KR20190107761A - 모노클로날 항체를 생성하는 방법 및 시약 - Google Patents

Abstract

일부 실시형태에서, 본 발명은 항원에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체를 생성하는 방법에 관한 것이다. 본 방법은 비특이적 폴리클로날 집단과 같은 항체의 폴리클로날 집단, 또는 항원에 특이적으로 ?바하는 항체의 폴리클로날 집단으로부터 출발될 수 있다. 본 방법은 동물로부터 다중 면역글로불린의 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 (또는 그의 가변 영역)을 코딩하는 핵산 분자를 얻는 단계; 선택된 항원에 특이적으로 결합하는 폴리클로날 면역글로불린의 펩타이드 단편의 질량 스펙트럼 정보를 얻는 단계; 폴리크로날 면역글로불린의 펩타이드 단편의 질량 스펙트럼을 핵산 분자에 의해 코딩되는 예측된 아미노산 서열의 예측된 질량 스펙트럼 정보와 비교 및/또는 서로 연관시킨 후, 중쇄 및 경쇄를 어셈블링하여 항원에 특이적으로 결합하는 항체 (또는 그의 가변 영역)을 생성하는 단계를 포함한다.

Description

모노클로날 항체를 생성하는 방법 및 시약{METHODS AND REAGENTS FOR CREATING MONOCLONAL ANTIBODIES}

관련출원의 상호참조

본 출원은 그 전체 내용이 참조로 본 명세서에 포함되는 2011년 3월 9일에 출원된 미국 가출원 제61/450,922호, 2011년 11월 15일에 출원된 미국 가출원 제61/560,006호, 2011년 12월 5일에 출원된 미국 가출원 제61/566,876호, 및 2012년 2월 3일에 출원된 미국 가출원 제61/594,729호로부터 우선권을 주장한다.

기술분야

본 개시는 생물학, 더욱 상세하게는 분자 생물학 및 면역학에 관한 것이다.

항체는 항원으로 칭해지는 특정 타겟 분자에 대하여 큰 특이성(specificity) 및 친화성(affinity)으로 결합하는 생물학적으로 및 상업적으로 중요한 폴리펩타이드이다. 항체는 척추동물의 면역 세포에 의해 생산되며, 모든 자연적으로 발생하는 항체는 동일한 기본 구조, 즉 2개의 동일한 경쇄(light chains)에 공유결합된 2개의 동일한 중쇄(heavy chains)를 공유한다. 단일 중쇄 및 단일 경쇄의 N 말단 영역(N-terminal region)은 각각의 개별적인 항체에 대하여 특이한 항원 결합 부위(antigen-binding site)를 형성한다. 중쇄의 C 말단 영역(C-terminal region)은 항체의 특정한 아이소타입(isotype)을 결정하며, 동일한 항체-생산 세포는 상이한 아이소타입의 항체를 생산할 수 있고, 여기에서 세포에 의해 생산된 모든 항체는 동일한 항원 결합 부위를 갖는다. 상이한 아이소타입은 동물에서 상이한 기능을 수행하는 것이 전형적이다. 예를 들어, E 아이소타입의 항체 (즉, IgE 항체)는 알레르기 반응에 관련되는 반면, A 아이소타입의 항체 (즉, in IgA 항체)는 점막, 침, 및 모유에서 발견될 수 있다. 4개 사슬의 항체 분자는 단독으로 (예를 들어, IgG 항체), 또는 부가적인 모노머와 함께 다이머(dimers)를 형성하여 (예를 들어, IgA 항체) 또는 펜타머(pentamers)를 형성하여 (예를 들어, IgM 항체) 존재할 수 있다.

항체의 기본적 구조는 잘 이해되어 있어, 표준 분자생물학 기술을 이용하여 항체의 상이한 영역을 조작함으로써 재조합 항체를 제조할 수 있다. 예를 들어, 미국특허 US 6,180,370 및 US 6,548,640 (전체적으로 참조로 본 명세서에 포함됨)는 분자생물학 기술을 이용하여 비인간 항체의 다양한 영역을 조작함으로써 인간이 아닌 동물에서 자연적으로 발생되는 항체를 인간화(humanizing)하는 것을 서술한다. 표준 분자생물학 기술을 이용하여 재조합 항체를 조작 또는 생성하는 다른 방법이 서술되어 있다 (예를 들어, 전체적으로 본 명세서에 참조로 포함되는, PCT 국제공개공보 WO91/17271호, PCT 국제공개공보 WO92/01047호; 미국특허 US 5,969,108, US 6,331,415, US 7,498,024, 및 US7,485,291 참조).

면역 반응 중에, 동물은 각각 상이한 항원 결합 특이성 (antigen-binding specificity)을 갖는 수많은 상이한 항체를 생성할 것이다. 이 항체의 집단은 항체의 폴리클로날 집단(polyclonal population)로 칭해진다. 면역 반응이 특정 항원에 대한 것인 경우, 동물에 의해 만들어지는 폴리크로날 항체의 대부분 (전부는 아닌)은 그 항원에 특이적으로 결합할 것이다. 그러나, 항원에 대한 결합 친화성과 결합 부위의 차이에 의해, 폴리클로날 항체의 일부는 다른 폴리클로날 항체보다 더욱 유리하다. 1975년 그들의 노벨상 수상 발견에서, Kohler와 Milstein은 폴리클로날 항체 생산 동물로부터, 대상 항원에 특이적으로 결합하는 모노클로날(monoclonal) 항체를 생산하는 단일 항체-생산 세포를 분리 및 불멸화하는 방법을 발견하였다 (Kohler and Milstein, Nature 256: 495-497, 1975). 항체 생산 세포를 불멸화된 세포에 융합시켜 모노클로날 항체 생산 하이브리도마(hybidoma)를 생성하는 것을 수반하는, 이 불멸화 기술은 지난 35년간 모노클로날 항체를 제조하는 산업 표준이 되었다.

그의 인기 및 오랜 지속성에도 불구하고, Kohler 및 Milstein의 하이브리도마 방법은 수많은 단점을 갖는다. 예를 들어, 이것은 매우 시간 소비적이며, 노동 집약적이다. 더욱 관련성 있게는, 얼마나 시간 소비적이며 노동 집약적인지를 고려하면, 동물의 항체 생산 세포의 단지 작은 부분만이 불멸화되어, 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 그 능력에 대하여 스크리닝된다. 마지막으로, 바람직한 항원 특이성을 갖는 하이브리도마가 분리되더라도, 항체의 인간화와 같은 추가적인 조작을 용이하게 하기 위하여 항체의 아미노산 서열을 수득하는 것은 몹시 힘들고, 시간 소비적이다.

원하는 항체에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체를 생성하는 향상된 방법에 대한 요구가 존재한다.

본 발명의 다양한 측면 및 실시형태는 대상 항원에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체를 신속하고 정확하게 생성하는 방법 및 시스템을 제공한다. 다른 측면 및 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 다양한 방법을 수행하기 위한 시약 및 조성물, 및 본 발명의 다양한 방법의 수행으로부터 유래되는 시약 및 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법, 시약, 및 조성물은 대상의 순환으로부터 모노클로날 항체를 생성하는데 유용하다.

일 측면에서, 본 발명은 항원에 특이적으로 결합하는 면역글로불린(immunoglobulin)(또는 그의 가변 영역(variable regions))의 서열을 얻는 방법을 제공하며, 이 방법은 (a) 적어도 하나의 동물의 다중 면역글로불린(multiple immunoglobulins)의 면역글로불린 사슬 (또는 그의 가변 영역)을 코딩하는 핵산 서열을 제공하는 단계; (b) 항원에 특이적으로 결합하는 폴리클로날 면역글로불린의 집단의 면역글로불린 중쇄(heavy immunoglobulin chains) 및 면역글로불린 경쇄(light immunoglobulin chains)의 펩타이드 단편(peptide fragment)의 질량 스펙트럼 정보(mass spectra information)를 얻는 단계; (c) 펩타이드 단편의 질량 스펙트럼 정보를 핵산 서열의 예측(predicted) 질량 스펙트럼 정보와 서로 연관시켜, 펩타이드 단편을 포함하는 면역글로불린 사슬 (또는 그의 가변 영역)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 동정하는 단계, 여기에서 상기 예측된 질량 스펙트럼 정보는 상기 핵산 서열의 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 예측된(predicted) 아미노산 서열로부터 유래됨; 및 (d) 펩타이드 단편에 의한 면역글로불린 사슬 또는 그의 단편의 아미노산 서열 커버리지(coverage)에 근거하여, 동정된 면역글로불린 사슬 (또는 그의 가변 영역)의 뉴클레오타이드 서열 또는 아미노산 서열로부터 선택하여, 항원에 특이적으로 결합하는 면역글로불린의 중쇄 또는 경쇄의 뉴클레오타이드 서열 또는 아미노산 서열을 얻는 단계를 포함한다.

일부 실시형태에서, 단계 (d)에서 선택되는 면역글로불린 중쇄 및 면역글로불린 경쇄 (또는 그의 가변 영역)는 항원에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 (또는 그의 가변 영역)을 생성하기 위하여 어셈블링(assemble)된다.

일부 실시형태에서, 단계(d)에서 얻어진 면역글로불린 사슬 가변 영역의 뉴클레오타이드 서열 또는 아미노산 서열은 어셈블링(assembly) 전에 재조합 분자 생물학 기술 또는 유전자 합성 기술에 의해 합성된다.

일부 실시형태에서, 본 방법은 상기 면역글로불린 (또는 그의 가변 영역)이 항원에 특이적으로 결합하는 것을 확인하기 위하여 면역분석(immunoassay)에 의해 생성된 면역글로불린 (또는 그의 가변 영역)을 스크리닝하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역분석은 유동 세포 계수 분석(flow cytometry assay), 효소 결합 면역흡착 분석(enzyme-linked immunosorbent assay, "ELISA"), 웨스턴 블롯 분석(Western blotting assay), 면역조직화학적 분석(immunohistochemistry assay), 면역형광 분석(immunofluorescence assay), 방사면역 분석(radioimmunoaasy), 중화 분석(neutralization assay), 결합 분석(binding assay), 친화성 분석(affinity assay), 또는 단백질 또는 펩타이드 면역침강반응 분석(immunoprecipitation assay)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 실시형태에서, 단계 (d)에서 면역글로불린 중쇄 및 면역글로불린 경쇄의 선택은 펩타이드 단편에 의한 사슬의 일부 (예를 들어, 가변 영역 또는 상보성 결정 영역(complementarity determining region))의 아미노산 서열 커버리지에 근거하여 이루어진다.

다른 실시형태에서, 단계 (d)에서 면역글로불린 중쇄 및 면역글로불린 경쇄의 선택은 맵핑된 특유한 펩타이드의 수(the number of unique peptides mapped), 스펙트럼 점유율(spectrum share), 총 펩타이드 계수(total peptide count), 특유한 펩타이드 계수(unique peptide count), 코딩 핵산 서열의 빈도(frequency of the encoding nucleic acid sequences), 및 복제 상호 관련성(clonal relatedness)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 파라미터와 조합되어, 펩타이드 단편에 의한 면역글로불린 사슬 또는 그의 단편의 아미노산 서열 커버리지에 근거하여 이루어진다.

다양한 실시형태에서, 핵산 서열 및 핵산 서열로부터 유래된 정보 (예를 들어, 뉴클레오타이드 서열, 예측된 아미노산 서열, 및 예측된 질량 스펙트럼을 포함함)는 유전 물질 데이터베이스(genetic material database)에 놓여진다.

일부 실시형태에서, 핵산 서열이 얻어지는 동물은 항원에 노출된 동물이다.

일부 실시형태에서, 동물로부터 다중 면역글로불린의 면역글로불린 사슬 (또는 그의 가변 영역)을 코딩하는 상기 핵산 서열에 의해 코딩되는 예측된 아미노산 서열은 (1) 상기 동물로부터의 백혈구로부터 핵산 분자를 분리하고; (2) 면역글로불린 사슬 (또는 그의 가변 영역)-코딩 핵산 분자에 인접한 폴리뉴클레오타이드 서열에 특이적인 프라이머를 이용하여 면역글로불린 사슬 (또는 그의 가변 영역)-코딩 핵산 분자를 증폭하고; (3) 동물로부터의 다중 면역글로불린의 면역글로불린 사슬 (또는 그의 가변 영역)을 코딩하는 상기 증폭된 핵산 분자의 뉴클레오타이드 서열을 얻고; 및 (4) 유전 코드(genetic code)를 이용하여 상기 뉴클레오타이드 서열을 예측된 아미노산 서열로 번역함으로써 얻어진다.

일부 실시형태에서, 핵산 서열은 발현된 핵산 서열이다(예를 들어, 동물의 세포에서, RNA로 전사된 및/또는 단백질로 번역된다).

일부 실시형태에서, 동물로부터 다중 면역글로불린의 면역글로불린 사슬 (또는 그의 가변 영역)을 코딩하는 핵산 분자에 의해 코딩되는 예측된 아미노산 서열은: (1) 상기 동물로부터의 백혈구로부터 핵산 분자를 분리하고; (2) 면역글로불린 사슬 (또는 그의 가변 영역)-코딩 핵산 분자에 인접한 폴리뉴클레오타이드 서열에 특이적인 프라이머를 이용하여 면역글로불린 사슬 (또는 그의 가변 영역)-코딩 핵산 분자를 시퀀싱(sequencing)하여, 동물로부터 다중 면역글로불린의 면역글로불린 사슬 (또는 그의 가변 영역)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 얻고; 및 (3) 유전 코드를 이용하여 핵산 서열을 아미노산 서열로 번역함으로써 얻어진다. 일부 실시형태에서, 핵산 분자는 RNA 분자이며, 상기 증폭 단계는 초기 역전사 단계를 포함한다.

일부 실시형태에서, 면역글로불린 사슬 (또는 그의 가변 영역)-코딩 핵산 분자에 인접한 폴리뉴클레오타이드 서열은 게놈 DNA 플랭킹 면역글로불린 유전자(genomic DNA flanking immunoglobulin genes), 면역글로불린 사슬 불변 영역-코딩 폴리뉴클레오타이드 서열(immunoglobulin chain constant region-encoding polynucleotide sequences), 및 면역글로불린 사슬 프레임워크 영역-코딩 폴리뉴클레오타이드 서열(and immunoglobulin chain framework region-encoding polynucleotide sequences)로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 실시형태에서, 예측된 질량 스펙트럼 정보는 하기 단계를 포함하는 방법을 이용하여 얻어진다: (ⅰ) 일 이상의 프로테아제(proteases) 및/또는 일 이상의 화학적 단백질 절단 시약(chemical protein cleavage reagents)에 의해, 핵산 분자의 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 예측된 아미노산 서열의 이론적인 소화(digestion)를 수행하여, 가상(vitual) 펩타이드 단편을 생성하는 단계; 및 (ⅱ) 상기 가상 펩타이드 단편의 예측된 질량 스펙트럼을 생성하는 단계.

일부 실시형태에서, 펩타이드 단편의 관찰된 질량 스펙트럼 정보는 하기 단계를 포함하는 방법을 이용하여 얻어진다: (ⅰ) 항원에 특이적으로 결합하는 폴리클로날 면역글로불린의 집단을 분리하는 단계; (ⅱ) 일 이상의 프로테아제 및/또는 일 이상의 화학적 단백질 절단 시약에 의해, 상기 집단을 소화하여 단편을 생성하는 단계; 및 (ⅲ) 상기 펩타이드 단편의 질량 스펙트럼 정보를 얻는 단계. 일부 실시형태에서, 폴리클로날 항체의 집단은 하기 단계를 포함하는 방법을 이용하여 분리된다: (1) 동물로부터 체액 또는 그의 분획 (예를 들어, 혈액, 혈청 및/또는 혈장)을 얻는 단계; (2) 항원에 특이적으로 결합하는 면역글로불린이 항원에 부착하게 되는 조건하에서 체액 또는 그의 분획을 항원 위로 지나게 하는 단계; 및 (3) 상기 항원에 부착된 상기 면역글로불린을 수집하여, 항원에 특이적으로 결합하는 폴리클로날 면역글로불린의 집단을 얻는 단계. 일부 실시형태에서, 항원은 고형 지지체에 부착된다 (예를 들어, 항원은 고형 지지체에 공유적으로 또는 비공유적으로 결합된다). 일부 실시형태에서, 고형 지지체는 비드 (예를 들어, 아가로스 또는 마그네틱 비드), 컬럼의 벽, 또는 플레이트의 하부 (예를 들어, 조직 배양 플레이트)일 수 있다.

일부 실시형태에서, 동물은 이전에 항원에 노출된 동물이다. 일부 실시형태에서, 이전에 항원에 노출된 동물은 이전에 항원에 의해 면역된 동물이다.

다른 측면에서, 본 발명은 항원에 특이적으로 결합하는 면역글로불린의 면역글로불린 사슬 가변 영역의 아미노산을 서열을 얻는 방법을 제공하며, 이 방법은 (a) 동물의 다중 면역글로불린의 면역 글로불린 가변 영역을 코딩하는 핵산 서열을 제공하는 단계; (b) 항원에 특이적으로 결합하는 폴리클로날 면역글로불린의 집단의 면역글로불린 사슬 가변 영역의 펩타이드 단편의 질량 스펙트럼 정보를 얻는 단계; (c) 펩타이드 단편의 질량 스펙트럼 정보를 핵산 서열의 예측된 질량 스펙트럼 정보와 서로 연관시켜, 펩타이드 단편을 포함하는 면역글로불린 사슬 가변 영역의 아미노산 서열을 얻는 단계, 여기에서 상기 예측된 질량 스펙트럼 정보는 상기 핵산 서열에 의해 코딩되는 예측된 아미노산 서열로부터 유래됨; 및 (d) 펩타이드 단편에 의한 가변 영역의 아미노산 서열 커버리지에 근거하여, 동정된 면역글로불린 사슬 가변 영역의 뉴클레오타이드 서열 또는 아미노산 서열로부터 선택하여, 항원에 특이적으로 결합하는 면역글로불린의 가변 영역의 뉴클레오타이드 서열 또는 아미노산 서열을 얻는 단계를 포함한다.

일부 실시형태에서, 본 방법은 (e) 항원에 특이적으로 결합하는 면역글로불린의 면역글로불린 사슬 가변 영역을 분리하기 위하여, 면역분석에 의해, 상기 면역글로불린 사슬 가변 영역의 아미노산 서열을 스크리닝하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 단계 (d)에서 얻어진 면역글로불린 사슬 가변 영역의 뉴클레오타이드 서열 또는 아미노산 서열은 단계 (e) 스크리닝 단계 이전에, 재조합 분자 생물학 기술 또는 유전자 합성 기술에 의해 합성된다. 일부 실시형태에서, 단계 (d)에서 생성된 면역글로불린 사슬 가변 영역은 항원에 특이적으로 결합하는 면역글로불린의 항체 결합 도메인(antibody binding domain)을 생성하기 위하여 제2 면역글로불린 사슬 가변 영역에 어셈블링된다. 일부 실시형태에서, 면역분석은 유동 세포 계수 분석, 효소 결합 면역흡착 분석 (ELISA), 웨스턴 블롯 분석, 면역조직화학적 분석, 면역형광 분석, 방사면역 분석, 중화 분석, 결합 분석, 친화성 분석, 및 단백질 또는 펩타이드 면역침강반응 분석으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 실시형태에서, 면역글로불린 사슬 가변 영역은 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역이다.

다른 측면에서, 본 발명은 항원에 특이적으로 결합하는 면역글로불린의 항원 결합 도메인을 생성하는 방법을 제공하며, 이 방법은: (a) 동물로부터 다중 면역글로불린의 면역글로불린 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산 서열을 제공하는 단계; (b) 항원에 특이적으로 결합하는 폴리클로날 면역글로불린의 집단의 면역글로불린 중쇄 및 면역글로불린 경쇄의 펩타이드 단편의 질량 스펙트럼 정보를 얻는 단계; (c) 펩타이드 단편의 질량 스펙트럼 정보를 핵산 서열의 예측된 질량 스펙트럼 정보와 서로 연관시켜, 펩타이드 단편을 포함하는 면역글로불린 사슬 가변 영역의 뉴클레오타이드 서열 또는 아미노산 서열을 얻는 단계, 여기에서 상기 예측된 질량 스펙트럼 정보는 상기 핵산 서열에 의해 코딩되는 예측된 아미노산 서열로부터 유래됨; (d) 펩타이드 단편에 의한 가변 영역의 아미노산 서열 커버리지에 근거하여, 동정된 면역글로불린 사슬 가변 영역의 뉴클레오타이드 서열 또는 아미노산 서열로부터 선택하여, 항원에 특이적으로 결합하는 면역글로불린의 가변 영역의 뉴클레오타이드 서열 또는 아미노산 서열을 얻는 단계; 및 (e) 선택된 면역글로불린 중쇄 가변 영역과 선택된 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 어셈블링하여 항원에 특이적으로 결합하는 면역글로불린의 항원 결합 도메인을 생성하는 단계를 포함한다.

본 발명의 모든 측면의 다양한 실시형태에서, 동물은 척추동물이다. 다양한 실시형태에서, 동물은 포유동물이다. 일부 실시형태에서, 동물은 인간이다. 일부 실시형태에서, 동물은 쥐, 토끼 또는 생쥐이다. 일부 실시형태에서, 동물은 조류, 길들인 동물, 반려 동물, 가축, 설치류, 또는 영장류이다. 일부 실시형태에서, 동물은 인간이 아닌, 형질전환 동물, 예를 들어, 인간 항체 서열을 발현하거나, 및/또는 적어도 부분적으로 인간인 항체를 생성하는, 인간이 아닌, 형질전환 동물이다.

다양한 측면에서, 본 발명은 또한 본 발명의 다양한 비제한적 실시형태에 따라 분리 또는 생성된, 항원에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 (또는 그의 가변 영역), 또는 항원에 특이적으로 결합하는 면역글로불린의 면역글로불린 사슬 가변 영역 또는 항원 결합 도메인을 제공한다. 다양한 실시형태에서, 항원에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 (또는 그의 가변 영역), 또는 항원에 특이적으로 결합하는 면역글로불린의 면역글로불린 사슬 가변 영역 또는 항원 결합 도메인은 분리되거나 재조합된다. 다양한 실시형태에서, 본 발명은 또한 본 발명의 다양한 비제한적 실시형태에 따라 분리 또는 생성된, 항원에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 (또는 그의 가변 영역), 또는 항원에 특이적으로 결합하는 면역글로불린의 면역글로불린 사슬 가변 영역 또는 항원 결합 도메인, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 제공한다.

다른 측면에서, 본 발명은 질병 항원에 의해 특징지워지는 질병을 갖는, 또는 질병을 갖는 것으로 의심되는 동물의 치료 방법을 제공하며, 이 방법은 유효량의 본 발명의 다양한 실시형태에 따른 조성물을 투여하는 것을 포함하며, 상기 조성물의 면역 글로불린 (또는 그의 가변 영역), 또는 면역글로불린 사슬 가변 영역 또는 항원 결합 도메인에 의해 특이적으로 결합된 항원과 질병 항원은 동일하다. 일부 실시형태에서, 동물은 인간이다. 일부 실시형태에서, 동물은 설치류, 가축, 길들인 동물, 반려 동물, 또는 영장류이다.

다른 측면에서, 본 발명은 질병 항원의 동물에서의 존재에 의해 특징지워지는 질병의 동물에서의 발생 가능성을 감소시키는 방법을 제공하며, 이 방법은 유효량의 본 발명의 다양한 실시형태에 따른 조성물을 투여하는 것을 포함하며, 상기 조성물의 면역 글로불린 (또는 그의 가변 영역), 또는 면역글로불린 사슬 가변 영역 또는 항원 결합 도메인에 의해 특이적으로 결합된 항원과 질병 항원은 동일하다. 일부 실시형태에서, 조성물은 보조제를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 동물은 인간이다. 일부 실시형태에서, 동물은 설치류, 가축, 길들인 동물, 반려 동물, 또는 영장류이다.

도 1은 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 항체의 개략도이다. 2개의 중쇄는 항체의 경첩 영역(hinge region)에 위치한 2개의 디설파이드 결합에 의해 서로 연결된다. 각각의 경쇄는 단일 디설파이드 결합을 통하여 중쇄에 연결된다. 항원 결합 부위는 중쇄 및 경쇄의 N-말단에서 생성된다.
도 2는 본 발명의 다양한 실시형태의 비제한적 방법의 실시예를 나타내는 개략 다이어그램이다. 이 실시예에서, B 림프구를 포함하는 샘플 (예를 들어, 혈액 샘플 또는 조직 샘플) 및 혈청 및/또는 혈장은 동일한 동물 (예를 들어, 인간, 생쥐, 또는 토끼)로부터 수집된다. 면역글로불린 사슬 (또는 그의 가변 영역)을 코딩하는 핵산 분자는 시퀀싱되고, 이 핵산 서열은, 이 핵산 서열에 의해 코딩되는 예측된 아미노산 서열에 근거하여 이론적 또는 예측된 질량 스펙트럼 정보를 생성하는데 이용된다. 혈청으로부터의 폴리클로날 항체는 단백질 가수분해적으로 소화되거나, 또는 화학적으로 절단되며, 수득된 펩타이드 단편은 질량 분광분석에 의해 분석된다. 핵산 서열로부터의 정보 (예를 들어, 질량 스펙트럼)는 펩타이드 단편의 질량 스펙트럼 정보와 비교되어, 항체의 면역글로불린 사슬 (또는 그의 가변 도메인)의 서열을 동정한다. 이어서, 이 항체는 표준 방법에 따라 재조합적으로 생성될 수 있다.
도 3은 본 발명의 다양한 실시형태의 비제한적 방법의 다른 실시예를 나타내는 개략 다이어그램이다. 이 실시예에서, B 림프구 및 혈청 및/또는 혈장은 동일한 동물 (이 경우, 토끼)로부터 수집된다. B 림프구로부터, mRNA가 추출되어, 면역글로불린 유전자-특이적 시퀀싱 프라이머를 이용하여, 454 Life Sciences로부터 상업적으로 입수가능한 Genome Sequencer FLX System을 이용하여 시퀀싱된다. 이 정보는 예측된 아미노산 서열에 근거하여 이론적 질량 스펙트럼을 생성하는데 이용된다. 혈청 및/또는 혈장으로부터, 폴리클로날 항체가 분리되어, 프로테아제에 의해 소화되거나, 및/또는 화학적 단백질 절단 시약에 의해 소화된다. 수득된 펩타이드 단편은 액체 크로마토그래피에 의해 분리된 후, 질량 분석된다 (MS/MS). 펩타이드 단편의 질량 스펙트럼은 핵산 서열의 이론적 질량 스펙트럼과 서로 연관되어, 펩타이드 단편을 포함하는 면역글로불린 사슬의 아미노산 서열을 얻는다. 이어서, 중쇄 및 경쇄는 어셈블링되어, 면역글로불린 사슬을 코딩하는 핵산 서열을 발현 벡터로 클로닝하고, 발현 벡터를 세포에서 발현시킴으로써 재조합 면역글로불린을 생성한다. 이어서, 발현된 재조합 면역글로불린은 특성화된다.
도 4는 본 발명의 다양한 실시형태의 비제한적 방법의 다른 실시예를 나타내는 개략 다이어그램이다. 이 실시예에서, 비제한적 B 세포 근원 (예를 들어, 비장 세포) 및 폴리클로날 항체는 동일한 동물 (예를 들어, 인간, 생쥐, 또는 토끼)로부터 수집된다. 핵산 분자는 B 세포 근원으로부터 추출되어, 면역글로불린 유전자-특이적 시퀀싱 프라이머에 의해 Roche 454 기계를 이용하여 차세대 시퀀싱 (next generation sequencing, "NGS")된다. 유전 물질 데이터베이스에 넣어질 수 있는 이 정보는 핵산 서열에 의해 코딩되는 예측된 아미노산 서열에 근거하여 이론적 질량 스펙트럼을 생성하는데 이용될 수 있다. 또한, 동물 (예를 들어, 인간, 생쥐, 또는 토끼)로부터, 폴리클로날 항체 (또는 그의 펩타이드 단편)는 분석을 위하여 질량 분석계에 탑재된다. 핵산 서열은 서열의 가변 영역 (예를 들어 CDR 영역 또는 FR 영역의 하나)의 서열을 동정하기 위하여, Kabat 규칙을 이용하여 분석된다. 이어서, 예측된 아미노산 서열로부터 가변 영역의 전부 또는 일부와 매치(match)되는 펩타이드를 동정하기 위하여, 분석된 폴리클로날 항체로부터 펩타이드 단편의 서열이 스크리닝된다.
도 5는 가변 영역에 걸쳐, 우수한 질량 분석 상관관계를 갖는 중쇄 및 경쇄 NGS (즉, 차세대 시퀀싱) 서열 및 펩타이드를 나타내는 표이다. 이러한 펩타이드의 일부는 매우 자주 나타났으며 (예를 들어, 경쇄 ref. no. G623FKB01A3GC7 참조), 일부는 높은 핵산 서열 빈도수(frequency count)를 가졌다 (예를 들어, 경쇄 ref. no. G623FKB01AXJ1C 참조). 굵은 이탤릭체의 열은 시험 시에 항원에 특이적으로 결합된 서열을 함유하는 것으로 확인된 면역 면역글로불린 사슬을 나타낸다 (도 6의 시험 결과 참조).
도 6은 p-Erk 펩타이드로 코팅된 ELISA 플레이트에 대하여 스크리닝된, 본 발명의 비제한적 방법을 이용하여 만들어진 항체를 시험하는 ELISA 분석의 결과를 나타내는 표이다. 도 5에 나타내어진 상이한 경쇄 및 중쇄는 서로 무작위로 결합되었다. 도 6으로부터 보여질 수 있는 바와 같이, 다수의 페어링(pairings)에 의해 p-ERK-코팅된 플레이트에 특이적으로 결합할 수 있는 항체에 이르렀다 (음영으로 나타내어진 양성 항체).
도 7은 p-MET 항원에 의해 면역된 토끼의 비장 세포로부터 생성된 cDNA로부터의 중쇄 및 카파 및 람다 경쇄의 RT-PCR 반응 (즉, 역전사 효소 중합효소 연쇄 반응)의 결과를 나타내는 아가로스 겔의 사진 표현이다.
도 8은 핵산 서열로부터 유래된 이론적 (즉, 예측된) 질량 스펙트럼을 친화성 정제된 항체로부터의 LC-MS/MS 데이터와 결합한 후, 항체 사슬의 서열을 나타내는 표이다. NGS 빈도에 근거한 항체 사슬 풍부도(abundance)도 표시되었다. 이탤릭체로 표시된 사슬이 합성되어 항체로 어셈블링되었으며; 굵은 이탤릭체로 표시된 사슬은 웨스턴 블롯 분석에 의한 시험 시에, p-MET 항원에 특이적으로 결합하는 것으로 나타났던 것들이다.
도 9는 본 발명의 비제한적 방법을 이용하여 생성된 2종의 상이한 토끼 항체 (1 및 2로 표지된 블롯) 및 대조군 항체 (제일 왼쪽의 블롯)에 의해, 비처리된 헬라 세포(Hela cells) (모든 3개의 블롯에서 - 레인) 또는 인간 성장 인자 (HGF)로 처리된 헬라 세포 (모든 3개의 블롯에서 + 레인)로부터 제조된 용해물을 조사한 웨스턴 블롯 실험의 결과를 나타내는 사진 표현이다. 웨스턴 블롯에 의한 양성 결과에 따라, 항원 특이적 항체 (중쇄 및 경쇄 페어링)가 동정되었다. 나타내어진 바와 같이, 레인 1 및 2 양자 모두에서 동정된 항체는 동일한 중쇄를 이용하였으나, 상이한 경쇄를 가졌다. 2개의 토끼 항체의 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열은 웨스텃 블롯 결과 아래에, 밑줄친 중쇄 및 경쇄의 CDR3 영역에 의해 나타내어진다.
도 10a 내지 10e. 프로게스테론 수용체-특이적 폴리클로날 토끼 IgG의 친화성 정제(Affinity purification). (a) 면역된 토끼로부터 혈청으로부터의 총 IgG는 단백질 A에 의해 분리되었고, 중력 유동(gravity flow)에 의해 고정된 항원 펩타이드에서 추가적으로 친화성 정제되었다. 비특이적 IgG를 감소시키기 위하여 광범위하게 세척한 후에, 점진적으로 산성인 pH에 의한 순차적 용리(sequential elution)가 항원-특이적 폴리클로날 IgG를 분별하기 위하여 이용되었다. 각각의 분획은 T47D 세포(+)로부터의 용해물에서 PR A/B을 검출하기 위하여, 매치된 항체 농도 (21.5ng/ml)에서 웨스턴 블롯팅에 의하여 특이적 활성(specific activity)에 대하여 시험되었다. HT1080(-)로부터의 음성 대조군 용해물도 시험되었다. (b) 가장 높은 특이적 활성을 갖는 pH 1.8의 분획이 LC-MS/MS 분석을 위하여 4종의 프로테아제로 처리되었다. (c) 5.560의 XCorr 및 0.39ppm의 ΔM (관찰된 m/z - 예측된 m/z)를 갖는, CDRH3를 함유하는 (밑줄) V 영역 전체 트립신 분해 펩타이드 (V-region full tryptic peptides) GFALWGPGTLVTVSSGQPK (SEQ ID NO: 305)에 대하여 SEQUEST에 의해 매치된 MS/MS 스펙트럼. (d) MS/MS 스펙트럼은 SEQUEST에 의해 V 영역 펩타이드에 대하여 맵핑되고, ≤2%의 FDR로 여과되었다. 이어서, 샘플 제조에 이용된 프로테아제를 고려하고, 펩타이드의 총 수, 펩타이드의 특유한 수, 스펙트럼 점유율 및 전체 V 영역의 아미노산 커버리지를 파악하여, 높은 신뢰도(confidence) 펩타이드는 NGS에 의해 생성된 V 영역 데이터베이스에 대하여 재맵핑되었다. 높은 커버리지 V 영역 서열이 선택되고, 모노클로날 항체로서 발현되며, 원하는 활성에 대하여 스크리닝되었다. (e) 클론 F9의 중쇄 및 경쇄 서열 동정 커버리지. 페어링되는 경우, 표시된 V 영역 서열은 인간 PR A/B에 특이적으로 결합한다 (도 11a 내지 11e 참조). 일 이상의 펩타이드에 의해 배치된 아미노산은 굵은 글씨체로 나타내어진다. V 영역 커버리지를 최대화하고, 매우 가변적인 아미노산 조성물을 설명하기 위하여, 상보적 프로테아제가 이용되었다 (키모트립신, 엘라스타아제, 펩신, 트립신).
도 11a 내지 11e. 프로게스테론 수용체 A/B에 대한 기능적 모노클로날 항체의 동정 및 특성화. (a) 중쇄 및 경쇄의 결합 페어링(Combinatorial pairing)에 의해 황색으로 표시된 12개의 항원 특이적 ELISA-반응성 클론이 수득되었다. CDR3 서열이 식별자로서 이용된다: √는 웨스턴 블롯-양성 클론을 나타낸다 (도 11b 참조). (b) 6개의 클론 (F1 F9, H1, C1, F7, 및 H9)은 웨스턴 블롯팅에 의한 프로게스테론 수용체 A/B 검출에 대하여 특이적이었다. 클론 E6 (ELISA-음성, 웨스턴-음성) 및 H7 (ELISA-양성, 웨스턴-음성)이 대조군으로서 나타내어진다. +, T47D (PR A/B-양성); -, MDA-MB-231 (PR A/B-음성). 모든 항체는 21.5 ng/mL에서 시험되었다. (c) 면역조직화학에 의한 친화성-정제된 폴리클로날 혼합물에 대한 클론 F9의 특이적 활성의 비교. 0.4 ug/mL의 F9은 PR A/B-양성조직 또는 세포주 (T47D 및 MCF-7)를 특이적으로 염색하였으나, PR A/B-음성 세포주 (MDA-MB-231)는 그렇지 않았다. 0.2 ㎍/mL의 폴리클로날 항체가 양성 대조군으로서 이용되었다. (d) 유동세포 계수 분석. 청색, T47D 세포 (프로게스테론 수용체 A/B 양성세포주); 흑색, MDA-MB-231 (프로게스테론 수용체 A/B 음성 세포주). 폴리클로날 항체 신호/잡음 비(signal/noise ratio), 1.69; 농도, 3.7 ㎍/mL. 모노클로날 항체 F9 신호/잡음 비 = 36.4; 농도 0.5 ㎍/mL. (e) 공초점 면역형광 현미경 분석은 프로게스테론 수용체 A/B 양성세포주 MCF-7에서 특이적인 핵 염색 패턴을 나타내었으나, 0.46 ㎍/mL MDA-MB-231 세포에서는 그렇지 않았다. 일차적인(primary) 항체는 배경 염색 대조군(background staining control)으로서 포함되지 않았다. 폴리클로날 항체도 1.85 ㎍/mL의 농도에서 비교로 사용되었다.
도 12a 내지 12d. 클론 C3 anti-Lin28A 모노클로날 항체의 특성화. (a) 중쇄와 경쇄의 결합 페어링에 의해 음영으로 표시된 5개의 항원-특이적 ELISA-반응성 클론이 수득되었다. √는 웨스턴 블롯-양성 클론을 나타낸다. CDR3 서열이 식별자로서 이용된다. (b) 웨스턴 블롯 분석은 다양한 Lin28A 양성 세포 용해물, NCCIT, NTERA, mMES, 및 IGROV1을 이용하여 수행되었다. (c) 공초점 면역형광 분석은 Lin28A 음성 세포 (HeLa) 및 Lin28A 양성세포 (NTERA)에 의해 수행되었다. (d) 모노클로날 항체의 유동 세포 계수 분석. 왼쪽 피크, 헬라 세포 (Lin28A -); 오른쪽 피크, NTERA 세포 (Lin28A +). *V 영역은 동일한 CDR3 서열을 가졌으나 V 영역 서열은 동일하지 않다.
도 13a 내지 13c. phospho-Erk에 대한 기능적 생쥐 모노클로날 항체의 동정 및 특성화. (a) 3마리의 생쥐로부터 합병된 혈청으로부터의 phospho-Erk 폴리클로날 항체의 정제. 합병 혈청, 합병 혈청으로부터의 단백질 G-정제된 총 IgG, 단백질 G 정제로부터 비결합된 분획, 및 pH 3.5, 2.7, 및 1.8의 산성 용리 분획은 Jurkat 세포 용해물에서 phospho-Erk에 대한 결합 특이성에 대하여 웨스턴 블롯팅에 의해 분석되었다. +, TPA에 의해 자극된 Jurkat 세포; -, U0126에 의해 처리된 Jurkat 세포. (b) 중쇄와 경쇄의 결합 페어링에 의해 펩타이드 항원 ELISA에 의해 반응성인, 음영으로 표시된 15개의 클론을 수득하였다. √은 웨스턴 블롯-양성 클론을 나타낸다 ((c) 참조). CDR3 서열은 식별자로 이용된다. 중쇄 서열에 있어서, 밑줄친 부분은 프레임워크 영역(Frame Work Region) 3의 끝을 표시한다. (c) 3개의 클론 (C10, F10 및 M3)은 웨스턴 블롯팅에 의한 phospho-Erk 검출에 특이적이었다. 클론 C9 (ELISA 양성, 웨스턴-음성)은 대조군으로서 나타내어진다. 모든 항체는 100 ng/mL에서 시험되었다.

본 개시는 대상 항원에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체의 아미노산 서열 (및 코딩 핵산 서열)을 신속하고 정확하게 얻는 방법 및 시스템에 관한 것이다. 더욱 상세하게, 본 방법론은 동물 혈청으로부터의 폴리클로날 항체를, 전장 면역글로불린 사슬 또는 가변 영역을 코딩하는 핵산 분자로 구성되는 유전 물질 데이터베이스에 대하여 순환(circulate)시키는 직접적인, 질량분석 기반의 단백질군(proteomic) 조사를 수반한다. 특정 실시형태에서, 유전 물질 데이터베이스는 핵산 시퀀싱 기술을 이용함으로써 동물 (예를 들어, 폴리클로날 항체를 얻기 위하여 혈청이 수집되는 동물과 동일한 동물)의 B 세포 레퍼토리(repertoire)로부터 생성된다. 따라서, 본 접근은 2개의 근원으로부터 정보: 동물의 폴리클로날 항체의 실제 순환으로부터의 질량 스펙트럼 정보 및 유전 물질 데이터베이스로부터의 정보 (예를 들어, 예측된 질량 스펙트럼을 포함)를 서로 연관시키는 것 (즉, 상호 비교(cross-comparing), 또는 상호 참조(cross-referencing))를 본질적으로 포함한다. 중쇄 및 경쇄 DNA 서열은 혈청으로부터의 실제 항체에 해당하는 유전 물질 데이터베이스로부터 동정될 수 있다. 그러한 중쇄 및 경쇄는 기능적 모노클로날 항체를 얻기 위하여 둘씩 짝을 지어 발현될 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 방법론은 B 세포 불멸화, 단일 세포 분류(sorting) 및 분자 클로닝(molecular cloning), 또는 파지 디스플레이(phage display)를 필요로 하지 않으며, 추측에 근거한 항체 서열의 어셈블리(assembly)를 포함하지 않는다. 질량 분석 기술 및 핵산 시퀀싱 기술 (차세대 DNA 시퀀싱 또는 NGS과 같은)의 힘을 모두 이용함으로써, 본 발명의 접근은 폴리클로날 집단으로부터 항원-특이적 모노클로날 항체의 서열을 분리하는데 요구되는 시간을 크게 감소시킬 수 있으며, 이에 의해 치료학적으로 이용될 수 있는 완전한 인간 항체 또는 인간화된 항체 (예를 들어, 인간화된 쥐 항체)와 같은 재조합 항체로 더 신속하게 전이될 수 있다.

또한, 본 방법론은 현존하는 기술에 의해 놓치기 쉬운 희귀한 항체를 동정할 수 있다. 본 발명자들은 매우 높은 선택적인 특이성을 갖는 개별적인 항체 (예를 들어 폴리펩타이드 내에서 인산화된 티로신 잔기에 특이적으로 결합하는 항체)가 폴리클로날 집단 내에 매우 드물게 나타날 수 있음을 놀랍게도 발견하였다. 그 가변 사슬이 매우 낮은 빈도로 발생하기 때문에, 항체-코딩 mRNAs의 빈도 및 PCT 증폭에 의존하는 방법은 이러한 항체를 놓칠 수 있다. 반대로, 본 방법론은 예를 들어, 폴리클로날 항체 집단으로부터 유래된 실제 펩타이드 단편의 질량 분석 기반 단백질군 분석을 이용하므로, PCR 증폭 후의 빈도의 오류(errors of frequency)를 겪지 않는다.

또한 본 방법론에 의하여 출발 폴리클로날 집단에는 존재하지 않을 수 있는 새로운 항원-특이적 항체의 신속한 생성이 가능하게 된다. 예를 들어, 가장 바람직한 품질 (예를 들어, 항원 또는 원하는 아이소타입 (예를 들어, IgG2a)에 대한 가장 높은 결합 친화성 (또는 가장 낮은 KD))를 갖는 생성된 면역글로불린 분자는 폴리클로날 집단에서 제1 항체로부터의 경쇄가 폴리클로날 집단에서 제2 항체 (즉, 제1 항체와 상이한)로부터의 중쇄와 어셈블링된 결과일 수 있다.

본 명세서에 개시된 방법은 기본 면역학 및 치료학에서의 응용을 갖는다. 예를 들어, 본 방법은 혈청 항체 다양성, 역학, 동역학, 클론형성능(clonality), 및 항원 노출 후의 B 세포의 이동(migration)을 포함하는 면역학 분야의 중심적인 문제를 이해하는데 있어 기준을 제공한다. 본 방법은 또한 면역된, 자연적으로 감염된, 또는 질병이 있는 개체로부터 치료학적으로 관련 있는 인간 모노클로날 항체를 추구하는데 이용될 수 있다.

본 명세서에 입증된 바와 같이, 본 방법론은 실험 동물 종 및 인간 모두에서 몇몇 상이한 항원에 대하여 성공적으로 적용되었으며, 면역된 대상의 혈청에서 발견되는 본래의 친화성-정제된 폴리클로날 항체의 활성을 반복 또는 초과하는 항원-특이적 활성을 갖는 모노클로날 항체의 분리에 이르게 되었다.

따라서, 본 개시는 또한 질병 항원에 대하여 특이적인 치료학적 항체를 포함하는, 항원에 대하여 특이적인 분리된 재조합 모노클로날 항체, 및 치료학적 모노클로날 항체의 투여에 근거하여 질병을 치료하는 치료학적 방법을 제공한다.

본 발명의 다양한 측면 및 실시형태는 하기에 상세하게 서술된다. 본 명세서에 참조된 특허, 공개된 출원 및 학술 문헌은 당해 기술분야의 통상의 기술자의 지식을 수립하며, 각각 참조로 포함되는 것으로 특별하게 개별적으로 표시되는 것과 같은 정도로 전체적으로 참조로 포함된다. 본 명세서에 인용된 임의의 참고문헌과 본 명세서의 특정한 교시 사이에 임의의 갈등은 후자의 이익을 위하여 해결되어야 한다. 유사하게, 단어 또는 문구의 기술분야에서 이해되는 정의와 본 명세서에서 특정하게 교시된 단어 또는 문구의 정의 사이에 임의의 갈등은 후자의 이익을 위하여 해결되어야 한다.

정의

본 명세서에 이용된 바와 같이, 하기 용어는 표시된 의미를 갖는다. 본 명세서에 이용된 바와 같이, 단수형 "a," "an" 및 "the"는 명확하게 다르게 해서되지 않으면 그들이 나타내는 용어의 복수형도 특히 포함한다. 용어 "약"은 "거의", "약", "대략" 또는 "정도"를 의미하기 위하여 본 명세서에 이용된다. 용어 "약"이 수치범위와 함께 이용되는 경우, 이는 제시된 수치범위보다 높게, 및 제시된 수치범위보다 낮게 그 경계를 확장함으로써 그 범위를 수정한다. 일반적으로, 용어 "약"은 20%의 변화량으로 언급된 수치보다 높게 및 언급된 수치보다 낮게 수치범위를 수정하기 위하여 본 명세서에서 이용된다.

"펩타이드" 또는 "펩타이드 단편(fragment)"은, 개별적인 아미노산 잔기를 서로 연결함으로써 형성되는 짧은 폴리머를 의미하며, 여기에서 하나의 아미노산 잔기와 제2의 아미노산 잔기 사이의 연결은 아마이드 결합 또는 펩타이드 결합으로 칭해진다. 펩타이드는 적어도 2개의 아미노산 잔기를 포함한다. 펩타이드는 더 짧다는 점에서 폴리펩타이드와 구별된다. 하나의 펩타이드의 C' 말단 아미노산 잔기와 제2 펩타이드의 N' 말단 아미노산 잔기 사이의 아마이드 결합 또는 펩타이드 결합에 의해 서로 연결된 적어도 2개의 펩타이드는 본 발명의 다양한 실시형태에 따라 폴리펩타이드를 형성한다.

"폴리펩타이드"는 개별적인 아미노산 잔기를 연결함으로써 형성된 긴 폴리머를 의미하며, 여기에서 하나의 아미노산 잔기와 제2 아미노산 잔기 사이의 결합은 아마이드 결합 또는 펩타이드 결합으로 칭해진다. 폴리펩타이드는 적어도 4개의 아미노산 잔기를 포함하나, 다중(multiple) 폴리펩타이드는 아마이드 또는 펩타이드 결합을 통하여 서로 연결되어 훨씬 더 긴 폴리펩타이드를 형성할 수 있다.

"핵산 분자"는 개별적인 뉴클레오타이드 (예를 들어, 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드)를 서로 연결함으로써 형성된 폴리머를 의미하며, 여기에서 하나의 뉴클레오타이드와 다른 뉴클레오타이드 사이의 결합은 예를 들어,인산디에스테르 결합을 포함하는 공유 결합이다. 따라서, 이 용어는 DNA, RNA, 및 DNA-RNA 하이브리드를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

"핵산 서열"은 면역글로불린 사슬의 전부 또는 일부 (예를 들어, 중쇄 또는 경쇄)를 코딩하는 뉴클레오타이드를 포함하는 핵산 서열 (또는 그에 상보적인 뉴클레오타이드 서열)을 의미한다. 일부 실시형태에서, 핵산 서열은 게놈 DNA (예를 들어, 인트론 DNA를 갖거나 갖지 않는 엑손 DNA)이다. 일부 실시형태에서, 핵산 서열은 cDNA 또는 일부 종류의 RNA (예를 들어, hn RNA, mRNA 등)이다. 일부 실시형태에서, 핵산 서열은 핵산 분자로 전사되거나 (예를 들어, RNA로 전사되는 DNA), 또는 그 핵산 서열을 함유하는 세포에서 폴리펩타이드로 번역되는, 발현된(expressed) 핵산 서열이다. 따라서, 발현된 핵산 분자는 hnRNA, mRNA, cDNA, 및 게놈 엑손(exon) 서열을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 핵산 분자 측면에서 "상보적complementary)"은 2개의 단일가닥 핵산 분자가, 이중가닥 분자가 DNA, RNA 또는 DNA-RNA 하이브리드이든지, 아니든지, 이중가닥 핵산 분자를 형성하기 위하여 표준 Watson-Crick 염기쌍을 형성하는, 뉴클레오타이드를 함유하는 것을 단순히 의미한다.

본 명세서에 이용된 바와 같이, "B 림프구"는 유전자 재조합 (또는 유전자 재배열)이 면역글로불린 사슬-코딩 유전자를 함유하는 위치(locus)에서 발생하기 시작하는 임의의 백혈구를 의미한다. 예를 들어, 인간 면역글로불린 유전자는 14번 염색체(중쇄 위치), 2번 염색체(카파 경쇄 위치), 및 22번 염색체(람다 경쇄 위치)에서 발생한다. 인간 백혈구가 면역글로불린 사슬 위치 (예를 들어, 14번 염색체, 2번 염색체, 또는 22번 염색체 상)에서 유전자 재배열 사례를 겪게 되면, 그 세포는 B 림프구로 여겨진다. 따라서, B 림프구는 B 세포, 전-B 세포(pre-B cells), 초기 프로-B 세포(early pro-B cells)(예를 들어, 중쇄 유전자의 D 및 J 영역은 재배열을 겪는 반면, 경쇄 유전자는 생식계열(germline)인(즉, 재배열되지 않는) 경우) 및 후기 프로-B 세포(late pro-B cells)(예를 들어, 중쇄 유전자의 V, D, 및 J 영역은 재배열되는 반면, 경쇄 유전자는 여전히 생식계열이며, 면역글로불린 단백질이 세포 표면에서 발현되지 않는 경우)를 포함하는 프로-B 세포(pro-B cells), 대형 전-B 세포(large pre-B cells) 및 소형 전-B 세포(small pre-B cells)를 포함하는 전-B 세포, 미성숙 B 세포(immature B cells), 활성 B 세포(active B cells), 배중심 B 세포(germinal center B cells), 형질 세포(plasma cells)(형질아세포를 포함함), 및 기억 B 세포(memory B cells)를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서 및 청구항 전체에서, 용어 "항체" 및 "면역글로불린"은 상호 교환적으로 사용되며, 영장류 (예를 들어, 인간 또는 침팬지), 설치류 (예를 들어, 생쥐 또는 쥐), 토끼목 포유동물 (예를 들어, 토끼 또는 토끼(hares)), 가축 (예를 들어, 소, 말, 염소, 돼지, 및 양), 어류 (예를 들어, 상어), 조류 (예를 들어, 닭) 또는 카멜리드(camelids)(예를 들어, 낙타 또는 라마)와 같은 임의의 종의 동물로부터, 또는 인간 항체를 생산하도록 유전자공학에 의해 생성된 형질전환된 비-인간 동물로부터, 임의의 아이소타입 또는 서브-아이소타입의 무손상 면역글로불린 폴리펩타이드 분자 (예를 들어, IgG, IgG1, IgG2, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgG4, IgM, IgD, IgE, IgE1, IgE2, IgA)(see, 예를 들어, Lonberg et al., WO93/12227; US 5,545,806; Kucherlapati, et al., WO91/10741; US 6,150,584; US 2009/0098134; US 2010/0212035; US 2011/0236378; US 2011/0314563; WO2011/123708; WO2011/004192; WO2011/158009 참조); Fab, Fab', F(ab')₂와 같은 그의 항원 결합 도메인 단편(antigen binding domain fragments); scFv, Fv, Fd, dAb, 이중특이성(bispecific) scFvs, 디아바디(diabodies), 선형 항체(linear antibodies)와 같은 그의 변이체(variants)(US 5,641,870; Zapata et al., Protein Eng. 8 (10): 1057-1062.1995 참조); 단일 사슬 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이성(multispecific) 항체; 및 항체 결합 도메인(본 명세서에 정의된)이거나, 또는 항체 결합 도메인과 상동인 결합 도메인을 포함하는 임의의 폴리펩타이드를 포함하는 것으로 의도된다. 본 발명의 다양한 실시형태의 비제한적 항체는 폴리클로날, 모노클로날, 단일특이성(monospecific), 다특이성(polyspecific) 항체 및 그의 단편, 다른 폴리펩타이드에 융합된 면역글로불린 결합 도메인을 포함하는 키메라(chimeric) 항체, 및 불변 및/또는 FR 도메인이 인간 항체로부터의 불변 및/또는 FR 도메인으로 대체된 비-인간 항체 (예를 들어, 토끼 항체)와 같은 인간화된(humanized) 항체를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다 (예를 들어, US 5,530,101; US 5,585,089; US 5,693,761; US 5,693,762; US 6,180,370; 및 US 6,548,640 참조). 인간 (예를 들어, 적어도 부분적으로 인간) 항체를 생성하도록 유전공학적으로 생산된 형질전환 비-인간 동물은 Harbour Antibodies (Rotterdam, The Netherlands), Ablexis (San Francisco, CA), Kymab Ltd (Cambridge, UK), OMT, Inc. (Palo Alto, CA), Amgen (Thousand Oaks, CA), Medarex (Princeton, NJ), 및 Regeneron (Tarrytown, NY)로부터 상업적으로 입수가능하다.

자연 발생 무손상(intact) 항체는 폴리펩타이드 사슬의 2종의 분류, 경쇄 및 중쇄로 만들어진다. 본 발명의 다양한 측면의 비제한적 항체는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 무손상의 4개의 면역글로불린 사슬 항체일 수 있다. 항체의 중쇄는 IgM, IgG, IgE, IgA 또는 IgD를 포함하는 임의의 아이소타입, 또는 IgG1, IgG2, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgG4, IgE1, IgE2 등을 포함하는 임의의 서브-아이소타입일 수 있다. 경쇄는 카파 경쇄(kappa light chain) 또는 람다 경쇄(lambda light chai)일 수 있다. 예를 들어, 단일 IgG 자연 발생(또는 무손상) 항체는 2개의 동일한 경쇄 복제(copies) 및 2개의 동일한 IgG 중쇄 복제를 포함한다. 각각의 중쇄가 하나의 가변 도메인 (V_H) 및 하나의 불변 도메인 (C_H, 그 자체는 CH1 영역, 경첩 영역, CH2 영역 및 CH3 영역을 포함한다)을 함유하는 모든 자연 발생 항체의 중쇄는 그들의 불변 도메인 내에서 다중 디설파이드 결합을 통하여 서로 결합하여 항체의 "줄기(stem)"를 형성한다. 각각의 경쇄가 하나의 가변 도메인 (V_L) 및 하나의 불변 도메인 (C_L)을 함유하는 모든 자연 발생 항체의 경쇄는 디설파이드 결합을 통하여 하나의 중쇄 불변 도메인과 각각 결합한다. 4개의 면역글로불린 사슬 항체 (예를 들어, IgG 항체)의 개략도가 도 1에 도시된다. 도 1에서, 3개의 CH 도메인은 흐린 청색으로 도시되고, 단일 VH 도메인은 어두운 청색으로 표시되고, 단일 CL 도메인은 흐린 핑크색으로 도시되고, 단일 VL 도메인은 어두운 핑크색으로 도시된다. 도 1에 나타내어진 바와 같이, 경쇄 및 중쇄의 VL 및 VH 도메인은 각각 합쳐져서 항체 결합 도메인을 형성한다.

일부 실시형태에서, 무손상 면역글로불린 사슬 (예를 들어, 중쇄 또는 경쇄)는 5'로부터 3'으로의 순서로(사슬을 코딩하는 핵산 서열에 있어서) 또는 아미노 말단으로부터 카르복시 말단으로의 순서로(사슬의 아미노산 서열에 있어서): 가변 도메인 및 불변 도메인을 포함할 수 있다. 가변 도메인은 산재된 프레임워크 (framework, "FR") 영역과 함께, 3개의 상보성 결정 영역 (CDRs; 과가변 영역hypervariable regions) 또는 HVs로도 칭해짐)을 포함할 수 있다. 경쇄 및 중쇄의 가변 도메인은 FR4 영역에 대하여 불변 영역 3' (또는 C')를 갖는, 5' (또는 N')- FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 3' (또는 C')의 구조에 있어서 4개의 좀더 보존된 프레임워크 영역 (FR) 사이에 삽입된 3개의 과가변 영역을 함유한다. CDRs는 항체의 주요 항원 결합 표면(principal antigen binding surface)을 포함하는 루프(loops)를 형성하며 (Kabat, E. A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., (1987) 및 Wu, T.T. and Kabat, E.A. (1970) J. Exp. Med. 132: 211-250 (1970) 참조), 4개의 프레임워크 영역은 베타 시트 구조(beta-sheet conformation)를 크게 채용하고, 루프를 형성하는 CDRs는 베타 시트 구조를 연결하고, 일부 경우, 베타 시트 구조의 일부를 형성한다. 각 사슬의 CDRs는 프레임워크 영역에 매우 근접하여 유지되며, 다른 사슬로부터 CDRs과 함께 항원 결합 도메인의 형성에 기여한다.

"항원"은 항체에 의해 특이적으로 결합될 수 있는 타겟 분자 (예를 들어, 폴리펩타이드 또는 탄수화물)을 의미한다. 항체에 의해 특이적으로 결합되는 항원의 부분은 "에피토프(epitope)"로 나타내어진다. "에피토프"는 항체의 항원 결합 도메인에 의해 특이적으로 결합될 수 있는 타겟 분자의 가장 작은 부분이다. 에피토프의 최소 크기는 약 3개 내지 7개의 아미노산 (예를 들어, 5개 또는 6개의 아미노산)일 수 있다. 단일 항원 상에 다중 에피토프가 있을 수 있으므로, 단일 항원은 다중 상이한 항체에 의해 특이적으로 결합될 수 있으며, 각각의 개별적인 항체가 항원 상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하더라도 이러한 항체는 모두 항원에 특이적으로 결합한다 (즉, 이러한 항체 모두는 항원-특이적 항체이다).

"질병 항원(disease antigen)"은 질병 상태 중에 동물에서 발생하는 항원을 의미한다. 예를 들어, 바이러스 항원 (예를 들어, 바이러스의 유전 물질의 핵산 분자에 의해 코딩되는 항원)은 그 바이러스에 의해 감염된 동물의 질병 항원이다. 유사하게, 일부 질병 (예를 들어, 암)은 키메라 단백질(예를 들어, BCR-ABL)을 생산하는 유전자 전좌에 의해 특징지워진다. 따라서, BCR-ABL 단백질은 질병 항원이다. 질병 항원은 반드시 그 질병을 앓고 있는 동물에서만 나타나는 것은 아니라는 것을 이해하여야 한다.

"질병(disease)"은 동물에 영향을 미치는 임의의 비정상적 상태를 단순히 의미한다. 질병의 비제한적 예는 자가면역 질병 (예를 들어, 류마티스 관절염 또는 Ⅰ형 당뇨병), 암 (예를 들어, 백혈병, 결장암, 또는 전립선암 등), 바이러스 감염 (예를 들어, HIV 바이러스의 감염에 의해 발생된 AIDS 또는 수두 대상포진 바이러스의 감염에 의해 발생되는 수두), 기생충 감염 (예를 들어, 주혈흡충증 또는 옴), 및 박테리아 감염 (예를 들어, 결핵 또는 디프테리아)을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

"특이적으로 결합한다(specifically bind)"는 면역글로불린 또는 항체가 그 항원(즉, 그의 특이적 항원)과 상호작용하는 것을 의미하며, 여기에서 상호작용은 항원 상의 특정 구조 (예를 들어, 에피토프)의 존재에 의존한다; 다시 말하면, 항체는 모든 분자 또는 일반적인 구조에 대해서보다는 특정 구조에 대하여 인식하고 결합한다. 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 "항원-특이적 항체" 또는 "항원에 대하여 특이적인 항체"로 나타내어질 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 항원 및 다른 분자 (예를 들어, 세포 용해물)을 함유하는 용액으로부터 그 항원을 면역침강시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 그 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 1 × 10^-6 M 이하의 그 항원에 대한 K_D를 갖는다. 일부 실시형태에서, 그 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 1 × 10^-7 M 이하의 그 항원에 대한 K_D, 또는 1 × 10^-8 M 이하의 그 항원에 대한 K_D, 또는 1 × 10^-9 M 이하의 그 항원에 대한 K_D, 또는 1 × 10^-10 M 이하의 그 항원에 대한 K_D, 또는 1 × 10^-11 M 이하의 그 항원에 대한 K_D, 또는 1 × 10^-12 M 이하의 그 항원에 대한 K_D를 갖는다. 일정한 실시형태에서, 그의 특이적 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 K_D는 1 pM 내지 500 pM, 또는 between 500 pM 내지 1 μM, 또는 1 μM 내지 100 nM, 또는 100　mM 내지 10 nM이다. 본 명세서에 이용된 바와 같이, "K_D"는 2종의 분자 사이의 상호작용의 해리상수 (예를 들어, 항체와 그의 특이적 항원 사이의 해리상수)를 나타내는 것으로 의도된다.

"면역글로불린 사슬의 가변 영역" 또는 "면역글로불린 사슬 가변 영역"은 면역글로불린의 중쇄의 가변 도메인 (즉, VH 도메인) 또는 경쇄의 가변 도메인 (즉, VL 도메인)의 적어도 일부를 포함하는 폴리펩타이드를 의미하며, 여기에서 VL 및 VH 도메인의 일부는 면역글로불린의 항원 결합 도메인을 형성한다 (도 1 참조). 따라서, 면역글로불린의 가변 영역은 단일 CDR (예를 들어, CDR1), 단일 FR에 의해 산재된 2개의 CDRs (예를 들어, CDR1, FR2, 및 CDR2), 2개의 FRs에 의해 산재된 3개의 CDRs (예를 들어, CDR1, FR2, CDR2, FR3, 및 CDR3), 또는 FR1 및 FR2의 어느 하나, 또는 양자가 옆에 배치된(flnked) 3개의 CDRs (예를 들어, FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4)를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 실시형태에서, 면역글로불린 사슬 가변 영역은 무손상 면역글로불린의 다른 사슬 (즉, 경쇄 또는 중쇄)의 면역글로불린 사슬 가변 영역과 결합되는 경우, 항원 결합 도메인을 형성하는 중쇄 또는 경쇄의 어느 하나 상의 영역이다.

"항원 결합 도메인(antigen binding domain)"은 면역글로불린에서 단일 경쇄와 어셈블링되는 단일 중쇄의 영역을 의미하며, 이는 그의 특이적 항원에 대하여 무손상 항체의 특이적 결합 활성을 보유한다. 따라서, 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 무손상 IgG 면역글로불린은 2개의 항원 결합 도메인을 갖는다. 유사하게, 중쇄와 경쇄 사이에 공유 결합을 보유하는 무손상 항체의 단편화(fragmentation)에 의해, 항원 결합 도메인을 갖는 면역글로불린 단편에 이르게 된다. 예를 들어, 효소 파파인에 의한 면역글로불린의 소화는 F(ab) 단편을 생성하며, 이들 각각은 단일 항원 결합 도메인을 갖는다. 물론, 전체 F(ab)는 항원 결합 도메인이 아니며; 오히려, 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 보유한 F(ab) 단편의 부분만이 항원 결합 도메인이다.

본 명세서에 이용된 기술적 및 학술적 용어는 다르게 정의되지 않으면, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다. 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 알려진 다양한 방법론 및 물질을 참고로 한다. 항체 및/또는 재조합 DNA 기술의 일반적 원칙을 제시하는 표준 참고 연구는 Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1988); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Coligan et al., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York, NY (1991-2010); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY (1987-2010); Kaufman et al., Eds., Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biology in Medicine, CRC Press, Boca Raton (1995); McPherson, Ed., Directed Mutagenesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford (1991)를 포함하며, 이들은 모두 전체적으로 참고로 본 명세서에 포함된다. 약리학의 일반 원칙을 제시하는 표준 참고 연구는 전체적으로 참고로 본 명세서에 포함되는 Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 11th Ed., McGraw Hill Companies Inc., New York (2006)를 포함한다.

항원-특이적 면역글로불린의 서열을 얻는 방법

일 측면에서, 본 발명은 폴리클로날 항체의 집단(population)으로부터 단일 면역글로불린의 면역글로불린 사슬 (또는 그의 가변 영역)의 아미노산 및/또는 핵산 서열을 얻는 방법에 관한 것이다.

본 방법에 따르면, 대상 폴리클로날 항체 집단은 동물로부터 얻어지며, 단편화되어, 질량 분석에 의해 분석되는 펩타이드 단편을 생성한다. 펩타이드 단편으로부터 관찰된 질량 스펙트럼 정보는 전장 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄 (또는 그의 가변 영역)을 코딩하는 핵산 서열로 구성된 유전 물질 데이터베이스로부터 유래된 예측된 질량 스펙트럼 정보와 서로 연관된다. 그러한 연관의 결과로, 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄 (또는 그의 가변 영역)는 출발 폴리클로날 항체 집단 내에서 면역글로불린 분자의 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄 (또는 그의 가변 영역)에 해당하는 유전 물질 데이터베이스로부터 동정될 수 있다.

본 방법의 다양한 측면은 하기에 상세하게 서술된다.

폴리클로날 항체의 출발 집단(Starting Population)

대상 항원에 특이적으로 결합하는 면역글로불린은 인간과 같은 임의의 포유동물을 포함하는 동물로부터 수집될 수 있다. 면역글로불린은 예를 들어, 혈액, 혈청 또는 혈장, 뇌척수액,　윤활액(synovial fluid),　복막액,　점막 분비물,　눈물,　코 분비물,　침,젖,　및 비뇨생식기 분비물(genitourinary secretions)을 포함하는, 동물의 체액 샘플로부터 수집될 수 있는 동물의 체액 샘플로부터 수집될 수 있다.

일부 실시형태에서, 면역글로불린은 단일의 개별 동물로부터 비롯될 필요는 없으며, 오히려 상이한 개체들로부터의 상이한 항체 (모노클로날 또는 폴리클로날)의 칵테일일 수 있다. 일부 실시형태에서, 면역글로불린은 형질전환 비-인간 동물, 예를 들어, 인간 항체 서열을 발현하거나, 및/또는 적어도 부분적인 인간인 항체를 생산하는 형질전환 비-인간 동물로부터 수집된다.

일부 실시형태에서, 면역글로불린이 수집된 동물이 이전에 항원으로 면역되었기 때문에, 또는 면역글로불린이 수집된 동물이 이전에 상태에 노출됨으로써 동물이 항원-특이적 항체를 생성할 것으로 예측되기 때문에, 이러한 면역글로불린은 대상 항원에 대하여 특이적이다. 후자 경우의 예에서, 동물은 바이러스 (예를 들어, 엡스타인 바 바이러스(Epstein Barr virus))에 의해 감염되었을 수 있으며, 이 경우 대상 항원은 엡스타인 바 바이러스의 게놈에 의해 코딩되는, EBNA1 단백질이다.

다양한 실시형태에서, 면역글로불린이 수집된 (즉, 수득된) 동물은 레퍼런스 데이터베이스를 생성하기 위하여 B 림프구 핵산 서열이 수집된 동물과 동일한 종이다. 일부 실시형태에서, 면역글로불린이 펩타이드 데이터베이스용으로 수집된 동물과 B 림프구 핵산이 레퍼런스 데이터베이스용으로 수집된 동물은 동일한 동물이다.

도 2에 나타내어진 바와 같이, 동물이 동일한 동물인 경우, 동물로부터 취해진 혈액은 핵산 서열 (예를 들어, 혈액의 세포로부터) 및 폴리클로날 항체 (예를 들어, 혈청 또는 혈장으로부터) 양자를 모두 제공한다.

상이한 B 림프구가 면역글로불린의 폴리클로날 집단의 일원(member)을 생성하므로, 동물로부터 수집된 면역글로불린을 형성한다. 그러한 폴리클로날 집단에서, 그 폴리클로날 집단 내의 개별적인 항체 전부가 동일한 항원에 대하여 특이적으로 결합하지는 않는다는 것을 주의하여야 한다. 사실은, 집단 내의 항체 각각은 상이한 항원과 결합할 수 있다. 그러나, 폴리클로날 집단의 적어도 하나의 개별적인 항체, 바람직하게는 다수 항체가 그 항원에 결합하는 경우, 이 폴리클로날 집단은 여전히 특정 항원에 특이적으로 결합하는 것으로 말해진다 (예를 들어, 하기 실시예 3 참조). 다른 예에서, 폴리클로날 집단의 일부 항체는 낮은 친화성으로 항원에 결합할 수 있다. 그러나, 그 집단에서 항체의 일부 (예를 들어, 적어도 일 이상의 항체)가 항원에 특이적으로 결합하면, 그 폴리클로날 집단은 항원에 특이적으로 결합하는 것으로 말해진다.

문구 "항원에 특이적으로 결합하는 폴리클로날 항체 (또는 면역글로불린)"은 폴리클로날 집단 내에서 적어도 하나의 항체가 항원에 특이적으로 결합하나, 그 하나의 항체가 항원과 특이적으로 결합하지 않는 폴리클로날 집단 내의 다른 항체로부터 반드시 분리되어야 하는 것은 아님을 의미하는 것임을 주의하여야 한다. 물론, 일부 실시형태에서, 폴리클로날 집단의 2 이상의 상이한 항체가 항원에 특이적으로 결합한다.

상이한 항체 분자는 상이한 B 세포에 의해 생성된 항체 분자임을 주의하여야 한다. 예를 들어, 혈청을 수집한 후에, 1000개 항체 분자의 폴리클로날 집단은 혈청으로부터 분리될 수 있다 (예를 들어, 다른 혈청 구성성분으로부터 항체를 분리하기 위하여 단백질 A 컬럼에 대한 항체의 부착(adherence)을 이용하여). 1000개 항체 분자의 집단 내에서, 900개는 동일할 수 있으며 (즉, 동일한 B 세포에 의해 분비되며), 따라서 그 폴리클로날 집단 내에는 실제로 단지 101개의 상이한 항체가 존재한다. 폴리클로날 집단에 관하여, 모든 900개의 동일한 항체 분자가 항원에 특이적으로 결합하면, 1000개 항체 분자의 폴리클로날 집단은 항원에 특이적으로 결합하는 폴리클로날 항체이다. 유사하게, 잔류 100개의 상이한 항체 분자의 5개의 상이한 항체 분자도 추가적으로 항원에 특이적으로 결합하면, 1000개 항체 분자의 폴리클로날 집단은 유사하게 항원에 특이적으로 결합하는 폴리클로날 항체이다.

그 집단이 "항원에 특이적으로 결합하는 폴리클로날 항체"로 나타내어지기 위하여, 폴리클로날 집단 내에서 항체 분자의 다수(majority)가 항원에 특이적으로 결합할 필요는 없다. 예를 들어, 1000개 항체 분자의 폴리클로날 집단 내에서, 단 1개의 항체 분자만 항원에 특이적으로 결합하고, 999개의 항체 분자는 그렇지 않더라도, 그 1000개 항체 분자의 집단은, 이 용어가 본 명세서에 이용되는 바와 같이, 여전히 "항원에 특이적으로 결합하는 폴리클로날 항체"이다.

폴리클로날 항체 집단의 항체 전부가 항원의 동일한 에피토프에 결합할 필요가 없음을 주의하여야 한다. 예를 들어, 폴리클로날 집단은 항원에 대하여 특이적일 수 있으며, 이 경우 집단 내의 모든 상이한 항체가 항원의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다.

본 발명의 비제한적 방법의 다양한 실시형태에서, 폴리클로날 면역글로불린의 집단은 집단 내에 적어도 2개의 상이한 면역글로불린, 또는 집단 내에 적어도 3개, 또는 적어도 5개, 또는 적어도 10개, 또는 적어도 12개, 또는 적어도 50개, 또는 적어도 100개, 또는 적어도 500개의 상이한 면역글로불린을 가질 수 있다.

본 발명은 또한 시험관내에서 성장한 B 세포의 조직 배양 상청액으로부터 면역글로불린의 폴리클로날 집단을 수집하는 것을 고려한다 (예를 들어, 이 경우 핵산 서열은 B 세포 자체로부터 수집된다). 예를 들어, B 세포의 집단은 엡스타인 바 바이러스에 노출된 동물로부터 수집될 수 있다. 이 집단은 예를 들어, 다른 백혈구에 비해 집단 내에서 B 림프구가 강화되도록 성장될 수 있다. 이러한 세포의 배지로부터 (폴리클로날 항체가 세포에 의해 분비되는), 항체의 폴리클로날 집단이 분리될 수 있다.

동물(들)로부터, 또는 B 세포의 조직 배양 상청액으로부터 수집된 면역글로불린의 폴리클로날 집단은 펩타이드 단편으로의 소화 전에 먼저 정제될 수 있다. 예를 들어, 수집된 폴리클로날 항체는, 항체를 다른 혈청 단백질로부터 분리할 수 있는 예를 들어 단백질 A 또는 단백질 G 세파로오스 컬럼에 놓여질 수 있다. 예를 들어, 도 2 및 도 3 참조. 대신에, 또는 부가적으로, 수집된 폴리클로날 항체는 높은 특이적 활성을 갖는 항체가 강화되도록 항체 친화성 정제되어진다. 전적으로 필요하지는 않으나, 정제 단계, 특히 항원 친화성 정제(antigen affinity purification)는 폴리클로날 혼합물의 복잡성을 감소시킬 수 있으며, 궁극적으로 잠재적인 위양성 또는 위음성 후보 면역글로불린의 수를 감소시킬 수 있다. 수집된 폴리클로날 항체는 정제 전에, 또는 정제 후에, 농축되거나, 정제되거나, 또는 농축 및 정제될 수 있다.

설명적인 일 실시형태에서, 동물로부터 대상 항원에 특이적으로 결합하는 면역글로불린을 수집하기 위하여, 말초 혈액이 동물로부터 뽑아지며, 혈청 및/또는 혈장 항체가 표준 방법 (예를 들어, 단백질 A에 대한 항체의 부착)에 따라 수집된다. 이어서, 혈청 및/또는 혈장 항체는 항원에 특이적으로 결합하는 면역글로불린이 강화되도록 정제 또는 스크리닝된다. 이 스크리닝은 예를 들어, 고체상 표면 (예를 들어, 세파로오스 비드 또는 플라스틱 웰의 하부)을 항원으로 코팅하고, 항원에 특이적으로 결합하는 면역글로불린이 결합하는 조건 하에서 혈청 및/또는 혈장을 항원-코팅된 표면 위로 지나게 함으로써 이루어질 수 있다. 결합된 항체는 프로테아제 (예를 들어, 파파인) 또는 부착되지 않은 Fc 부분을 제거하기 위하여 면역글로불린의 경첩 영역 근처를 특이적으로 절단하는 화학적 단백질 절단에 의해 처리될 수 있다. 비결합 혈청 및/또는 혈장 단백질 (비특이적 면역글로불린 포함)을 헹궈서 제거한 후, 항원-특이적 면역글로불린이 수집될 수 있으며, 그 양은 항원에 특이적으로 결합하지 않는 항체와 비교하여 강회될 수 있다.

수집된 폴리클로날 항체로부터 관찰된 질량 스펙트럼

관찰된 (즉, 실제) 질량 스펙트럼을 얻기 위하여, 수집된 폴리클로날 항체 (또는 그 단편)는 단백질 분석 방법 (예를 들어, 질량 분석, 액체 크로마토그래피 등)에 의해 분석된다.

일부 실시형태에서, 관찰된 질량 스펙트럼 정보는 폴리클로날 항체로부터 생성되는 펩타이드 단편으로부터 얻어진다. 폴리클로날 항체는 예를 들어, 일 이상의 프로테아제, 및/또는 브롬화시안(cyanogen bromide)과 같은 화학적 단백질 절단 시약에 의해 단편화될 수 있다.

특정 프로테아제가 특정 부위에서 그들의 기질을 절단하는 것으로 알려져 있다. 표 1은 일반적으로 이용되는 프로테아제 및 그들의 절단 부위(cleavage sites)의 비포괄적인 리스트를 제공한다(3글자 아미노산 코드로).

프로테아제	절단 부위
트립신	Pro가 뒤따르지 않으면, Arg 또는 Lys 뒤에서 (즉, 그의 카르복실측에) 절단함
키모트립신	Pro가 뒤따르지 않으면, Phe, Trp, 또는 Tyr 뒤에서 절단함
엘라스타아제	Pro가 뒤따르지 않으면, Ala, Gly, Ser, 또는 Val 뒤에서 절단함
엔도프로테나제 Lys-C	Lys 뒤에서 절단함
펩신	Phe 또는 Leu 뒤에서 절단함
서몰리신	Pro가 앞서지 않으면, Ile, Met, Phe, Trp, Tyr, 또는 Val 앞에서 절단함
엔도펩티다아제 V8 (일명 Glu-C)	Glu 뒤에서 절단함

단백질을 더 작은 단편으로 소화하는데 이용될 수 있는 프로테아제의 더욱 포괄적인 리스트는 Riviere and Tempst (Riviere LR, Tempst P. Enzymatic digestion of proteins in solution. Curr Protoc Protein Sci. 2001 May; Chapter 11:Unit 11.1. PubMed PMID: 18429101; 전체적으로 본 명세서에 참조로 포함됨)의 표 11.1.1 및 11.1.3에 제공된다.특정 실시형태에서, 폴리클로날 항체를 소화하여 V 영역 커버리지를 최대화하고, 면역글로불린의 매우 다양한 아미노산 조성물을 설명하기 위하여, 다수의 (즉, 2 이상의) 프로테아제가 이용된다 (예를 들어, 독립적으로 또는 함께). 예를 들어, 본 명세서의 실시예 7에 설명된 바와 같이 키모트립신, 엘라스타아제, 펩신 및 트립신의 조합이 이용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 프로테아제 또는 프로테아제들은, 이들이 유전 물질 데이터베이스에서 핵산 분자의 분석에 근거하여 예측된 CDR3 영역 내에서 절단하지 않는다는 것에 기반하여 선택된다.

단백질은 단백질 분해 효소보다 특정한 화학적 단백질 절단 시약으로 처리됨으로써, 질량 분석될 수 있는 더 작은 단편으로 소화될 수 있다. 예를 들어 G. Allen. Sequencing of Proteins and Peptides, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 9. Elsevier 1989의 chapter 3 참조. 그러한 화학적 단백질 절단 시약은 브롬화시안, BNPS-스카톨(BNPS-skatole), o-아이오도소벤조산(o-iodosobenzoic acid), 묽은 산 (예를 들어, 묽은 HCl) 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 단백질은 브롬화시안에 의해 Met 잔기에서, 시아닐레이션(cyanylation) 이후 Cys 잔기 뒤에서, BNPS-스카톨 또는 o-아이오도소벤조산에 의해 Trp 잔기 뒤에서 절단할 수 있다. 단백질 단편은 묽은 산, 예를 들어 HCl에 대한 노출에 의해 생성될 수 있다. 질량 분석에 의해 단백질 서열을 결정하기 위한 부분적 산성 가수분해(partial acid hydrolysis) 이용의 예는 Zhong et al. (Zhong H, et al., J. Am. Soc. Mass Spectrom. 16(4):471-81, 2005. PubMed PMID: 15792716, 전체적으로 참조로 포함됨)에 의해 제공된다. 상기 Zhong et al.은 질량 분석에 의한 시퀀싱을 위하여 단편 박테리오로돕신에 대한, 물 중의 25% 트리플루오로아세트산에 의한 초음파-보조 산성 가수분해를 이용하였다. 또한, Wang N, and Li L., J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 21(9):1573-87, 2010.PubMed PMID: 20547072 (전체적으로 본 명세서에 참조로 포함됨) 참조.

단백질은 하나의 프로테아제에 의해 처리함으로써, 2 이상의 프로테아제를 조합하여 처리함으로써, 화학적 절단 시약에 의해 처리함으로써, 2 이상의 화학적 절단 시약을 조합하여 처리함으로써, 또는 프로테아제와 화학적 절단 시약을 조합하여 처리함으로써, 단편화되어 질량 분석을 더 잘할 수 있도록 만들어질 수 있다. 반응은 고온 또는 고압에서 일어날 수 있다. 예를 들어 Loepez-Ferrer D, et al., J. 프로테옴. Res. 7(8):3276-81, 2008. PubMed PMID: 18605748; PubMed Central PMCID: PMC2744211 (전체적으로 참조로 포함됨) 참조. 단편화는, 소화 시약이 절단할 수 있는 모든 결합에서 단백질이 절단되도록 완결될 수 있으며; 또는 항체 가변 영역 서열의 판독에 특히 도움을 줄 수 있는 더 큰 단편을 생산하기 위하여, 일부러 단편화가 완결되지 않도록 소화 조건이 조정될 수 있으며; 또는 Klenow 단편을 만들기 위하여 E. coli DNA 중합효소에 의해 이루어진 것과 같이, 단백질이 부분적으로 도메인으로 소화되도록 소화 조건이 조정될 수 있다. 소화 수준을 조절하기 위하여 달라질 수 있는 조건은 특히 지속시간, 온도, 압력, pH, 단백질 변성화 시약의 부재 또는 존재, 특정한 단백질 변성제 (예를 들어, 요소, 구아니딘 HCl, 세제(detergent), 산-절단가능 세제(acid-cleavable detergent), 메탄올, 아세토니트릴, 다른 유기 용매), 변성제의 농도, 절단 시약의 양이나 농도 또는 소화되어야 하는 단백질에 대한 그의 중량비를 포함한다.

일부 실시형태에서, 단백질을 절단하는데 이용되는 시약 (즉, 프로테아제 또는 화학적 단백질 절단 시약)은 완전히 비특이적 시약이다. 그러한 시약을 사용하여, 펩타이드의 N-말단, 펩타이드의 C-말단 또는 N-말단 및 C-말단 모두에서 어떠한 제약도 생기지 않는다. 예를 들어, 펩타이드 서열의 한쪽 말단, 또는 다른 쪽 말단에서, 그러나 양쪽 모두에서는 아닌, 트립신에 의한 절단(tryptic cleavage)을 갖도록 제약되는 부분적으로 단백질 가수분해된(proteolyzed) 서열이 본 명세서에 서술된 다양한 방법에 이용될 수 있다.

수득된 펩타이드 단편은 관찰된 질량 스펙트럼이 생성되는 질량 분석계에 결합된 HPLC를 이용하여 검출 및 분석될 수 있다. 이 방법은 "바텀 업(bottom up)" 단백질군 접근(proteomics approach)으로 나타내어질 수 있으며, 단백질을 비교적 작은 펩타이드, 예를 들어, 길이가 3 내지 45개 잔기인 펩타이드로 줄인 후에 프로테옴(proteome) 성분이 분리 및 동정될 수 있다.

다른 실시형태에서, 대안, "탑 다운(top down)" 단백질군 접근이 관찰된 질량 스펙트럼을 얻는데 채용될 수 있으며, 이는 무손상 단백질 또는 큰 단백질 단편 또는 단백질 도메인 또는 큰 폴리펩타이드의 질량 분석을 포함한다. 예를 들어, 특정한 폴리클로날 항체 분자에 대하여 특이적 항원 인식을 부여하는 항체 가변 영역의 부분을 동정하기 위하여, 가변 영역의 큰 부분을 시퀀싱하여, CDRs이 서로 연결되어 유지되기에 충분히 큰 단편의 직접적 분석에 의해, 그 CDR을 동정하는 것은 도움이 된다.

"바텀 업" 및 "탑 다운" 전략을 서술하는 리뷰에 대하여, Han X, Aslanian A, Yates JR 3rd. Mass spectrometry for proteomics. Curr Opin Chem Biol. 2008 Oct;12(5):483-90. Review. PubMed PMID: 18718552; PubMed Central PMCID: PMC2642903 (전체적으로 참조로 포함됨) 참조. 항체 서열을 결정하는데 적용되는 탑-다운 단백질군의 최근 리뷰에 대하여, Zhang Z. et al., Mass Spectrom Rev. 2009 Jan-Feb;28(1):147-76. Review. PubMed PMID: 18720354 (전체적으로 참조로 포함됨) 참조. 탑-다운 단백질군에 의한 모노클로날 항체의 광범위한 시퀀싱을 나타내는 최근 논문에 대하여, Tsybin et al, Anal Chem. 2011 Oct 21. PubMed PMID: 22017162 (전체적으로 참조로 포함됨) 참조.

상기 비제한적 방법의 일부 실시형태에서, 항원-특이적 면역글로불린은 항원-코팅된 표면에 결합되었지만, 면역글로불린은 각각 F(ab) 및 F(ab)₂ 단편을 생성하기 위하여 파파인 또는 펩신에 의해 소화될 수 있다. 면역글로불린 사슬 가변 영역의 전체가 F(ab) 단편의 사슬에 위치하므로, 이러한 파파인 및/또는 펩신에 의한 전처리는 면역글로불린 사슬 가변 영역을 강화시킬 할 것이다. 면역글로불린의 비결합 부분을 헹궈서 제거한 후, 면역글로불린 사슬 가변 영역이 수집될 수 있다.

면역글로불린 단편이 질량 분석계를 통과한 후에, 많은 관찰된 질량 스펙트럼이 생성될 것이다. 그러나, 폴리클로날 집단 내의 잠재적으로 많은 수의 상이한 면역글로불린을 고려하면, 이들 각각은 상이한 아미노산 서열을 가지고 이는 질량 분석계에 의해 분석되므로, 얻어진 관찰된 질량 스펙트럼은 기능적인(functional) 면역글로불린 사슬 가변 영역으로 다시 어셈블링되기는 어려울 것이다. 본 발명의 다양한 실시형태의 방법에서, 근본적인 핵산 서열이 이용가능하기 때문에, 관찰된 질량 스펙트럼 데이터를 어셈블링할 필요가 없다. 대신에, 출발 폴리클로날 면역글로불린 집단으로부터 항원에 특이적으로 결합하는 면역글로불린의 전체 면역글로불린 사슬 (또는 그의 가변 영역)의 아미노산 (및 근본적인 뉴클레오타이드) 서열을 얻기 위하여, 단일 펩타이드 단편의 관찰된 질량 스펙트럼은 핵산 서열의 예측된 질량 스펙트럼과 서로 연관될 수 있다. 이 연관 단계는 하기에 더 서술된다.

질량 스펙트럼 정보에 더하여, 폴리클로날 항체의 펩타이드 단편으로부터 유래된 추가적인 정보는 본 발명의 다양한 실시형태에서 유용하다. 이 정보는 각각의 펩타이드의 질량, 각각의 펩타이드의 길이(아미노산 잔기로), 각각의 펩타이드의 관찰된 질량 스펙트럼 (예를 들어, MS2 또는 MS3 스펙트럼과 같은 탠덤(tandem) 질량 분석으로부터), 각각의 펩타이드의 질량 대 전하 비(mass to charge ratio), 각각의 펩타이드의 이온 전하, 각각의 펩타이드의 크로마토그래피 프로파일 및 각각의 펩타이드의 아미노산 서열을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

질량 분석

본 발명의 방법에서, 질량 스펙트럼 정보는, 그로부터 정보가 생성되는, 수집된 면역글로불린 또는 단편의 질량 분석에 의해 얻어질 수 있다. 질량 분석계는 개별적인 이온화된 분자의 질량 대 전하 (m/z) 비를 측정하고, 연구자들이 미지의 화합물을 확인하고, 알려진 화합물을 정량화하고, 분자의 구조 및 화학적 특성을 설명하도록 할 수 있는 기구이다. 일부 실시형태에서, 샘플을 기구 위에 분리 및 탑재함으로써 질량 분석을 시작한다. 탑재되면, 샘플은 증발된 후 이온화된다. 그 뒤에, 이온은 자기장에 노출됨으로써 그의 질량 대 전하 비에 따라 분리된다. 일부 실시형태에서, 섹터 기구(sector instrument)가 이용되며, 이온이 기구의 전자기장을 통과하는 동안, 이온 질량 대 전하 비와 직접적으로 서로 연관되는, 이온 궤도의 편향(deflection)의 크기에 따라 이온이 정량화된다. 다른 실시형태에서, 이온 질량 대 전하 비는 이온이 4중극(quadrupoles)을 통과하는 동안, 또는 3차원 또는 선형 이온 트랩 또는 오비트랩(Orbitrap)에서, 또는 퓨리에 변환 이온 사이클로트론 공명 질량 분석계의 자기장에서 이온의 움직임에 근거하여 측정된다. 기구는 각각의 이온의 상대적 풍부도를 기록하며, 이는 원래 샘플의 화학적, 분자적 및/또는 동위원소적 조성을 결정하는데 이용된다. 일부 실시형태에서, 비행시간 기구(time-of-flight instrument)가 이용되며, 이온이 동일한 전위를 통과하는 것을 가속화하기 위하여 전기장이 이용되고, 각각의 이온이 검출기에 도달하는데 걸리는 시간을 측정한다. 이 접근법은 균일한 각각의 이온의 전하에 의존하므로 각각의 이온의 운동에너지가 동일할 것이다. 이 시나리오에서 속도에 영향을 미치는 유일한 변수는 질량으로, 더 가벼운 이온은 더 큰 속도로 이동하여, 결과적으로 검출기에 더 빨리 도달한다. 수득된 데이터는 질량 스펙트럼 또는 히스토그램에서 질량 대 전하 비에 대한 강도(intensity)로 표현되며, 피크는 이온화된 화합물 또는 단편을 나타낸다.

단백질 샘플의 질량 스펙트럼 데이터를 얻기 위하여, 샘플은 기구에 탑재되어 이온화된다. 이온화는 예를 들어, 전기분무(electrospray ionization) 이온화 및 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화(matrix-assisted laser desorption/ionization, "MALDI")에 의해 이루어질 수 있다. 예를 들어, Zenobi, "Ion Formation in MALDI Mass Spectrometry", 17 Mass Spectrometry Review, 337 (1998) 참조. 단백질 특성화(characterization)는 2가지 방식의 하나, 탑-다운 또는 바텀-업 방식으로 이루어질 수 있다. 탑-다운 접근법은 무손상 단백질 또는 더 큰 단백질 단편을 이온화하는 것을 포함한다. 예를 들어, Allison Doerr, "Top-down Mass Spectrometry", 5 Nature Methods, 24 (2008) 참조. 바텀-업 접근법은 프로테아제를 이용하여 단백질을 구성 펩타이드로 효소적으로 또는 화학적으로 소화시키는 것을 포함한다. Biran Chait, "Mass Spectrometry: Bottom-Up or Top-Down?", 6 Science 65 (2006) 참조. 수득된 펩타이드는 기구에 도입되어, 펩타이드 질량 지문(peptide mass fingerprinting) 또는 탠덤 질량 분석에 의하여 궁극적으로 동정된다.

일부 실시형태에서, 질량 분석은 크로마토그래피 분별 (예를 들어, 액체 크로마토그래피)과 결합될 수 있다.

본 발명에 유용한 질량 스펙트럼 데이터는 펩타이드 질량 지문에 의해 얻어질 수 있다. 펩타이드 질량 지문은 단백질 가수분해 소화(proteolytic digestion)에 의해 생성된 펩타이드 혼합물의 스펙트럼으로부터 관찰된 질량을 데이터베이스에 입력하는 것, 및 관찰된 질량을 공지된 단백질 소화로부터 발생하는 단편의 예측된 질량과 인 실리코(in silico) 서로 연관시키는 것을 포함한다. 샘플 질량에 해당하는 공지된 질량은 공지된 단백질이 시험된 샘플에 존재한다는 증거를 제공한다.

질량 스펙트럼 데이터는 탠덤 질량 분석에 의해 얻어질 수 있다. 일부 실시형태에서, 탠덤 질량 분석은 전형적으로 충돌 유도 해리(collision-induced-dissociation)를 이용하며, 이는 펩타이드 이온이 가스와 충돌하여 단편으로 되도록 한다 (예를 들어, 충돌에 의해 부여되는 진동 에너지에 의해). 단편화 과정에 의해, 단백질을 따라 있는 다양한 부위의 펩타이드 결합에서 끊어지는 절단 생성물이 생성된다. 관찰된 단편의 질량은 많은 주어진 펩타이드 서열의 하나에 대한 예측된 질량의 데이터베이스와 매치될 수 있으며, 단백질의 존재가 예측될 수 있다. 예를 들어, Eng, 5 An Approach to Correlate Tandem Mass Spectal Data of Peptides with Amino Acid Sequences in a Protein Datanbase, JASMS, 976 (1994) 참조.

다른 실시형태에서, 탠덤 질량 분석은 고에너지 충돌 유도 해리 (higher-energy collision induced dissociation, "HCD")에 의해 수행되며, 이는 일부 질량 분석계에서 충돌 유도 해리보다 펩타이드 말단에 더 근접한 단편 생성물 이온을 나타낸다. Olsen JV, Macek B, Lange O, Makarov A, Horning S, Mann M. Higher-energy C-trap dissociation for peptide modification analysis. Nat. Methods. 2007 Sep;4(9):709-12. Epub 2007 Aug 26. PubMed PMID: 17721543 참조.

다른 실시형태에서, 탠덤 질량 분석은 전자 전달 해리 (electron transfer dissociation, "ETD")에 의해 수행되며, 이는 별개 시약의 화학적 이온이 펩타이드 이온에 라디칼을 공여하고, 펩타이드 이온은 즉각 단편화되어 생성물 이온을 생성하는 이온-이온 반응에 근거한다. Mikesh LM, Ueberheide B, Chi A, Coon JJ, Syka JE, Shabanowitz J, Hunt DF. The utility of ETD mass spectrometry in proteomic analysis. Biochim Biophys Acta. 2006 Dec;1764(12):1811-22. Epub 2006 Oct 30. Review. PubMed PMID: 17118725; PubMed Central PMCID: PMC1853258 참조. ETD와 같은 특정 단편화 방법은 "탑 다운" 단백질군 전략에 특히 잘 맞는다. 다른 단편화 메커니즘은 특정 이온화 메커니즘에 대해 특유하며, 예를 들어, 다음 원천 쇠퇴(post-source decay, "PSD")는 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 ((MALDI)에 양립가능하며, 또한 "탑 다운" 단백질군 전략에 잘 맞는다.

유전 물질 데이터베이스

본 발명에 따르면, 출발 폴리클로날 면역글로불린 집단으로부터 면역글로불린의 면역글로불린 사슬 (또는 그의 가변 영역)의 아미노산 (및 근본적인 뉴클레오타이드) 서열을 얻기 위하여, 출발 폴리클로날 면역글로불린 집단으로부터 관찰된 질량 스펙트럼 정보는 유전 물질 데이터베이스로부터 유래된 예측된 질량 스펙트럼 정보와 서로 연관된다.

본 명세서에 이용된 바와 같이, 유전 물질 데이터베이스는 복수의 면역글로불린 사슬 (또는 그의 가변 영역)을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 따라서, 그러한 유전 물질 데이터베이스로부터 얻어질 수 있거나, 또는 유래될 수 있는 정보는, 예를 들어, 각각의 핵산 분자의 뉴클레오타이드 서열 정보, 각각의 핵산 분자의 길이 (뉴클레오타이드로), 각각의 핵산 분자에 의해 코딩되는 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 아미노산 서열 정보, 각각의 핵산 분자에 의해 코딩되는 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 질량, 각각의 핵산 분자에 의해 코딩되는 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 길이 (아미노산 잔기로), 각각의 핵산 분자에 의해 코딩되는 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 질량 스펙트럼 정보 (예를 들어, 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 아미노산 서열에 근거한 예측된 질량 스펙트럼 정보), 및 각각의 핵산 분자에 의해 코딩되는 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명의 일부 실시형태에서, 유전 물질 데이터베이스는 전장 면역글로불린 사슬 (및 그의 가변 영역만이 아님)을 코딩하는 핵산 서열의 유전 정보를 함유한다. 일부 실시형태에서, 핵산 서열은, 상기 서열이 유래되는 세포에 의해 발현된다(즉, RNA로 전사되거나, 및/또는 단백질로 번역된다). 특정 실시형태에서, 유전 물질 데이터베이스는 동물로부터 다중 면역글로불린의 면역글로불린 사슬 가변 영역을 코딩하는 발현된 핵산 서열(expressed nucleic acid sequences )을 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전 물질 데이터베이스는 적어도 100개의 상이한 발현된 핵산 서열을 함유한다. 다른 실시형태에서, 유전 물질 데이터베이스는 적어도 1000개의 상이한 발현된 핵산 서열을 함유한다.

면역글로불린 사슬 (또는 그의 가변 영역)을 코딩하는 핵산 분자는 B 림프구를 함유하는 세포 (예를 들어, 말초 백혈구)의 집단으로부터 쉽게 얻어질 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵산 분자는 비장 세포, 또는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMCs)와 같은 단핵 세포로부터 얻어진다. 일부 실시형태에서, B 림프구는 나이브(naive) 동물 (예를 들어, 그에 대하여 항원 특이적 항체가 찾아진 항원에 노출되지 않았던 동물)로부터 얻어진다. 일부 실시형태에서, 나이브 동물은 극히 적은 항원에 노출되었다 (예를 들어, 멸균 또는 무-병원균 환경에서 길러진 동물). 일부 실시형태에서, 나이브 동물은 전형적인 항원에 노출되었으나, 선택되는 항원에는 노출되지 않았던 전형적인 동물이다.

일부 실시형태에서, 면역글로불린 사슬 (또는 그의 가변 영역)을 코딩하는 핵산 분자가 얻어지는 동물은 이전에 항원에 노출되었던 동물이다. 예를 들어, 동물은 항원 (예를 들어, 보조제와 혼합된 항원 또는 키홀림펫헤모사이아닌(keyhole limpet hemocyanin, "KLH")과 같은 면역성 담체(immunogenic carrier)에 결합된 항원)으로 면역된 동물일 수 있으며, 항원을 포함하는 병원균으로 감염된 동물 (예를 들어, 선택된 항원이 HIV p24 항원인 경우, HIV 바이러스로 감염된 동물)일 수 있으며, 또는 그렇지 않으면 이전에 항원에 노출되었을 수 있다. 일부 실시형태에서, 동물은 조류 (예를 들어, 닭 또는 칠면조), 또는 영장류 (예를 들어, 인간 또는 침팬지), 설치류 (예를 들어, 생쥐, 햄스터, 또는 쥐), 토끼목 포유동물 (예를 들어, 토끼 또는 토끼(hare)), 카멜리드 (예를 들어, 낙타 또는 라마) 포유동물, 또는 반려 동물 (고양이, 개, 또는 말)과 같은 길들여진 동물, 또는 가축 (예를 들어, 염소, 양 또는 소)이다.

본 발명의 다양한 측면 및 실시형태의 핵산 서열은 단일 동물로부터 나올 필요는 없다는 것을 이해하여야 한다. 예를 들어, 본 발명의 다양한 실시형태의 핵산 서열의 일부는 이전에 항원에 노출된 동물로부터 나올 수 있고, 핵산 서열의 일부는 나이브 동물로부터 나올 수 있다. 본 발명의 일부 실시형태에서, 핵산 서열은 단일 종의 동물로부터 나온다. 예를 들어, 핵산 서열이 얻어지는 다수의 동물이 있는 경우, 이러한 동물은 전부 동일한 종일 수 있다(예를 들어, 모두 토끼이거나, 또는 모두 인간이다). 일부 실시형태에서, 핵산 서열은 단일 종의 동물로부터 얻어진다. 다른 실시형태에서, 2개 이상 종의 동물로부터 핵산 서열이 얻어질 수 있다. 예를 들어, 핵산 서열은 생쥐 및 쥐로부터 얻어질 수 있고, 항원에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 (또는 그의 가변 영역, 항원 결합 도메인, 또는 사슬)을 생성하기 위하여, 이러한 서열에 근거한 예측된 질량 스펙트럼은 폴리클로날 항체의 펩타이드 단편의 실제 질량 스펙트럼 정보와 서로 연관시키거나, 및/또는 비교하는데 이용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵산 서열은 단일 성별의 동물로부터 얻어진다(예를 들어, 모든 동물이 암컷이다).

폴리클로날 항체가 수집되는 동물과 핵산 서열이 수집되는 동물은 동일한 동물, 또는 동일한 종의 동물, 또는 동계(syngenic) 동물 (예를 들어, 둘다 Balb/c 생쥐임), 또는 동일한 성별의 동물 (예를 들어, 둘다 암컷 동물임)일 수 있다. 항원 결합 항체를 코딩하는 핵산 서열을 동정하기 위하여, 폴리클로날 항체의 항원 결합 성분(antigen-binding components)으로부터의 MS2 스펙트럼은 동물로부터 얻어진 핵산 서열로부터 유래된 이론적 MS2 스펙트럼과 서로 연관될 수 있다.

핵산 서열 및 폴리클로날 항체는 동물의 세포로부터 수집되며, 이 경우, 동물로부터 제거된 후 폴리클로날 항체의 수집 전에 (예를 들어, 배양된 세포의 상청액 또는 배지로부터), 및 세포로부터 핵산 서열의 수집 전에, 시험관내에서 세포가 배양된다. 이 배양 단계는 예를 들어 다른 혈액 또는 조직 세포에 비해 B 림프구를 확장시키거나, 또는 강화하기 위하여 (예를 들어, B 림프구를 적혈구 또는 상피 세포보다 강화하기 위하여) 유용하다. 본 발명의 다양한 실시형탱에서 이론적 질량 스펙트럼을 생성하는데 이용되는 개별적인 핵산 서열의 수는 제한되지 않는다. 예를 들어, 5개, 또는 10개, 또는 50개, 또는 100개, 또는 1000개, 또는 100만개, 또는 10억개, 또는 1조개, 또는 그 이상의 상이한 핵산 서열이 얻어지고, 이론적 질량 스펙트럼을 생성하는데 이용될 수 있다. 핵산 서열은 임의의 근원으로부터 얻어질 수 있고, 근원들의 조합으로부터 얻어질 수 있다. 예를 들어, 핵산 서열은 본 명세서에 서술된 바와 같이, 면역글로불린 사슬 가변 영역 (또는 가변 영역 및 불변 영역을 포함하는 전체의 전장 면역글로불린 사슬)를 코딩하는 발현된 핵산 분자를 시퀀싱함으로써 얻어질 수 있다. 핵산 서열은 또한 완전 V(D)J 재조합(full V(D)J recombination)을 겪었을 수 있거나, 또는 겪지 않았을 수 있는 게놈 DNA로부터 얻어질 수 있다. 핵산 서열은 또한 공개적으로 입수가능한 근원으로부터 얻어질 수 있다. 예를 들어, 다수 종의 동물로부터 면역글로불린 사슬 가변 영역 (및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드)의 다수의 아미노산 서열 (및 뉴클레오타이드 서열)이 알려져 있다(예를 들어, 전체적으로 참조로 본 명세서에 포함되는 하기 미국 및 PCT 특허 공개공보: US 20100086538; WO 2010/097435; US 20100104573; US 7,887,805; US 7,887,801; US 7,846,691; US 7,833,755; US 7,829,092 참조).

핵산 서열이 얻어지는 B 림프구는 골수, 태아 혈액, 태아 간, 감염 부위 (예를 들어 류마티즘 환자의 윤활액을 둘러싸는 염증이 생긴 관절), 종양 (예를 들어, 종양 침윤 림프구), 말초 혈액, 림프절에서, 페이어 패치(peyer's patches)에서, 편도선에서, 및 비장에서 또는 임의의 림프 기관을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아닌 임의의 혈액 또는 조직 근원으로부터 얻어질 수 있다. 일부 실시형태에서, 전체 조직 (예를 들어, 골수 또는 림프절)이 처리되고 (예를 들어, 세포가 서로 분리되고 용해되며), 유전 물질이 제거되고, 면역글로불린 사슬 (또는 그의 가변 영역)을 코딩하는 핵산 분자가 시퀀싱된다.

일부 실시형태에서, B 림프구는, B 림프구로부터 유전 물질을 분리하기 전에 그들을 함유하는 세포 (예를 들어, 말초 혈액)의 조직 또는 집단으로부터 풍부하다. 본 발명의 다양한 실시형태에 따르면, 동물로부터 B 림프구를 강화하는 방법은 잘 알려져 있다. B 림프구는 골수, 태아 혈액, 태아 간, 감염 부위 (예를 들어, 류마티즘 환자의 윤활액을 둘러싸는 염증이 생긴 관절), 종양 (예를 들어, 종양 침윤 림프구), 말초 혈액, 림프절에서, 및 비장을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아닌 신체의 많은 기관 및 부위에서 찾아질 수 있다. 이러한 조직 샘플 (예를 들어, 동물의 말초 혈액 또는 비장)로부터, 백혈구가 표준 방법에 따라 분리될 수 있다 (예를 들어, 제조자의 지시에 따라 GE Healthcare, Piscataway, NJ로부터 상업적으로 입수가능한 Ficoll-Paque PLUS 또는 Ficoll-Paque PREMIUM 시약을 이용하여). B 림프구 자체는 예를 들어, B 림프구에서 찾아진 세포 표면 표지(cell surface markers)를 이용하여 다른 백혈구로부터 추가적으로 분리될 수 있다. B 림프구 세포 표면 표지는 세포 표면 발현된 면역글로불린 사슬(cell surface expressed immunoglobulin chains)(예를 들어, 람다 경쇄, 카파 경쇄, 및 IgM 또는 IgG와 같은 중쇄)을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 추가적인 B 림프구 세포 표면 표지는 CD21, CD27, CD138, CD20, CD19, CD22, CD72, 및 CD79A를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 더 추가적인 B 림프구 세포 표면 표지는 CD38, CD78, CD80, CD83, DPP4, FCER2, IL2RA, TNFRSF8, CD24, CD37, CD40, CD74, CD79B, CR2, IL1R2, ITGA2, ITGA3, MS4A1, ST6GAL1, CD1C, CD138, 및CHST10을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

이러한 B 림프구 표면 표지는 B 림프구를 강화 하기 위하여 연속적으로 이용될 수 있다. 예를 들어, B 림프구 세포 표면 표지 (예를 들어, CD19)에 특이적인 항체가 마그네틱 비드 (예를 들어, Invitrogen Corp., Carlsbad, CA로부터 상업적으로 입수가능한 Dynabeads)에 결합될 수 있으며, 비드에 부착된 세포 (예를 들어, CD19 양성세포)가 비-CD19 발현 세포로부터 분리될 수 있다. B 림프구는 예를 들어, 그 세포 표면에서 면역글로불린 사슬을 발현하는 세포의 유동 세포 계수 분류에 의해 CD19 양성세포로부터 더 강화될 수 있다. 이러한 강화된 B 림프구는 본 발명의 다양한 실시형태의 방법에서 이용되도록 분리될 수 있다.

항원 특이적 B 세포 수용체(막 면역글로불린)를 발현하는 B 세포를 분리하기 위하여, 항원 특이적 B 림프구는 원하는 항원을 미끼로 이용하여 직접적으로 정제될 수 있다. 예를 들어, B 세포는 원하는 항원이 부착된 컬럼에 가해질 수 있다. 항원 특이적 B 세포는 비특이적 B 세포 또는 다른 세포 (예를 들어, 적혈구, 대식세포 등)보다 더 천천히 컬럼을 통하여 흐를 것이다. 따라서, 항원 특이적 B 세포는 이 방법을 이용하여 강화될 수 있다.

동물로부터 강화된, 또는 강화되지 않은 B 림프구 (예를 들어, 다양한 방법에 의해 강화된)는 핵산 추출 1, 또는 2, 또는 3, 또는 4일, 또는 그 이상 전에 시험관내 세포 배양될 수 있다. 그러한 시험관내 배양은 B 림프구의 수를 확장시킬 수 있으며, 따라서 비-B 림프구 세포에 비하여 B 림프구를 강화시킬 수 있다. 하나의 하나의 비제한적 예에서, B 림프구로부터 핵산 추출 전에 B 림프구의 성장 및/또는 분화를 자극하기 위하여, CD27 분리된 인간 B 림프구는, 핵산 추출 전에, 다양한 사이토카인 및 세포외 분자 칵테일 (활성화된 T 세포 처리된 배지, 또는 B 세포 성장 및/또는 분화 인자의 임의의 조합과 같은, 그러한 이에 제한되는 것은 아닌)에 놓여질 수 있다. 성장, 분화, 및/또는 시험관내 면역, 및/또는 그 조합을 돕기 위하여, 시험관내 배양 중에 다른 생물학적 분자도 조직 배지에 첨가될 수 있다.

이러한 분리된, 강화된, 또는 자극된 B 림프구로부터, 핵산 서열 (예를 들어, 게놈 DNA, hnRNA, mRNA 등)은 표준 방법을 이용하여 추출될 수 있다 (예를 들어, 페놀: 클로로포름 추출; 전술한 Ausubel et al. 참조). 이어서, 이 핵산은 다양한 시퀀싱 방법을 이용하여 시퀀싱 분석될 수 있다.

일부 실시형태에서, 핵산 서열은 생물학적 물질로부터 직접적으로 시퀀싱될 수 있다 (즉, 시퀀싱 전에 증폭되지 않음). 핵산 서열로부터 직접적으로 시퀀싱하는 서비스 및 시약은 예를 들어 Helicos BioSicences Corp. (Cambridge, MA)로부터 상업적으로 입수가능하다. 예를 들어, Helicos' True Single Molecule Sequencing에 의해 DNA, cDNA, 및 RNA의 직접적인 시퀀싱이 가능하다. 미국특허 US 7,645,596; US 7,037,687, US 7,169,560; 및 문헌 Harris et al., Science 320: 106-109, 2008; Bowers et al., Nat. Methods 6: 493-494, 2009; 및 Thompson and Milos, Genome Biology 12: 217, 2011 참조(이 특허 및 문헌은 모두 전체적으로 본 명세서에 참조로 포함된다).

다른 실시형태에서, 서열 정보를 얻기 전에, 핵산 서열이 증폭된다 (예를 들어, 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해).

하나의 비제한적 예에서, 올리고 dT PCR 프라이머가 RT-PCR에 이용된다. 다른 비제한적 예에서, 유전자 특이적 RT-PCR이 454 특이적 융합 생쥐 프라이머, 454 토끼 면역글로불린 사슬 융합 프라이머 또는 가변 중쇄 및 가변 경쇄 영역 프라이머와 같은 본 명세서에 서술된 PCR 프라이머를 이용하여 수행된다. 다른 예에서, 생쥐의 중쇄 및 경쇄 집단에 대한 PCR 프라이머는 본 명세서 참조로 포함되는 PCT 공개공보 WO2010/097435에 제시된다.

B 세포가 강화되거나, 또는 강화되지 않거나, NGS 시퀀싱 전에 라이브러리를 제조하기 위하여 정제된 유전 물질 (DNA 또는 mRNA)은 표준 방법 (예를 들어, 전술한 Ausubel et al. 참조)에 따라 증폭될 수 있다(예를 들어, PCR 또는 RT-PCR에 의해).

다양한 수단에 의해 분리된 전술한 B 림프구는 오일 에멀젼 캡슐화와 같은 당해 기술분야의 방법을 이용하여, 또는 RainDance 기술 (RainDance Technologies, Inc., Lexington, MA)과 같은 상업적인 기구에 의해 단일 세포 캡슐화되어질 수 있다. 이 캡슐화된 B 림프구는 이어서 적합한 증폭 프라이머를 갖는 적합한 단일 세포 RT-PCR 시약 (예를 들어, Qiagen에 의해, Cat # 210210로 팔리는 시약)에 융합되어, 각각의 단일 B 세포로부터 연결된 중쇄 및 경쇄 PCR 생성물을 생성할 수 있다. 결찰(ligation) 또는 오버랩(overlap) PCR이 이 분야에 알려져 있으며, 2개의 DNA 조각을 하나로 스티치하는 다양한 분자생물학 적용을 위하여 일상적으로 실시된다 (예를 들어, 오버랩 PCR에 대하여 Meijer P.J. et al., J. Mol. Biol. 358(3):764-72, 2006 참조). 이 접근법에 의해 시퀀싱 중에 동족 페어링 보존(cognate pairing preservation) 및 동정(identification during)이 가능하게 된다.

DNA 시퀀싱 방법

당해 기술분야에 잘 알려져 있고 일반적으로 이용가능한 DNA 시퀀싱 방법이 본 발명의 다양한 실시형태의 핵산 서열을 얻기 위하여 이용될 수 있다. 본 방법은 DNA 중합효소 Ⅰ의 Klenow 단편인 SEQUENASE® (US Biochemical Corp, Cleveland, Ohio), Taq 중합효소 (Invitrogen), 내열성 T7 중합효소 (Amersham, Chicago, Ill.), DNA 리가아제 (예를 들어, T4로부터) 또는 Gibco BRL (Gaithersburg, Md.)에 의해 시판되는 ELONGASE Amplification System과 같은, 재조합 중합효소와 프루프리딩 엑소뉴클리아제(proofreading exonucleases)의 조합과 같은 효소를 채용할 수 있다. 이 방법은 Hamilton Micro Lab 2200 (Hamilton, Reno, Nev.), Peltier Thermal Cycler (PTC200; MJ Research, watertown, Mass.) 및 ABI 377 DNA 서열기 (Applied Biosystems)과 같은 기계에 의해 자동화될 수 있다.

본 발명의 다양한 실시형태의 핵산 분자를 시퀀싱하고 핵산 서열을 생성하는 (예를 들어 유전 물질 데이터베이스에 데이터를 부가하는) 비제한적 방법은 Sanger 방법 (예를 들어, Sanger et al, Nature 24: 687-695, 1977 참조), Maxam-Gilbert 방법 (예를 들어, Maxam and Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 560-564, 1977 참조), 및 파이로시퀀싱(pyrosequencing) (예를 들어, Ronaghi et al., Science 281 (5375): 363, 1998 및 Ronaghi et al., Analytical Biochemistry 242 (1): 84, 1996 참조)을 포함한다. 폴리뉴클레오타이드 서열을 얻는데 이용될 수 있는 다른 비제한적 시퀀싱 방법인 파이로시퀀싱은 초기 DNA에 부가된 개별적인 뉴클레오타이드 (각각 dATP, dTTP, dGTP, 또는 dCTP, 집합적으로 "dNTPs")의 검출을 위한 빛을 생성하기 위하여 루시페라아제(luciferase)를 이용하며, 조합된 데이터는 서열 리드 아웃(read-outs)을 생성하기 위하여 이용된다.

일부 실시형태에서, 핵산 서열은 딥 시퀀싱(deep sequencing) 또는 차세대 시퀀싱을 이용하여 얻어진다. 통장적인 DNA 시퀀싱의 속도 제한 단계의 하나는 겔 전기영동에 의해 무작위로 종결된 DNA 폴리머를 분리하기 위한 필요성으로부터 발생된다. 차세대 시퀀싱 장치는 예를 들어 DNA 분자를 고체 표면에 물리적으로 배열하고, 겔 분리를 할 필요 없이 인 시츄로 DNA 서열을 결정함으로써, 이러한 제한을 우회한다. 이 높은 처리량의 시퀀싱 기술에 의해 많은 핵산 분자가 동시에 시퀀싱될 수 있다.

따라서, 수천 또는 수백만의 상이한 핵산 분자가 동시에 시퀀싱될 수 있다 ( Church, G.M., Sci. Am. 294 (1): 46-54, 2006; Hall, N., J. Exp. Biol. 210(Pt. 9): 1518-1525, 2007; Schuster et al., Nature Methods 5(1): 16-18, 2008; 및 MacLean et al., Nature Reviews Microbiology 7: 287-296, 2009 참조). 차세대 시퀀싱을 수행하기 위한 다수의 상이한 방법 및 기계가 존재하며, 이들은 모두 핵산 서열을 생성하는데 이용될 수 있다. 다수의 차세대 시퀀싱 기술의 개관을 위하여 Lin et al., Recent Patents on Biomedical Engineering 1:60-67, 2008 참조.

예를 들어, Shendure, J. et al., Science 309(5741): 1728-32, 2005 및 미국특허공개 US 20070087362는 결찰 기반 시퀀싱 방법을 이용하는 폴로니 차세대 시퀀싱(polony next generation sequencing) 방법을 서술한다(미국특허 US 5750341 참조). Applied Biosystems (a LifeTechnolgies Corp. company, Carlsbad, CA)으로부터 상업적으로 입수가능한 SOLiD 기술은 결찰에 의한 시퀀싱을 채용한다. SOLiD 기술을 이용함으로써, 시퀀싱되어야 하는 DNA 단편의 라이브러리가 에멀젼 PCR에 의해 증폭되며, 라이브러리의 다수의 단편 중에서, 단일 단편 종이 단일 마그네틱 비드 (소위, 클로날 비드(clonal beads))에 부착될 것이다. 마그네틱 비드에 부착된 단편은 부착된 유니버셜 P1 어댑터(universal P1 adapter) 서열을 가지므로, 각 단편의 출발 서열은 알려지고 동일하다. 이어서, 라이브러리 주형 내에서 P1 어댑터 서열에 하이브리다이즈(hybridize)되는 프라이머가 선택된다. 한 세트의, 4개의 형광 표지된 이염기 프로브는 결찰을 향하여 시퀀싱 프라이머에 대하여 경쟁한다. 이염기 프로브의 특이성은 각각의 결찰 반응에서 매 1번째 염기 및 2번째 염기를 검색(interrogating)함으로써 이루어진다.

Margulies et al., Nature 437: 376-380, 2005 및 미국특허 US 7,211,390; US 7,244,559; 및 US 7,264,929의 다른 차세대 시퀀싱 방법은 오일 용액의 물 방울 내에서 DNA를 증폭하는 파이로시퀀싱과 유사한 버전을 서술하며, 각각의 방울은 단일 프라이머-코팅된 비드에 부착된 단일 DNA 주형을 함유한다. 시퀀싱 기계 (454 Life Sciences, a Roche company, Branford, CT로부터 상업적으로 입수가능한 Genome Sequencer FLX System 기계)를 이용하여, 올리고뉴클레오타이드 어댑터는 단편화된 핵산 분자에 대하여 결찰된 후, 오일 방울 에멀젼에서 증폭되기 전에 미세한 비드의 표면에 고정화된다. 이어서, 비드는 다수의 피코리터 부피의 웰에서 분리되며, 각각은 단일 비드, 시퀀싱 효소, 및 dNTPs를 함유한다. dNTP를 상보적 가닥에 포함시키면 파이로포스페이트(pyrophosphate)를 방출하며, 이는 ATP를 생산하고, 이는 차례로 분석용 이미지로 기록될 수 있는 빛을 생성한다.

미국특허 US 7,115,400는 핵산 분자의 고체상 증폭을 위한 다른 기술을 서술한다. 이에 의하여, 다수의 상이한 핵산 서열이 정렬되고 동시에 증폭될 수 있다. 이 기술은 Solexa (Illumina, Inc.)로부터 상업적으로 입수가능한 TGenome Analyzer 시스템에 구현된다. 이 기술에서, DNA 분자는 먼저 슬라이드 상의 프라이머에 부착되고, 증폭되어, 국부적인 클로날 콜로니(clonal colonies)가 형성된다 (브리지 증폭). 4가지 형태의 ddNTPs가 첨가되고, 비-포함된 뉴클레오타이드는 세척에 의해 제거된다. 파이로시퀀싱과 달리, DNA는 한번에 하나의 뉴클레오타이드만 확장될 수 있다. 카메라가 형광 표지된 뉴클레오타이드의 이미지를 찍은 후, 말단 3' 차단제 (terminal 3' blocker)와 함께 염색제가 DNA로부터 화학적으로 제거되어 다음 사이클이 가능하게 된다.

프로모터 및 조절 요소와 같은 업스트림 서열을 검출하기 위하여, 면역글로불린 사슬 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 부분적 뉴클레오타이드 서열을 이용하고 당해 기술분야에 공지된 다양한 방법을 채용하여 확장될 수 있다. 예를 들어, 채용될 수 있는 하나의 방법인 "제한부위(restriction-site)" PCR은 알려진 위치에 인접한 알려지지 않은 서열을 검색하기 위하여 유니버셜 프라이머를 이용한다 (Sarkar, G., PCR Methods Applic. 2: 318-322 (1993)). 특히, 게놈 DNA는 먼저 링커 서열에 대한 프라이머 및 공지 영역에 대해 특이적인 프라이머의 존재 하에 증폭된다. 예시적인 프라이머는 본 명세서의 실시예 4에 서술된 것이다. 이어서, 증폭된 서열은 동일한 링커 프라이머 및 첫 번째 것에 대해 내부의 다른 특이적 프라이머에 의한 PCR의 두 번째 라운드에 놓여진다. PCR 각 라운드의 생성물은 적합한 RNA 중합효소에 의해 전사되고, 역전사 효소를 이용하여 시퀀싱된다.

역 PCR(Inverse PCR)은 공지된 영역에 근거하여 다른 프라이머를 이용하여 서열을 증폭 또는 확장시키는데 이용될 수 있다(Triglia et al., Nucleic Acids Res. 16: 8186 (1988)). 프라이머는 OLIGO 4.06 프라이머 분석 소프트웨어 (National Biosciences Inc., Plymouth, Minn.) 또는 다른 적합한 프로그램을 이용하여 길이가 22-30개 뉴클레오타이드가 되고, 50% 이상의 GC 함량을 가지며, 약 68-72℃의 온도에서 타겟 서열에 어닐링(anneal)되도록 설계될 수 있다. 이 방법은 공지의 유전자 영역에 적합한 단편을 생성하기 위하여 몇몇 제한 효소를 이용한다. 이어서, 단편은 분자내 결찰에 의해 순환되고, PCR 주형으로 이용된다.

이용될 수 있는 다른 방법은 포획 PCR(capture PCR)이며, 이는 인간 및 효모 인공 염색체 DNA에서 공지된 서열에 인접한 DNA 단편의 PCR 증폭을 포함한다 (Lagerstrom et al., PCR Methods Applic. 1: 111-119 (1991)). 이 방법에서, PCR을 수행하기 전에 조작된 이중가닥 서열을 DNA 분자의 알려지지 않은 부분에 넣기 위하여 다중 제한 효소 소화 및 결찰이 이용될 수 있다. 알려지지 않은 서열을 검색하기 위하여 이용될 수 있는 다른 방법은 Parker et al., Nucleic Acids Res. 19: 3055-3060 (1991))에 서술된 것이다. 또한, PCR, 네스티드(nested) 프라이머, 및 게놈 DNA로 들어가기 위한 PROMOTERFINDER® 라이브러리를 이용할 수 있다(Clontech, Palo Alto, Calif.). 이 과정은 라이브러리를 스크리닝하는 것을 피할 수 있으며, 인트론/엑손 접합을 찾는데 유용하다.

B 림프구로부터의 핵산은 시퀀싱 전에 면역글로불린을 코딩하는 그 핵산 분자에 대하여 추가적으로 스크리닝될 수 있음을 이해하여야 한다. 이를 위하여, 면역글로불린-코딩 핵산 분자에 특이적인 (또는 그에 인접한 영역에 특이적인) 프라이머가 채용될 수 있다.

본 명세서에 이용된 바와 같이, "프라이머"는 길이가 적어도 약 15개 뉴클레오타이드, 또는 적어도 약 20개 뉴클레오타이드, 또는 적어도 약 30개 뉴클레오타이드, 또는 적어도 약 40개 뉴클레오타이드일 수 있는 핵산 서열을 의미한다. 특정 핵산 분자에 특이적인 프라이머는 PCR 어닐링 조건 (예를 들어, 30초 동안 60℃) 하에서 핵산 분자의 일부에 하이브리다이즈하는 프라이머를 포함하는 것을 의미한다. 일부 실시형태에서, 특정 핵산 분자에 특이적인 프라이머는 그 핵산 분자에 상보적인 것이다.

핵산 서열을 시퀀싱하는데 이용되는 프라이머는 시퀀싱 프라이머로 나타내어질 수 있다. 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의한 타겟 핵산 서열의 증폭에 이용되는 프라이머는 PCR 프라이머 또는 증폭 프라이머로 나타내어질 수 있다 (예를 들어, 전체적으로 본 명세서에 참조로 포함되는 전술한 Sambrook et al., 및 전술한 Ausubel et al.의 PCR의 설명 참조).

본 발명의 다양한 실시형태에 따른 핵산 서열을 얻기 위한 하나의 비제한적 예에서, B 림프구로부터 총 핵산이 단일 가닥으로 만들어질 수 있다 (예를 들어, 핵산을 적어도 1분 동안 94-98℃로 가열함으로써). 이어서, 단일 가닥 핵산은, 면역글로불린-코딩 핵산 분자의 비-가변 영역 또는 그에 인접한 비-코딩 영역 (예를 들어, 면역글로불린 유전자 프로모터, 인핸서(enhancers) 및/또는 인트론)에 특이적인 단일 가닥 프라이머가 부착되는 고형 지지체 (예를 들어, 컬럼 또는 겔) 위를 지나게 될 수 있다. 이러한 면역글로불린의 비-가변 영역의 일부 비제한적 예는 중쇄의 불변 영역, 경쇄의 불변 영역, 및 중쇄 또는 경쇄의 어느 하나의 FR1 영역을 포함한다. 핵산은 고형 지지체-결합된 프라이머에 하이브리다이즈되게 되고, 비-하이브리다이징 핵산은 제거된다. 제거 후에, 하이브리다이즈된 핵산 (이는 면역글로불린-코딩 핵산 분자가 강화된)은 예를 들어, 열을 부가하거나, 또는 버퍼 중의 EDTA 농도를 증가시킴으로써 프라이머로부터 방출된다.

본 발명의 다른 실시형태에서, B 림프구로부터의 핵산에 면역글로불린-코딩 핵산 분자가 강하되든지 아닌지에 무관하게, 면역글로불린-코딩 핵산 분자는 그들의 복제수를 증가시키기 위하여 증폭될 수 있다. 이 증폭은 예를 들어 면역글로불린-코딩 핵산 분자의 비-가변 영역 또는 그에 인접한 비-코딩 영역에 특이적인 프라이머를 이용하는 PCR 증폭에 의해 수행될 수 있다.

본 발명의 다양한 실시형태에 따른 핵산 서열을 얻기 위한 전술한 모든 방법에서, 면역글로불린 사슬 가변 영역-코딩 핵산 서열을 생성하기 위하여 이용된 프라이머 (예를 들어, 시퀀싱 또는 PCR 프라이머)는 유니버셜일 수 있으며 (예를 들어, polyA 꼬리), 또는 면역글로불린-코딩 서열에 특이적일 수 있다.

일부 실시형태에서, 면역글로불린 유전자-코딩 핵산 서열 정보가 얻어지는 출발 물질은 게놈 DNA이다. 예를 들어, 면역글로불린 사슬 가변 영역이 인간으로부터인 경우, 프라이머 (예를 들어, 시퀀싱 프라이머 및/또는 PCR 프라이머)는 면역글로불린 사슬 유전자 프로모터와 동일하도록 또는 면역글로불린 사슬 유전자 프로모터에 하이브리다이즈되도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 인간 게놈 서열은 알려져 있다. 중쇄-코딩 유전자는 14번 염색체에 존재하며, 경쇄-코딩 유전자는 22번 염색체 (람다 경쇄) 및 2번 염색체 (카파 경쇄)에 존재하므로, 중쇄-코딩 유전자 및 경쇄-코딩 유전자의 조절 요소에 하이브리다이즈하는 프라이머를 설계하는 것은 통상적인 기술을 갖는 생물학자에게 일상적일 것이다. 그러한 조절 요소는 프로모터, 인핸서 및 인트론을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

쥐의 카파 경쇄 유전자는 6번 염색체에 위치하고, 쥐의 중쇄 유전자는 12번 염색체에 위치하는 것으로 알려져 있으므로, 면역글로불린 가변 영역-특이적 프라이머는 생쥐 면역글로불린에 대하여 유사하게 쉽게 결정될 수 있다.

다른 비제한적 실시형태에서, 면역글로불린 유전자-코딩 핵산 서열 정보가 얻어지는 출발 물질은 mRNA, 또는 mRNA로부터 역번역된(reversed translated) cDNA이다. 이 실시예에서, 면역글로불린 가변 영역-코딩 핵산 서열을 얻기 위하여, 프라이머는 mRNA의 polyA 꼬리, 또는 mRNA의 상응하는 cDNA의 상보적 TTTT (SEQ ID NO: 306)-풍부 서열과 동일하도록, 또는 이에 하이브리다이즈되도록 선택될 수 있다. 그 대신에, 또는 부가적으로, 프라이머는 FR1-코딩 핵산 서열과 동일하도록 또는 이에 하이브리다이즈되도록 선택될 수 있다. 그 대신에, 또는 부가적으로, 프라이머는 CH 영역 (즉, CH1, CH2, 또는 CH3)의 하나의 일부 (또는 전부) 및/또는 VH 영역-코딩 핵산 서열과 동일하도록, 또는 이에 하이브리다이즈되도록 선택될 수 있다.

시퀀싱 오류는 하이브리도마로부터 면역글로불린을 코딩하는 핵산 분자를 시퀀싱하기 위하여 유니버셜 축퇴 프라이머(universal degenerate primers)를 사용하는 것으로부터 발생할 수 있다. 예를 들어, Essono et al, Protein Engineering, Design and Selection, pp. 1-8, 2009는 하이브리도마 클론에 의해 생성된 모노클로날 항체의 정확한 서열을 결정하기 위하여 상응하는 Ig 사슬의 펩타이드 질량 분석 지문법을 시퀀싱과 결합하는 방법을 서술한다. 그러나, 본 발명의 다양한 실시형태의 비제한적 방법에서, 시퀀싱 오류의 존재는 단지 상이한 핵산 서열의 수를 증가시킬 것이다. 전술한 Essono et al.와 달리, 본 발명의 다양한 실시형태의 방법은 항체의 출발 폴리클로날 집단으로부터 단일 항체 (중쇄 및 경쇄, 또는 그의 가변 영역)의 생성을 가능하게 하므로(여기에서, 생성된 항체는 항체의 출발 폴리클로날 집단 내에 실제로 존재하지 않을 수 있다), 펩타이드의 관찰된 질량 스펙트럼 데이터와 서로 연관되는 유전 물질 데이터베이스에 다수의 서열을 갖는 것이 자산이다.

유전 물질 데이터베이스로부터의 예측된 질량 스펙트럼 정보

본 발명의 다양한 실시형태에 따르면, 핵산 분자의 뉴클레오타이드 서열이 생성되면, 추가적인 정보는 뉴클레오타이드 서열 정보 단독에 근거하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오타이드 서열 정보는 유전 코드를 이용하여 예측된 아미노산 서열로 번역될 수 있다. 당해 기술분야의 통상의 기술자가 유전 코드를 이용하여 뉴클레오타이드 서열을 아미노산 서열로 쉽게 번역할 수는 있으나, EMBOSS Transeq 번역 툴과 같은 몇몇 자동화된 번역 툴이 이용될 수 있다.

유사하게, 핵산 서열에 의해 코딩된 예측된 아미노산 서열의 예측된 질량 스펙트럼 정보는 당해 기술분야의 통상의 기술자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 예를 들어, 핵산 서열에 의해 코딩되는 예측된 폴리펩타이드의 가상 (즉, 인 실리코) 소화에 따라, 펩타이드 단편의 예측된 질량 스펙트럼은 Sequest 소프트웨어 (Thermo Fisher Scientific, Inc., West Palm Beach, FL로부터의), Sequest 3G 소프트웨어 (Sage-N Research, Inc., Milpitas, CA로부터의), Mascot 소프트웨어 (Matrix Science, Inc., Boston, MA; 또한 Electrophoresis, 20(18) 3551-67 (1999) 참조), 또한 X!Tandem 소프트웨어 (The Global Proteome 기계 Organization로부터 오픈소스, 그 이용은 The Global Proteome 기계 Organization에 기재되어 있음)을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아닌 표준 공개적으로 이용가능한 소프트웨어 알고리즘 툴을 이용함으로써 생성될 수 있다.

본 명세서에 이용된 바와 같이, 단어 "예측된(predicted)" "이론적(theoretical)," 및 "가상의(virtual)"는 핵산 서열로부터 정보의, 인 실리코 (즉, 컴퓨터상에서) 전사 및/또는 번역 (예측된 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열에 대하여) 또는 인 실리코 소화 및/또는 질량 분석 (예측된 질량 스펙트럼에 대하여)으로부터 유래되는 뉴클레오타이드 서열, 아미노산 서열 또는 질량 스펙트럼을 나타내기 위하여 상호교환적으로 이용된다. 예를 들어, 핵산 서열은 본 명세서에 서술된 바와 같이 B 림프구로부터 얻어진 게놈 핵산 분자로부터 유래된다. 예를 들어, 게놈 DNA로부터 유래된 mRNA의 뉴클레오타이드 서열은 게놈 DNA의 인 실리코 번역에 따라 예측된다. 이어서, 예측된 아미노산 서열을 생성하기 위하여, 이 예측된 mRNA (또는 cDNA)는 인 실리코 번역될 수 있다. 이어서, 예측된 (또는 이론적인 또는 가상의) 펩타이드 단편을 생성하기 위하여, 예측된 아미노산 서열은 프로테아제 (예를 들어, 트립신) 및/또는 화학적 단백질 절단 시약 (예를 들어, 브롬화시안)으로 인 실리코 소화될 수 있다. 이어서, 예측된 질량 스펙트럼 정보를 생성하기 위하여, 가상 펩타이드 단편이 분석될 수 있다. 따라서, 예측된 질량 스펙트럼 정보, 예측된 펩타이드 단편, 예측된 아미노산 서열, 및 예측된 mRNA 또는 cDNA 서열은 모두 B 림프구 (예를 들어, 동물로부터)로부터 수집된 핵산 서열로부터 유래될 수 있다.

일정한 실시형태에서, 예측된 펩타이드 단편 및 궁극적으로 예측된 질량 스펙트럼을 생성하기 위하여 예측된 폴리펩타이드를 소화하는데 이용되는 프로테아제(들) 및/또는 화학적 시약은 전술한 바와 같이 폴리클로날 항체의 출발 집단을 소화하는데 이용된 프로테아제(들) 및/또는 시약(들)과 동일하다.

관찰된 질량 스펙트럼과 예측된 질량 스펙트럼의 상호 연관

전술한 바와 같이,항체의 출발 폴리클로날 집단으로부터 유래된 단편이 질량 분석계를 통과함으로써 다수의 관찰된 질량 스펙트럼이 생성된다. 폴리클로날 집단 내의 잠재적으로 다수인, 질량 분석계로 분석되는 각각 상이한 아미노산 서열을 갖는 상이한 면역글로불린을 고려하면, 얻어진 관찰된 질량 스펙트럼은 기능적 면역글로불린 사슬 가변 영역으로 다시 어셈블링되기 어려울 것이다. 본 발명의 다양한 실시형태의 방법에서, 코딩 핵산 서열이 이용가능하므로, 관찰된 질량 스펙트럼 데이터를 어셈블링할 필요가 없다. 대신에, 출발 폴리클로날 면역글로불린 집단으로부터 항원에 특이적으로 결합하는 면역글로불린의 전장 면역글로불린 사슬 (또는 그의 가변 영역)의 아미노산 (및 근본적으로 뉴클레오타이드) 서열을 얻기 위하여, 관찰된 질량 스펙트럼은 유전 물질 데이터베이스의 핵산 서열로부터 유래된 예측된 질량 스펙트럼과 서로 연관된다.

또한 전술한 바와 같이, 유전 물질 데이터베이스는 전장 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 및 그 가변 영역을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는, 면역된 동물의 B-세포 레퍼토리로부터 분리된 핵산 분자로부터 유래될 수 있다. 유전 물질 데이터베이스로부터의 정보 (예를 들어, 가변 영역 서열의 빈도 순위)에만 근거하여 항원 특이적 면역글로불린을 코딩하는 핵산을 동정하기 위한 시도는 여전히 우수한 항원 특이적 활성을 나타내는 저빈도로 존재하는 면역글로불린을 놓칠 수 있다. 그러나, 본 발명의 다양한 실시형태에 따르면, 본 명세서에 개시된 바와 같이 유전 물질 데이터베이스로부터의 예측된 질량 스펙트럼 정보를 실제 순환하는 폴리클로날 항체로부터의 관찰된 질량 스펙트럼 정보와 서로 연관시킴으로써, 순환하는 폴리클로날 항체 내의 면역글로불린에 해당하는, 유전 물질 데이터베이스 내의 그러한 면역글로불린 사슬 (또는 그의 가변 영역)이 선택될 수 있다.

"연관(correlating)"은, 출발 폴리클로날 집단에서 항원 특이적 면역글로불린의 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄 (또는 그의 가변 영역)에 해당하는, 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄 (또는 그의 가변 영역)가 유전 물질 데이터베이스로부터 동정 또는 식별될 수 있도록, 출발 폴리클로날 항체로부터 유래되는 관찰된 질량 스펙트럼 정보와 유전 물질 데이터베이스로부터 유래되는 예측된 질량 스펙트럼 정보가 상호참조되며(cross-referenced) 서로 비교되는 것이다.

특정 실시형태에서, 연관 과정은 매치(matches)를 확인하기 위하여 관찰된 질량 스펙트럼 정보를 예측된 스펙트럼 정보와 비교하는 것을 포함한다. 예를 들어, 각각의 관찰된 스펙트럼은 유전 물질 데이터베이스로부터 유래되는 예측된 질량 스펙트럼의 수집에 대하여 검색될 수 있으며, 각각의 예측된 스펙트럼은 유전 물질 데이터베이스로부터의 펩타이드 서열에 인식가능하게 결합된다. 매치가 발견되면, 즉, 관찰된 질량 스펙트럼이 예측된 질량 스펙트럼과 매치되면, 각각의 예측된 질량 스펙트럼은 유전 물질 데이터베이스의 펩타이드 서열에 인식가능하게 결합되므로, 관찰된 질량 스펙트럼은 그의 매칭(matching) 펩타이드 서열을 찾았다라고 말해지며, 그러한 매치는 또한 "펩타이드 스펙트럼 매치" 또는 "PSM"로 나타내어진다. 다수의 스펙트럼이 검색 및 매치되므로, 이러한 검색 및 매칭 과정은 SEQUEST 알고리즘 (Sage-N Research, Inc., Milpitas, CA)과 같은 컴퓨터-실행 기능 및 소프트웨어에 의해 수행될 수 있다.

일부 실시형태에서, 검색 및 매칭은 가변 영역 서열, 불변 영역 서열, 및/또는 일 이상의 CDR 서열과 같은, 면역글로불린의 기능적 도메인(functional domains) 또는 단편에 관한다. 예를 들어, V 영역 (및/또는 CDR3) PSMs를 동정하기 위하여, 관찰된 스펙트럼은 면역글로불린의 V 영역 (및/또는 CDR3 서열)으로부터 유래되는 예측된 질량 스펙트럼에 대하여만 검색된다. 다른 실시형태에서, 검색 및 매칭은 전체(full)-면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 서열에 관한다.

검색 및 매칭이 완료된 후, 유전 물질 데이터베이스의 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄는 일 이상의 하기 파라미터에 근거하여 분석 및 선택된다: 특유한 펩타이드의 수, 스펙트럼 점유율, 아미노산 서열 커버리지, 펩타이드의 계수 (총 펩타이드 계수 또는 특유한 펩타이드 계수), 코딩 핵산 서열의 빈도, 및 복제 상호 관련성.

서열 또는 영역 (예를 들어, 중쇄 또는 경쇄 서열, V 영역 서열, 또는 CDR 서열)에 대해 이용된 용어 "커버리지"는 서열 또는 영역에서의 아미노산의 수로 나뉘어진, 서열 또는 영역에 대하여 맵핑(map)되고, 매칭 관찰된 스펙트럼(matching observed spectrum)을 갖는 펩타이드에서 동정되었던 서열 내의 아미노산의 총수로서 정의된다. 커버리지가 클수록, 서열 또는 영역은 실제 폴리클로날 집단에 더 잘 나타난다.

"특유한 펩타이드의 수"는 단일 단백질 서열 (예를 들어, 단일 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄, 또는 그의 가변 영역)에 대하여 맵핑되는 관찰된 별개의 펩타이드의 수를 의미한다. 이 수가 클수록, 면역글로불린 사슬이 폴리클로날 집단 내에 더 잘 존재한다. 특정 실시형태에서, 면역글로불린 사슬의 선택은 면역글로불린 사슬 또는 그의 가변 영역에서 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 이상의 특유한 펩타이드 수에 근거하여 이루어진다.

"스펙트럼 점유율"은 서열에 대하여 맵핑된 펩타이드의 총수를 전체 유전자 데이터베이스에 대하여 맵핑된 신뢰성 있는(confident) PSMs의 총수로 나눔으로써 결정된다. 스펙트럼 점유율은 특정한 V 영역 서열에 대하여 맵핑된, PSMs의 퍼센티지로 표현된, 인간이 해독가능한 펩타이드의 계수(count)를 제공한다.

단백질 서열 (예를 들어, CDR3 영역 또는 가변 영역)에 대해 이용된 용어 을 나타내는 "펩타이드 계수"는 펩타이드가, 단백질 서열에 매칭되는 관찰된 질량 스펙트럼으로부터 동정되는 횟수를 나타낸다. 예를 들어, CDR3 영역의 계수는 펩타이드가, CDR3 영역에 매칭되는 관찰된 질량 스펙트럼으로 동정되는 횟수를 의미한다. 가변 영역의 계수는 펩타이드가, 가변 영역에 매칭되는 관찰된 질량 스펙트럼으로부터 동정되는 횟수를 의미한다. 단백질 서열에 대해 이용된 "총 펩타이드 계수"는 임의의 (특유한 또는 특유하지 않은) 펩타이드가, 단백질 서열에 매칭되는 관찰된 질량 스펙트럼으로부터 동정되는 횟수를 의미한다. "특유한 펩타이드 계수"는 특유한(unique) 펩타이드가, 단백질 서열에 매칭되는 관찰된 질량 스펙트럼으로부터 동정되는 횟수를 의미한다. 동일한 펩타이드가 관찰된 질량 스펙트럼으로부터 다수회 동정되면, 이 펩타이드가 관찰된 총 횟수는 총 펩타이드 계수를 결정하는데 고려되며, 이 펩타이드는 특유한 펩타이드 계수를 결정하기 위해서는 1번만 세어진다.

특정 실시형태에서, 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄는 서열 커버리지에 근거하여 선택된다. 다른 실시형태에서, 이 선택은 특유한 펩타이드의 수, 스펙트럼 점유율, 총 펩타이드 계수, 특유한 펩타이드 계수, 코딩 핵산 서열의 빈도, 또는 복제 상호 관련성을 포함하는 일 이상의 다른 파라미터와 서열 커버리지의 조합에 근거하여 이루어진다.

상기 파라미터는 전장 중쇄 또는 경쇄에 대하여, 또는 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄의 일 이상의 부분, 예를 들어, 가변 영역, CDR (예를 들어, CDR1, CDR2, 또는 CDR3, 특히 CDR3)에 대하여 독립적으로 결정될 수 있다. 일정한 실시형태에서, 면역글로불린 사슬 (또는 그의 가변 영역)의 선택은 V 영역 커버리지 및/또는 CDR 커버리지 (예를 들어, CDR3 커버리지)에 근거하여 이루어진다.

면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 (또는 그의 가변 영역)의 선택은 일 이상의 파라미터의 절대값에 근거하여, 또는 관련된 파라미터에 대한 절대값의 등급(ranking of absolute values)에 근거하여 이루어질 수 있다. 특정 파라미터에 대한 등급이 고려되는 경우, 그 파라미터의 절대값에 상관없이 최상위의 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100개, 또는 그 이상의 서열이 선택될 수 있다. 파라미터의 값이 고려되는 경우, 예를 들어, 서열 커버리지의 퍼센티지, 일부 실시형태에서, 면역글로불린 사슬의 선택은 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 그 이상의 CDR 커버리지 (CDR3 커버리지)에 근거하여 이루어질 수 있으며; 또한 대신에, 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 그 이상의 V 영역 커버리지에 근거하여 이루어질 수 있다.

일부 실시형태에서, 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역, 또는 일 이상의 CDR's (예를 들어, CDRH3 또는 CDRL3)의 복제 상호 관련성을 결정하기 위하여 계통발생학적 분석이 수행된다. 　생식계열 서열에 비교한 중쇄 및 경쇄의 핵산 서열의 변화 또는 돌연변이는 항원 노출 후에 항체의 친화성 성숙(affinity maturation)의 증거를 제공할 수 있다. 복제 상호 관련성은 항체 서열의 선택에서 인자로 이용될 수 있다. 계통발생학적 분석은 당해 기술분야에 공지된 방법, 예를 들어, Dereeper et al., 2008, Nucl. Acids Res., 36(Web Server issue):W456-459; Dereeper et al., 2010, BMC Evol. Biol., 10:8에 서술된 방법, 및 이용가능한 온라인 www.phylogeny.fr/version2_cgi/index.cgi에 의해 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 전체 중쇄 또는 경쇄 가변 영역은 상동성에 의해 분류된 후, CDR (예를 들어, CDR3) 상동성에 의해 더 분류된다.

선택된 중쇄 및 경쇄 서열은 둘씩 짝을 지어 발현되어, 항원 특이적 기능성을 확인하기 위하여 분석되는 모노클로날 항체로 어셈블링될 수 있다. 선택된 중쇄 및 경쇄 서열의 페어링은 완전히 무작위일 수 있으며, 또는 서열 커버리지, 펩타이드의 특유한 수, 스펙트럼 점유율, 총 펩타이드 계수 및 특유한 펩타이드 계수를 포함하는 전술한 일 이상의 파라미터를 고려할 수 있다.

일부 실시형태에서, 특정 펩타이드 서열을 갖는 항체 집단의 풍부도(abundance)는 무거운 동위원소 표지된 (예를 들어, AQUA) 펩타이드를 이용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, WO 03/016861 및 Gerber et al., 2003, 100:6940-45 참조. 이 방법은, 펩타이드 표준물과 비교함으로써, 생물학적 샘플 내의 동일한 서열 및 단백질 변형(modification)을 갖는 펩타이드의 절대량을 결정하기 위하여, 알려진 양의 적어도 하나의 무거운 동위원소 표지된 펩타이드 표준물 (LC-SRM 크로마토그래피에 의해 검출가능한 표시를 갖는)을 소화된 생물학적 샘플 내에 도입하는 것을 채용한다. 펩타이드는 1종의 항체에 특유할 수 있으며, 또는 다수 (예를 들어, 클론적으로 관련된(clonally-related)) 항체에서 발견될 수 있다. 일부 실시형태에서, 펩타이드는 CDR (예를 들어, CDR3)의 적어도 일부분을 포함할 수 있다. 항체 집단의 풍부도의 정량화는 예를 들어 대상의 예방 접종(vaccination) 후에 혈청 항체 조성물을 모니터링하는 방법에 유용할 수 있다.

그 아미노산 서열 (또는 핵산 서열)이 본 발명의 다양한 실시형태의 비제한적 방법을 이용하여 생성되는, 항원에 특이적으로 결합하는 면역글로불린은 면역글로불린의 출발 폴리클로날 집단 내에 실제로 존재할 필요가 없다는 것을 주목하여야 한다. 오히려, 본 발명의 다양한 실시형태의 비제한적 방법은 면역글로불린이 출발 폴리클로날 집단에 실제로 존재하든지 그렇지 않든지, 항원에 특이적으로 결합하는 면역글로불린의 신속한 생성을 가능하게 한다. 예를 들어, 가장 바람직한 품질 (예를 들어, 항원 또는 원하는 아이소타입 (예를 들어, IgG2a)에 대하여 가장 높은 결합 친화성 (또는 가장 낮은 KD))을 갖는 생성된 면역글로불린은 폴리클로날 집단에서 제2 항체 (즉, 제1 항체와 상이한)의 중쇄에 어셈블링되는 폴리클로날 집단의 제1 항체로부터의 경쇄의 결과일 수 있다. 얻어진 생성된 면역글로불린은 표준 방법에 따라 더 특성화될 수 있다 (예를 들어, 항원 또는 아이소타입에 대한 결합 친화성).

재조합 항체의 제조방법

항원에 특이적으로 결합하는 항체의 면역글로불린 사슬 (또는 그의 가변 영역)의 뉴클레오타이드 서열이 밝혀지면, 그 서열을 포함하는 핵산 분자가 생성될 수 있다.

예를 들어, 면역글로불린 사슬 (또는 그의 가변 영역)-코딩 핵산 분자가 얻어지는 출발 집단이 cDNA 라이브러리이면, 밝혀진 서열을 포함하는 핵산 분자는 라이브러리로부터 쉽게 얻어질 수 있다 (예를 들어, 밝혀진 서열의 부분과 동일하거나 또는 이와 하이브리다이징할 수 있는 프라이머에 의해 라이브러리를 스크리닝함으로써, 또는 밝혀진 핵산 서열을 증폭하도록 설계된 프라이머를 이용하여 라이브러리ㄹ로부터 핵산 분자를 PCR 증폭시킴으로써).

대신에 (또는 부가적으로), 밝혀진 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자는 표준 DNA 합성 기계를 이용하여 핵산 분자를 간단히 인공적으로 생성함으로써 생성될 수 있다. BioAutomation, Plano, TX로부터 상업적으로 입수가능한 다수의 MerMade 합성기 시리즈 (예를 들어, MerMade 4, Mermade 6, MerMade 384 등); Applied Biosystems (현재 Life Technologies, Corp., Carlsbad, CA의 일부임)로부터 상업적으로 입수가능한 다양한 DNA/RNA 합성기를 포함하나 이에 제한되는 것은 아닌 다수의 DNA 합성 기계가 상업적으로 입수가능하다. 몇몇 회사들은 DNA 합성 서비스 (예를 들어, BioPioneer, Bio S&R, Biomatik, Epoch BioLabs 등)를 제공한다.

재조합 면역글로불린을 생산하기 위하여 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 핵산을 발현시키는 방법이 알려져 있다(예를 들어, 미국특허공개 US 6,331,415; US 5,969,108; US 7,485,291; US 2011-0045534; 및 PCT 공개공보 WO 2011/022077 참조). 재조합 면역글로불린은 곤충 세포 (예를 들어, SF9 세포), 햄스터 세포 (예를 들어, CHO 세포), 쥐 세포 (예를 들어, NIH-3T3 세포), 영장류 세포 (예를 들어, COS 세포), 인간 세포 (예를 들어, 헬라 세포), 및 원핵 세포 (예를 들어, E. coli 세포)를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아닌 다수의 세포에서 만들어질 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 다양한 실시형태의 재조합 면역글로불린을 발현하는 세포는 면역글로불린이 원래 유래된 종의 것과 유사한 방식으로 재조합 면역글로불린에 2차 변형(secondary modifications)(예를 들어, 글리코실화)을 가할 수 있다. 예를 들어, 그 단편이 관찰된 질량 스펙트럼 데이터를 생성하기 위하여 이용되는 폴리클로날 항체의 집단이 인간으로부터 수집되는 경우, 인간 세포 (또는 인간 세포와 유사하게 또는 동일하게 단백질을 글리코실화하는 세포)가 이용될 수 있다.

세포에서, 항원에 대하여 특이적으로 결합하는 재조합 면역글로불린 (또는 그의 항원 결합 단편)의 핵산 서열의 발현을 얻기 위하여, 삽입된 핵산 서열이, 핵산 서열이 도입되는 세포에서 발현되도록, 핵산 서열은 적절한 조절 서열을 함유하는 벡터 (예를 들어, 플라스미드 또는 레트로바이러스 벡터)로 결찰될 수 있다. 그러한 조절 서열은 예를 들어, 프로모터, 인핸서, 인트론 수용체 요소(intron acceptor elements), 폴리아데닐레이션 부위(poly adenylation sites) 등을 포함한다. 전기천공, 화학적 수단 (예를 들어, CaPO4, DEAE-덱스트란, 폴리에틸렌이민)에 의한 형질감염(transfection), 감염, 형질도입(transduction), 리포좀 융합(liposome fusion) 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아닌 임의의 방법이 재조합 면역글로불린 (또는 이를 함유하는 벡터)의 핵산 서열을 세포로 도입하는데 채용될 수 있다 (예를 들어, 전술한 Ausubel et al.에서의 방법 참조).

본 발명의 일부 실시형태에 따르면, 면역글로불린 중쇄 및 면역글로불린 경쇄는 무작위적으로 선택되어 면역글로불린 (또는 그의 가변 영역 또는 항체 결합 도메인)으로 어셈블링된다. 예를 들어, 폴리클로날 항체의 펩타이드 단편으로부터의 실제 질량 스펙트럼과 핵산 서열에 의해 코딩되는 예측된 펩타이드의 예측된 질량 스펙트럼의 상관관계는 펩타이드 단편을 포함하는 면역글로불린 사슬의 뉴클레오타이드 서열 또는 예측된 아미노산 서열을 얻기 위하여 이용될 것이다. 이어서, 얻어진 면역글로불린 사슬의 뉴클레오타이드 서열은 유사하게 얻어진, 제2의 면역글로불린 사슬의 뉴클레오타이드 서열과 함께 및/또는 무작위적으로 공동발현될 수 있으며, 이 경우 제2의 뉴클레오타이드 서열은 2개의 코딩된 면역글로불린 사슬이 무손상 항체로 어셈블링되는 조건 하에서 무손상 항체의 다른 사슬을 코딩한다.

무손상 면역글로불린이 어셈블링되도록 각각 면역글로불린 사슬을 코딩하는 2개의 뉴클레오타이드 서열을 공동발현(co-expressing)시키기(예를 들어, 세포에서) 위한 조건은 알려져 있다 (예를 들어, 전체적으로 본 명세서에 참조로 포함되는 미국특허 US 5,969,108; US 6,331,415; 7,498,024; US 7,485,291; 및 미국특허공개 US 20110045534 참조). 본 명세서에 개시된 방법을 이용하여 얻어질 수 있는 상이한 뉴클레오타이드 서열의 수 때문에, 본 발명은 항원에 특이적으로 결합하는 면역글로불린을 생성하기 위하여 코딩된 면역글로불린을 스크리닝하는 고처리량 방법 및 로봇 공학의 이용을 고려한다.

본 명세서에 이용된 바와 같이, "어셈블링된" 또는 "어셈블링"은 항체 (또는 그 단편)의 경쇄 및 항체 (또는 그 단편)의 중쇄가, 2개의 사슬이 결합되어 항체 (또는 그 단편)를 생성하는 방식으로 서로 결합되는 것을 의미한다. 일부 실시형태에서, 어셈블링된 항체 (또는 그 단편)에서, 중쇄 및 경쇄 모두로부터의 아미노산 잔기는 어셈블링된 항체 (또는 그 단편)의 항원 결합 도메인의 원인이 된다. 일부 실시형태에서, 어셈블링된 항체 (또는 그 단편)는 중쇄 (또는 그 단편)에 공유적으로 결합된 경쇄 (또는 그 단편)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 어셈블링된 항체 (또는 그 단편)는 중쇄 (또는 그 단편)에 비공유적으로 결합된 경쇄 (또는 그 단편)을 포함한다.

일부 실시형태에서, 전술한 단백질군 분석에서 동정된 면역글로불린 사슬 (또는 그의 가변 영역)의 뉴클레오타이드 서열 또는 아미노산 서열은 재조합 항체의 어셈블리 전에 재조합 분자 생물학 기술 또는 유전자 합성 기술에 의해 합성된다. 예를 들어, 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열은 어셈블리 전에 뉴클레오타이드 또는 펩타이드 합성 기계에서 합성될 수 있다. 또는, 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열은, 뉴클레오타이드 서열을 발현 벡터 (예를 들어, Invitrogen, Carlsbad, CA로부터의 pCDNA3.1)로 클로닝하고, 발현 벡터로 형질감염된 세포 (예를 들어, 헬라 세포, CHO 세포, COS 세포 등)에서 코딩된 펩타이드를 발현시킴으로써 재조합적으로 발현될 수 있다. 일부 실시형태에서, 어셈블리 단계는 형질감염된 형질감염된 세포에서 발생한다 (예를 들어, 단일 세포는 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 일 이상의 발현 벡터로 형질감염되며, 여기에서 중쇄 및 경쇄는 형질감염된 세포에서 폴리펩타이드로서 발현될 것이다).

본 발명의 다양한 실시형태에서, 재조합 항체가 분리된다. 본 명세서에 이용된 바와 같이, "분리된(isolated)" (또는 "정제된(purified)")은 항체에, 자연적으로 연관된 다른 생물학적 물질이 실질적으로 없는, 또는 예를 들어 본 발명의 항체를 발현하도록 유전공학적으로 생성된 세포로부터 유래되는 다른 생물학적 물질이 없는 것을 의미한다. 예를 들어, 분리된 재조합 항체는 숙주 세포의 다른 구성성분 (예를 들어, 소포체 또는 세포질 단백질 및 RNA)으로부터 물리적으로 분리된 것이다. 유사하게, 혈청 및/또는 혈장으로부터 정제된 항체는 다른 혈청 또는 혈장 구성성분 (예를 들어, 알부민 또는 세포)로부터 분리된 항체이다 (예를 들어, 단백질 A에 대한 항체의 부착을 이용하여, 여기에서 비-항체 혈청 구성성분은 단백질 Adp 부착되지 않음). 따라서, 본 발명의 분리된 항체 (또는 분리된 면역글로불린)은 적어도 70-100% 순수한 항체, 즉 항체가 총 조성물의 70-100중량%를 구성하는, 조성물 내에 존재하는 항체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 분리된 항체는 75%-99중량% 순수하거나, 80%-99중량% 순수하거나, 90-99중량% 순수하거나, 또는 95% 내지 99중량% 순수하다. 본 발명의 다양한 비제한적 실시형태의 항체의 상대적 순도는 잘 알려진 방법에 의해 쉽게 결정된다.

일부 실시형태에서, 항체가 항원에 특이적으로 결합한 것을 확인하기 위하여, 재조합 항체 (또는 그의 가변 영역)은 면역분석(immunoassay)에서 더 스크리닝되거나 분석된다. 일부 실시형태에서, 면역분석은 유동 세포 계수 분석 (예를 들어, FACS 스캔), 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA), 웨스턴 블롯 분석, 면역조직화학적 분석, 면역형광 분석, 방사면역 분석, 중화 분석, 결합 분석, 친화성 분석, 또는 단백질 또는 펩타이드 면역침강반응 분석과 같은 표준 면역분석이다. 모든 이러한 면역분석은 잘 알려진 표준 분석이며, 표준 방법 책에 잘 서술되어 있다 (예를 들어, 전술한 Ausubel et al.; 전술한 Coligan et al.; 전술한 Harlow and Lane 참조).

치료학적 항체

본 발명의 다양한 비제한적 실시형태 및 방법은 예를 들어 치료학적 가치를 갖는 항체를 분리하는데 유용하다. 예를 들어, 병원균에 대한 동물의 정상적인 면역 반응 중에, 병원균의 항원에 대하여 가장 높은 특이성을 갖는 항체는 발생하는데 수주가 걸릴 수 있다. 이는, 동물의 모든 유핵 세포에 의해 발현되는 주조직적합성 복합체(major histocompatibility complex)의 맥락에서, 항원 제시 세포에 제시된 항원을 인식하는 적합한 T 림프구에 의해 항체를 생산하는 B 림프구가 먼저 자극되어야 하기 때문이다. 초기에 항원에 반응하는 B 림프구는 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 생산한다. 그러나, 가장 높은 친화성 항체는 그들의 항원에 결합되며(B 세포 수용체를 형성하기 위하여 다른 세포 표면 항원과 복합화된 세포 표면 발현된 면역글로불린을 통하여), B 세포 수용체 및 다른 세포 (T 세포를 포함)를 통한 자극 시에, 그들의 특이한 항원에 대하여 높은 친화성을 갖는 항체를 생산하기 위하여 친화성 성숙을 겪는 B 림프구에 의해 생산되는 실제의 항체이다. 고친화성 항체를 신속하게 생산하기 위하여, 친화성 성숙을 겪는 B 림프구 (또는 동일한 항체 특이성을 갖는 자손)는 동일한 병원균에 접해진 동물에서 이용가능하다.

항원이 보이는 처음에 (예를 들어, 동물이 특정 병원균에 감염된 처음) 항원에 반응하는 T 림프구 및 B 림프구의 이러한 엄격한 조절은 자가면역 또는 부적절한 면역 반응을 방지하기 위하여 필요하다. 그러나, 하나의 단점은 항원 특이적 B 림프구가 항원에 대하여 가장 높은 친화성 및 특이성을 갖는 항체를 분비할 때까지 빠르게 성장하는 병원균이 더 이상 쉽게 제거되지 않는 정도로 동물 내에 성장할 수 있다는 점이다. 본 발명의 일부 실시형태에서, 본 방법에 의해, 항체를 분비하는 항원 특이적 B 림프구를 먼저 분리하고, 그 림프구를 불멸화하는 시간 소비적 과정이 생략되는, 항원 특이적 항체의 신속한 발달이 가능하게 된다.

따라서, 다른 측면에서, 본 발명은 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 재조합 항체를 포함하는 치료학적 조성물을 제공한다.

본 명세서에 이용된 바와 같이, "약학적으로 허용가능한 담체"는 활성 성분 (예를 들어, 본 발명의 다양한 실시형태에 따라 만들어진 재조합 항체)과 조합되는 경우, 활성 성분이 생물학적 활성을 보유하도록 하며, 전달된 경우 대상의 면역 시스템과는 비반응성이고, 대상에게는 비독성인 임의의 물질을 포함한다. 예는 인산염 완충 식염수와 같은 임의의 표준 약학적 담체, 물, 오일/물 에멀젼과 같은 에멀젼, 및 다양한 형태의 습윤제(wetting agents)를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 에어로졸 또는 장관외 투여를 위한 희석제의 비제한적 예는 인산염 완충 식염수, 생리 식염수 (0.9%), 링거 용액(Ringer's solution) 및 덱스트로스 용액이다. 용액의 pH는 약 5 내지 약 8, 또는 약 7 내지 약 7.5일 수 있다. 추가적인 담체는 항체를 함유하는 고형 소수성 폴리머의 반투과성 매트릭스와 같은 지연 방출 제제를 포함하며, 이 매트릭스는 성형된 물체 형태, 예를 들어 필름, 리포좀 또는 미세입자이다. 일정 담체가 예를 들어 투여 경로 및 투여된 항체의 농도에 따라 더욱 바람직할 수 있음이 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 그러한 담체를 포함하는 조성물은 잘 알려진 통상적인 방법에 의해 제제화된다 (예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990; 및 Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed. Mack Publishing, 2000 참조).

당해 기술분야의 통상의 기술자에게 알려진 임의의 적합한 담체가 본 발명의 약학적 조성물에 채용될 수 있으나, 담체의 형태는 투여 모드에 따라 달라질 것이다. 본 발명의 다양한 실시형태에서, 본 명세서에 서술된 비제한적 약학적 조성물을 위한 다수의 전달 기술 (예를 들어, 결합제 또는 결합제-코딩 폴리뉴클레오타이드를 함유)이 Rolland, 1998, Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems 15:143-198, 및 이에 인용된 참고문헌에 서술된 것과 같이 당해 기술분야에 잘 알려져 있다.

치료 방법

다른 측면에서, 본 발명은 질병 항원에 의해 특징지워지는 질병을 갖는, 또는 가질 것으로 의심되는 동물을 치료하는 방법을 제공하며, 이 방법은 본 발명의 다양한 실시형태에 따라 제조된, 항원에 특이적으로 결합하는 면역글로불린을 포함하는 유효량의 치료학적 조성물을 투여하는 것을 포함하며, 치료학적 조성물의 면역글로불린에 의해 특이적으로 결합된 항원과 질병 항원은 동일하다.

일부 실시형태에서, 동물은 인간 또는 길들여진 동물 (예를 들어, 개, 고양이, 소, 염소, 양, 닭, 칠면조, 라마, 에뮤, 코끼리, 또는 타조)이다.

본 명세서에 이용된 바와 같이, 질병 및 표시된 질병 항원 (예를 들어, AIDS로부터 HIVgp120 항원)에 관한 문구 "의해 특징지워지는"는 표시된 질병 항원이 그 질병을 갖는 동물에 존재하는 질병을 의미한다. 일부 실시형태에서, 질병 항원은질병의 원인체 (예를 들어, 바이러스)로부터의 핵산에 의해 코딩된다. 일부 실시형태에서, 질병 항원은 동물의 게놈에 의해 코딩된다 (예를 들어, BCR-ABL 융합 질병 항원은 만성 골수성 백혈병 (CML)을 앓는 환자의 필라델피아 염색체에 의해 코딩된다).

"치료하는"은 동물의 질병 진행의 중단, 지연 또는 억제, 또는 동물의 질병 발전의 예방을 의미한다. 치료가 성공적인지 여부를 검출하는 방법은 알려져 있다. 예를 들어, 질병이 고형 종양인 경우, 본 발명의 다양한 실시형태의 방법을 이용하여 생산된 재조합 면역글로불린을 포함하는 치료학적 조성물을 유효량 투과한 후, 종양의 퇴화, 전이의 감소, 종양 크기의 감소 및/또는 종양 세포 계수의 감소가 있으면 질병의 진행은 억제, 중단 또는 지연된다.

본 명세서에 이용된 바와 같이, "유효량(effective amount)"은 동물에서 질병 진행의 중단, 느려짐, 중단, 지연 또는 억제, 또는 동물에서 질병의 발달의 예방을 포함하는 이로운, 또는 원하는 결과를 달성하는데 충분한 양 또는 투여량이다. 유효량은 예를 들어, 재조합 면역글로불린을 포함하는 치료학적 조성물이 투여되는 대상의 연령 및 체중, 증상의 심각도 및 투여 경로에 따라 달라질 것이며, 이에 따라 투여는 개별적 기준으로 결정된다. 일반적으로, 경구투여용 일간 성인 투여량은 단일 투여 또는 분할된 투여로 주어지는, 약 0.1 to 1000 mg이다. 연속적인 정맥 내 투여를 위하여, 조성물은 0.01 ug/kg/min 내지 1.0 ug/kg/min의 범위로, 바람직하게는 0.025 ug/kg/min 내지 0.1 ug/kg/min의 범위로 투여될 수 있다.

유효량은 일 이상의 투여로 투여될 수 있다. 예로서, 유효량의 본 발명의 다양한 실시형태의 방법을 이용하여 생산된 재조합 면역글로불린은 동물에서 질병 진행의 완화, 중지, 안정화, 반전, 늦추거나 및/또는 지연시키는데 충분한 양이거나, 또는 시험관내에서 질병에 걸린 세포 (예를 들어, biospsied 암 세포)의 성장을 완화, 중지, 안정화, 반전, 늦추거나 및/또는 지연시키는데 충분한 양이다. 당해 기술분야에서 이해되는 바와 같이, 유효량의 본 발명의 다양한 실시형태의 재조합 항체는 그 중에서도 동물의 병력, 및 재조합 항체의 아이소타입 (및/또는 용량)과 같은 다른 인자에 따라 달라질 수 있다.

본 발명의 다양한 실시형태의 비제한적 재조합 항체를 포함하는 조성물을 투여하기 위한 유효량 및 스케쥴은 경험적으로 결정될 수 있으며, 그러한 결정은 당해 기술분야의 통상의 기술 범위 이내이다. 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 투여되어야 하는 용량이 예를 들어, 본 발명의 다양한 실시형태의 조성물을 받는 동물, 투여 경로, 이용된 조성물의 특정 형태 (예를 들어, 조성물 내에서 재조합 항체의 아이소타입) 및 동물에 투여되는 다른 약물에 따라 달라지는 것임을 이해할 것이다. 동물 (예를 들어, 인간 환자)에게 항체를 포함하는 조성물이 투여되는 경우, 항체에 적합한 투여량을 선택하는데 있어서 지침은 항체의 치료학적 용도에 대한 문헌, 예를 들어, Handbook of Monoclonal Antibodies, Ferrone et al., eds., Noges Publications, Park Ridge, N.J., 1985, ch. 22 and pp. 303-357; Smith et al., Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, Haber et al., eds., Raven Press, New York, 1977, pp. 365-389에서 찾아진다.

단독으로 이용된 유효량의 항체의 전형적인 일간 투여량(daily dosage)은 전술한 인자에 따라, 1일에, 약 1 ug/kg(체중) 내지 100 mg/kg(체중), 또는 그 이상의 범위일 수 있다. 일반적으로, 임의의 하기 투여량이 이용될 수 있다: 적어도 약 50 mg/kg(체중); 적어도 약 10 mg/kg(체중); 적어도 약 3 mg/kg(체중); 적어도 약 1 mg/kg(체중); 적어도 약 750 ug/kg(체중); 적어도 약 500 ug/kg(체중); 적어도 약 250 ug/kg(체중); 적어도 약 100 ug /kg(체중); 적어도 약 50 ug/kg(체중); 적어도 약 10 ug /kg(체중); 적어도 약 1 ug/kg(체중), 또는 그 이상이 투여된다. 일부 실시형태에서, 여기에 제공되는 결합제(binding agent)(예를 들어, 항체)의 투여량(dose)은 약 0.01 mg/kg 내지 약 50 mg/kg, 약 0.05 mg/kg 내지 약 40 mg/kg, 약 0.1 mg 내지 약 30 mg/kg, 약 0.1 mg 내지 약 20 mg/kg, 약 0.5 mg 내지 약 15 mg, 또는 약 1 mg 내지 10 mg이다. 일부 실시형태에서, 투여량은 약 1 mg 내지 5 mg이다. 일부 대안적인 실시형태에서, 투여량은 약 5 mg 내지 10 mg이다.

본 명세서에 개시된 방법 (치료학적 방법을 포함)은 단일 또는 다중 부위에, 단일 시점 또는 다중 시점에, 단일 직접 주사(single direct injection)에 의해 이루어질 수 있다. 투여는 다중 부위에 거의 동시에 이루어질 수 있다. 투여 빈도는 치료 과정에 걸쳐 결정되고 조절될 수 있으며, 원하는 결과를 달성하는 것에 기초한다. 일부 경우, 본 발명의 다양한 실시형태의 재조합 면역글로불린의 지연된 연속 방출 제제(sustained continuous release formulations)가 적합할 수 있다. 지연 방출을 이루기 위한 다양한 제제 및 장치는 당해 기술분야에 공지되어 있다.

본 발명의 재조합 항체를 포함하는 조성물은 예를 들어, 전신, 국부, 경구, 코, 정맥 내, 두개 내, 복막 내, 피하 또는 근육 내 투여를 포함하는 임의의 적합한 투여 방식을 위하여, 또는 주입(infusion)과 같은 다른 방법에 의하여 제제화될 수 있으며, 이에 의하여 유효한 형태로 혈류 내에 확실하게 전달된다. 조성물은 국부적 치료 효과를 발휘하기 위하여, 고립된 조직 관류(isolated tissue perfusion)와 같은 고립된 관류 기술에 의해 투여될 수 있다. 피하 주사와 같은 장관외 투여를 위하여, 담체를 물, 식염수, 알코올, 지방, 왁스 또는 버퍼를 포함하는 것이 바람직하다. 경구 투여를 위하여, 만니톨, 락토오스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 사카린, 탤컴, 셀룰로오스, 글루코오스, 수크로오스, 및 마그네슘 카보네이트와 같은 임의의 전술한 담체 또는 고형 담체가 채용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 경구 투여를 위하여, 조성물의 제제는 예를 들어, 리포좀 내에 본 발명의 다양한 실시형태의 재조합 면역글로불린을 캡슐화한 마이크로캡슐로서, 소화관 내에서의 분해에 저항성이다. 생분해성 마이크로스피어 (예를 들어, 폴리락테이트 폴리글리콜레이트(polylactate polyglycolate))가 본 발명의 치료학적 조성물을 위한 담체로서 채용될 수 있다. 적합한 생분해성 마이크로스피어는 예를 들어, 미국특허 US 4,897,268 및 US 5,075,109에 개시되어 있다.

본 발명의 일부 실시형태에서, 조성물은 버퍼 (예를 들어, 중성 완충 식염수또는 인산염 완충 식염수), 탄수화물 (예를 들어, 글루코오스, 만노스, 수크로오스 또는 덱스트란), 만니톨, 단백질, 폴리펩타이드 또는 글리신과 같은 아미노산, 항산화제, EDTA 또는 글루타티온과 같은 킬레이트제, 보조제 (예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드) 및/또는 보존제를 포함할 수 있다. 그 대신에, 본 발명의 다양한 실시형태의 비제한적 조성물은 동결건조물(lyophilizate)로서 제제화될 수 있다.

본 발명의 일부 실시형태에서, 재조합 면역글로불린은 또한 예를 들어, 코아세르베이션(coacervation) 기술에 의해, 또는 계면 중합(interfacial polymerization)에 의해 제조된 마이크로캡슐 (예를 들어, 각각 하이드록시메틸셀룰오로스 또는 젤라틴-마이크로챕슐 및 폴리(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐) 내에, 콜로이드 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포좀, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼(microemulsions), 나노입자 및 나노캡슐) 내에, 또는 매크로에멀젼(macroemulsions) 내에, 포획(entrap)될 수 있다. 그러한 기술은 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990; 및 Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing, 2000에 개시되어 있다. 본 발명의 다양한 실시형태의 재조합 면역글로불린의 혈청 반감기(serum half life)를 증가시키기 위하여, 예를 들어 미국특허 US 5,739,277에 서술된 바와 같이, 구조 수용체 결합 에피토프(salvage receptor binding epitope)를 항체 (특히, 항체 단편) 내에 포함시킬 수 있다. 본 명세서에 이용된 바와 같이, 용어 "구조 수용체 결합 에피토프"는 IgG 분자의 생체 내 혈청 반감기를 증가시키는데 책임이 있는 IgG 분자 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4)의 Fc 영역의 에피토프를 나타낸다.

본 발명의 일부 실시형태에서, 재조합 면역글로불린은 리포좀으로서 제제화될 수 있다. 재조합 면역글로불린을 함유하는 리포좀은 Epstein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688; Hwang et al., 1980, Proc. Natl Acad. Sci. USA 77:4030; 및 미국특허 US 4,485,045 및 US 4,544,545에 서술된 것과 같은, 당해 기술분야에 공지된 방법에 의해 제조된다. 증가된 순환 시간을 갖는 리포좀은 미국특허 US 5,013,556에 개시되어 있다. 특히 유용한 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화된 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE)을 포함하는 리피드 조성물에 의한 역상 증발에 의하여 생성될 수 있다. 리포좀은 정의된 기공 크기를 갖는 필터를 통하여 압출되어, 원하는 직경을 갖는 리포좀을 얻는다. 또한, 본 발명의 다양한 실시형태의 항체 (Fab' 단편과 같은 항원 결합 도메인 단편을 포함)는 디설파이드 교환 반응(disulfide interchange reaction)을 통하여, Martin et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:286-288에 서술된 바와 같이 리포좀으로 컨주게이트(컨주게이트된)될 수 있다. 본 발명의 다양한 실시형태의 재조합 항체의 투여는 주사, 경구 투여, 파티클건 또는 카테터 투여, 및 국부 투여를 포함하는 부분 또는 전신 투여를 포함한다. 당해 기술분야의 통상의 기술자는 생체내에서 외인성 단백질의 발현을 얻기 위하여 발현 벡터를 투여하는 것에 익숙하다. 예를 들어, 미국특허 US 6,436,908, US 6,413,942, 및 US 6,376,471 참조.

다른 측면에서, 본 발명은 동물에서 질병 항원의 존재에 의해 특징지워지는 질병의 동물에서의 발생 가능성을 감소시키는 방법을 제공하며, 이 방법은 본 발명의 다양한 실시형태의 재조합 면역글로불린을 포함하는 유효량의 치료학적 조성물을 투여하는 것을 포함하며, 여기에서 치료학적 조성물의 면역글로불린에 의해 특이적으로 결합되는 항원과 질병 항원은 동일하다.

백신 제제는 Vaccine Design ("The subunit and adjuvant approach" (eds Powell M. F. & Newman M. J., (1995) Plenum Press New York)에 일반적으로 서술되어 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 (a) 동물로부터 다중 면역글로불린의 면역글로불린 사슬 가변 영역을 코딩하는 핵산 서열을 얻기 위한 수단, 및 (b) 항체의 아미노산 서열을 결정하기 위하여, 질량 분석에 의해 분석된 항체로부터의 질량 스펙트럼 정보를 핵산 서열로부터 유래되는 예측된 질량 스펙트럼 정보와 상호 연관시키기 위한 지시(instruction)를 포함하는, 동물로부터 항체의 아미노산 서열을 결정하는 키트를 제공한다.

본 명세서에 개시된 방법은 예를 들어, 항원으로 면역된 대상에서 시간 경과에 따라 순환하는 항체를 모니터링하는데 이용될 수 있다. 이 실시형태에서, 샘플은 복수의 시점 (예를 들어, 면역 이전 및 이후)에서 대상으로부터 취해질 수 있으며, 본 명세서에 개시된 방법이 각 시점에서 순환하는 항체를 확인하기 위하여 이용될 수 있다. 백신 접종의 효능 및/또는 시간 경과(time course)를 결정하기 위하여, 순환하는 항체의 조성물이 복수의 시점에서 비교될 수 있다. 이는 개별적인 대상에서 면역 반응을 모디터링하고, 백신을 개발하는데 이용될 수 있다.

하기 실시예는 본 발명의 다양한 측면 및 실시형태를 설명하기 위한 것이며, 이를 제한하기 위한 것은 아니다.

실시예 1

항원에 특이적으로 결합하는 항체의 폴리클로날 집단으로부터 개별적인 항체 중쇄의 동정

이 실시예에서, 다중 모노클로날 항체는 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 폴리클로날 집단으로부터 유래되었다. 본 발명의 다양한 실시형태의 방법을 이용하여, 그 혈청이 출발 폴리클로날 집단을 포함하는 동물로부터의 핵산 분자로부터 생성된 유전 물질 데이터베이스로부터의 정보가 모노클로날 항체의 분석으로부터의 펩타이드 데이터베이스 정보와 비교되었다.

핵산 서열은, 토끼 면역글로불린 사슬-코딩 서열에 특이적인 프라이머 (예를 들어, 하기 실시예 6에서의 프라이머 서열)를 이용하여 본 명세서에 개시된 방법에 따라 항원으로 면역된 동물로부터의 비장 세포로부터 얻어졌다. 폴리클로날 항체의 중쇄로부터의 CDR3 영역은 데이터베이스에서 나타난 횟수 및 모든 CDR3 영역 중 각각의 CDR3가 데이터베이스에서 나타난 횟수의 퍼센티지에 근거하여 등급화되었다. 표 2는 상위 25개 CDR3 영역 및 그의 빈도를 나타낸다. 이 결과는 동일한 CDR3 서열이 폴리클로날 혼합물 중의 많은 상이한 항체에서 발견되었음을 보여준다. 이 정보는 동일한 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 그들의 CDR3 영역 (및 추정하건대 다른 CDR 영역에서) 흔히 서열을 공유하고 있음을 보여준다. 이 정보는 본 명세서에 개시된 방법이 항원에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 사슬 (또는 단편)을 동정 및 분리할 수 있음을 나타낸다.

펩타이드 데이터베이스의 생성을 위하여, 하기 방법이 이용되었다.

항체의 단백질 가수분해 소화(Proteolytic Digestion)

항체의 폴리클로날 집단 약 10ug이 농축되고, 초음파 (0.5ml 10K Amicon: Millipore)에 의해 버퍼 교환되었다. 초기 부피는 먼저 농축된 후, pH 8에서 200mM Hepes 400ul를 첨가함으로써 교환되었다. 샘플은 실온에서 15분 동안 pH 8 Hepes 중의 8M 요소 80ul에 재현탁됨으로써 변성되었다. 항체는 40분 동안 실온에서 10mM DTT에서 환원되었다. 알킬화(Alkylation)가 20mM IAA에 의해 1시간 동안 수행되었다. 요소 농도는 2M 최종 농도로 낮아졌다. 다음으로, 샘플은 5개로 동등하게 나눠지고, 각각 트립신, Lys-C, Glu-C, 펩신, 또는 키모트립신으로 37℃에서 하룻밤동안 따로따로 소화되었다. 펩신 소화에 있어서, 샘플은 농축되고, 3M 아세트산으로 교환되고, 1시간 동안 실온에서 소화되었다. 소화물(Digests)은 20% TFA를 가함으로써 켄치(quench)되고, Sep-Pack cartridges (Waters)를 이용하여 정제되었다. 클리닝된 샘플은 LTQ Orbitrap Velos 질량 분석계에서의 분석을 위하여 동결건조되고, 재현탁되었다.

질량 분석

프로테아제 Lys-C, 트립신, 키모트립신, 펩신, 또는 Glu-C에 의해 항체 분획을 소화시킴으로써 생성된 펩타이드 혼합물 (즉, 펩타이드는 항체 분획을 각각의 이러한 프로테아제로 개별적으로 소화시킴으로써 생성되었다)은 LTQ Orbitrap Velos (Thermo-Fisher) 하이브리드 질량 분석계를 이용하여 개별적으로 LC-MS/MS에 의해 분석되었다. 샘플은, 인라인 플로우 스플리터(in-line flow splitter)를 구비한 Agilent1100 series 바이너리 펌프(binary pump)를 이용하여 MagicC18aQ 수지 (5 m, 200 Å)로 패킹된 손으로 부어진(hand-poured) 용융 실리카 모세관 컬럼 (125 um 내부 직경 18 cm)에 Famos 오토샘플러 (LC Packings)를 이용하여 15분 동안 탑재되었다. 크로마토그래피는 35분 동안 8-30% 용매 B의 400 nl/min에서 2원 경사(binary gradient)를 이용하여 전개되었다 (용매 A, 0.25% 포름산 (FA); 용매 B, 0.1% FA, 97% 아세토니트릴). 펩타이드가 액체 크로마토그래피 컬럼으로부터 질량 분석계로 용리하였을 때, 이들은 이온화되고, 펩타이드 이온의 질량 대 전하 비가 측정되어, MS1 스펙트럼을 생성하였다. 이어서, 질량 분석계는 그 때 용리되는 20개의 가장 풍부한, 지난 35초 동안 MS2 스펙트럼 획득에 놓여지지 않았던 펩타이드 이온을 선택하였으며, 이어서, 20개 MS2 생성물 이온 스펙트럼을 생성하기 위하여, 차례차례 이들 각각의 20개의 전구체 펩타이드 이온이 분리 및 단편화되었다. 전구체 이온의 하나의 MS1 스펫트럼을 얻은 후에, 데이터-의존적 방식으로 20개의 MS2 생성물 이온 스펙트럼을 얻는 전체 사이클은 약 1.6초 동안 수행되었으며, 이후 펩타이드가 액체 크로마토그래피 컬럼으로부터 용리됨에 따라 계속적으로 반복되었다. 전하 상태 스크리닝이 단일 전하 종을 거부하기 위하여 이용되었고, 500 계수(counts)의 문턱값이 MS/MS 스펙트럼을 유발하는데 필요하였다. 가능한 경우, LTQ 및 Orbitrap이 동시 처리 모드로 작동되었다.

데이터베이스 검색 및 데이터 처리.

MS/MS 스펙트럼은 유전자 데이터베이스에 대하여 SEQUEST 알고리즘을 이용하여 검색되었다. 검색 파라미터는 키모트립신, Glu-C, Lys-C, 및 트립신에 대한 완전한 효소 특이성, 및 펩신에 대하여 효소 비특이성을 포함하였으며, 50 p.p.m의 모질량 내성(parent mass tolerance), 시스테인에서 57.0214의 정적 변형(static modification), 및 메티오닌에서 15.9949의 동적 변형(dynamic modification)을 가졌다. HCD 스펙트럼은 ±0.02 Da의 단편 이온 내성(fragment ion tolerance)으로 검색된 반면, CID 스펙트럼은 ±1 Da의 단편 이온 내성으로 검색되었다. 펩타이드는, Xcorr, ΔCn 및 전구체 질량 오차(precursor mass error)와 같은 파라미터에 근거하여 각각의 펩타이드의 등급을 매기기 위하여 선형 판별 함수(linear discriminant function)를 이용하여, 타겟-유인(target-decoy) 접근법을 통해 1% 펩타이드 FDR로 필터링되었다.

결과

도 4는 이 실시예에 따른 방법을 개략적으로 도시한다. 가변 영역 및 CDR3 영역 (및 그의 서열)이 서열 내에 위치하는 부위를 결정하기 위하여, 핵산 서열은 Kabat rules (Kabat, E. A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., (1987) and Wu, T.T. and Kabat, E.A. J. Exp. Med. 132: 211-250 (1970))를 이용하여 분석되었다. 다음으로, 질량 분석에 의해 동정된 다중 모노클로날 항체의 중쇄의 CDR3 영역의 퍼센트 커버리지가 설명되었다. 표 3에 나타내어진 바와 같이, MS-분석된 폴리클로날 항체 혼합물로부터 16개의 상이한 펩타이드 서열이 동정되었으며, 16개의 펩타이드 각각은 동물로부터 수집된 핵산 서열로부터의 상응하는 서열의 CDR3 영역의 전체(즉, 100%)를 포함하였다.

SEQ ID NO:	CDR3	% CDR3 커버리지
	GNL	100
	GNV	100
29	GVKF	100
30	GVSTNV	100
51	SRSTSYYINL	100
45	DGTDHGFNIDL	100
52	DGSDHGFNIDL	100
53	GADSIYRIYFDL	100
54	NVGSSSYYNLNL	100
55	GGDAGYGYFDAFGP	100
56	GGDAGYGSFDAFGP	100
57	GLGYVGSSVYISKYINL	100
58	VPWTGGSGDARLTRLDL	100
36	GLGYVGSSVYIVKYINL	100
59	DLGYASYIGYGYPSYYFKL	100
60	DLGYASYRGYGYPSYYFKL	100

표 3에 열거된 펩타이드 중에서, 질량 분석에 의해 가장 자주-발생하는 것으로 관찰된 펩타이드의 5개는 핵산 서열로부터의 정보로부터 유래된 이론적 질량 스펙트럼으로서 나타내어졌다. 따라서, 이 실험은 핵산 서열로부터 유래되는 예측된 질량 스펙트럼 (및 근본적인 서열)을 폴리클로날 항체의 실제 펩타이드 단편으로부터 관찰된 질량 스펙트럼과 비교 및 상호연관시킴으로써, 다중 모노클로날 항체(적어도 그의 중쇄)의 서열이 쉽게 얻어지는 것을 증명하였다.

실시예 2

인플루엔자 항원-특이적 재조합 인간 항체의 개발

2009-2010년 겨울 동안, H1N1 인플루엔자 바이러스 변종이 다수의 사람들을 감염시켜, 죽음 및 영구적인 손상을 일으켰다. 본 발명의 다양한 실시형태의 비제한적 방법을 이용하여, 이전에 유사한 바이러스 변종에 노출되었던 사람으로부터 중화 항체가 클로닝되어, 현재 질병을 앓는 인간 환자를 치료하기 위한 조성물로서 이용될 수 있다..

따라서, 1918년 인플루엔자 유행 중에 인플루엔자 바이러스에 노출되었던 것으로 알려졌던 노인층이 1918년 바이러스를 중화할 수 있는 혈청 항체의 존재에 대하여 스크리닝된다. 이를 위하여, Yu et al., Nature 455: 532-536, 2008 (및온라인 부록; 논문 및 부록은 전체적으로 본 명세서에 참조로 포함됨)에 서술된 방법이 수행된다.

그의 혈청 및/또는 혈장이 바이러스-중화 항체를 함유하는 환자들이 확인되고, 그러한 환자들로부터 혈액이 취해져, 세포와 혈청 및/또는 혈장으로 분리된다.

혈액 세포로부터, B 림프구가 표준 방법 (예를 들어, 본 명세서에 서술된 방법)에 따라 분리되고, B 림프구로부터 핵산 분자가 얻어진다. 인간 면역글로불린 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL) 가변 영역 유전자의 업스크림 및 다운스트림 영역에 하이브리다이즈하는 프라이머를 이용하여 게놈 DNA를 PCR 증폭함으로써 면역글로불린 사슬-코딩 핵산 분자가 분리된다. 그러한 프라이머를 만들기 위한 방법은 면역학 분야에서 표준적이다 (예를 들어, 참조로 본 명세서에 포함되는 Marks and Bradbury, "PCR Cloning of Human Immunoglobulin Genes" in Antibody Engineering: Methods and Protocols, 248: 117-134, 2003에 기재된 방법 참고).

PCR 증폭을 위한 이러한 프라이머를 이용하여 얻어진 이와 같은 핵산 분자는 유전 물질 데이터베이스에 데이터를 부가하기 위하여 이용된다. 유전자 데이터베이스 내에서, 핵산 서열은 각각의 핵산 서열에 의해 코딩되는 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 결정하기 위하여 표준 소프트웨어 패키지를 이용하여 더 조작되며, 코딩된 폴리펩타이드는 트립신으로 가상으로 소화되고, 여기에서 그러한 소화로부터 생성된 예측된 얻어진 펩타이드는 예측된 질량 스펙트럼을 생성하는데 이용된다.

환자로부터의 혈액에서, 혈청 및/또는 혈장이 수집된다. 혈청 및/또는 혈장 내에 존재하는 항체는 표준 방법에 의해 분리된다. 예를 들어, 혈청 단백질은, 면역글로불린은 부착하지만 비-면역글로불린 단백질은 부착하지 않는 단백질 A 세파로오스 컬럼을 통과한다. 혈액이 수집된 각각의 사람들이 1918년 인플루엔자 바이러스에 새롭게 노출된 것이 아니므로, 그들의 혈청 항체는, 혈청 항체를 1918년 바이러스 (예를 들어, 희석된 바이러스 또는 그 단편)로 코팅된 제2 컬럼 상을 지나게 함으로써 1918년 바이러스 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 더 강화된다. 결합된 항체는 다음으로 프로테아제 (예를 들어, 파파인), 또는 면역글로불린의 경첩 영역 근처에서 특이적으로 절단하는 화학적 단백질 절단 시약으로 처리되고, 부착되지 않은 Fc 부분이 제거된다. 마지막으로, 펩타이드 단편을 생성하기 위하여 결합된 Fab 또는 Fab2 단편이 트립신으로 처리된 후, 모든 단편이 액체 크로마토그래피를 이용하여 분별되고, 단편은 질량 분석에 의해 분석된다. Sequest 프로그램과 같은 알고리즘을 이용하여, 펩타이드의 관찰된 탠덤 질량 스펙트럼이 환자의 B 림프구로부터 추출된 핵산 서열로부터 예측된 질량 스펙트럼과 서로 연관된다. 이 과정을 이용하여, 유전 물질 데이터베이스의 특유한 면역글로불린 사슬의 예측된 아미노산 서열 내에서 발견된 적어도 하나의 펩타이드가 동정될 수 있다. 이 면역글로불린 사슬 (또는 그의 가변 영역)을 코딩하는 핵산 서열이 유전자 데이터베이스로부터 검색되고, 표준 DNA 합성 방법을 이용하여 합성된다. 합성된 DNA 서열은 발현 벡터로 서브클로닝되고, 이는 CHO 세포로 형질감염된다. 이 세포에 의해 생성된 재조합 항체는 분리되어, 1918년 바이러스 (또는 그 단편)에 결합하는 능력에 대하여 시험된다.

이 방법을 이용하여 생성된 재조합 항체는 약학적으로 허용가능한 담체와 결합되어, H1N1 바이러스 감염으로 고통받는 환자에게 투여된다. 이러한 재조합 항체는 그 기원이 완전히 인간이므로, 환자의 면역 시스템에 의해 거부될 것으로 예측되지 않는다.

실시예 3

핵산 서열의 수득

이 프로토콜은 차세대 시퀀싱 (NGS)을 이용하며, 454 NGS 플랫폼 (FLX+, FLX or junior; 454 Life Sciences, a Roche company, Branford, CT로부터 상업적으로 입수가능함)에 기반한다. 다른 고처리량 NGS 플랫폼에 대하여 약간의 변형이 필요할 것이고, 이는 NGS 제조자의 지시에 기반한다.

생쥐는 표준 면역 프로토콜 (예를 들어, 전술한 Coligan et al.)에 의해, 대상 항원 (펩타이드(들), 재조합 단백질, 바이러스, 독소 등)으로 면역된다. 면역 반응은 특이적 항원에 대한 혈장 면역글로불린 역가(titer)에 의해 모니터링된다. 혈액, 비장, 골수, 림프절, 또는 임의의 림프 기관이 수집 및 처리되어, 표준 방법에 따라 B 세포를 분리할 수 있다. 재료가 제한되고, 동물로부터의 중쇄 및 경쇄 집단에 대하여 면역글로불린 가변 도메인 특이적 PCR 프라이머를 이용하는 직접 RT-PCR 과정으로 대체되는 경우, 이 분리 과정은 줄어들 수 있다.

물론 일부 실시형태에서, 핵산 서열은 생물학적 물질로부터 바로 직접적으로 (즉, 시퀀싱 전에 증폭되지 않고) 시퀀싱될 수 있다. 핵산 서열로부터 직접적으로 시퀀싱하기 위한 서비스 및 시약은 상업적으로 입수 가능하며, 예를 들어, Helicos BioSicences Corp. (Cambridge, MA)로부터 입수 가능하다. 예를 들어, Helicos' True Single Molecule Sequencing은 DNA, cDNA, 및 RNA의 직접적인 시퀀싱을 가능하게 한다. 또한, 미국특허 US 7,645,596; US 7,037,687, US 7,169,560; 및 공개문헌 Harris et al., Science 320: 106-109, 2008; Bowers et al., Nat. Methods 6: 493-494, 2009; 및 Thompson and Milos, Genome Biology 12: 217, 2011 참조 (이 특허 및 문헌은 모두 전체적으로 본 명세서에 참조로 포함된다).

일부 실시형태에서, 서열 정보를 얻기 전에 핵산 서열은 증폭된다 (예를 들어, 중합효소 연쇄 반응에 의해).

하나의 비제한적 예에서, 올리고 dT PCR 프라이머가 RT-PCR에 이용된다. 다른 비제한적 예에서, 유전자 특이적 RT-PCR는 하기 서술된 PCR 프라이머를 이용하여 수행된다. 다른 예에서, 생쥐의 중쇄 및 경쇄 집단에 대한 PCR 프라이머는 참조로 본 명세서에 포함되는 PCT 공개공보 WO2010/097435에 제시된다.

B 세포 강화(enrichment)가 있든지 또는 없든지, 정제된 유전 물질 (DNA 또는 mRNA)은 이어서 표준 과정에 따라 RT-PCR된다 (예를 들어, 전술한 Ausubel et al., 참조). 이는 NGS 시퀀싱 전에 유전 물질의 라이브러리 제조 단계이다. cDNAs를 생성하기 위하여, 역 전사 (RT) 반응은 올리고 dT 또는 면역글로불린 특이적 프라이머를 적용할 수 있다. 샘플로부터 (재배열된 또는/및 발현된) 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 증폭하기 위하여, 중합효소 연쇄 반응 과정은 면역글로불린 특이적 프라이머를 이용할 것이다.

이 방법은 하기에 상세하게 서술된다.

라이브러리 제조

샘플 제조예:

생쥐가 항원에 의한 마지막 부스트(boost)를 받은 후에, 혈액, 비장, 골수, 또는 림프절이 분리된다. 단핵 세포는 전술한 바와 같이, Ficoll 분리에 의해 분리된다. Ficoll 분리된 세포는 이어서 PBS로 세척되고, 카운트되고, 총 RNA 제조를 위하여 스냅 프리즈된다(snap frozen).

총 RNA는 제조자의 지시에 따라 Qiagen RNeasy 키트 (Qiagen Inc., Hilden, Germany로부터 상업적으로 입수 가능함)을 이용하여 세포로부터 분리되고, 총 RNA는 -80℃에서 저장된다.

유전자 특이적 RT-PCR 또는 표준 RT-PCR (올리고 dT를 이용)에 있어서, 하기 프로토콜이 이용될 수 있다.

10uM CST 생쥐 RT-Ig 프라이머 또는 올리고 dT 1ul

2.5ug 총 RNA (비장 세포) xul

10mM dNTP 2ul

멸균 증류수 14ul 까지

5분 동안 65℃에서 혼합물을 배양한 후, 얼음 위에 놓음.

5x cDNA 합성 버퍼 4ul

0.1M DTT 1ul

Invitrogen Thermoscript RT (15U/ul) 1ul

내용물을 부드럽게 혼합하고, 60분 동안 60℃에서 배양함.

5분 동안 85℃에서 가열함으로써 반응을 종료함.

cDNA는 라이브러리를 만드는데 이용될 준비가 됨

이어서, cDNA는 중쇄 및 경쇄에 대한 CST 454 특이적 융합 생쥐 프라이머를 이용하여 PCR될 것이다. 프라이머는 하기 서열을 가질 것이다:

생쥐 454 앰플리콘 프라이머

중쇄 (포워드 및 리버스 프라이머)

HV1 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG ACGAGTGCGTGATGTGAAGCTTCAGGAGTC

(SEQ ID NO: 1)

HV2 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG ACGCTCGACACAGGTGCAGCTGAAGGAGTC

(SEQ ID NO: 2)

HV3 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG AGACGCACTCCAGGTGCAGCTGAAGCAGTC

(SEQ ID NO: 3)

HV4 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG AGCACTGTAGCAGTTACTCTGAAAAGAGTC

(SEQ ID NO: 4)

HV5 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG ATCAGACACGGAGGTCCAGCTGCAACAATCT

(SEQ ID NO: 5)

HV6 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG ATATCGCGAGGAGGTCCAGCTGCAGCAGTC

(SEQ ID NO: 6)

HV7 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG CGTGTCTCTACAGGTCCAACTGCAGCAGCCT

(SEQ ID NO: 7)

HV8 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG CTCGCGTGTCGAGGTGAAGCTGGTGGAGTC

(SEQ ID NO: 8)

HV9 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG TCTCTATGCGGAGGTGAAGCTGGTGGAATC

(SEQ ID NO: 9)

HV10 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG TGATACGTCTGATGTGAACTTGGAAGTGTC

(SEQ ID NO: 10)

HVFOR1 CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAGTGCAGAGACAGTGACCAGAGT

(SEQ ID NO: 11)

HVFOR2 CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAGTGAGGAGACTGTGAGAGTGGT

(SEQ ID NO: 12)

HVFOR3 CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAGTGAGGAGACGGTGACTGAGGT

(SEQ ID NO: 13)

HVFOR4 CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAGTGAGGAGACGGTGACCGTGGT

(SEQ ID NO: 14)

카파 사슬 (포워드 및 리버스 프라이머)

KV1 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG CATAGTAGTGGATGTTTTGATGACCCAAACT

(SEQ ID NO: 15)

KV2 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG CGAGAGATACGATATTGTGATGACGCAGGCT

(SEQ ID NO: 16)

KV3 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG ATACGACGTAGATATTGTGATAACCCAG

(SEQ ID NO: 17)

KV4 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG TCACGTACTAGACATTGTGCTGACCCAATCT

(SEQ ID NO: 18)

KV5 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG CGTCTAGTACGACATTGTGATGACCCAGTCT

(SEQ ID NO: 19)

KV6 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG TCTACGTAGCGATATTGTGCTAACTCAGTCT

(SEQ ID NO: 20)

KV7 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG TGTACTACTCGATATCCAGATGACACAGACT

(SEQ ID NO: 21)

KV8 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG ACGACTACAGGACATCCAGCTGACTCAGTCT

(SEQ ID NO: 22)

KV9 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG CGTAGACTAGCAAATTGTTCTCACCCAGTCT

(SEQ ID NO: 23)

KVFOR1 CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAGCCGTTTCAGCTCCAGCTTG (SEQ ID NO: 24)

KVFOR2 CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAGCCGTTTTATTCCAGCTTGGT(SEQ ID NO: 25)

KVFOR3 CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAGCCGTTTTATTTCCAACTTTG (SEQ ID NO: 26)

람다 사슬 (포워드 및 리버스 프라이머)

LV CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG TACGAGTATGCAGGCTGTTGTGACTCAGGAA

(SEQ ID NO: 27)

LVFOR CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAGCTTGGGCTGACCTAGGACAGT

(SEQ ID NO: 28)

상기 모든 서열에서, 밑줄친 서열은 454 시퀀싱에 대한 것이며, 굵은 글씨체의 서열은 멀티플렉싱(multiplexing)을 위한 바코드이며, 보통 글씨체의 서열은 생쥐-특이적 서열이다.

상기 서술된 라이브러리를 증폭하기 위하여 이용된 프라이머는 하기와 같다:

중쇄 PCR:

CST454 생쥐 중쇄 프라이머 mix 1ul

cDNA 1ul

2x Phusion Master Mix 12.5ul

H2O 10.5ul

경쇄 PCR:

CST454 생쥐 경쇄 프라이머 mix 1ul

cDNA 1ul

2x Phusion Master Mix 12.5ul

H2O 10.5ul

PCR 사이클 조건은 표 4에서 기재된 바와 같을 수 있다.

단계	온도	시간(분)
1: 변성 단계	98℃	01:30
2: 변성 단계	98℃	00:10
3: 어닐링 단계	60℃	00:30
4: 확장 단계	72℃	00:30

단계 2-4가 적용되는 20 사이클이 적용된다. 이어서, PCR 생성물은 제조자의 프로토콜에 따라(Beckman Coulter Genomics' Agencourt AMPure XP system의 프로토콜), 2회 Agencourt Ampure DNA 정제 (Beckman Coulter Genomics, Danvers, MA로부터 상업적으로 입수 가능함)된다.PCR/유전자 라이브러리가 제조되면, 모든 후속 단계들은 emPCR 및 시퀀싱 반응에 대하여 454 제조 프로토콜을 따를 것이다. "Sequencing Method Manual, GS Junior Titanium Series" (May 2010 (rev. June 2010)) 및 "emPCR Amplification Method Manual-Lib-L, GS junior Titanium Series" (May 2010 (rev. June 2010)) 명칭의 454 Life Sciences Corp., a Roche Company, Branford, CT 06405에 의한 공개문헌 참조, 이들은 모두 전체적으로 본 명세서에 참조로 포함된다.

다수의 샘플이 이 단계에서 단일 시퀀싱 런으로 결합될 수 있다. 이는 특유한 바코드 (또는 454 플랫폼으로부터의 MID)에 의해 구별될 것이다. 예를 들어, 바코드는 PCR 프라이머에 포함된다.

일부 실시형태에서, emPCR Amplification Method Manual - Lib-L, GS junior Titanium Series (May 2010 (rev. June 2010); 454 Life Sciences Corp.)에 따른다. 일부 실시형태에서, 다음으로 Sequencing Method Manual, GS Junior Titanium Series" (May 2010 (rev. June 2010); 454 Life Sciences Corp.)에 따른다.

시퀀싱 데이터는 FASTA 파일 (또는 임의의 표준 파일 포맷)로 생성되고, 유전 물질 데이터베이스에 저장될 수 있다. 이 서열 데이터는, 동일한 동물의 혈청 및/또는 혈장 면역글로불린으로부터 생성된 관찰된 펩타이드 질량 스펙트럼을 분석하기 위하여 예측된 질량 스펙트럼 데이터베이스를 생성하는데 이용될 것이다. 이를 위하여 표준 프로그램이 이용될 수 있다. 이 실시예에서, 예측된 질량 스펙트럼은 Sequest 소프트웨어 패키지에 의해 생성되었다.

실시예 4

폴리클로날 집단으로부터 개별적인 항체 사슬의 동정

다음으로, 본 명세서에 개시된 방법이 몇몇 상이한 폴리클로날 집단으로부터의 개별적인 항체의 서열을 동정하기 위하여 이용되었다. 본 실시예의 방법은 도 2 및 4에 개략적으로 도시된다.

실시예 2에 기재된 방법을 이용하여, 3개의 상이한 항원에 특이적으로 결합하는 3개의 상이한 폴리클로날 집단이 3개의 상이한 라이브러리로 만들어졌다. 3개의 상이한 유전 물질 데이터베이스를 얻기 위하여, 전술한 454 시퀀싱 방법을 이용하는 딥 시퀀싱이 토끼 면역글로불린 사슬-코딩 서열에 특이적인 프라이머를 이용하여 수행되었다.

상응하게, 유전 물질 데이터베이스를, 상기 실시예 3에 서술된 방법을 이용하여 상이한 3개의 단백질 데이터베이스를 생성하는데 이용하였다.

첫 번째 항원에 대한 결과는 표 5(경쇄 및 표 6(중쇄)에 나타내어지며; 두 번째 항원은 표 7(경쇄) 및 표 8(중쇄)에 나타내어지며; 및 세 번째 항원은 표 9(경쇄) 및 표 10(중쇄)에 나타내어진다.

표 5 내지 10은 동물의 항체 레퍼토리로부터 딥 시퀀싱에 의해 생성된 서열 (특히 CFR3 영역)에 상응하는, 질량 분석에 의해 높은 신뢰도 (>99% 확실성)로 동정된 펩타이드 (CDR3 펩타이드)를 나타낸다. CDR3 계수는 펩타이드가, CDR3 영역에 매칭된 폴리클로날 항체 혼합물로부터 동정된 횟수를 나타낸다. CDR3 커버리지는 CDR3 영역의 총 아미노산에 대한, 질량 분석에 의해 동정된 펩타이드에 나타나는 CDR3 영역의 아미노산의 퍼센티지 (CDR3 컬럼에 나타내어짐)를 표시한다. 총 펩타이드는 딥 시퀀싱에 의해 결정된 전장 가변 영역 서열에 해당하는, 질량 분석에 의해 동정된 서열에 의한 펩타이드의 총 수를 나타낸다. 특유한 펩타이드는 딥 시퀀싱에 의해 결정된 전장 가변 영역 서열에 해당하는, 질량 분석에 의해 동정된 서열에 의한 특유한 펩타이드의 수를 나타낸다.

실시예 5

다른 예에서, 핵산 서열 및 폴리클로날 항체를 생성하기 위하여 하기 프로토콜이 이용될 수 있다. 결과는 이 방법을 이용하여 항원 특이적 항체를 생성하는데 성공하였음을 나타낸다.

이러한 프로토콜에서, 생쥐는 면역성 P-ERK 항원으로 면역다되었다. 유전 물질 데이터베이스 및 펩타이드 데이터베이스는 하기 방법을 이용하여 생성될 수 있다.

Ⅰ. 유전 물질 데이터베이스:

세포 분리.

면역된 생쥐로부터의 비장이 주사기 및 21G 바늘을 이용하여 5 mL의 RPMI/10%FCS로 5회 플러쉬(flush)되었다. 세포는 90% FCS/10% DMSO에서 동결되었다. 총 50-100 × 10⁶ 개 세포가 각각의 비장으로부터 분리되었다.

RNA 분리 및 cDNA 합성.

총 RNA는 QIAshredder (Qiagen cat#79654) 및 RNeasy 미니 키트 (Qiagen, Hilden, Germany; cat#74104)를 이용하여 제조자의 프로토콜에 따라 비장 세포로부터 분리되었다. RNA는 표준 차세대 시퀀싱 프로토콜에 따라 컬럼 상에서 DNAse 처리되었다. 총 RNA 농도는 ND-1000 분광광도계 (NanoDrop; Thermo Scientific, Wilmington, DE로부터 상업적으로 입수 가능함)를 이용하여 측정되었다.

분리된 RNA는, Thermoscript RT-PCR 시스템 (Invitrogen (part of Life 기술), Carlsbad, CA cat#11146-024)을 이용하는 역전사에 의한 first-strand cDNA 합성(first-strand cDNA synthesis)에 이용되었다. cDNA는 제조자의 프로토콜에 따라 1.5ug의 RNA 및 올리고 dT 프라이머를 이용하여 합성되었다.

V _H 및 V _L 증폭.

2-단계 PCR 반응이 V_H 및 V_L 유전자를 증폭하는데 이용되었다. 축퇴 센스 및 안티센스 프라이머의 혼합물이 PCR의 첫 번째 라운드에 이용되었고, 유니버셜 프라이머 세트가 PCR의 두 번째 라운드에 이용되었다. 다수의 센스 축퇴 프라이머(sense degenerate primers)에 의해, 중쇄 PCR은 8개의 독립된 반응으로 나뉘어진다. 이용된 프라이머의 서열은 하기에 나타내어진다.

첫 번째 라운드 프라이머, 유니버셜 꼬리는 밑줄쳐짐

중쇄 센스 프라이머:

V_H1.1:

ACGAGCTACGCACGA ACTGCAGGTRTCCACTCC (SEQ ID NO: 197)

ACGAGCTACGCACGA ATAGCAGGTGTCCACTCC (SEQ ID NO: 198)

ACGAGCTACGCACGA RGTACAGGTGTCCACTCC (SEQ ID NO: 199)

ACGAGCTACGCACGA GCYACAGMTGTCCACTCC (SEQ ID NO: 200)

ACGAGCTACGCACGA ACTGCAGGTGTCCWMTCC (SEQ ID NO: 201)

V_H1.2:

ACGAGCTACGCACGA RCTRCAGGTGTKCACTCC (SEQ ID NO: 202)

ACGAGCTACGCACGA GCTAWMGGTGTCCACTCC (SEQ ID NO: 203)

ACGAGCTACGCACGA CCTCAGGTGTCCACTCC (SEQ ID NO: 204)

ACGAGCTACGCACGA GCTACAGGTGCTCACTCC (SEQ ID NO: 205)

ACGAGCTACGCACGA ACTGCAGGTGTCCTCTCT (SEQ ID NO: 206)

V_H1.3:

ACGAGCTACGCACGA AYTGCAGGTGTCCAYTGC (SEQ ID NO: 207)

ACGAGCTACGCACGA GCTAMMGGTGTCCACTTC (SEQ ID NO: 208)

ACGAGCTACGCACGA CTCCTGTCAKTAACTKCAGGT (SEQ ID NO: 209)

ACGAGCTACGCACGA AACTGCAGGTGTCTCTCT (SEQ ID NO: 210)

ACGAGCTACGCACGA RCTRCAGGYGTCCACTCT (SEQ ID NO: 211)

V_H2:

ACGAGCTACGCACGA CCAAGCTGTATCCTTTCC (SEQ ID NO: 212)

ACGAGCTACGCACGA CCAAGCTGTGTCCTRTCC (SEQ ID NO: 213)

V_H3:

ACGAGCTACGCACGA TGTTGACAGYCVTTCCKGGT (SEQ ID NO: 214)

ACGAGCTACGCACGA TGTTCACAGCCTTTCCTGGT (SEQ ID NO: 215)

V_H4:

ACGAGCTACGCACGA TTTAAAAGGGGTCCAGTGT (SEQ ID NO: 216)

V_H5:

ACGAGCTACGCACGA TAYTTTAAAARGTGTCMAGTGT (SEQ ID NO: 217)

ACGAGCTACGCACGA GTTTTAAAAGGTGTCCTGTG (SEQ ID NO: 218)

V_H6-8:

ACGAGCTACGCACGA CTYTTAAAAGGKGTCCAGWG (SEQ ID NO: 219)

ACGAGCTACGCACGA CYTTTAMATGGTATCCAGTGT (SEQ ID NO: 220)

ACGAGCTACGCACGA CTTTTACATGGTTTCAAGTGT (SEQ ID NO: 221)

ACGAGCTACGCACGA YTGTCCCTGCATATGTCYT (SEQ ID NO: 222)

V_H9-15:

ACGAGCTACGCACGA ATGGCAGCWGCYCCAAG (SEQ ID NO: 223)

ACGAGCTACGCACGA TTTATCAAGGTGTGCATTGT (SEQ ID NO: 224)

ACGAGCTACGCACGA CTTTTAAAAGWTGTCCAGKGT (SEQ ID NO: 225)

ACGAGCTACGCACGA GTGACAGTCCTTCCTGGTAG (SEQ ID NO: 226)

ACGAGCTACGCACGA CTTCCTGATGGCAGTGGTT (SEQ ID NO: 227)

ACGAGCTACGCACGA AGCTACAGGTATCCAATCC (SEQ ID NO: 228)

중쇄 안티센스 프라이머:

IgG1:

CACTGGTGTGAGTCA ATGCAGACAGATGGGGGTGTCG (SEQ ID NO: 229)

IgG2a:

CACTGGTGTGAGTCA AGACCGATGGGGCTGTTGTT (SEQ ID NO: 230)

IgG2b:

CACTGGTGTGAGTCA ACAGACTGATGGGGGTGTTGTT (SEQ ID NO: 231)

IgG3:

CACTGGTGTGAGTCA AGACAGATGGGGCTGTTGTT (SEQ ID NO: 232)

카파 사슬 센스 프라이머:

ACGAGCTACGCACGA GACATYWWGATGACCCAGTCTCC (SEQ ID NO: 233)

카파 사슬 안티센스 프라이머:

CACTGGTGTGAGTCA CAGTTGGTGCAGCATCAGCCCG (SEQ ID NO: 234)

두 번째 라운드 프라이머, 유니버셜 꼬리는 밑줄쳐짐

중쇄 또는 경쇄 센스 프라이머:

CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTC ACGAGCTACGCACGA (SEQ ID NO: 235)

중쇄 안티센스 프라이머:

MID97:

CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC TCAGctagtcactc CACTGGTGTGAGTCA

(SEQ ID NO: 236)

MID81:

CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGAGAGCGTCACCACTGGTGTGAGTCA

(SEQ ID NO: 237)

MID24:

CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTAGAGACGAGCACTGGTGTGAGTCA

(SEQ ID NO: 238)

경쇄 안티센스 프라이머:

MID34:

CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC TCAGcacgctacgt CACTGGTGTGAGTCA

(SEQ ID NO: 239)

MID66:

CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCACGCGAGACACTGGTGTGAGTCA

(SEQ ID NO: 240)

MID57:

CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCGCGTATACACACTGGTGTGAGTCA

(SEQ ID NO: 241)

상기 서열에서, 및줄쳐진 이탤릭체의 서열은 2단계 PCR 증폭을 위한 것이며, 밑줄쳐진 서열은 454 시퀀싱을 위한 것이며, 굵은 글씨체의 서열은 454 키(key)이며, 소문자 서열은 멀티플렉싱을 위한 바코드이며, 보통 글씨체의 대문자 서열은 생쥐-특이적 서열이다.

PCR 반응은 표 11에 요약된 바와 같이 상기 프라이머를 이용하여 셋업되었다.

첫 번째 라운드에 있어서, 50 ㎕ 중쇄 PCR 반응물은 0.2 μM의 각각의 센스 프라이머 (반응당 5개의 센스 프라이머) 및 0.2 μM의 각각의 안티센스 프라이머 (반응당 4개의 안티센스 프라이머), 10 ㎕의 5x Phusion HF 반응 버퍼(Finnzymes (part of Thermos Scientific), cat#F-518), 1 ㎕의 cDNA, 0.2 μM dNTP (NEB, cat#N0447), 1 ㎕의 Phusion Hot Start II DNA polymerase (Finnzymes, cat#F-549L) 및 28 ㎕ RT-PCR 등급 물 (Ambion (a Life Technologies company), Austin, TX, cat#AM9935)을 함유하였다. 첫 번째 라운드에 있어서, 50 ㎕ 경쇄 PCR 반응물은 0.2 μM의 센스 프라이머 및 0.2 μM의 안티센스 프라이머, 10 ㎕의 5x Phusion HF 반응 버퍼 (Finnzymes, cat#F-518), 1 ㎕의 cDNA, 0.2 μM dNTP (NEB, cat#N0447), 1 ㎕의 Phusion Hot Start II DNA polymerase (Finnzymes, cat#F-549L) 및 35 ㎕ RT-PCR 등급 물 (Ambion, cat#AM9935)을 함유하였다. PCR 열화학사이클 프로그램은 하기와 같다: 2분 동안 98℃; 15 사이클 (0.5분 동안 98℃, 0.5분 동안 55℃, 1분 동안 72℃); 5분 동안 72℃; 4℃ 저장. PCR 생성물은 DNA clean and Concentrator -5 kit (Zymo Research Co., Irvine, CA, cat#DR014)를 이용하여 제조자의 프로토콜에 따라 정제되었다.

두 번째 라운드에 있어서, 50 ㎕ 중쇄 PCR 반응물은 0.2 μM의 유니버셜 센스 및 유니버셜 안티센스 프라이머, 10 ㎕의 5x Phusion HF 반응 버퍼 (Finnzymes, cat#F-518), 10 ㎕의 정제된 첫 번째 라운드 PCR 생성물, 0.2 μM dNTP (NEB, cat#N0447), 1 ㎕의 Phusion Hot Start II DNA 중합효소 (Finnzymes, cat#F-549L) 및 19 ㎕의 RT-PCR 등급 물 (Ambion, cat#AM9935)을 함유하였다. PCR 열화학사이클 프로그램은 다음과 같았다: 2분 동안 98℃; 10 사이클 (0.5분 동안 98℃, 0.5분 동안 55℃, 1분 동안 72℃); 5분 동안 72℃; 4℃ 저장. 두 번째 라운드에 있어서, 50 ㎕ 경쇄 PCR 반응물은 0.2 μM의 유니버셜 센스 및 유니버셜 안티센스 프라이머, 10 ㎕의 5x Phusion HF 반응 버퍼 (Finnzymes, cat#F-518), 10 ㎕의 정제된 첫 번째 라운드 PCR 생성물, 0.2 μM dNTP (NEB, cat#N0447), 1 ㎕의 Phusion Hot Start II DNA 중합효소 (Finnzymes, cat#F-549L) 및 19 ㎕ RT-PCR 등급 물 (Ambion, cat#AM9935)을 함유하였다. PCR 열화학사이클 프로그램은 다음과 같다: 2분 동안 98℃; 8 사이클 (0.5분 동안 98℃, 0.5분 동안 55℃, 1분 동안 72℃); 5분 동안 72℃; 4℃ 저장. PCR 생성물은 AMPure XP (Agencourt; Beckman Coulter Genomics, Brea, CA, cat#A63881)를 이용하여 제조자의 프로토콜에 따라 정제되고, Agilent 2100 BioAnalyzer를 이용하여 분석되었다.

PCR 생성물의 서열은 예측된 아미노산 서열로 번역되고, 이는 이후 이론적으로 소화되어 (예를 들어, 프로테아제 및/또는 화학적 단백질 절단 시약에 의해), 가상 펩타이드 단편을 생성한다. 이러한 가상 펩타이드 단편은 예측된 질량 스펙트럼을 생성하는데 이용된다.

Ⅱ. 폴리클로날 항체로부터의 펩타이드 단편의 실제 질량 스펙트럼의 생성:

폴리클로날 항체는 동물의 혈청 및/또는 혈장으로부터 (예를 들어, 핵산 서열이 얻어지는 동물의 혈청 및/또는 혈장으로부터) 정제된다. 항체를 정제하기 위하여, 하기 방법이 이용된다.

단백질-G 정제:

1mL의 마그네틱 단백질-G 비드 (Millipore (Billerica, MA), cat# LSKMAGG10)가 4개의 15mL 원뿔 모양 튜브 (Falcon (BD Biosciences, Franklin Lake, NJ), cat#352097) 각각에 가해졌다. 각각의 튜브 내의 비드는 10mL의 인산염 완충 식염수 pH7.4, 0.05% Tween-20 (PBST)로 2회 세척되고, 10mL의 PBS로 3회 세척되었다. 3마리 생쥐 (ID 1262-2, 1262-4, 1263-4)로부터의 혈청은 함께 모아져 PBS 중 6ml의 최종 부피로 10배 희석되었다. 이어서 1.5ml의 합병된 희석 혈청은 각각의 비드 튜브에 가해져, 4℃에서 하룻밤동안 배양되었다. 통과액이 수집되어, 2회 더 정제 과정이 수행되었다. 통과액이 수집된 후, 각각의 튜브는 10mL PBST로 2회, 10mL의 PBS로 3회 세척되었다. 이어서, 각각의 튜브는 0.1M pH 2.7 글리신 0.5mL에 의해 30분 동안 4℃에서 배양되어, IgG를 용리하였다. 용리는 5회 반복되었다. 모든 용리액은 1M Tris pH 8.5로 중화되고, PBS에 대하여 하룻밤동안 투석(dialyzed)되고, ND-1000 분광광도계 (Nanodrop)에 의해 단백질 농도가 측정되었다. 총 2.5mg의IgG가 정제되었다.

항원 컬럼 제조:

5.0mL의 새로운 스트렙타비딘 (SA) 마그네틱 비드 (Pierce, cat#88817)가 10mL PBS로 3회 세척되고, 비오틴(biotin) p-ERK 펩타이드 (Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA.로부터 상업적으로 입수 가능한 Catalog No. 1150의 비오틴화된 형태)의 20mg/ml 저장액 105 uL에 의해 4℃에서 하룻밤동안 배양되며, 5.0mL의 PBS에서 희석되었다. 통과액은 버려졌으며, 비드는 10mL의 PBS로 3회 세척되고, 10개의 로우 바인딩 1.7mL 튜브 (Axygen (Union City, CA), cat# MCT-175-L-C)로 앨리쿼트되었다(aliquoted). 앨리쿼트된 비드는 마그네틱 랙 (Invitrogen, DynaMag)에 놓여졌고, 희석된 혈청을 첨가하기 전에 PBS가 제거되었다.

항원 특이적 정제:

상기로부터 단백질-G 정제된 IgG가 비오틴 P-Erk 펩타이드에 결합된 SA-마그네틱 비드에 가해졌다. 4℃에서 하룻밤동안 배양한 후, 통과액이 수집되고, 비드는 PBS-함유 버퍼로 세척되었다.

이어서, IgG는 1.5mL 0.1M 글리신 pH 3.5의 5개 분획(fraction), 이어서 1.5mL 0.1M 글리신 pH 2.7의 5개 분획, 이어서 1.5mL 0.1M 글리신 pH 1.8의 5개 분획에 의해 용리되고, 1M Tris pH 8.5로 중화되었다. 용리액은 p-ERK -BSA 펩타이드로 코팅된 96-웰 플레이트를 이용하여 P-ERK (즉, 포스포릴레이티드(phosphorylated) ERK 키나제, 생쥐를 면역시키는데 이용된 항원) 반응성에 대하여 분석되었다. 활성을 갖는 분획들이 ELISA (Thermo, cat#23300)에 의해 정량화되었고, 1시간 동안 20uM U0126로, 또는 15분 동안 200nM 테트라데카노일-포르볼-미리스트산 (Tetradecanoyl-Phorbol-Myristic Acid, "TPA")의 어느 하나로 처리된, Jurkat T 세포로부터의 용해물을 이용하여 웨스턴 블롯에 의해 p-ERK 반응성에 대하여 분석되었다. 가장 깨끗한 p-ERK-반응성을 갖는 분획이 질량 분석에 의해 분석되었다.

질량 분석

항체-함유 분획은 적어도 하나의 프로테아제 (예를 들어, 트립신) 및/또는 적어도 하나의 화학적 단백질 절단 반응에 의해 소화되었고, 수득된 펩타이드는 질량 분석을 이용하여 분석되었다. 펩타이드를 분석하는데 이용된 질량 분석 방법은 표준적이며, 이전에 상세하게 서술되었다 (예를 들어, 미국특허 US 7,300,753; Geiger et al., Nature Methods 7: 383-385, 2010; Elias and Gygi, Nature Methods 4: 207-214, 2007; Keshishian et al., Molecular and Cellular Proteomics 6: 2212-2229, 2007 참조, 이들 모두는 전체적으로 본 명세서에 참조로 포함됨).

전술한 바와 같이 (예를 들어, 실시예 3 참조), 질량 스펙트럼은 유전 물질 데이터베이스의 정보를 레퍼런스로 이용하여 분석된다. 이를 위하여, MS2 스펙트럼이 수집된 후, 매 MS2 스펙트럼에 대하여 매치(match)를 찾는 표준 컴퓨터 프로그램을 이용하여, 우수한 질의 스펙트럼이 아니거나 우수한 매치가 아닌 경우일지라도, 레퍼런스 서열로부터의 (즉, 유전 물질 데이터베이스로부터의) 예측된 MS2 스펙트럼에 하나하나씩 서로 연관된다. 그러한 프로그램은 상업적으로 입수 가능하다. 예를 들어, Sequest 소프트웨어는 Sage-N Research, Inc. (Milpitas, CA)로부터 Sorcerer 소프트웨어 패키지의 일부로 얻어질 수 있다. 우수한 품질의 스펙트럼으로, 또는 유전 물질 데이터베이스에 대한 우수한 매치로 확인된 스펙트럼은 유전 물질 데이터베이스로부터의 레퍼런스 서열 상에 맵핑된다. 펩타이드 MS2가 유전자 데이터베이스의 2 이상의 별개의 구성요소에 대하여 맵핑되는 경우, 이는 일 이상의 확인된 구성요소일 수 있으므로, 어느 구성요소가 항원 결합 폴리클로날 항체 내에 존재하는지 불명확하다. 따라서, 과정이 반복되어, 반복에 의해 일부 구성요소가 다른 것보다 더 수집된 MS 스펙트럼과 서로 연과되는 것을 나타내는 증거가 수집될 수 있다. 다시 말하면, 그 가변 영역 서열의 다수는 항원 결합에 의한 강화(enrichment) 후에 MS2 스펙트럼으로서 관찰된다. 이러한 요소는 진성(true) 항원 결합 항체를 코딩하는 것으로 추정되므로, 그 서열이 구성되고 (예를 들어, 합성 올리고뉴클레오타이드 생성기에서), 발현 플라스미드 (예를 들어, Invitrogen로부터 pcDNA3.1)로 클로닝되고, 세포에서 발현되고, 항원 결합에 대하여 시험된다.

결과

도 5에 나타내어진 바와 같이, 펩타이드 단편으로부터의 실제 질량 분석 결과와 핵산 서열로부터의 이론적 질량 분석 정보의 상호연관성은 중쇄 및 경쇄 단편의 서열의 동정을 가능하게 한다. 질량 분석 커버리지가 관련되는 한 가장 높은 정도의 신뢰도(confidence)를 갖는 펩타이드 및 핵산 서열에 대한 상호연관성이 나타내어진다. 실제 펩타이드 단편을 포함하는 전장 사슬을 코딩하는 핵산 서열이 합성되었고, 재조합 발현 벡터로 클로닝되었다. 무작위 페어링에 의해, 중쇄 및 경쇄가 결합되고, 세포에서 함께 발현되어 재조합 항체를 생산 (즉, 창조)하였다 (예를 들어, 미국특허 US 4,816,397; US 4,816,567; 및 미국특허공개 US 20110045534의 방법 참조). 도 6은 pERK-코팅된 플레이트를 이용한 ELISA 실험의 결과를 나타내는 표이다. 나타내어진 바와 같이, 도 5에서 동정된 사슬의 몇몇 페어링은 p-ERK-코팅된 플레이트에 특이적으로 결합할 수 있는 항체에 이르렀다 (양성항체는 도 6에서 황색으로 나타내어지고, 양성 펩타이드는 도 5에서 적색으로 나타내어진다).

놀랍게도, 이 결과는 펩타이드 발생 빈도 단독, 또는 CDR3 계수의 빈도 단독은 모두 항원에 특이적으로 결합하는 특정 항체 사슬의 이용을 예측하지 않음을 나타내었다. 예를 들어, LC-MS/MS (즉, 액체 크로마토그래피, 탠덤 질량 분석) 분석으로부터 235개 펩타이드에 매치된 경쇄 핵산 서열 ref. no. G623FKB01A3GC7, 및 경쇄 핵산 서열 ref. no. G623FKB01AXJ1C는 단일 NGS 런에서 1068회 나타난 서열을 가졌다 (도 5, 아래쪽 표). 그러나, 이들 중 어느 것도, 중쇄와 결합되었을 때, pERK 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 실제로 형성할 수 없었다. 이 결과는 매우 놀랍고, NGS 분석으로부터 핵산 서열 빈도에만 의존하는 Reddy et al., Nature Biotechnology 28(9):965-969, 2010의 방법은 진정한 항원 결합 서열을 놓치게 될 것임을 보여준다. 따라서, 본 명세서에 개시된 방법은 선택된 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 동정 및 분리하는데 신뢰성 있게 이용될 수 있다.

실시예 6

항원 특이적 토끼 항체가 본 명세서에 개시된 방법에 따라 생성되었다. 이를 위하여, 하기 프로토콜에 따랐다.

토끼 비장 세포 RNA 정제

p-MET 항원 (Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA Catalog # 1645)이 표준 방법을 이용하여 토끼를 면역시키기 위하여 이용되었다. 항원 특이적 혈청 (즉, 면역 항원에 특이적으로 결합된 폴리클로날 항체를 함유하는 혈청)을 갖는 면역된 토끼가 마지막 항원 주사 (부스트) 후에 희생되었다. 50ml의 혈액이 수집되고, 비장 또는 다른 림프 기관이 수집되었다. 천만개의 비장 세포가 RNA 정제에 이용되었다. 50 ml 수집된 혈액으로부터의 혈청 및/또는 혈장은 항원 특이적 항체 친화성 정제(antigen specific antibody affinity purification)를 위하여 따로 놓아졌다.

RNA는 Qiagen's RNeasy 키트 (Qiagen cat# 74104)를 이용하여 제조자의 프로토콜에 따라 비장 세포로부터 정제되었다. 컬럼에서, DNase I-처리가 수행되어, DNase I 소화 단계를 포함함으로써 오염된 게놈을 제거하였다. RW1 버퍼 세척 후에, RDD 버퍼에서 희석된 DNase I (Qiagen cat# 79254)가 RNA 정제 컬럼에 적용되고, 실온에서 20분 동안 배양되었다. 이어서, 컬럼이 1회 더 RW1 버퍼로 세척된 후, RPE 버퍼로 2회 세척되고, RNA는 30㎕ 또는 50㎕의 물로 용리되었다. RNA의 농도는 450nm 파장에서 Nanodrop 분광광도계 (Thermo Scientific)에서 측정된 흡수도(absorbance)에 의해 결정되었다.

cDNA 합성 및 PCR에 의한 앰플리콘의 생성

토끼 비장 세포로부터 분리된 RNA는 먼저 Invitrogen's Thermoscript 역전사 효소 (Invitrogen cat#12236-022)를 이용하여 하기와 같이 역전사되었다:

DNase 처리된 RNA: 5 uL

올리고 dT 프라이머(50uM): 1 uL

dNTP's (10mM): 2 uL

dI H2O: 4 uL

5분 동안 65℃에서 배양하고, 2분 동안 얼음에 놓은 후 하기를 첨가한다:

5X cDNA 버퍼: 4 uL

0.1mM DTT: 1 uL

RNAse OUT: 1 uL

dI H2O: 1 uL

ThermoScript: 1 uL

혼합물은 1시간 동안 50℃에서 배양된 후, 5분 동안 85℃에서 가열-비활성화 단계를 거쳤다. 마지막으로, 상보적 RNA 가닥은 1㎕의 RNase H (Invitrogen (Carlsbad, CA), cat#18021-071)를 첨가하고, 20분 동안 37℃에서 배양함으로써 cDNA로부터 제거되었다.

시퀀싱을 위한 중쇄, 카파 및 람다 사슬 가변 영역의 앰플리콘이 하기와 같이 PCR에 의해 생성되었다.

중쇄 융합 프라이머:

리버스

포워드

CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTC TCAGatcagacacgATGGAGACTGGGCTGCGCT

(SEQ ID NO: 243)

카파 사슬 융합 프라이머

리버스

포워드

CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTC TCAGATGGACATGAGGGCCCCC

(SEQ ID NO: 245)

람다 사슬 융합 프라이머

리버스

포워드

CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTC TCAGATGGCCTGCACCCCG

(SEQ ID NO: 247)

상기 서열에서, 밑줄친 서열은 454 시퀀싱을 위한 것이고, 굵은 글씨체 서열은 454 키이며, 소문자 서열은 멀티플렉싱을 위한 바코드이며, 보통 글씨체의 대문자 서열은 토끼-특이적 서열이다.

PCR 증폭은 Finnzyme's Phusion Hot Start II 중합효소 (Thermo Scientific cat# F-540S)를 이용하여 이루어졌고, 반응 혼합물 및 조건은 하기와 같이 설정되었다:

반응 혼합물:

cDNA: 2.5 uL

5X 버퍼 GC: 5 uL

10 mM dNTP mix: 0.25 uL

Phusion HotStart II: 0.25 uL

프라이머 (포워드+리버스) 30 uM: 0.25 uL

물: 16.75 uL

PCR 프로그램:

단계 1 98℃ - 1.5분

단계 2 98℃ - 10초

단계 3 60℃ - 30 초

단계 4 72℃ - 30 초

단계 5 단계 2에서 4까지를 20회 반복

단계 6 72℃ - 2 분

단계 7 유지(hold)

임의의 시약에서 오염된 주형으로부터의 임의의 허위(false) 증폭이 없음을 확실하게 하기 위하여, 중복 반응(duplicate reactions)이 각각의 혼합물에 대하여 셋업되었으며(중쇄에 대하여 4개의 별도 반응, 및 각각의 경쇄에 대하여 1개의 반응), 이 경우 cDNA 주형은 물로 대체되었다. 주형이 없는 이러한 음성 대조군은 주형을 함유하는 샘플과 동시에 시행(run)되었다. PCR 프로그램 완결 시에, 3㎕의 각각의 반응물(음성 대조군 포함)이, 주형이 반응물에 첨가되었으나, cDNA는 없었던 때에 앰플리콘의 존재에 대하여 1.5% TAE 아가로스 겔에서 전기영동에 의해 분석되었다. 도 7은 이 전기영동 겔의 결과를 나타낸다.

454 시퀀싱을 위한 앰플리콘 정제, 분석, 정량화 및 제조

PCR 샘플 내의 과다한 프라이머 및/또는 프라이머 다이머를 제거하기 위하여, 앰플리콘은 Agentcourt Ampure 마그네틱 비드 (Beckman Coulter cat#A63881)를 이용하여 제조자의 프로토콜 (000387v001)에 따라 정제되었다. Ampure 정제 후에 용리된 앰플리콘은 고감도 DNA 칩 (Agilent Technologies cat# 5067-4626)을 이용하여, 제조자의 프로토콜에 따라 Agilent 2100 Bioanalyzer에서 순도 및 임의의 오염 DNA 종의 존재에 대하여 분석되었다.

앰플리콘의 순도가 확인되면, DNA의 농도가 Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit (Invitrogen cat#P7589)를 이용하여 제조자의 프로토콜에 서술된 바에 따라 형광강도계(fluorometer)에서 정량화되었다. 키트에 제공되는 람다 DNA는 표준 곡선이 100ng/well로부터 1.56ng/well까지 생성되는 농도 표준으로서 이용되었다. TE 버퍼에서 10배 희석된 각각의 앰플리콘의 형광은 2회 측정되었고, DNA의 농도는 표준 곡선의 선형 부분(linear portion)에 따라 결정되었다. 모든 형광 측정은 흑색 96-웰 플레이트에서 이루어졌다. 형광 값이 표준 곡선의 선형 범위(linear range)를 벗어나는 경우, 샘플은 선형 범위 내에 속하는 형광 값을 얻기 위하여 더 크거나 더 작은 희석액으로 다시 측정되었다. 각 사슬 형태의 베이스 페어에서의 대략적인 크기를 이용하여 (중쇄-540bp, 카파-485bp 및 람다-510bp), 하기 식이 농도를 결정하는데 이용되었다:

각 앰플리콘의 농도 (분자/㎕) =

[샘플 농도 (ng/㎕)*6.022×10²³]/[656.6×10⁹*앰플리콘 길이 (bp)]

각각의 앰플리콘은 1 × 10⁷ 분자/㎕로 정상화된 후(normalized), 중쇄: 카파 사슬: 람다 사슬의 부피비 3:3:1에서 혼합되고, 보텍스되고(vortexed), 최종적으로 1:10으로 희석되어, 1×10⁶ 분자/㎕에서 혼합물의 최종 농도를 얻었다.

에멀젼 PCR 증폭, 비드 강화(enrichment), 비드 카운팅 및 시퀀싱

에멀젼 PCR은 하기 변형과 함께 454 발간된 프로토콜: "emPCR Amplification Method Manual - Lib-L" (Edition: May 2010 (Rev. April 2011, 전체적으로 본 명세서에 참조로 포함됨)에 따라 수행되었다.

Section 3.1.3 Step 2)

시약 부피(㎕)

분자생물학 등급의 물 458

첨가제 515

증폭 혼합물(Amp Mix) 270

증폭 프라이머(Amp Primer) 32

효소 혼합물(Enzyme Mix) 70

PPiase 2

합계 1347

시퀀싱 비드가 강화되면, "emPCR Amplification Method Manual - Lib-L" 의 단계 3.7로부터, 비드가 하기 세팅을 갖는 Beckman Coulter's Z2 Particle Counter에서 카운팅되었다:

Aperture: <100 ㎛>

Aperture Kd: <60.04>

Set Upper cutoff: <30.00 ㎛>

Set Lower cutoff: <10.00 ㎛>

Count Mode: <between>

Metered Volume: <0.5 ml>

Resolution: <256>

비드 농도는 하기와 같이 계산되었다:

비드의 농도 = [입자 카운터로부터 읽은 평균(Avg. reading from particle counter) * 4] 비드/㎕

에멀젼 PCR로부터 강화된 비드는 GS FLX+ 또는 GS Junior를 위한 454 시퀀싱 프로토콜에 따라 454 Sequencer (Roche)에서 시퀀싱되었다.

면역된 토끼의 혈청으로부터 수집된 폴리클로날 항체의 펩타이드 단편은 생쥐에 대하여 전술한 바와 같이 생성되었다 (예를 들어, 실시예 6 참조). 요약하면, 하기 프로토콜이 이용되었다.

토끼 IgG의 펩타이드-친화성 정제

1. 펩타이드-친화성 수지를 재현탁하고, 0.4 ml의 슬러리를 새로운 컬럼 (Bio-rad, 731-1550, 0.8x4cm)으로 취하며, 이는 0.2ml 안정적인 정제 수지를 만들어야 한다. 필요한 경우, 동일한 부피의 블랭크 수지 또는 비-관련된 펩타이드-친화성 수지의 대조군 컬럼을 만든다. 블랭크 수지는 컨쥬게이션 과정에서 펩타이드 없이 만들어졌다.

2. 컬럼을 10ml PBS로 세척하고, 이를 완전히 따라낸다.

3. 단백질-A 정제된 총 IgG를 탑재한다. 하부를 먼저 덮고 파라핀으로 둘러싼다. 3-5ml의 총 IgG를 가한다. 상부를 덮고, 파라핀으로 싼다.

4. 실온에서 15분 동안 롤러에서 회전시킨다.

5. 통과액을 수집한다. 상부를 먼저 벗긴 후, 컬럼을 완전히 빼낸다.

6. 10 ml PBS로 3회 세척한다 (모든 수지가 하부에 채워진 것을 확실하게 하기 위하여 컬럼 벽을 세척한다).

7. 10ml 1x RIPA로 세척한다.

8. pH7.4 PBS 중의 10ml 20% 아세토니트릴로 세척한다.

9. pH7.4 PBS 중의 60% 에틸렌글리콜 10ml로 세척한다.

10. pH7.4 PBS 중의 2.0M NaCl 10ml로 세척한다.

11. pH3.5 0.1M 글리신 5ml로 용리하고, 즉시 70ul 1M Tris pH8.5로 중화한다.

12. pH2.7 0.1M 글리신 5ml로 용리하고, 즉시 300ul 1M Tris pH8.5로 중화한다.

13. pH1.8 0.1M 글리신 5ml로 용리하고, 즉시 800ul 1M Tris pH8.5로 중화한다.

14. 대상의 전부 또는 일부가 토끼 IgG ELISA 플레이트 (Molecular assay/ELISA group에 의해 제공됨)를 이용하여 IgG 농도에 대하여 측정된다.

15. 항원 특이적 활성은 ELISA 및/또는 웨스턴 블롯을 이용하여 평가될 수 있다. 특이적 활성은 모든 분획을 동일한 농도로 정상화한 후에 평가될 수 있다.

16. 정제된 항체 물질은 LC-MS/MS를 위하여 처리될 준비가 된다.

액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석 (LC-MS/MS)은 전술한 바와 같이, 정제된 항체로부터의 펩타이드에서 수행되었다 (즉, 정제된 항체는 소화되고, 펩타이드는 분석된다). 얻어진 질량 스펙트럼은 유전 물질 데이터베이스에서의 정보에 근거하여 이론적 질량 분석 데이터와 서로 연관되었다.

도 8에 제시된 표에 나타내어진 바와 같이, 펩타이드의 실제 (즉, 관찰된) 질량 분석과 핵산 서열로부터의 이론적인 질량 분석 데이터를 서로 연관시킴으로써, 다수의 중쇄 및 경쇄 펩타이드가 동정되었다. 이러한 펩타이드의 발생 빈도는 표의 가장 오른쪽 레인에 나타내어진다. 이러한 사슬은 그들의 CDR3 커버리지(대부분의 경우 100%)에 근거하여 선택되었으며, 근본적인 뉴클레오타이드 서열은 유전 물질 데이터베이스로부터 검색되고 합성되었다. 6개의 중쇄는 5개의 경쇄와 무작위로 결합되었고 (도 8의 적색으로 나타내어짐), 수득된 항체는 ELISA (항원-코팅된 플레이트에 의해) 및 웨스턴 블롯팅 분석 (비처리된 헬라 세포 (- 레인)에 대하여)를 이용하여 시험되거나, 또는 인간 성장 인자로 처리되며 (+ 레인), 이 경우 HGF-처리된 세포는 p-MET 항원을 발현하는 것으로 알려진다. 웨스턴 블롯팅 분석의 결과는 도 9에 나타내어진다. p-MET 특이적 항체 (Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA, catalog no. 3126로부터 상업적으로 입수 가능함)가 대조군으로서 이용되었다. 세포 용해물에서 항원에 대하여 높은 특이적인 결합을 나타내었던 본 명세서에 개시된 방법에 따라 생성된 항체는 도 8에 굵은 적색으로 나타내어진다 (즉, 중쇄 ref nos. GXRYQP201BIQD2 및 GXRYQP201A97DZ, 및 경쇄 ref nos. GXRYQP201A291T 및 GXRYQP201BRIWK 및 GXRYQP201ALDF5). 도 9는 이 실시예에서 생성된 항원에 특이적으로 결합한 6개의 상이한 항체의 2개만을 나타냄을 주의하라(즉, 도 9는 GXRYQP201A291T 경쇄 및 GXRYQP201BRIWK 경쇄와 결합된 GXRYQP201BIQD2 중쇄를 이용하는 단 2개의 항체만 나타낸다).

다시, 생쥐 항체에 의해 관찰된 바와 같이, 가장 높은 빈도를 갖는 사슬은 항원 특이적 항체에 이르지 않았다 (9.12%의 빈도를 가지나 항원에 특이적으로 결합하지 않은 중쇄 GXRYQP201A1C3B를, 단지 0.19%의 빈도를 가지지만 항원에 특이적으로 결합한 중쇄 GXRYQP201 BIQD2와 비교).

실시예 7

이 실시예는 전술한 접근법을 이용하여 4개의 상이한 항원으로 면역된 토끼로부터, 및 추가적인 상이한 항원 (표 12)으로 면역된 생쥐로부터 모노클로날 항체의 생성을 서술하며, 이는 본 접근법이 적어도 2개의 실험의 동물 종에서 강건하고 재생가능함을 더욱 입증한다.

뉴질랜드 백색 토끼가 키홀림펫헤모사이아닌 (KLH)에 컨주게이트된 인간 프로게스테론 수용체 A/B 특이적 (PR A/B) 펩타이드로 면역되었다. PR A/B에 대해 가장 높은 ELISA 및 웨스턴 블롯 신호를 갖는 토끼를 선택하기 위하여, 각각의 동물의 조(crude) 혈청에서 항원 특이적 항체 활성이 스크리닝되었다. 이 동물로부터의 혈청이 20 mL의 혈액으로부터 수집되었고, RNA는 비장의 B 세포로부터 수집되었다. 총 γ 면역글로불린 (IgG)이 단백질 A 세파로오스 컬럼을 이용하여 혈청으로부터 분리되었고, 항원 특이적 폴리클로날 항체가 세파로오스 비드에 컨주게이트된 항원 특이적 펩타이드로 이루어진 맞춤(custom) 컬럼을 이용하여 친화성 크로마토그래피에 의해 정제되었다. 결합된 IgGs는 PBS로 광범위하게 세척된 후, 점진적으로 산성인 버퍼 (pH 3.5, pH 2.7 및 pH 1.8)에 의해 순차적 용리되었다(도 10a). 각각의 용리로부터의 분획이 수집, 중화되고, PR A/B 발현 세포주 T47D 및PR A/B 음성 세포주 HT1080로부터의 용해물의 항원 특이적 ELISA 및 웨스턴 블롯팅에 의해 스크리닝되었다 (도 10a). 폴리클로날 분획이 농도 매치된 경우, PR A/B 웨스턴 블롯 특이적 활성이 pH 1.8 분획에서 크게 강화되었고, pH 2.7 분획에서 보다 적었으며, pH 3.5 분획에서는 검출되지 않았음이 확인되었다. 따라서, pH 1.8 분획이 LC-MS/MS 분석에 이용되었다.

NGS에 의해 Ig V 영역 서열의 맞춤 데이터베이스를 생성하기 위하여, RNA는 PR A/B에 대하여 강한 특이적 활성을 나타내었던 동일한 동물로부터 수집된 총 비장 세포로부터 분리되었다. 전체 V 영역을 증폭시키기 위하여, Ig 중쇄 및 경쇄 가변 영역 앰플리콘(amplicon)은 토끼 Ig-특이적 γ 및 κ 사슬 프라이머를 이용하여 생성되었다. 프라이머는 바코드를 함유하였으며, Roche 454 NGS 플랫폼용으로 설계된 454 티타늄 융합 프라이머에 대한 특별한 조건을 따랐다. 수집된 V 영역 서열의 수를 증가시키기 위하여, γ 및 κ 사슬로 이루어진 3개의 454 GS Junior 시퀀싱 런(runs)을 결합하였으며, 이에 의하여 총 80,000개의 passed filter reads에 이르렀고, 그 중 44,363개는 전체 V 영역을 함유하였으며, 후술되는 단백질군 접근법의 기초를 제공하였다. 수집된 서열은, 가우시안 분포를 따르는 다양한 길이의, 5,279개의 특유한 γ 사슬 상보성 결정 영역 3 (CDR3) 서열 및 11,681개의 특유한 κ 사슬 CDR3 서열을 포함하였다. 이전 데이터와 일치하여, 이 토끼는 중쇄 VDJ 재배열에서 우선적으로 VH1 (V1S69+ V1S40 >64%), 다음으로 VH4 (V1S44+ V1S45 ~30%)를 이용하였다 (Becker et al., Eur J Immunol 20: 397-402, 1990, Knight, Annu Rev Immunol 10: 593-616, 1992, Mage et al., Dev Comp Immunol 30: 137-153, 2006).

다음으로, pH 1.8 분획은 그의 이전 활성에 근거하여 LC-MS/MS에 의해 시험되었다 (도. 10a). 서열 커버리지를 최대화하기 위하여, 5ug의 폴리클로날 항체가 고르게 나눠졌고, 키모트립신, 엘라스타아제, 펩신 및 트립신에 의해 각각 소화되었다. 45-분 경사(45-minute gradient)를 이용하는 총 4회의 LC-MS/MS 런이 Orbitrap Velos (Thermo Fisher)를 이용하여 수집되었고, 런 당 평균 10,000개의 스펙트럼이 생산되었다 (도 10b). 오류발견률 (false-discovery rate, "FDR")을 산정하기 위하여, 타겟/유인 접근법이 포워드 및 리버스-배향된 서열의 복합 데이터베이스를 생성함으로써 이용되었고 (Elias et al., Nat Methods 4: 207-214, 2007), 각각의 LC-MS/MS 런은 SEQUEST (Yates et al., Anal Chem 67: 1426-1436, 1995) 프로그램을 이용하여 검색되었다. 펩타이드 스펙트럼 매치 (Peptide spectral matches, "PSMs")는 가능한 경우 효소의 특이성을 고려하여 (키모트립신/트립신), 선형 판별 분석 (linear discriminant analysis)을 이용하여 ≤2%의 최종 FDR로 필터링되었다 (Huttlin et al., Cell 143: 1174-1189, 2010). 이 방법을 통하여 동정된 고 신뢰도 중쇄 CDR3 펩타이드의 예는 도 10c에 나타내어진다. 개별적인 런은 결합되고, 총 2,356개의 V 영역 PSMs가 1.8%의 FDR로 확인되었다.

항체 V 영역 서열의 데이터베이스는 동형 단백질의 데이터베이스와 유사하다. 결과적으로, 단지 일부 펩타이드만 단백질을 확실하게 동정하는데 일반적으로 이용되는 LC-MS/MS에 의한 샷건 시퀀싱(shotgun sequencing)을 이용하는 전통적인 접근법은 폴리클로날 항체 혼합물에서 항체 V 영역 서열을 동정하기에 불충분하다. 또한, 항체 V 영역 서열은 하나의 아미노산만큼 작게 달라질 수 있으므로, 높은 질량 정확성은 PSMs에서 추가적인 신뢰성을 제공한다. PMS 리던던시(redundancy) 및 데이터세트에 걸쳐 커버리지를 처리하기 위하여, SEQUEST에 의해 결정된 ≥-5이고, ≤5ppm인 질량 오차(mass error)를 갖는 각각의 V 영역 PSM는 전체 V 영역 데이터베이스에 다시 맵핑되었다 (도 10d). 재맵핑 후에, 펩타이드의 총 수, 펩타이드의 특유한 수, 스펙트럼 점유율 (서열에 맵핑된 총 펩타이드 / 총 V 영역 PSMs), 총 V 영역 서열 커버리지, 및 CDR3 커버리지가 각각의 V 영역 서열에 대하여 결정되었다. 폴리클로날 혼합물로부터 강화될 것 같은 높은 신뢰도를 갖는 V 영역 서열을 동정하기 위하여, 경험적으로 엄격한 기준이 단백질군 분석에 적용되었으며, 이는 하기를 포함한다: a) 전체적인 높은 커버리지 (≥65%), b) V 영역 서열의 높은 정도의 상동성에 기인한 적어도 12개의 특유한 펩타이드, 및 c) 높은 과가변 영역 커버리지, 특히, ≥95% CDR3 커버리지. V 영역 서열이 하나의 프로테아제 단독을 이용하여 동정될 수 있기는 하나, 폴리클로날 혼합물의 예측불가능한 복잡성과 함께, V 영역 서열의 높은 정도의 가변성 때문에, V 영역 커버리지를 증가시키기 위하여 다중 프로테아제를 이용하는 것이 유리함이 확인되었다. 예를 들어, 도 10e에 나타내어진 바와 같이, 상이한 프로테아제로부터의 다수의 중첩된 펩타이드 단편이 중쇄 및 경쇄 서열 모두의 전체 CDR3를 동정하는데 기여하였다. 동일한 V 영역 서열에 맵핑되는 다중 프로테아제로부터 다수의 런에 걸쳐 특유한 PSMs를 동정하는 것은 전체 V 영역 서열에 걸쳐 스펙트럼 계수 및 커버지리를 증가시키고, 특이적인 V 영역 서열이 폴리클로날 혼합물 내에 존재하는 더 높은 신뢰성을 제공하며, NGS 서열 품질에 있어 신뢰성을 증가시켰다 (Kircher et al., Bioessays 32: 524-536, 2010). 전술한 필터링 기준을 이용함으로써, 높은 신뢰도의 총 10개의 γ 및 8개의 κ 사슬 서열이 pH 1.8 용리 분획으로부터 동정되었다 (표 13).

친화성 정제된 혈청 내에 있는 높은 신뢰도 V 영역 서열의 존재에 대한 증거를 제공하였음에도 불구하고, 동족의(cognate) 중쇄 및 경쇄 페어링에 대한 직접적인 정보는, 샘플 제조 중의 단백질 가수분해 및 디설파이드 결합의 환원에 기인하여 LC-MS/MS 데이터로부터 없다. 결과적으로, NGS 빈도에 의해 관찰되고, ELISA에 의해 PR A/B 펩타이드에 대한 항원 특이적 활성에 대하여 스크리닝된 가장 높은 등급의 중쇄 및 경쇄 서열에 더하여, 중쇄 및 경쇄 페어링의 모든 가능한 조합이 발현되었다 (총 80개의 항체에 대하여 8×10 매트릭스, 하나의 96-웰 플레이트 형질감염에서). 총 12개의 중쇄 및 경쇄 쌍이 항원 특이적 ELISA에 의해 양성이었다 (도 11a). 각각의 항원 특이적 ELISA-양성클론은 세포 용해물에서 내인성으로 발현된 PR A/B에 대한 특이성에 대해 웨스턴 블롯에 의해 시험되었다 (도 11b). 6개의 클론이 PR A/B에 특이적으로 결합하는 것으로 확인되었고 (도 11b); 2개의 클론이 동일한 항체 농도에서 평가된 경우, 원래 폴리클로날 혼합물과 비교하여 매우 더 강한 신호를 나타내었다. 웨스턴 블롯에 의해 양성인 항원 특이적 클론은 추가적인 분석에서 더 특성화되었다. 하나의 모노클로날 항체, 클론 F9 및 클론 C1는 웨스턴 블롯팅 및 면역조직화학 (IHC)에서 우수한 신호 및 특이성을 나타내었으며 (도 11b-c), 폴리클로날 혼합물이 실패하였던 유동 세포 계수 (FC) 및 면역형광 (IF) 분석에서 특이적으로 반응하였다 (도 11d-e). 반대로, 그들의 높은 MGS 등급에 의해 선택된 γ 및 κ 사슬은 항원 특이적 항체를 제공하지 않았다. CDR3 함유 펩타이드는 가장 높은 NGS 등급 γ 및 κ 사슬로부터 관찰되지 않았으며, 30개의 가장 높은 등급 γ 및 κ 사슬로부터의 CDR3 서열은 우리의 단백질군 접근에 의해 높은 신뢰도로 동정되지 않았다. 활성의 부재가 동족 페어링의 결여에 기인할 수 있다고 판단할 수 없으나, 이러한 사슬이 LC-MS/MS에 의해 관찰되지 않았다는 사실은 가장 높은 등급 NGS 사슬은 항원에 대하여 특이적이지 않음을 시사한다. 따라서, 이 실험에서, 항원 특이적 항체는 NGS 등급에만 의존해서는 동정될 수 없었다.

클론 다양성을 시각화하기 위하여, 계통발생 분석 (Dereeper et al., Nucleic Acids Res 36: W465-469, 2008)이 표 13에 나타내어진 높은 신뢰도 중쇄 및 경쇄 V 영역 서열에 수행되었다. 중쇄 또는 경쇄의 어느 하나에 대해 밀접하게 관련된 서열이 별개의 그룹으로 무리지워졌다. 흥미롭게도, 이 리포트에서 발견된 모든 PR A/B-특이적 모노클로날 항체는 계통발생 트리에서 함께 밀접하게 무리지워졌고, 이는 면역 중에 밀접하게 관련된 B 세포로부터의 클론 확장(clonal expansion)에 가장 많이 기인할 것 같다. 생식계열 사용도 이 관찰을 뒷받침하였다 (표 13). 유사한 관찰이, 상이한 항원에 의한 독립적인 실험에서도 이루어졌다 (Lin28A, 도 12).

이 실시예에서 기재된 실험에 이용된 방법은 하기와 같다.

동물의 면역 및 핸들링. 뉴질랜드 백색 토끼는 각각의 인간 단백질 항원으로부터 상이한 영역의 아미노산 서열로부터 유래된 키홀림펫헤모사이아닌-컨주게이트된 펩타이드의 혼합물로, 각 3주 떨어져, 4개의 분리된 용량에 의한 피내 주사로 면역되었다. 펩타이드는 Imject 말레이미드-비활성화된 KLH (Thermo-Pierce)로 컨주게이트되었다. 생쥐 면역은, 면역 경로가 복막 내이며, 2주 떨어져 주사된 것을 제외하고는 동일한 방식으로 수행되었다. 혈액은 마지막 부스트 후 3일에 빼내어졌다. 각각의 동물로부터의 전체 비장이 바람직한 폴리클로날 활성의 확인에 따라 안락사시 채취되었다.

토끼 및 생쥐 B 세포 레퍼토리의 차세대 DNA 시퀀싱. 과면역된 토끼 및 생쥐로부터의 비장 세포가 채취되었고, Qiagen's RNeasy 키트를 이용하여 제조자의 프로토콜에 따라 총 RNA 정제를 위하여 용해되었다. 제공된 프로토콜을 이용하여 게놈 DNA를 제거하기 위하여, RNA는 DNase I (Qiagen cat# 79254)으로 컬럼상에서(on-column) 처리되었다. 454 Life Sciences platform (Roche)에 의해 시퀀싱되는 이 물질로부터 중쇄 및 경쇄 앰플리콘 라이브러리를 생성하기 위하여, RT-PCR이 하기와 같이 수행되었다. cDNA는 프라이머로 올리고 dT와 함께 Thermoscript 역전사 효소 (Invitrogen cat# 12236014)를 이용하여 주형으로서 비장 세포 총 RNA로부터 생성되었다. 토끼 IgG 시퀀싱에 있어서, γ, κ1, 및 κ2 사슬의 가변 영역은 Phusion® Hot Start II High-Fidelity DNA 중합효소 (Finnzymes Oy, Finland)를 이용하여 서열특이적 454 융합 프라이머 (5' 말단의 리더(leader)에 하이브리다이징하고, 454 시퀀싱 플랫폼의 Lib-L 포맷에서의 동정 및 바코딩에 필요한 3' 말단에서의 서열을 함유함)에 의해 하기 단계로 증폭되었다: 변성화-90초 동안 98℃; [변성화-10초 동안 98℃; 어닐링-30초 동안 60℃; 확장-30초 동안 72℃]의 20 사이클. 생쥐 IgG 시퀀싱에 있어서, 중쇄 및 경쇄 앰플리콘은 2-단계 PCR 과정에 의해 생성되었다. 제1 단계에서, γ 또는 κ 사슬 가변 영역은 센스 프라이머로서 유전자군-특이적 축퇴 올리고뉴클레오타이드, 및 불변 영역의 시작에서 높게 보존된 영역(conserved region)으로 하이브리다이즈되는 안티센스 플라이머의 혼합물에 의해 증폭되었으며(토끼에 대하여 전술한 바와 같은 동일한 조건에 의해 15 사이클), 각각의 센스 및 안티센스 프라이머는 그의 5' 말단에 별개의 어댑터(adaptor) 서열을 함유하였다. 첫 번째 라운드로부터의 각각의 반응물은 상업적 키트 (Qiagen cat#28104)에 의해 컬럼 정제된 후, 제2 단계에서, 454 시퀀싱 플랫폼의 Lib-L 포맷에서의 동정 및 바코딩에 필요한 3' 말단에서의 서열을 함유하는 어댑터 서열-특이적 프라이머를 이용하여 추가적인 10 사이클 (γ 사슬) 및 8 사이클 (κ 사슬)에 의해 더 증폭되었다. 모든 종에 대하여, 각각의 동물에 대한 모든 경쇄 증폭 반응물은 모아졌다. 중쇄 및 경쇄 샘플에 있어서 과다한 프라이머는 Agencourt AMPure XP DNA 정제 시스템을 이용하여 제공된 프로토콜에 따라 제거되었다. 프라이머 제거 후의 앰플리콘 풀의 품질 및 순도는 Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies)에서 확인되었으며, DNA의 농도는 Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit (Invitrogen)를 이용하여 형광강도계에서 정확하게 정량화되었다. 454 Life Sciences로부터의 Lib-L LV, GS FLX Titanium Series 프로토콜에 따라, 에멀젼 PCR 및 비드 강화가 수행되었다. 비드 수는 Beckman Coulter Z2 Particle Counter에서 카운팅되었고, 라이브러리는 454 GS Junior (Roche)에서 시퀀싱되었다.

항원 특이적 IgG의 친화성 정제. 과면역된 토끼 (뉴질랜드 백색)의 혈청으로부터의 IgG는 단백질 A 세파로오스 비드 (GE Healthcare)를 이용하여 정제된 후, 세파로오스 비드에 공유적으로 결합된 면역원(immunogen) 펩타이드를 갖는 컬럼에서 15분 동안 회전하면서 배양되었다. 중력 유동에 의해, 비결합된 분획은 빼내어 졌고, 비특이적 IgG를 제거하기 위하여 컬럼은 1x 인산염 완충 식염수(PBS)로 광범위하게 세척되었다. 항원 특이적 폴리클로날 IgG 풀은 pH 3.5, 이어서 pH 2.7 및 마지막으로 pH 1.8에서 0.1M 글리신/HCl 버퍼에 의해 순차적으로 용리되었다. 각각의 용리액은 1M Tris 버퍼 (pH 8.5)로 즉시 중화되었다. 과면역된 생쥐의 혈청으로부터의 총 IgG는 단백질-G 마그네틱 비드 (Millipore, cat# LSKMAGG10)를 이용하여 정제된 후, 마그네틱 비드 (Pierce, cat#88817) 상에 고정된 면역원 펩타이드에 의해 4℃에서 하룻밤동안 회전하면서 배양되었다. 마그네틱 튜브 랙 (Invitrogen, cat# 12321D)을 이용하여, 비드는 PBS에 의해 광범위하게 세척된 후, 컬럼에 결합된 항체는 토끼 IgG 정제에 대하여 서술된 바와 같은 점진적으로 산성인 pH에 의해 순착적으로 용리되었다.

친화성-정제된 항체의 프로테아제 소화. 폴리클로날 항체는 20mM HEPES pH 8에서 8 M 요소에서 변성된 후, 55℃ 10 mM DTT에서 환원되었다. 환원된 폴리클로날은 실온 (RT)으로 냉각되고, 1시간 동안 20 mM 아이오도아세트아미드의 존재 하에 알킬화가 수행되었다. 키모트립신, 엘라스타아제, 및 트립신 소화가, 1:50의 효소 대 기질의 비(enzyme to substrate ratio)로 37℃에서 하룻밤동안 20 mM HEPES pH 8.0 중의 2 M 요소의 존재 하에 수행되었다. 펩신 소화는 1:50의 효소 대 기질의 비로 하룻밤동안 실온에서 3 M 아세트산의 존재 하에 수행되었다. 소화된 펩타이드가 이전에 공개된 바와 같이 STAGE-TIPS에 의해 탈염되고 (Rappsilber et al., Anal Chem 75: 663-670, 2003), LC-MS/MS에 의해 분석되었다.

질량 분석. LC-MS/MS가 LTQ Orbitrap Velos (Thermo-Fisher) 질량 분석계를 이용하여 수행되었다. 샘플은 인라인 플로우 스플리터를 구비한 Agilent 1100 시리즈 바이너리 펌프를 이용하여 Magic C18aQ 수지 (5 ㎛, 200Å)로 패킹된 손으로 부어진 용융 실리카 모세관 컬럼 (125 ㎛ 내부 직경 X 20 cm)에 Famos 오토 샘플러 (LC Packings)를 이용하여 7분 동안 탑재되었다. 크로마토그래피는 45분 동안 5-30% 용매 B의 400 nl/min의 이원 경사를 이용하여 전개되었다 (용매 A, 0.25% 포름산 (FA); 용매 B, 0.1% FA, 97% 아세토니트릴). 20개의 MS/MS 스펙트럼이 10⁶의 자동 이득 제어 (automatic gain control, "AGC") 타겟을 갖는 Orbitrap (300-1, 6×10⁴의 resolution setting에서 500 m/z)에서 선행 마스터 스펙트럼(preceding master spectrum)으로부터 데이터-의존적 방식으로 획득되었다. 전하 상태 스크리닝이 단일 전하 종을 거부하기 위하여 이용되었고, 500 계수의 문턱값이 MS/MS 스펙트럼을 유발하는데 필요하였다. 가능한 경우, LTQ 및 Orbitrap이 동시 처리 모드로 작동되었다.

데이터베이스 검색 및 데이터 처리. MS/MS 스펙트럼은 21,932개의 전장 감마 및 22,431개의 전장 카파 V 영역 서열, 및 6,358개의 효모 단백질 (S. cerevisiae, NCBI) 및 몇몇 인간 케라틴, 트립신 및 키모트립신을 포함하는 42개의 통상적인 오염물에 연쇄된(concatenated) 감마 및 카파 불변 영역 서열으로 구성된 맞춤 하이브리드 데이터베이스에 대하여 SEQUEST 알고리즘 (version 28 rev 12) (Yates et al., Anal Chem 67: 1426-1436, 1995)을 이용하여 검색되었다. V 영역 서열이 높게 관련되기 때문에, 효모 프로테옴은 더욱 다양한 서열을 레퍼런스 데이터베이스에 인공적으로 부여하였고 (Beausoleil et al., Nat Biotechnol 24: 1285-1292, 2006), 필터링된 데이터는 효모로부터 동정된 펩타이드를 포함하지 않아야 하므로 최종 데이터세트의 필터링 후에 다른 신뢰도 근원을 제공하였다. 검색 파라미터는 키모트립신 및 트립신에 대한 부분적 특이성 및 엘라스타아제 및 펩신에 대한 비특이성, ±50의 질량 내성, 시스테인에서 57.0214의 정적 변형, 및 메티오닌에서 15.9949의 동적 변형을 포함하였다. 데이터세트에서 오류발견률은 타겟/유인 접근법을 이용하여 산정되었다 (Elias et al., Nat Methods 4: 207-214, 2007). 데이터세트는 선형 판별 분석을 이용하여 ≤2%의 FDR로 필터링되었다 (Huttlin et al., Cell 143: 1174-1189, 2010). Orbitrap의 질량 정확도가 50 ppm을 많이 초과하였으나, 더 넓은 전구체 이온 내성(precursor ion tolerance)으로 검색되는 경우, 정확한 펩타이드 동정은 작은 전구체 질량 오차 (± 1 ppm)를 야기한 반면, 부정확한 펩타이드 동정은 전체 50 ppm 창에 걸쳐 분포된다. 결과적으로, 엄격한 전구체 질량 필터가 데이터세트로부터 많은 부정확한 PSMs을 선택적으로 제거한다.

포획 후 분석(Post acquisition analysis)이 문서에 기재된 바와 같이 수행되었다. 요약하면, V 영역 서열로부터 유래된 통과한 펩타이드를 NGS Ig 데이터베이스에 대하여 재맵핑하였다. 키모트립신 및 트립신 소화로부터 발생된 펩타이드에 대하여, 매치는 예측된 절단 (트립신에 대하여 KR, 키모트립신에 대하여 YWFLMA)으로부터 발생되는 것에 제한된다. CDR 커버리지는 Kabat (Wu et al., J Exp Med 132: 211-250, 1970)에 의해 정의된 규칙을 이용하여 CDRs를 동정함으로써 결정되었다. 모든 경우, 커버리지는 성숙 V 영역 서열에서 아미노산의 수에 의해 나뉘어진, 높은 신뢰도 펩타이드로부터 동정된 아미노산의 총 수로 정의된다.

동정된 면역글로불린 사슬의 클로닝, 발현 및 특성화. 친화성-정제된 폴리클로날 IgG 풀의 질량 분석을 통하여 동정된 γ 및 κ 사슬은 하기와 같이 클로닝 및 발현되었다. 각각의 동정된 사슬에 있어서, FWR1으로부터 FWR4까지 전체 가변 도메인을 코딩하는 핵산 서열이 합성되었다 (Integrated DNA Technologies, Coralville Iowa). 오버랩 PCR을 이용하여, 각각의 중쇄-경쇄 복합 순열(combination permutation)이, 단일 오픈 리딩 프레임(single open reading frame)으로부터 2개의 폴리펩타이드를 생성하기 위하여 리보좀 스킵 메커니즘(ribosomal skip mechanism)을 이용하는 바이러스 2A 서열에 의해 발현되었다 (Doronina et al., Mol 세포 Biol 28: 4227-4239, 2008, Donnelly et al., J Gen Virol 82: 1027-1041, 2001). 5'으로부터 3'까지의 순서로, 경쇄 가변 및 불변 영역, Thosea asigna 바이러스로부터의 2A 펩타이드 서열, 및 중쇄 가변 도메인의 단일 오픈 리딩 프레임 카세트가 인프레임(in-frame) 토끼 γ 사슬 리더 서열 및 토끼 κ 사슬 불변 영역, 5' 및 3' 클로닝 부위를 각각 함유하는 CMV-프로모터에 의한 포유동물 발현 플라스미드로 클로닝되었다. HEK293는 폴리에틸렌이민을 이용하여 이런식으로 어셈블링된 각각의 경쇄-중쇄 조합을 코딩하는 플라스미드 프렙(plasmid preps)에 의해 형질감염되었다 (Boussif et al., Proc Natl Acad Sci USA 92: 7297-7301, 1995). 상청액은, 코팅 항원으로서 면역원 펩타이드를 이용하는 ELISA에 의해 항원 특이적 항체의 분비에 대하여 형질감염 2 내지 5일 후에 스크리닝되었고, 반응성을 나타내었던 경쇄-중쇄 순열은 더 특성화되었다. 생쥐 항체 발현에 있어서, 불변 영역은 생쥐 IgG2a의 것이다.

ELISA, 웨스턴 블롯팅, 유동 세포 계수, 면역형광 및 면역조직화학에 의한 폴리클로날 및 모노클로날 항체의 특성화. ELISA, 웨스턴 블롯팅, 유동 세포 계수, 면역형광 및 면역조직화학의 상세한 프로토콜은 Cell Signaling Technology Inc.의 웹사이트에서 온라인으로 확인될 수 있다. Costar cat#3369 공인된 고 결합 폴리스티렌 96-웰 플레이트가 ELISA에 이용되었다. 각각의 타겟에 대하여 ELISA 분석에 이용된 항원은 면역에 이용된 펩타이드와 동일하였다. 프로게스테론 수용체 항체에 대하여, 웨스턴 블롯팅은 T47D (PR+), MDA-MB-231 세포 (PR-) 및 HT-1080 (PR-) 세포 용해물에서 수행되었고, 유동 세포 계수는 T47D (PR+) 및 MDA-MB-231 세포 (PR-)에서 수행되었으며, 공초점 면역형광 분석은 MDA-MB-231 세포 (PR-)와 비교하여 MCF-7 세포 (PR+)에서 수행되었고, 면역조직화학 분석은 MDA-MB-231 세포 (PR-)와 비교하여, 파라핀 삽입된 인간 원발성 유방 암종 섹션, T47D 및 파라핀 삽입된 MCF-7 세포 (PR+)에서 수행되었다. 포스포-p44/42 MAPK 생쥐 항체에 대하여, 웨스턴 블롯팅은 U1026 (Cell Signaling Technology, Inc. cat# 9903) 또는 12-O-테트라데카노일포르볼-13-아세테이트 (TPA) (Cell Signaling Technology, Inc. cat# 4174)의 어느 하나로 처리된 Jurkat 세포로부터의 용해물에서 수행되었다. Lin28A 항체에 대하여, 웨스턴 블롯팅은 NCCIT, NTERTA, MES 및 IGROV1 세포주로부터의 총 용해물에서 수행되었고, 공초점 면역형광 및 유동 세포 계수 분석은 NTERA (Lin28A+) 및 HeLa (Lin28A-) 세포에서 수행되었다. 포스포-Met (pMet) 항체에 대하여, 비처리된 (pMet+) 또는 SU11274 Met 키나제 억제제로 처리된 MKN45 세포로부터의 용해물이 이용되었다. Sox1 항체에 대하여, 생쥐 뇌 추출물 (Sox1+) 및 NIH-3T3 (Sox1-) 세포로부터의 용해물이 이용되었다.

실시예 8

이 실시예에서, B형 간염 바이러스 소 표면 항원 (HBsAg)에 특이적인 인간 모노클로날 항체가 본 명세서에 개시된 방법에 따라 생성되었다. 이를 위하여, 유전 물질 데이터베이스를 생성하기 위해 하기 프로토콜에 따랐다. 폴리클로날 항체는 후술하는 바와 같이 정제되었고, 생쥐 및 토끼에 대하여 전술한 바와 같이 질량 분석에 따라 분석되었다.

Ⅰ. 핵산 서열의 생성.

항원 특이적, 기억 및 총 B-세포 분리 및 RNA 정제

말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)가 Ficoll 경사를 이용하여 헤파린 진공 튜브에서 수집된 새로운 전체 인간 혈액으로부터 분리되었다. 하부에 20ml의 Histopaque 1077 (Sigma Aldrich cat#10771)를 함유하는 Greiner Leucocep 50ml 원뿔형 튜브 (Sigma Aldrich cat# Z642843)에, 25ml 이하의 혈액을 상부에 적용한 후, 튜브를 실온에서 1500xg로 20분 동안 원심분리하였다. 백혈구 (버피 코트)는 멸균 피펫을 이용하여 수집되었고, 50ml의 RPMI에서 세포를 재현탁시킴으로써 2번 RPMI 매질에서 세척된 후, 4℃에서 10분 동안 300xg로 원심분리되었다. 세척 후에, PBMC는 소태아 혈청 중 20% DMSO에서 저온보존되거나, 또는 B-세포 분리를 위하여 즉시 처리되었다.

B-세포 분리에 있어서, 음성 선택 방법이 Invitrogen's Dynabeads Untouched B-cell 분리 키트 (Invitrogen cat#113-51D)를 이용하여 제조자의 프로토콜에 따라 PMBC로부터 모든 비-B 세포를 제거하기 위하여 이용되었다. 얻어진 비표지된 B-세포 집단은 항원 특이적 또는 기억 B-세포를 분리하기 위하여 더 처리되었다.

항원 특이적 B-세포 분리에 있어서, 총 비표지된 B-세포는 20분 동안 실온에서 회전기 상에서 스트렙타비딘 마그네틱 비드 (Pierce-Thermo Scientific cat#88816)에 고정된 비오틴화 항원으로 배양되었다. 임의의 항원 결합 B-세포를 함유하는 비드는 1xPBS로 2회 세척되었다. 이어서, 세척된 비드는 RNA 분리를 위하여 Qiagen's RNeasy 키트 RLT 용해 버퍼 (1% β-메르캅토에탄올이 보충됨)에 재현탁되었다.

기억 B-세포 분리에 있어서, CD27⁺ 및 표면 IgG⁺ 세포는 CD27⁺ 및 표면 IgG⁺ 세포 분리용 Miltenyi's MACS 키트 (Miltenyi Biotec (Auburn, CA) cat#130-051-601 and 130-047-501)를 이용하여 총 비표지된 B-세포로부터 분리되었다. CD27⁺ 및 sIgG⁺ B-세포를 동시에 분리하기 위하여, 두 세포 표면 표지에 마그네틱 비드-컨주게이트된 항체를 배양 단계 중에 동시에 첨가하였다. 정제 시에, 기억 B-세포는 10분 동안 300xg에서 회전하여 가라앉은 후, RNA 분리를 위하여 전술한 바와 같이 RNA를 위한 RLT 버퍼에서 용해되었다.

RNA는 Qiagen's RNeasy 키트 (Qiagen cat# 74104)를 이용하여 제조자의 프로토콜에 따라 선택된 세포로부터 정제되었다. 컬럼에서 DNase I 소화 단계를 포함시킴으로써 오염된 게놈을 제거하기 위하여 DNase I-처리가 수행되었다. RW1 버퍼 세척 후에, RDD 버퍼에서 희석된 DNase I (Qiagen cat# 79254)이 RNA 정제 컬럼에 적용되어 실온에서 20분 동안 배양되었다. 이어서, 컬럼은 RW1 버퍼로 1회 세척한 후, RPE 버퍼로 2회 세척하였으며, RNA는 30㎕ 또는 50㎕ 물로 용리되었다. RNA의 농도는 파장 450nm에서 Nanodrop 분광광도계 (Thermo Scientific)에서 측정된 흡수도에 의해 결정되었다.

cDNA 합성 및 PCR에 의한 앰플리콘의 생성

기억 또는 항원 특이적 B-세포로부터 분리된 RNA는 먼저 하기와 같이 Invitrogen's Thermoscript 역전사 효소 (Invitrogen cat#12236-022)를 이용하여 역전사되었다:

DNase treated RNA: 5 uL

올리고 dT 프라이머(50uM): 1 uL

dNTP's (10mM): 2 uL

dI H2O: 4 uL

5분 동안 65℃에서 배양하고, 2분 동안 얼음에 둔 후, 하기를 첨가하였다:

5X cDNA 버퍼: 4 uL

0.1mM DTT: 1 uL

RNAse OUT: 1 uL

dI H2O: 1 uL

ThermoScript: 1 uL

혼합물은 1시간 동안 50℃에서 배양된 후, 5분 동안 85℃에서 가열-비활성화되었다. 마지막으로, 상보적 RNA 가닥은, 1㎕의 RNase H (Invitrogen cat#18021-071)를 첨가하고, 20분 동안 37℃에서 배양함으로써 cDNA로부터 제거되었다.

시퀀싱을 위한 중쇄, 카파 및 람다 사슬 가변 영역의 앰플리콘은 하기와 같이 PCR에 의해 생성되었다. 중쇄의 증폭에 있어서, B-세포의 풀에서의 V_H 유전자 전사 빈도(transcript frequency)의 자연적 분포를 보존하기 위하여, 4개의 독립적인 반응물 (각각의 것은 V_H1 및 7; V_H2, 5 및 6; V_H3; 및 V_H4의 유전자군에 특이적임)이 하기 열거된 프라이머를 이용하여 각각의 cDNA 샘플에 대하여 시행되었다. 카파 및 람다 사슬 증폭에 있어서, 각각의 사슬에 대한 단일 반응물이 각각의 cDNA 샘플에 대하여 시행되었다. 각각의 반응에서, 포워드 프라이머의 등몰 (equimolar) 혼합물이 하기 표시된 것과 같은 동일한 농도의 리버스 프라이머(들)과 함께 이용되었다. 증폭은 Lib-L 플랫폼에 의해 454 시퀀싱 (Roche)에 양립할 수 있는 융합 프라이머에 의해 수행되었다. 리버스 프라이머는 각각의 사슬의 불변 영역의 5' 말단에 하이브리다이즈되도록 설계된다. 이 프라이머는 Lib-L 프라이머 B 및 MID 서열을 함유하므로, 시퀀싱 판독은 각각의 불변 영역(리버스 센스에서)의 5' 극말단으로부터 가변 영역의 3' 말단으로 시작된다. 중쇄 및 카파 사슬에 있어서, 단일 리버스 프라이머가 각 MID에 이용된 반면, 람다 사슬에 있어서, 2개의 별개의 리버스 프라이머가 각 MID에 대하여 요구되었다.

중쇄 융합 프라이머:

리버스

포워드

VH1/7

VH2/5/6

VH3

VH4

카파 사슬 융합 프라이머

리버스

포워드

람다 Chain 융합 프라이머

리버스

포워드

PCR 증폭은 Finnzyme's Phusion Hot Start II 중합효소 (Thermo Scientific cat# F-540S)를 이용하여 이루어졌으며, 여기에서 반응 혼합물 및 조건은 하기와 같이 설정되었다:

반응 혼합물:

cDNA: 2.5 uL

5X 버퍼 GC: 5 uL

10 mM dNTP mix: 0.25 uL

Phusion HotStart II: 0.25 uL

프라이머 (포워드+리버스) 30 uM: 0.25 uL

물: 16.75 uL

PCR 프로그램:

단계 1 98℃-2 분

단계 2 98℃-10 초

단계 3 60℃-30 초

단계 4 7℃-30 초

단계 5 단계 2에서 4까지를 반복

단계 6 72℃-2 분

단계 7 유지

각각의 사슬에 있어서 항원 특이적 B-세포로부터 충분한 증폭을 위하여 추가 5 사이클이 필요하므로, 기억 B-세포로부터 또는 항원 특이적 B-세포로부터 cDNA 주형을 증폭시킬 때, 중쇄 증폭에 있어서, 25 또는 30 사이클 (단계 5가 24 또는 29회 반복됨), 및 카파 및 람다 사슬에 있어서, 20 또는 30 사이클이 각각 시행되었다. 임의의 시약에서 오염된 주형으로부터 임의의 허위 증폭이 없음을 확실하게 하기 위하여, 중복 반응이 각각의 혼합물에 대하여 설정되었으며 (중쇄에 대하여 4개의 개별적인 반응, 및 각각의 경쇄에 대하여 1개의 반응), 여기에서, cDNA 주형은 물로 치환되었다. 주형이 없는 이 음성 대조군 반응물은 샘플 함유 주형과 동시에 시행되었다. PCR 프로그램 완료 시에, 3㎕의 각각의 반응물 (음성 대조군 포함)이, 주형이 반응물에 첨가되었으나, cDNA가 없는 경우, 앰플리콘 (중쇄에 대하여 대략적으로 540bp, 카파 사슬에 대하여 대략적으로 485bp 및 람다 사슬에 대하여 대략적으로 510bp)의 존재에 대하여, 1.5% TAE 아가로스 겔에서 전기영동에 의해 분석되었다.

454 시퀀싱을 위한 앰플리콘 정제, 분석, 정량화, 및 제조

PCR 샘플에서 과다한 프라이머 및/또는 프라이머 다이머를 제거하기 위하여, Agentcourt Ampure 마그네틱 비드 (Beckman Coulter cat#A63881)를 이용하여 제조자의 프로토콜에 따라 앰플리콘이 정제되었다. 중쇄에 있어서, 모든 4개의 반응물 (VH1/7, VH2/5/6, VH3, VH4)이 합병되어 하나의 샘플로서 정제되었으므로, 총 3개의 앰플리콘 샘플 (중쇄, 카파 및 람다 사슬)이 각각의 cDNA 증폭을 위하여 정제되었다. Ampure 정제를 위한 프로토콜은, 정제가 96-웰 플레이트 포맷에서 대신에 1.5ml 튜브에 적합한 유전자 마그네틱 랙을 이용하여 단일 1.5ml 마이크로튜브에서 이루어진 점에서 변형되었다. 모든 부피 및 다른 과정은 프로토콜에 서술된 바와 같다. Ampure 정제 후에 용리된 앰플리콘은 이어서 고선택성 DNA 칩 (Agilent Technologies cat# 5067-4626)을 이용하여 Agilent 2100 Bioanalyzer에서, 제조자의 프로토콜에 따름으로써, 순도 및 임의의 오염 DNA 종의 부재에 대하여 분석되었다.

앰플리콘의 순도가 확인되면, DNA의 농도는 제조자의 프로토콜에 기재된 바와 같이, Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit (Invitrogen cat#P7589)를 이용하여 형광강도계에서 정량화되었다. 키트에 제공된 람다 DNA는 표준 곡선이 100ng/well로부터 1.56ng/well까지 생성되는 농도 표준으로서 이용되었다. TE 버퍼에서 100배 희석된 각각의 앰플리콘의 형광은 2회 측정되었으며, DNA의 농도는 표준 곡선의 선형 부분에 따라 결정되었다. 모든 형광 측정은 흑색 96-웰 플레이트에서 이루어졌다. 형광 값이 표준 곡선의 선형 범위를 벗어나는 경우, 선형 범위 내에 속하는 형광 값을 얻기 위하여 샘플은 더 큰 또는 더 작은 희석액에 의해 재측정되었다. 각각의 사슬 형태의 염기쌍의 대략적인 크기 (중쇄-540bp, 카파-485bp 및 람다-510bp)를 이용하여, 하기 식이 농도를 결정하기 위하여 이용되었다.

각 앰플리콘의 농도 (분자/㎕) =

[샘플 농도 (ng/㎕)*6.022×10²³]/[656.6×10⁹*앰플리콘 길이 (bp)]

각각의 앰플리콘은 1 × 10⁷ 분자/㎕로 정상화된 후(normalized), 중쇄: 카파 사슬: 람다 사슬의 부피비 3:3:1에서 혼합되고, 보텍스되고(vortexed), 최종적으로 1:10으로 희석되어, 1×10⁶ 분자/㎕에서 혼합물의 최종 농도를 얻었다.

에멀젼 PCR 증폭, 비드 강화(enrichment), 비드 카운팅 및 시퀀싱

에멀젼 PCR은 하기 변형과 함께 454 발간된 프로토콜: "emPCR Amplification Method Manual - Lib-L" (Edition: May 2010 (Rev. April 2011, 전체적으로 본 명세서에 참조로 포함됨)에 따라 수행되었다.

Section 3.1.3 Step 2)

시약 부피(㎕)

분자생물학 등급의 물 458

첨가제 515

증폭 혼합물(Amp Mix) 270

증폭 프라이머(Amp Primer) 32

효소 혼합물(Enzyme Mix) 70

PPiase 2

합계 1347

시퀀싱 비드가 강화되면, "emPCR Amplification Method Manual - Lib-L" 의 단계 3.7로부터, 비드가 하기 세팅을 갖는 Beckman Coulter's Z2 Particle Counter에서 카운팅되었다:

Aperture: <100 ㎛>

Aperture Kd: <60.04>

Set Upper cutoff: <30.00 ㎛>

Set Lower cutoff: <10.00 ㎛>

Count Mode: <between>

Metered Volume: <0.5 ml>

Resolution: <256>

비드 농도는 하기와 같이 계산되었다:

비드의 농도 = [입자 카운터로부터 읽은 평균(Avg. reading from particle counter) * 4] 비드/㎕

에멀젼 PCR로부터 강화된 비드는 전체적으로 본 명세서에 참조로 포함되는 454 시퀀싱 프로토콜: "Sequencing Method Manual-GS Junior Titanium Series" - May 2010 (Rev. June 2010)에 따라 454 Sequencer (Roche)에서 시퀀싱되었다.

Ⅱ. 펩타이드 단편의 생성:

인간 공여자 혈장으로부터의 항원 특이적 IgG의 정제

공여자 혈장 분리 및 특이적 항원에 대한 반응성에 대한 스크리닝

인간 지원자로부터 전혈은 헤라핀 튜브에 IRB 가이드라인에 따라 수집되었다. PBMC의 ficoll-경사 분리 중에 (전술한 바와 같이), 혈장 샘플은 동시에 수집되었고, -80℃에서 저장되었다. 다양한 항원에 대한 혈장 IgG의 반응성이 ELISA에 의해 시험되었다. 요약하면, 하이 바인딩 96-웰 플레이트 (Costar cat#)는 2시간 동안 37℃에서, 또는 하룻밤동안 4℃에서, 카보네이트 버퍼에 용해된 2㎍/ml에서 항원 100㎕/well 코팅되었다. 플레이트는 PBS-Tween (0.1%)로 3회 헹궈진 후, 1시간 동안 37℃에서 PBS-Tween 중의 5% 탈지분유의 300㎕/well로 차단되었다. 혈장 샘플은 5% 밀크 PBS-Tween에서 1/100, 1/500 및 1/1000 및 1/2000로 희석되었고, 100㎕의 각각의 희석액이 96-웰 플레이트의 차단된 웰에 2세트로(in duplicates) 첨가되었으며, 37℃에서 2시간 동안 배양되었다. 플레이트는 1xPBS-Tween로 3회 세척되고, PBS-Tween에서 1/4000로 희석된 호스래디쉬 퍼옥시다제-컨주게이트된 안티-인간 IgG 항체 (Southern Biotech 2040-05)가 각각의 웰에 첨가되었고(100㎕), 1시간 동안 37℃에서 배양되었다. 플레이트는 PBS-Tween로 6회 세척되었고, 50㎕ TMB 기질 용액 (BioFX cat#TMBW-1000-01)의 첨가에 의해 현상된 후, 50㎕의 정지액 (BioFX cat# STPR1000-01)이 첨가되었다. 신호는 450nm의 광학 밀도에서 측정되었다. 혈장이 1/500 또는 더 높은 희석액에서 중요한 신호를 나타내었던 공여자는 NG-XMT 과정에 의한 스크리닝을 위하여 선택되었다.

B형 간염 바이러스 소 표면 항원 (HBsAg) adw 서브타입은 Prospec (Rehovot, Israel, cat# HBS-872)로부터 구입하였다.

총 혈장 IgG로부터의 항원 특이적 IgG의 정제

단백질 G 정제

1. Protein G Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare cat#17-0618-05)의 비드 슬러리 (2.5ml bead bed volume) 5ml가 중력 흐름(gravity flow) 컬럼에 적용되고, 1xPBS로 2회 세척되었다.

2. 1xPBS로 15ml까지 희석된 인간 혈장 5ml를 비드를 갖는 컬럼에 적용하고, 컬럼을 4℃에서 하룻밤동안, 또는 2시간 동안 실온에서 회전기에서 배양하였다.

3. 컬럼을 20ml의 1xPBS로 4회 세척하였다.

4. IgG는 pH2.7 0.1M 글리신/HCl 버퍼 20ml로 용리되고, 중화를 위하여 1M Tris pH8.5 1.2ml를 함유하는 튜브에 수집되었다.

5. 10ml의 1xPBS (pH7.4)를 용리액을 중화하기 위하여 첨가하여, 고농도의 IgG에 기인한 침전을 최소화하였다.

6. 정제된 IgG는 10kDa 컷오프 투석 카세트(cut-off dialysis cassette) (Pierce cat#66456)에서 4리터의 1xPBS에 대하여 2회 투석되었다.

7. IgG 농도는 Nanodrop 분광광도계 (Thermo Scientific)에서 280 nm에서의 흡수도를 측정함으로써 결정되었다.

친화성 정제

1. HBsAg는 제조자의 프로토콜에 따라 비오틴 (Pierce Cat #20217)에 컨주게이트되었다. 컨주게이트된 항원은 1xPBS에서 광범위하게 투석되었다.

2. 2mg의 비오틴-컨주게이트된 항원은 5ml의 마그네틱　스트렙타비딘 비드 (Thermo Scientific cat#8816)에 의해 회전기에서, 4℃에서 하룻밤동안, 또는 실온에서 2시간 동안 배양되었다. 비드는 1xPBS로 2회 세척된 후, 9개의 튜브로 나뉘어졌다.　

3. 비드에 대한 항원의 고정의 효율성은 HBsAg Elisa에 의해 평가되었고, 80%보다 높은 결합을 일관되게 나타내었다.

4. 고정화된 항원을 함유하는 각각의 튜브에, 단일 공여자로부터의 1mg의 단백질　G-정제된 IgG가 첨가되었고, 비드는 보텍싱에 의하여 완전히 재현탁되었고, 15분 동안 실온에서 회전하면서 배양되었다.

5. 튜브는 마그네틱 랙에 놓아졌고, 상청액은 제거되었으며, 비드는 1ml 1xPBS로 5회 세척되었다.

6. 마지막 세척 단계 후에, pH 1.8에서 0.9ml의 0.1M 글리신-HCl 버퍼가 하나의 튜브에 적용되고, 보텍싱되며, 5분 동안 실온에서 배양되었다. 5분 후에, 첫 번째 튜브는 마그네틱 랙에 놓여진 후, 튜브 내의 산성 버퍼가 제거되고 제2 튜브에 놓여졌다. 이 과정은 모든 9개의 튜브가 산성 버퍼로 배양될 때까지 반복되었다. 용리된 IgG는 마지막으로 중화를 위하여 0.14ml의 1M Tris　pH8.5를 함유하는 튜브에 수집되었다.

7. 각각의 튜브가 용리를 겪은 후, 1mg의 단백질 G-정제된 IgG가 비드에 첨가되는 단계로부터 정제가 다시 시작되기 전에, 비드는 1xPBS로 2회 세척되었다. 이 과정은 MS 분석 전에 프로테아제 처리를 위하여 충분한 물질을 생성하기 위하여 다수회 반복되었다.

Ⅲ. 질량 분석

질량 분석은 전술한 바와 같이 수행하였다. 요약하면, 프로테아제 (예를 들어, 트립신) 및/또는 화학적 단백질 절단 시약 (예를 들어, 브롬화시안)에 의한 소화 후에, 질량 분석이 펩타이드에서 수행되었다. B형 간염 바이러스 소 표면 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 코딩하는 유전자 서열을 동정하기 위하여, 얻어진 MS2 스펙트럼은 유전 물질 데이터베이스의 정보로부터 유래된 이론적 MS2 스펙트럼에 대하여 서로 연관되었다.

Ⅳ. 모노클로날 항체의 발현 및 동정

24개의 별개의 중쇄 (감마 사슬) 가변 영역 클론, 20개의 별개의 카파 사슬 가변 영역 클론 및 10개의 별개의 람다 사슬 가변 영역 클론은 결합 포맷(combinatorial format)으로 발현되었고, 항원 특이적 결합 활성에 대하여 스크리닝되었다 (표 14-15 참조, 여기에서, 감마 사슬 클론은 제일 왼쪽 수직 열에 표시되며, 경쇄 클론은 상부 수평 행에 표시된다). 각각의 감마 사슬은 모든 경쇄 (카파 및 람다) 사슬과 페어링되어, 표준 96-웰 조직 배양 플레이트에서 HEK293E 세포의 일시적 형질감염에 의해 항체를 발현하였다.

각각의 웰에서 형질감염된 세포로부터 분리된 항체는 효소 결합 면역 흡착법 (enzyme-linked immunosorbant assay, "ELISA")에 의해 정제된 재조합 B형 간염 표면 항원 (Prospec, Ness-Ziona, ISRAEL로부터 구입한 HBsAg-adw subtype)에 대한 결합에 대하여 스크리닝되었다. 하이 바인딩 96-웰 ELISA 플레이트 (Costar-3369)는 2시간 동안 37℃에서 배양됨으로써 2㎍/ml 카보네이트 버퍼에서 희석된 HBsAg 50㎕/well로 코팅되었고, 이후 1시간 동안 37℃에서 배양됨으로써 인산연 완충 식염수 (PBS) 중의 5% 분유의 300㎕/well로 차단되었다. 일시적으로 형질감염된 HEK293E 세포로부터의 상청액은 0.05% Tween 20 (PBS-T)에 의해 PBS 중의 5% 밀크에서 5배 희석된 후, 50㎕의 희석된 상청액이 HBsAg-코팅된 ELISA 플레이트의 각각의 웰에 가해졌다. 비특이적 결합을 평가하기 위하여, 동일한 상청액이 PBS 중의 5% 밀크로만 코팅된 플레이트에 가해졌다. 상청액 첨가 후에, ELISA 플레이트는 2시간 동안 37℃에서 배양된 후, 250㎕/well의 PBS-T로 3회 세척되었다. 항체 결합을 검출하기 위하여, PBS-T에서 4000배 희석된 50㎕/well의 호스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP)-컨주게이트된 항-인간 IgG (Southern Biotech)가 각각의 웰에 첨가되었고, 1시간 동안 37℃에서 배양되었다. 플레이트는 전술한 바와 같이 6회 세척되었고, 이후, 50㎕/well의 HRP에 대한 발색 기질인, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘이 첨가되었으며, 이는 약 10분 후에 50㎕/well로 중화되었다. 산으로 중화된 발색 기질로부터의 신호는 450nm에서의 흡수도 (광학 밀도)에 의해 측정되었다.

표 14-15는, 각각의 웰에서 밀크 단독 플레이트의 흡수도가 빼진, HBsAg 플레이트의 흡수도로부터 얻어진 값을 나타낸다. 하기 상청액 샘플은 대조군 샘플로서 이용되었다 (값은 각 경우 2개의 독립적인 웰의 평균이다): 양성= 항-HBsAg 인간 항체 중쇄 및 경쇄의 형질감염으로부터의 상청액; 음성 = PEI만으로 형질감염된 세포로부터의 상청액. 음성 대조군보다 10-20배, 20-40배 및 40배보다 큰 신호를 갖는 웰은 증가하는 회색 음영으로 표시된다. 30개의 중쇄-경쇄 순열은, 4개의 웰 중 2 이상에서 백그라운에 비해 40배보다 더 큰 강한 반응성을 나타내었으며, 26개는 백그라운드에 비해 20 내지 40배, 18개는 백그라운드에 비하여 10-20배 더 큰 반응성을 나타내었다 (18개의 하나는 표에서 *로 나타내어진 EVUGG 감마 사슬의 조합으로서 발현되었으며, AKUOL 람다 사슬은 후에 비반응성인 것으로 확인되었다). 따라서, 시험된 30개 경쇄 클론의 적어도 하나와 페어링된 경우, 시험된 24개의 별개의 가변 영역 감마 사슬 클론 중에서, 17개는 HBsAg-특이적 항체를 발현하였다.

실시예 9

이 실시예에서, 인간 대상은 대상 항원을 포함하는 백신을 투여받으며, 혈액 샘플은 백신 접종 전(week 0), 및 이후 1주 및 2주(weeks 1 and 2)에 취해진다. 후속적인 샘플은 4주 간격으로 52주(week 52)까지 취해진다. PBMC는 실시예 8에 기재된 바와 같이 분리되고, 소태아 혈청 중의 20% DMSO에서 저온보존되거나, 또는 B-세포 분리를 위하여 즉시 처리된다. 혈장 샘플은 질량 분석에 의한 이후 분석을 위하여 -80℃에서 저장된다. 각각의 샘플에 있어서, 백신 접종 후 시간 경과에 따라 항원 특이적 항체 집단을 평가하기 위하여, PBMC 및 혈장은 후술하는 바와 같이 처리된다.

Ⅰ. 핵산 서열의 생성

항원 특이적, 기억 및 총 B-세포 분리 및 RNA 정제

B-세포 분리에 있어서, 음성 선택 방법이, Invitrogen's Dynabeads Untouched B-cell Isolation kit (Invitrogen cat#113-51D)를 이용하여 제조자의 프로토콜에 따라 모든 비-B 세포를 제거하기 위하여 이용된다. 얻어진 비표지된 B-세포 집단은 항원 특이적 또는 기억 B-세포를 분리하기 위하여 더 처리된다.

항원 특이적 B-세포 분리에 있어서, 총 비표지된 B-세포는 실온에서 20분 동안 회전기에서 스트렙타비딘 마그네틱 비드 (Pierce-Thermo Scientific cat#88816) 상에 고정화된 비오틴화 항원에 의해 배양된다. 임의의 항원 결합 B-세포를 함유하는 비드는 1xPBS로 2회 세척된다. 이어서, 세척된 비드는 RNA 분리를 위하여 Qiagen's RNeasy kit RLT 용해 버퍼 (1% β-메르캅토에탄올이 보충됨)에 재현탁된다.

기억 B-세포 분리에 있어서, CD27⁺ 및 표면 IgG⁺ 세포는 CD27⁺ 및 표면 IgG⁺ 세포 분리용 Miltenyi's MACS 키트 (Miltenyi Biotec (Auburn, CA) cat#130-051-601 and 130-047-501)를 이용하여 총 비표지된 B-세포로부터 분리된다. CD27⁺ 및 sIgG⁺ B-세포를 동시에 분리하기 위하여, 마그네틱 비드-컨주게이트된 항체가 두 세포 표면 표지에 배양 단계 중에 동시에 첨가된다. 정제 시에, 기억 B-세포는 10분 동안 300xg에서 회전하여 가라앉은 후, RNA 분리를 위하여 전술한 바와 같이 RNA에 대한 RLT 버퍼에서 용해된다.

RNA는 Qiagen's RNeasy kit (Qiagen cat# 74104)를 이용하여 제조자의 프로토콜에 따라 선택된 세포로부터 정제된다. DNase I 소화 단계를 포함시킴으로써 오염 게놈을 제거하기 위하여 컬럼에서의 DNase I-처리가 수행된다. RW1 버퍼 세척 후에, RDD 버퍼에서 희석된 DNase I (Qiagen cat# 79254)는 RNA 정제 컬럼에 적용되어, 실온에서 20분 동안 배양된다. 이어서, 컬럼은 RW1 버퍼로 1번 더, 이어서, RPE 버퍼로 2번 세척되고, RNA는 30 또는 50㎕ 물로 용리된다. RNA의 농도는 파장 450nm에서 Nanodrop 분광광도계 (Thermo Scientific)에서 측정된 흡수도에 의해 결정된다.

cDNA 합성 및 PCR에 의한 앰플리콘의 생성

기억 또는 항원 특이적 B-세포로부터 분리된 RNA는 먼저 실시예 8에 기재된 바와 같이 역전사된다. 시퀀싱을 위한 중쇄, 카파 및 람다 사슬 가변 영역의 앰플리콘은 하기와 같이 PCR에 의해 생성된다. 중쇄 증폭에 있어서, 4개의 독립적인 반응물 (각각은 유전자군 V_H1 및 7; V_H2, 5 및 6; V_H3; 및 V_H4에 대하여 특이적임)은, B-세포의 풀에서 V_H 유전자 전사 빈도의 자연적 분포를 보존하기 위하여, 실시예 8에 기재된 프라이머를 이용하여 각각의 cDNA의 샘플에 대하여 시행된다. 카파 및 람다 사슬 증폭에 있어서, 각각의 사슬에 대한 단일 반응물이 각각의 cDNA 샘플에 대하여 시행된다. 각각의 반응물에 있어서, 포워드 프라이머의 등몰 혼합물이 동일한 농도의 리버스 프라이머와 함께 이용된다. 증폭은 Lib-L 플랫폼에 의해 454 Sequencing (Roche)에 양립가능한 융합 프라이머에 의해 수행된다. 리버스 프라이머는 각각의 사슬의 불변 영역의 5' 말단에 하이브리다이즈하도록 설계된다. 이 프라이머는 Lib-L 프라이머 B 및 MID 서열을 함유하여, 시퀀싱 판독은 각각의 불변 영역 (리버스 센스에서) 5' 극말단으로부터 가변 영역의 3' 말단으로 시작된다. 중쇄 및 카파 사슬에 있어서, 단일 리버스 프라이머가 각각의 MID에 대하여 이용된 반면, 람다 사슬에 있어서, 2개의 별개의 리버스 프라이머가 각각의 MID에 대하여 요구되었다.

PCR 증폭은 Finnzyme's Phusion Hot Start II 중합효소 (Thermo Scientific cat# F-540S)를 이용하여 수행되며, 여기에서 반응 혼합물 및 조건은 실시예 8에서 기재된 바와 같이 설정된다.

임의의 시약에서 오염된 주형으로부터 임의의 허위 증폭이 없음을 확실하게 하기 위하여, 중복 반응이 각각의 혼합물에 대하여 설정되며 (중쇄에 대하여 4개의 개별적인 반응, 및 각각의 경쇄에 대하여 1개의 반응), 여기에서, cDNA 주형은 물로 치환된다. 주형이 없는 이 음성 대조군 반응물은 샘플 함유 주형과 동시에 시행된다. PCR 프로그램 완료 시에, 3㎕의 각각의 반응물 (음성 대조군 포함)이, 주형이 반응물에 첨가되나, cDNA가 없는 경우, 앰플리콘 (중쇄에 대하여 대략적으로 540bp, 카파 사슬에 대하여 대략적으로 485bp 및 람다 사슬에 대하여 대략적으로 510bp)의 존재에 대하여, 1.5% TAE 아가로스 겔에서 전기영동에 의해 분석되었다.

시퀀싱 중에 항체 사슬의 동족 페어링을 보존하기 위하여, 분리된 B 세포는 단일-세포 마이크로방울 캡슐화 (Raindance Technologies, Inc., Lexington, MA)를 이용하여, 단일 세포 캡슐화된다. 캡슐화된 B 세포는 증폭 프라이머를 갖는 단일 세포 RT-PCR 시약 (Qiagen에 의해, Cat # 210210로 팔리는 시약)과 융합되어, 각각의 단일 B 세포로부터 연결된 중쇄 및 경쇄 PCR 생성물을 생성한다. 오버랩 PCR (Meijer P.J. et al., J. Mol. Biol. 358(3):764-72, 2006)이, 다운스트림 시퀀싱을 통한 항체 사슬 쌍의 보존을 위하여 중쇄 및 경쇄 PCR 생성물을 하나의 DNA로 스티치하는데 이용된다.

454 시퀀싱을 위한 앰플리콘 정제, 분석, 정량화 및 제조

PCR 샘플에서 과다한 프라이머 및/또는 프라이머 다이머를 제거하기 위하여, 앰플리콘은 Agentcourt Ampure 마그네틱 비드 (Beckman Coulter cat#A63881)를 이용하여 제조자의 프로토콜 (000387v001)에 따라 정제된다. 중쇄에 있어서, 모든 4개의 반응물 (VH1/7, VH2/5/6, VH3, VH4)은 하나로 합병되어 하나의 샘플로 정제되므로, 총 3개의 앰플리콘 샘플 (중쇄, 카파 및 람다 사슬)가 각 DNA 증폭을 위하여 정제되었다. Ampure 정제를 위한 프로토콜은, 정제가 96-웰 플레이트 포맷 대신에 1.5ml 튜브에 적합한 유전자 마그네틱 랙을 이용하여 단일 1.5ml 마이크로튜브에서 이루어지는 점에서 변형된다. 모든 부피 및 다른 과정은 프로토콜에 기재된 바와 같다. Ampure 정제 후 앰플리콘은 고선택성 DNA 칩 (Agilent Technologies cat# 5067-4626)을 이용하여 Agilent 2100 Bioanalyzer에서 제조자의 프로토콜에 따라 순도 및 임의의 오염 DNA 종에 대하여 분석된다.

앰플리콘의 순도가 확인되면, DNA의 농도는 제조자의 프로토콜에 기재된 바와 같이, Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit (Invitrogen cat#P7589)를 이용하여 형광강도계에서 정량화된다. 키트에 제공된 람다 DNA는, 표준 곡선이 100 ng/well으로부터 1.56 ng/well까지 생성되는 농도 표준으로서 이용된다. TE 버퍼에서 100배 희석된 각각의 앰플리콘의 형광은 2번 측정되며, DNA의 농도는 표준 곡선의 선형 부분에 따라 결정된다. 모든 형광 측정은 흑색 96-웰 플레이트에서 이루어진다. 각각의 사슬의 염기쌍의 대략적인 크기 (중쇄-540bp, 카파-485bp 및 람다-510bp)를 이용하여, 하기 식이 농도를 결정하는데 이용된다:

각 앰플리콘의 농도 (분자/㎕) =

[샘플 농도 (ng/㎕)*6.022×10²³]/[656.6×10⁹*앰플리콘 길이 (bp)]

각각의 앰플리콘은 1 × 10⁷ 분자/㎕로 정상화된 후(normalized), 중쇄: 카파 사슬: 람다 사슬의 부피비 3:3:1에서 혼합되고, 보텍스되고(vortexed), 최종적으로 1:10으로 희석되어, 1×10⁶ 분자/㎕에서 혼합물의 최종 농도를 얻는다.

에멀젼 PCR 증폭, 비드 강화, 비드 카운팅 및 시퀀싱

에멀젼 PCR은 454 발간된 프로토콜: "emPCR Amplification Method Manual - Lib-L" (Edition: May 2010 (Rev. April 2011))에 따라 수행되며, 실시예 8에 기재된 변형이 있다.

시퀀싱 비드가 강화되면, "emPCR Amplification Method Manual - Lib-L"의 Step 3.7로부터, 비드가 Beckman Coulter's Z2 Particle Counter에서 카운팅되며, 비드의 농도는 하기와 같이 계산된다:

비드의 = [입자 카운터로부터 읽은 평균(Avg. reading from particle counter) * 4] 비드/㎕

에멀젼 PCR로부터 강화된 비드는 전체적으로 본 명세서에 참조로 포함되는 454 시퀀싱 프로토콜: "Sequencing Method Manual-GS Junior Titanium Series"-May 2010 (Rev. June 2010)에 따라 454 Sequencer (Roche) 에서 시퀀싱된다.

Ⅱ. 펩타이드 단편의 생성:

인간 공여자 혈장으로부터 항원 특이적 IgG의 정제

항원에 대한 반응성에 대한 스크리닝

대상 항원(들)에 대한 혈장 IgG의 반응성은 ELISA에 의해 시험된다. 요약하면, 하이 바인딩 96-웰 플레이트 (Costar cat#)는 2시간 동안 37℃에서, 또는 하룻밤동안 4℃에서, 카보네이트 버퍼에 용해된 2㎍/ml에서의 항원 100㎕/well로 코팅된다. 플레이트는 PBS-Tween (0.1%)로 3회 헹궈진 후, 1시간 동안 37℃에서 PBS-Tween 중의 5% 탈지분유의 300㎕/well로 차단된다. 혈장 샘플은 5% 밀크 PBS-Tween에서 1/100, 1/500 및 1/1000 및 1/2000로 희석되고, 100㎕의 각각의 희석액이 96-웰 플레이트의 차단된 웰에 2세트로 첨가되며, 37℃에서 2시간 동안 배양된다. 플레이트는 1xPBS-Tween로 3회 세척되고, PBS-Tween에서 1/4000로 희석된 호스래디쉬 퍼옥시다제-컨주게이트된 안티-인간 IgG 항체 (Southern Biotech 2040-05)가 각각의 웰에 첨가되고(100㎕), 1시간 동안 37℃에서 배양된다. 플레이트는 PBS-Tween로 6회 세척되었고, 50㎕ TMB 기질 용액 (BioFX cat#TMBW-1000-01)의 첨가에 의해 현상된 후, 50㎕의 정지액 (BioFX cat# STPR1000-01)이 첨가된다. 신호는 450nm의 광학 밀도에서 측정된다. 혈청 역가는 백신 접종 후 시간에 따라 일반적으로 증가하는 것으로 관찰된다.

총 혈장 IgG로부터 항원 특이적 IgG의 정제

총 IgG는 실시예 8에 기재된 바와 같이 단백질 G를 이용하여 각각의 혈청 샘플로부터 정제된다. 정제된 IgG는 10kDa 컷오프 투석 카세트 (Pierce cat#66456)에서 4리터의 1xPBS에 대하여 2회 투석되고, IgG 농도는 Nanodrop photospectrometer (Thermo Scientific)에서 280nm에서의 흡수도를 측정함으로써 결정된다. 이어서, 실시예 8에 기재된 바와 같이 단백질 G-정제된 IgG는 항원에 결합된 비드를 이용하여 친화성 정제된다. 각각의 샘플로부터 친화성-정제된 항체 는 질량 분석을 위하여 수집된다.

Ⅲ. 질량 분석

질량 분석은 전술한 바와 같이 수행된다. 요약하면, 프로테아제 (예를 들어, 트립신) 및/또는 화학적 단백질 절단 시약 (예를 들어, 브롬화시안)에 의한 소화에 따라, 질량분석은 펩타이드에서 수행된다. 대상 항원에 특이적으로 결합하는 항원을 코딩하는 유전자 서열을 동정하기 위하여, 얻어진 MS2 스펙트럼은 유전 물질 데이터베이스의 정보로부터 유래된 이론적인 MS2 스펙트럼와 서로 연관된다. 샘플에서 항체의 서열을 결정함으로써, 백신 접종 후 다수 시점에서의 대상에서의 항원 특이적 항체 집단의 조성이 결정된다.

실시예 10

본 실시예는 인간 항체 유전자를 발현하는 형질전환 동물을 이용하여 항원 특이적 인간 항체를 생산하는 것을 서술한다.

XENOMOUSE strain XMG1-KL 생쥐 (Amgen, Thousand Oaks, CA)는 기계적으로 비활성화된 내인성 생쥐 항체를 가지며, 인간 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 부위를 함유한다 (Jakobovits et al., 2007, Nature Biotechnol., 25:1134-43). 이 생쥐는 인간 IgG1κ 및 IgG1γ 항체를 완전히 생산한다. 이 생쥐는 대상 인간 항원으로 면역되고, 유전 물질 데이터베이스 및 펩타이드 데이터베이스가 하기 방법을 이용하여 생성된다.

Ⅰ. 유전 물질 데이터베이스:

세포 분리

면역된 생쥐로부터의 비장이 주사기 및 21G 바늘을 이용하여 5 mL의 RPMI/10%FCS로 5회 플러쉬된다. 세포는 90% FCS/10% DMSO에서 동결된다. 총 50-100 ×10⁶개의 세포가 각각의 비장으로부터 분리된다.

RNA 분리 및 cDNA 합성.

총 RNA는 QIAshredder (Qiagen cat#79654) 및 RNeasy mini kit (Qiagen, Hilden, Germany; cat#74104)를 이용하여 제조자의 프로토콜에 따라 비장 세포로부터 분리된다. RNA는 표준 차세대 시퀀싱 프로토콜에 따라 컬럼에서 DNAse 처리된다. 총 RNA 농도는 ND-1000 분광광도계 (NanoDrop; Thermo Scientific, Wilmington, DE로부터 상업적으로 입수 가능함)를 이용하여 측정된다.

분리된 RNA는 Thermoscript RT-PCR system (Invitrogen (part of Life Technologies), Carlsbad, CA cat#11146-024)를 이용하여 역전사에 의해 first-strand cDNA 합성에 이용된다. cDNA는 제조자의 프로토콜에 따라 1.5ug의 RNA 및 올리고 dT 프라이머를 이용하여 합성된다.

V _H 및 V _L 증폭.

시퀀싱을 위한 중쇄, 카파 및 람다 사슬 가변 영역의 앰플리콘은 실시예 8에 기재된 바와 같이 인간 항체 서열에 특이적인 프라이머를 이용하여 하기와 같이 PCR에 의해 생성된다. 중쇄 증폭에 있어서, B-세포의 풀에서 V_H 유전자 전사 빈도 의 자연적 분포를 보존하기 위하여, 4개의 독립적인 반응물 (각각은 유전자군 V_H1 및 7; V_H2, 5 및 6; V_H3; 및 V_H4에 대하여 특이적임)이 각각의 cDNA 샘플에 대하여 시행된다. 카파 및 람다 사슬 증폭에 있어서, 각각의 사슬에 대한 단일 반응물이 각각의 cDNA 샘플에 시행된다. 각각의 반응에 있어서, 포워드 프라이머의 등몰 혼합물이 동일한 농도의 리버스 프라이머(들)과 함께 이용된다. 증폭은 Lib-L 플랫폼에 의해 454 Sequencing (Roche)에 양립가능한 융합 프라이머로 수행된다. 리버스 프라이머는 각각의 사슬의 불변 영역의 5' 말단에 하이브리다이즈하도록 설계된다. 이러한 프라이머는 Lib-L 프라이머 B 및 MID 서열을 함유하고 있어, 시퀀싱 판독은 각각의 불변 영역(리버스 센스에서)의 5' 극말단으로부터 가변 영역의 3' 말단으로 시작된다. 중쇄 및 카파 사슬에 있어서, 단일 리버스 프라이머가 각 MID에 이용된 반면, 람다 사슬에 있어서, 2개의 별개의 리버스 프라이머가 각 MID에 대하여 요구되었다.

PCR 증폭은 Finnzyme's Phusion Hot Start II 중합효소 (Thermo Scientific cat# F-540S)를 이용하여 수행되며, 여기에서 반응 혼합물 및 조건은 실시예 8에 서술된 바와 같이 설정된다.

임의의 시약에서 오염된 주형으로부터의 임의의 허위(false) 증폭이 없음을 확실하게 하기 위하여, 중복 반응(duplicate reactions)이 각각의 혼합물에 대하여 셋업되며(중쇄에 대하여 4개의 별도 반응, 및 각각의 경쇄에 대하여 1개의 반응), 이 경우 cDNA 주형은 물로 대체된다. 주형이 없는 이러한 음성 대조군은 주형을 함유하는 샘플과 동시에 시행(run)된다. PCR 프로그램 완료 시에, 3㎕의 각각의 반응물 (음성 대조군 포함)이, 주형이 반응물에 첨가되나, cDNA가 없는 경우, 앰플리콘 (중쇄에 대하여 대략적으로 540bp, 카파 사슬에 대하여 대략적으로 485bp 및 람다 사슬에 대하여 대략적으로 510bp)의 존재에 대하여, 1.5% TAE 아가로스 겔에서 전기영동에 의해 분석된다. PCR 생성물은 AMPure XP (Agencourt; Beckman Coulter Genoms, Brea, CA, cat#A63881)를 이용하여 제조자의 프로토콜에 따라 정제되며, Agilent 2100 BioAnalyzer를 이용하여 분석된다.

이어서, PCR 생성물의 서열은 예측된 아미노산 서열로 번역되며, 이는 이론적으로 소화되어 (예를 들어, 프로테아제 및/또는 화학적 단백질 절단 시약에 의해), 가상 펩타이드 단편을 생성한다. 이러한 가상 펩타이드 단편은 예측된 질량 스펙트럼을 생성하는데 이용된다.

폴리클로날 항체의 펩타이드 단편으로부터 실제 질량 스펙트럼의 생성:

폴리클로날 항체는 생쥐의 혈청 및/또는 혈장으로부터 정제된다. 항체를 정제하기 위하여, 하기 방법이 이용된다:

단백질-G 정제:

1mL의 마그네틱 단백질-G 비드 (Millipore (Billerica, MA), cat# LSKMAGG10)가 4개의 15mL 원뿔 모양 튜브 (Falcon (BD Biosciences, Franklin Lake, NJ), cat#352097) 각각에 첨가된다. 각각의 튜브의 비드는 10mL의 인산염 완충 식염수 pH7.4, 0.05% Tween-20 (PBST)로 2회 세척된 후, 10mL의 PBS로 3회 세척된다. 3마리의 생쥐 (ID 1262-2, 1262-4, 1263-4)로부터의 혈청은 함께 합병되고, PBS에서 최종 부피 6ml로 10배 희석된다. 1.5ml의 모아진 희석된 혈청은 각각의 비드의 튜브에 첨가되고, 4℃에서 하룻밤동안 배양된다. 통과액이 수집되고, 2회 더 정제 과정에 놓여진다. 통과액이 수집된 후, 각각의 튜브는 10mL PBST로 2회, 및 10mL의 PBS로 3회 세척된다. 각각의 튜브는 0.5mL의 0.1M pH 2.7 글리신으로 30분 동안 4℃에서 배양되어, IgG를 용리한다. 용리는 5회 반복된다. 모든 용리액은 1M Tris pH 8.5로 중화되고, PBS에 대하여 하룻밤동안 투석되고, 단백질 농도는 ND-1000 분광광도계 (Nanodrop)에 의해 측정되었다. 전체적으로, 약 2.5mg의 IgG이 정제된다.

항원 컬럼 제조:

5.0mL의 새로운 스트렙타비딘 (SA) 마그네틱 비드 (Pierce, cat#88817)이 10mL PBS로 3회 세척되고, 5.0mL의 PBS에서 희석된 비오틴에 컨주게이트된 대상 항원의 20mg/ml 저장액 105uL에 의해 4℃에서 배양된다. 통과액은 버려지고, 비드는10mL의 PBS로 3회 세척되고, 10개의 로우 바인딩 1.7mL 튜브 (Axygen (Union City, CA), cat# MCT-175-L-C)로 앨리쿼트된다. 앨리쿼트된 비드는 마그네틱 랙 (Invitrogen, DynaMag)에 놓여지고, 희석된 혈청을 첨가하기 전에 PBS는 제거된다.

항원 특이적 정제:

상기에서 단백질-G 정제된 IgG는 비오틴화 항원에 결합된 SA-마그네틱 비드에 첨가된다. 4℃에서 하룻밤동안 배양한 후, 통과액이 수집되고, 비드는 연속적으로 하기 버퍼의 총 10mL로 세척된다:

PBS

RIPA 버퍼 (즉, 방사면역침강반응 분석 버퍼(radioimmunoprecipitation assay buffer); Alcaraz et al., J. Vet. Diagn. Invest. 2(3): 191-196, 1990; Ngoka, L.C., Proteome Sci. 6(1): 30, 2008)

PBS 중의 20% 아세토니트릴

PBS 중의 60% 에틸렌글리콜

PBS 중의 0.5M NaCl

PBS (즉, 인산염 완충 식염수)

이어서, IgG는 1.5mL 0.1M 글리신 pH 3.5의 5개 분획, 이어서 1.5mL 0.1M 글리신 pH 2.7의 5개 분획, 이어서, 1.5mL 0.1M 글리신 pH 1.8의 5개 분획으로 용리되고, 1M Tris pH 8.5에 의해 중화된다. 용리액은 항원으로 코팅된 96-웰 플레이트를 이용하여 대상 항원에 대한 반응성에 대하여 분석된다. 활성을 갖는 분획은 ELISA (Thermo, cat#23300)에 의해 정량화되고, 웨스턴 블롯에 의해 항원 반응성에 대하여 분석된다. 가장 깨끗한 반응성을 갖는 분획이 질량 분석에 의해 분석된다.

질량 분석

질량 분석은 전술한 바와 같이 수행된다. 요약하면, 프로테아제 (예를 들어, 트립신) 및/또는 화학적 단백질 절단 시약 (예를 들어, 브롬화시안)에 의한 소화 후에, 질량 분석이 펩타이드에서 수행된다. 대상 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 코딩하는 유전자 서열을 동정하기 위하여, 얻어진 MS2 스펙트럼은 유전 물질 데이터베이스의 정보로부터 유래된 이론적 MS2 스펙트럼과 서로 연관된다.

모노클로날 항체의 발현 및 동정

별개의 중쇄 (감마 사슬) 가변 영역 클론, 카파 사슬 가변 영역 클론 및 람다 사슬 가변 영역 클론이 결합 포맷으로 발현되며, 항원 특이적 결합 활성에 대하여 스크리닝된다. 각각의 감마 사슬은 모든 경쇄 (카파 및 람다 사슬)와 페어링되어, 표준 96-웰 조직 배양 플레이트에서 HEK293E의 일시적 형질감염에 의하여 항체를 발현한다.

각각의 웰에서의 형질감염된 세포로부터 분비되는 항체는 효소 결합 면역 흡착법 (ELISA)에 의하여 정제된 재조합 항원에 대한 결합에 대하여 스크리닝된다. 중쇄 및 경쇄의 몇몇 페어링은 항원-코팅된 플레이트에 특이적으로 결합하는 항체에 이르게 된다. 이러한 중쇄 및 경쇄 쌍은 선택되어, 대상 인간 항원에 특이적으로 결합하는 인간 항체의 완전한 생산에 이르게 된다.

균등물

당해 기술분야의 통상의 기술자는 일상적인 실험을 이용하여 본 명세서에 특별히 기재된 특정 실시형태에 대한 다수의 균등물을 인식, 또는 확신할 수 있을 것이다. 그러한 균등물은 하기 청구항의 범위에 포함되는 것으로 의도된다.

<110> Polakiewicz, Roberto Cheung, Wan Cheung Rush, II, John Edward Beausoleil, Sean Andre <120> METHODS AND REAGENTS FOR CREATING MONOCLONAL ANTIBODIES <130> P13CS073D1 <150> 61/450,922 <151> 2011-03-09 <150> 61/560,006 <151> 2011-11-15 <150> 61/566,876 <151> 2011-12-05 <150> 61/594,729 <151> 2012-02-03 <160> 412 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1 ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag acgagtgcgt gatgtgaagc ttcaggagtc 60 60 <210> 2 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2 ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag acgctcgaca caggtgcagc tgaaggagtc 60 60 <210> 3 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 3 ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag agacgcactc caggtgcagc tgaagcagtc 60 60 <210> 4 <211> 60 <212> DNA <213> 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tccgactcag tcacgtacta gacattgtgc tgacccaatc 60 t 61 <210> 19 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 19 ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag cgtctagtac gacattgtga tgacccagtc 60 t 61 <210> 20 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 20 ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag tctacgtagc gatattgtgc taactcagtc 60 t 61 <210> 21 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 21 ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag tgtactactc gatatccaga tgacacagac 60 t 61 <210> 22 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 22 ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag acgactacag gacatccagc tgactcagtc 60 t 61 <210> 23 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 23 ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag cgtagactag caaattgttc tcacccagtc 60 t 61 <210> 24 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 24 cctatcccct gtgtgccttg gcagtctcag ccgtttcagc tccagcttg 49 <210> 25 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 25 cctatcccct gtgtgccttg gcagtctcag ccgttttatt ccagcttggt 50 <210> 26 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 26 cctatcccct gtgtgccttg gcagtctcag ccgttttatt tccaactttg 50 <210> 27 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 27 ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag tacgagtatg caggctgttg tgactcagga 60 a 61 <210> 28 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 28 cctatcccct gtgtgccttg gcagtctcag cttgggctga cctaggacag t 51 <210> 29 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 29 Gly Val Lys Phe 1 <210> 30 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 30 Gly Val Ser Thr Asn Val 1 5 <210> 31 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 31 Asp Pro Tyr Asp Asp Pro Thr Tyr Arg Gly Tyr Gly Met Asp Leu 1 5 10 15 <210> 32 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 32 Asn Pro Ala Val Asn Thr Tyr Ala Ser 1 5 <210> 33 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 33 His Leu Phe Leu His Phe 1 5 <210> 34 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 34 His Leu Phe Leu Asn Leu 1 5 <210> 35 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 35 His Leu Phe Leu Asn Phe 1 5 <210> 36 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 36 Gly Leu Gly Tyr Val Gly Ser Ser Val Tyr Ile Val Lys Tyr Ile Asn 1 5 10 15 Leu <210> 37 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 37 Asp Leu Ile Arg Val Ala Gly Asp Thr Phe Tyr Asp Gly Ala Phe Asn 1 5 10 15 Leu <210> 38 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 38 Gly Arg Tyr Asn Gly Trp Gly Tyr Ser Asn Asp Leu 1 5 10 <210> 39 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 39 Gly Gly Gly Thr Thr Leu 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Synthetic peptide <400> 50 Glu Leu Ala Gly Tyr Asp Val Gly Val Glu Phe 1 5 10 <210> 51 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 51 Ser Arg Ser Thr Ser Tyr Tyr Ile Asn Leu 1 5 10 <210> 52 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 52 Asp Gly Ser Asp His Gly Phe Asn Ile Asp Leu 1 5 10 <210> 53 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 53 Gly Ala Asp Ser Ile Tyr Arg Ile Tyr Phe Asp Leu 1 5 10 <210> 54 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 54 Asn Val Gly Ser Ser Ser Tyr Tyr Asn Leu Asn Leu 1 5 10 <210> 55 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 55 Gly Gly Asp Ala Gly Tyr Gly Tyr Phe Asp Ala Phe Gly Pro 1 5 10 <210> 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peptide <400> 80 Leu Tyr Asn Ser Leu Val Gly Asp Asp Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu 1 5 10 15 Val Thr Val Ser Leu Gly Gln Pro Lys 20 25 <210> 81 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 81 Lys Gly Asp Pro Gly His Pro Asn Gly Leu Phe Phe Thr Met 1 5 10 <210> 82 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 82 Lys Gly Asp Pro Gly His Pro Asn Gly Leu Phe Phe Thr Met Trp Gly 1 5 10 15 Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Phe Gly Gln Pro Lys 20 25 <210> 83 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 83 Gly Gly Gly Ser His Ser Gly Ser Ala Ile Tyr Asp Met Asp Pro 1 5 10 15 <210> 84 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 84 Gly Gly Gly Ser His Ser Gly Ser Ala Ile Tyr Asp Met Asp Pro Trp 1 5 10 15 Gly Pro 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Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 89 Asp Ala Ile Ala Asn Ile 1 5 <210> 90 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 90 Asp Ala Ile Ala Asn Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 1 5 10 15 Leu Gly Gln Pro Lys 20 <210> 91 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 91 Asp Lys Trp Met Val Phe Gly Asp Leu Arg Leu 1 5 10 <210> 92 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 92 Asp Lys Trp Met Val Phe Gly Asp Leu Arg Leu Trp Gly Pro Gly Thr 1 5 10 15 Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gln Pro Lys 20 25 <210> 93 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 93 Gln Gln Gly Arg Thr Tyr Ser Asp Val Ala Asn Val 1 5 10 <210> 94 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 94 Thr Tyr Ser Asp Val Ala Asn Val Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val 1 5 10 15 Val Lys <210> 95 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 95 Gln Gln Gly Tyr Ser Ser Tyr Asn Val Asp Asn Ala 1 5 10 <210> 96 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 96 Asn Val Asp Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 1 5 10 15 <210> 97 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 97 Gln Gln Gly Tyr Ser Ser Ser Asn Val Asp Asn Ala 1 5 10 <210> 98 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 98 Asn Val Asp Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 1 5 10 15 <210> 99 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 99 Leu Gly Thr Tyr Asp Cys Arg Ser Ala Asp Cys Asn Ala 1 5 10 <210> 100 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 100 Ser Ala Asp Cys Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 1 5 10 15 <210> 101 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 101 Gln His Gly Tyr Tyr Ser Asn Val Asp Asn Ala 1 5 10 <210> 102 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 102 Asn Val Asp Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 1 5 10 15 <210> 103 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 103 Gln Gln Gly Phe Ser Ser Arg Asn Val Asp Asn Ala 1 5 10 <210> 104 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 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DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 197 acgagctacg cacgaactgc aggtrtccac tcc 33 <210> 198 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 198 acgagctacg cacgaatagc aggtgtccac tcc 33 <210> 199 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 199 acgagctacg cacgargtac aggtgtccac tcc 33 <210> 200 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 200 acgagctacg cacgagcyac agmtgtccac tcc 33 <210> 201 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 201 acgagctacg cacgaactgc aggtgtccwm tcc 33 <210> 202 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 202 acgagctacg cacgarctrc aggtgtkcac tcc 33 <210> 203 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 203 acgagctacg cacgagctaw mggtgtccac tcc 33 <210> 204 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 204 acgagctacg cacgacctca ggtgtccact cc 32 <210> 205 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 205 acgagctacg cacgagctac aggtgctcac tcc 33 <210> 206 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 206 acgagctacg cacgaactgc aggtgtcctc tct 33 <210> 207 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 207 acgagctacg cacgaaytgc aggtgtccay tgc 33 <210> 208 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 208 acgagctacg cacgagctam mggtgtccac ttc 33 <210> 209 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 209 acgagctacg cacgactcct gtcaktaact kcaggt 36 <210> 210 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 210 acgagctacg cacgaaactg caggtgtctc tct 33 <210> 211 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 211 acgagctacg cacgarctrc aggygtccac tct 33 <210> 212 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 212 acgagctacg cacgaccaag ctgtatcctt tcc 33 <210> 213 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 213 acgagctacg cacgaccaag ctgtgtcctr tcc 33 <210> 214 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 214 acgagctacg cacgatgttg acagycvttc ckggt 35 <210> 215 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 215 acgagctacg cacgatgttc acagcctttc ctggt 35 <210> 216 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 216 acgagctacg cacgatttaa aaggggtcca gtgt 34 <210> 217 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 217 acgagctacg cacgataytt taaaargtgt cmagtgt 37 <210> 218 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 218 acgagctacg cacgagtttt aaaaggtgtc ctgtg 35 <210> 219 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 219 acgagctacg cacgactytt aaaaggkgtc cagwg 35 <210> 220 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 220 acgagctacg cacgacyttt amatggtatc cagtgt 36 <210> 221 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 221 acgagctacg cacgactttt acatggtttc aagtgt 36 <210> 222 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 222 acgagctacg cacgaytgtc cctgcatatg tcyt 34 <210> 223 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 223 acgagctacg cacgaatggc agcwgcycca ag 32 <210> 224 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 224 acgagctacg 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Synthetic oligonucleotide <400> 245 cctatcccct gtgtgccttg gcagtctcag atggacatga gggccccc 48 <210> 246 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 246 ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag tacagatcgt cttgttgtcc ttgagttcct 60 cagagga 67 <210> 247 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 247 cctatcccct gtgtgccttg gcagtctcag atggcctgca ccccg 45 <210> 248 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 248 ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag ctgtgcgtcg cagaagacsg atgggccctt 60 ggtgga 66 <210> 249 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 249 ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag acgcgagtat gaagacsgat gggcccttgg 60 tgga 64 <210> 250 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 250 ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag cacgctacgt gaagacsgat gggcccttgg 60 tgga 64 <210> 251 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 251 ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag tgagtcagta tgaagacsga tgggcccttg 60 gtgga 65 <210> 252 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 252 ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag atctactgac atgatgaaga csgatgggcc 60 cttggtgga 69 <210> 253 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 253 ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag agtagtgatc tcacagaaga csgatgggcc 60 cttggtgga 69 <210> 254 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 254 cctatcccct gtgtgccttg gcagtctcag atggactgga cctggagvat c 51 <210> 255 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 255 cctatcccct gtgtgccttg gcagtctcag atggactgga tttggaggrt c 51 <210> 256 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 256 cctatcccct gtgtgccttg gcagtctcag atggactgca cctggaggat c 51 <210> 257 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 257 cctatcccct gtgtgccttg gcagtctcag atggactgga cctggaggkt c 51 <210> 258 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 258 cctatcccct gtgtgccttg gcagtctcag atggacatac tttgttccac gc 52 <210> 259 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 259 cctatcccct gtgtgccttg gcagtctcag atggacacac 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ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag tacacacact gaagatgaag acagatggtg 60 cagccac 67 <210> 270 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 270 ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag tgtagtgtga tgaagatgaa gacagatggt 60 gcagccac 68 <210> 271 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 271 cctatcccct gtgtgccttg gcagtctcag atggacatga gggtsccygc tcagctc 57 <210> 272 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 272 cctatcccct gtgtgccttg gcagtctcag atggacatga grgtcctcgc tcagctc 57 <210> 273 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 273 cctatcccct gtgtgccttg gcagtctcag atggaagccc cagcdcagct tctc 54 <210> 274 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 274 cctatcccct gtgtgccttg gcagtctcag atggaaaccc cagcgcagct tctc 54 <210> 275 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 275 cctatcccct gtgtgccttg gcagtctcag atggtgttgc agacccaggt cttc 54 <210> 276 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 276 cctatcccct gtgtgccttg gcagtctcag atggggtccc aggttcacct cctc 54 <210> 277 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 277 cctatcccct gtgtgccttg gcagtctcag atgaggctcc ytgctcagct cctg 54 <210> 278 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 278 ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag cgtagactag agggcgggaa cagagtgacm 60 gtgg 64 <210> 279 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 279 ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag cgtagactag agggygggaa cagagtgacc 60 gakg 64 <210> 280 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 280 ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag tctagcgact atagggcggg aacagagtga 60 cmgtgg 66 <210> 281 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 281 ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag tctagcgact atagggyggg aacagagtga 60 ccgakg 66 <210> 282 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 282 ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag tagcgcgcgc tagggcggga acagagtgac 60 mgtgg 65 <210> 283 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 283 ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag tagcgcgcgc tagggyggga acagagtgac 60 cgakg 65 <210> 284 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 284 ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag atagagtact agggcgggaa cagagtgacm 60 gtgg 64 <210> 285 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 285 ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag atagagtact agggygggaa cagagtgacc 60 gakg 64 <210> 286 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 286 cctatcccct gtgtgccttg gcagtctcag atgacctgct cccctctcct cctca 55 <210> 287 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 287 cctatcccct gtgtgccttg gcagtctcag atggccggct tccctctcct cctca 55 <210> 288 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 288 cctatcccct gtgtgccttg gcagtctcag atggcctggt ctcctctcct cctca 55 <210> 289 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 289 cctatcccct gtgtgccttg gcagtctcag atggcctgga cycctctcct cctcm 55 <210> 290 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 290 cctatcccct gtgtgccttg gcagtctcag atgccctggg ctctgctsct cctsa 55 <210> 291 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 291 cctatcccct gtgtgccttg gcagtctcag atgccctggg tcatgctcct cctga 55 <210> 292 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 292 cctatcccct gtgtgccttg gcagtctcag atggcctgga ctcctctctt tctgt 55 <210> 293 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 293 cctatcccct gtgtgccttg gcagtctcag atggagaaga agaggagacc tgggg 55 <210> 294 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 294 cctatcccct gtgtgccttg gcagtctcag atggcctgga ccgctctcct tctga 55 <210> 295 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 295 cctatcccct gtgtgccttg gcagtctcag atggcctgga ccgttctcct cctcg 55 <210> 296 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 296 cctatcccct gtgtgccttg gcagtctcag atggcatgga tccctctctt cctcg 55 <210> 297 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 297 cctatcccct gtgtgccttg gcagtctcag atggcctgga tccctctact tctcc 55 <210> 298 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 298 cctatcccct gtgtgccttg gcagtctcag atggcctgga yccctctcct gctcc 55 <210> 299 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 299 cctatcccct gtgtgccttg gcagtctcag atggcatggg ccacactcct gctcc 55 <210> 300 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 300 cctatcccct gtgtgccttg gcagtctcag atggcctgga cccctctctg gctca 55 <210> 301 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 301 cctatcccct gtgtgccttg gcagtctcag atggcctggg tctccttcta cctac 55 <210> 302 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 302 cctatcccct gtgtgccttg gcagtctcag atggcctgga ccccactcct cctcc 55 <210> 303 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 303 cctatcccct gtgtgccttg gcagtctcag atggcctggg ctcctctgct cctca 55 <210> 304 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 304 cctatcccct gtgtgccttg gcagtctcag atggcctggg ctccactact tctca 55 <210> 305 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 305 Gly Phe Ala Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly 1 5 10 15 Gln Pro Lys <210> 306 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 306 Thr Thr Thr Thr 1 <210> 307 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 307 Arg Gly Tyr Tyr Ser Gly Thr Tyr Val Asp Tyr 1 5 10 <210> 308 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 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Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 314 His Glu Pro Leu Asn Trp Phe Pro Tyr 1 5 <210> 315 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 315 Lys Tyr Gly Gly Gly Phe Asp Tyr 1 5 <210> 316 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 316 Gly Ser Ala Phe Ala Tyr 1 5 <210> 317 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 317 Tyr Tyr Arg Asn Tyr Gly Gly Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 318 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 318 Glu Asp Tyr Tyr Ser Asp Gln Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 319 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 319 Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr 1 5 <210> 320 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> 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Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 341 Ala Ser Asp Tyr Asp Ser Ser Arg Gly His Trp Leu Val Tyr Asp Arg 1 5 10 15 Leu Asp Leu <210> 342 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 342 Leu Tyr Asn Ser Val Val Gly Asp Asp Ile 1 5 10 <210> 343 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 343 Leu Tyr Asn Ser Leu Val Gly Asp Asp Ile 1 5 10 <210> 344 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 344 Gly Met Pro Gly Ser Thr Ser Gly Asn Ser Asn Ile 1 5 10 <210> 345 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 345 Gly Met Pro Ala Ser Thr Ser Gly Asn Ser Asn Ile 1 5 10 <210> 346 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide 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Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 357 Ala Gly Gly Tyr Lys Ser Ala Ser Asp Gly Ser Ala 1 5 10 <210> 358 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 358 Gln Gly Glu Phe Ser Cys Asp Ala Gly Val Cys Thr Leu 1 5 10 <210> 359 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 359 Gln Gly Glu Phe Ser Cys Arg Ser Tyr Asp Cys Thr Val 1 5 10 <210> 360 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 360 Leu Gln Asp Trp Ser Pro Ser Tyr Ala Asp Val Ala 1 5 10 <210> 361 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 361 Gln Gln Gly Arg Arg Ser Val Asp Val Asp Asn Val 1 5 10 <210> 362 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 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Claims (50)

1. 항원에 특이적으로 결합하는 면역글로불린의 중쇄 또는 경쇄의 뉴클레오타이드 서열 또는 아미노산 서열을 얻는 방법으로서,
   (a) 적어도 하나의 동물의 면역글로불린 사슬 또는 그의 가변 영역을 코딩하는 핵산 서열을 제공하는 단계;
   (b) 항원에 특이적으로 결합하는 폴리클로날 면역글로불린의 집단을 얻고, 상기 집단의 중쇄 또는 경쇄, 또는 그의 가변 영역의 펩타이드 단편의 질량 스펙트럼 정보(mass spectra information)를 얻는 단계;
   (c) 펩타이드 단편의 질량 스펙트럼 정보를 핵산 서열로부터의 예측된 질량 스펙트럼 정보(predicted mass spectra information)와 서로 연관시켜, 펩타이드 단편을 포함하는 면역글로불린 사슬 (또는 그의 가변 영역)의 뉴클레오타이드 서열 또는 아미노산 서열을 동정하는 단계 - 여기에서, 상기 예측된 질량 스펙트럼 정보는 상기 핵산 서열에 의해 코딩되는 예측된 아미노산 서열(predicted amino acid sequences)로부터 유래됨 -; 및
   (d) 펩타이드 단편에 의한 면역글로불린 사슬 또는 그의 단편의 아미노산 서열 커버리지(amino acid sequence coverage)에 근거하여, 상기 동정된 면역글로불린 사슬 (또는 그의 가변 영역)의 뉴클레오타이드 서열 또는 아미노산 서열로부터 선택하여, 항원에 특이적으로 결합하는 면역글로불린의 중쇄 또는 경쇄의 뉴클레오타이드 서열 또는 아미노산 서열을 얻는 단계를 포함하는
   방법.
   
2. 제1항에 있어서,
   단계 (a)의 상기 적어도 하나의 동물은 항원에 노출된 동물인
   방법.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 핵산 서열은 발현된 핵산 서열인
   방법.
   
4. 제1항에 있어서,
   면역글로불린 사슬 (또는 그의 가변 영역)을 코딩하는 핵산 서열은,
   (1) 상기 적어도 하나의 동물로부터의 백혈구로부터 핵산 분자를 분리하는 단계; 및
   (2) 면역글로불린 사슬 (또는 그의 가변 영역)-코딩 핵산 분자에 인접한 폴리뉴클레오타이드 서열에 대하여 특이적인 프라이머를 이용하여, 면역글로불린 사슬 (또는 그의 가변 영역)-코딩 핵산 분자를 증폭하는 단계; 및
   (3) 상기 증폭된 면역글로불린 사슬 (또는 그의 가변 영역)을 코딩하는 핵산 분자의 뉴클레오타이드 서열을 얻는 단계
   에 의하여, 상기 적어도 하나의 동물로부터 얻어지는
   방법.
   
5. 제4항에 있어서,
   폴리펩타이드-코딩 핵산 분자는 RNA 분자이며, 상기 증폭 단계는 초기 역전사 단계(initial reverse transcription step)를 포함하는
   방법.
   
6. 제4항에 있어서,
   상기 면역글로불린 사슬 (또는 그의 가변 영역)-코딩 핵산 분자에 인접한 상기 폴리뉴클레오타이드 서열은 게놈 DNA 플랭킹 면역글로불린 유전자(genomic DNA flanking immunoglobulin genes), 면역글로불린 사슬 불변 영역-코딩 폴리뉴클레오타이드 서열(immunoglobulin chain constant region-encoding polynucleotide sequences), 및 면역글로불린 사슬 프레임워크 영역-코딩 폴리뉴클레오타이드 서열(immunoglobulin chain framework region-encoding polynucleotide sequences)로 이루어진 군으로부터 선택되는
   방법.
   
7. 제1항에 있어서,
   예측된 질량 스펙트럼 정보는 하기 단계:
   (i) 일 이상의 프로테아제 및/또는 일 이상의 화학적 단백질 절단 시약에 의하여, 핵산 서열의 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열의 이론적 소화(theoretical digest)를 수행하여, 가상 펩타이드 단편(virtual peptide fragments)을 생성하는 단계; 및
   (ⅱ) 상기 가상 펩타이드 단편의 예측된 질량 스펙트럼을 생성하는 단계
   를 포함하는 방법을 이용하여 얻어지는
   방법.
   
8. 제1항에 있어서,
   단계 (a)의 핵산 서열, 예측된 아미노산 서열, 및 상기 핵산 서열로부터 유래되는 예측된 질량 스펙트럼은 유전 물질 데이터베이스(genetic material database) 내에 놓여지는
   방법.
   
9. 제1항에 있어서,
   단계 (b)의 면역글로불린의 상기 폴리클로날 집단은 동물의 체액 샘플 또는 그 분획(fraction)으로부터 얻어지는
   방법.
   
10. 제9항에 있어서,
    상기 체액은 혈액, 뇌척수액,　윤활액(synovial fluid),　복막액,　점막 분비물,　눈물,　코 분비물,　침,　젖,　및 비뇨생식기 분비물(genitourinary secretions)로 이루어진 군으로부터 선택되는
    방법.
    
11. 제9항에 있어서,
    상기 동물은 이전에 항원에 노출되었던 동물인
    방법.
    
12. 제11항에 있어서,
    상기 이전에 항원에 노출되었던 동물은 이전에 항원으로 면역되었던 동물인
    방법.
    
13. 제9항에 있어서,
    상기 동물은 단계 (a)의 상기 적어도 하나의 동물과 동일한 것인
    방법.
    
14. 제9항에 있어서,
    단계 (b)의 면역글로불린의 상기 폴리클로날 집단은 상기 체액 샘플 또는 그 분획으로부터 정제되는
    방법.
    
15. 제14항에 있어서,
    상기 정제는 단백질 A 또는 단백질 G 정제, 또는 항원에 근거한 친화성 정제(affinity purification)에 의해 이루어지는
    방법.
16. 제1항에 있어서,
    단계 (b)의 면역글로불린의 상기 폴리클로날 집단은 시험관내(in vitro) 배양된 세포의 배지로부터 얻어지는
    방법.
    
17. 제1항에 있어서,
    단계 (b)의 펩타이드 단편의 질량 스펙트럼 정보는 면역글로불린의 폴리클로날 집단을 일 이상의 프로테아제 및/또는 일 이상의 화학적 단백질 절단 시약에 의해 소화시켜, 단편을 생성하고, 생성된 단편을 질량 분석함으로써, 면역글로불린의 폴리클로날 집단으로부터 얻어지는
    방법.
    
18. 제1항에 있어서,
    단계 (d)의 선택은 펩타이드 단편에 의한 면역글로불린의 CDR3 서열의 아미노산 서열 커버리지에 근거하는
    방법.
    
19. 제1항에 있어서,
    단계 (d)의 선택은 펩타이드 단편에 의한 면역글로불린의 가변 영역의 아미노산 서열 커버리지에 근거하는
    방법.
    
20. 제1항에 있어서,
    단계 (d)의 선택은 펩타이드 단편에 의한, 면역글로불린의 CDR3 서열의 아미노산 서열 커버리지 및 면역글로불린의 가변 영역의 아미노산 서열 커버리지에 근거하는
    방법.
    
21. 제1항에 있어서,
    단계 (d)의 선택은 맵핑된 특유한 펩타이드의 수(number of unique peptides mapped), 스펙트럼 점유율(spectrum share), 총 펩타이드 계수(total peptide count), 특유한 펩타이드 계수(unique peptide count), 코딩 핵산 서열의 빈도(frequency of the encoding nucleic acid sequences), 및 복제 상호 관련성(clonal relatedness)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 파라미터에 근거하는
    방법.
    
22. 항원에 특이적으로 결합하는 면역글로불린을 생성하는 방법으로서,
    제1항의 방법을 이용하여 중쇄 및 경쇄의 뉴클레오타이드 서열 또는 아미노산 서열을 얻는 단계,
    얻어진 뉴클레오타이드 서열 또는 아미노산 서열에 근거하여, 재조합 분자 생물학 기술 또는 유전자 합성 기술에 의해 상기 중쇄 및 상기 경쇄를 만드는 단계, 및
    상기 중쇄를 상기 경쇄와 어셈블링(assembling)하여, 항원에 특이적으로 결합하는 면역글로불린을 생성하는 단계를 포함하는
    방법.
    
23. 제22항에 있어서,
    상기 면역글로불린이 항원에 특이적으로 결합하는 것을 확인하기 위하여 면역분석에서 상기 면역글로불린을 평가하는 단계를 더 포함하는
    방법.
    
24. 제23항에 있어서,
    면역분석은 유동 세포 계수 분석(flow cytometry assay), 효소 결합 면역흡착 분석(enzyme-linked immunosorbent assay, "ELISA"), 웨스턴 블롯 분석(Western blotting assay), 면역조직화학적 분석(immunohistochemistry assay), 면역형광 분석(immunohistochemistry assay), 방사면역 분석(radioimmunoassay), 중화 분석(neutralization assay), 결합 분석(binding assay), 친화성 분석(affinity assay), 단백질 면역침강반응 분석(protein immunoprecipitation assay), 및 펩타이드 면역침강반응 분석(peptide immunoprecipitation assay)으로 이루어진 군으로부터 선택되는
    방법.
    
25. 항원에 특이적으로 결합하는 면역글로불린의 면역글로불린 사슬 가변 영역의 뉴클레오타이드 서열 또는 아미노산 서열을 얻는 방법으로서,
    (a) 적어도 하나의 동물의 다중 면역글로불린(multiple immunoglobulins)의 면역글로불린 가변 영역을 코딩하는 핵산 서열을 제공하는 단계;
    (b) 항원에 특이적으로 결합하는 폴리클로날 면역글로불린의 집단의 면역글로불린 사슬 가변 영역의 펩타이드 단편의 질량 스펙트럼 정보를 얻는 단계;
    (c) 펩타이드 단편의 질량 스펙트럼 정보를 핵산 서열의 예측된 질량 스펙트럼 정보(predicted mass spectra information)와 서로 연관시켜, 펩타이드 단편을 포함하는 면역글로불린 사슬 가변 영역의 뉴클레오타이드 서열 또는 아미노산 서열을 동정하는 단계 - 여기에서, 상기 예측된 질량 스펙트럼 정보는 상기 핵산 서열에 의해 코딩되는 예측된 아미노산 서열(predicted amino acid sequences)로부터 유래됨 -; 및
    (d) 펩타이드 단편에 의한 가변 영역의 아미노산 서열 커버리지(amino acid sequence coverage)에 근거하여, 상기 동정된 면역글로불린 사슬 가변 영역의 뉴클레오타이드 서열 또는 아미노산 서열로부터 선택하여, 항원에 특이적으로 결합하는 면역글로불린의 가변 영역의 뉴클레오타이드 서열 또는 아미노산 서열을 얻는 단계를 포함하는
    방법.
    
26. 제25항에 있어서,
    (e) 단계 (d)에서 얻어진 뉴클레오타이드 서열 또는 아미노산 서열에 근거하여 재조합 분자 생물학 기술 또는 유전자 합성 기술에 의해 면역글로불린 사슬 가변 영역을 만드는 단계를 더 포함하는
    방법.
    
27. 제26항에 있어서,
    (f) 항원에 특이적으로 결합하는 면역글로불린의 면역글로불린 사슬 가변 영역을 분리하기 위하여, 면역분석에 의해 면역글로불린 사슬 가변 영역을 스크리닝하는 단계를 더 포함하는
    방법.
    
28. 제25항에 있어서,
    상기 면역글로불린 사슬은 중쇄인
    방법.
    
29. 제25항에 있어서,
    상기 면역글로불린 사슬은 경쇄인
    방법.
    
30. 항원에 특이적으로 결합하는 면역글로불린의 항원 결합 도메인을 생성하는 방법으로서,
    (a) 제25항의 방법에 따라 항원에 특이적으로 결합하는 면역글로불린의 면역글로불린 사슬 가변 영역의 뉴클레오타이드 서열 또는 아미노산 서열을 얻는 단계; 및
    (b) 면역글로불린 중쇄 가변 영역을 면역글로불린 경쇄 가변 영역과 서로 연관시켜, 항원에 특이적으로 결합하는 면역글로불린의 항원 결합 도메인을 생성하는 단계를 포함하는
    방법.
    
31. 제1항, 제22항, 제25항 또는 제30항에 있어서,
    상기 동물은 인간인
    방법.
    
32. 제1항, 제22항, 제25항 또는 제30항에 있어서,
    상기 동물은 토끼 또는 생쥐인
    방법.
    
33. 제22항의 방법에 따라 생성된 항원에 특이적으로 결합하는 면역글로불린.
    
34. 제25항의 방법에 따라 분리된 항원에 특이적으로 결합하는 면역글로불린의 면역글로불린 사슬 가변 영역.
    
35. 제30항의 방법에 따라 생성된 항원에 특이적으로 결합하는 면역글로불린의 항원 결합 도메인.
    
36. 제33항의 면역글로불린 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.
    
37. 제34항의 면역글로불린 사슬 가변 영역 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.
    
38. 제35항의 항원 결합 도메인 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.
    
39. 질병 항원에 의해 특징지워지는, 질병을 갖거나 또는 질병을 갖는 것으로 의심되는 동물의 치료 방법으로서,
    상기 방법은 유효량의 제36항 내지 제38항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 것을 포함하며, 항원과 상기 질병 항원은 동일한 것인
    방법.
    
40. 제39항에 있어서,
    상기 동물은 인간인
    방법.
    
41. 동물에서 질병 항원의 존재에 의해 특징지워지는 질병의 동물에서의 발생 가능성을 감소시키는 방법으로서,
    상기 방법은 유효량의 제36항 내지 제38항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 것을 포함하며, 항원과 상기 질병 항원은 동일한 것인
    방법.
    
42. 제41항에 있어서,
    상기 조성물은 보조제를 더 포함하는
    방법.
    
43. 제41항에 있어서,
    상기 동물은 인간인
    방법.
    
44. 항원에 노출된 대상의 항원 특이적 집단을 모니터링하는 방법으로서,
    (a) 항원에 노출된 대상으로부터 다중 면역글로불린의 면역글로불린 사슬 (또는 그의 가변 영역)을 코딩하는 핵산 서열을 얻는 단계;
    (b) 항원에 특이적으로 결합하는 대상으로부터 폴리클로날 면역글로불린 집단의 면역글로불린 중쇄 및 면역글로불린 경쇄의 펩타이드 단편의 질량 스펙트럼 정보를 얻는 단계;
    (c) 상기 펩타이드 단편의 질량 스펙트럼 정보를 핵산 서열의 예측된 질량 스펙트럼 정보(predicted mass spectra information)와 서로 연관시켜, 항원에 특이적으로 결합하는 대상으로부터 폴리크로날 면역글로불린 집단의 서열을 동정하는 단계 - 여기에서, 상기 예측된 질량 스펙트럼 정보는 상기 핵산 서열에 의해 코딩되는 예측된 아미노산 서열(predicted amino acid sequences)로부터 유래됨 -; 및
    (d) 펩타이드 단편에 의한 면역글로불린 사슬 또는 그의 단편의 아미노산 서열 커버리지에 근거하여, 상기 동정된 면역글로불린 사슬 (또는 그의 가변 영역)의 뉴클레오타이드 서열 또는 아미노산 서열로부터 선택하여, 항원에 특이적으로 결합하는 면역글로불린의 중쇄 또는 경쇄의 뉴클레오타이드 서열 또는 아미노산 서열을 얻는 단계를 포함하는
    방법.
    
45. 제44항에 있어서,
    상기 핵산 서열 및 상기 폴리클로날 면역글로불린 집단은 각각 항원에 대한 대상의 노출 후의 시점(time point)에 상응하는
    방법.
    
46. 제44항에 있어서,
    상기 핵산 서열 및 상기 폴리클로날 면역글로불린 집단은 각각 각각 항원에 대한 대상의 노출 후의 다수의 시점(multiple time points)에 상응하는
    방법.
    
47. 제33항의 면역글로불린의, 질병 항원에 의해 특징지워지는 질병의 치료 또는 가능성 감소에 이용되는 의약 제조를 위한 용도로서, 항원과 상기 질병 항원은 동일한 것인 용도.
    
48. 제34항의 면역글로불린 사슬 가변 영역의, 질병 항원에 의해 특징지워지는 질병의 치료 또는 가능성 감소에 이용되는 의약 제조를 위한 용도로서, 항원과 상기 질병 항원은 동일한 것인 용도.
    
49. 제35항의 항원 결합 도메인의, 질병 항원에 의해 특징지워지는 질병의 치료 또는 가능성 감소에 이용되는 의약 제조를 위한 용도로서, 항원과 상기 질병 항원은 동일한 것인 용도.
    
50. 제47항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 동물은 인간인
    용도.

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