CN114560930B - 抗新型冠状病毒的广谱中和抗体及其应用 - Google Patents
抗新型冠状病毒的广谱中和抗体及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及抗新型冠状病毒的广谱中和抗体及其应用。本发明提供了一种抗新型冠状病毒的广谱中和抗体或其抗原结合片段，该广谱中和抗体或其抗原结合片段具有包含VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3的重链可变区和包含VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3的轻链可变区，并且其中VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3分别包含SEQ ID No.1、2和3所示的氨基酸序列，且VLCDR1、VLCDR2、VLCDR3分别包含SEQ ID No.4、5和6所示的氨基酸序列。最终筛选出的抗体具有高效且广谱的中和活性，对新型冠状病毒的野生型以及13个突变株的IC50均小于0.05µg/ml，对WT、Beta、Delta和Omicron BA.1活病毒的IC50均小于0.1µg/ml。
Description
技术领域
本发明涉及免疫技术领域，尤其是涉及抗新型冠状病毒的广谱中和抗体及其应用。
背景技术
新型冠状病毒(SARS-CoV-2)在传播过程中会随机产生突变形成各种突变株，而其中一些携带关键突变位点的突变株具有更强的免疫逃逸能力，进而引起了突破性感染。以奥密克戎(Omicron)突变株(B.1.1.529)为例，其在重要靶位的大量突变极大地降低了免疫血清的中和活性，对疫苗的保护效果构成了威胁。因此，急需高效广谱的预防和治疗手段来控制SARS-CoV-2的流行。广谱中和抗体(broadly neutralizing antibodies，bNAbs)可有效应对不同突变株的免疫逃逸，既可在感染后用药，通过Fab阻断病毒感染，以及通过Fc效应功能增强机体对病毒的免疫应答；也可在感染前被动免疫，快速发挥预防作用。
目前获准或处于不同研究阶段的抗SARS-CoV-2中和抗体对Alpha、Beta、Gamma和Delta等突变株的中和活性多数无显著降低或仅有部分降低，但超过85%的抗体对奥密克戎(Omicron)突变株几乎完全耐药。因此，需要分离和鉴定更多具有高效和广谱特征的抗SARS-CoV-2中和抗体，来应对已有和未来可能出现的突变株和流行株，为临床应用提供更多的候选抗体。
发明内容
本申请旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本申请的主要目的在于提供一种高效的抗新型冠状病毒的广谱中和抗体及其应用。
在一方面，本发明提供了一种抗新型冠状病毒的广谱中和抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段具有包含VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3的重链可变区和包含VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3的轻链可变区，并且其中VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3分别包含SEQ IDNo. 1、2和3所示的氨基酸序列，且VLCDR1、VLCDR2、VLCDR3分别包含SEQ ID No. 4、5和6所示的氨基酸序列。
在另一方面，本发明提供了一种分离的多核苷酸，该多核苷酸编码根据本发明的抗新型冠状病毒的广谱中和抗体或其抗原结合片段。
在再一方面，本发明提供了一种表达载体，该表达载体包含根据本发明的多核苷酸。
在又一方面，本发明提供了一种重组细胞，该重组细胞包含根据本发明的多核苷酸或者包含根据本发明的表达载体。
在另一方面，本发明提供了一种制备根据本发明的抗新型冠状病毒的广谱中和抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括培养根据本发明的重组细胞，并且回收得到所述广谱中和抗体或其抗原结合片段。
在再一方面，本发明提供了一种药物组合物，该药物组合物包含根据本发明的抗新型冠状病毒的广谱中和抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体。
在又一方面，本发明提供了一种试剂盒，该试剂盒包含根据本发明的抗新型冠状病毒的广谱中和抗体或其抗原结合片段。
在另一方面，本发明提供了根据本发明的抗新型冠状病毒的广谱中和抗体或其抗原结合片段、多核苷酸、表达载体、重组细胞、或药物组合物在制备预防和/或治疗新型冠状病毒感染的药物中的应用。
在本发明中，通过单个特异性记忆性B细胞的流式分选快速高效获得与特定病原体靶抗原结合的B细胞，联合分子克隆技术以及高通量的结合和中和实验筛选技术，短期内获得了大量的天然候选抗体。分选样本来源于新型冠状病毒灭活疫苗免疫后的健康人群，避免了感染者样本可能产生的生物安全风险，以及动物源性抗体所需的人源化改造。最终筛选出的抗体具有高效且广谱的中和活性，其中，抗体10-5B与野生型新型冠状病毒RBD的亲和力KD为2.68 nM，对新型冠状病毒的野生型以及Alpha、Beta、Gamma、Delta、OmicronBA.1和Omicron BA.2等13个突变株的IC50均小于0.05 µg/ml，对WT、Beta、Delta和OmicronBA.1活病毒的IC50均小于0.1 µg/ml。
附图说明
图1是本申请的实施例中流式细胞分选的结果。其中，A为全部计数中圈出的淋巴细胞，B为从A中圈出单细胞，C为再次从B中圈出单细胞，D为从C中圈出CD3-CD8-CD14-DAPI-CD19+的B细胞，E为从D中圈出CD19+CD27+的B细胞，F为从E中圈出RBDo+的B细胞。
图2是本申请的实施例中不同的记忆性B细胞的第二轮巢式PCR产物的凝胶电泳结果。从上到下分别为重链可变区IgH、轻链(κ)可变区Igκ和轻链(λ)可变区Igλ的结果。
图3是本申请的实施例中筛选出的抗体序列的参数。其中，A中从左到右依次为重链可变区胚系基因占比、轻链κ链可变区胚系基因占比、轻链λ链可变区胚系基因占比的统计结果；B中从左到右依次为重链CDR3的长度和轻链CDR3的长度统计结果；C为重链可变区和轻链可变区的突变率的统计结果。
图4是本申请的实施例中293T细胞系统中抗体表达的Western印迹结果，上方为重链，下方为轻链。
图5是本申请的实施例中抗体对不同抗原的结合活性筛选结果。其中，从左到右分别是以新型冠状病毒野生型RBD蛋白、奥密克戎(Omicron)突变株的RBD蛋白、Beta突变株的S1蛋白和Delta突变株的S1蛋白作为筛选抗原的结果，横坐标为倒数上清稀释度(reciprocal supernatants dilutions)，纵坐标为OD值(OD450-OD630)。
图6是本申请的实施例中抗体的中和活性筛选结果。其中，A为结合活性筛选出的10个抗体的表达上清不同稀释条件下对奥密克戎(Omicron BA.1)突变株假病毒的中和活性的比较结果，B为抗体10-5B的表达上清在不同稀释条件下对不同假病毒的中和活性检测结果。
图7是本申请的实施例中抗体10-5B转染的大规模表达和纯化的电泳结果。其中，A为大规模表达的Western印迹鉴定结果，B为亲和层析纯化后的产物的电泳检测结果。
图8是本申请的实施例中抗体10-5B的亲和力检测结果。
图9是本申请的实施例中抗体10-5B的假病毒中和试验结果。
图10为本申请的实施例中抗体10-5B的活病毒中和结果。
具体实施方式
在下文中，将更详细地描述本发明的实施方式以帮助理解本发明。应当理解，对于这些实施方式的描述仅出于说明性目的，而并非意在以任何方式对本发明所要求的保护范围进行限制。
如本发明所用，抗体是指能够与特定抗原结合的任何免疫球蛋白、单克隆抗体、多克隆抗体、多价抗体、二价抗体、一价抗体、多特异性抗体或双特异性抗体。完整抗体通常由两对多肽链组成，每对包含一条轻(L)链和一条重(H)链，轻链可以分为kappa (κ)型或lambda (λ)型，而根据重链的类型分别为μ、δ、γ、α和ε可以将抗体定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。重链包含重链恒定区(CH)和重链可变区(VH)。不同类型的重链的CH含有3到4个不等的结构域(CH1、CH2、CH3和CH4)。轻链包含轻链恒定区(CL)和轻链可变区(VL)。VH和VL中各自包含具有高度可变性的互补决定区(CDR)以及散布其间的构架区(FR)，各VH和VL由氨基末端至羧基末端包含依次的FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。抗原结合片段是指抗体中保持有特异性结合抗原能力的一个或多个片段，具体而言，包括但不限于Fab (由VL、VH、CL和CH1构成)、Fab′ (包含一部分铰链区的Fab)、F(ab′)2 (铰链区二硫桥连接的两个Fab)、Fv(由VL和VH构成)、scFv (单链Fv)等。
在第一方面，本发明提供了一种抗新型冠状病毒的广谱中和抗体或其抗原结合片段，抗新型冠状病毒的广谱中和抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段具有包含VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3的重链可变区和包含VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3的轻链可变区，并且其中VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3分别包含SEQ ID No. 1、2和3所示的氨基酸序列，且VLCDR1、VLCDR2、VLCDR3分别包含SEQ ID No. 4、5和6所示的氨基酸序列QNG。其中，VHCDR1~3分别是重链可变区的CDR1~CDR3，VLCDR1~3分别是轻链可变区的CDR1~3。优选地，VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3的氨基酸序列分别是SEQ ID No. 1、2和3，且VLCDR1、VLCDR2、VLCDR3的氨基酸序列分别是SEQ ID No. 4、5和6。
根据本发明的一个实施方式，VHCDR1~3和VLCDR1~3的氨基酸序列如下：
VHCDR1：GFTVSR (SEQ ID No.1)；
VHCDR2：IYTGGNT (SEQ ID No.2)；
VHCDR3：VRGSGGIHDAFDI (SEQ ID No.3)；
VLCDR1：QGISTW (SEQ ID No.4)；
VLCDR2：AAS (SEQ ID No.5)；
VLCDR3：QQAHSFPPT (SEQ ID No.6)。
根据本发明的特定实施方式，广谱中和抗体包括重链可变区和轻链可变区，其中：
重链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID No.7所示的氨基酸序列，或与SEQ IDNo.7所示的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%的同源性的序列：
EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAVSGFTVSRMSWVRQAPGKGLECVSVIYTGGNTDYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTALYYCVRGSGGIHDAFDIWGQGTMVTVSS (SEQ ID No.7)；并且
轻链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID No.8所示的氨基酸序列，或与SEQ IDNo.8所示的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%的同源性的序列：
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISTWLAWYQQKPGKAPKVLINAASGLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAHSFPPTFGPGTKLEIK (SEQ ID No.8)。
可以理解的是，抗体的抗原结合部位一般为重链和轻链的CDR区，而抗原结合部位的结构、理化性质决定抗体对抗原的特异性。因此，在上述具有80%或更高的序列同源性的序列中，重链可变区和轻链可变区的CDR1~CDR3分别与SEQ ID No.1~6一致，而只在其FR区发生一个或多个氨基酸的改变形成满足序列同源性要求的变体。
根据本发明的特定实施方式，广谱中和抗体还包括重链恒定区和/或轻链恒定区。
根据本发明的特定实施方式，重链恒定区(CH)包含SEQ ID No.11的氨基酸序列。优选地，重链恒定区的序列为SEQ ID No.11：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID No.11)。
根据本发明的特定实施方式，轻链恒定区(CL)包含SEQ ID No.12的氨基酸序列。优选地，轻链恒定区的序列为SEQ ID No.12：
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID No.12)。
在另一方面，本发明提供了一种分离的多核苷酸，该多核苷酸编码根据本发明的抗新型冠状病毒的广谱中和抗体或其抗原结合片段。
根据本发明的特定实施方式，在本发明的分离的多核苷酸中，编码重链可变区的核苷酸序列包含如SEQ ID No.9所示的序列，编码轻链可变区的核苷酸序列包含如SEQ IDNo.10所示的序列：
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCCGGAGGAGGCTTGATCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGTCTCTGGGTTCACCGTCAGTCGCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGTGTCTCAGTTATTTATACCGGTGGTAACACAGACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCTAAGAACACCCTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCCTGTATTATTGTGTGAGAGGATCAGGGGGTATCCATGATGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCCTCA (SEQ ID No.9)；
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCGTGTCTGCGTCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAGGGGATTAGCACCTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGGTCCTGATCAATGCTGCATCCGGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGTTCTGGTACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTACTATTGTCAACAGGCTCACAGTTTCCCCCCGACTTTCGGCCCTGGGACCAAGCTGGAGATCAAA (SEQ ID No.10)。
在再一方面，本发明提供了一种表达载体，该表达载体包含根据本发明的多核苷酸。如本发明所用，表达载体是指通过转化、转导、转染等方式导入宿主细胞后，插入的多核苷酸所编码的蛋白能够表达的核酸运载工具。表达载体包括但不限于质粒、噬菌体、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒等。可以理解的是，在载体还可以含有控制表达的元件如启动子序列、转录起始序列、增强子序列、报告基因。
在又一方面，本发明提供了一种重组细胞，该重组细胞包含根据本发明的多核苷酸或者包含根据本发明的表达载体。如本发明所用，重组细胞是指导入有载体的细胞，包括但不限于原核细胞(如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌)、真核细胞(如CHO细胞、HeLa细胞、BHK细胞、HEK 293细胞等)。
根据本发明的特定实施方式，重组细胞选自293T细胞、293F细胞。293T细胞是HEK293细胞中转入SV40T-抗原基因形成的高转衍生细胞系，293F细胞一类能够在无血清中高表达蛋白的野生型HEK 293细胞系。
在另一方面，本发明提供了一种制备根据本发明的抗新型冠状病毒的广谱中和抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括培养根据本发明的重组细胞，并且回收得到所述广谱中和抗体或其抗原结合片段。优选地，所述药学上可接受的载体包括但不限于液相载体、固相载体等成分，例如溶剂、悬浮剂、分散剂、稀释剂、赋形剂等。
在再一方面，本发明提供了一种药物组合物，该药物组合物包含根据本发明的抗新型冠状病毒的广谱中和抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体。
在又一方面，本发明提供了一种试剂盒，该试剂盒包含根据本发明的抗新型冠状病毒的广谱中和抗体或其抗原结合片段。
在另一方面，本发明提供了根据本发明的抗新型冠状病毒的广谱中和抗体或其抗原结合片段、多核苷酸、表达载体、重组细胞、或药物组合物在制备预防和/或治疗新型冠状病毒感染的药物中的应用。
本发明运用B.1.1.529 (Omicron) Spike RBD蛋白对新型冠状灭活疫苗免疫后的志愿者进行特异性单个记忆B细胞的分选，获得了配对的抗体重链和轻链基因，并筛选得到抗新型冠状病毒的单克隆抗体10-5B。该抗体具有高效的中和活性并且可以广谱中和新型冠状病毒的变异株，包括目前的所有VOC (variant of concern)和VOI (variant ofinterest)毒株。该单克隆抗体的发现不仅为新型冠状病毒感染的预防和治疗提供了备选药物，也为抗病毒感染的单抗药物研发提供了技术参考。
在下文中，将通过实施例更详细地说明本发明。然而，提供以下实施例仅出于说明性目的，而非意在限制本发明的保护范围。本领域技术人员可以在不脱离本发明的范围和精神的情况下可以进行各种修改和变化，并且所述修改和变化也落在本发明的范围之内。
实施例
下述实施例中，部分实验材料和试剂说明如下：
新型冠状病毒野生型以及突变株(Alpha、Beta、Gamma、Delta、Lambda、Mu、Kappa、Eta、Iota v1、Iota v2、Epsilon、Omicron BA.1和 Omicron BA.2)假病毒：参考以下文献自制得到：
MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 2021 Jan 22;70(3):95-99.
Cell. 2021 Apr 29;184(9):2372-2383.e9.
Cell. 2021 Aug 5;184(16):4220-4236.e13.
Microbiol Spectr. 2021 Oct 31;9(2):e0078921.
Infect Genet Evol. 2021 Nov;95:105038.
Nature. 2022 Feb;602(7898):664-670.
Nature. 2022 Mar 3. doi: 10.1038/s41586-022-04594-4.
GM：DEME (Thermo, C11995500BT)+10%FBS (HyClone, SH30084)+1%双抗(GIBCO,15140122)。
Hela-hACE2：由清华大学丁强教授馈赠，记载于PLoS Pathog. 2021 Nov 8;17(11):e1010053。
Bright-LiteTM检测试剂：Vazyme, DD1204。
RPMI 1640培养基：Thermo, C22400500BT (+10%FBS)。
细胞染色缓冲液：PBS (Biosharp) + 2%FBS。
B.1.1.529 (Omicron) Spike RBD 蛋白：Sino Biological, 40592-V08H121。
生物素标记的B.1.1.529 (Omicron) Spike RBD蛋白：Sino Biological, 40592-V49H7-B。
荧光素标记的抗体：CD3-Pacific Blue (Biolegend, 300431), CD8a-PacificBlue (Biolegend, 301023), CD14-Pacific Blue (Biolegend, 325616), CD19-FITC(Biolegend, 302206), CD27-PerCP-Cy5.5 (Biolegend, 356408), PE链霉亲和素(Biolegend, 405203), APC链霉亲和素(Biolegend, 405207)。
裂解液：0.5×PBS, 10 mM DTT (Invitrogen, 18064022), 10 U RNA酶抑制剂(NEB, M0307L)。
重链和轻链的表达载体CMV：由清华大学张林琦教授实验室馈赠，记载于Nature.2020 Aug; 584(7819):115-119。
实施例1. 抗新型冠状病毒单克隆抗体的制备
一、血浆结合活性检测
1.样本：新型冠状灭活疫苗(BBIBP-CorV)免疫两次后的志愿者的血浆。
2.结合活性检测：检测28个样本对新型冠状病毒奥密克戎(Omicron)突变株(B.1.1.529) RBD蛋白的结合滴度。方法如下：
(1)包被：将上述RBD蛋白用PBS稀释为0.5 µg/ml，在96孔ELISA板中加入100 µl/孔，4℃包被过夜。
(2)封闭：弃去包被液，每孔加入200 µl封闭液(PBST+3%BSA)，37℃封闭1 h。
(3)洗涤：弃去封闭液，用PBST洗涤3次。
(4)样品：每个血浆样本100倍起稀释，系列3倍稀释，并加阴性对照，37℃孵育2 h。
(5)洗涤：弃去样品，用PBST洗涤5次。
(6)二抗：将羊抗人IgG抗体用稀释液(PBST+1%BSA) 1：50000稀释，每孔加100 µl，37℃孵育30 min。
(7)洗涤：弃去样品，用PBST洗涤5次。
(8)显色：每孔加显色液100 µl，室温避光孵育15 min。
(9)终止：每孔加50 µl终止液。
(10)读数：用酶标仪读取450 nm和630 nm处的吸光度，结果为450 nm读数值减去630 nm读数值。
(11)计算血浆的结合滴度：以免疫前的血浆样本OD450的均值+2×SD作为cut-off值，高于该值的最大稀释度即为样品的结合滴度。
结果如下表1所示：经过活性筛选，结合滴度高于1000的样本17号可以作为中和抗体分选的候选样本。
表1. 样本结合滴度的检测结果
二、新型冠状病毒特异性单个记忆B细胞的分选
(1)PBMC复苏：将冻存的上述步骤一获得的编号17的候选样本的PBMC (约1×107个)在37℃水浴中迅速复苏，并用10 ml 37℃预热的RPMI 1640培养基(+10%FBS)重悬，400×g离心5 min。
(2)标记：弃去培养基，将细胞用10 ml 预冷的细胞染色缓冲液(cell stainingbuffer)重悬，400×g离心5 min，弃上清，100 µl 细胞染色缓冲液重悬细胞；取0.4 µg 生物素标记的新型冠状病毒奥密克戎(Omicron)突变株RBD蛋白加入细胞，充分混匀后4℃孵育1 h；2 ml预冷的细胞染色缓冲液洗两次，95 µl 细胞染色缓冲液重悬细胞；将荧光素标记的抗体(CD3-Pacific Blue、CD8a-Pacific Blue、CD14-Pacific Blue、CD19-FITC、CD27-PerCP-Cy5.5、PE链霉亲和素、APC链霉亲和素)混合加入细胞悬液中，4℃孵育30 min；2 ml预冷的细胞染色缓冲液洗两次，500 µl 细胞染色缓冲液重悬获得标记的PBMC。
(3)分选：将标记的PBMC在Sony MA900 Cell Sorter流式细胞仪上进行分析和分选，分选出CD3−CD8−CD14−CD19+CD27+RBDomicron+B细胞(见图1)，即为抗原特异性的记忆性B细胞，共获得35个细胞。抗原特异性的记忆性B细胞以单个分入含有4 µl裂解液(0.5×PBS,10 mM DTT, 10 U RNase Inhibitor)的96孔PCR 板中。
(4)冻存：迅速置于干冰中，直接用于逆转录或移至-80℃冰箱冻存。
三、单个B细胞基因克隆
1.逆转录
将上述冻存的抗原特异性的记忆性B细胞解冻后，按照High Capacity cDNA逆转录试剂盒(Thermo，4368813)的说明，加入试剂进行逆转录，步骤如下：
(1)每孔加入
2 μl 10× 随机六聚体(random hexamer),
0.8 μl 25× dNTP混合物, 各为10 mM,
1 μl 10% v/v Igepal CA-630 (Sigma)
8.95 μl 无核酸酶H2O。
(2) 65℃加热5 min，冰上放置至少2 min。
(3)加2 μl 10× RT Buffer，0.25 μl RNA酶抑制剂(40U/μl)和1 μlMultiScribe™逆转录酶。
(4)反应条件：25℃ 10 min，37℃ 120 min，然后85℃灭活5 min。
2.巢氏PCR
第一轮PCR模板采用上述步骤1逆转录获得的cDNA，第二轮PCR模板采用第一轮PCR产物。
(1)重链可变区(H)巢氏PCR
引物如表2所示。
表2. 重链可变区巢氏PCR引物
抗体重链基因第一轮巢式PCR反应体系为：PrimerSTAR Max Premix(2×) 10 μl；引物混合物：5′引物0.6 μl；3′ Cγ CH1 0.6 μl；模板5 μl；灭菌蒸馏水3.8 μl；总体积20μl。
PCR反应条件：预变性98℃ 2 min；98℃ 10 s，56℃ 5 s，72℃ 10 s，35个循环；终延伸72℃ 5 min。
抗体重链基因第二轮巢式PCR反应体系为：PrimerSTAR Max Premix (2×)10 μl；引物混合物：5′引物0.6 μl；Primer mix：3′引物0.6 μl；模板2 μl；灭菌蒸馏水6.8 μl；总体积20 μl。
PCR反应条件：预变性98℃ 2 min；98℃ 10 s，58℃ 5 s，72℃ 10 s，35个循环；延伸72℃ 5 min。
(2)轻链(kappa，κ)可变区巢氏PCR
引物如表3所示。
表3. 轻链(κ)可变区巢氏PCR引物
抗体轻链(κ)基因第一轮巢式PCR反应体系为：PrimerSTAR Max Premix (2×)10μl；引物混合物：5′引物0.6 μl；3′ Cκ 543 0.6 μl；模板 5 μl；灭菌蒸馏水3.8 μl；总体积20 μl。
PCR反应条件：预变性98℃ 2 min；98℃ 10 s，56℃ 5 s，72℃ 10 s，35个循环；终延伸72℃ 5 min。
抗体轻链(κ)基因第二轮巢式PCR反应体系为：PrimerSTAR Max Premix (2×)10μl；引物混合物：5′引物0.6 μl；引物混合物：3′引物 0.6 μl；模板2 μl；灭菌蒸馏水6.8 μl；总体积20 μl。
PCR反应条件：预变性98℃ 2 min；98℃ 10 s，58℃ 5 s，72℃ 10 s，35个循环；延伸72℃ 5 min。
(3)轻链(Lambda，λ)可变区巢式PCR
引物如表4所示。
表4. 轻链(λ)可变区巢式PCR引物
抗体轻链(λ)基因第一轮巢式PCR反应体系为：PrimerSTAR Max Premix (2×)10μl；引物混合物：5′引物 0.6 μl；3′ Cλ 0.6 μl；模板5 μl；灭菌蒸馏水 3.8 μl；总体积20μl。
PCR反应条件：预变性98℃ 2 min；98℃ 10 s，58℃ 5 s，72℃ 10 s，35个循环；终延伸72℃ 5min。
抗体轻链(λ)基因第二轮巢式PCR反应体系为：PrimerSTAR Max Premix (2×)10μl；引物混合物：5′引物 0.6 μl；3′Cl 0.6 μl；模板2 μl；灭菌蒸馏水6.8 μl；总体积20 μl。
PCR反应条件：预变性98℃ 2 min；98℃ 10 s，60℃ 5 s，72℃ 10 s，35个循环；延伸72℃ 5 min。
结果分析：使用1 %琼脂糖凝胶电泳对最后一轮的PCR产物进行检测，结果如图2所示，其中，每一列为同一个记忆性B细胞进行重链可变区巢氏PCR (IgH)和轻链可变区巢氏PCR (Igκ、Igλ)的PCR产物电泳结果，对大小在300bp~400bp处有阳性片段且重链和轻链配对的PCR产物进行胶回收。
3. PCR产物胶回收纯化
采用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根，DP209)进行PCR产物胶回收纯化。
具体方法如下：
(1)柱平衡步骤：向吸附柱CB2中(吸附柱放入收集管中)加入500 μl平衡液BL，12000 rpm离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
(2)将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下放入干净的离心管中，称取重量。
(3)向胶块中加入等倍体积溶液PC (如果凝胶重为0.1 g，其体积可视为100 µl，则加入100 µl PC溶液)，50℃水浴放置10 min左右，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。
(4)将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB2中(吸附柱放入收集管中)，12000 rpm离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。
(5)向吸附柱CB2中加入600 μl漂洗液PW (已加入无水乙醇)， 12000 rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中；重复操作步骤。
(6)将吸附柱CB2放入收集管中，12000 rpm离心2 min，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底晾干。
(7)将吸附柱CB2放入一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量预热的纯水，室温放置2 min。12000 rpm离心2 min，收集DNA溶液；将收集DNA溶液滴加在吸附膜中上，室温放置2 min；12000 rpm离心2 min，再次收集DNA溶液以提高DNA的回收量。
纯化的DNA片段浓度使用Nanodrop测定其浓度。
四、可变区基因连接载体
1. 将重链和轻链的巨细胞病毒表达载体CMV分别用限制性内切酶双酶切获得酶切产物，反应体系如下：
重链表达载体的双酶切反应体系：CMV-H 1 μl (1 μg)；10×NEBuffer 3 μl；AgeI-HF 1 μl；Sal I-HF 1 μl；去离子水24 μl；总体积30 μl。
轻链(κ)表达载体的双酶切反应体系：CMV-κ 1 μl (1 μg)；10×NEBuffer 3 μl；Age I-HF 1 μl；BsiW I-HF 1 μl；去离子水24 μl；总体积30 μl。
轻链(λ)表达载体的双酶切反应体系：CMV-λ 1 μl (1 μg)；10×NEBuffer 3 μl；Age I-HF 1 μl；Xho I-HF 1 μl；去离子水24 μl；总体积 30 μl。
反应条件：37℃反应20min。
酶切结束后进行琼脂糖凝胶电泳和胶回收纯化，方法同上。
2. 将步骤三中重链和轻链的PCR胶回收产物分别与双酶切的表达载体进行同源重组获得连接产物，反应体系如下：
CMV-H连接产物的反应体系：同源重组试剂(2×) (vazyme，C115) 5 μl；CMV-H酶切产物1 μl (约50 ng)；H链基因片段1 μl (约10 ng)；无核酸酶水3 μl；总体积10 μl。
CMV-κ连接产物的反应体系：同源重组试剂(2×) 5 μl；CMV-κ酶切产物1 μl (约50 ng)；k链基因片段1 μl (约10 ng)；无核酸酶水3 μl；总体积10 μl。
CMV-λ连接产物的反应体系：同源重组试剂(2×) 5 μl；CMV-λ酶切产物 1 μl (约50 ng)；λ链基因片段1 μl (约10 ng)；无核酸酶水3 μl；总体积 10 μl。
分别混匀上述反应液，50℃连接反应20 min获得CMV-H、CMV-κ和CMV-λ连接产物。
3. 连接产物转化感受态细胞DH5α
(1)在冰浴上融化感受态细胞DH5α (100 μl)，分别加入CMV-H、CMV-κ或CMV-λ连接产物10 μl，轻轻混匀，冰上静置30 min。
(2)放入温度为42℃的水浴中热激45 s，迅速转移至冰浴中，静置2 min。
(3)向离心管中加入500 μl不含抗生素的无菌培养基LB，混匀后在温度为37℃、转速为200 rpm的摇床中复苏1 h。
(4)将复苏的菌液均匀涂布到含氨苄霉素的LB培养基上，待菌液吸收后，将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。
4. 接种
挑取上述LB平板中生长的单个菌落，加入至3 ml氨苄抗性的液体LB培养基中，在温度为37℃、转速为220 rpm的摇床中培养6 h~7 h。每个平板挑取2个菌落。
5. 阳性克隆的鉴定
将菌液送生物技术公司进行测序鉴定。
结果如图3所示，获得20对抗体序列，图中A依次为重链可变区胚系基因占比、轻链κ链可变区胚系基因占比和轻链λ链可变区胚系基因占比的统计结果；图中B依次为重链CDR3长度和轻链CDR3长度的统计结果，图中C为重链可变区和轻链可变区的突变统计结果。重链可变区分别来自16个不同的胚系基因，IGHV3-23、IGHV3-7、IGHV4-39和IGHV5-51占比均为10%，其余为5%；与胚系基因相比，重链可变区的突变频率在0%-12.2%之间；互补决定区CDR3 loop的长度分析显示，重链可变区有9aa-22aa。轻链以κ链居多，为13个，λ链为7个，分别以IGKV3-15以及IGLV2-23为主；与胚系基因相比，轻链可变区的突变频率在0%-5.7%之间；互补决定区CDR3 loop的长度分析显示，轻链可变区有8aa-12aa。
上述序列的DNA片段也可通过人工合成制备。
实施例2. 单克隆抗体的制备
一、不同细胞系中的抗体表达
1. 293T细胞系统的抗体表达
将成功配对的抗体重链和轻链基因表达载体瞬时转染293T细胞：
(1)转染前24 h在12孔板中，每孔铺5×105个293T细胞。
(2)转染当天观察细胞的汇合程度，以70%~80%为宜。
(3)各取1 μg通过质粒小提试剂盒(天根，DP103)提取的质粒DNA用60 μl Opti-MEM培养基稀释。
(4)取4 μl Lipofectamine® 2000 Reagent用60 μl Opti-MEM培养基稀释。
(5)将上述稀释的DNA和Lipofectamine® 2000以1：1体积混合获得混合液，室温孵育5 min。
(6)取120 μl混合液轻轻加入293T细胞中，5%CO2 37℃培养。
(7)培养48 h后，收集细胞和上清，12000 rpm离心2 min，收集细胞培养上清和细胞沉淀，细胞培养上清在-20℃保存。取1 ml预冷的PBS加入装有细胞沉淀的离心管中，吹打混匀细胞沉淀，12000 rpm离心2 min，弃上清，洗涤两次，再加入100 μl细胞裂解液(Promega，E1531)，冰浴10 min，12000 rpm离心5 min，收获上清。将细胞培养上清及裂解沉淀后收获的上清分别进行Western印迹检测。
结果如图4所示，多数抗体都能表达且分泌到细胞上清中。
2. 抗体结合活性初筛
将表达的抗体进行结合活性的初筛，过程如下：
(1)包被：将新型冠状病毒野生型RBD蛋白、奥密克戎(Omicron)突变株RBD蛋白、Beta突变株的S1蛋白和Delta突变株的S1蛋白用PBS稀释为0.5 µg/ml，在96孔ELISA板中加入100 µl/孔，4℃包被过夜。
(2)封闭：弃去包被液，每孔加入200 µl封闭液(PBST+3%BSA)，37℃封闭1 h。
(3)洗涤：弃去封闭液，用PBST洗涤3次。
(4)样品：将抗体的表达上清样本2倍和10倍稀释，并加阳性和阴性对照，37℃孵育2 h。
(5)洗涤：弃去样品，用PBST洗涤5次。
(6)二抗：将羊抗人IgG抗体用稀释液(PBST+1%BSA) 1：50000稀释，每孔加100 µl，37℃孵育30 min。
(7)洗涤：弃去样品，用PBST洗涤5次。
(8)显色：每孔加显色液100 µl，室温避光孵育15 min。
(9)终止：每孔加50 µl终止液。
(10)读数：用酶标仪读取450 nm和630 nm处的吸光度，结果为450 nm读数值减去630 nm读数值。
以阴性对照OD450的2.5倍且大于0.1为cut-off值，结果参考图5，稀释倍数在10倍时，总计20个抗体中有10个至少可以结合四种抗原之一。
3. 抗体中和活性初筛
将筛选出的10个具有结合活性的抗体进行中和活性的初筛，具体过程如下：
(1)在96孔细胞培养板中，细胞对照加150 µl GM (DMEM+10%FBS +1%双抗)，样品起始稀释孔加130 µl GM，其余各孔加100 µl GM。
(2)在样品起始稀释孔加入22 µl抗体表达上清，起始稀释度为10，系列3倍稀释，共4个梯度。
(3)充分混匀抗体，取50 µl移入后一列处理孔，依次3倍系列稀释。
(4)解冻新型冠状病毒假病毒，用GM稀释至4000 TCID50/ml ，取50 µl (200TCID50)加入2-12列。
(5) 37℃孵育1 h。
(6)消化Hela-hACE2细胞，用GM重悬，细胞浓度为1.3×105个/ml。
(7)取100 µl细胞悬液(即每1.3×104个细胞)加到细胞板中，37℃ 5 %CO2培养48h。
(8)读数：48 h后弃去细胞培养液，用200 μl PBS清洗一次，拍干；每孔加100 μlBright-LiteTM检测试剂，室温放置2 min后，用酶标仪读板。
(9)计算表达上清的50%抑制浓度(ID50)：抑制率=(V-T)/(V-C)，T为待测抗体的酶标仪读数，C为细胞对照亲和力，V为病毒对照亲和力；通过GraphPad Prism的log(抑制剂)vs. 响应（可变斜率）(log(inhibitor) vs. response -- Variable slope)计算ID50。
结果如图6所示，图6中的A为不同抗体在不同稀释倍数条件下对奥密克戎(Omicron BA.1)突变株的中和率(抑制率)，从图中可以看出，相同浓度条件下10-5B对奥密克戎(Omicron)突变株的中和活性明显高于筛出的其它抗体。图6中的B为抗体10-5B对不同突变株的假病毒的中和活性结果，从中可以看出，10-5B能够有效中和野生型、Alpha、Beta、Delta和Omicron BA.1这5个待测假病毒。
4. 293F细胞系统的抗体表达
将初筛具有中和活性的抗体10-5B转染293F细胞进行大量表达和纯化。
(1)转染前一天，将处在对数生长期且活率高于90%的293F细胞以1.5×106个/ml的密度接种到新鲜培养基中，置于37℃，5% CO2，150 rpm转速恒温摇床中培养(125 ml摇瓶)。
(2)转染当天，取样计数细胞密度和活率。细胞密度为2×106-3×106个/ml，活率高于90%。调整细胞密度至2×106个/ml，每瓶细胞液体积为30 ml。
(3)转染液的配制：用150 mM的NaCl溶液稀释60 µg用无内毒素质粒大提试剂盒(天根，DP117-T)提取的DNA (重链和轻链摩尔比1：1)至总体积为0.75 ml，温和混匀；用150mM的NaCl稀释120 µl Sinofection转染试剂至总体积为0.75 ml，温和混匀；将稀释好的DNA和转染试剂同时单独静置约5分钟后温和混匀，总体积1.5 ml，之后室温静置10分钟获得转染液。
(4)将转染液逐滴加入到步骤(2)获得的细胞液中，滴加的同时轻轻摇动培养瓶，摇匀后放回摇床继续培养。
(5)在转染后第24小时加入体积百分比2% SMS 293-SUPI加料液(SinoBiological, M293-SUPI)，此后每隔48小时添加一次加料液(体积百分比2%)，在转染后5天收样。
结果如图7的A中所示，为293F细胞中表达的抗体的Western印迹结果，从图中可以清楚地看到解链后的重链和轻链。
二、抗体纯化
1. 亲和层析纯化抗体
(1)缓冲液的准备：所用水和缓冲液用0.45 μm滤膜过滤，结合/洗杂缓冲液(0.15M NaCl，20 mM Na2HPO4，pH7.0)，洗脱缓冲液(0.1 M甘氨酸，pH 3.0)，中和液(1 M Tris-HCl，pH 8.5)。
(2)样品准备：细胞上清用0.45 μm滤膜过滤，减少杂质，提高蛋白纯化效率和防止堵塞柱子。
(3)样品纯化
1)将rProtein G Beads (Solarbio，R8300)与收集的细胞上清混合，在摇床上缓慢摇动孵育2 h。
2)在层析柱中装入适量rProtein G Beads，层析用5倍柱体积的结合缓冲液进行平衡。
3)将孵育好的细胞上清加到平衡好的rProtein G Beads中，收集流出液；将流出液加回层析柱中，收集流出液。
4)用10倍柱体积的洗杂缓冲液进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白。
5)使用10倍柱体积的洗脱缓冲液，收集洗脱液，即目的蛋白组分。
6)依次使用3倍柱体积的结合缓冲液和5倍柱体积的去离子水平衡填料，最后再用5倍柱体积的20%的乙醇平衡，然后保存在等体积的20%的乙醇中，置于4℃保存。
7)使用BCA法对纯化抗体进行蛋白定量。定量结果显示，纯化抗体的浓度为1 mg/ml-2 mg/ml。抗体10-5B的浓度为1.34 mg/ml。
8)采用SDS-PAGE对纯化抗体进行电泳检测，结果如图7的B所示，从图中可以看出，亲和层析后的蛋白纯度较高，提示该目标抗体可用于体外活性分析。
单克隆抗体10-5B的序列如下：
重链可变区(VH)的氨基酸序列为：
EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAVSGFTVSRMSWVRQAPGKGLECVSVIYTGGNTDYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTALYYCVRGSGGIHDAFDIWGQGTMVTVSS (SEQ ID No.7)；
其中，VHCDR1为GFTVSR (SEQ ID No.7中第26~31位，即SEQ ID No.1)、VHCDR2为IYTGGNT (SEQ ID No.7中第49~55位，即SEQ ID No.2)；VHCDR3为CVRGSGGIHDAFDI (SEQ IDNo.7中第94-106位，即SEQ ID No.3)；VH的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示。
轻链可变区(VL)的氨基酸序列为：
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISTWLAWYQQKPGKAPKVLINAASGLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAHSFPPTFGPGTKLEIK (SEQ ID No.8)；
其中，VLCDR1为QGISTW (SEQ ID No.8中第27-32位，即SEQ ID No.4)；VLCDR2为AAS (SEQ ID No.8中第50~52位，即SEQ ID No.5)；VLCDR3为QQAHSFPPT (SEQ ID No.8中第89~97位，即SEQ ID No.6)；VL的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示。
重链恒定区(CH)的氨基酸序列为：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID No.11)；
轻链恒定区(CL)的氨基酸序列为：
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID No.12)。
实施例3. 抗体10-5B亲和力和中和活性分析
一、单克隆抗体的亲和力分析
1. BLI检测单克隆抗体10-5B与新型冠状病毒RBD的结合能力
(1)配体偶联：在高通量分子间相互作用仪Octet RED 384上，将生物素标记的10µg/ml野生型RBD蛋白(acrobiosystems，SPD-C82E9)和奥密克戎(Omicron)突变株的RBD蛋白(Sino Biological，40592-V49H7-B)偶联到SA传感器(SARTORIUS，18-0009)上。
(2)将抗体10-5B用PBS以160 nM起2倍系列稀释6个梯度。
(3)按如下表5设置从低浓度到高浓度进样分析。
表5. 低浓度到高浓度进样设置
(4)数据分析：在分析软件中进行如下表6设置，并进行曲线拟合。
表6 分析软件设置
结果如图8所示，图为10-5B在不同浓度时与野生型（WT）RBD蛋白的结合与解离曲线。从图中可以看出，抗体10-5B与野生型RBD亲和力很高，KD为2.68nM。
二、单克隆抗体的中和活性分析
1. 中和试验检测单克隆抗体的中和活性
(1)在96孔细胞培养板中，细胞对照加150 µl GM(DMEM+10%FBS+1%双抗)，其余各孔加100 µl GM。
(2)在样品起始稀释孔中加入抗体，使初始浓度为10 µg/ml，补加GM使总体积为150µl。
(3)充分混匀抗体，取50 µl移入后一列处理孔孔，依次3倍系列稀释。
(4)解冻新型冠状病毒假病毒，用GM稀释至4000 TCID50/ml，取50 µl (200TCID50)加入2-12列。
(5) 37℃孵育1 h。
(6)消化Hela-hACE2细胞，用GM重悬，细胞浓度为1.3×105个/ml。
(7)取100 µl细胞悬液(即每1.3×104个细胞)加到细胞板中，37℃ 5%CO2培养48h。
(8)读数：48 h后弃去细胞培养液，用200 μl PBS清洗一次，拍干；每孔加100 μlBright-LiteTM检测试剂，室温放置2 min后，用酶标仪读板。
(9)计算抗体的50%抑制浓度(IC50)：抑制率=(V-T)/(V-C)，T为待测抗体的酶标仪读数，C为细胞对照亲和力，V为病毒对照亲和力；通过GraphPad Prism的log(抑制剂) vs.响应（可变斜率）计算IC50。
结果如图9和表7所示，从表中可以看出，本申请实施例所提供的抗体10-5B能够高效中和新型冠状病毒的野生型毒株以及13个突变株，IC50均小于0.05 µg/ml。其中，除Beta外的Alpha、Gamma、Delta三种VOC变异株的IC50均在0.02 µg/ml以下，对于Omicron BA.1和BA.2的IC50更是可以达到0.005 µg/ml和0.016 µg/ml。对于新型冠状病毒的野生型和各个突变株的假病毒具有广谱的中和活性。
表7. 抗体10-5B中和活性(IC50，µg/ml)
实施例4. 单克隆抗体10-5B用于抑制新型冠状病毒感染
病毒抑制实验
(1)细胞准备：实验前一天，将Vero细胞以5×103/孔接种到96孔板中。
(2)将50 µl (100 TCID50) SARS-CoV-2 野生型 (IME-BJ01株，Genbank No.MT291831), Beta (CSTR: 16698.06.NPRC2.062100001), Delta (CSTR.16698.06.NPRC6.CCPM-B-V-049-2105-6) 或Omicron (SARS-CoV-2 strain Omicron CoV/human/CHN_CVRI-01/2022)活病毒与等体积不同浓度(2 µg/ml, 1 µg/ml, 0.5 µg/ml, 0.25 µg/ml, 0.125µg/ml, 0.0625 µg/ml, 0.03125 µg/ml, 0.015625 µg/ml)的单抗10-5B在37℃孵育1h。每个稀释度设置三个复孔。细胞对照为培养基，病毒对照为100 TCID50 SARS-CoV-2活病毒。
(3)将步骤(2)的病毒和抗体的混合液分别加入至步骤(1)的Vero细胞中，37℃孵育3天。
(4)通过显微镜观察细胞病变效应，并对病变程度进行评分（-到+++）。
(5)将病变评分转换成抑制百分比，通过GraphPad Prism的log(抑制剂) vs. 响应（可变斜率）计算IC50。
(6)如图10所示，从结果可知，单抗10-5B对SARS-CoV-2活毒株均有很好的中和活性，对WT, Beta, Delta和Omicron BA.1的IC50值分别为 0.031 µg/ml、0.035 µg/ml、0.035µg/ml和0.071 µg/ml。
以上结合实施例对本申请作了详细说明，但是本申请不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本申请宗旨的前提下作出各种修改和变化。此外，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
序列表
<110> 清华大学
深圳湾实验室
<120> 抗新型冠状病毒的广谱中和抗体及其应用
<130> GAI22CN2229
<141>
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Gly Phe Thr Val Ser Arg
1 5
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Ile Tyr Thr Gly Gly Asn Thr
1 5
<210> 3
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Val Arg Gly Ser Gly Gly Ile His Asp Ala Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 4
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Gln Gly Ile Ser Thr Trp
1 5
<210> 5
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Ala Ala Ser
1
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Gln Gln Ala His Ser Phe Pro Pro Thr
1 5
<210> 7
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Val Ser Arg Met
20 25 30
Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Cys Val Ser Val
35 40 45
Ile Tyr Thr Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg
50 55 60
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met
65 70 75 80
Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Val Arg Gly
85 90 95
Ser Gly Gly Ile His Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 8
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 8
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Thr Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile
35 40 45
Asn Ala Ala Ser Gly Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala His Ser Phe Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 9
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gaggtgcagc tggtggagtc cggaggaggc ttgatccagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag tctctgggtt caccgtcagt cgcatgagct gggtccgcca ggctccaggg 120
aaggggctgg agtgtgtctc agttatttat accggtggta acacagacta cgcagactcc 180
gtgaagggcc gattcaccat ctccagagac aattctaaga acaccctgta tcttcaaatg 240
aacagcctga gagccgagga cacggccctg tattattgtg tgagaggatc agggggtatc 300
catgatgctt ttgatatctg gggccaaggg acaatggtca ccgtctcctc a 351
<210> 10
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gacatccaga tgacccagtc tccatcttcc gtgtctgcgt ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgtc gggcgagtca ggggattagc acctggttag cctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaaggtcct gatcaatgct gcatccggtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggttc tggtacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg caacttacta ttgtcaacag gctcacagtt tccccccgac tttcggccct 300
gggaccaagc tggagatcaa a 321
<210> 11
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 11
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 12
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 12
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
Claims (13)
1.一种抗新型冠状病毒的中和抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段具有包含VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3的重链可变区和包含VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3的轻链可变区，并且其中VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID No.1、2和3，且VLCDR1、VLCDR2、VLCDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID No. 4、5和6。
2.如权利要求1所述的抗新型冠状病毒的中和抗体或其抗原结合片段，其中，所述中和抗体选自多特异性抗体和双特异性抗体。
3.如权利要求1所述的抗新型冠状病毒的中和抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗原结合片段选自Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv。
4.如权利要求3所述的抗新型冠状病毒的中和抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗原结合片段是scFv。
5.如权利要求1所述的抗新型冠状病毒的中和抗体或其抗原结合片段，其中：
所述重链可变区的序列是SEQ ID No.7；并且
所述轻链可变区的序列是SEQ ID No.8。
6.一种分离的多核苷酸，该多核苷酸编码权利要求1至5中任一项所述的抗新型冠状病毒的中和抗体或其抗原结合片段。
7. 如权利要求6所述的多核苷酸，其中，编码所述重链可变区的核苷酸序列是SEQ IDNo.9所示的序列，编码轻链可变区的核苷酸序列是SEQ ID No.10所示的序列。
8.一种表达载体，该表达载体包含权利要求6或7所述的多核苷酸。
9.一种重组细胞，该重组细胞包含权利要求6或7所述的多核苷酸，或者包含权利要求8所述的表达载体。
10.一种制备权利要求1至5中任一项所述的抗新型冠状病毒的中和抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括培养权利要求9所述的重组细胞，并且回收得到所述中和抗体或其抗原结合片段。
11.一种药物组合物，该药物组合物包含权利要求1至5中任一项所述的抗新型冠状病毒的中和抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体。
12.一种试剂盒，该试剂盒包含权利要求1至5中任一项所述的抗新型冠状病毒的中和抗体或其抗原结合片段。
13.权利要求1至5中任一项所述的抗新型冠状病毒的中和抗体或其抗原结合片段、权利要求6或7所述的多核苷酸、权利要求8所述的表达载体、权利要求9所述的重组细胞、或权利要求11所述的药物组合物在制备预防和/或治疗新型冠状病毒感染的药物中的应用。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| CN202210447701.4A CN114560930B (zh) | 2022-04-27 | 2022-04-27 | 抗新型冠状病毒的广谱中和抗体及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210447701.4A CN114560930B (zh) | 2022-04-27 | 2022-04-27 | 抗新型冠状病毒的广谱中和抗体及其应用 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114560930A CN114560930A (zh) | 2022-05-31 |
| CN114560930B true CN114560930B (zh) | 2022-09-23 |
Family
ID=81721365
Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
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- 2022-04-27 CN CN202210447701.4A patent/CN114560930B/zh active Active
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