CN114839382A - 一种在酵母中建立基于红色荧光蛋白的双分子荧光互补系统的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种在酵母中建立基于红色荧光蛋白的双分子荧光互补系统的方法。该方法包括：将yEmRFP(SEQ ID No.1)分成N端(第1‑159位)和C端(第160‑236位)；在N端编码基因5’或3’端通过连接序列(编码SEQ ID No.2所示连接肽)连接目的蛋白A的编码基因，形成融合基因片段A；在C端编码基因5’或3’端通过所述连接序列连接目的蛋白B的编码基因，形成融合基因片段B；将融合基因片段A和B导入受体酵母细胞，培养所得转基因酵母细胞，检测其是否产生红色荧光，若产生红色荧光，则目的蛋白A与B互作；若不产生红色荧光，则目的蛋白A与B不互作。本发明建立的BiFC技术具有较高的敏感性和特异性，适合于在酵母中开展蛋白质相互作用筛选。

Description

一种在酵母中建立基于红色荧光蛋白的双分子荧光互补系统 的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种在酵母中建立基于红色荧光蛋白的双分子荧光互补系统的方法。

背景技术

蛋白质间的互作构成生命活动的基础，在后基因组时代，科研人员已经建立了包括细菌、酵母、拟南芥、线虫和人类在内等的多个物种的蛋白质互作网络，并在此基础上鉴定了许多蛋白质的新功能及其在蛋白质互作网络中的作用，为揭示蛋白质在生命活动过程中的作用奠定了基础。然而现有网络中含有的相互作用蛋白数目距离理论估算的数目仍有较大差距，这其中很大一部分原因是由于实验技术本身的缺陷所导致的。例如酵母双杂交技术只能用于入核蛋白的相互作用研究，其技术本身还存在着自激活和假阳性等问题，且实验周期较长，工作量较大。而亲和纯化串联质谱技术主要是针对蛋白质复合体的相互作用进行研究，在蛋白质纯化的过程中会丢失一些较弱的相互作用，其后续的蛋白质分析和检测费用较高且需要较为专业的生物信息学知识对质谱结果进行分析。因此，开发快速、简便、可信性好的蛋白质相互作用新技术将会在规模化蛋白质相互作用研究中发挥重要作用。

Hu等于2002年开发出了在哺乳细胞中表达的基于黄色荧光蛋白(Venus)的双分子荧光互补系统(bimolecular fluorescent complementation,BiFC)，该系统将Venus在154个氨基酸处分别VN154和VC154两个无荧光片段，这两个片段在细胞内共表达或体外混合时，不能自发地组装成荧光蛋白。但是当这两个荧光片段分别连接到一对有相互作用的蛋白上并在细胞内共表达或体外混合时，由于目标蛋白质之间的相互作用，荧光蛋白的两个片段在空间上互相靠近，重新构建成完整的具有活性的荧光蛋白分子而发出荧光。BiFC技术具有试验周期耗时短、操作简单和无需添加发光物质等优点。然而现有的适合于哺乳动物细胞中表达的BiFC系统在酵母和植物中表达时存在着荧光信号弱，背景值高等问题，因此需要在酵母中建立一种经济、方便且具有高荧光值、低背景的BiFC系统用于蛋白质相互作用研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种在酵母中建立基于红色荧光蛋白的双分子荧光互补系统的方法。

第一方面，本发明要求保护一种检测目的蛋白A与目的蛋白B是否为互作蛋白的方法。

本发明要求保护的检测目的蛋白A与目的蛋白B是否为互作蛋白的方法，可包括如下步骤：

(1)将红色荧光蛋白分成N端部分和C端部分；在所述N端部分的编码基因的5’末端或3’末端通过连接序列(linker)连接目的蛋白A的编码基因，形成融合基因片段A；在所述C端部分的编码基因的5’末端或3’末端通过所述连接序列(linker)连接目的蛋白B的编码基因，形成融合基因片段B。

所述红色荧光蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；所述N端部分的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第1-159位所示；所述C端部分的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第160-236位所示；所述连接序列(linker)编码SEQ ID No.2所示连接肽。

其中，所述连接肽的加入是为了使目的蛋白能够充分折叠。

(2)将所述融合基因片段A和所述融合基因片段B导入同一受体酵母细胞，得到转基因酵母细胞；培养所述转基因酵母细胞，然后检测所述转基因酵母细胞是否产生红色荧光，根据检测结果按照如下确定所述目的蛋白A与所述目的蛋白B是否互作：若所述转基因酵母细胞产生红色荧光，则所述目的蛋白A与所述目的蛋白B为或候选为互作蛋白；若所述转基因酵母细胞不产生红色荧光，则所述目的蛋白A与所述目的蛋白B不为或候选不为互作蛋白。

如果所述目的蛋白A与所述目的蛋白B存在相互作用，则所述红色荧光蛋白的N端部分和C端部分靠近，重新组装成完整的红色荧光蛋白产生荧光；如果所述目的蛋白A与所述目的蛋白B不存在相互作用，则由于所述红色荧光蛋白的N端部分和C端部分分离，因而检测不到红色荧光。

在步骤(2)中，将所述融合基因片段A和所述融合基因片段B均导入同一受体酵母细胞具体可为：先将所述融合基因片段A和所述融合基因片段B中的任一个导入所述受体酵母细胞，然后再导入另一个；或者为将所述融合基因片段A和所述融合基因片段B同时导入所述受体酵母细胞。

在步骤(2)中，检测所述转基因酵母细胞是否产生红色荧光可通过采用荧光显微镜进行观察或者采用流式细胞仪进行分析。

进一步地，所述融合基因片段A可通过酵母重组表达载体A导入所述受体酵母细胞中；所述融合基因片段B可通过酵母重组表达载体B导入所述受体酵母细胞中。

进一步地，所述酵母重组表达载体A中启动所述融合基因片段A转录的启动子可为pADH启动子；所述酵母重组表达载体B中启动所述融合基因片段B转录的启动子可为pADH启动子。

在本发明中，所述pADH启动子的序列具体为SEQ ID No.4的第99-1552位(对应SEQID No.5的第4283-5736位)。

更进一步地，所述酵母重组表达载体A可为将所述N端部分的编码基因和所述目的蛋白A的编码基因，两者中的一个插入到酵母表达载体A的酶切位点SalI和BglII之间，另一个插入到所述酵母表达载体A的酶切位点SpeI和NotI之间后得到的重组质粒；所述酵母表达载体A的序列如SEQ ID No.4所示。

更进一步地，所述酵母重组表达载体B可为将所述C端部分的编码基因和所述目的蛋白B的编码基因，两者中的一个插入到酵母表达载体B的酶切位点SalI和NcoI之间，另一个插入到所述酵母表达载体B的XbaI和NotI两个之间后得到的重组质粒；所述到酵母表达载体B的序列如SEQ ID No.5所示。

进一步地，所述红色荧光蛋白的编码基因可如SEQ ID No.3所示。相应的，所述N端部分的编码基因可如SEQ ID No.3的第1-477位所示；所述C端部分的编码基因可如SEQ IDNo.3的第478-708位所示。

进一步地，所述连接序列可如SEQ ID No.4的第1586-1630位所示。

在本发明的一个实施例中，所述目的蛋白A和所述目的蛋白B分别为bJun蛋白和bFos蛋白(或△bFos蛋白)。其中，所述bJun蛋白为由SEQ ID No.6所示DNA片段编码的蛋白质；所述bFos蛋白为由SEQ ID No.7所示DNA片段编码的蛋白质；所述△bFos蛋白为由SEQID No.8所示DNA片段编码的蛋白质。

在本发明的实施例中，所述受体酵母细胞具体为酵母细胞AH109。

在上述方法中，所述培养的时间具体可为48±4小时(如48小时)。

具体的，所述培养为将所述转基因酵母细胞在缺陷型液体培养基SD-2中30℃振荡培养24小时，然后转入4℃振荡培养24±4小时(如24小时)。

所述缺陷型液体培养基SD-2的溶剂为水，溶质及其浓度如下：YNB 6.7g/L，葡萄糖20g/L，缺少亮氨酸和色氨酸的氨基酸混合物(SD-Leu/-Trp,Clontech，目录号：630417)0.64g/L，pH 5.9。

第二方面，本发明还要求保护如下(A)或(B)所示的产品：

(A)酵母表达载体组，由酵母表达载体A和酵母表达载体B组成；

所述酵母表达载体A的SEQ ID No.4所示；所述酵母表达载体B的序列如SEQ IDNo.5所示。

(B)由所述酵母表达载体组和受体酵母细胞组成的产品。

其中，所述受体酵母细胞可为酵母细胞AH109。

第三方面，本发明还要求保护前文第二方面所述产品在检测目的蛋白A与目的蛋白B是否为互作蛋白中的应用。

本发明建立了适合在酵母表达的基于yEmRFP的BiFC技术，具有较高的敏感性和特异性，适合于在酵母中开展蛋白质相互作用研究。

附图说明

图1为pPC86-pADH-linker载体和pDBLeu-pADH-linker载体的质粒图谱。其中，A为pPC86-pADH-linker载体的质粒图谱；B为pDBLeu-pADH-linker载体的质粒图谱。

图2为pPC86-RN159-bJun、pPC86-bJun-RN159和pDBLeu-RC160-bFos、pDBLeu-bFos-RC160载体两两组合转化AH109酵母，培养48h后进行荧光显微镜观察和流式检测的结果。其中，A为荧光显微镜观察结果(Merge为RFP和DAPI的叠加；DIC为DifferentialInterference Contrast微分干涉差(也就是在明场视野下观察)；B为流式检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

酵母表达载体pPC86：Invitrogen公司产品，是目录号为10835031的试剂盒中的产品。酵母表达载体pDBLeu：Invitrogen公司产品，是目录号10835031的试剂盒中的产品。酵母表达载体pPC86和pDBLeu均记载于“Wang,J.,et al.,Toward an understanding of theprotein interaction network of the human liver.Mol Syst Biol,2011.7:p.536.”一文，公众可从申请人处获得，仅用于重复本发明试验使用，不得他用。

酵母细胞AH109：Clontech公司产品，是目录号PT3247-1的试剂盒中的产品。

实施例1、基于yEmRFP的BiFC系统的建立

一、改造酵母表达载体pPC86和pDBLeu

1、改造酵母表达载体pPC86，构建pPC86-pADH-linker

(1)采用限制性内切酶KpnI和SpeI双酶切酵母表达载体pPC86，将ADH promoter-NLS-GAL4 AD序列去除，保留大小约为5209bp的载体骨架片段。

(2)以pPC86为模板，采用引物pPC86-pADH-F和pPC86-linker-R进行PCR扩增，扩增得到ADH promoter-linker序列，将其采用KpnI和SpeI双酶切处理后连入步骤(1)经KpnI和SpeI双酶切处理的pPC86载体骨架片段，形成pPC86-pADH-linker载体。

上游引物pPC86-pADH-F：5’-AAAGGTACCATCCGGGATCGAAGAAATG-3’；

下游引物pPC86-linker-R：5’-CTAGACTAGTAGAACCACCACCACCAGAACCACCACCACCAGAACCACCACCACCAGATCTGAATTCCCGGGGTCGACGGCATAAGCTTGGAGTTGATT-3’。

pPC86-pADH-linker载体的全序列如SEQ ID No.4所示，其中第99-1552位为pADH启动子序列，第1586-1630位为linker序列。

pPC86-pADH-linker载体的质粒图谱如图1中A所示。

2、改造酵母表达载体pDBLeu，构建pDBLeu-pADH-linker载体

(1)采用限制性内切酶Bgl II和Spe I双酶切酵母表达载体pDBLeu，切除部分CYH2和ADH promoter-GAL4 DB序列，保留大小约为7131bp的载体骨架片段。

(2)以pDBLeu为模板，采用引物pDBLeu-CYH2-pADH-F和pDBLeu-linker-R进行PCR扩增，扩增得到部分的CYH2-ADH promoter-linker序列，经Bgl II和Spe I双酶切处理后，将其连入步骤(1)经Bgl II和Spe I双酶切处理的pDBLeu载体骨架片段，形成pDBLeu-pADH-linker载体。

上游引物pDBLeu-CYH2-pADH-F：5’-GGAAGATCTTACCGTAACCGGCTG-3’；

下游引物pDBLeu-linker-R：5’-CTAGACTAGTCTAGAAGAACCACCACCACCAGAACCACCACCACCAGAACCACCACCACCCCATGGGCTAGCACCCGGGGTCGACATTGCTTCAAGCTTGGAGTTGATT-3’。

pDBLeu-pADH-linker载体的全序列如SEQ ID No.5所示，其中第4283-5736位为pADH启动子序列，第5775-5819位为linker序列。

pDBLeu-pADH-linker载体的质粒图谱如图1中B所示。

二、建立适合于酵母中表达的BiFC系统

1、将适合于酵母中表达的红色荧光蛋白(yeast-enhanced mRFP，yEmRFP)分成N端部分和C端部分；在所述N端部分的编码基因的5’末端或3’末端通过连接序列(linker)连接目的蛋白A的编码基因，形成融合基因片段A；在所述C端部分的编码基因的5’末端或3’末端通过所述连接序列(linker)连接目的蛋白B的编码基因，形成融合基因片段B；

所述红色荧光蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；所述N端部分的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第1-159位所示；所述C端部分的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第160-236位所示；所述连接序列编码SEQ ID No.2所示连接肽。

所述红色荧光蛋白的编码基因如SEQ ID No.3所示；所述N端部分的编码基因如SEQ ID No.3的第1-477位所示；所述C端部分的编码基因如SEQ ID No.3的第478-708位所示；所述连接序列如SEQ ID No.4的的第1586-1630位(对应SEQ ID No.5的第5775-5819位)所示。

2、将含有所述融合基因片段A的酵母重组表达载体A和含有所述融合基因片段B的酵母重组表达载体B均导入同一受体酵母细胞AH109，得到转基因酵母细胞；培养所述转基因酵母细胞48小时，具体为将所述转基因酵母细胞在缺陷型液体培养基SD-2(配制方法如下：YNB 6.7g,葡萄糖20g，缺少亮氨酸和色氨酸的氨基酸混合物(SD-Leu/-Trp,Clontech，目录号：630417)0.64g，调节pH值为5.9，定容到1L，120℃高压灭菌15min)中30℃振荡培养24小时，然后转入4℃振荡培养24小时，然后采用荧光显微镜或者基于流式细胞术分析检测所述转基因酵母细胞是否产生红色荧光，根据检测结果按照如下确定所述目的蛋白A与所述目的蛋白B是否互作：如果目的蛋白A与目的蛋白B存在相互作用，则yEmRFP的N端和C端靠近，重新组装成完整的yEmRFP蛋白产生红色荧光；如果A与B不存在相互作用，则由于所述红色荧光蛋白的N端部分和C端部分分离，因而检测不到红色荧光。

其中，所述酵母重组表达载体A为将所述N端部分的编码基因(SEQ ID No.3的第1-477位)和所述目的蛋白A的编码基因，两者中的一个插入到步骤一构建的pPC86-pADH-linker载体的酶切位点SalI和BglII之间，另一个插入到pPC86-pADH-linker载体的酶切位点SpeI和NotI之间后得到的重组质粒。所述酵母重组表达载体B为将所述C端部分的编码基因(SEQ ID No.3的第478-708位)和所述目的蛋白B的编码基因，两者中的一个插入到步骤一构建的pDBLeu-pADH-linker载体的酶切位点SalI和NcoI之间，另一个插入到pDBLeu-pADH-linker载体的XbaI和NotI之间后得到的重组质粒。

实施例2、采用实施例1建立的BiFC系统验证bJun蛋白和bFos蛋白的互作

已知bJun蛋白和bFos蛋白为一对存在相互作用的蛋白(参见“Hu,C.D.,Chinenov,Y.&Kerppola,T.K.Visualization of interactions among bZIP and Rel familyproteins in living cells using bimolecular fluorescencecomplementation.Molecular cell 9,789-798(2002).”一文，本实施例选取存在相互作用的“bJun蛋白和bFos蛋白”为阳性试验组，“bJun蛋白和缺失了与bJun蛋白相互作用结构域的ΔbFos蛋白”(公开“bFos蛋白中与bJun蛋白相互作用结构域”的参考文献为“Hu,C.D.,Chinenov,Y.&Kerppola,T.K.Visualization of interactions among bZIP and Relfamily proteins in living cells using bimolecular fluorescencecomplementation.Molecular cell 9,789-798(2002).”)作为阴性实验组，验证实施例1建立的BiFC系统。

一、构建pPC86-RN159-bJun、pPC86-bJun-RN159和pDBLeu-RC160-bFos、pDBLeu-bFos-RC160载体

1、构建pPC86-RN159-bJun载体

以SEQ ID No.3所示的yEmRFP蛋白的编码基因为模板，采用引物对RN159-F1和RN159-R1进行PCR扩增，获得两端分别带有酶切位点SalI和BglII的扩增产物。

RN159-F1：5’-ACGCGTCGACCATGGTTTCAAAAGGTGAAG-3’；

RN159-R1：5’-GGAAGATCTATCTTCTGGATACATTCTTT-3’。

采用限制性内切酶SalI和BglII双酶切扩增产物，胶回收后与经过同样双酶切的实施例1步骤一构建的pPC86-pADH-linker载体相连，得到重组质粒。将经测序表明为在pPC86-pADH-linker载体的酶切位点SalI和BglII之间插入了“C+SEQ ID No.3的第1-477所示的DNA片段(即yEmRFP蛋白的N端部分的编码基因)”的重组质粒命名为pPC86-RN159。

以SEQ ID No.6所示的bJun蛋白的编码基因为模板，采用引物对bJun-F1和bJun-R1进行PCR扩增，获得两端带有酶切位点SpeI和NotI的扩增产物。

bJun-F1：5’-ATTACTAGTAAGGCGGAGAGGAAGCGCATGAG-3’；

bJun-R1：5’-ATTGCGGCCGCGTGGTTCATGACTTTCTGTTT-3’。

采用限制性内切酶SpeI和NotI双酶切扩增产物，胶回收后与经过同样双酶切的pPC86-RN159载体相连，得到重组质粒。将经测序表明为在pPC86-pADH-linker载体的酶切位点SalI和BglII之间插入了“C+SEQ ID No.3的第1-477所示的DNA片段(即yEmRFP蛋白的N端部分的编码基因)”，同时在酶切位点SpeI和NotI之间插入了SEQ ID No.6所示DNA片段(即bJun蛋白的编码基因)的重组质粒命名为pPC86-RN159-bJun。将酵母重组表达载体pPC86-RN159-bJun表达的融合蛋白命名为RN159-bJun。

2、构建pPC86-bJun-RN159载体

以SEQ ID No.6所示的bJun蛋白的编码基因为模板，采用引物对bJun-F2和bJun-R2进行PCR扩增，获得两端带有酶切位点SalI和BglII的扩增产物。

bJun-F2：5’-ATTGTCGACTAAGGCGGAGAGGAAGCGCATGAG-3’；

bJun-R2：5’-GCCAGATCTGTGGTTCATGACTTTCTGTTT-3’。

采用限制性内切酶SalI和BglII双酶切扩增产物，胶回收后与经过同样双酶切的实施例1步骤一构建的pPC86-pADH-linker载体相连，得到重组质粒。将经测序表明为在pPC86-pADH-linker载体的酶切位点SalI和BglII之间插入了“T+SEQ ID No.6所示DNA片段(即bJun蛋白的编码基因)”的重组质粒命名为pPC86-bJun。

以SEQ ID No.3所示的yEmRFP蛋白的编码基因为模板，采用引物对RN159-F2和RN159-R2进行PCR扩增，获得两端分别带有酶切位点SpeI和NotI的扩增产物。

RN159-F2：5’-CGGACTAGTATGGTTTCAAAAGGTGAAG-3’；

RN159-R2：5’-TAAAGCGGCCGCATCTTCTGGATACATTCTTT-3’。

采用限制性内切酶SpeI和NotI双酶切扩增产物，胶回收后与经过同样双酶切的pPC86-bJun载体相连，得到重组质粒。将经测序表明为在pPC86-pADH-linker载体的酶切位点SalI和BglII之间插入了“T+SEQ ID No.6所示DNA片段(即bJun蛋白的编码基因)”，同时在酶切位点SpeI和NotI之间插入了SEQ ID No.3的第1-477所示的DNA片段(即yEmRFP蛋白的N端部分的编码基因)的重组质粒命名为pPC86-bJun-RN159。将酵母重组表达载体pPC86-bJun-RN159表达的融合蛋白命名为bJun-RN159。

3、构建pDBLeu-RC160-bFos载体

以SEQ ID No.3所示的yEmRFP蛋白的编码基因为模板，采用引物对RC160-F1和RC160-R1进行PCR扩增，获得两端分别带有酶切位点SalI和NcoI的扩增产物。

RC160-F1：5’-ACGCGTCGACCATGGGTGCTTTAAAAGGTGAAA-3’；

RC160-R1：5’-CCGCCATGGTTTATATAATTCATCCATACC-3’。

采用限制性内切酶SalI和NcoI双酶切扩增产物，胶回收后与经过同样双酶切的实施例1步骤一构建的pDBLeu-pADH-linker载体相连，得到重组质粒。将经测序表明为在pDBLeu-pADH-linker载体的酶切位点SalI和NcoI之间插入了“CATG+SEQ ID No.3的第478-708所示的DNA片段(即yEmRFP蛋白的C端部分的编码基因)”的重组质粒命名为pDBLeu-RC160。

以SEQ ID No.7所示的bFos蛋白的编码基因为模板，采用引物对bFos-F1和bFos-R1进行PCR扩增，获得两端带有酶切位点XbaI和NotI的扩增产物。

bFos-F1：5’-TAATCTAGAGGTCGTGCGCAGTCCATCGGTC-3’；

bFos-R1：5’-ATTGCGGCCGCACCCAGGTCGTTCGGGATTTTGC-3’。

采用限制性内切酶XbaI和NotI双酶切扩增产物，胶回收后与经过同样双酶切的pDBLeu-RC160载体相连，得到重组质粒。将经测序表明为在pDBLeu-pADH-linker载体的酶切位点SalI和NcoI之间插入了“CATG+SEQ ID No.3的第478-708所示的DNA片段(即yEmRFP蛋白的C端部分的编码基因)”，同时在酶切位点XbaI和NotI之间插入了SEQ ID No.7所示DNA片段(即bFos蛋白的编码基因)的重组质粒命名为pDBLeu-RC160-bFos。将酵母重组表达载体pDBLeu-RC160-bFos表达的融合蛋白命名为RC160-bFos。

4、构建pDBLeu-bFos-RC160载体

以SEQ ID No.7所示的bFos蛋白的编码基因为模板，采用引物对bFos-F2和bFos-R2进行PCR扩增，获得两端带有酶切位点SalI和NcoI的扩增产物。

bFos-F2：5’-TAAGTCGACTGGTCGTGCGCAGTCCATCGGT-3’；

bFos-R2：5’-ATTCCATGGACCCAGGTCGTTCGGGATTTT-3’。

采用限制性内切酶SalI和NcoI双酶切扩增产物，胶回收后与经过同样双酶切的实施例1步骤一构建的pDBLeu-pADH-linker载体相连，得到重组质粒。将经测序表明为在pDBLeu-pADH-linker载体的酶切位点SalI和NcoI之间插入了“T+SEQ ID No.7所示的DNA片段(即bFos蛋白的编码基因)”的重组质粒命名为pDBLeu-bFos。

以SEQ ID No.3所示的yEmRFP蛋白的编码基因为模板，采用引物对RC160-F2和RC160-R2进行PCR扩增，获得两端分别带有酶切位点XbaI和NotI的扩增产物。

RC160-F2：5’-TGCTCTAGAATGGGTGCTTTAAAAGGTGAA-3’；

RC160-R2：5’-TTTGCGGCCGCTTTATATAATTCATCCATACCACC-3’。

采用限制性内切酶XbaI和NotI双酶切扩增产物，胶回收后与经过同样双酶切的pDBLeu-bFos载体相连，得到重组质粒。将经测序表明为在pDBLeu-pADH-linker载体的酶切位点SalI和NcoI之间插入了SEQ ID No.7所示的DNA片段(即bFos蛋白的编码基因)，同时在酶切位点XbaI和NotI之间插入了“ATG+SEQ ID No.3的第478-708所示的DNA片段(即yEmRFP蛋白的C端部分的编码基因)”的重组质粒命名为pDBLeu-bFos-RC160。将酵母重组表达载体pDBLeu-bFos-RC160表达的融合蛋白命名为bFos-RC160。

5、构建pDBLeu-RC160-△bFos载体

以SEQ ID No.8所示的△bFos蛋白的编码基因为模板，采用引物对△bFos-F1和△bFos-R1进行PCR扩增，获得两端带有酶切位点XbaI和NotI的扩增产物。

△bFos-F1：5’-TAATCTAGAGGTCGTGCGCAGTCCATCGGTC-3’；

△bFos-R1：5’-ATTGCGGCCGCACCCAGGTCGTTCGGGATTTTGC-3’。

采用限制性内切酶XbaI和NotI双酶切扩增产物，胶回收后与经过同样双酶切的pDBLeu-RC160载体相连，得到重组质粒。将经测序表明为在pDBLeu-pADH-linker载体的酶切位点SalI和NcoI之间插入了“CATG+SEQ ID No.3的第478-708所示的DNA片段(即yEmRFP蛋白的C端部分的编码基因)”，同时在酶切位点XbaI和NotI之间插入了SEQ ID No.8所示DNA片段(即△bFos蛋白的编码基因)的重组质粒命名为pDBLeu-RC160-△bFos。将酵母重组表达载体pDBLeu-RC160-△bFos表达的融合蛋白命名为RC160-△bFos。

二、转化受体酵母细胞

将步骤一构建的pPC86-RN159-bJun、pPC86-bJun-RN159和pDBLeu-RC160-bFos、pDBLeu-bFos-RC160载体两两配对组合转化受体酵母细胞AH109。转化时，具体是先采用以pDBLeu-pADH-linker为骨架载体的B载体(pDBLeu-RC160-bFos或pDBLeu-bFos-RC160)转化AH109酵母后，制备含有B载体的AH109酵母感受态，再转入以pPC86-pADH-linker为骨架载体的A载体(pPC86-RN159-bJun或pPC86-bJun-RN159)，当然可以调整A载体和B载体的导入顺序。

实验同时设置向受体酵母细胞AH109中转入pPC86-RN159-bJun和pDBLeu-RC160-△bFos的阴性对照。

三、荧光检测

将步骤二转化后所得的各转基因酵母细胞在缺陷型液体培养基SD-2(配方见上文)中30℃振荡培养24小时，然后转入4℃振荡培养24小时。收集各转基因酵母细胞，进行荧光检测。

1、荧光显微镜观察

取培养后收集的各转基因酵母细胞，采用DAPI进行细胞核染色，然后进行荧光观察。

结果如图2中的A所示，由图可见，阳性试验组“pPC86-RN159-bJun+pDBLeu-RC160-bFos”和“pPC86-bJun-RN159+pDBLeu-bFos-RC160”的组合产生了很强的红色荧光。阴性实验组“pPC86-RN159-bJun+pDBLeu-RC160-△bFos”没有产生红色荧光。

2、流式细胞分析法

取培养后收集的各转基因酵母细胞，采用流式细胞仪分析产生红色荧光的酵母细胞。

结果如图2中的B所示，流式检测结果显示阳性试验组“pPC86-RN159-bJun+pDBLeu-RC160-bFos”和“pPC86-bJun-RN159+pDBLeu-bFos-RC160”的组合其荧光细胞比例分别达到了23.0％和25.2％。而阴性实验组荧光细胞的比例仅为本底的0.37％。

由以上结果，可见本发明实施例1建立的BiFC系统可用于检测两个目的蛋白是否存在相互作用。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> 一种在酵母中建立基于红色荧光蛋白的双分子荧光互补系统的方法

<130> GNCLN220989

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 236

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 1

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Asp Asn Met Ala Ile Ile Lys Glu Phe

1 5 10 15

Met Arg Phe Lys Val His Met Glu Gly Ser Val Asn Gly His Glu Phe

20 25 30

Glu Ile Glu Gly Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr

35 40 45

Ala Lys Leu Lys Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp

50 55 60

Ile Leu Ser Pro Gln Phe Met Tyr Gly Ser Lys Ala Tyr Val Lys His

65 70 75 80

Pro Ala Asp Ile Pro Asp Tyr Leu Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe

85 90 95

Lys Trp Glu Arg Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Val Thr Val

100 105 110

Thr Gln Asp Ser Ser Leu Gln Asp Gly Glu Phe Ile Tyr Lys Val Lys

115 120 125

Leu Arg Gly Thr Asn Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys

130 135 140

Thr Met Gly Trp Glu Ala Ser Ser Glu Arg Met Tyr Pro Glu Asp Gly

145 150 155 160

Ala Leu Lys Gly Glu Ile Lys Gln Arg Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly

165 170 175

His Tyr Asp Ala Glu Val Lys Thr Thr Tyr Lys Ala Lys Lys Pro Val

180 185 190

Gln Leu Pro Gly Ala Tyr Asn Val Asn Ile Lys Leu Asp Ile Thr Ser

195 200 205

His Asn Glu Asp Tyr Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Ala Glu Gly

210 215 220

Arg His Ser Thr Gly Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys

225 230 235

<210> 2

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 2

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 3

<211> 708

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

atggtttcaa aaggtgaaga agataatatg gctattatta aagaatttat gagatttaaa 60

gttcatatgg aaggttcagt taatggtcat gaatttgaaa ttgaaggtga aggtgaaggt 120

agaccatatg aaggtactca aactgctaaa ttgaaagtta ctaaaggtgg tccattacca 180

tttgcttggg atattttgtc accacaattt atgtatggtt caaaagctta tgttaaacat 240

ccagctgata ttccagatta tttaaaattg tcatttccag aaggttttaa atgggaaaga 300

gttatgaatt ttgaagatgg tggtgttgtt actgttactc aagattcatc attacaagat 360

ggtgaattta tttataaagt taaattgaga ggtactaatt ttccatcaga tggtccagtt 420

atgcaaaaaa aaactatggg ttgggaagct tcatcagaaa gaatgtatcc agaagatggt 480

gctttaaaag gtgaaattaa acaaagattg aaattaaaag atggtggtca ttatgatgct 540

gaagttaaaa ctacttataa agctaaaaaa ccagttcaat taccaggtgc ttataatgtt 600

aatattaaat tggatattac ttcacataat gaagattata ctattgttga acaatatgaa 660

agagctgaag gtagacattc aactggtggt atggatgaat tatataaa 708

<210> 4

<211> 6748

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

agcggataac aatttcacac aggaaacagc tatgaccatg attacgccaa gctcggaatt 60

aaccctcact aaagggaaca aaagctgggt accatccggg atcgaagaaa tgatggtaaa 120

tgaaatagga aatcaaggag catgaaggca aaagacaaat ataagggtcg aacgaaaaat 180

aaagtgaaaa gtgttgatat gatgtatttg gctttgcggc gccgaaaaaa cgagtttacg 240

caattgcaca atcatgctga ctctgtggcg gacccgcgct cttgccggcc cggcgataac 300

gctgggcgtg aggctgtgcc cggcggagtt ttttgcgcct gcattttcca aggtttaccc 360

tgcgctaagg ggcgagattg gagaagcaat aagaatgccg gttggggttg cgatgatgac 420

gaccacgaca actggtgtca ttatttaagt tgccgaaaga acctgagtgc atttgcaaca 480

tgagtatact agaagaatga gccaagactt gcgagacgcg agtttgccgg tggtgcgaac 540

aatagagcga ccatgacctt gaaggtgaga cgcgcataac cgctagagta ctttgaagag 600

gaaacagcaa tagggttgct accagtataa atagacaggt acatacaaca ctggaaatgg 660

ttgtctgttt gagtacgctt tcaattcatt tgggtgtgca ctttattatg ttacaatatg 720

gaagggaact ttacacttct cctatgcaca tatattaatt aaagtccaat gctagtagag 780

aaggggggta acacccctcc gcgctctttt ccgatttttt tctaaaccgt ggaatatttc 840

ggatatcctt ttgttgtttc cgggtgtaca atatggactt cctcttttct ggcaaccaaa 900

cccatacatc gggattccta taataccttc gttggtctcc ctaacatgta ggtggcggag 960

gggagatata caatagaaca gataccagac aagacataat gggctaaaca agactacacc 1020

aattacactg cctcattgat ggtggtacat aacgaactaa tactgtagcc ctagacttga 1080

tagccatcat catatcgaag tttcactacc ctttttccat ttgccatcta ttgaagtaat 1140

aataggcgca tgcaacttct tttctttttt tttcttttct ctctcccccg ttgttgtctc 1200

accatatccg caatgacaaa aaaaatgatg gaagacacta aaggaaaaaa ttaacgacaa 1260

agacagcacc aacagatgtc gttgttccag agctgatgag gggtatcttc gaacacacga 1320

aactttttcc ttccttcatt cacgcacact actctctaat gagcaacggt atacggcctt 1380

ccttccagtt acttgaattt gaaataaaaa aagtttgccg ctttgctatc aagtataaat 1440

agacctgcaa ttattaatct tttgtttcct cgtcattgtt ctcgttccct ttcttccttg 1500

tttctttttc tgcacaatat ttcaagctat accaagcata caatcaactc caagcttatg 1560

ccgtcgaccc cgggaattca gatctggtgg tggtggttct ggtggtggtg gttctggtgg 1620

tggtggttct actagtgcgg ccgctaagta agtaagacgt cgagctctaa gtaagtaacg 1680

gccgccaccg cggtggagct ttggacttct tcgccagagg tttggtcaag tctccaatca 1740

aggttgtcgg cttgtctacc ttgccagaaa tttacgaaaa gatggaaaag ggtcaaatcg 1800

ttggtagata cgttgttgac acttctaaat aagcgaattt cttatgattt atgattttta 1860

ttattaaata agttataaaa aaaataagtg tatacaaatt ttaaagtgac tcttaggttt 1920

taaaacgaaa attcttgttc ttgagtaact ctttcctgta ggtcaggttg ctttctcagg 1980

tatagcatga ggtcgctctt attgaccaca cctctaccgg catgccgagc aaatgcctgc 2040

aaatcgctcc ccatttcacc caattgtaga tatgctaact ccagcaatga gttgatgaat 2100

ctcggtgtgt attttatgtc ctcagaggac aatacctgtt gtaatcgttc ttccacacgg 2160

atcccaattc gccctatagt gagtcgtatt acaattcact ggccgtcgtt ttacaacgtc 2220

gtgactggga aaaccctggc gttacccaac ttaatcgcct tgcagcacat ccccctttcg 2280

ccagctggcg taatagcgaa gaggcccgca ccgatcgccc ttcccaacag ttgcgcagcc 2340

tgaatggcga atggacgcgc cctgtagcgg cgcattaagc gcggcgggtg tggtggttac 2400

gcgcagcgtg accgctacac ttgccagcgc cctagcgccc gctcctttcg ctttcttccc 2460

ttcctttctc gccacgttcg ccggctttcc ccgtcaagct ctaaatcggg ggctcccttt 2520

agggttccga tttagtgctt tacggcacct cgaccccaaa aaacttgatt agggtgatgg 2580

ttcacgtagt gggccatcgc cctgatagac ggtttttcgc cctttgacgt tggagtccac 2640

gttctttaat agtggactct tgttccaaac tggaacaaca ctcaacccta tctcggtcta 2700

ttcttttgat ttataaggga ttttgccgat ttcggcctat tggttaaaaa atgagctgat 2760

ttaacaaaaa tttaacgcga attttaacaa aatattaacg tttacaattt cctgatgcgg 2820

tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca ggcaagtgca caaacaatac 2880

ttaaataaat actactcagt aataacctat ttcttagcat ttttgacgaa atttgctatt 2940

ttgttagagt cttttacacc atttgtctcc acacctccgc ttacatcaac accaataacg 3000

ccatttaatc taagcgcatc accaacattt tctggcgtca gtccaccagc taacataaaa 3060

tgtaagcttt cggggctctc ttgccttcca acccagtcag aaatcgagtt ccaatccaaa 3120

agttcacctg tcccacctgc ttctgaatca aacaagggaa taaacgaatg aggtttctgt 3180

gaagctgcac tgagtagtat gttgcagtct tttggaaata cgagtctttt aataactggc 3240

aaaccgagga actcttggta ttcttgccac gactcatctc catgcagttg gacgatatca 3300

atgccgtaat cattgaccag agccaaaaca tcctccttag gttgattacg aaacacgcca 3360

accaagtatt tcggagtgcc tgaactattt ttatatgctt ttacaagact tgaaattttc 3420

cttgcaataa ccgggtcaat tgttctcttt ctattgggca cacatataat acccagcaag 3480

tcagcatcgg aatctagagc acattctgcg gcctctgtgc tctgcaagcc gcaaactttc 3540

accaatggac cagaactacc tgtgaaatta ataacagaca tactccaagc tgcctttgtg 3600

tgcttaatca cgtatactca cgtgctcaat agtcaccaat gccctccctc ttggccctct 3660

ccttttcttt tttcgaccga attaattctt aatcggcaaa aaaagaaaag ctccggatca 3720

agattgtacg taaggtgaca agctattttt caataaagaa tatcttccac tactgccatc 3780

tggcgtcata actgcaaagt acacatatat tacgatgctg tctattaaat gcttcctata 3840

ttatatatat agtaatgtcg tttatggtgc actctcagta caatctgctc tgatgccgca 3900

tagttaagcc agccccgaca cccgccaaca cccgctgacg cgccctgacg ggcttgtctg 3960

ctcccggcat ccgcttacag acaagctgtg accgtctccg ggagctgcat gtgtcagagg 4020

ttttcaccgt catcaccgaa acgcgcgaga cgaaagggcc tcgtgatacg cctattttta 4080

taggttaatg tcatgataat aatggtttct taggacggat cgcttgcctg taacttacac 4140

gcgcctcgta tcttttaatg atggaataat ttgggaattt actctgtgtt tatttatttt 4200

tatgttttgt atttggattt tagaaagtaa ataaagaagg tagaagagtt acggaatgaa 4260

gaaaaaaaaa taaacaaagg tttaaaaaat ttcaacaaaa agcgtacttt acatatatat 4320

ttattagaca agaaaagcag attaaataga tatacattcg attaacgata agtaaaatgt 4380

aaaatcacag gattttcgtg tgtggtcttc tacacagaca agatgaaaca attcggcatt 4440

aatacctgag agcaggaaga gcaagataaa aggtagtatt tgttggcgat ccccctagag 4500

tcttttacat cttcggaaaa caaaaactat tttttcttta atttcttttt ttactttcta 4560

tttttaattt atatatttat attaaaaaat ttaaattata attattttta tagcacgtga 4620

tgaaaaggac ccaggtggca cttttcgggg aaatgtgcgc ggaaccccta tttgtttatt 4680

tttctaaata cattcaaata tgtatccgct catgagacaa taaccctgat aaatgcttca 4740

ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat tcaacatttc cgtgtcgccc ttattccctt 4800

ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga aagtaaaaga 4860

tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg ttacatcgaa ctggatctca acagcggtaa 4920

gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg ttttccaatg atgagcactt ttaaagttct 4980

gctatgtggc gcggtattat cccgtattga cgccgggcaa gagcaactcg gtcgccgcat 5040

acactattct cagaatgact tggttgagta ctcaccagtc acagaaaagc atcttacgga 5100

tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc tgccataacc atgagtgata acactgcggc 5160

caacttactt ctgacaacga tcggaggacc gaaggagcta accgcttttt ttcacaacat 5220

gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg ggaaccggag ctgaatgaag ccataccaaa 5280

cgacgagcgt gacaccacga tgcctgtagc aatggcaaca acgttgcgca aactattaac 5340

tggcgaacta cttactctag cttcccggca acaattaata gactggatgg aggcggataa 5400

agttgcagga ccacttctgc gctcggccct tccggctggc tggtttattg ctgataaatc 5460

tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggtat cattgcagca ctggggccag atggtaagcc 5520

ctcccgtatc gtagttatct acacgacggg cagtcaggca actatggatg aacgaaatag 5580

acagatcgct gagataggtg cctcactgat taagcattgg taactgtcag accaagttta 5640

ctcatatata ctttagattg atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa 5700

gatccttttt gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc 5760

gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat 5820

ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga 5880

gctaccaact ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt 5940

ccttctagtg tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata 6000

cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac 6060

cgggttggac tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg 6120

ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg 6180

tgagcattga gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag 6240

cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca ggggggaacg cctggtatct 6300

ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc 6360

aggggggccg agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt 6420

ttgctggcct tttgctcaca tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg 6480

tattaccgcc tttgagtgag ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga 6540

gtcagtgagc gaggaagcgg aagagcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg 6600

gccgattcat taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg 6660

caacgcaatt aatgtgagtt acctcactca ttaggcaccc caggctttac actttatgct 6720

tccggctcct atgttgtgtg gaattgtg 6748

<210> 5

<211> 9478

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt 60

cttaggacgg atcgcttgcc tgtaacttac acgcgcctcg tatcttttaa tgatggaata 120

atttgggaat ttactctgtg tttatttatt tttatgtttt gtatttggat tttagaaagt 180

aaataaagaa ggtagaagag ttacggaatg aagaaaaaaa aataaacaaa ggtttaaaaa 240

atttcaacaa aaagcgtact ttacatatat atttattaga caagaaaagc agattaaata 300

gatatacatt cgattaacga taagtaaaat gtaaaatcac aggattttcg tgtgtggtct 360

tctacacaga caagatgaaa caattcggca ttaatacctg agagcaggaa gagcaagata 420

aaaggtagta tttgttggcg atccccctag agtcttttac atcttcggaa aacaaaaact 480

attttttctt taatttcttt ttttactttc tatttttaat ttatatattt atattaaaaa 540

atttaaatta taattatttt tatagcacgt gatgaaaagg acccaggtgg cacttttcgg 600

ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg 660

ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt caataatctg cagctctggc ccgtgtctca 720

aaatctctga tgttacattg cacaagataa aaatatatca tcatgaacaa taaaactgtc 780

tgcttacata aacagtaata caaggggtgt tatgagccat attcaacggg aaacgtcttg 840

ctggaggccg cgattaaatt ccaacatgga tgctgattta tatgggtata aatgggctcg 900

cgataatgtc gggcaatcag gtgcgacaat ctttcgattg tatgggaagc ccgatgcgcc 960

agagttgttt ctgaaacatg gcaaaggtag cgttgccaat gatgttacag atgagatggt 1020

cagactaaac tggctgacgg aatttatgcc tcttccgacc atcaagcatt ttatccgtac 1080

tcctgatgat gcatggttac tcaccactgc gatccgcggg aaaacagcat tccaggtatt 1140

agaagaatat cctgattcag gtgaaaatat tgttgatgcg ctggcagtgt tcctgcgccg 1200

gttgcattcg attcctgttt gtaattgtcc ttttaacagc gatcgcgtat ttcgtctcgc 1260

tcaggcgcaa tcacgaatga ataacggttt ggttgatgcg agtgattttg atgacgagcg 1320

taatggctgg cctgttgaac aagtctggaa agaaatgcat acgcttttgc cattctcacc 1380

ggattcagtc gtcactcatg gtgatttctc acttgataac cttatttttg acgaggggaa 1440

attaataggt tgtattgatg ttggacgagt cggaatcgca gaccgatacc aggatcttgc 1500

catcctatgg aactgcctcg gtgagttttc tccttcatta cagaaacggc tttttcaaaa 1560

atatggtatt gataatcctg atatgaataa attgcagttt catttgatgc tcgatgagtt 1620

tttctaatca gaattggtta attggttgta acactggcag agcattacgc tgacttgacg 1680

ggacggcgca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc 1740

gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg 1800

caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact 1860

ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg 1920

tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg 1980

ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac 2040

tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca 2100

cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagcattga 2160

gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc 2220

ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca ggggggaacg cctggtatct ttatagtcct 2280

gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggccg 2340

agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct 2400

tttgctcaca tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc 2460

tttgagtgag ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc 2520

gaggaagcgg aagagcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat 2580

taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg caacgcaatt 2640

aatgtgagtt acctcactca ttaggcaccc caggctttac actttatgct tccggctcct 2700

atgttgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagcta tgaccatgat 2760

tacgccaagc tcggaattaa ccctcactaa agggaacaaa agctggtacc gatcccgagc 2820

tttgcaaatt aaagccttcg agcgtcccaa aaccttctca agcaaggttt tcagtataat 2880

gttacatgcg tacacgcgtc tgtacagaaa aaaaagaaaa atttgaaata taaataacgt 2940

tcttaatact aacataacta taaaaaaata aatagggacc tagacttcag gttgtctaac 3000

tccttccttt tcggttagag cggatgtggg gggagggcgt gaatgtaagc gtgacataac 3060

taattacatg atatcgacaa aggaaaaggg gcctgtttac tcacaggctt ttttcaagta 3120

ggtaattaag tcgtttctgt ctttttcctt cttcaaccca ccaaaggcca tcttggtact 3180

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3240

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttcatagaa ataatacaga agtagatgtt 3300

gaattagatt aaactgaaga tatataattt attggaaaat acatagagct ttttgttgat 3360

gcgcttaagc gatcaattca acaacaccac cagcagctct gattttttct tcagccaact 3420

tggagacgaa tctagctttg acgataactg gaacatttgg aattctaccc ttacccaaga 3480

tcttaccgta accggctgcc aaagtgtcaa taactggagc agtttcctta gaagcagatt 3540

tcaagtattg gtctctcttg tcttctggga tcaatgtcca caatttgtcc aagttcaaga 3600

ctggcttcca gaaatgagct tgttgcttgt ggaagtatct cataccaacc ttaccgaaat 3660

aacctggatg gtatttatcc atgttaattc tgtggtgatg ttgaccaccg gccatacctc 3720

taccaccggg gtgctttctg tgcttaccga tacgaccttt accggctgag acgtgacctc 3780

tgtgctttct agtcttagtg aatctggaag gcattcttga ttagttggat gattgttctg 3840

ggatttaatg caaaaatcac ttaagaagga aaatcaacgg agaaagcaaa cgccatctta 3900

aatatacggg atacagatga aagggtttga acctatctgg aaaatagcat taaacaagcg 3960

aaaaactgcg aggaaaattg tttgcgtctc tgcgggctat tcacgcgcca gaggaaaata 4020

ggaaaaataa cagggcatta gaaaaataat tttgattttg gtaatgtgtg ggtcctggtg 4080

tacagatgtt acattggtta cagtactctt gtttttgctg tgtttttcga tgaatctcca 4140

aaatggttgt tagcacatgg aagagtcacc gatgctaagt tatctctatg taagctacgt 4200

ggcgtgactt ttgatgaagc cgcacaagag atacaggatt ggcaactgca aatagaatct 4260

ggggatcccc cctcgagatc cgggatcgaa gaaatgatgg taaatgaaat aggaaatcaa 4320

ggagcatgaa ggcaaaagac aaatataagg gtcgaacgaa aaataaagtg aaaagtgttg 4380

atatgatgta tttggctttg cggcgccgaa aaaacgagtt tacgcaattg cacaatcatg 4440

ctgactctgt ggcggacccg cgctcttgcc ggcccggcga taacgctggg cgtgaggctg 4500

tgcccggcgg agttttttgc gcctgcattt tccaaggttt accctgcgct aaggggcgag 4560

attggagaag caataagaat gccggttggg gttgcgatga tgacgaccac gacaactggt 4620

gtcattattt aagttgccga aagaacctga gtgcatttgc aacatgagta tactagaaga 4680

atgagccaag acttgcgaga cgcgagtttg ccggtggtgc gaacaataga gcgaccatga 4740

ccttgaaggt gagacgcgca taaccgctag agtactttga agaggaaaca gcaatagggt 4800

tgctaccagt ataaatagac aggtacatac aacactggaa atggttgtct gtttgagtac 4860

gctttcaatt catttgggtg tgcactttat tatgttacaa tatggaaggg aactttacac 4920

ttctcctatg cacatatatt aattaaagtc caatgctagt agagaagggg ggtaacaccc 4980

ctccgcgctc ttttccgatt tttttctaaa ccgtggaata tttcggatat ccttttgttg 5040

tttccgggtg tacaatatgg acttcctctt ttctggcaac caaacccata catcgggatt 5100

cctataatac cttcgttggt ctccctaaca tgtaggtggc ggaggggaga tatacaatag 5160

aacagatacc agacaagaca taatgggcta aacaagacta caccaattac actgcctcat 5220

tgatggtggt acataacgaa ctaatactgt agccctagac ttgatagcca tcatcatatc 5280

gaagtttcac tacccttttt ccatttgcca tctattgaag taataatagg cgcatgcaac 5340

ttcttttctt tttttttctt ttctctctcc cccgttgttg tctcaccata tccgcaatga 5400

caaaaaaaat gatggaagac actaaaggaa aaaattaacg acaaagacag caccaacaga 5460

tgtcgttgtt ccagagctga tgaggggtat cttcgaacac acgaaacttt ttccttcctt 5520

cattcacgca cactactctc taatgagcaa cggtatacgg ccttccttcc agttacttga 5580

atttgaaata aaaaaagttt gccgctttgc tatcaagtat aaatagacct gcaattatta 5640

atcttttgtt tcctcgtcat tgttctcgtt ccctttcttc cttgtttctt tttctgcaca 5700

atatttcaag ctataccaag catacaatca actccaagct tgaagcaatg tcgaccccgg 5760

gtgctagccc atggggtggt ggtggttctg gtggtggtgg ttctggtggt ggtggttctt 5820

ctagactagt gcggccgcta agtaagtaag acgtcgagct ctaagtaagt aacggccgcc 5880

accgcggtgg agctttggac ttcttcgcca gaggtttggt caagtctcca atcaaggttg 5940

tcggcttgtc taccttgcca gaaatttacg aaaagatgga aaagggtcaa atcgttggta 6000

gatacgttgt tgacacttct aaataagcga atttcttatg atttatgatt tttattatta 6060

aataagttat aaaaaaaata agtgtataca aattttaaag tgactcttag gttttaaaac 6120

gaaaattctt gttcttgagt aactctttcc tgtaggtcag gttgctttct caggtatagc 6180

atgaggtcgc tcttattgac cacacctcta ccggcatgcc gagcaaatgc ctgcaaatcg 6240

ctccccattt cacccaattg tagatatgct aactccagca atgagttgat gaatctcggt 6300

gtgtatttta tgtcctcaga ggacaatacc tgttgtaatc gttcttccac acggatccca 6360

attcgcccta tagtgagtcg tattacaatt cactggccgt cgttttacaa cgtcgtgact 6420

gggaaaaccc tggcgttacc caacttaatc gccttgcagc acatccccct ttcgccagct 6480

ggcgtaatag cgaagaggcc cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg 6540

gcgaatggac gcgccctgta gcggcgcatt aagcgcggcg ggtgtggtgg ttacgcgcag 6600

cgtgaccgct acacttgcca gcgccctagc gcccgctcct ttcgctttct tcccttcctt 6660

tctcgccacg ttcgccggct ttccccgtca agctctaaat cgggggctcc ctttagggtt 6720

ccgatttagt gctttacggc acctcgaccc caaaaaactt gattagggtg atggttcacg 6780

tagtgggcca tcgccctgat agacggtttt tcgccctttg acgttggagt ccacgttctt 6840

taatagtgga ctcttgttcc aaactggaac aacactcaac cctatctcgg tctattcttt 6900

tgatttataa gggattttgc cgatttcggc ctattggtta aaaaatgagc tgatttaaca 6960

aaaatttaac gcgaatttta acaaaatatt aacgtttaca atttcctgat gcggtatttt 7020

ctccttacgc atctgtgcgg tatttcacac cgcatatcga ccggtcgagg agaacttcta 7080

gtatatccac atacctaata ttattgcctt attaaaaatg gaatcggaac aattacatca 7140

aaatccacat tctcttcaaa atcaattgtc ctgtacttcc ttgttcatgt gtgttcaaaa 7200

acgttatatt tataggataa ttatactcta tttctcaaca agtaattggt tgtttggccg 7260

agcggtctaa ggcgcctgat tcaagaaata tcttgaccgc agttaactgt gggaatactc 7320

aggtatcgta agatgcaaga gttcgaatct cttagcaacc attatttttt tcctcaacat 7380

aacgagaaca cacaggggcg ctatcgcaca gaatcaaatt cgatgactgg aaattttttg 7440

ttaatttcag aggtcgcctg acgcatatac ctttttcaac tgaaaaattg ggagaaaaag 7500

gaaaggtgag aggccggaac cggcttttca tatagaatag agaagcgttc atgactaaat 7560

gcttgcatca caatacttga agttgacaat attatttaag gacctattgt tttttccaat 7620

aggtggttag caatcgtctt actttctaac ttttcttacc ttttacattt cagcaatata 7680

tatatatatt tcaaggatat accattctaa tgtctgcccc tatgtctgcc cctaagaaga 7740

tcgtcgtttt gccaggtgac cacgttggtc aagaaatcac agccgaagcc attaaggttc 7800

ttaaagctat ttctgatgtt cgttccaatg tcaagttcga tttcgaaaat catttaattg 7860

gtggtgctgc tatcgatgct acaggtgtcc cacttccaga tgaggcgctg gaagcctcca 7920

agaaggttga tgccgttttg ttaggtgctg tgggtggtcc taaatggggt accggtagtg 7980

ttagacctga acaaggttta ctaaaaatcc gtaaagaact tcaattgtac gccaacttaa 8040

gaccatgtaa ctttgcatcc gactctcttt tagacttatc tccaatcaag ccacaatttg 8100

ctaaaggtac tgacttcgtt gttgtcagag aattagtggg aggtatttac tttggtaaga 8160

gaaaggaaga cgatggtgat ggtgtcgctt gggatagtga acaatacacc gttccagaag 8220

tgcaaagaat cacaagaatg gccgctttca tggccctaca acatgagcca ccattgccta 8280

tttggtcctt ggataaagct aatgttttgg cctcttcaag attatggaga aaaactgtgg 8340

aggaaaccat caagaacgaa ttccctacat tgaaggttca acatcaattg attgattctg 8400

ccgccatgat cctagttaag aacccaaccc acctaaatgg tattataatc accagcaaca 8460

tgtttggtga tatcatctcc gatgaagcct ccgttatccc aggttccttg ggtttgttgc 8520

catctgcgtc cttggcctct ttgccagaca agaacaccgc atttggtttg tacgaaccat 8580

gccacggttc tgctccagat ttgccaaaga ataaggttga ccctatcgcc actatcttgt 8640

ctgctgcaat gatgttgaaa ttgtcattga acttgcctga agaaggtaag gccattgaag 8700

atgcagttaa aaaggttttg gatgcaggta tcagaactgg tgatttaggt ggttccaaca 8760

gtaccaccga agtcggtgat gctgtcgccg aagaagttaa gaaaatcctt gcttaaaaag 8820

attctctttt tttatgatat ttgtacataa actttataaa tgaaattcat aatagaaacg 8880

acacgaaatt acaaaatgga atatgttcat agggtagacg aaactatata cgcaatctac 8940

atacatttat caagaaggag aaaaaggagg atagtaaagg aatacaggta agcaaattga 9000

tactaatggc tcaacgtgat aaggaaaaag aattgcactt taacattaat attgacaagg 9060

aggagggcac cacacaaaaa gttaggtgta acagaaaatc atgaaactac gattcctaat 9120

ttgatattgg aggattttct ctaaaaaaaa aaaaatacaa caaataaaaa acactcaatg 9180

acctgaccat ttgatggagt ttaagtcaat accttcttga accatttccc ataatggtga 9240

aagttccctc aagaatttta ctctgtcaga aacggcctta cgacgtagtc gatatggtgc 9300

actctcagta caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agccccgaca cccgccaaca 9360

cccgctgacg cgccctgacg ggcttgtctg ctcccggcat ccgcttacag acaagctgtg 9420

accgtctccg ggagctgcat gtgtcagagg ttttcaccgt catcaccgaa acgcgcga 9478

<210> 6

<211> 186

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 6

aaggcggaga ggaagcgcat gaggaaccgc atcgctgcct ccaagtgccg gaaaaggaag 60

ctggagcgga tcgcccggct agaggaaaaa gtgaaaacct tgaaagcgca aaactccgag 120

ctggcgtcca cggccaacat gctcagggaa caggtggcac agcttaaaca gaaagtcatg 180

aaccac 186

<210> 7

<211> 282

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 7

ggtcgtgcgc agtccatcgg tcgtcgcggt aaagttgaac aactgtcccc ggaagaggaa 60

gagaaacgtc gcatccgccg tgaacgtaac aaaatggcgg cagcgaaatg ccgtaaccgc 120

cgtcgtgaac tgaccgacac cctgcaggcg gaaaccgacc agctggaaga cgaaaaatcc 180

gcgctgcaaa ccgaaatcgc gaacctgctg aaagaaaaag aaaagctgga gttcatcctg 240

gcggcacacc gtccggcgtg caaaatcccg aacgacctgg gt 282

<210> 8

<211> 237

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 8

ggtcgtgcgc agtccatcgg tcgtcgcggt aaagttgaac aactgtcccc ggaagaggaa 60

gagaaacgtc gcatccgccg tgaacgtaac aaaatggcgg cagcgaaatg ccgtaaccgc 120

cgtcgtgaac tgaccgacac cctgcaggcg gaaaccgacc agctggaaga cgaaaaatcc 180

gcggagttca tcctggcggc acaccgtccg gcgtgcaaaa tcccgaacga cctgggt 237

Claims (10)

1.一种检测目的蛋白A与目的蛋白B是否为互作蛋白的方法，包括如下步骤：

(1)将红色荧光蛋白分成N端部分和C端部分；在所述N端部分的编码基因的5’末端或3’末端通过连接序列连接目的蛋白A的编码基因，形成融合基因片段A；在所述C端部分的编码基因的5’末端或3’末端通过所述连接序列连接目的蛋白B的编码基因，形成融合基因片段B；

所述红色荧光蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；所述N端部分的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第1-159位所示；所述C端部分的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第160-236位所示；所述连接序列编码SEQ ID No.2所示连接肽；

(2)将所述融合基因片段A和所述融合基因片段B导入同一受体酵母细胞，得到转基因酵母细胞；培养所述转基因酵母细胞，然后检测所述转基因酵母细胞是否产生红色荧光，根据检测结果按照如下确定所述目的蛋白A与所述目的蛋白B是否互作：若所述转基因酵母细胞产生红色荧光，则所述目的蛋白A与所述目的蛋白B为或候选为互作蛋白；若所述转基因酵母细胞不产生红色荧光，则所述目的蛋白A与所述目的蛋白B不为或候选不为互作蛋白。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述融合基因片段A是通过酵母重组表达载体A导入所述受体酵母细胞中的；所述融合基因片段B是通过酵母重组表达载体B导入所述受体酵母细胞中的；

所述酵母重组表达载体A中启动所述融合基因片段A转录的启动子为pADH启动子；所述酵母重组表达载体B中启动所述融合基因片段B转录的启动子为pADH启动子。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述酵母重组表达载体A为将所述N端部分的编码基因和所述目的蛋白A的编码基因，两者中的一个插入到酵母表达载体A的酶切位点SalI和BglII之间，另一个插入到所述酵母表达载体A的酶切位点SpeI和NotI之间后得到的重组质粒；所述酵母表达载体A的序列如SEQ ID No.4所示；

所述酵母重组表达载体B为将所述C端部分的编码基因和所述目的蛋白B的编码基因，两者中的一个插入到酵母表达载体B的酶切位点SalI和NcoI之间，另一个插入到所述酵母表达载体B的XbaI和NotI两个之间后得到的重组质粒；所述到酵母表达载体B的序列如SEQID No.5所示。

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述红色荧光蛋白的编码基因如SEQ ID No.3所示；所述N端部分的编码基因如SEQ ID No.3的第1-477位所示；所述C端部分的编码基因如SEQ ID No.3的第478-708位所示。

5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述连接序列如SEQ ID No.4的第1586-1630位所示。

6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述受体酵母细胞为酵母细胞AH109。

7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：所述培养的时间为48±4小时。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述培养为将所述转基因酵母细胞在缺陷型液体培养基SD-2中30℃振荡培养24小时，然后转入4℃振荡培养24±4小时。

9.如下(A)或(B)所示的产品：

(A)酵母表达载体组，由酵母表达载体A和酵母表达载体B组成；

所述酵母表达载体A的SEQ ID No.4所示；所述酵母表达载体B的序列如SEQ ID No.5所示；

(B)由所述酵母表达载体组和受体酵母细胞组成的产品。

10.权利要求9所述产品在检测目的蛋白A与目的蛋白B是否为互作蛋白中的应用。

Images