CN104789589B - 一种猪源产肠毒素大肠杆菌鞭毛蛋白3FliCon融合蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种猪源产肠毒素大肠杆菌鞭毛蛋白3FliCon融合蛋白及其应用，本发明提供了一种猪源ETEC3个拷贝基因fliC的重组质粒pRSET‑3FliCon。将该重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)，诱导重组表达菌BL21(DE3)/pRSET‑3FliCon表达融合蛋白3FliCon。利用表达的重组蛋白主动免疫新西兰雄兔，制备了针对这种蛋白的血清抗体，验证了重组蛋白具有良好的抗原性，培养肠上皮细胞系IPEC‑J2，利用抑制粘附试验，证明了猪源ETEC鞭毛在参与粘附小肠上皮细胞过程中起重要作用。利用该融合蛋白制备的鸡卵黄抗体能抑制ETEC在体外对上皮细胞的粘附，且抑制不同血清型的ETEC菌株。

Description

一种猪源产肠毒素大肠杆菌鞭毛蛋白3FliCon融合蛋白及其 应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种猪源产肠毒素大肠杆菌鞭毛蛋白3FliCon融合蛋白及其应用，通过构建猪源肠毒素大肠杆菌的3个拷贝的鞭毛基因fliC重组质粒pRSET-3FliCon，将其转入大肠杆菌表达融合蛋白。利用该融合蛋白制备的鸡卵黄抗体能抑制ETEC在体外对上皮细胞的粘附，且抑制不同血清型的ETEC菌株。

背景技术

ETEC是引起新生仔猪和断奶仔猪腹泻的最主要病原菌之一(Nagy et al.,1990；Harel et al.,1991)。其引起的腹泻死亡率上升，使得生产效率降低和治疗成本增高，给畜牧业造成了巨大的经济损失(Gaastra and Svennerholm,1996)。ETEC引起腹泻的毒力因子主要包括：粘附素和肠毒素(Turner et al.,2006)，其能够形成多种毒力因子以适应宿主(Smith and Halls,1967)。ETEC通过粘附素介导粘附肠粘膜上皮细胞，以便细菌定殖并大量繁殖，随后分泌大量的肠毒素，造成肠粘膜上皮细胞的病理变化，引起腹泻(Qadri etal.,2005)。

在世界养猪业中ETEC是引起仔猪腹泻的主要的病原菌之一(Broes et al.,1988)。由于肠道大肠杆菌引起的一些疾病对养猪业造成了很大影响，引起人们对仔猪管理方面的重视。现在仔猪腹泻较明显的主要导致出生1-7天新生仔猪腹泻和断奶后一周的断奶仔猪腹泻(Amezcue et al.,2002；Verdonck et al.,2002)。ETEC引起的新生仔猪和断奶仔猪腹泻对养猪业造成了巨大损失，主要体现为仔猪腹泻，导致生长停滞，提高死亡率等(Verdonck et al.,2002)。据Gyles报道，在养猪业中，ETEC引起的腹泻是最普遍的肠道疾病，全球每年100,000头腹泻仔猪中死亡率高达50％(Gyles,1994)。

鞭毛主要是螺旋菌、弧菌及多数杆菌和少数球菌的细胞膜表面一种丝状结构蛋白，不仅是细菌的运动器官，而且鞭毛与细菌毒力有关，它在细菌的趋化作用和运动性中起重要作用(Bardy et al.,2003)。现有研究发现细菌的鞭毛能参与粘附粘膜和上皮细胞，如：绿脓杆菌(Arora et al.,1996)、霍乱弧菌(Richardson et al.,1991)、幽门螺杆菌(Eaton et al.,1996)、类鼻疽伯克霍尔德菌(Brett et al.,1994)。Chua等采用同源重组技术对假单胞杆菌强毒株KHW的fliC基因缺失突变，研究发现该突变菌株无鞭毛，并且在半固体琼脂培养基上无运动性。实验证明，与野生型假单胞杆菌相比，其繁殖能力并没降低，但丧失了毒力功能。在感染老鼠后，从小鼠肺和脾中几乎分离不到该细菌。Jorge等(2002)用肠致病性大肠杆菌(EPEC)感染3h的HeLa细胞，通过利用免疫荧光标记对鞭毛进行标记，发现EPEC的鞭毛能够直接参与该细菌粘附宿主细胞，但发现其运动功能对其粘附宿主细胞作用不大。

Koushik Roy等(2009a)发现人源的产肠毒素大肠杆菌(H10407)分泌的双伴侣分泌蛋白EtpA(双伴侣胞外分泌蛋白)能够介导鞭毛与肠上皮细胞(HCT-8和Caco-2细胞系)粘附过程。通过试验作者发现抗EtpA抗体和抗鞭毛蛋白抗体能够抑制多种H血清型的ETEC粘附宿主细胞。为预防ETEC性腹泻提供两种具有一定广谱性的免疫抗原。在参与粘附过程中，Koushik Roy等通过构建完整(1-498aa)和不完整的FliC蛋白(1-173aa和174-498aa区域)进行免疫共沉淀捕获EtpA蛋白，发现完整的FliC蛋白和不完整的FliC蛋白(1-173aa区域)都能与EtpA蛋白作用，而不完整的FliC蛋白(174-498aa区域)不能与EtpA蛋白作用，同时以完整的FliC蛋白和不完整的FliC蛋白(1-173aa区域)两个蛋白作为免疫原都能起到抑制细菌粘附宿主细胞的效果，也进一步确定了参与粘附作用的主要是鞭毛蛋白FliC的保守区域(1-173aa区域)。现有研究报道，猪源ETEC(F18ab)鞭毛蛋白作为一种重要的毒力因子参与感染猪源细胞系IPEC-J2(Duan et al.,2012)。从而推测猪源ETEC鞭毛蛋白可以作为一种候选蛋白作为预防仔猪腹泻的疫苗研制。

大量研究结果表明，通过给幼龄动物提供外源抗体(包括血清抗体和卵黄抗体)能够有效的提高被动免疫水平，对于预防和治疗细菌和病毒感染(特别是肠道腹泻)是一种较为有效的途径(Hatta et al.,1993；王劼,2007)。

基于以上研究背景，本研究以鞭毛蛋白FliC保守区域作为候选抗原，利用基因工程方法克隆表达含3个拷贝的FliC保守区域的融合蛋白，获得大量目的蛋白。通过免疫新西兰雄兔来生产针对FliC抗原的特异性多克隆血清抗体，旨在制备一种成本低廉的具有预防仔猪腹泻的疫苗。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种猪源ETEC3个拷贝基因fliC的重组质粒pRSET-3FliCon，其序列为SEQ ID NO.1所示。

本发明的另一个目的在于提供了一种含有重组质粒pRSET-3FliCon的基因工程菌。将重组质粒pRSET-3FliCon转化入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)，该基因工程菌能够表达鞭毛蛋白3FliCon融合蛋白。

本发明还有一个目的在于提供了一种猪源产肠毒素大肠杆菌鞭毛蛋白3FliCon融合蛋白，其序列为SEQ ID NO.2所示。该融合蛋白免疫原性好，生产成本低。利用该融合蛋白制备的兔血清抗体，可在体外有效抑制大肠杆菌粘附。将该蛋白免疫蛋鸡后，可获得具有抗ETEC的鸡蛋。

本发明还有一个目的在于提供了一种人源产肠毒素大肠杆菌鞭毛蛋白2FliC融合蛋白的复性方法，方法简单，易行，采用SKL，氧化型谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽对表达的目的蛋白进行复性。在后期免疫过程中获得了较高效价的卵黄抗体。

本发明还有一个目的在于提供了一种利用3FliCon融合蛋白制备的卵黄抗体，该卵黄抗体具有广谱性抑制ETEC粘附的作用。

本发明最后一个目的在于提供了一种卵黄抗体在制备抗猪源产肠毒素大肠杆菌免疫疫苗中的应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种重组质粒pRSET-3FliCon的制备方法(图1)，其具体步骤如下：

在NCBI中查找序列号AY906918全长1464bp，保守区是5ˊ端的519bp。以猪源产肠毒素大肠杆菌标准菌株K88ac为试验材料，设计引物。本发明克隆的重组质粒，是利用多串联体构建技术等基因工程技术和利用BamHⅠ和BglⅡ一对同尾酶的原理，将3个编码鞭毛5ˊ端保守区的核苷酸序列插入原核表达载体pRSET-B中构建而成。将构建好的重组质粒命名为pRSET-3FliCon，其序列为SEQ ID NO.1所示。

重组蛋白3FliCon诱导表达及提取纯化

一种猪源鞭毛蛋白3FliCon融合蛋白，其制备方法如下：

将重组质粒pRSET-3FliCon转化大肠杆菌BL21(DE3)，以诱导物异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(I sopropyl-β-d-Thiogalactoside，IPTG)做诱导表达。以不同的诱导温度和诱导剂浓度进行优化表达条件，得到最佳诱导表达条件：37℃摇床培养至OD₆₀₀达到0.5-1.0，加入诱导剂IPTG至终浓度为0.5mM，诱导培养3-4h，最终表达量达到45％左右，主要以包涵体形式存在。诱导后的重组菌经压力破碎、变性和复性浓缩后得到3FliCon融合蛋白，其序列为SEQ ID NO.2所示，采用Bradford法测定蛋白质浓度。

一种人源产肠毒素大肠杆菌鞭毛蛋白2FliC融合蛋白的复性方法，其步骤如下：

接种菌株至300mL培养基中，诱导表达，从培养液中收集菌体，再重悬于预冷的30ml的BufferA中，压力破碎仪破碎3-5次，离心保留沉淀，30ml BufferA重悬沉淀，缓慢加入10％SKL，不停搅拌至沉淀溶解，溶液澄清，4℃静置2h。继续加入终浓度0.2％的PEG4000、600μL氧化型谷胱甘肽与还原型谷胱甘肽，4℃静置2h，10000rpm离心15min弃去未溶解的菌体杂质，即得。

BufferA：Tris6.055g，EDTA0.186g，NaCl2.925g，甘油50mL，加入ddH₂O定容至1L，使用前现加入DTT至终浓度0.5mmol/L。

一种利用3FliCon融合蛋白制备的卵黄抗体，其步骤如下：

向复性、浓缩后的3FliCon融合蛋白溶液中加入灭菌的tween-80至终浓度4％，再与等体积白油佐剂在组织匀浆机中混合30min，充分乳化至蛋白浓度为0.5mg/mL。将蛋鸡随机分2组，空白组50只(生理盐水)和免疫组100只。采用胸部肌肉注射(每侧500μL)。首免2周后各组分别用相同油乳苗加强免疫一次，间隔2周再次免疫，二免后每周各组随机采集5枚鸡蛋，提纯收集卵黄抗体，间接ELISA监测抗体效价变化，western-blot鉴定卵黄抗体的特异性，待卵黄抗体效价达1:2⁹后收集鸡蛋。将收集的鸡蛋去壳，搅拌，喷雾干燥(进气150℃，出气70℃)，冷却后装入密封的样品袋内。

一种卵黄抗体在制备抗猪源产肠毒素大肠杆菌免疫疫苗中的应用，其应用过程如下：

体外抑制细菌粘附试验检测卵黄抗体在体外具有抗粘附作用，以产肠毒素大肠杆菌K88ac、F41和2134P粘附IPEC-J2细胞，发现添加卵黄抗体组与对照组细菌粘附率都有降低，其中K88ac和F41中有显著差异(P<0.01)，而2134P中无显著差异(P>0.05)。证实了卵黄抗体具有抗粘附效果，同时具有一定的广谱性抑制粘附效果。

与现有技术相比，本发明具备以下优点：

1)申请人针对按照常规表达方法对猪源鞭毛蛋白进行表达后，无目的蛋白表达的问题。通过分析其蛋白特性，采用pRSET-B上的一对同尾酶来构建含有2个拷贝和3个拷贝的重组质粒pRSET-2FliCon和pRSET-3FliCon，经检测发现在相应大小处有目的蛋白的表达，利用目的蛋白制备的卵黄抗体，可显著抑制产肠毒素大肠杆菌对细胞的粘附作用，并具备一定的广谱性。

2)本实验中表达的目的蛋白主要在包涵体中存在，为了使后期制备抗体效价更高，抗体效果更好，我们通过采用SKL，氧化型谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽对表达的目的蛋白进行复性。在后期免疫过程中获得了较高效价的卵黄抗体。

附图说明

图1为PCR扩增fliC保守区域产物的琼脂糖凝胶电泳示意图。

图中产物fliC保守区域分子量大小为519bp；M为DNA分子标准DL2000。

图2为重组表达质粒pRSET-3FliCon的双酶切鉴定电泳示意图。

图中M分别为DNA分子量标准DL2000和1KD；泳道1：pRSET-3FliCon，泳道2：

pRSET-2FliCon，泳道3：pRSET-FliCon，插入片段分别为1363bp、1103bp和565bp。

图3为基因工程菌IPTG诱导蛋白表达前后的SDS-PAGE电泳检测示意图。

图中1、2分别代表空载体诱导前后；3、4分别代表重组蛋白2FliCon诱导前后；5、6分别代表重组蛋白3FliCon诱导前后。重组蛋白3FliCon分子量为60KD。

图4为基因工程菌诱导后重组蛋白可溶性分析示意图。

图中1、2：BL21(DE3)/pRSET-3FliCon诱导表达后上清和沉淀；M为蛋白质分子量标准。

图5为浓缩复性后融合蛋白3FliCon的SDS-PAGE电泳分析示意图。

图中1、2：重组蛋白3FliCon浓缩前和浓缩后；M为蛋白质分子量标准。

图6为Western-Blotting检测重组蛋白3FliCon的抗原性示意图。

图7为猪源产肠毒素大肠杆菌(K88ac)生长曲线示意图。

图8为猪源产肠毒素大肠杆菌(K88ac)粘附猪源肠上皮细胞系(IPEC-J2)示意图。

图9为血清抗体对猪源ETEC和猪源肠上皮细胞(IPEC-J2)的抗粘附效果示意图，*表示差异显著，**表示差异极显著。

图10为第二次免疫后卵黄抗体效价随时间的变化规律示意图。

图11为Western-Blot检测卵黄抗体的特异性示意图。

图12为卵黄抗体对几种猪源ETEC和猪源肠上皮细胞(IPEC-J2)的抗粘附效果示意图。

A表示抑制K88ac粘附细胞，B表示抑制2134P和F41粘附细胞；*表示差异显著，**表示差异极显著。

具体实施方式

下列具体实施例中未经特别说明的方法均参照美J.萨姆布鲁克和D.W.拉塞尔(J.萨姆布鲁克和D.W.拉塞尔著，黄培堂等译。分子克隆实验指南(第三版)，北京：科学出版社，2002年)。本发明所用试剂，细胞或菌株，若无特别说明，均来源于商业渠道。

实施例1：

肠毒素大肠杆菌3个拷贝基因fliC的重组质粒重组质粒的构建

1、本实施例使用的菌株和质粒载体见下表1。

表1菌株和质粒

2、主要试剂和试剂盒

PCR相关试剂：Taq DNA聚合酶、dNTP(2.5mM)、10×Taq buffer、DNA marker (2kb和10kb)：北京全式金生物技术有限公司；

限制性内切酶：大连宝生物工程有限公司；

琼脂糖：Biowest Agarose分装；

胰蛋白胨、酵母提取物：英国OXOID；

胰酶消化大豆肉汤：美国碧迪医疗器械有限公司；

DNA凝胶回收试剂盒：上海生工生物技术有限公司；

质粒提取试剂盒：上海生工生物技术有限公司。

3、溶液配制

3.1细菌DNA提取相关溶液

PBS(0.012M)：称取NaCl8g，KCl0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O3.58g，KH₂PO₄0.27g，加ddH₂O定容至1L，分装121℃灭菌30min。

氯仿/异戊醇(24：1)：氯仿480ml，异戊醇20ml，混匀移入棕色玻璃瓶中4℃保存。

蛋白酶K(20mg/mL)：称取粉末20mg溶于ddH₂O1mL，混匀-20℃保存。

3.2培养基

1)LB培养基:胰蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，NaCl1g，琼脂粉1.5g(LB平板)，加ddH₂O溶解至100mL,搅拌均匀，锡箔纸密封高压蒸汽灭菌30min。

2)TSB：称取0.3g TSB，加ddH₂O溶解至100mL，同1)灭菌。

3)氨苄青霉素储液(100mg/mL)：在无菌操作台将1g粉末加入10mL ddH₂O溶解，无菌滤器过滤，分装至1.5mL EP管，-20℃保存。

4)卡那霉素储液(50mg/mL)：在无菌操作台将1g粉末加入20mL ddH₂O溶解，其余同(3)。

3.3DNA凝胶电泳相关溶液

1)50×TAE：Tris242g，EDTA37.2g，冰乙酸57.1mL，加ddH₂O溶解至900mL,调节pH至8.0，定容至1L。使用时稀释到1×TAE即可。

2)6×DNA上样缓冲液：EDTA7.4g，蔗糖40g，二甲苯腈0.25g，溴酚蓝0.25g,加ddH₂O溶解至100mL,搅拌均匀，四度保存。

3)EB染液(10mg/mL)：称取1g粉末，小心加入100mLddH₂O，搅拌至完全溶解，锡纸包裹瓶身室温保存。使用时每200mL ddH₂O加入10μL EB。注意EB为强诱变剂，操作时注意全身防护。

4、3个串联体FliC保守区重组质粒的构建

构建重组质粒过程。

4.1细菌DNA的提取

1)在无菌操作台中，从斜面培养基中挑取ETEC K88ac菌液涂TSB平板，次日挑取单菌落于5mL TSB培养基中，37℃过夜培养。

2)次日10000rpm离心收集菌体，PBS洗涤2次并重悬菌体至500μL。

3)加入100μL10％SDS，10μL20mg/mL蛋白酶K，50℃孵育3h或37℃过夜。

4)上清中加入等体积苯酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，颠倒混匀5min，10000rpm离心5min，转移上清。重复一次。

5)加入等体积氯仿/异戊醇，颠倒混匀5min，10000rpm离心5min，转移上清。

6)加入0.6(V/V)异丙醇，颠倒混匀，静置5min，10000rpm离心5min，收集的沉淀经预冷的75％酒精洗涤，晾干后溶于100μL ddH₂O中，-20℃保存。

4.2引物设计

根据NCBI上报道的人源ETEC鞭毛(fliC)基因序列(序列号为AY906918)设计合

成引物(见表2)。

表2 PCR扩增引物

注：F，上游引物；R，下游引物；黑体字为保护性碱基；下划线表示酶切位点。

4.3PCR扩增目的基因

加入ddH₂O先将A，B两对引物稀释至10μM,基因组DNA稀释至0.05mg/mL。以25μL反应体系为例(单位：μL)：

ddH₂O 17μL

10×Easy Taq Buffer 2.5μL

dNTP 2μL

Taq DNA聚合酶 0.5μL

上游引物 1μL

下游引物 1μL

DNA模板 1μL

反应条件95℃预变性3min，进行35次循环(94℃变性30s，最适退火温度下退火30s，72℃延伸1min(根据片段长度确定时间))，再72℃延伸10min，最后4℃保存。获得两个目的片段。

4.4PCR产物检测与回收

采用琼脂糖凝胶电泳法进行检测。琼脂糖凝胶浓度为1％-1.5％，染液含溴化乙锭(EB)0.25μg/μL，缓冲液为1×TAE，以100V恒压电泳20-30min后，置凝胶成像系统中观察分析并拍照。

制备1％琼脂糖凝胶，使用宽梳子，点20μL样品于点样孔中，100-150V稳定电泳20-30min。然后在紫外灯下切取目的片段所在的凝胶，放于1.5mL离心管中。按照AXYGEN DNA胶回收试剂盒的操作说明进行PCR产物的回收纯化。用30μLddH₂O溶解回收的DNA片段，-20℃保存备用。

4.5重组表达载体的构建

1)制备感受态DH5α：

将冻存在甘油管中的E.coli DH5α接种于LB琼脂平板上培养，37℃恒温培养过夜(16-18h)。无菌条件下，将活化的菌挑取单菌落接种于含100mL LB培养基的锥形瓶中。于37℃剧烈震荡2-4h,至出现云雾状菌悬液即可。将100mL菌液分别装入50mL已灭菌并冰上预冷的80mL离心管中，用天平平衡两管的重量，冰上静置30min。静置后将离心管在4℃、4000rpm/min离心10min，将上清倒入废液缸，倒置离心管于吸水纸上，使培养基流尽。两管各取10mL冰预冷的0.1mol/L CaCl₂重悬沉淀，并在冰上静置30min，两管各分5mL于10mL冰预冷的10mL离心管中，将10mL离心管在4℃、4000rpm/min离心10min，将上清倒入废液缸，倒置离心管于吸水纸上，使液体流尽。每10mL离心管加入1mLCaCl₂重悬沉淀，将4管合成一管，加入0.7-1mL甘油吹吸混匀，将感受态细胞按每100μL分装至1.5mL离心管，于-80℃冻存备用。

2)重组表达载体pRSET-FliCon的构建

用A引物对扩增的目的片段不含终止密码子，B引物对扩增的目的片段含有终止密码子。将含有保护性碱基的目的片段(不含终止密码子和含终止密码子)和pRSET-B用相同的限制性内切酶分别进行酶切和回收，都按20μL体系酶切：

ddH₂O 6μL

BamH I 1μL

Sac I 1μL

BSA 2μL

10×K 2μL

质粒DNA 8μL

回收带有粘性末端的目的片段和pRSET-B片段按以下20μL的连接体系进行连接：

Target DNA 10μL

pRSET-B 7μL

10×T4buffer 2μL

T4ligase 1μL

4℃连接过夜后，取10μL转化DH5α感受态细胞，复苏后将菌液均匀涂到LB琼脂平板(含Amp100μg/mL)上，培养过夜。分别挑取平板上的多个单菌落于500μL(含Amp 100μg/mL)LB培养基中，37℃225r/min振荡培养过夜。取1μL菌液进行PCR检测。PCR 检测呈阳性的克隆，进行质粒的提取和酶切鉴定。将酶切鉴定正确的重组质粒送至北京奥科鼎盛生物科技有限公司。

3)重组表达载体pRSET-2FliCon的构建

用引物C-F和C-R对上述构建好的重组质粒pRSET-FliCon(不含终止密码子)和重组质粒pRSET-FliCon(含终止密码子)进行PCR扩增，回收目的片段。将回收的目的片段用BamH I和Hind III进行双酶切，同时将重组质粒pRSET-FliCon(不含终止密码子)用BglⅡ和Hind III进行双酶切。回收带有粘性末端的目的片段和pRSET-FliCon(不含终止密码子)片段按以下20μL的连接体系进行连接：

Target DNA 10μL

pRSET-FliCon 7μL

10×T4buffer 2μL

T4ligase 1μL

4℃连接过夜后，取10μL转化DH5α感受态细胞，复苏后将菌液均匀涂到LB琼脂平板(含Amp100μg/mL)上，培养过夜。分别挑取平板上的多个单菌落于500μL(含Amp 100μg/mL)LB培养基中，37℃225r/min振荡培养过夜。取1μL菌液进行PCR检测。PCR检测呈阳性的克隆，进行质粒的提取和酶切鉴定。将酶切鉴定正确的重组质粒送至北京奥科鼎盛生物科技有限公司。

4)重组表达载体pRSET-3FliCon的构建

用引物C-F和C-R对上述构建好的pRSET-2FliCon(含终止密码子)进行PCR扩增，回收目的片段。将回收的目的片段用BamH I和Hind III进行双酶切，同时将重组质粒pRSET-2FliCon(不含终止密码子)用BglⅡ和Hind III进行双酶切。回收带有粘性末端的目的片段和pRSET-2FliCon(不含终止密码子)片段按以下20μL的连接体系进行连接：

Target DNA 10μL

pRSET-2FliCon 7μL

10×T4buffer 2μL

T4ligase 1μL

4℃连接过夜后，取10μL转化DH5α感受态细胞，复苏后将菌液均匀涂到LB琼脂平板(含Amp100μg/mL)上，培养过夜。分别挑取平板上的多个单菌落于500μL(含Amp 100μg/mL)LB培养基中，37℃225r/min振荡培养过夜。取1μL菌液进行PCR检测。PCR检测呈阳性的克隆，进行质粒的提取和酶切鉴定。将酶切鉴定正确的重组质粒送至北京奥科鼎盛生物科技有限公司。

为书写简便，将重组表达质粒简写为：pRSET-3FliCon，3FliCon融合基因的序列为SEQ ID NO.3所示。以BamH I和Hind III对重组质粒做酶切，结果见图2。

本发明获得的pRSET-3FliCon经双酶切后经琼脂糖凝胶电泳后，在约1363bp分别观察到目的片段，所得的阳性克隆子测序结果与前期确定的序列比对显示与预期的碱基序列和大小均一致，重组质粒序列如SEQ ID NO.1所示。

实施例2：重组蛋白的诱导表达和提取纯化

1、试剂

胰蛋白胨、酵母提取物：英国OXOID；

胰酶消化大豆肉汤：美国碧迪医疗器械有限公司；

Tris碱，甘氨酸，SDS：Amresco分装；

IPTG，Amp，Kan，氧化型谷胱甘肽，还原型谷胱甘肽，PEG4000：BIOSHARP分装；

2、溶液配制

LB培养基如实施例1中所示。

IPTG储液(1mol/L)：在无菌操作台将1g的粉末加入4.2mL灭菌ddH₂O，无菌滤器过滤后分装至1.5mLEP管中。

SDS-PAGE电泳相关溶液：

1)2×蛋白上样液：Tris-HCl(1M,pH＝6.8)10mL，SDS4g，溴酚蓝200mg，甘油20mL，加ddH₂O定容至100mL，使用时加入2-3％β-巯基乙醇(现配现用)。

2)5×电泳缓冲液：Tris15.10g，Gly72.06g，SDS5g，加ddH₂O定容至1L。使用时稀释5倍。

3)30％聚丙烯酰胺：依次称取N,N'-甲叉双丙烯酰胺1g，丙烯酰胺29g，加ddH₂O定容至100mL，转入棕色瓶中四度保存。称量过程注意防护。

4)分离胶缓冲液：Tris18.17g，加ddH₂O90mL，浓HCl调节pH至8.8,定容至100mL，四度保存。

5)浓缩胶缓冲液：Tris12.11g，加ddH₂O90mL，浓HCl调节pH至6.8,定容至100mL，四度保存。

6)10％SDS：称取十二烷基硫酸钠10g，加ddH₂O定容至100mL，常温保存。

7)10％过硫酸铵：称取过硫酸铵0.1g至EP管中，加入1mLddH₂O，四度保存，两周内使用。

8)1％TEMED：吸取N,N,N',N'-四甲基乙二胺1mL，加ddH₂O至100mL，转入棕色瓶中四度保存。注意环境通风。

9)考马斯亮蓝染色液：考马斯亮蓝R-2501.25g，甲醇450mL，冰乙酸50mL，加ddH₂O450mL。

10)脱色液：甲醇50mL，冰乙酸75mL，加入ddH₂O875mL混匀。

包涵体纯化相关试剂：

1)BufferA：Tris6.055g，EDTA0.186g，NaCl2.925g，甘油50mL，加入ddH₂O定容至1L。使用前现加入DTT至终浓度0.5mmol/L。

2)10％SKL：称取十二烷基肌酸钠1g，加入ddH₂O10mL，搅拌至溶解完全。

3)50mM氧化型谷胱甘肽：1g包装的粉末加入ddH₂O32.65mL，吹吸至溶解。

4)100mM还原型谷胱甘肽：1g包装的粉末加入ddH₂O32.54mL，同上。

5)20％PEG4000：称取聚乙二醇400020g，加入ddH₂O定容至100mL。

6)透析袋处理液A(2％碳酸氢钠，1mMEDTA，pH8.0)：称取碳酸氢钠20g，EDTA0.372g，加ddH₂O至900mL，调节pH至8.0，定容至1L。

7)透析袋处理液B(1mM EDTA，pH8.0)：A液中去除碳酸氢钠即可。

3、重组蛋白的诱导表达和SDS-PAGE检测

将构建成功的表达质粒转化表达菌株BL21(DE3)，挑取单菌落过夜培养。次日菌液按1％接种量加入到5mL含抗性的新鲜培养基中，37℃摇床培养3-4h。当OD₆₀₀达到0.5-1.0时，加入IPTG至终浓度1mmol/L，继续培养3-4h。取500μL菌液离心收集菌体，50μLPBS重悬，等体积加入上样液，沸水浴5min，取10μL上清进行SDS-PAGE电泳检测。对照不添加诱导剂培养相同时间。

4、重组蛋白的可溶性分析

如上将重组表达菌株接种至50mL的LB中扩大培养，收集诱导表达的菌体，5mLbufferA充分重悬菌体，置于冰上。待压力破碎仪温度降至4℃，开始破碎菌体，重复3遍。离心分离上清，5mLbufferA充分重悬沉淀，各取50μL以进行SDS-PAGE电泳分析。

5、重组蛋白的提取纯化

接种重组表达菌至300mL培养基中，以优化后的条件诱导表达。从培养液中收集菌体，再重悬于预冷的1/10体积的BufferA中，压力破碎仪破碎3-5次，注意整个过程保持低温。离心保留沉淀，以同等上述体积的BufferA充分重悬沉淀，缓慢加入10％SKL，不停搅拌至沉淀溶解，溶液澄清，4℃静置2h。继续加入终浓度0.2％的PEG4000、600μL氧化型谷胱甘肽与还原型谷胱甘肽，4℃静置2h，10000rpm离心15min弃去未溶解的菌体杂质。透析袋处理方法：将透析袋按20-30cm的长度剪裁。在A液中沸水浴10min，蒸馏水清洗。在B液中沸水浴10min，蒸馏水清洗，4℃保存。取用时注意带手套。复性的蛋白液装入处理好的透析袋，共2天，期间换液数次，PEG包埋透析袋浓缩至所需浓度。SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度，Bradford法测定蛋白浓度。

6、试验结果

IPTG诱导重组大肠杆菌BL21(DE3)/pRSET-3FliCon表达，结果见图3。相应位置有预期大小的蛋白出现，3FliCon分子量分别约为60KD，表达量约45％。可溶性分析显示(见图4)蛋白均大部分以包涵体的形式存在于沉淀中，上清中极少。图4显示确定重组蛋白诱导条件为37℃摇床培养至OD₆₀₀达到0.5-1.0，加入IPTG至适宜浓度0.5mM，继续培养3-4h，收集菌体。纯化后，蛋白浓度是0.63g/L。

本发明构建的3FliCon融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例3：以重组蛋白免疫新西兰白兔制备血清抗体

1、试剂

弗氏完全佐剂(CFA)和弗氏不完全佐剂(IFA)(Sigma公司，美国)。

辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，为SBA公司产品。

显色液Supersignal west pico试验试剂盒：Thermo

2、溶液配制

ELISA相关试剂：

PBS(0.012M)：称取NaCl8g，KCl0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O3.58g，KH₂PO₄0.27g，加ddH₂O定容至1L，分装121℃灭菌30min。

包被液(0.05M碳酸盐缓冲液)：NaHCO₃2.93g，Na₂CO₃1.59g，加入ddH₂O900mL 溶解完全后调节pH至9.6，定容至1L，常温放置。

洗涤液：PBS中加入终浓度为0.05％的吐温-20。

封闭液：3％的牛血清白蛋白(BSA)溶于洗涤液中。

OPD显色液：邻苯二胺80mg，0.1mol/L柠檬酸4.86mL，0.2mol/L Na₂HPO₄5.14mL，ddH₂O10mL，最后加入30％H₂O₂30μL。现配现用。

终止液(2M H₂SO₄)：浓硫酸22.2mL，蒸馏水182mL，酸沿着杯壁慢慢加入水中，并不停搅匀。

western-blot相关试剂：

膜转移缓冲液：Tris5.8g，甘氨酸2.9g，SDS0.37g，甲醇200mL，ddH₂O定容至1L。

TBS：Tris2.42g，NaCl8.78g，ddH₂O900mL，盐酸调节pH至8.0，定容1L。

TBST：TBS中加入终浓度为0.05％的吐温-20。

封闭液：含1％BSA的TBST。

显色液：将A液、B液以1:1的比例混合，现配现用。

3、免疫兔制备血清抗体

每种抗原准备两只新西兰白兔。将与等体积完全弗氏佐剂混合，充分乳化，于新西兰白兔背部皮下多点注射，剂量为约500μg免疫原/只。2周左右，进行第二次免疫，将免疫原与等体积不完全佐剂混合，充分乳化，于新西兰白兔背部皮下多点注射，进行加强免疫一次，后期每隔一周后加强免疫(2次)。免疫第四次后，进行静脉采血(待测血样)，ELISA 检测抗血清效价。直至抗体水平升到高峰，心脏采血收集血清。至-20℃保存备用。

4、间接ELISA测定血清抗体效价

用方阵滴定法确定最佳抗原包被量与抗体稀释度。取酶标板(8×12孔)，横排将抗体从1:400倍比稀释到1:51200，竖排将抗原从1:100倍比稀释到1:3200，进行ELISA试验。整个试验重复三次，综合三次结果，以OD₄₅₀值接近1的抗原作为最佳抗原包被浓度。

将样品用包被液稀释加至聚苯乙烯微量反应孔内，100μL/孔，阴性对照取1孔(1:400)，用保鲜膜封住反应孔，4℃过夜(或37℃4h)。倾去孔内液体，加洗涤液至反应孔，200μL/孔，放置3min后倾去孔内液体，重复3次(或5次)，最后一次将反应板倒置于吸水纸上，除尽孔内液体。取封闭液100μL/孔，37℃密封温育1h。倾去孔内液体，加洗涤液至反应孔，200μL/孔，放置3min后倾去孔内液体，重复3次(或5次)，最后一次将反应板倒置于吸水纸上，除尽孔内液体。每孔加不同稀释倍数的一抗100μL(抗体从1:400倍比稀释到1:51200)，阴性孔中加较低稀释倍数的100μL免疫前血清，37℃密封温育1h。倾去孔内液体，加洗涤液至反应孔，200μL/孔，放置3min后倾去孔内液体，重复3次(或5次)，最后一次将反应板倒置于吸水纸上，除尽孔内液体。每孔加100μL二抗，合适浓度(稀释3000倍)，37℃密封温育1h。倾去孔内液体，加洗涤液至反应孔，200μL/孔，放置3min后倾去孔内液体，重复3次(或5次)，最后一次将反应板倒置于吸水纸上，除尽孔内液体。取新鲜配制的底物溶液100μL/孔，37℃密封温育至各阳性反应孔显色明显的梯度，加终止液50μL/孔，终止反应，用酶标仪读取在各孔450nm处的吸光度(A₄₅₀),当A₄₅₀(待测样品)/A₄₅₀(阴性)﹥2.1时，结果为阳性。

5、western-blot检测重组蛋白免疫原性

1)SDS-PAGE电泳：将蛋白样品按实例2方法电泳。

2)转膜：采用湿法转移，电转液冰上预冷

3)拆去玻璃板，取出凝胶，根据marker和分子量大小将目的条带附近1cm宽度的胶切下来浸泡在电转液中。

4)根据胶的尺寸裁剪出相同大小的滤纸和PVDF膜。滤纸浸泡在电转液中，膜先在甲醇中浸润约30s，转移至ddH2O漂洗1-2min，之后浸泡在电转液中。

5)依次将塑料板黑面、海绵、2层滤纸、凝胶、PVDF膜、2层滤纸、海绵对齐放好，注意赶走膜与胶之间的气泡，塑料板白面与黑面夹紧，放入电转槽中。

6)开启电源，100V恒压电泳1-1.5h(根据蛋白分子量)。

7)封闭：取出PVDF膜用TBST稍加漂洗，浸没在含封闭液的平皿中缓慢摇荡2h。

8)一抗孵育：将一抗用封闭液以1:1000稀释，PVDF膜浸没其中，4℃过夜。

9)二抗孵育：TBST漂洗膜三次，每次5-10min。二抗用封闭液以1:10000稀释，PVDF膜室温摇床孵育1h。

10)ECL显色：TBST漂洗膜3次，TBS漂洗膜2次，每次5-10min。打开成像系统，预冷30min。将混合好的显色液均匀覆盖到PVDF膜上，及时拍照保存图片。

6、实验结果

免疫新西兰兔后，通过ELISA检测抗体效价证明重组蛋白具有良好的免疫原性，能够引起兔的免疫应答反应，并产生相应的特异性抗体。在第四次免疫后3FliCon的血清抗体效价达到12800，第五次免疫后发现效价达到51200。

采用Western blotting检测结果显示重组蛋白的免疫原性良好，再次证明了血清抗体制备成功。

实施例4：

血清抗体在体外抑制大肠杆菌粘附中的应用，应用过程如下：

1、细胞系

猪源小肠上皮细胞系IPEC-J2；

2、试验材料

菌株：大肠杆菌标准菌C83715(O8：K88ac)购自中国兽医监察所。

细胞培养与染色：胎牛血清(Gibico公司，美国)、DEME/F12培养基(Gibico公司，美国)、胰蛋白酶(Sigma公司，美国)、NaH₂PO₄·2H₂O、Na₂HPO₄·12H₂O、NaCl、多聚甲醛(国药集团化学试剂有限公司，中国)。

细菌培养：胰蛋白胨，酵母提取物、麦康凯培养基。

血清抗体为实施例3制备得到，3FliCon的血清抗体由融合蛋白3FliCon免疫兔所得(效价为51200)。

3、ETEC生长曲线的测定

取ETEC标准菌单菌落，接种于3mL的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，另取10mLLB液体培养基，分别加入100μL过夜培养的菌液(每株菌3个重复)，接种1h后，每隔60min取菌液测其OD₆₀₀值，背景为LB培养基，以横轴为时间，纵轴为OD₆₀₀值作图，画出各个ETEC标准菌的生长曲线。每一小时吸取100μL菌液进行稀释平板计数(每个稀释度涂3个平板)。

4、细菌粘附试验

在10mLLB培养基中，按1/100接种细菌，于37℃225r/min振荡培养至细菌达到生长对数期。以100:1的感染复数加入到细胞培养板中。温育1h后，用无菌的PBS洗脱3次，除去未粘附的细菌。

5、抑制细菌粘附试验

在10mLLB培养基中，按1/100接种细菌，于37℃225r/min振荡培养至细菌达到生长对数期。分别加600μL菌液于1.5mL的离心管中，在5000r/min离心5min，去上清，加入600μL的细胞培养基，对于处理组添加50μL的血清抗体。将对照组和处理组都置于37℃孵育1h。在接种细胞的12孔板中接种细菌，37℃温育1h。用无菌的PBS洗脱3次，除去未粘附的细菌，与细胞粘附的细菌经0.1％Triton-X-100磷酸盐孵育5-10min，将悬液稀释一定倍数(3个稀释倍数，每个稀释倍数涂3个)，均匀涂布LB平板，粘附的细菌数即菌落数(CFU)。粘附率＝粘附细菌数/添加细菌数(每个处理重复三次)。

本试验中数据采用SAS(1990)软件中GLM程序进行单因素方差分析；并在单因素方差分析基础上进行多重比较。P<0.05时差异显著，P<0.01时差异极显著。

6、试验结果

对于猪源ETEC(K88ac)生长曲线的测定(结果如图7)，发现在0-1h阶段细菌生长处于生长稳定期，2-8h阶段处于生长对数期，8h后就进入生长平台期。同时发现猪源ETEC 菌株在3-4h处于生长对数期的中期阶段，在这个阶段细菌活性可用于后面的粘附试验。对于3-4h对细菌进行稀释平板计数，确定其在这个阶段的细菌数为4-8×10⁹cfu/mL。

将生长至对数中期的猪源ETEC(K88ac)添加到6孔板培养的细胞IPEC-J2中，共孵育1-2小时，在荧光倒置显微镜观察各种猪源ETEC粘附情况。结果显示K88ac能够粘附于IPEC-J2细胞，适合用于抑制细菌粘附试验(图8)。

采用稀释平板计数统计粘附情况，每个处理3个重复，取平均值进行比较。未添加血清抗体时，K88ac的粘附率为1.79％，；添加血清抗体时，K88ac的粘附率为1.03％。

如图9所示，以猪源ETEC(K88ac)进行细胞粘附试验，与对照组相比，菌株K88ac在添加特异性血清抗体后细菌粘附数显著降低(P<0.01)。从而验证了制备的血清抗体具有抗粘附效果。

实施例5：

以重组蛋白免疫蛋鸡制备卵黄抗体

1、试剂

白油，硬质酸铝，司本-80，吐温-80：武汉科前生物制品有限责任公司。

HRP兔抗鸡IgG：sigma

显色液Supersignal west pico试验试剂盒：Thermo

2、溶液配制

ELISA相关试剂：

PBS(0.012M)：称取NaCl8g，KCl0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O3.58g，KH₂PO₄0.27g，加ddH₂O定容至1L，分装121℃灭菌30min。

包被液(0.05M碳酸盐缓冲液)：NaHCO₃2.93g，Na₂CO₃1.59g，加入ddH₂O900mL 溶解完全后调节pH至9.6，定容至1L，常温放置。

洗涤液：PBS中加入终浓度为0.05％的吐温-20。

封闭液：3％的牛血清白蛋白(BSA)溶于洗涤液中。

OPD显色液：邻苯二胺80mg，0.1mol/L柠檬酸4.86mL，0.2mol/L Na₂HPO₄5.14mL，ddH₂O10mL，最后加入30％H₂O₂30μL。现配现用。

终止液(2M H₂SO₄)：浓硫酸22.2mL，蒸馏水182mL，酸沿着杯壁慢慢加入水中，并不停搅匀。

western-blot相关试剂：

膜转移缓冲液：Tris5.8g，甘氨酸2.9g，SDS0.37g，甲醇200mL，ddH₂O定容至1L。

TBS：Tris2.42g，NaCl8.78g，ddH₂O900mL，盐酸调节pH至8.0，定容1L。

TBST：TBS中加入终浓度为0.05％的吐温-20。

封闭液：含1％BSA的TBST。

显色液：将A液、B液以1:1的比例混合，现配现用。

3、重组蛋白油乳苗的制备

白油94mL，硬脂酸铝2g，搅拌均匀，加热至80度左右，并持续搅拌至溶液澄清。缓慢加入6mL的司班-80，继续搅拌20min，冷却后即为白油佐剂，4℃保存。向复性、浓缩后的蛋白溶液中加入灭菌的tween-80至终浓度4％，再与等体积白油佐剂在组织匀浆机中混合30min，充分乳化至蛋白浓度为0.5mg/mL。

4、蛋鸡的免疫

选择20周龄笼养罗曼蛋鸡450只，将蛋鸡随机分5组，空白组50只(生理盐水)和免疫组100只。采用胸部肌肉注射(每侧500μL)。首免2周后各组分别用相同油乳苗加强免疫一次，间隔2周再次免疫，二免后每周各组随机采集鸡蛋ELISA监测看抗体效价变化，待卵黄抗体效价达1:2⁹后收集鸡蛋，低温保存。

5、喷雾干燥全蛋粉

将收集的鸡蛋去壳，搅拌，喷雾干燥(进气150℃，出气70℃)，冷却后装入密封的样品袋内。采集喷雾干燥中不同时间段的全蛋粉，抗体提纯方法同新鲜鸡蛋，间接ELISA检测抗体效价。

6、卵黄抗体的纯化

水稀释法，具体步骤如下：

分离蛋黄，即在蛋壳一端打破一个小孔，将蛋清流尽，扩大破壳范围，蛋黄放置于滤纸上来回滚动，直至蛋清吸干。扎破蛋黄膜，收集蛋黄液于离心管中。蛋黄液用8倍体积的蒸馏水稀释，搅拌均匀，盐酸调节pH至5.0-5.2，4℃放置6h或过夜。10000rpm离心20min，收集上清得到水溶性组分WSF(water-solve fract)。上清加入硫酸铵至50％饱和度，搅拌均匀，4℃放置2h或过夜，充分沉淀，10000rpm离心10min，弃上清，沉淀溶于PBS至原蛋黄液体积。加入硫酸铵至33％饱和度，重复以上步骤。4℃透析24h，-20℃保存备用。

7、间接ELISA测定卵黄抗体效价

二免后一周开始采集鸡蛋，每周随机从100只蛋鸡中收集5枚鸡蛋，提取抗体后，以重组蛋白包被抗原，间接ELISA测定二免后1-7周的抗体效价。喷雾干燥过程前、中、后段样品，提取抗体后以同样方法检测效价。

方阵滴定法确定最佳抗原包被浓度。将抗原分别用包被液做倍比稀释(1:400，1:800，1:1600，1:3200，1:6400)，每孔100μL包被聚苯乙烯反应板，每个稀释度两个平行孔，4℃过夜。测定样品时将样品按需要倍比稀释，酶标兔抗鸡IgG用PBST作1：10000稀释，进行ELISA检测，具体样品测定步骤如下：

1)将抗原按每孔100μL包被聚苯乙烯反应板，4℃过夜；

2)弃去液体，PBST洗涤3次拍干，加封闭液每孔100μL，37℃孵育2小时；

3)如上洗涤，加入待测抗体每孔100μL(用PBST稀释)，37℃孵育1小时；

4)如上洗涤，加入酶标二抗(PBST稀释)每孔100μL，37℃孵育1小时；

5)如上洗涤，加入现配的OPD显色液100μL，37℃避光孵育15min；

6)每孔加终止液50μL，在450nm波长下测量各孔的OD值，以空白孔调零。待测抗体OD值与阴性对照的比值大于2.1时判为阳性，抗体效价即为出现阳性反应时的最高稀释度。

1)将抗原按每孔100μL包被聚苯乙烯反应板，4℃过夜；

2)弃去液体，PBST洗涤3次拍干，加封闭液每孔100μL，37℃孵育2小时；

3)如上洗涤，加入待测抗体每孔100μL(用PBST稀释)，37℃孵育1小时；

4)如上洗涤，加入酶标二抗(PBST稀释)每孔100μL，37℃孵育1小时；

5)如上洗涤，加入现配的OPD显色液100μL，37℃避光孵育15min；

6)每孔加终止液50μL，在450nm波长下测量各孔的OD值，以空白孔调零。待测抗体OD值与阴性对照的比值大于2.1时判为阳性，抗体效价即为出现阳性反应时的最高稀释度。

8、western-blot检测重组蛋白免疫原性

1)SDS-PAGE电泳：将蛋白样品按实例2方法电泳。

2)转膜：采用湿法转移，电转液冰上预冷

3)拆去玻璃板，取出凝胶，根据marker和分子量大小将目的条带附近1cm宽度的胶切下来浸泡在电转液中。

4)根据胶的尺寸裁剪出相同大小的滤纸和PVDF膜。滤纸浸泡在电转液中，膜先在甲醇中浸润约30s，转移至ddH2O漂洗1-2min，之后浸泡在电转液中。

5)依次将塑料板黑面、海绵、2层滤纸、凝胶、PVDF膜、2层滤纸、海绵对齐放好，注意赶走膜与胶之间的气泡，塑料板白面与黑面夹紧，放入电转槽中。

6)开启电源，100V恒压电泳1-1.5h(根据蛋白分子量)。

7)封闭：取出PVDF膜用TBST稍加漂洗，浸没在含封闭液的平皿中缓慢摇荡2h。

8)一抗孵育：将一抗用封闭液以1:1000稀释，PVDF膜浸没其中，4℃过夜。

9)二抗孵育：TBST漂洗膜三次，每次5-10min。二抗用封闭液以1:10000稀释，PVDF膜室温摇床孵育1h。

10)ECL显色：TBST漂洗膜3次，TBS漂洗膜2次，每次5-10min。打开成像系统，预冷30min。将混合好的显色液均匀覆盖到PVDF膜上，及时拍照保存图片。

9、试验结果

蛋鸡免疫后，通过抗体效价的检测证明重组蛋白具有良好的免疫原性，能够引起蛋鸡的免疫应答反应，并可产生相应的特异性抗体。在二免后一周3FliCon的抗体效价分别达到了50000，二免后第二周出现效价升高，至第七周抗体效价分别达到160000，未出现效价下降的趋势。

实施例6：

卵黄抗体在制备抗猪源肠毒素大肠杆菌免疫疫苗中的应用，其步骤如下：

1、细胞系

猪源小肠上皮细胞系IPEC-J2；

2、试验材料

菌株：大肠杆菌标准菌C83715(O8：K88ac)和C83921(F41)购自中国兽医监察所。F18ac(2134P)由扬州大学兽医院成大荣教授惠赠(成大荣，2005)。

细胞培养与染色：胎牛血清(Gibico公司，美国)、DEME/F12培养基(Gibico公司，美国)、胰蛋白酶(Sigma公司，美国)、NaH₂PO₄·2H₂O、Na₂HPO₄·12H₂O、NaCl、多聚甲醛(国药集团化学试剂有限公司，中国)。

细菌培养：胰蛋白胨，酵母提取物、麦康凯培养基。

卵黄抗体为实施例3制备得到，抗3FliCon的卵黄抗体由融合蛋白3FliCon免疫兔所得(浓度为10mg/mL，效价为160000)。

3、抑制粘附试验

在10mLLB培养基中，按1/100接种细菌，于37℃225r/min振荡培养至细菌达到生长对数期。分别加600μL菌液于1.5mL的离心管中，在5000r/min离心5min，去上清，加入600μL的细胞培养基，对于处理组添加50μL的卵黄抗体。将对照组和处理组都置于37℃孵育1h。在接种细胞的12孔板中接种细菌，37℃温育1h。用无菌的PBS洗脱3次，除去未粘附的细菌，与细胞粘附的细菌经0.1％Triton-X-100磷酸盐孵育5-10min，将悬液稀释一定倍数(3个稀释倍数，每个稀释倍数涂3个)，均匀涂布LB平板，粘附的细菌数即菌落数(CFU)。粘附率＝粘附细菌数/添加细菌数(每个处理重复三次)。

本试验中数据采用SAS(1990)软件中GLM程序进行单因素方差分析；并在单因素方差分析基础上进行多重比较。P<0.05时差异显著，P<0.01时差异极显著。

4、试验结果与分析

以三种能够粘附IPEC-J2细胞的猪源ETEC，进行抑制粘附试验。

采用稀释平板计数统计粘附情况，每个处理3个重复，取平均值进行比较。未添加卵黄抗体时，K88ac的粘附率为4.73％，2134P的粘附率为15.8％，F41的粘附率为13.35％；添加卵黄抗体时，K88ac的粘附率为2.72％，2134P的粘附率为14.8％，F41的粘附率为10.53％。如图12所示，以ETEC K88ac进行细胞粘附，与对照组相比，产肠毒素大肠杆菌K88ac和F41在添加特异性卵黄抗体后的细菌粘附数均极显著降低(P<0.01)。而产肠毒素大肠杆菌2134P在粘附过程中，处理组和对照组相比无显著差异，但呈现了一定的下降趋势。通过体外试验验证了卵黄抗体的抗粘附效果，且能抑制不同血清型的ETEC粘附宿主细胞。

SEQUENCE LISTING

<110> 华中农业大学

<120> 一种猪源产肠毒素大肠杆菌鞭毛蛋白3FliCon融合蛋白及其应用

<130> 一种猪源产肠毒素大肠杆菌鞭毛蛋白3FliCon融合蛋白及其应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 4478

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

gatctcgatc ccgcgaaatt aatacgactc actataggga gaccacaacg gtttccctct 60

agaaataatt ttgtttaact ttaagaagga gatatacata tgcggggttc tcatcatcat 120

catcatcatg gtatggctag catgactggt ggacagcaaa tgggtcggga tctgtacgac 180

gatgacgata aggatccgat ggcacaagtc attaatacca acagcctctc gctgatcact 240

caaaataata tcaacaagaa ccagtctgcg ctgtcgagtt ctatcgagcg tctgtcttct 300

ggcttgcgta ttaacagcgc gaaggatgac gccgcaggtc aggcgattgc taaccgtttt 360

acttctaaca ttaaaggcct gactcaggct gcacgtaacg ccaacgacgg tatttctgtt 420

gcgcagacca ctgaaggcgc gctgtccgaa attaacaaca acttacagcg tattcgtgaa 480

ctgacggttc aggcgacgac cggaactaac tccacctctg acctggactc catccaggac 540

gaaatcaaat cccgtcttga cgaaattgac cgcgtatctg gtcagaccca gttcaacggc 600

gtgaacgtgc tgtctaaaga tggctcgatg aaaattcagg tcggcgcgaa cgatggcgaa 660

acgattacta ttgatctgaa gaaaattgac tctgatacgc tgaatctggc tggttttcga 720

gctcgagatc tgatggcaca agtcattaat accaacagcc tctcgctgat cactcaaaat 780

aatatcaaca agaaccagtc tgcgctgtcg agttctatcg agcgtctgtc ttctggcttg 840

cgtattaaca gcgcgaagga tgacgccgca ggtcaggcga ttgctaaccg ttttacttct 900

aacattaaag gcctgactca ggctgcacgt aacgccaacg acggtatttc tgttgcgcag 960

accactgaag gcgcgctgtc cgaaattaac aacaacttac agcgtattcg tgaactgacg 1020

gttcaggcga cgaccggaac taactccacc tctgacctgg actccatcca ggacgaaatc 1080

aaatcccgtc ttgacgaaat tgaccgcgta tctggtcaga cccagttcaa cggcgtgaac 1140

gtgctgtcta aagatggctc gatgaaaatt caggtcggcg cgaacgatgg cgaaacgatt 1200

actattgatc tgaagaaaat tgactctgat acgctgaatc tggctggttt tcgagctcga 1260

gatctgatgg cacaagtcat taataccaac agcctctcgc tgatcactca aaataatatc 1320

aacaagaacc agtctgcgct gtcgagttct atcgagcgtc tgtcttctgg cttgcgtatt 1380

aacagcgcga aggatgacgc cgcaggtcag gcgattgcta accgttttac ttctaacatt 1440

aaaggcctga ctcaggctgc acgtaacgcc aacgacggta tttctgttgc gcagaccact 1500

gaaggcgcgc tgtccgaaat taacaacaac ttacagcgta ttcgtgaact gacggttcag 1560

gcgacgaccg gaactaactc cacctctgac ctggactcca tccaggacga aatcaaatcc 1620

cgtcttgacg aaattgaccg cgtatctggt cagacccagt tcaacggcgt gaacgtgctg 1680

tctaaagatg gctcgatgaa aattcaggtc ggcgcgaacg atggcgaaac gattactatt 1740

gatctgaaga aaattgactc tgatacgctg aatctggctg gtttttgaga gctcgagatc 1800

tgcagctggt accatggaat tcgaagcttg atccggctgc taacaaagcc cgaaaggaag 1860

ctgagttggc tgctgccacc gctgagcaat aactagcata accccttggg gcctctaaac 1920

gggtcttgag gggttttttg ctgaaaggag gaactatatc cggatctggc gtaatagcga 1980

agaggcccgc accgatcgcc cttcccaaca gttgcgcagc ctgaatggcg aatgggacgc 2040

gccctgtagc ggcgcattaa gcgcggcggg tgtggtggtt acgcgcagcg tgaccgctac 2100

acttgccagc gccctagcgc ccgctccttt cgctttcttc ccttcctttc tcgccacgtt 2160

cgccggcttt ccccgtcaag ctctaaatcg ggggctccct ttagggttcc gatttagtgc 2220

tttacggcac ctcgacccca aaaaacttga ttagggtgat ggttcacgta gtgggccatc 2280

gccctgatag acggtttttc gccctttgac gttggagtcc acgttcttta atagtggact 2340

cttgttccaa actggaacaa cactcaaccc tatctcggtc tattcttttg atttataagg 2400

gattttgccg atttcggcct attggttaaa aaatgagctg atttaacaaa aatttaacgc 2460

gaattttaac aaaatattaa cgcttacaat ttaggtggca cttttcgggg aaatgtgcgc 2520

ggaaccccta tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct catgagacaa 2580

taaccctgat aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat tcaacatttc 2640

cgtgtcgccc ttattccctt ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa 2700

acgctggtga aagtaaaaga tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg ttacatcgaa 2760

ctggatctca acagcggtaa gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg ttttccaatg 2820

atgagcactt ttaaagttct gctatgtggc gcggtattat cccgtattga cgccgggcaa 2880

gagcaactcg gtcgccgcat acactattct cagaatgact tggttgagta ctcaccagtc 2940

acagaaaagc atcttacgga tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc tgccataacc 3000

atgagtgata acactgcggc caacttactt ctgacaacga tcggaggacc gaaggagcta 3060

accgcttttt tgcacaacat gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg ggaaccggag 3120

ctgaatgaag ccataccaaa cgacgagcgt gacaccacga tgcctgtagc aatggcaaca 3180

acgttgcgca aactattaac tggcgaacta cttactctag cttcccggca acaattaata 3240

gactggatgg aggcggataa agttgcagga ccacttctgc gctcggccct tccggctggc 3300

tggtttattg ctgataaatc tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggtat cattgcagca 3360

ctggggccag atggtaagcc ctcccgtatc gtagttatct acacgacggg gagtcaggca 3420

actatggatg aacgaaatag acagatcgct gagataggtg cctcactgat taagcattgg 3480

taactgtcag accaagttta ctcatatata ctttagattg atttaaaact tcatttttaa 3540

tttaaaagga tctaggtgaa gatccttttt gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt 3600

gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat 3660

cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg 3720

gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga 3780

gcgcagatac caaatactgt tcttctagtg tagccgtagt taggccacca cttcaagaac 3840

tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt 3900

ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag 3960

cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac gacctacacc 4020

gaactgagat acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag 4080

gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca 4140

gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt 4200

cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc 4260

tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca tgttctttcc tgcgttatcc 4320

cctgattctg tggataaccg tattaccgcc tttgagtgag ctgataccgc tcgccgcagc 4380

cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc gaggaagcgg aagagcgccc aatacgcaaa 4440

ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat taatgcag 4478

<210> 2

<211> 529

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 2

Met Ala Gln Val Ile Asn Thr Asn Ser Leu Ser Leu Ile Thr Gln Asn

1 5 10 15

Asn Ile Asn Lys Asn Gln Ser Ala Leu Ser Ser Ser Ile Glu Arg Leu

20 25 30

Ser Ser Gly Leu Arg Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala Ala Gly Gln

35 40 45

Ala Ile Ala Asn Arg Phe Thr Ser Asn Ile Lys Gly Leu Thr Gln Ala

50 55 60

Ala Arg Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser Val Ala Gln Thr Thr Glu Gly

65 70 75 80

Ala Leu Ser Glu Ile Asn Asn Asn Leu Gln Arg Ile Arg Glu Leu Thr

85 90 95

Val Gln Ala Thr Thr Gly Thr Asn Ser Thr Ser Asp Leu Asp Ser Ile

100 105 110

Gln Asp Glu Ile Lys Ser Arg Leu Asp Glu Ile Asp Arg Val Ser Gly

115 120 125

Gln Thr Gln Phe Asn Gly Val Asn Val Leu Ser Lys Asp Gly Ser Met

130 135 140

Lys Ile Gln Val Gly Ala Asn Asp Gly Glu Thr Ile Thr Ile Asp Leu

145 150 155 160

Lys Lys Ile Asp Ser Asp Thr Leu Asn Leu Ala Gly Phe Arg Ala Arg

165 170 175

Asp Leu Met Ala Gln Val Ile Asn Thr Asn Ser Leu Ser Leu Ile Thr

180 185 190

Gln Asn Asn Ile Asn Lys Asn Gln Ser Ala Leu Ser Ser Ser Ile Glu

195 200 205

Arg Leu Ser Ser Gly Leu Arg Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala Ala

210 215 220

Gly Gln Ala Ile Ala Asn Arg Phe Thr Ser Asn Ile Lys Gly Leu Thr

225 230 235 240

Gln Ala Ala Arg Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser Val Ala Gln Thr Thr

245 250 255

Glu Gly Ala Leu Ser Glu Ile Asn Asn Asn Leu Gln Arg Ile Arg Glu

260 265 270

Leu Thr Val Gln Ala Thr Thr Gly Thr Asn Ser Thr Ser Asp Leu Asp

275 280 285

Ser Ile Gln Asp Glu Ile Lys Ser Arg Leu Asp Glu Ile Asp Arg Val

290 295 300

Ser Gly Gln Thr Gln Phe Asn Gly Val Asn Val Leu Ser Lys Asp Gly

305 310 315 320

Ser Met Lys Ile Gln Val Gly Ala Asn Asp Gly Glu Thr Ile Thr Ile

325 330 335

Asp Leu Lys Lys Ile Asp Ser Asp Thr Leu Asn Leu Ala Gly Phe Arg

340 345 350

Ala Arg Asp Leu Met Ala Gln Val Ile Asn Thr Asn Ser Leu Ser Leu

355 360 365

Ile Thr Gln Asn Asn Ile Asn Lys Asn Gln Ser Ala Leu Ser Ser Ser

370 375 380

Ile Glu Arg Leu Ser Ser Gly Leu Arg Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp

385 390 395 400

Ala Ala Gly Gln Ala Ile Ala Asn Arg Phe Thr Ser Asn Ile Lys Gly

405 410 415

Leu Thr Gln Ala Ala Arg Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser Val Ala Gln

420 425 430

Thr Thr Glu Gly Ala Leu Ser Glu Ile Asn Asn Asn Leu Gln Arg Ile

435 440 445

Arg Glu Leu Thr Val Gln Ala Thr Thr Gly Thr Asn Ser Thr Ser Asp

450 455 460

Leu Asp Ser Ile Gln Asp Glu Ile Lys Ser Arg Leu Asp Glu Ile Asp

465 470 475 480

Arg Val Ser Gly Gln Thr Gln Phe Asn Gly Val Asn Val Leu Ser Lys

485 490 495

Asp Gly Ser Met Lys Ile Gln Val Gly Ala Asn Asp Gly Glu Thr Ile

500 505 510

Thr Ile Asp Leu Lys Lys Ile Asp Ser Asp Thr Leu Asn Leu Ala Gly

515 520 525

Phe

<210> 3

<211> 1590

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

atggcacaag tcattaatac caacagcctc tcgctgatca ctcaaaataa tatcaacaag 60

aaccagtctg cgctgtcgag ttctatcgag cgtctgtctt ctggcttgcg tattaacagc 120

gcgaaggatg acgccgcagg tcaggcgatt gctaaccgtt ttacttctaa cattaaaggc 180

ctgactcagg ctgcacgtaa cgccaacgac ggtatttctg ttgcgcagac cactgaaggc 240

gcgctgtccg aaattaacaa caacttacag cgtattcgtg aactgacggt tcaggcgacg 300

accggaacta actccacctc tgacctggac tccatccagg acgaaatcaa atcccgtctt 360

gacgaaattg accgcgtatc tggtcagacc cagttcaacg gcgtgaacgt gctgtctaaa 420

gatggctcga tgaaaattca ggtcggcgcg aacgatggcg aaacgattac tattgatctg 480

aagaaaattg actctgatac gctgaatctg gctggttttc gagctcgaga tctgatggca 540

caagtcatta ataccaacag cctctcgctg atcactcaaa ataatatcaa caagaaccag 600

tctgcgctgt cgagttctat cgagcgtctg tcttctggct tgcgtattaa cagcgcgaag 660

gatgacgccg caggtcaggc gattgctaac cgttttactt ctaacattaa aggcctgact 720

caggctgcac gtaacgccaa cgacggtatt tctgttgcgc agaccactga aggcgcgctg 780

tccgaaatta acaacaactt acagcgtatt cgtgaactga cggttcaggc gacgaccgga 840

actaactcca cctctgacct ggactccatc caggacgaaa tcaaatcccg tcttgacgaa 900

attgaccgcg tatctggtca gacccagttc aacggcgtga acgtgctgtc taaagatggc 960

tcgatgaaaa ttcaggtcgg cgcgaacgat ggcgaaacga ttactattga tctgaagaaa 1020

attgactctg atacgctgaa tctggctggt tttcgagctc gagatctgat ggcacaagtc 1080

attaatacca acagcctctc gctgatcact caaaataata tcaacaagaa ccagtctgcg 1140

ctgtcgagtt ctatcgagcg tctgtcttct ggcttgcgta ttaacagcgc gaaggatgac 1200

gccgcaggtc aggcgattgc taaccgtttt acttctaaca ttaaaggcct gactcaggct 1260

gcacgtaacg ccaacgacgg tatttctgtt gcgcagacca ctgaaggcgc gctgtccgaa 1320

attaacaaca acttacagcg tattcgtgaa ctgacggttc aggcgacgac cggaactaac 1380

tccacctctg acctggactc catccaggac gaaatcaaat cccgtcttga cgaaattgac 1440

cgcgtatctg gtcagaccca gttcaacggc gtgaacgtgc tgtctaaaga tggctcgatg 1500

aaaattcagg tcggcgcgaa cgatggcgaa acgattacta ttgatctgaa gaaaattgac 1560

tctgatacgc tgaatctggc tggtttttga 1590

Claims (9)

1.一种猪源ETEC3个拷贝基因fliC的重组质粒pRSET-3FliCon，其序列为SEQ ID NO.1所示。

2.含有权利要求1所述重组质粒的基因工程菌。

3.权利要求2所述基因工程菌表达的融合蛋白，其序列为SEQ ID NO.2所示。

4.利用权利要求3所述融合蛋白制备的血清抗体。

5.权利要求4所述的血清抗体在体外抑制大肠杆菌粘附中的应用。

6.利用权利要求3所述的融合蛋白制备的卵黄抗体。

7.权利要求6所述的卵黄抗体在制备抗猪源产肠毒素大肠杆菌免疫疫苗中的应用。

8.权利要求3所述的融合蛋白在制备抗腹泻蛋类中的应用。

9.权利要求3所述融合蛋白的复性方法，其步骤如下：

接种菌株至300mL培养基中，诱导表达，从培养液中收集菌体，再重悬于预冷的30ml的BufferA中，压力破碎仪破碎3-5次，离心保留沉淀，30ml BufferA重悬沉淀，缓慢加入10%SKL，不停搅拌至沉淀溶解，溶液澄清，4℃静置2h，继续加入终浓度0.2%的PEG4000、600μL氧化型谷胱甘肽与还原型谷胱甘肽，4℃静置2h，10000rpm离心15min弃去未溶解的菌体杂质，即得；

所述的BufferA的配方：Tris 6.055g，EDTA 0.186g，NaCl 2.925g，甘油50mL，加入ddH₂O定容至1L，使用前现加入DTT至终浓度0.5mmol/L；

所述的菌株为含有重组质粒pRSET-3FliCon的基因工程菌，pRSET-3FliCon序列为SEQID NO.1所示。