KR20200037206A

KR20200037206A - 과립상 각막 변성증에 대한 유전자 치료약

Info

Publication number: KR20200037206A
Application number: KR1020207000430A
Authority: KR
Inventors: 도모히코 우스이; 유카코 다케타니; 야스오 오우치
Original assignee: 도꾜 다이가꾸; 고쿠리츠 다이가쿠 호우징 지바 다이가쿠
Priority date: 2017-06-07
Filing date: 2018-06-07
Publication date: 2020-04-08
Also published as: IL271216A; JPWO2018225807A1; CN111065736A; WO2018225807A1; JP7161730B2; EP3636754A1; EP3636754A4; US20200149041A1

Abstract

본 발명은, 과립상 각막 변성증에 관련하는, 트랜스포밍 증식 인자 β 유발(TGFBI) 유전자의 변이 부위를 포함하는 표적 서열과 하이브리다이즈하는 가이드 RNA 분자에 관한 것이다.

Description

과립상 각막 변성증에 대한 유전자 치료약

본 발명은, 과립상 각막 변성증에 대한 유전자 치료약에 관한 것이다.

각막은, 그의 투명성이 시력 유지에 매우 중요하고, 각막이 혼탁하면 시력이 현저하게 저하된다. 각막에 대하여는 각종 유전성 질환이 알려져 있다. 예를 들어, 각막 변성증으로 이환하면, 각막에 흰 침착물이 발생하고, 가령과 함께 점점 혼탁이 많아져, 서서히 앞이 보이지 않게 된다. 각막 변성증 중에서도 일본인에게 가장 빈도가 높은 질환이 과립상 각막 변성증이다. 과립상 각막 변성증으로 이환한 환자에 있어서는, 원래 투명한 각막이 연령과 함께 혼탁이 강해져, 또한 60세 전후에서 상당히 시력이 저하된다.

이러한 각막 혼탁 질환으로서, 상염색체 우성의 유전성 질환인 과립 각막 디스트로피(Granular corneal dystrophy(GCD))가 알려져 있다. GCD는, 염색체 5q31 상에 위치하는 트랜스포밍 증식 인자 β 유발(TGFBI) 유전자에 있어서의 점 돌연 변이에 의해 야기되어, 각막 실질에 복수의 불규칙한 형태의 과립상 불투명성을 초래한다. TGFBI 관련 각 디스트로피의 하나인 과립상 각막 디스트로피 2형(Granular corneal dystrophy type 2(GCD2))은, TGFBI 단백질의 124번째 아미노산의 아르기닌이 히스티딘으로 치환됨으로써 발생한다. 한국에서는 약 870명에 1명이 GCD2로 이환하고 있다고 되어 있고, 그 환자수는 5만명 이상이라고 추정되고 있다.

각막 혼탁 질환의 치료 방법으로서, 각막 이식이나, 불화알콘 가스의 엑시머 레이저(파장 193nm)를 사용한 각막 표층 절제 방법에 의한 각막 혼탁 제거가 알려져 있다. 근년 채용되고 있는 각막 이식에는 크게 나누어, 각막 상피층, 보우만막, 각막 실질층, 데스메층, 각막 내피층의 5층 모두를 이식하는 전체층 각막 이식(Penetrating Keratoplasty(PKP))과, 표면의 3층을 교체하는 심층 층상 각막 이식(Deep Anterior Lamellar Keratoplasty(DALK))의 2가지가 있다. 모두 이식 성적이 우수하였고, 수년에 걸쳐 혼탁을 제거한 상태를 유지할 수 있다는 이점이 있다. 그러나, 침습성이 높고, 이식에 수반하는 합병증이 발생하는 경우가 있고, 재발의 리스크도 있다.

엑시머 레이저에 의한 각막 절제에도 각종 이점이 있고, 예를 들어 각막 이식과 비교하여 비교적 저침습인 것, 반복 수술이 가능한 것, 그리고 각막 이식까지의 기간을 연장할 수 있는 것 등을 들 수 있다. 그러나, 각막이 얇아짐으로써 굴절이 변화되어, 원시화되는 경우가 있다. 또한, 수술 후 불쾌감을 수반하는 경우가 있고, 각막 이식과 동일하게 재발성의 문제도 존재한다.

Mannis MJ and Holland EJ. Cornea-fundamentals, diagnosis and management-Fourth edition, volume1, P781-785, Elsevier

현재, GCD2를 완치할 수 있는 치료 방법은 확립되어 있지 않다. 또한, 각막 이식이나 엑시머 레이저에 의한 각막 절제에는 상술한 바와 같은 개선해야 할 결점이 많이 존재한다.

이러한 사정을 감안하여, 본 발명은, 과립 각막 디스트로피 등의 각막에 있어서의 유전성 질환, 특히 GCD2를 종래보다 더욱 저침습이며, 또한 치료 후에는 증상이 재발하지 않는 신규의 어프로치에 의해 해결하는 것을 과제로 한다.

근본적인 치료를 실현하기 위해서는, TGFBI 단백질의 124번째의 히스티딘에 대응하는 유전자 서열의 변이를 정상적인 유전자 서열로 수복할 필요가 있다(도 1). 종래, 유전자 개변을 행하기 위해서는 유전자 도입 부위에 상동적인 서열을 양단에 포함한 외래 유전자를 세포 내에 도입함으로써, 우발적으로 일어나는 유전자 상동 재조합을 이용하는 방법이 배아 줄기 세포에 대한 발생 공학을 중심으로 행해져 왔지만, 세포의 크로마틴 상태와 DNA의 메틸화 상태에 강하게 영향받는 것이 알려져 있다(Feng Liang, et al., "Studies on the influence of cytosine methylation on DNA recombination and end-joining in mammalian cells., J Biol Chem. 1995 Oct 6; 270(40): 23838-44(http://www.jbc.org/content/270/40/23838.full.pdf)). 이로부터, 일반적으로 크로마틴 구조가 응축된 상태에 있는 분화 후의 체세포에서는, 유전자 상동 재조합을 이용한 유전자 도입은 매우 곤란하고, 사실, 각막 실질 세포에서는 본 방법에 의한 유전자 도입의 보고는 존재하지 않는다.

근년, 징크 핑커 뉴클레아제(ZFN), TALEN, CRISPR/Cas9 등을 이용한 게놈 편집 기술이라 불리는 새로운 유전자 개변 기술의 등장에 의해, 용이하게 표적 유전자 서열을 절단하는 것이 가능해져 왔다. 이들 게놈 편집 툴에 의해 얻어진 게놈DNA의 이중쇄 절단(DSB) 영역은, 비상동성 말단 결합(Non-Homologous End Joining(NHEJ))과 상동성 배향형 수복(HDR)이라는, 2종류의 수복 기능 중 어느 것에 의해 수복되지만, 절단 부위에 상동적인 서열을 갖는 주형 핵산을 세포 내에 도입하고, HDR을 유도함으로써 절단 부위의 유전자 서열을 치환하는 것이 가능하다. HDR 기술은 게놈 상의 특정 서열을 표적으로 하여, 자유롭게 유전자 서열을 편집하는 것을 가능하게 하는 획기적인 기술이다.

그러나, 고효율, 높은 특이성, 또한 재현성이 양호한 게놈 편집 기술을 실현하기 위해서는, 게놈 편집 툴의 고효율로의 세포 내 도입과, 게놈 편집 툴의 정교하며 치밀한 설계가 필요해진다.

특히 RNA 유도형의 게놈 편집 툴인 CRISPR/Cas9는, 일반적으로 사용되고 있는 화농성 연쇄 구균(Streptococcus pyogenes) 유래의 RNA 유도형 뉴클레아제인 Cas9(SpCas9)를 이용한 경우, 가이드 RNA(gRNA)라 불리는 20 염기의 표적 서열의 인식에 필요한 서열을 갖는 약 120 염기 정도의 RNA와 SpCas9 단백질의 복합체를 사용하여 gRNA와 상보적으로 결합한 임의의 DNA 서열을 이중쇄 절단하지만, PAM 서열(스페이서 전(前) 인접 모티프)이라 불리는 NGG의 3 염기가 20 염기의 표적 서열의 직후에 존재하지 않으면 절단은 불가능하다.

또한 SpCas9에 의한 이중쇄 절단은, 이 PAM 서열의 3-4 염기의 상류에서 일어나기 때문에, 절단하고자 하는 부위가 결정되어 있는 경우, 그의 하류에 PAM 서열이 없으면, SpCas9를 사용한 당해 부위의 이중쇄 절단은 불가능해진다. 나아가 gRNA의 염기 서열에 있어서의 GC 함유량은 40-80％의 범위에서, GC 함유율이 높은 쪽이 절단 효율이 양호한 것이 알려져 있다. 또한 오프 타깃 효과에 의한 비특이적인 절단도 보고되어 있으며, 표적 서열에 대하여 3 염기 미스매치까지의 서열이 절단되어버릴 가능성이 있기 때문에, gRNA의 설계 시에는 미스매치가 되는 서열을 가능한 한 저감시킬 필요가 있다.

통상 플라스미드 벡터를 사용한 CRISPR/Cas9 게놈 편집 툴의 세포 내 도입 시에는, gRNA를 발현시키는 프로모터로서 통상 U6 프로모터가 사용된다. 이 U6 프로모터의 전사 개시점은 푸린 염기(G 또는 A)가 아니면 충분한 발현 레벨로 gRNA가 발현되지 않기 때문에, 표적 서열의 설계가 제한된다.

한편, HDR 기술을 사용한 표적 유전자 서열의 편집은, 통상 단일쇄 올리고 DNA(ssODN), 이중쇄 DNA(dsDNA), 플라스미드 등을 HDR 주형 도너로서 사용하여 행해지지만, 그 효율은 매우 효율이 낮고(20％ 이하), 주형 도너의 상동성 아암의 서열 설계도 HDR에서의 게놈 편집을 행하기 위해 중요한 요소가 되는 것이 명백해졌다.

본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 예의 연구를 거듭하였다. 먼저, 게놈 편집 기술로서 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여, 일반적인 설계 방법으로는 불가능했던 변이 TGFBI 유전자를 표적으로 하는 특수한 gRNA를 설계하고, HDR 주형 도너로서 재절단에 의한 영향을 방지하며, 또한 TGFBI 유전자의 정상화와 유전자 수복의 용이한 확인을 실현할 수 있는 전체 길이 100nt의 ssODN을 개발하는 것에 성공하였다. 그 결과, 본 발명자들은, 각막 변성증 환자 유래의 세포 TGFBI 단백질의 124번째에 위치하는 아미노산의 변이에 대하여, 고효율, 높은 특이성, 또한 높은 재현성으로 변이 유전자를 수복하고, 정상적인 TGFBI 아미노산 서열로 수복하는 수단을 발견하여, 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.

즉, 본원 발명은 이하의 발명을 포함한다:

(1) 대상에 있어서의 과립상 각막 변성증을 치료하는 방법으로서,

과립상 각막 변성증에 관련하는 트랜스포밍 증식 인자 β 유발(TGFBI) 유전자의 변이를 수복하기 위해서, 대상의 각막 실질 세포와 Cas9 및 가이드 RNA를 접촉시키는 공정을 포함하는 방법.

(2) TGFBI 유전자의 변이가 점 변이인, (1)에 기재된 방법.

(3) 과립상 각막 변성증이 과립상 각막 디스트로피 2형(GCD2)인, (1) 또는 (2)에 기재된 방법.

(4) 점 변이가 TGFBI 단백질의 124위치에 있어서의 아미노산 치환인, (2)에 기재된 방법.

(5) 아미노산 치환이 R124H, R124C 및 R124L로 이루어지는 군에서 선택되는, (4)에 기재된 방법.

(6) 가이드 RNA가, TGFBI 유전자의 스페이서 전 인접 모티프(PAM) 서열의 상류측에 인접한 22 염기의 서열을 포함하는 표적 서열과 하이브리다이즈할 수 있는 가이드 서열을 포함하는, (1) 내지 (5) 중 어느 한 항에 기재된 방법.

(7) PAM 서열이 CGG를 포함하는, (6)에 기재된 방법.

(8) 가이드 서열이, 표적 서열과 상보적인, 적어도 17 내지 18 염기를 포함하는 영역을 포함하는, (6) 또는 (7)에 기재된 방법.

(9) 가이드 서열이, 아데닌 또는 구아닌으로부터 시작되는 22 염기의 서열을 포함하는, (6) 내지 (8) 중 어느 한 항에 기재된 방법.

(10) 가이드 서열이 서열 번호 1의 염기 서열을 갖는, (9)에 기재된 방법.

(11) 가이드 서열이 trans-activating crRNA(tracr RNA) 서열과 결합되어 있는, (6) 내지 (10) 중 어느 한 항에 기재된 방법.

(12) 가이드 RNA의 발현이 U6 프로모터에 의해 구동되는, (1) 내지 (11) 중 어느 한 항에 기재된 방법.

(13) 가이드 RNA와 U6 프로모터가 동일하거나 또는 상이한 벡터 상에 위치하는, (12)에 기재된 방법.

(14) 가이드 RNA와 U6 프로모터가 동일한 벡터 상에서 작용 가능하게 연결되어 있는, (13)에 기재된 방법.

(15) TGFBI 유전자의 변이의 수정이, Cas9에 의해 절단된 서열의 상동성 배향형 수복(HDR)을 통해 행해지는, (1) 내지 (14) 중 어느 한 항에 기재된 방법.

(16) HDR의 주형 도너로서 단일쇄 올리고 DNA(ssODN)가 사용되는, (15)에 기재된 방법.

(17) ssODN이, 점 변이를 야생형의 아미노산에 상당하는 염기로 치환되는 노크인 서열을 갖는, (16)에 기재된 방법.

(18) 야생형의 아미노산에 상당하는 염기가 CGT 또는 CGC인, (17)에 기재된 방법.

(19) 노크인 서열이 제한 효소 부위를 갖는, (18)에 기재된 방법.

(20) 야생형의 아미노산에 상당하는 염기가 CGT이며, 제한 효소 부위가 BsiWI 부위인, (19)에 기재된 방법.

(21) ssODN이 추가로, 절단 부위의 양단에 상동적인 50 염기의 상동성 아암을 노크인 서열의 양단에 갖는, (17) 내지 (20) 중 어느 한 항에 기재된 방법.

(22) 세포와의 접촉 시에 Cas9와 gRNA가 리보핵 단백질(RNP) 복합체를 형성하고 있는, (1) 내지 (21) 중 어느 한 항에 기재된 방법.

(23) 과립상 각막 변성증에 관련하는, TGFBI 유전자의 변이 부위를 포함하는 표적 서열과 하이브리다이즈하는 가이드 RNA 분자.

(24) TGFBI 유전자의 변이가 점 변이인, (23)에 기재된 가이드 RNA 분자.

(25) 과립상 각막 변성증이 GCD2인, (23) 또는 (24)에 기재된 가이드 RNA 분자.

(26) 점 변이가 TGFBI 단백질의 124위치에 있어서의 아미노산 치환인, (23) 내지 (25) 중 어느 한 항에 기재된 가이드 RNA 분자.

(27) 아미노산 치환이 R124H, R124C 및 R124L로 이루어지는 군에서 선택되는, (26)에 기재된 가이드 RNA 분자.

(28) TGFBI 유전자의 PAM 서열의 상류측에 인접한 22 염기의 서열을 포함하는 표적 서열과 하이브리다이즈할 수 있는 가이드 서열을 포함하는, (23) 내지 (28) 중 어느 한 항에 기재된 가이드 RNA 분자.

(29) PAM 서열이 CGG를 포함하는, (28)에 기재된 가이드 RNA 분자.

(30) 가이드 서열이, 표적 서열과 상보적인, 적어도 17 내지 18 염기를 포함하는 영역을 포함하는, (28) 또는 (29)에 기재된 가이드 RNA 분자.

(31) 가이드 서열이, 아데닌 또는 구아닌으로부터 시작되는 22 염기의 서열을 포함하는, (28) 내지 (30) 중 어느 한 항에 기재된 가이드 RNA 분자.

(32) 가이드 서열이 서열 번호 1의 염기 서열을 갖는, (28) 내지 (31) 중 어느 한 항에 기재된 가이드 RNA 분자.

(33) 가이드 서열이 tracr RNA 서열과 결합되어 있는, (28) 내지 (32) 중 어느 한 항에 기재된 가이드 RNA 분자.

(34) (23) 내지 (33) 중 어느 한 항에 기재된 가이드 RNA 분자를 코딩하는 핵산.

(35) (23) 내지 (33) 중 어느 한 항에 기재된 가이드 RNA 분자를 발현하는 벡터.

(36) 가이드 RNA의 발현이 U6 프로모터에 의해 구동되는, (35)에 기재된 벡터.

(37) 가이드 RNA와 U6 프로모터가 동일하거나 또는 상이한 벡터 상에 위치하는, (36)에 기재된 벡터.

(38) 가이드 RNA와 U6 프로모터가 동일한 벡터 상에서 작용 가능하게 연결되어 있는, (36)에 기재된 벡터.

(39) (35) 내지 (38) 중 어느 한 항에 기재된 벡터와, HDR의 주형 도너로서의 ssODN 분자를 포함하는 키트.

(40) ssODN이, 점 변이를 야생형의 아미노산에 상당하는 염기로 치환되는 노크인 서열을 갖는, (39)에 기재된 키트.

(41) 야생형의 아미노산에 상당하는 염기가 CGT 또는 CGC인, (40)에 기재된 키트.

(42) 노크인 서열이 제한 효소 부위를 갖는, (40) 또는 (41)에 기재된 키트.

(43) 야생형의 아미노산에 상당하는 염기가 CGT이며, 제한 효소 부위가 BsiWI 부위인, (42)에 기재된 키트.

(44) ssODN이 추가로, 절단 부위의 양단에 상동적인 50 염기의 상동성 아암을 노크인 서열의 양단에 갖는, (39) 내지 (43) 중 어느 한 항에 기재된 키트.

(45) ssODN 분자가 서열 번호 2의 염기 서열을 갖는, (39) 내지 (44) 중 어느 한 항에 기재된 키트.

(46) (23) 내지 (33) 중 어느 한 항에 기재된 가이드 RNA 분자와, Cas9 단백질을 포함하는 키트.

(47) 가이드 RNA 분자와 Cas9 단백질이 리보핵 단백질(RNP) 복합체를 형성하고 있는, (46)에 기재된 키트.

(48) 이하 중 어느 하나 이상:

(23) 내지 (33) 중 어느 한 항에 기재된 가이드 RNA 분자;

(34)에 기재된 가이드 RNA 분자를 코딩하는 핵산; 또는

서열 번호 2의 염기 서열을 갖는 HDR의 주형 도너로서의 ssODN 분자

를 포함하는 의약 조성물.

본 발명자들은 특히, 변이된 TGFBI 유전자의 124번째 아미노산에 대응하는 유전자 서열을 절단하기 위해서, 그 절단 부위의 4bp 하류에 존재하는 CGG의 서열을 PAM 서열로서 이용하여, 변이 서열 특이적인 핵산 서열을 갖는 22nt의 gRNA를 개발하였다. 또한 통상, SpCas9에 사용되는 gRNA는 20nt의 길이로 설계되지만, 124번째 아미노산에 대응하는 유전자 서열을 절단하는 경우, PAM 서열의 제약으로부터 gRNA의 전사 개시점의 서열이 T가 되고, gRNA의 발현량과 절단 효율의 저하를 야기하는 문제가 존재한다. 나아가 이 종래의 20nt의 길이로 설계한 gRNA에 대하여는, 3nt 미스매치의 오프 타깃이 되는 표적 서열이 많이 존재하기 때문에, 비특이적인 서열을 절단하는 문제도 생각할 수 있다. 이로부터, 종래 기술에 있어서, CRISPR/Cas9 시스템을 사용하여 당해 유전자 서열을 고효율, 높은 특이성으로 절단하는 것은 불가능하였다.

도 1은 각막 변성증에 있어서의 TGFBI 유전자의 변이예를 야생형과의 비교로 나타낸다(Wild type(야생형)/Wild type: 야생형의 아미노산 서열을 서열 번호 3, 염기 서열을 서열 번호 4로 함; Wild type/R124H: 헤테로 변이형의 아미노산 서열을 서열 번호 5, 염기 서열을 서열 번호 6으로 함). 동 도에서는, TGFBI 유전자의 124번째 아미노산에 대응하는 유전자가 변이되어 있다.
도 2는, hTGFBI R124H gRNA와, BsiWI 부위(C/GTACG)가 도입된 hTGFBI R124H 수복 ssODN의 각 서열과 그 근방의 서열을 나타낸다.
도 3은, 변이 TGFBI 유전자 특이적 CRISPR/Cas9 타깃팅 플라스미드 벡터의 구조를 모식한 도면을 나타낸다.
도 4는, BsiWI를 사용한 PCR-RFLP에 의한 노크인의 확인 결과를 나타낸다.
도 5는, 노크인 후의 서열의 유전자 해석 결과를 나타낸다.
도 6은, 노크인에 의해, 63클론 중 13클론(20.6％)에서 편 대립 유전자의 편집이 확인되고, 26클론(41.3％)에서 양 대립 유전자의 편집이 확인된 결과를 나타낸다.
도 7의 a는, 오프 타깃의 후보가 되는 게놈 서열의 해석 결과를 나타낸다. 도 7의 b는 오프 타깃 후보가 되는 게놈 서열을 나타낸다. 도 7의 c는 오프 타깃 서열에 대하여, PCR법으로 게놈 서열을 증폭하고, T7 엔도누크레아제 I법을 사용하여 해석한 결과를 나타낸다.

(과립상 각막 변성증의 치료 방법)

일 형태에 있어서, 본 발명은, 게놈 편집의 기구를 통해서, TGFBI 유전자의 변이를 수복함으로써 과립상 각막 변성증을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명에 있어서는, 과립상 각막 변성증에 관여하는, 모든 TGFBI 유전자의 변이, 예를 들어 점 변이를 수복하는 것이 의도된다.

과립상 각막 변성증의 하나인 과립상 각막 디스트로피 2형(GCD2)에 있어서는, TGFBI 단백질의 124번째에 위치하는 아르기닌이, 히스티딘 등의 다른 아미노산으로 치환되어 있다. 이러한 R124H의 점 변이 이외에도, GCD2의 원인이 되는 점 변이에는 R124C나 R124L 등이 알려져 있다.

이론적으로는, 게놈 편집 툴을 사용하여, TGFBI 유전자에 있어서의 점 변이에 대응하는 염기 서열의 변이를 정상적인 염기 서열로 치환함으로써, 과립상 각막 변성증을 치료할 수 있다. 그러나, 고효율, 높은 특이성, 또한 재현성이 양호한 게놈 편집 기술을 실현하고, 나아가서는, 과립상 각막 변성증을 확실하게 치료하기 위해서는, 게놈 편집 툴의 고효율로의 세포 내 도입과, 게놈 편집 툴의 정교하며 치밀한 설계가 필요해진다.

게놈 편집 툴 중에서도, 특히 RNA 유도형의 CRISPR/Cas9에 대하여, 일반적으로 사용되고 있는 화농성 연쇄 구균(Streptococcus pyogenes) 유래의 RNA 유도형 뉴클레아제인 Cas9(SpCas9)를 이용한 경우를 예로 들어 설명한다. 이러한 RNA 유도형의 CRISPR/Cas9에서는, 가이드 RNA(gRNA)라 불리는 20 염기의 표적 서열의 인식에 필요한 서열을 갖는 약 120 염기 정도의 RNA와 SpCas9 단백질의 복합체를 사용하여 gRNA와 상보적으로 결합한 임의의 DNA 서열이 이중쇄 절단된다.

본 발명에 있어서는, 과립상 각막 변성증에 관여하는 TGFBI 유전자에 있어서의 표적 서열을 절단하기 위해서, 과립상 각막 변성증으로 이환한 대상으로부터 얻어진 각막 실질 세포와, Cas 단백질 및 gRNA가 접촉된다. Cas 단백질과 gRNA는 따로따로 첨가해도 되지만, 오프 타깃 효과를 억제하기 위해서, 리보핵 단백질(RNP) 복합체의 상태에서 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 사용되는 Cas 단백질은, CRISPR 시스템에 속하는 것이면 한정되지 않지만, Cas9가 바람직하다. Cas9로서는, 예를 들어 화농성 연쇄 구균 유래의 Cas9(SpCas9), 스트렙토코커스·서모필러스(Streptococcus thermophilus) 유래의 Cas9(StCas9) 등을 들 수 있다. 그 중에서도 표적 부위의 절단에는 PAM 서열의 제한이 있기 때문에, 일반적으로 게놈 편집에 사용되는 SpCas9가 바람직하다. 세포 내로의 Cas 단백질 및 gRNA의 송달은, 그들을 코딩하는 벡터를 통해, 당업자에게 공지된 방법, 예를 들어 표준적인 트랜스펙션법, 일렉트로포레이션, 렌티 바이러스의 트랜스덕션 등을 사용할 수 있다. Cas를 발현하기 위한 벡터 및 gRNA를 발현하기 위한 벡터는, 동일한 벡터여도 서로 다른 벡터여도 된다. 또한, 리콤비넌트Cas9 단백질, gRNA의 복합체(RNP, 리보핵 단백질)를 형성시켜, 당업자에게 공지된 방법, 즉, 트랜스펙션법, 일렉트로포레이션 등으로 직접, RNP를 세포 내에 송달할 수도 있다.

각막 실질 세포는, 각막의 투명성을 유지하는 데 중요한 각막 실질층 내에 존재하는 편평한 세포이다. 각각의 세포는 돌기를 갖고, 인접하는 각막 실질 세포와 그 돌기를 통해 접촉하고, 그물눈 형상의 구조를 나타내고 있다. 과립상 각막 변성증의 각막 실질 세포에 있어서는, 변이 TGFBI 단백질이 축적함으로써, 투명성이 장해된다. 각막 실질 세포는, 심층 층상 각막 이식 등의 외과 처치 시에, 각막 상피를 제거 후, 간질로부터 채취하고, 콜라게나아제 처리를 실시함으로써 얻을 수 있다.

피험자의 각막 실질 세포로의 유전자 도입은, 당업자에게 공지된 방법, 예를 들어 표준적인 트랜스펙션법, 일렉트로포레이션법, 아데노 수반 바이러스 등의 바이러스 벡터를 사용한 방법을 이용한다. 각막은 Naked DNA delivery법에 의해, 특수한 도입 시약을 사용하지 않고 DNA를 세포 내 도입할 수 있는 일을 할 수 있는 조직이며, DNA의 직접 주입에 의한 세포 내 전달도 가능하다(Brain Res Bull. 2010 Feb 15; 81(2-3): 256-261). 또한, 리콤비넌트 Cas9 단백질과 gRNA의 복합체를 형성시킨 후에, 당업자에게 공지된 방법, 즉, 트랜스펙션법, 일렉트로포레이션법을 사용함으로써 세포 내에 송달한다.

대상은, 인간, 원숭이, 히말라야 원숭이, 명주 원숭이, 오랑우탄, 침팬지 등의 영장류에 한정되지 않고, 예를 들어 마우스, 래트, 햄스터, 모르모트 등의 설치류나 토끼 등의 실험 동물, 돼지, 소, 염소, 양 등의 우제류, 말 등의 기제류, 개, 고양이 등의 애완 동물이 의도된다. 그러나, 대상은 인간 각막 변성증 환자인 것이 바람직하다.

DNA 절단 효소인 Cas9는, DNA 엔도누크레아제로서 기능하고, 표적 DNA가 존재하는 부위에서 DNA를 절단할 수 있다. gRNA는, 그의 5' 말단에 표적 DNA에 상보적인 서열을 갖고, 해당 상보적인 서열을 통해 표적 DNA에 결합함으로써, Cas9를 표적 DNA로 유도하는 기능을 갖는다. 또한, Cas9 단백질과 gRNA는, 실온 조건 하에 10분 정도로 복합체를 형성하고, 즉시 표적 DNA의 절단능을 발휘한다.

고효율로 표적 서열의 이중쇄 절단을 행하기 위해서는, gRNA의 설계가 중요해진다. 예를 들어, PAM 서열(스페이서 전 인접 모티프)이라 불리는 NGG의 3 염기가 20 염기의 표적 서열의 직후에 존재할 필요가 있다. 또한 SpCas9에 의한 이중쇄 절단은, 이 PAM 서열의 3-4 염기의 상류에서 일어나기 때문에, 절단하고자 하는 부위가 결정되어 있는 경우, 그의 하류에 PAM 서열이 없으면, SpCas9를 사용한 당해 부위의 이중쇄 절단은 불가능해진다. 절단해야 할 개소가 TGFBI 유전자의 124번째 아미노산에 대응하는 유전자 서열인 경우, 그 유전자 서열의 4 염기 하류에 존재하는 CGG의 서열을 PAM 서열로서 이용할 수 있다.

gRNA를 설계함에 있어서, 당업자는, 염기 서열에 있어서의 GC 함유량을 40-80％의 범위로부터 적절히 선택할 수 있다. 절단 효율을 향상시키는 관점에서는, GC 함유율이 높은 쪽이 바람직하고, 예를 들어 50％ 이상인 것이 바람직하다.

gRNA는 또한, 오프 타깃 효과에 의한 비특이적인 절단을 최대한 줄이도록 설계된다. 예를 들어, 염기 길이는 통상 채용되는 20 염기로 해도 되지만, 오프 타깃 후보가 다수 발견되는 경우가 있다. 이 경우, 염기 길이를 22로 증대함으로써, 오프 타깃이 되는 서열을 대폭 저감시켜, 3 염기 미스매치까지의 오프 타깃 서열이 인간 게놈 상에 존재하지 않는다는, 높은 특이성을 갖는 gRNA를 제공할 수 있다.

충분한 양의 gRNA를 발현시키기 위해서는, 그의 구동에 적절한 프로모터를 선택할 필요가 있다. 이러한 프로모터로서, 통상 RNA 폴리메라제 III 의존형의 U6 프로모터 또는 T7 프로모터 등이 사용되지만, 사용하는 프로모터에 따라서 gRNA를 설계할 필요도 있다. 예를 들어, U6 프로모터를 사용하는 경우, 전사 개시점은 푸린 염기(G 또는 A)가 아니면 충분한 발현 레벨로 gRNA가 발현되지 않기 때문에, U6 프로모터의 존재 하에서 gRNA를 발현시키는 경우, gRNA는 아데닌 또는 구아닌으로부터 시작되는 염기 서열로 하는 것이 바람직하다.

gRNA는 통상, 적절한 프로모터와 함께, 1개 또는 복수의 플라스미드 벡터에 배치된 상태에서 세포 내에 도입될 수 있다. 이 경우, 가이드 RNA와 프로모터는 동일한 벡터 상에서 작용 가능하게 연결되어 있어도 되고, 또는 다른 벡터 상에 존재하고 있어도 된다.

가이드 서열은, 표적 서열과 하이브리다이즈할 수 있도록, 표적 서열과 상보적인, 적어도 17 내지 18 염기를 포함하는 영역을 포함하도록 설계된다. 본 명세서에 있어서, 표적 서열이란 TGFBI 유전자의 변이 부위를 포함하는 영역, 예를 들어 PAM 서열의 상류측에 인접한 22 염기의 서열을 의미한다.

보다 바람직한 양태에 있어서, gRNA는 서열 번호 1의 염기 서열:

5'-acucagcuguacacggaccaca-3'를 갖도록 설계된다. 이러한 gRNA는 화학적으로 합성할 수 있다.

Cas 단백질을 리크루트하기 위해서, gRNA를 추가로 trans-activating crRNA(tracr RNA) 서열과 결합해도 된다.

변이 부위를 포함하는 표적 서열의 이중쇄를 절단한 후, 절단 개소에 정상 서열을 포함하는 도너 DNA를 노크인함으로써 변이 부위를 수복할 수 있다. 도너 DNA는 Cas9 mRNA 및 gRNA와 동시에 세포 내에 도입할 수 있다. 이중쇄 절단(DSB) 형성 시에 도너가 존재함으로써, 상동성 배향형 수복(HDR)이 가능해진다.

각종 노크인의 방법이 존재하지만, 수정 정밀도가 높은 상동 재조합(HR)을 통한 노크인이 바람직하다. 정상 서열을 코딩하는 도너 DNA 존재 하에서 상동 재조합을 행함으로써, 변이 부위를 포함하는 염색체 상의 유전적 정보가 도너 유래의 신규 정보로 치환된다. 도너 DNA는, ssODN, dsDNA 또는 플라스미드의 어느 것이어도 되지만, R124H와 같은 1 염기 다형을 치환하는 경우, 정상 서열을 포함하는 ssODN을 이용하여 변이 개소를 수복하는 것이 바람직하다.

점 변이를 수복하기 위한 도너 DNA는, 1) 점 변이를 야생형의 아미노산에 상당하는 염기로 치환되는 노크인 서열과, 2) 치환되어야 할 서열의 양단에 인접하는 서열과 동일한 「왼팔」과 「오른팔」의 상동성 아암을 갖는다. 상동성 아암의 염기 길이는 50 염기 정도가 바람직하지만, 40전후 또는 60전후의 길이의 염기 길이를 배제하는 것을 의도하지 않고, 당업자는 상동성 아암의 길이를 적절히 변경할 수 있다.

임의로, 도너 DNA는 추가로 제한 효소 부위를 갖는다. 도너 DNA 중에 제한 효소 부위를 마련함으로써, 유전자 개변 효율의 확인을 간편화할 수 있다. TGFBI 단백질의 124번째에 위치하는 점 변이를 수복하는 경우를 예로 설명하면, 야생형의 아미노산에 상당하는 염기는 CGC이지만, 예를 들어 CGC 대신에 CGT를 노크인 서열에 포함함으로써, 제한 효소 부위로서의 BsiWI 부위(C/GTACG)의 도입이 가능해진다.

제한 효소 부위 이외의 필요한 서열, 예를 들어 리포터 유전자나 약제 내성 유전자를 도너 DNA 중에 삽입해도 된다. 예를 들어, 정상 서열의 C 말단에 리포터 유전자를 인프레임으로 연결시키면, 정상 서열의 검출이 용이해진다. 리포터 유전자로서는, 녹색 형광 단백질(GFP), 인간화 레닐라 녹색 형광 단백질(hrGFP), 증강 녹색 형광 단백질(eGFP) 등의 형광 단백질을 코딩하는 유전자나, 반디 루시페라아제, 레닐라 루시페라아제 등의 생물 발광 단백질을 코딩하는 유전자 등을 들 수 있다.

서열 번호 2로 표시되는 ssODN은, 제한 효소 부위로서의 BsiWI부와 각 아암이 50 염기의 상동성 아암을 갖고 있으며, 상동성 재조합 수복 HDR 주형 도너로서 재절단에 의한 영향을 방지하고, 또한 TGFBI 유전자의 정상화와 유전자 수복의 용이한 확인을 실현할 수 있다.

(가이드 RNA 및 그의 용도)

일 형태에 있어서, 본 발명은 또한, TGFBI 유전자의 변이 부위를 포함하는 표적 서열과 하이브리다이즈하는 가이드 RNA 분자 및/또는 그것을 코딩하는 핵산, 또는 그들의 용도를 제공한다. 가이드 RNA 분자가 갖는 가이드 서열 등의 상세한 것은 전술한 바와 같다.

다른 양태에 있어서, 본 발명은, 가이드 RNA 분자를 코딩하는 핵산 등을 포함하는 벡터를 제공한다. 본 발명에 의해 제공되는 벡터는, 환상의 벡터여도 되고, 직쇄상의 벡터여도 된다. 바람직하게는, 본 발명에 의해 제공되는 벡터는 환상 벡터이다. 본 발명의 벡터로서는, 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 바이러스 벡터, 인공 염색체 벡터 등을 들 수 있다. 인공 염색체 벡터로서는, 효모 인공 염색체 벡터(YAC), 세균 인공 염색체 벡터(BAC), P1 인공 염색체 벡터(PAC), 마우스 인공 염색체 벡터(MAC), 인간 인공 염색체 벡터(HAC)를 들 수 있다.

가이드 RNA를 코딩하는 벡터와, Cas 엔도누크레아제를 발현하기 위한 벡터는, 동일한 벡터여도 서로 다른 벡터여도 된다. 또한, 이들 벡터와 ssODN 등의 도너 DNA를 코딩하는 벡터도, 동일해도 상이해도 된다.

일 형태에 있어서, 본 발명은, 상기 가이드 RNA 분자 혹은 그것을 코딩하는 핵산, 및/또는 주형 도너 분자(예를 들어 ssODN) 혹은 그것을 코딩하는 핵산을 코딩하는 1개 또는 복수의 벡터를 포함하는 키트를 제공한다. 본 발명의 키트는 과립상 각막 변성증을 치료하기 위해 적합하게 사용할 수 있다. 또한, 변이 TGFBI 유전자에 대하여 게놈 편집을 행한 후에, 당해 서열을 포함하는 영역을 PCR 등으로 증폭하고, HDR에서 유전자 도입한 BsiWI 제한 효소 절단 서열을 이용하여 BsiWI에 의한 소화를 행함으로써, 수복한 TGFBI 유전자의 검출에 의한 진단 기술에도 이용이 가능하다.

다른 양태에 있어서, 본 발명은, 상기 가이드 RNA 분자 혹은 그것을 코딩하는 핵산, 및/또는 주형 도너 분자(예를 들어 ssODN) 혹은 그것을 코딩하는 핵산을 포함하는 의약 조성물을 제공한다. 본 발명의 의약 조성물은 과립상 각막 변성증을 치료하기 위해 적합하게 사용할 수 있다.

이하에 실시예, 비교예를 들어, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다.

실시예

상술한 바와 같은 gRNA의 설계 상의 유의점을 고려하여, 본건 특허 발명의 gRNA를 설계하였다(서열 번호 1). 예를 들어, 염기 길이를 통상 채용되는 20 염기로 하면, 오프 타깃 후보가 다수 발견되기 때문에, 염기 길이를 22로 증대하여 오프 타깃이 되는 서열을 대폭 저감시켰다. 서열 번호 1의 gRNA는 GC 함유율이 50％ 이상으로 되어 있으며, spCas9와 복합체를 형성하고, 표적 서열을 절단하기 위해 이상적인 값으로 되어 있다.

또한, HDR 주형 도너로서, 절단 영역에 대하여 상동적인 50bp의 상동성 아암을 양단에 갖는 ssODN(5'-GAGACCCTGGGAGTCGTTGGATCCACCACCACTCAGCTGTACACGGACCGTACGGAGAAGCTGAGGCCTGAGATGGAGGGGCCCGGCAGCTTCACCATCT-3'(서열 번호 2))을 설계하였다. 또한 본 HDR 주형 도너는, TGFBI 유전자 변이 부위에 도입하는 염기 서열을 야생형 TGFBI의 아르기닌(CGC)과는 다른 코돈(CGT)을 도입할 수 있도록 설계되어 있어, 유전자 서열의 정상화, 유전자 개변 효율의 확인 간편화(BsiWI 제한 효소 사이트의 도입), 유전자 서열 정상화 후의 재절단의 방지를 가능하게 하였다(도 2).

변이 TGFBI 유전자 특이적 gRNA의 서열(서열 번호 1)을, gRNA와 SpCas9-2A-GFP 유전자의 동시 발현을 가능하게 하는 pX458 벡터(Addgene사제: 카탈로그 번호 48138)에 도입하고, 변이 TGFBI 유전자 특이적 CRISPR/Cas9 타깃팅 플라스미드 벡터를 제작하였다(도 3). 플라스미드의 DNA 염기 서열을 서열 번호 7로 하고, 하기 가이드 RNA의 RNA 염기 서열을 서열 번호로 한다.

pX458-hTGFBI(R124H)gRNA, RNA 염기 서열(전체 길이):

5-ACUCAGCUGUACACGGACCACAguuuuagagcuaGAAAuagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu-3'

계속해서, 상기 플라스미드 벡터를 인간 각막 변성증 환자 유래 각막 실질 세포에 대하여, ssODN HDR 주형 도너(서열 번호 2)와 함께 모두 유전자 도입을 행하고, 1주일 후 유전자 도입 세포를 GFP 유전자의 발현을 지표로 세포 분리하였다. 얻어진 세포를 배양하여 증폭 후, 게놈 편집 효율의 확인을 RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism, 제한 효소 단편 길이 다형)법 및 유전자 서열의 해석을 행함으로써 확인하였다.

그 결과, 변이 TGFBI 유전자 특이적 CRISPR/Cas9 타깃팅 플라스미드 벡터 및 HDR 주형 ssODN을 도입함으로써, 인간 각막 변성증 환자 유래 각막 실질 세포에 있어서의 TGFBI 유전자의 변이를 정상적인 서열로 수복하는 것에 성공하였다(도 4, 5).

TGFBI 유전자 R124H 변이 부위에 대응하는 유전자 서열을 PCR로 증폭하고, RFLP법, 유전자 서열 해석을 행함으로써, 게놈 편집 효율의 확인을 행하였다. TGFBI 변이 부위의 PCR에 의한 유전자 서열 해석에 사용한 PCR 프라이머 서열을 이하에 나타낸다.

포워드: 5'-GTTGAGTTCACGTAGACAGGC-3'(서열 번호 9)

리버스: 5'-GACTCCCATTCATCATGCCCA-3'(서열 번호 10)

그 결과, 컨트롤의 TGFBI 야생형 각막 실질 세포에서는 461bp의 밴드가 검출된 것에 비해, 게놈 편집을 행한 인간 각막 변성증 환자 유래 각막 실질 세포에서는, 게놈 편집에 의해 BsiWI 제한 효소 사이트가 도입되어, BsiWI로 소화함으로써, 288bp와 173bp의 밴드에서 절단되었다. 유전자 도입 세포 전체 89클론에 대하여, 본 해석을 행한 바, 63클론 중 13클론(20.6％)에서 편 대립 유전자의 편집이 확인되고, 26클론(41.3％)에서 양 대립 유전자의 편집이 확인되었다. 이 결과로부터, 본 발명을 이용함으로써, 합계 61.9％라는 매우 높은 게놈 편집 효율로, 인간 각막 변성증 환자 유래 각막 실질 세포에 있어서의 TGFBI 유전자의 변이를 정상적으로 수복할 수 있는 것을 알 수 있다(도 6).

나아가 본 발명에 의해, 종래 기술에서 설계한 gRNA보다도 오프 타깃이 되는 서열 후보의 수를 감소시킬 수 있었다. 일반적으로 gRNA는 그의 표적 서열에 대하여 3 염기 다른 서열에 대하여는 절단 활성을 갖지 않게 되는 것이 보고되어 있지만(Nature Biotechnology 31, 822-826(2013)), 설계한 gRNA에 대하여 오프 타깃 서열의 해석을 행한 결과, 설계한 gRNA에 대한 1 내지 3 염기 미스매치의 서열은 존재하지 않는 것이 명백해졌다(도 7의 a). 한편, 3군데의 염색체 영역 내에 (염색체 20번 24871179-24871203, 2번 98321072-98321097, 8번 1150445-1150469)에 4, 5 염기 미스매치의 서열이 확인되었다(도 7의 a, b). 당해 서열을 포함하는 게놈 영역을 PCR로 증폭하여, 일반적인 T7 엔도누크레아제 I법으로 해석을 행하였다.

Off target(오프 타깃) 해석에 사용한 PCR 프라이머 일식을 이하에 나타낸다.

OTS1

5'-ATGTCAGAAGTCCCGCTGTG-3'(서열 번호 11)

5'-TGATGGGGTCAGAGGGCATA-3'(서열 번호 12)

OTS2

5'-CTTCCTGCTCTGTGTTTAGCCA-3'(서열 번호 13)

5'-ACCTCCAAGTTGAGCAGTGTC-3'(서열 번호 14)

OTS3

5'-GCAGCAAAGCACTCAAGAGG-3'(서열 번호 15)

5'-CAAACTTCTGCCTGGGCATC-3'(서열 번호 16)

T7 엔도누크레아제 I는 오프 타깃 절단으로 유래의 PCR 증폭 부산물과 야생형 산물의 이중쇄의 미스매치를 인식하여, 헤테로 이중쇄의 미스매치 부분을 절단한다. 그 결과, 모든 PCR산물에 있어서, T7 엔도누크레아제 I에 의한 절단은 검출되지 않았다. 즉, 어느 서열에 대해서도 오프 타깃 효과에 의한 비특이적인 절단은 확인되지 않았다(도 7의 c)

상기 결과로부터 이 점에서 본 발명에 따른 변이 TGFBI 유전자 특이적 gRNA는, 실제로 오프 타깃 효과에 의한 절단을 저감할 수 있는 것이 시사되었다.

SEQUENCE LISTING <110> The University of Tokyo Chiba University <120> Gene Therapeutic Agent for Granular Corneal Dystrophy <130> T0529AJP0006 <150> JP 2017-112406 <151> 2017-06-07 <160> 16 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA <400> 1 acucagcugu acacggacca ca 22 <210> 2 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssODN <400> 2 gagaccctgg gagtcgttgg atccaccacc actcagctgt acacggaccg tacggagaag 60 ctgaggcctg agatggaggg gcccggcagc ttcaccatct 100 <210> 3 <211> 683 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Ala Leu Phe Val Arg Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu 1 5 10 15 Gly Pro Ala Ala Thr Leu Ala Gly Pro Ala Lys Ser Pro Tyr Gln Leu 20 25 30 Val Leu Gln His Ser Arg Leu Arg Gly Arg Gln His Gly Pro Asn Val 35 40 45 Cys Ala Val Gln Lys Val Ile Gly Thr Asn Arg Lys Tyr Phe Thr Asn 50 55 60 Cys Lys Gln Trp Tyr Gln Arg Lys Ile Cys Gly Lys Ser Thr Val Ile 65 70 75 80 Ser Tyr Glu Cys Cys Pro Gly Tyr Glu Lys Val Pro Gly Glu Lys Gly 85 90 95 Cys Pro Ala Ala Leu Pro Leu Ser Asn Leu Tyr Glu Thr Leu Gly Val 100 105 110 Val Gly Ser Thr Thr Thr Gln Leu Tyr Thr Asp Arg Thr Glu Lys Leu 115 120 125 Arg Pro Glu Met Glu Gly Pro Gly Ser Phe Thr Ile Phe Ala Pro Ser 130 135 140 Asn Glu Ala Trp Ala Ser Leu Pro Ala Glu Val Leu Asp Ser Leu Val 145 150 155 160 Ser Asn Val Asn Ile Glu Leu Leu Asn Ala Leu Arg Tyr His Met Val 165 170 175 Gly Arg Arg Val Leu Thr Asp Glu Leu Lys His Gly Met Thr Leu Thr 180 185 190 Ser Met Tyr Gln Asn Ser Asn Ile Gln Ile His His Tyr Pro Asn Gly 195 200 205 Ile Val Thr Val Asn Cys Ala Arg Leu Leu Lys Ala Asp His His Ala 210 215 220 Thr Asn Gly Val Val His Leu Ile Asp Lys Val Ile Ser Thr Ile Thr 225 230 235 240 Asn Asn Ile Gln Gln Ile Ile Glu Ile Glu Asp Thr Phe Glu Thr Leu 245 250 255 Arg Ala Ala Val Ala Ala Ser Gly Leu Asn Thr Met Leu Glu Gly Asn 260 265 270 Gly Gln Tyr Thr Leu Leu Ala Pro Thr Asn Glu Ala Phe Glu Lys Ile 275 280 285 Pro Ser Glu Thr Leu Asn Arg Ile Leu Gly Asp Pro Glu Ala Leu Arg 290 295 300 Asp Leu Leu Asn Asn His Ile Leu Lys Ser Ala Met Cys Ala Glu Ala 305 310 315 320 Ile Val Ala Gly Leu Ser Val Glu Thr Leu Glu Gly Thr Thr Leu Glu 325 330 335 Val Gly Cys Ser Gly Asp Met Leu Thr Ile Asn Gly Lys Ala Ile Ile 340 345 350 Ser Asn Lys Asp Ile Leu Ala Thr Asn Gly Val Ile His Tyr Ile Asp 355 360 365 Glu Leu Leu Ile Pro Asp Ser Ala Lys Thr Leu Phe Glu Leu Ala Ala 370 375 380 Glu Ser Asp Val Ser Thr Ala Ile Asp Leu Phe Arg Gln Ala Gly Leu 385 390 395 400 Gly Asn His Leu Ser Gly Ser Glu Arg Leu Thr Leu Leu Ala Pro Leu 405 410 415 Asn Ser Val Phe Lys Asp Gly Thr Pro Pro Ile Asp Ala His Thr Arg 420 425 430 Asn Leu Leu Arg Asn His Ile Ile Lys Asp Gln Leu Ala Ser Lys Tyr 435 440 445 Leu Tyr His Gly Gln Thr Leu Glu Thr Leu Gly Gly Lys Lys Leu Arg 450 455 460 Val Phe Val Tyr Arg Asn Ser Leu Cys Ile Glu Asn Ser Cys Ile Ala 465 470 475 480 Ala His Asp Lys Arg Gly Arg Tyr Gly Thr Leu Phe Thr Met Asp Arg 485 490 495 Val Leu Thr Pro Pro Met Gly Thr Val Met Asp Val Leu Lys Gly Asp 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tgcagcacag caggctccgg 120 ggccgccagc acggccccaa cgtgtgtgct gtgcagaagg ttattggcac taataggaag 180 tacttcacca actgcaagca gtggtaccaa aggaaaatct gtggcaaatc aacagtcatc 240 agctacgagt gctgtcctgg atatgaaaag gtccctgggg agaagggctg tccagcagcc 300 ctaccactct caaaccttta cgagaccctg ggagtcgttg gatccaccac cactcagctg 360 tacacggacc gcacggagaa gctgaggcct gagatggagg ggcccggcag cttcaccatc 420 ttcgccccta gcaacgaggc ctgggcctcc ttgccagctg aagtgctgga ctccctggtc 480 agcaatgtca acattgagct gctcaatgcc ctccgctacc atatggtggg caggcgagtc 540 ctgactgatg agctgaaaca cggcatgacc ctcacctcta tgtaccagaa ttccaacatc 600 cagatccacc actatcctaa tgggattgta actgtgaact gtgcccggct gctgaaagcc 660 gaccaccatg caaccaacgg ggtggtgcac ctcatcgata aggtcatctc caccatcacc 720 aacaacatcc agcagatcat tgagatcgag gacacctttg agacccttcg ggctgctgtg 780 gctgcatcag ggctcaacac gatgcttgaa ggtaacggcc agtacacgct tttggccccg 840 accaatgagg ccttcgagaa gatccctagt gagactttga accgtatcct gggcgaccca 900 gaagccctga gagacctgct gaacaaccac atcttgaagt cagctatgtg 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ggaagtcagc 1800 ttgaaaaaca atgtggtgag tgtcaacaag gagcctgttg ccgagcctga catcatggcc 1860 acaaatggcg tggtccatgt catcaccaat gttctgcagc ctccagccaa cagacctcag 1920 gaaagagggg atgaacttgc agactctgcg cttgagatct tcaaacaagc atcagcgttt 1980 tccagggctt cccagaggtc tgtgcgacta gcccctgtct atcaaaagtt attagagagg 2040 atgaagcatt ag 2052 <210> 5 <211> 683 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Ala Leu Phe Val Arg Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu 1 5 10 15 Gly Pro Ala Ala Thr Leu Ala Gly Pro Ala Lys Ser Pro Tyr Gln Leu 20 25 30 Val Leu Gln His Ser Arg Leu Arg Gly Arg Gln His Gly Pro Asn Val 35 40 45 Cys Ala Val Gln Lys Val Ile Gly Thr Asn Arg Lys Tyr Phe Thr Asn 50 55 60 Cys Lys Gln Trp Tyr Gln Arg Lys Ile Cys Gly Lys Ser Thr Val Ile 65 70 75 80 Ser Tyr Glu Cys Cys Pro Gly Tyr Glu Lys Val Pro Gly Glu Lys Gly 85 90 95 Cys Pro Ala Ala Leu Pro Leu Ser Asn Leu Tyr Glu Thr Leu Gly Val 100 105 110 Val Gly Ser Thr Thr Thr Gln Leu Tyr Thr Asp His Thr Glu Lys Leu 115 120 125 Arg Pro Glu Met Glu Gly Pro Gly 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gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag 9120 ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg 9180 acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag 9240 caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca tgt 9293 <210> 8 <211> 102 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pX458-hTGFBI(R124H)gRNA <400> 8 acucagcugu acacggacca caguuuuaga gcuagaaaua gcaaguuaaa auaaggcuag 60 uccguuauca acuugaaaaa guggcaccga gucggugcuu uu 102 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 9 gttgagttca cgtagacagg c 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 10 gactcccatt catcatgccc a 21 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OTS1 primer <400> 11 atgtcagaag tcccgctgtg 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OTS1 primer <400> 12 tgatggggtc agagggcata 20 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OTS2 primer <400> 13 cttcctgctc tgtgtttagc ca 22 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OTS2 primer <400> 14 acctccaagt tgagcagtgt c 21 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OTS3 primer <400> 15 gcagcaaagc actcaagagg 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OTS3 primer <400> 16 caaacttctg cctgggcatc 20

Claims

과립상 각막 변성증에 관련하는, 트랜스포밍 증식 인자 β 유발(TGFBI) 유전자의 변이 부위를 포함하는 표적 서열과 하이브리다이즈하는 가이드 RNA 분자.
제1항에 있어서, TGFBI 유전자의 변이가 점 변이인 가이드 RNA 분자.
제2항에 있어서, 점 변이가 TGFBI 단백질의 124위치에 있어서의 아미노산 치환인 가이드 RNA 분자.
제3항에 있어서, 아미노산 치환이 R124H, R124C 및 R124L로 이루어지는 군에서 선택되는 가이드 RNA 분자.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 과립상 각막 변성증이 과립상 각막 디스트로피 2형(GCD2)인 가이드 RNA 분자.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, TGFBI 유전자의 스페이서 전 인접 모티프(PAM) 서열의 상류측에 인접한 22 염기의 서열을 포함하는 표적 서열과 하이브리다이즈할 수 있는 가이드 서열을 포함하는 가이드 RNA 분자.
제6항에 있어서, PAM 서열이 CGG를 포함하는 가이드 RNA 분자.
제6항 또는 제7항에 있어서, 가이드 서열이, 표적 서열과 상보적인, 적어도 17 내지 18 염기를 포함하는 영역을 포함하는 가이드 RNA 분자.
제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 가이드 서열이, 아데닌 또는 구아닌으로부터 시작되는 22 염기의 서열을 포함하는 가이드 RNA 분자.
제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 가이드 서열이 서열 번호 1의 염기 서열을 갖는 가이드 RNA 분자.
제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 가이드 서열이 trans-activating crRNA(tracr RNA) 서열과 결합되어 있는 가이드 RNA 분자.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 기재된 가이드 RNA 분자를 코딩하는 핵산.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 기재된 가이드 RNA 분자를 발현하는 벡터.
제13항에 있어서, 가이드 RNA의 발현이 U6 프로모터에 의해 구동되는 벡터.
제14항에 있어서, 가이드 RNA와 U6 프로모터가 동일하거나 또는 상이한 벡터 상에 위치하는 벡터.
제14항에 있어서, 가이드 RNA와 U6 프로모터가 동일한 벡터 상에서 작용 가능하게 연결되어 있는 벡터.
제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 기재된 벡터와, HDR의 주형 도너로서의 ssODN 분자를 포함하는 키트.
제17항에 있어서, ssODN이, 점 변이를 야생형의 아미노산에 상당하는 염기로 치환되는 노크인 서열을 갖는 키트.
제18항에 있어서, 야생형의 아미노산에 상당하는 염기가 CGT 또는 CGC인 키트.
제18항 또는 제19항에 있어서, 노크인 서열이 제한 효소 부위를 갖는 키트.
제20항에 있어서, 야생형의 아미노산에 상당하는 염기가 CGT이며, 제한 효소 부위가 BsiWI 부위인 키트.
제17항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, ssODN이 추가로, 절단 부위의 양단에 상동적인 50 염기의 상동성 아암을 노크인 서열의 양단에 갖는 키트.
제17항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, ssODN 분자가 서열 번호 2의 염기 서열을 갖는 키트.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 기재된 가이드 RNA 분자와, Cas9 단백질을 포함하는 키트.
제24항에 있어서, 가이드 RNA 분자와 Cas9 단백질이 리보핵 단백질(RNP) 복합체를 형성하고 있는 키트.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 기재된 가이드 RNA 분자 또는 제12항에 기재된 핵산 및/또는
서열 번호 2의 염기 서열을 갖는 HDR의 주형 도너로서의 ssODN 분자
를 포함하는 의약 조성물.