CN111575248A - 一种慢病毒、重组间充质干细胞及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种慢病毒、重组间充质干细胞及其构建方法和应用，慢病毒载体，是过表达TGF‑β1的慢病毒载体，能够感染人间充质干细胞并建立的稳定表达细胞系，其感染效率高；重组间充质干细胞，重组间充质干细胞通过慢病毒感染间充质干细胞得到，为经过表达TGF‑β1的慢病毒载体所感染，感染后能够建立的稳定表达细胞系；重组间充质干细胞的应用，培养重组间充质干细胞并得到外泌体，本发明中得到的外泌体，具有DNA损伤、促进细胞增殖、损伤修复的作用，抑制细胞衰老，在皮肤疾病与再生修复领域具有广阔的用途。

Description

一种慢病毒、重组间充质干细胞及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及一种慢病毒、重组间充质干细胞及其构建方法和应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

基因治疗是一种新型的重组蛋白转运方法，具有明显的优势，包括稳定，有效和永久的基因表达，对受体相同的糖基化模式以及对受体无免疫原性。病毒载体对分裂期及非分裂期细胞均具有感染作用，能使目的基因进入靶细胞并能够稳定长期得表达，可向同一细胞引入多种基因，或对同一细胞进行对此转染，不易引起靶细胞的免疫反应，生物学安全性也较高。

随着时间的流逝，细胞损伤的积累是引发衰老和癌症发作的关键机制之一。细胞衰老可能是由各种细胞类型中的DNA，脂质或蛋白质改变驱动的。成体组织增殖潜能的丧失是促进衰老的主要机制之一，其中包括免疫细胞增殖(如T细胞)的下降、胰腺细胞增殖的年龄依赖性下降以及肝细胞的年龄相关性凋亡。相反，在生理组织中，诸如TGF-β信号通路的细胞抑制和促凋亡作用对于预防高增殖性疾病的产生至关重要。TGF-β诱导的细胞周期抑制能力主要是通过细胞依赖性激酶抑制剂CDKN2B(编码p15/ink4b)、CDKN1A(编码p21/cip/waf1)和p27/kip1上调或通过下调转录因子c-Myc和DNA抑制剂(ID)结合蛋白ID1、ID2和ID3诱导G1/S期阻滞，因此正常细胞建立了保持增殖“记忆”的调节机制，以防止超过一定数量的传代后细胞继续分裂。这些传代能促进与衰老相关的过程，这种增殖性记忆被认为主要是通过端粒缩短来维持的。除了已分化组织的增殖潜能外，更多的证据表明，维持无限的体细胞干细胞增殖和更新能力是延缓衰老和延长寿命的另一个关键先决条件。现有技术将TGF-β或外泌体，和免疫细胞如T细胞共培养，达到激活或调节免疫细胞的作用。

除了TGF-β超家族成员例如BMP-4和Nodal在维持和正常功能的胚胎干细胞种群中已经确立的作用外，越来越多的证据表明TGF-β类因子对于正常的体细胞干细胞生物学也是至关重要的，包括肠道、毛囊表皮、神经和间充质干细胞(MSC)。MSC具有自我更新和多向分化的潜能，成为再生医学领域常用的种子细胞，其来源广泛，可来自骨髓、脐带、脂肪等。MSC具有许多临床应用，因为它通过与淋巴细胞接触具有免疫抑制和抗炎特性，与先天性和适应性免疫反应相关。

通过基因修饰或许可以加强MSC的免疫调节作用，将成为免疫性皮肤疾病的新选择。目前主流的MSC转基因技术使用脂质体转染的方法，该方法细胞毒性大、转染效率低，并且只能转染正在分裂的细胞，因此严重制约了MSC转基因的研究和生产。而慢病毒技术可以克服上述方法的缺点。它对细胞的毒性小，感染效率高，而且可以高效率感染静止期的细胞。但由于现有技术中MSC的转基因效率低，难度高，实现存在一定的困难，领域中一直未能实现。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的第一个目的在于提供一种慢病毒载体，是过表达TGF-β1的慢病毒载体，能够感染人间充质干细胞并建立的稳定表达细胞系，其感染效率高。

本发明的第二个目的在于提供一种重组间充质干细胞，为经过表达TGF-β1的慢病毒载体所感染，感染后能够建立的稳定表达细胞系。

本发明的第三个目的在于提供一种上述重组间充质干细胞的构建方法，该方法重复稳定性良好，方法简单。

本发明的第四个目的在于提供一种上述重组间充质干细胞的应用，为从重组间充质干细胞建立的稳定表达细胞系中获取外泌体，外泌体具有显著的抗衰老作用。

实现本发明的第一个目的可以通过采取如下技术方案达到：一种慢病毒，慢病毒通过将慢病毒载体、包装质粒和表达质粒共转染细胞获得；慢病毒载体包括TGF-β1基因全长序列。

进一步地，慢病毒通过将慢病毒载体、包装质粒VSVG和表达质粒sPA共转染细胞293T获得；包括TGF-β1基因全长序列的慢病毒载体的序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，慢病毒载体、包装质粒VSVG和表达质粒sPA以质量之比3:1:2共转染细胞293T。

实现本发明的第二个目的可以通过采取如下技术方案达到：一种重组间充质干细胞，重组间充质干细胞通过如上所述的慢病毒感染间充质干细胞得到。

实现本发明的第三个目的可以通过采取如下技术方案达到：一种重组间充质干细胞的构建方法，取未感染的间充质干细胞，消化后离心重悬，将细胞悬液接种于培养皿，待细胞贴壁率25-30％时，加入无血清DMEM/F12培养液、含有绿色荧光蛋白的慢病毒和感染增强液进行培养；吸出病毒液并使用完全培养基培养，细胞经消化、离心后重悬，观察增强型绿色荧光蛋白的表达，将绿色荧光蛋白阳性细胞分选出来并传代培养，得到重组间充质干细胞。

进一步地，未感染的间充质干细胞获自以下中的至少一种：脂肪组织、骨髓、牙髓、毛囊、子宫内膜、月经血、外周血、网膜、皮肤、脐带血、华顿氏胶、胎盘或输卵管。

进一步地，待细胞贴壁率25-30％时，加入无血清DMEM/F12培养液、含有绿色荧光蛋白的慢病毒和感染增强液，置于37℃、5％CO₂饱和浓度的条件下培养至少12h。

进一步地，感染增强液为聚凝胺。

进一步地，吸出病毒液并使用完全培养基培养至少96h。

进一步地，含有绿色荧光蛋白的慢病毒按MOI＝50或MOI＝100配制。

实现本发明的第四个目的可以通过采取如下技术方案达到：一种重组间充质干细胞的应用，培养如上所述重组间充质干细胞并得到外泌体。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

1、本发明的慢病毒包括转化生长因子-β1(TGF-β1)，能够促进细胞外基质(ECM)如胶原蛋白、纤粘连蛋白的表达和抑制ECM的降解，对细胞的形态发生、增殖和分化过程起着重要作用，有利于胚胎发育和细胞修复，有改善过敏与免疫调节的作用；

2、本发明的慢病毒能够在培养中实现高水平的转导效率(接近100％)，而且没有免疫原性，感染效率高、细胞毒性小、外源基因表达稳定；能将TGF-β1基因转载至细胞中以调节细胞分泌，这种作用可稳定存在；现有技术中采用的质粒转染间充质干细胞，转染效率低下并且细胞毒性大；

3、本发明重组间充质干细胞的构建方法能够大大提高间充质干细胞的转基因效率，现有技术中间充质干细胞的转基因难度高，效率低；

4、本发明的应用为通过重组间充质干细胞获得外泌体，外泌体是一类由细胞分泌到胞外的囊泡，具有独特的物理化学性质，其直径为30-200nm，密度为1.13-1.19g/mL，组成包括细胞来源相关的脂质、蛋白质、RNA、DNA等物质，在其表面连接有大量的糖链，如甘露糖、聚乳糖胺和α-2，6-唾液酸等；不同细胞的外泌体在产生方式、尺寸、密度和内容物等方面存在明显差异，其调节作用也各不相同；TGF-β1在间充质干细胞中过表达，可以诱导很多与细胞衰老、损伤修复相关细胞因子、microRNA的表达并被包裹到外泌体中；各种原因造成的难愈性创面和瘢痕形成是软组织修复面临的棘手问题，免疫功能失调也是皮肤慢性疾病迁延不愈的重要因素，而这背后的深层机制是皮肤细胞的衰老；本发明中得到的外泌体，具有DNA损伤、促进细胞增殖、损伤修复的作用，抑制细胞衰老，在皮肤疾病与再生修复领域具有广阔的用途。

附图说明

图1为实施例1慢病毒转染细胞的荧光显微镜视图；

图2为实施例1对照慢病毒转染细胞的荧光显微镜视图；

图3为实施例2细胞阳性率曲线图；

图4为实施例4DAPI标记的A组细胞激光共聚焦显微镜视图；

图5为实施例4抗53BP1抗体标记的A组细胞激光共聚焦显微镜视图；

图6为实施例4抗γ-H2AX抗体标记的A组细胞激光共聚焦显微镜视图；

图7为实施例4DAPI标记的B组细胞激光共聚焦显微镜视图；

图8为实施例4抗53BP1抗体标记的B组细胞激光共聚焦显微镜视图；

图9为实施例4抗γ-H2AX抗体标记的B组细胞激光共聚焦显微镜视图；

图10为实施例4C组染色视图；

图11为实施例4D组染色视图。

具体实施方式

下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述：

实施例1：

慢病毒的制备：

将包括TGF-β1基因全长序列和增强型绿色荧光蛋白基因的慢病毒载体、包装质粒VSVG和表达质粒sPA以质量之比3:1:2共转染细胞293T，转染72h后收集培养上清，浓缩，采用Millipore公司截留分子量100kD的超滤管超滤离心，使得慢病毒原液浓缩50倍以上；收获的慢病毒用PBS悬浮，并分装到无菌EP管中，-80℃冰箱保存，得到慢病毒；慢病毒载体的序列如SEQ ID NO.1所示。

慢病毒滴度检测：

将293T细胞消化成单细胞悬液，采用细胞计数仪对细胞密度计数。将293T细胞加入到12孔板中培养，每孔1.0×10⁵个干细胞，共11孔。第1孔最为对照，不加入慢病毒。第2-6孔分别加入1、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、系列稀释的实施例1慢病毒。第7-11孔分别加入1、1^0-1、10^-2、10^-3、10^-4、系列稀释的对照慢病毒(不含TGF-β1)。然后把细胞置于含有5％CO₂的37℃细胞培养箱中培养48h，荧光显微镜下观察每孔带荧光的细胞个数，如图1-2所示，图1为实施例1慢病毒转染细胞的荧光显微镜视图，图2为对照慢病毒转染细胞的荧光显微镜视图，实施例1慢病毒和对照慢病毒的滴度约10⁸TU/mL。

实施例2：

1)间充质干细胞的获得：对离体的脂肪组织进行1500rpm离心5min，弃掉上层油脂和下层血性细胞层，取中间脂肪层，使用PBS清洗脂肪3-5次，直到清洗液清澈；最后一次清洗所得混合物进行1500rpm离心5min，吸取脂肪，记录脂肪体积；得脂肪按照1:1使用消化酶进行消化，37℃恒温摇床150-280rp m消化20-60min；消化结束后，2000rpm离心5min，弃掉上层油脂层及消化后的脂肪层，留下层干细胞沉淀及少量的消化液，加入等体积的FBS进行终止；终止后混合物进行1500rpm离心5min，收集脂肪干细胞，使用PBS重悬，1500rpm清洗2次，去除前期使用的双抗和FBS；所得细胞计数。

使用原代培养基重悬脂肪干细胞，100um过滤，按照3-5*10e5密度接种于T75培养瓶中，37℃，5％二氧化碳培养箱进行孵育；接种后24-48h，观察细胞贴壁状态，原代培养基全量换液，去除未贴壁的悬浮细胞；每隔2-3d进行一次原代培养基的换液，至细胞融合度达到80-90％；对融合度达到80-90％的脂肪干细胞进行传代，弃掉原培养液，PBS清洗3次，细胞消化液进行消化处理，收集所得脂肪干细胞，进行细胞计数，使用传代培养基按照3-5*10e5接种于T75培养瓶中，37℃，5％二氧化碳培养箱进行孵育；重复上述步骤至传代到P3，进行保存。

消化酶的配置：90mL PBS中添加胶原酶I 72mg，胶原酶IV 18mg，过滤之后，加入0.125wt％Trypsin-EDTA混匀，制成100mL；

原代培养基的配置：DMEM-F12培养基455mL中加入HPL血清替代物45mL，再加入1000IU肝素钠；

传代培养基的配置：DMEM-F12培养基455mL加入HPL血清替代物45mL，加入bFGF10mg，再加入1000IU肝素钠。

2)重组间充质干细胞的构建：

先将1)获得的未感染的间充质干细胞复苏：将冻存的干细胞从液氮罐中取出放入37℃水浴，边摇晃使其充分溶化；1000rpm离心3min，吸走冻存液，用培养基重悬细胞，收集细胞种到细胞瓶中；细胞计数，细胞种植密度：8000个/cm²；细胞传代培养，3天传代一次。

取未感染的间充质干细胞，胰酶消化后离心重悬，将1×10⁵/mL细胞悬液接种于培养皿，设置三个组：TGF-β1慢病毒组、慢病毒空载体组和空白组；待细胞贴壁率25-30％时，TGF-β1慢病毒组加入无血清DMEM/F12培养液、M OI＝50含有绿色荧光蛋白的慢病毒和聚凝胺(Sigma,cat.no.H9268)，慢病毒空载体组加入无血清DMEM培养液、慢病毒空载体及聚凝胺(Sigma,cat.no.H9268)，空白组仅加入无血清DMEM/F12培养液。置于37℃、5％CO₂饱和浓度的条件下培养12h；吸出病毒液并使用完全培养基(含有10％胎牛血清的DME M/F1)培养，每2d换液1次，96h后细胞经0.25％胰蛋白酶消化、PBS清洗离心2次后重悬，调整细胞浓度为5×10⁵个/mL，取200uL细胞悬液观察增强型绿色荧光蛋白的表达，将绿色荧光蛋白阳性细胞分选出来并传代培养，得到重组间充质干细胞。

阳性率检测：

采用流式细胞术检测TGF-β1慢病毒组细胞、慢病毒空载体组细胞的阳性率，检测时以空白组细胞为阴性对照，流式细胞仪选用FITC通道。阳性率如图3所示曲线a为空白组，曲线b为TGF-β1慢病毒组，曲线c为慢病毒空载体组。从图3得知，TGF-β1慢病毒组和慢病毒空载体组细胞的阳性率均超过90％。

实施例3：

获得外泌体：

实施例2中获得的重组间充质干细胞在300、2000和10000g离心，去除细胞、细胞碎片和大囊泡，随后在110000g条件下收集沉淀，最后用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗沉淀以去除可溶的干扰蛋白质，收获外泌体。

实施例4：

用实施例3得到的外泌体处理CHL-1人皮肤黑色素瘤细胞：

实验分为两组：A组表达TGF-β1的MSC外泌体处理组，B组不表达TG F-β1的MSC外泌体处理组；分别使用表达TGF-β1的MSC外泌体和不表达TGF-β1的MSC外泌体处理CHL-1细胞，然后加入0.1wt％的过氧化氢处理30min，然后用DAPI、抗53BP1抗体、抗γ-H2AX抗体对细胞进行标记，然后进行激光共聚焦显微镜观察。如图4-6为A组用DAPI、抗53BP1抗体、抗γ-H2AX抗体标记的激光共聚焦显微镜视图，图7-9为B组用DAPI、抗53BP1抗体、抗γ-H2AX抗体标记的激光共聚焦显微镜视图。可以发现，表达TGF-β1的M SC的外泌体可以显著降低过氧化氢诱导的衰老(53BP1及γ-H2AX聚集点越多，说明细胞越衰老)。

外泌体对小鼠皮肤抗衰老的功能：C组表达TGF-β1的MSC外泌体处理组，D组不表达TGF-β1的MSC外泌体处理组；取两组BALB/C小鼠，剃光背部的毛，首先分别使用MSC外泌体涂抹处理，然后用0.1wt％浓度的过氧化氢处理30min，然后快速处死小鼠，取皮肤组织进行β半乳糖苷酶活性染色(β-galacto sidase(SA-b-gal)activity)。C组染色视图如图10所示，D组染色视图如图11所示。可以发现，表达C组可以显著降低过氧化氢诱导的衰老(聚集点越多，说明细胞越衰老)。

对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。

序列表

<110> 艾一生命科技（广东）有限公司

<120> 一种慢病毒、重组间充质干细胞及其构建方法和应用

<130> 2020

<141> 2020-05-27

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 10092

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aagcttaatg tagtcttatg caatactctt gtagtcttgc aacatggtaa cgatgagtta 60

gcaacatgcc ttacaaggag agaaaaagca ccgtgcatgc cgattggtgg aagtaaggtg 120

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gggggcggtg ttcgccgaga tcggcccgcg catggccgag ttgagcggtt cccggctggc 5640

cgcgcagcaa cagatggaag gcctcctggc gccgcaccgg cccaaggagc ccgcgtggtt 5700

cctggccacc gtcggcgtct cgcccgacca ccagggcaag ggtctgggca gcgccgtcgt 5760

gctccccgga gtggaggcgg ccgagcgcgc cggggtgccc gccttcctgg agacctccgc 5820

gccccgcaac ctccccttct acgagcggct cggcttcacc gtcaccgccg acgtcgaggt 5880

gcccgaagga ccgcgcacct ggtgcatgac ccgcaagccc ggtgcctgag cggccgcgtc 5940

gacaatcaac ctctggatta caaaatttgt gaaagattga ctggtattct taactatgtt 6000

gctcctttta cgctatgtgg atacgctgct ttaatgcctt tgtatcatgc tattgcttcc 6060

cgtatggctt tcattttctc ctccttgtat aaatcctggt tgctgtctct ttatgaggag 6120

ttgtggcccg ttgtcaggca acgtggcgtg gtgtgcactg tgtttgctga cgcaaccccc 6180

actggttggg gcattgccac cacctgtcag ctcctttccg ggactttcgc tttccccctc 6240

cctattgcca cggcggaact catcgccgcc tgccttgccc gctgctggac aggggctcgg 6300

ctgttgggca ctgacaattc cgtggtgttg tcggggaagc tgacgtcctt tccatggctg 6360

ctcgcctgtg ttgccacctg gattctgcgc gggacgtcct tctgctacgt cccttcggcc 6420

ctcaatccag cggaccttcc ttcccgcggc ctgctgccgg ctctgcggcc tcttccgcgt 6480

cttcgccttc gccctcagac gagtcggatc tccctttggg ccgcctcccc gcctggaatt 6540

cgagctcggt acctttaaga ccaatgactt acaaggcagc tgtagatctt agccactttt 6600

taaaagaaaa ggggggactg gaagggctaa ttcactccca acgaagacaa gatctgcttt 6660

ttgcttgtac tgggtctctc tggttagacc agatctgagc ctgggagctc tctggctaac 6720

tagggaaccc actgcttaag cctcaataaa gcttgccttg agtgcttcaa gtagtgtgtg 6780

cccgtctgtt gtgtgactct ggtaactaga gatccctcag acccttttag tcagtgtgga 6840

aaatctctag cagtagtagt tcatgtcatc ttattattca gtatttataa cttgcaaaga 6900

aatgaatatc agagagtgag aggaacttgt ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa 6960

gcaatagcat cacaaatttc acaaataaag catttttttc actgcattct agttgtggtt 7020

tgtccaaact catcaatgta tcttatcatg tctggctcta gctatcccgc ccctaactcc 7080

gcccatcccg cccctaactc cgcccagttc cgcccattct ccgccccatg gctgactaat 7140

tttttttatt tatgcagagg ccgaggccgc ctcggcctct gagctattcc agaagtagtg 7200

aggaggcttt tttggaggcc tagggacgta cccaattcgc cctatagtga gtcgtattac 7260

gcgcgctcac tggccgtcgt tttacaacgt cgtgactggg aaaaccctgg cgttacccaa 7320

cttaatcgcc ttgcagcaca tccccctttc gccagctggc gtaatagcga agaggcccgc 7380

accgatcgcc cttcccaaca gttgcgcagc ctgaatggcg aatgggacgc gccctgtagc 7440

ggcgcattaa gcgcggcggg tgtggtggtt acgcgcagcg tgaccgctac acttgccagc 7500

gccctagcgc ccgctccttt cgctttcttc ccttcctttc tcgccacgtt cgccggcttt 7560

ccccgtcaag ctctaaatcg ggggctccct ttagggttcc gatttagtgc tttacggcac 7620

ctcgacccca aaaaacttga ttagggtgat ggttcacgta gtgggccatc gccctgatag 7680

acggtttttc gccctttgac gttggagtcc acgttcttta atagtggact cttgttccaa 7740

actggaacaa cactcaaccc tatctcggtc tattcttttg atttataagg gattttgccg 7800

atttcggcct attggttaaa aaatgagctg atttaacaaa aatttaacgc gaattttaac 7860

aaaatattaa cgcttacaat ttaggtggca cttttcgggg aaatgtgcgc ggaaccccta 7920

tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct catgagacaa taaccctgat 7980

aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat tcaacatttc cgtgtcgccc 8040

ttattccctt ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga 8100

aagtaaaaga tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg ttacatcgaa ctggatctca 8160

acagcggtaa gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg ttttccaatg atgagcactt 8220

ttaaagttct gctatgtggc gcggtattat cccgtattga cgccgggcaa gagcaactcg 8280

gtcgccgcat acactattct cagaatgact tggttgagta ctcaccagtc acagaaaagc 8340

atcttacgga tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc tgccataacc atgagtgata 8400

acactgcggc caacttactt ctgacaacga tcggaggacc gaaggagcta accgcttttt 8460

tgcacaacat gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg ggaaccggag ctgaatgaag 8520

ccataccaaa cgacgagcgt gacaccacga tgcctgtagc aatggcaaca acgttgcgca 8580

aactattaac tggcgaacta cttactctag cttcccggca acaattaata gactggatgg 8640

aggcggataa agttgcagga ccacttctgc gctcggccct tccggctggc tggtttattg 8700

ctgataaatc tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggtat cattgcagca ctggggccag 8760

atggtaagcc ctcccgtatc gtagttatct acacgacggg gagtcaggca actatggatg 8820

aacgaaatag acagatcgct gagataggtg cctcactgat taagcattgg taactgtcag 8880

accaagttta ctcatatata ctttagattg atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga 8940

tctaggtgaa gatccttttt gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt 9000

tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc 9060

tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc 9120

cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac 9180

caaatactgt tcttctagtg tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac 9240

cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt 9300

cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct 9360

gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat 9420

acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt 9480

atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg 9540

cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt 9600

gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt 9660

tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg 9720

tggataaccg tattaccgcc tttgagtgag ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg 9780

agcgcagcga gtcagtgagc gaggaagcgg aagagcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc 9840

ccgcgcgttg gccgattcat taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg 9900

gcagtgagcg caacgcaatt aatgtgagtt agctcactca ttaggcaccc caggctttac 9960

actttatgct tccggctcgt atgttgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag 10020

gaaacagcta tgaccatgat tacgccaagc gcgcaattaa ccctcactaa agggaacaaa 10080

agctggagct gc 10092

Claims (10)

1.一种慢病毒，其特征在于，所述慢病毒通过将慢病毒载体、包装质粒和表达质粒共转染细胞获得；所述慢病毒载体包括TGF-β1基因全长序列。

2.如权利要求1所述的慢病毒，其特征在于，所述慢病毒通过将慢病毒载体、包装质粒VSVG和表达质粒sPA共转染细胞293T获得；所述包括TGF-β1基因全长序列的慢病毒载体的序列如SEQ ID NO.1所示。

3.如权利要求1所述的慢病毒，其特征在于，所述慢病毒载体、包装质粒VSVG和表达质粒sPA以质量之比3:1:2共转染细胞293T。

4.一种重组间充质干细胞，其特征在于，所述重组间充质干细胞通过如权利要求1所述的慢病毒感染间充质干细胞得到。

5.一种如权利要求4所述的重组间充质干细胞的构建方法，其特征在于，取未感染的间充质干细胞，消化后离心重悬，将细胞悬液接种于培养皿，待细胞贴壁率25-30％时，加入无血清DMEM/F12培养液、含有绿色荧光蛋白的慢病毒和感染增强液进行培养；吸出病毒液并使用完全培养基培养，细胞经消化、离心后重悬，观察增强型绿色荧光蛋白的表达，将绿色荧光蛋白阳性细胞分选出来并传代培养，得到重组间充质干细胞。

6.如权利要求5所述的重组间充质干细胞的构建方法，其特征在于，所述未感染的间充质干细胞获自以下中的至少一种：脂肪组织、骨髓、牙髓、毛囊、子宫内膜、月经血、外周血、网膜、皮肤、脐带血、华顿氏胶、胎盘或输卵管。

7.如权利要求5所述的重组间充质干细胞的构建方法，其特征在于，待细胞贴壁率25-30％时，加入无血清DMEM/F12培养液、含有绿色荧光蛋白的慢病毒和感染增强液，置于37℃、5％CO₂饱和浓度的条件下培养至少12h。

8.如权利要求5所述的重组间充质干细胞的构建方法，其特征在于，吸出病毒液并使用完全培养基培养至少96h。

9.如权利要求5所述的重组间充质干细胞的构建方法，其特征在于，所述含有绿色荧光蛋白的慢病毒按MOI＝50或MOI＝100配制。

10.一种重组间充质干细胞的应用，其特征在于，培养如权利要求4所述的重组间充质干细胞并得到外泌体。

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