特定引物，以预扩增产物为模版进行巢式PCR，扩增得到抗体重链、轻链基因全长序列，通过表达及鉴定获得了一对能够特异性结合并中和猪瘟病毒的单克隆抗体，命名为HK24；
所述HK24的重链全长氨基酸序列为SEQ ID 1，可变区氨基酸序列为序列表中的SEQ ID3；
所述HK24的轻链全长氨基酸序列为SEQ ID 5，可变区氨基酸序列为序列表中的SEQ ID7；
能够编码抗体重链全长核酸序列为SEQ ID 2；所述抗体的重链可变区包含核苷酸序列为SEQ ID 4；
能够编码抗体轻链全长核酸序列为SEQ ID 6；所述抗体的轻链可变区包含核苷酸序列为SEQ ID 8。
2.根据权利要求1制备的猪瘟病毒单克隆抗体HK24在制备诊断或检测猪瘟病毒试剂中的用途。
3.根据权利要求1制备的猪瘟病毒单克隆抗体HK24在制备预防治疗猪瘟生物制剂中的用途。
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"Characterization of antibody responses against a neutralizing epitope on the glycoprotein E2 of classical swine fever virus";Qi Y et al.;《Arch Virol》;20080708;第153卷(第8期);摘要 *
"The protective immune response induced by B cell epitope of classical swine fever virus glycoprotein E2";SiguoLiu et al.;《Journal of Virological Methods》;20060207;第134卷;摘要 *
"Tools to therapeutically harness the human antibody response";Wilson PC et al.;《Nat Rev Immunol》;20120925;第12卷(第10期);摘要，第709页左栏最后1段-右栏第1段，第710页左栏倒数第2段，第712页右栏最后1段-第714页右栏第1段 *

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