CN104560980B

CN104560980B - 基于高通量测序构建鼠BCR轻链Lamda文库的多重PCR引物和方法

Info

Publication number: CN104560980B
Application number: CN201510027884.4A
Authority: CN
Inventors: 贾罄竹; 万瑛; 陈钢; 于海礼; 关鹏; 张建阳
Original assignee: Third Military Medical University TMMU
Current assignee: Third Military Medical University TMMU
Priority date: 2015-01-20
Filing date: 2015-01-20
Publication date: 2017-04-05
Anticipated expiration: 2035-01-20
Also published as: CN104560980A

Abstract

本发明公开了基于高通量测序构建鼠BCR轻链Lamda文库的多重PCR引物和方法，其引物序列如SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.13所示，该引物是根据B淋巴细胞受体轻链体细胞重排的规律设计，并在正向引物和反向引物的上游添加测序接头，该引物能高效扩增模板，能够用于构建免疫组库；本发明还公开了构建鼠BCR轻链Lamda文库的方法，该方法简单，能够快速构建鼠BCR轻链Lamda文库，对进一步了解免疫组库变化规律、揭示疾病发病机制有重要意义。

Description

基于高通量测序构建鼠BCR轻链Lamda文库的多重PCR引物和方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及基于高通量测序构建鼠BCR轻链Lamda文库的多重PCR引物，和利用该引物构建鼠BCR轻链Lamda文库的方法。

背景技术

得益于下一代高通量测序技术的快速发展和广泛应用，DNA和RNA测序平台在基因组学的各个方面发挥着突出的推动作用。同时，这一新兴的技术领域已经被应用于T细胞和B细胞受体的免疫组库测序。在获得性免疫中，T细胞和B细胞通过表面的T细胞受体和B细胞受体特异性的识别抗原肽-主要组织相容性复合物(pMHC)进而启动免疫系统活化。通过测序淋巴细胞受体的CDR3免疫组库，确定T、B淋巴细胞中受体分子的组成，可以用以评价免疫组库的多样性等特征参数，并进一步研究获得性免疫系统的应答发生过程及其发生机制。

B细胞受体(BCR)由两条重链和两条轻链，共四条肽链组成，重链由IGH基因编码，轻链分别由IGL(Lamda链)和IGK(Kappa链)编码，同时由于轻链与重链相比具有相同的可变区长度，因而可以很好的反应。IGL基因的胚系基因由多个开放阅读框依次排列而成，可划分为IGLV，IGLJ，IGLC三组片段，在B淋巴细胞发育过程中通过体细胞重排实现不同片段间随机组合产生成熟的IGL分子，为BCR的多样性提供了分子遗传基础。在IGLV-IGLJ的连接处，由于非模版核苷酸的随机插入与缺失，大大增加了BCR分子的多样性程度。B细胞活化过程中，由于体细胞超突变(即亲和力成熟)及重组类型转换的作用，BCR的多样性进一步增加。而IGL基因的互补决定区3(CDR3)刚好覆盖IGLV-Junction-IGHJ区域，包括了IGL基因几乎全部的多样性信息，因此，对于B淋巴细胞IGL基因CDR3区域的序列组成进行测序可以很好的反映BCR免疫组库的组成及应答状况。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供基于高通量测序构建鼠BCR轻链Lamda文库的多重PCR引物；本发明的目的之二在于提供利用所述多重PCR引物构建鼠BCR轻链Lamda文库的方法。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

1、基于高通量测序构建鼠BCR轻链Lamda文库的多重PCR引物，所述多重PCR引物如SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.13所示。

2、利用所述多重PCR引物构建鼠BCR轻链Lamda文库的方法，先提取鼠脾腺组织或外周血总RNA，然后以SEQ ID NO.1为反转录引物合成cDNA，以合成的cDNA为模板，SEQ IDNO.2～SEQ ID NO.13所示序列为引物进行多重PCR，回收PCR产物，将PCR产物进行微乳滴PCR，然后进行PGM测序，得鼠BCR轻链Lamda文库。

优选的，所述多重PCR的扩增条件为：95℃预变性10min；95℃变性30s，59℃退火90s，72℃延伸90s，循环35次；最后72℃后延伸10min。

本发明的有益效果在于：本发明公开了构建鼠BCR轻链Lamda文库的多重PCR引物，该引物能够扩增IGL基因CDR3区，能够构建鼠BCR轻链Lamda文库，本发明还公开了构建鼠IGL基因CDR3区测序文库的方法，实现了B细胞受体免疫组库的稳定检测，对进一步了解免疫组库变化规律、揭示疾病发病机制有重要意义。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：

图1为凝胶成像检测目的条带图(1：DL2000；2：鼠TCRB文库条带)。

图2为鼠TCRB文库统计结果。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、提取鼠组织中总RNA

鼠组织中总RNA的提取方法，包括如下步骤：

a.取鼠脾腺组织和外周血加入Trizol后吹打，室温静置5min，直接提取RNA或放入-80℃冰箱冻存；

b.按每微升Trizol加入200μl氯仿，颠倒混匀(30s)，室温放置3min，然后于4℃、12000g离心15min；

c.取水相，按每微升Trizol加入200μl氯仿颠倒混匀(30s)，室温放置3min，然后于4℃条件下12000g离心15min；

d.再取上层水相，按每微升Trizol加入0.5ml异丙醇，颠倒混匀，室温放置10min，然后于4℃条件下12000g离心10min，弃上清；

e.沉淀按每微升Trizol加入1ml体积分数为75％乙醇，温和震荡，悬浮沉淀，然后于4℃、8000g离心5min，吸去上清，沉淀于室温(18～25℃)晾干；

d.晾干后用无RNA酶水溶解，得鼠总RNA。

将提取所得RNA用epoch测定RNA浓度和质量。检测结果显示，OD260/OD280在1.8～2.0左右。

再利用变性胶电泳检测28s，18s和5s。检测结果显示，条带明显，28s/18s在2.0左右。

上述检测结果表明本实施例提取的RNA质量满足建库需求，能够用于后续建库。

实施例2、逆转录和多重PCR

将实施例1获得的总RNA样本分别进行逆转录，逆转录使用RevertAid FirstStrand cDNA Systhesis kit，具体操作按试剂盒说明书进行，其反应体系为：总RNA 0.1～5μg，浓度为20pmol的反转录引物(5’-tgactggagttcagacgtgtgttgcagcagcgggtcaaggg-3’(SEQ ID NO.1))1μL，加入DEPC处理水定容至12μL，然后将混合液在PCR仪中65℃孵育5min，然后迅速放入冰中冰浴5min，再加入5×reaction buffer 4μL，Ribolock^TM RNase抑制剂(20u/μL)1μL，1mM dNTP Mix 2μL，revertAid TM M-MuLV反转录酶200u/μL 1μL，混匀后，离心，然后在42℃条件下孵育1h，得第一链cDNA。

根据B淋巴细胞受体轻链(IGL基因)体细胞重排、非模版随机插入缺失、体细胞超突变和类型转换重组的规律，设计多重PCR引物，为方便测序在正向引物和反向引物的上游添加的测序接头，具体引物如表1所示：

表1、鼠BCR轻链Lamda文库的多重PCR引物

引物名称	5’→3’	序号
			trP1-mmIGLfwd01	cctctctatgggcagtcggtgatmtgatgacccartctcca	SEQ ID NO.2
trP1-mmIGLfwd02	cctctctatgggcagtcggtgatsrgatattgtgatgacgcagg	SEQ ID NO.3
			trP1-mmIGLfwd03	cctctctatgggcagtcggtgatawtgtdctsacccartctcc	SEQ ID NO.4
trP1-mmIGLfwd04	cctctctatgggcagtcggtgatcctgtggrgacattgtgat	SEQ ID NO.5
			trP1-mmIGLfwd05	cctctctatgggcagtcggtgatayccvgatgacycagtct	SEQ ID NO.6
trP1-mmIGLfwd06	cctctctatgggcagtcggtgatccagatgtgayrtycaratg	SEQ ID NO.7
			trP1-mmIGLfwd07	cctctctatgggcagtcggtgatbcagtgtgacatccrvat	SEQ ID NO.8
trP1-mmIGLfwd08	cctctctatgggcagtcggtgatacacaggctccagcttctct	SEQ ID NO.9
			trP1-mmIGLfwd09	cctctctatgggcagtcggtgattcccaggctgttgtgactc	SEQ ID NO.10
trP1-mmIGLfwd10	cctctctatgggcagtcggtgatcaacttgtgctcactcagtc	SEQ ID NO.11
			trP1-mmIGLfwd11	cctctctatgggcagtcggtgatctctaggaagcacagtcaaac	SEQ ID NO.12
Akbcd15-mmIGLrev	ccatctcatccctgcgtgtctccgactcagtctagaggtcgtggtbccttsgccccag	SEQ ID NO.13

表1中，R＝A/G，Y＝C/T，M＝A/C，K＝G/T，S＝C/G，W＝A/T，H＝A/C/T，B＝C/G/T，V＝A/C/G，D＝A/G/T，N＝A/C/G/T。

然后以获得的第一链cDNA为模板，以SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.13所示序列为引物，进行PCR扩增，PCR扩增的反应体系如下：multiplex-PCR预混液25μL，正向引物5μL，反向引物5μL，cDNA 5μL，水10μL，共计50μL；PCR扩增条件为：95℃预变性10min；95℃变性30s，59℃退火90s，72℃延伸90s，循环35次；最后72℃后延伸10min。将扩增得到的产物用质量分数为3％的TAE琼脂糖凝胶(低熔点琼脂糖凝胶)，在50V电压下电泳3h，电泳后在紫外下将含目的条带的凝胶切下，放入1.5mL EP管中，然后加入1mL QG Solubilization buffer，在45℃条件下水浴5～10min直至胶块完全溶解，然后冰浴1-2min；冰预后将溶解好的溶胶液加入到吸附柱上，每次加入500μL，然后在18000g离心1min，离心后倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中，向吸附柱中加入300μL QG Solubilization buffer，18000g离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中，18000g离心2min，在将吸附柱放在新的1.5mlEP管中，用吹风机将吸附柱上残留的酒精彻底吹干后向吸附柱中加入25℃预热(95℃预热)的超纯水，静置2min，最后18000g下离心2min，收集洗脱液，该洗脱液为建库样本。

为了确定建库样本质量符合要求，对建库样本在质量分数为1.5％琼脂糖凝胶、100V电压下电泳30min，然后通过凝胶成像检测目的条带，结果如图1所示。上述检测结果表明获得的建库样本满足建库需求，能够用于下一步测序。

实施例3、em-PCR(微乳滴PCR)及PGM测序

利用Qubit测定获得不同样本的建库样本浓度，然后按相同量混合。样品稀释的方法为：假设Qubit测得的浓度为N ng/μL，文库扩增子程度为M kb，则文库的稀释倍数为N*1,.515*1000/26*M。

然后以稀释后的文库为模板，进行emPCR，emPCR使用Ion OneTouch^TM测序系统提供试剂，操作步骤按试剂盒说明书进行，然后进行PGM测序，测序结果即为鼠B淋巴细胞受体轻链Lamda文库。然后将测序结果进行统计，结果如图2所示。结果表明，利用本发明的方法构建的鼠B淋巴细胞受体轻链Lamda文库能够覆盖IGL基因的多样性信息。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims

1.基于高通量测序构建鼠BCR轻链Lamda文库的多重PCR引物，其特征在于：所述多重PCR引物如SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.13所示。

2.利用权利要求1所述多重PCR引物构建鼠BCR轻链Lamda文库的方法，其特征在于：先提取鼠脾腺组织或外周血总RNA，然后以SEQ ID NO.1为反转录引物合成cDNA，以合成的cDNA为模板，SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.13所示序列为引物进行多重PCR，回收PCR产物，将PCR产物进行微乳滴PCR，然后进行PGM测序，得鼠BCR轻链Lamda文库。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述多重PCR的扩增条件为：95℃预变性10min；95℃变性30s，59℃退火90s，72℃延伸90s，循环35次；最后72℃后延伸10min。