CN108866097A - 一种表达细粒棘球蚴eg95蛋白的重组羊痘病毒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供的转移载体pLSEG‑EG95的TK基因同源臂之间插入了EG95和两个筛选标记基因。所述的EG95基因开放阅读框(ORF)上游为p7.5K启动子，下游为ATTTTTAT早期转录终止信号。所述的转移载体使用了筛选标记eGFP基因，使得后期筛选更为便捷；又由于引入了gpt基因，较大程度降低了亲本病毒的污染，使重组病毒的纯化更为容易。

Description

一种表达细粒棘球蚴EG95蛋白的重组羊痘病毒
技术领域
本发明属于重组病毒疫苗技术领域，具体涉及一种表达细粒棘球蚴EG95蛋白的重组羊痘病毒。
背景技术
细粒棘球蚴病，俗称“包虫病”，是一种人兽共患病，严重危害绵羊、山羊、人等宿主的健康，已经引起了各国对这一公共卫生问题的关注。该病是由细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)的幼虫，细粒棘球蚴引发的一种慢性地方性寄生虫病。细粒棘球绦虫属于扁形动物门、绦虫纲、圆叶目、带科、棘球属。其生活史包括虫卵、六钩蚴、棘球蚴和成虫四个阶段，终末宿主是犬、狼等犬科食肉动物，中间宿主主要是羊、牛等偶蹄兽，人因误食被虫卵污染的水和食物而成为中间宿主。在我国，细粒棘球蚴病主要流行于西部和西北部诸省区，严重阻碍了农牧区经济发展。
绵羊和山羊是该病最主要的中间宿主，其疫苗防疫目前只依赖于EG95蛋白基因工程亚单位疫苗。该蛋白包含156个氨基酸，分子量约为17kD。免疫组化证明，Eg95蛋白位于六钩蚴、育囊生发层和原头蚴以及成虫体被上，可能在六钩蚴钻穿小肠绒毛上皮层的过程中起重要作用。EG95蛋白的重组亚单位疫苗能诱导较高水平的免疫保护，但免疫保护期相对较短，按实际情况需复免多次。因此，开发基于EG95蛋白免疫期更长的新型疫苗就显得尤为重要。
山羊痘病毒活载体疫苗是山羊痘病毒(goatpox virus,GPV)新型疫苗的研究方向。由于山羊痘病毒基因组较大，复制非必需区较多，且具有感染特异性，因此可以在山羊痘病毒基因组内插入多种免疫原基因，使其成为活载体疫苗的理想病毒载体。同时，山羊痘致弱疫苗株本身又能诱导较高水平的羊痘免疫保护，因此接种重组山羊痘活载体疫苗可达到一针防多病的目的。
发明内容
本发明提供一种表达细粒棘球蚴EG95蛋白的重组山羊痘病毒，从而弥补现有技术的不足。
首先，本发明提供一种用于重组山羊痘病毒构建的转移载体(pLSEG-EG95)。所述的转移载体包含有TK基因的左臂(TKL)和右臂(TKR)，EG95基因；增强型绿色荧光蛋白(eGFP)和大肠杆菌gpt两个筛选标记，且该转移载体携带氨苄青霉素抗性基因。
所述的EG95基因开放阅读框(ORF)上游为p7.5K启动子，下游为ATTTTTAT早期转录终止信号；
所述eGFP和gpt两个筛选标记分别受p11K和p7.5K启动子转录调控。
作为一种具体的记载，所述的转移载体pLSEG-EG95，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1：
本发明所提供的山羊痘病毒转移载体用于制备表达细粒棘球蚴EG95蛋白的重组羊痘病毒，其一种制备方法如下：
制备山羊睾丸上皮细胞，培养至80－90％致密单层，接种山羊痘病毒，37℃进行病毒孵育，按照每孔加150uL无血清OPTI-MEM和6μL Lipofectamine 2000的比例配制溶液I，温柔混匀，再按照每孔加入150uL无血清OPTI-MEM和3μg山羊痘病毒转移载体pLSEG-EG95配制溶液II，然后将溶液II逐滴加入溶液I中，温柔混匀，室温放置20min；在此期间，吸弃六孔板内病毒液，每孔加入1mL OPTI-MEM，再逐滴加入孵育后的脂质体-DNA混合液；37℃ 5％CO2培养箱培养6h，吸弃转染液，加入细胞维持液，37℃ 5％CO2培养箱培养72-96h；转染后24h筛选重组羊痘病毒；
构建得到的重组羊痘病毒用于制备疫苗。
本发明提供的pLSEG-EG95的TK基因同源臂之间插入了EG95和筛选标记基因。所述的EG95基因开放阅读框(ORF)上游为p7.5K启动子，下游为ATTTTTAT早期转录终止信号，并使用筛选标记基因eGFP基因和大肠杆菌gpt基因，使得后期筛选更为便捷；又由于引入了gpt基因，较大程度降低了亲本病毒的污染，使重组病毒的纯化更为容易。
其次，本发明提供的pLSEG-EG95转移载体在细胞内，通过TK基因左右同源臂与亲本山羊痘病毒进行同源重组，得到重组山羊痘病毒(GPV-EG95)。通过噬斑纯化和终点稀释法纯化重组病毒，纯化后的病毒提取核酸后，采用特异性PCR方法进行核实。将纯化后的重组病毒接种山羊睾丸细胞，24-48h后，采用Western blot、间接免疫荧光和质谱分析，证明了重组病毒对EG95蛋白的有效表达。
最后，鉴于目前无市售包虫病-羊痘二联疫苗，本发明构建的重组山羊痘病毒能够有效地在体外表达EG95蛋白，因此为将来包虫病-羊痘二联活疫苗的研发奠定基础。
附图说明
图1：重组羊痘病毒构建及检测示意图。a:重组山羊痘病毒转移载体(pLSEG-EG95)模式图；b：pLSEG-EG95与山羊痘AV41株重组模式图；c：三对用于检测重组山羊痘病毒的PCR引物退火位点。
图2：构建及纯化重组羊痘病毒显微图。a：pLSEG-EG95与山羊痘AV41株共转/感染24h后图片；b：只感染山羊痘AV41株24h后图片；c：只转染pLSEG-EG95质粒24h后图片；d：重组病毒第一次盲传后图片；e：重组病毒噬斑纯化的噬斑图片；f：终点滴定法纯化病毒图片。
图3：重组羊痘病毒特性分析及EG95蛋白表达检测图片。A：重组病毒盲传第十代后荧光显微图片；B：重组病毒PCR检测图片；C：重组病毒一步和多步生长曲线；D：重组病毒对EG95蛋白表达的Western blot检测；E：重组病毒对EG95蛋白表达的间接免疫荧光检测。rGPV：重组山羊痘病毒；pGPV：亲本山羊痘病毒。
具体实施方式
本发明利用分子克隆及同源重组技术，构建一种重组山羊痘病毒转移载体(pLSEG-EG95)，利用该重组载体将EG95、eGFP和gpt表达框插入至山羊痘病毒TK基因内，通过eGFP和gpt两个筛选标记，促进重组病毒的筛选，从而纯化出表达EG95蛋白的重组山羊痘病毒。
以下通过实施例来进一步阐明本发明。但是应理解，所述实施例只是举例说明的目的，并不意欲限制本发明的范围和精神。
实施例1.重组山羊痘病毒转移载体的构建
所构建的pLSEG-EG95模式图如图1-a所示。TK基因被外源序列截断为左臂(TKL)和右臂(TKR)，以用于同源重组(重组机制见图1-b)；EG95开放阅读框(ORF)上游为p7.5K启动子，下游为“ATTTTTAT”早期转录终止信号；eGFP和gpt两个筛选标记分别受p11K和p7.5K启动子转录调控。重组载体全长7087bp，氨苄青霉素抗性。
实施例2.GPV-EG95的构建
按常规方法制备山羊睾丸上皮细胞，在六孔细胞培养板中培养至80－90％致密单层，接种山羊痘AV41疫苗株，37℃作用2h。在病毒孵育过程中，按照每孔加入150μL无血清OPTI-MEM和6μL Lipofectamine 2000的比例配制溶液I，温柔混匀，再按照每孔加入150μL无血清OPTI-MEM和3μg pLSEG-EG95配制溶液II，然后将溶液II逐滴加入溶液I中，温柔混匀，室温放置20min。在此期间，吸弃六孔板内病毒液，每孔加入1mL OPTI-MEM，再逐滴加入孵育后的脂质体-pLSEG-EG95混合液。37℃5％CO2培养箱培养6h，吸弃转染液，加入细胞维持液，37℃5％CO2培养箱培养72–96h。转染后24h，便可明显观察到绿色荧光(图2-a)，而只感染病毒(图2-b)和只转染质粒(图2-c)的对照孔无绿色荧光。
实施例3.GPV-EG95的纯化
接种重组病毒前24小时，山羊睾丸细胞用选择培养基(含25μg/mL霉酚酸、250μg/mL黄嘌呤和15μg/mL次黄嘌呤)培养。接种当天，重组病毒细胞液冻融三次后接种山羊睾丸细胞，并用选择培养基置于37℃5％CO2培养箱培养72h后置于荧光显微镜观察。显微镜下可看到少量绿色荧光细胞(图2-d)。
然后将病毒液冻融三次，按10–1至10–5连续稀释度分别接种选择培养基提前预处理的山羊睾丸细胞，37℃5％CO2培养箱培养2h。吸弃病毒液，每孔加入2mL含1％低熔点琼脂糖的选择培养基，继续培养7–10天。荧光显微镜下可观察到绿色荧光噬斑(图2-e)，挑取噬斑在96孔板上采用终点稀释法进一步纯化病毒，收集最高稀释度绿色荧光孔(图2-f)的病毒液，重复进行噬斑纯化和终点稀释纯化3-5次。
实施例4.GPV-EG95纯化的PCR鉴定
将纯化后但未鉴定的重组病毒在山羊睾丸细胞上连续传至第10代，荧光显微镜下仍可见绿色荧光(图3-A)。收集病毒液，提取重组病毒基因组作为PCR模板。分别设计三对特异性鉴别引物(表1)，其退火位点见图1-c。应用表1中的引物进行PCR鉴定，同时设亲本山羊痘病毒为对照。PCR反应体系包含2×PrimeSTAR Max Premix，经历30个反应循环，反应条件为：98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸15s(对应F1/R1和F2/R2引物)或延伸30s(对应F3/R3引物)。PCR检测结果如图3-B，重组病毒的PCR结果与亲本毒完全不同，表明重组病毒已完全纯化。
表1三对用于检测重组山羊痘病毒的PCR引物
实施例5.GPV-EG95的生长曲线测定
在六孔板中，将重组和亲本病毒以10和0.1的MOI值分别感染山羊睾丸细胞。感染后0,24,48,72和96h后收获病毒液进行病毒滴度测定，绘制一步(图3-C-upper，对应MOI＝10)和多步(图3-C-lower，对应MOI＝0.1)生长曲线。虽然重组病毒的TK基因有外源片段的插入，但较亲本毒，不论多步或一步生长曲线，均无显著差异，说明外源基因的插入并未显著改变病毒的增殖特性。
实施例6.GPV-EG95对EG95蛋白的表达
Western blot分析：分别接种重组和亲本病毒于山羊睾丸细胞，24和48h后分别收集感染细胞进行Western blot分析。SDS-PAGE胶浓度为10％，硝酸纤维素膜电转印后，无蛋白封闭液4℃封闭过夜，按1︰1 000比例稀释鼠源EG95蛋白多抗，室温孵育一抗2小时。TBST洗膜三次，每次10分钟。加入HRP标记的兔抗鼠IgG(1︰10 000稀释)，室温孵育1小时。TBST洗膜三次，每次10分钟，最后用增敏二氨基联苯胺(DAB)显色并照相。图3-D所示，纯化的重组病毒对应泳道在约17kD处有三条连续印记带，可能和EG95蛋白表达后不完全修饰有关。而亲本病毒对应泳道则无类似连续印记带。
间接免疫荧光分析：分别接种重组和亲本病毒于山羊睾丸细胞，48h后用预冷的丙酮固定细胞10分钟，PBS洗五次。用无蛋白封闭液37℃封闭1h，PBS洗三次。按1︰400比例稀释鼠源EG95蛋白多抗，37℃孵育一抗1小时，PBS洗三次。最后加入Alexa555标记的驴抗鼠IgG(1︰250稀释)，37℃孵育二抗1小时，PBS洗三次，荧光显微镜下观察。图3-E所示，重组病毒感染的细胞能够明显看到红色荧光，亲本病毒对照则无红色荧光。
蛋白质谱分析：分别接种重组和亲本病毒于山羊睾丸细胞，48h后收集感染细胞进行SDS-PAGE电泳，电泳后切下17kD处的PAGE胶，用于蛋白质谱分析。质谱分析表明，所切下的条带含有EG95特异性肽段，如AVNPSDPLVYKR，HFNLTPVGSQGIR和LSWEVQHLSDLK。
因此，Western blot、间接免疫荧光和质谱分析表明，GPV-EG95可在胞内有效表达EG95蛋白。由于目前无市售商品化包虫病-羊痘二联疫苗，因此本发明为将来制备包虫病-羊痘二联疫苗奠定了基础。
应该理解，尽管参考其示例性实施方案，对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由后附的权利要求所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。
序列表
<110> 中国动物卫生与流行病学中心
<120> 一种表达细粒棘球蚴EG95蛋白的重组羊痘病毒
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 7087
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aagcttttta ttagtgggtt acctaatact atgtactcaa aggaagcact atcattaaat 60
agacaaccga taacatataa atattgtaat gatcttttac aatcaataaa tggatcacag 120
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ttgaattttt tagtgatact agtaagaaat ataaagaaga atatcccatt gttaacataa 4740
acaccataaa gcgttattac gaaataaaag attcaaaaat gacatgtata aattttgaat 4800
cacctataag tgattatgat caagtaaatt atttaaaaga ttacataaat ataagtgatg 4860
attattatct gtatgacgaa ttaattcttg aagacgaaag ggcctcgtga tacgcctatt 4920
tttataggtt aatgtcatga taataatggt ttcttagacg tcaggtggca cttttcgggg 4980
aaatgtgcgc ggaaccccta tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct 5040
catgagacaa taaccctgat aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat 5100
tcaacatttc cgtgtcgccc ttattccctt ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc 5160
tcacccagaa acgctggtga aagtaaaaga tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg 5220
ttacatcgaa ctggatctca acagcggtaa gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg 5280
ttttccaatg atgagcactt ttaaagttct gctatgtggc gcggtattat cccgtgttga 5340
cgccgggcaa gagcaactcg gtcgccgcat acactattct cagaatgact tggttgagta 5400
ctcaccagtc acagaaaagc atcttacgga tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc 5460
tgccataacc atgagtgata acactgcggc caacttactt ctgacaacga tcggaggacc 5520
gaaggagcta accgcttttt tgcacaacat gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg 5580
ggaaccggag ctgaatgaag ccataccaaa cgacgagcgt gacaccacga tgcctgtagc 5640
aatggcaaca acgttgcgca aactattaac tggcgaacta cttactctag cttcccggca 5700
acaattaata gactggatgg aggcggataa agttgcagga ccacttctgc gctcggccct 5760
tccggctggc tggtttattg ctgataaatc tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggtat 5820
cattgcagca ctggggccag atggtaagcc ctcccgtatc gtagttatct acacgacggg 5880
gagtcaggca actatggatg aacgaaatag acagatcgct gagataggtg cctcactgat 5940
taagcattgg taactgtcag accaagttta ctcatatata ctttagattg atttaaaact 6000
tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa gatccttttt gataatctca tgaccaaaat 6060
cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc 6120
ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct 6180
accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg 6240
cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg tagccgtagt taggccacca 6300
cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc 6360
tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga 6420
taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac 6480
gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga 6540
agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag 6600
ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg 6660
acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag 6720
caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca tgttctttcc 6780
tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc tttgagtgag ctgataccgc 6840
tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc gaggaagcgg aagagcgcct 6900
gatgcggtat tttctcctta cgcatctgtg cggtatttca caccgcatac ttggtgtttg 6960
gcttcagcaa caagtacaac tctccattca ccataatcat ctttgacctc tacaattcca 7020
ccatcaggtt tgatgctgga atttgaaaca aataaagtac cgccaagatc agggtcaatt 7080
tttttta 7087

Claims (6)

1.一种用于重组山羊痘病毒构建的转移载体，其特征在于，所述的转移载体包含有TK基因的左臂TKL和右臂TKR，EG95基因；增强型绿色荧光蛋白eGFP和大肠杆菌gpt两个筛选标记基因，且该转移载体携带氨苄青霉素抗性基因。
2.如权利要求1所述的转移载体，其特征在于，所述的EG95基因开放阅读框的上游为p7.5K启动子，下游为ATTTTTAT早期转录终止信号。
3.如权利要求1所述的转移载体，其特征在于，所述的eGFP和gpt筛选标记分别受p11K和p7.5K启动子转录调控。
4.如权利要求1所述的转移载体，其特征在于，所述的转移载体的核苷酸序列为SEQ IDNO:1。
5.权利要求1所述的转移载体在制备表达细粒棘球蚴EG95蛋白的重组羊痘病毒中的应用。
6.一种制备表达细粒棘球蚴EG95蛋白的重组羊痘病毒的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：
制备山羊睾丸上皮细胞，培养至80－90％致密单层，接种山羊痘病毒，37℃进行病毒孵育，按照每孔加150uL无血清OPTI-MEM和6μL Lipofectamine 2000的比例配制溶液I，温柔混匀，再按照每孔加入150uL无血清OPTI-MEM和3μg权利要求1所述的转移载体配制溶液II，然后将溶液II逐滴加入溶液I中，温柔混匀，室温放置20min；在此期间，吸弃六孔板内病毒液，每孔加入1mL OPTI-MEM，再逐滴加入孵育后的脂质体-DNA混合液；37℃5％CO2培养箱培养6h，吸弃转染液，加入细胞维持液，37℃5％CO2培养箱培养72-96h；转染后24h筛选重组羊痘病毒。
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