CN103483430A - 蛋白a1g_07050在抗立氏立克次体的免疫保护中的应用 - Google Patents
蛋白a1g_07050在抗立氏立克次体的免疫保护中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103483430A CN103483430A CN201310444429.5A CN201310444429A CN103483430A CN 103483430 A CN103483430 A CN 103483430A CN 201310444429 A CN201310444429 A CN 201310444429A CN 103483430 A CN103483430 A CN 103483430A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- albumen
- protein
- rickettsia rickettsii
- application
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 241000606701 Rickettsia Species 0.000 title abstract description 9
- 229940075118 rickettsia rickettsii Drugs 0.000 claims abstract description 44
- 241000606695 Rickettsia rickettsii Species 0.000 claims abstract description 41
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 19
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 12
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 44
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 27
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 23
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 20
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 14
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 claims description 14
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 claims description 12
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 8
- 208000031726 Spotted Fever Group Rickettsiosis Diseases 0.000 claims description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 7
- 201000004284 spotted fever Diseases 0.000 claims description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 6
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 claims description 6
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 claims description 5
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 2
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 claims description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 abstract description 3
- 206010039207 Rocky Mountain Spotted Fever Diseases 0.000 abstract description 2
- 229940023143 protein vaccine Drugs 0.000 abstract description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 21
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 20
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 17
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 16
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 13
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 12
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 11
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 11
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 10
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 10
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 10
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 10
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 10
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 9
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 8
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 101710153593 Albumin A Proteins 0.000 description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 7
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 7
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 7
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 6
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 6
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 description 6
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 6
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 6
- 101710203389 Outer membrane porin F Proteins 0.000 description 5
- 101710160102 Outer membrane protein B Proteins 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 5
- 238000011735 C3H mouse Methods 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 238000010023 transfer printing Methods 0.000 description 4
- 101150017565 A1G_07050 gene Proteins 0.000 description 3
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 3
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 3
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 3
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 3
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 3
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M Nitrite anion Chemical compound [O-]N=O IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010079246 OMPA outer membrane proteins Proteins 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 101710194807 Protective antigen Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000606699 Rickettsia conorii Species 0.000 description 2
- 241000850368 Rickettsia rickettsii str. 'Sheila Smith' Species 0.000 description 2
- 241000606651 Rickettsiales Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 2
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 229940005654 nitrite ion Drugs 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 2
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- NWXMGUDVXFXRIG-WESIUVDSSA-N (4s,4as,5as,6s,12ar)-4-(dimethylamino)-1,6,10,11,12a-pentahydroxy-6-methyl-3,12-dioxo-4,4a,5,5a-tetrahydrotetracene-2-carboxamide Chemical compound C1=CC=C2[C@](O)(C)[C@H]3C[C@H]4[C@H](N(C)C)C(=O)C(C(N)=O)=C(O)[C@@]4(O)C(=O)C3=C(O)C2=C1O NWXMGUDVXFXRIG-WESIUVDSSA-N 0.000 description 1
- 101710098119 Chaperonin GroEL 2 Proteins 0.000 description 1
- 206010009192 Circulatory collapse Diseases 0.000 description 1
- 241001480819 Dermacentor andersoni Species 0.000 description 1
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 206010019233 Headaches Diseases 0.000 description 1
- 241000350280 Intsia Species 0.000 description 1
- 208000000112 Myalgia Diseases 0.000 description 1
- 101710116435 Outer membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 101001137308 Rickettsia rickettsii Outer membrane protein A Proteins 0.000 description 1
- 241000772420 Rickettsia rickettsii str. Iowa Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- YVNQAIFQFWTPLQ-UHFFFAOYSA-O [4-[[4-(4-ethoxyanilino)phenyl]-[4-[ethyl-[(3-sulfophenyl)methyl]amino]-2-methylphenyl]methylidene]-3-methylcyclohexa-2,5-dien-1-ylidene]-ethyl-[(3-sulfophenyl)methyl]azanium Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C(=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S(O)(=O)=O)C)C=2C(=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S(O)(=O)=O)C)C=C1 YVNQAIFQFWTPLQ-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 description 1
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000003837 chick embryo Anatomy 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 231100000869 headache Toxicity 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 239000011229 interlayer Substances 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 210000004279 orbit Anatomy 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000012113 quantitative test Methods 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 206010040560 shock Diseases 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 241000189107 spotted fever group Species 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 101150071242 tolC gene Proteins 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 229940126680 traditional chinese medicines Drugs 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 206010048282 zoonosis Diseases 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/29—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Richettsiales (O)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
- A61K2039/552—Veterinary vaccine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开了一种蛋白A1G_07050在抗立氏立克次体的免疫保护中的应用。本发明公开的A1G_07050蛋白,其序列如SEQ ID No.1中自N端起第164位至第381位氨基酸所示。蛋白A1G_07050可通过基因工程制备,用蛋白A1G_07050作为疫苗与立氏立克次体全菌蛋白疫苗相比,具有制备方法简单、成本低、产量高、更安全等优点,本发明对于落基山斑点热的防疫和治疗具有重大价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种蛋白A1G_07050在抗立氏立克次体的免疫保护中的应用。
背景技术
立氏立克次体(Rickettsia rickettsii)是一种严格胞内寄生的革兰氏阴性菌,是落基山斑点热(Rocky Mountain Spotted Fever,RMSF)的病原体。该菌主要分布在北美洲,其为斑点热群立克次体(spotted fever group rickettsia,SFGR)中毒力最强的一个种,被列为生物战剂和潜在的生物恐怖剂。
落基山斑点热是一种严重威胁人类健康的人兽共患自然疫源性疾病。RMSF最早发现在美国西北部的爱达荷州和蒙大拿州,1899年Maxey报告了第一例RMSF临床病例。在1906到1909年之间,Ricketts首先对该病进行了病原学研究,他证实了安氏革蜱为该病的传播媒介。
RMSF的早期临床表现主要有发热,头痛和肌痛。后期病情严重者可出现血压下降,未接受治疗者可产生肺炎,组织坏死和循环衰竭,并发心和脑后遗症。在暴发型病例中可因心跳突然停止而死亡。虽然抗生素治疗对落基山斑点热有效,但由于立氏立克次体能以气溶胶的形式传播,一旦流行难以控制。并且RMSF早期症状缺乏特异性,很难与其他疾病相区别,难以做到早发现早治疗。因此采用有效的疫苗作为预防接种是防止RMSF发生和流行的最有效手段。
二十世纪中期到末期,RMSF疫苗的研制主要集中在灭活疫苗上。1970年美国陆军传染病医学研究所用鸡胚成纤维细胞培养立氏立克次体并通过蔗糖密度梯度离心获得纯化的病原体,将纯化立克次体甲醛灭活后制成疫苗,在1983年进行的人体保护性试验中证明该疫苗可以保护25%的接种者,可减轻患者的发热反应,并能使四环素的治疗效果更快更好。但是该灭活疫苗仅提供有限的保护作用,远没有达到有效疫苗保护标准。另外制备立氏立克次体灭活疫苗通常需要鸡胚或者细胞大量培养立克次体,但是提取纯化立克次体的防护要求高,工艺复杂,成本昂贵,因此难以大量制备和推广使用。
随着对RMSF疫苗研究的不断深入以及蛋白质组学的飞速发展,人们将目光转向了亚单位。研究发现立氏立克次体外膜蛋白A(OmpA)、外膜蛋白B(OmpB)以及普氏立克次体外膜蛋白B(OmpB)免疫产生的抗体可以中和立克次体对小鼠的致死毒性,给予OmpA及OmpB的单克隆抗体可以保护豚鼠有效抵抗致死剂量的立氏立克次体的感染并交叉保护小鼠抵抗致死剂量的康氏立克次体(R.conorii)的感染。这些外膜蛋白尽管有一定的保护作用,但是其免疫保护效果有限,目前难以代替灭活RMSF疫苗。因此,鉴定立氏立克次体的保护性抗原,研发更加安全、有效、持久的亚单位疫苗对预防RMSF具有重大的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种蛋白A1G_07050在抗立氏立克次体的免疫保护中的应用。
本发明提供的A1G_07050蛋白,为如下(1)-(3)中任一所示的蛋白:
(1)SEQ ID No.1中自N端起第164位至第381位氨基酸所示的蛋白;
(2)SEQ ID No.1所示的蛋白;
(3)将(1)或(2)所示的序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质;
上述蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。
上述基因中,所述编码基因为如下中至少一种:
1)SEQ ID No.3中自5’末端起第490位至第1143位核苷酸所示的DNA分子;
2)SEQ ID No.3所示的DNA分子;
3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子;
4)与1)或2)或3)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且编码所述蛋白质的DNA分子。
含有上述任一所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。
上述蛋白在制备预防和/或治疗立氏立克次体引起的疾病的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
上述应用中,所述疾病为落基山斑点热。
上述任一所述的应用中,所述产品为疫苗。
上述蛋白在制备降低被立氏立克次体感染的动物的脏器组织内立氏立克次体数量的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
上述应用中,所述脏器为脾脏、肝脏和/或肺脏。
本发明的蛋白A1G_07050可以作为一种抗原蛋白,刺激机体产生免疫应答对抗立氏立克次体毒株的攻击,可以作为具有落基山斑点热疫苗功能的保护性抗原。蛋白A1G_07050可通过基因工程制备,用蛋白A1G_07050作为疫苗与立氏立克次体全菌蛋白疫苗相比,具有制备方法简单、成本低、产量高、更安全等优点,本发明对于落基山斑点热的防疫和治疗具有重大价值。
附图说明
图1为DNA电泳检测。
图2为蛋白电泳检测和免疫印迹实验(Western blot)。
图3为实时荧光定量PCR检测免疫小鼠脾组织内立氏立克次体拷贝数。
图4为实时荧光定量PCR检测免疫小鼠肝组织内立氏立克次体拷贝数。
图5为实时荧光定量PCR检测免疫小鼠肺组织内立氏立克次体拷贝数。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
下述实施例中所用的试剂如无特殊说明,均购自国药集团化学试剂公司。
下述实施例中的定量试验,均设置三次重复实验,结果取平均值。
以下实施例中利用仪器NANODROP1000分光光度计(购自Thermo Scientific公司)进行蛋白浓度的测定;利用仪器7300Real Time PCR System(购自Applied Biosystems公司)进行立氏立克次体拷贝数的测定。
载体pET-32a(+)购自Novagen公司,产品目录号为69015。
大肠杆菌BL21购自Novagen公司,产品目录号为69450。
C3H/HeN小鼠(3-4周龄,雄性)购自北京维通利华公司。
弗氏完全佐剂(CFA)购自Sigma公司,产品目录号为F-5881。
弗氏不完全佐剂(IFA)购自Sigma公司,产品目录号为F-5506。
镍-NTA琼脂糖凝胶(Ni-NTA)试剂盒购自Qiagen公司,产品目录号为30230。
DNA提取试剂盒购自Qiagen公司,产品目录号为69506。
辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG购自中科瑞泰公司,产品目录号为ZB-2305。
限制性内切酶均购自大连TaKaRa公司。
实施例中所用的立氏立克次体(Rickettsia rickettsii)均为立氏立克次体Sheila Smith株(Rickettsia rickettsii,Sheila Smith strain),该菌株在文献“Ellison DW,Clark TR,Sturdevant DE,Virtaneva K,Porcella SF,Hackstadt T.Genomic comparison of virulent Rickettsia rickettsii Sheila Smith andavirulent Rickettsia rickettsii Iowa.Infect Immun.2008Feb;76(2):542-50.Epub2007Nov19.”中公开过,公众可从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得。
主要试剂的配制:
PCR反应用2×Mix的配制(1ml):
加去离子水定容至1ml。
可溶性蛋白裂解缓冲液pH8.0(1000ml):
称取上述质量的各试剂,用去离子水溶解并定容到1000ml,NaOH调节pH至8.0。
包涵体表达形式目的蛋白纯化所需缓冲液的配制如下:
一、包涵体蛋白裂解缓冲液pH8.0(1000ml):
称取或量取上述各试剂,用去离子水溶解并定容到1000ml,NaOH调节pH至8.0。
二、包涵体蛋白洗涤缓冲液pH6.3(1000ml):
称取或量取上述各试剂,用去离子水溶解并定容到1000ml,NaOH调节pH至6.3。
三、包涵体蛋白洗脱缓冲液pH4.5(1000ml):
称取或量取上述各试剂,用去离子水溶解并定容到1000ml,NaOH调节pH至4.5。
每升转移缓冲液的制备:称取2.9g甘氨酸、5.8g Tris碱、0.37gSDS,并加入200ml甲醇,加水定容至1L。
PBS缓冲液(0.01mol/L、pH7.2)的制备:2.86g Na2HPO4·12H2O、8.5g NaCl、2.86g NaH2PO4·2H2O加入到1L ddH2O中,完全溶解,调节pH至7.2。实施例中的PBS缓冲液均为0.01mol/L、pH7.2PBS缓冲液。
每100ml封闭液的制备:称取1g牛血清白蛋白(BSA),溶于100ml PBS缓冲液(0.01mol/L、pH7.2)中。
立氏立克次体全菌蛋白的制备方法见文献“Ammerman NC,Beier-Sexton M,AzadAF(2008)Laboratory maintenance of Rickettsia rickettsii.Curr ProtocMicrobiol Chapter3:Unit3A5.”
6周龄雌性C3H/HeN小鼠购自北京维通利华公司。
立氏立克次体免疫血清的制备:将6周龄雌性C3H/HeN小鼠分别在第0天、第28天和第42天进行立氏立克次体全菌蛋白免疫。首次免疫采用皮下注射免疫(每只小鼠免疫剂量:100ul含20ug立氏立克次体全菌蛋白的溶液与100ul弗氏完全佐剂的混合物);第二次和第三次免疫均采用腹部注射免疫(每只小鼠免疫剂量:100ul含10ug立氏立克次体全菌蛋白的溶液与100ul弗氏不完全佐剂的混合物)。末次免疫后第14天通过眼眶静脉取血,分离血清备用。
显色液A\B\C购自武汉博士德公司。
实施例1、重组质粒的构建
一、重组质粒甲的构建
(一)提取立氏立克次体的基因组DNA。
(二)以步骤(一)提取的基因组DNA为模板,用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增,得到A1G_07050基因片段。
F1:5'-GCGGATCCCTTTTAATAGCTGCTAC-3';
R1:5'-GGCTCGAGAAATCTTATACCGGCTG-3'。
(下划线所示序列为酶切识别位点)
PCR反应体系25μl:
模板1μl,2×Mix12.5μl,上、下游引物各1μl(50μM/μl),加水至25μl。
PCR扩增的条件:
94℃预变性5min;95℃30sec,55℃30sec,72℃1.5min,循环30次;72℃延伸7min。
(三)将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测,结果如图1中的泳道1所示。
A1G_07050蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1中自N端起第164位至第381位氨基酸所示,A1G_07050基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3中自5’末端起第490位至第1143位核苷酸所示。
PCR扩增产物大小与预期一致。
(四)用限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切PCR扩增产物,得到基因片段;用限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切载体pET-32a(+),得到载体大片段;将基因片段与载体大片段连接,得到重组质粒甲。将重组质粒甲送测序,测序正确。
根据测序结果,对重组质粒甲进行结构描述如下:在载体pET-32a(+)的BamHI和XhoI酶切位点之间插入了SEQ ID No.3中自5’末端起第490位至1143位核苷酸所示的DNA分子。
由于A1G_07050基因与载体骨架上的His标签形成融合基因,表达融合蛋白,从而可用Ni-NTA进行进一步纯化。
二、重组质粒乙的构建
(一)提取立氏立克次体的基因组DNA。
(二)以步骤(一)提取的基因组DNA为模板,用F2和R2组成的引物对进行PCR扩增,得到TolC基因片段。
F2:5'-CCGGATCCACTGAAGGGTATAAGAA-3';
R2:5'-CCGTCGACAAACTCTTCTTCAGGACTA-3'。
(下划线所示序列为酶切识别位点)
PCR反应体系25μl:
模板1μl,2×Mix12.5μl,上、下游引物各1μl(50μM/μl),加水至25μl。
PCR扩增的条件:
94℃预变性5min;95℃30sec,55℃30sec,72℃1.5min,循环30次;72℃延伸7min。
(三)将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测,结果如图1中的泳道2所示。
TolC蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2中自N端起第164位至579位氨基酸所示;TolC基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4中自5’末端起第490位至1737位核苷酸所示的DNA分子。
PCR扩增产物大小与预期一致。
(四)用限制性内切酶BamHI和SalI双酶切PCR扩增产物,回收基因片段;用限制性内切酶BamHI和SalI双酶切载体pET-32a(+),得到载体大片段;将基因片段与载体大片段连接,得到重组质粒乙。将重组质粒乙送测序,测序正确。
根据测序结果,对重组质粒乙进行结构描述如下:在载体pET-32a(+)的BamHI和SalI酶切位点之间插入了SEQ ID No.4中自5’末端起第490位至1737位核苷酸所示的DNA分子。
由于TolC基因与载体骨架上的His标签形成融合基因,表达融合蛋白,从而可用Ni-NTA进行进一步纯化。
实施例2、重组蛋白的制备
一、蛋白A1G_07050(又称为蛋白甲)的制备
(一)重组菌的制备
将重组质粒甲导入大肠杆菌BL21,得到重组菌。
重组菌的验证方法:将菌株接入LB固体培养基平板(含200mg/L氨苄青霉素),挑取单克隆并转接入LB液体培养基,37℃培养并提取质粒进行测序,如果提取的质粒为重组质粒甲,即为目的重组菌。
(二)蛋白甲的表达
将重组菌接入LB液体培养基(含200mg/L氨苄青霉素),37℃、200rpm培养过夜。次日按照体积百分含量为1%的接种量转接入含有相同抗生素浓度的LB液体培养基中,在37℃、200rpm条件下培养至OD600值≈0.6时,加入IPTG诱导剂至终浓度0.1mM,在25℃、200rpm条件下继续进行诱导表达8h,得到发酵液。
(三)蛋白甲的纯化
1、取发酵液100ml,5000rpm离心10min,收集菌体沉淀。
2、用30ml可溶性蛋白裂解缓冲液重悬菌体,吹打混匀后冰浴条件下进行超声,超声条件为:工作4.5sec,间隔9sec,共超声60min,功率为125W。将超声裂解物以12,000×g离心20min,弃去上清,将10ml包涵体蛋白裂解液加入沉淀部分,并且充分吹打混匀,室温放置过夜。
3、次日将步骤2得到的过夜混合物与2mlNi-NTA混合,室温200rpm振荡混匀4h,使得目的蛋白(蛋白甲)与Ni-NTA充分结合,然后将混合物移入纯化柱内,用包涵体蛋白洗涤缓冲液洗涤3次,每次10ml(流速控制为3ml/min)。然后用包涵体蛋白洗脱缓冲液洗脱5次,每次500ul(流速控制为3ml/min),合并收集的洗脱液并测蛋白浓度,得到目的蛋白溶液,即蛋白甲溶液。
二、蛋白TolC(又称为蛋白乙)的制备
(一)重组菌的制备
将重组质粒乙导入大肠杆菌BL21,得到重组菌。
重组菌的验证方法:将菌株接入LB固体培养基平板(含200mg/L氨苄青霉素),挑取单克隆并转接入LB液体培养基,37℃培养并提取质粒进行测序,如果提取的质粒为重组质粒乙,即为目的重组菌。
(二)蛋白乙的表达
将重组菌接入LB液体培养基(含200mg/L氨苄青霉素),37℃、200rpm培养过夜。次日按照体积百分含量为1%的接种量转接入含有相同抗生素浓度的LB液体培养基中,在37℃、200rpm条件下培养至OD600值≈0.6时,加入IPTG诱导剂至终浓度0.1mM,在25℃、200rpm条件下继续进行诱导表达8h,得到发酵液。
(三)将步骤(二)的发酵液进行纯化得到蛋白乙溶液,具体操作过程同蛋白甲的纯化。
三、蛋白的鉴定
将蛋白甲溶液(位置:泳道1)和蛋白乙溶液(位置:泳道2)进行12%聚丙烯酰胺凝胶电泳,结果如图2A所示。
图2A中,M:蛋白Marker;1:蛋白甲;2:蛋白乙
图2A表明,蛋白甲溶液只显示一条41KD的条带,与预期相符合。蛋白乙溶液只显示一条63KD的条带,与预期相符合。
实施例3、免疫印迹实验(Western blot assay)
一、半干转印
(一)戴上手套,切滤纸和硝酸纤维素膜。
(二)将硝酸纤维素膜置于一盛有20ml甲醇的培养皿中,浸泡30s-60s后用镊子取出,放入事先配制好的转移缓冲液中。同时将滤纸放入另一个盛有转移缓冲液的培养皿中,赶走气泡。
(三)将转移装置擦拭干净后,从下向上依次放置滤纸→PAGE胶→硝酸纤维素膜→滤纸,每放一层都要用试管赶走气泡和多余的液体。
(四)将阳极放在夹层物上,接通电源,60-70mA电流电转印75min。断电,将凝胶用考马斯亮蓝G-250染色,检查是否转印完全。
二、结合一抗
(一)将步骤一中电转印之后的硝酸纤维素膜用镊子轻轻夹起放入一个干净的塑封袋中,然后向其中加入封闭液30ml。
(二)封闭过夜。弃去封闭液,加入事先配制好的一抗混合物(即:取新鲜的封闭液10ml左右,向其中加入100ul立氏立克次体免疫血清,混匀,加入到塑封袋中即可),摇床孵育1h。
(三)弃去一抗混合液,取一个干净培养皿,向其中加入适量去离子水,然后将硝酸纤维素膜放入,轻轻漂洗。
(四)弃去培养皿中的去离子水,用PBST漂洗3次,每次10min。
三、结合二抗
弃去培养皿中的PBST,向其中加入10ml二抗混合液(即:取新鲜的封闭液10ml左右,向其中加入100ul辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG,混匀,加入到塑封袋中即可),摇床孵育1h。弃去二抗混合液,用PBST漂洗3次,每次10min。
四、DAB显色
取3ml去离子水,向其中先后加入显色液A\B\C(武汉博士德公司)各3滴,混匀后倒入盛有硝酸纤维素膜的培养皿中。轻轻摇晃,细心观察显色反应,一旦蛋白条带的颜色达到要求,用水漂洗。拍照。结果如图2B所示。
图2B中,M:蛋白Marker;1:蛋白甲;2:蛋白乙
图2B表明,蛋白甲和蛋白乙是目的蛋白。
实施例4、抗原蛋白A1G_07050的保护性评价
一、小鼠免疫
将3-4周龄的雄性C3H/HeN小鼠(以下简称C3H小鼠)20只按照体重等量地分配到4个实验组中,每组5只C3H小鼠。
组别设置:实验组:A1G_07050蛋白加佐剂;阴性对照组:PBS加佐剂;阳性对照组:全菌蛋白加佐剂;阴性蛋白组:TolC蛋白加佐剂。
各组分别在第0天、第28天和第42天进行第1次、第2次和第3次免疫。
除阴性对照组外,各组的免疫方案均如表1所示。
表1免疫方案
阴性对照组在第0天、第28天和第42天进行第1次、第2次和第3次免疫。第1次免疫的试剂为100ulPBS缓冲液与100ulCFA佐剂的混合物,免疫方式为皮下注射;第2次免疫的试剂为100ulPBS缓冲液与100ulIFA佐剂的混合物,免疫方式为腹腔注射;第3次免疫的试剂为100ulPBS缓冲液与100ulIFA佐剂的混合物,免疫方式为腹腔注射。
二、立氏立克次体攻击C3H小鼠
末次免疫后第14天,用立氏立克次体通过腹腔注射感染各组C3H小鼠,剂量为6×106个/只。攻毒5天后,将各组小鼠处死,摘取脾脏、肺脏、肝脏。
三、RT-PCR检测各脏器中立氏立克次体拷贝数
(一)将各组小鼠的各个脏器表面的粘连组织剥离干净,然后称重并记录。将剥离干净的各个脏器分别与1mlPBS缓冲液放入研磨器中充分研磨,研磨液移入EP管并用PBS缓冲液定容至1.5ml。从各个EP管中取出10mg脾脏或20mg肝脏或20mg肺脏组织对应的研磨液进行DNA提取。
利用RT-PCR检测各脏器中立氏立克次体的载量,进行统计分析,比较和评价各重组蛋白的保护性。
实时荧光定量PCR所用的引物及探针序列如下:
Fp:5’-TgA AgA TAC TAC CTT Agg gTT CAT CAC TA-3’;
Rp:5’-ACC ggC ATT AAg CgT AAg gTT-3’;
TaqMan MGB探针:5’-FTgT TgT TCA TAA CgC TCA CP-3’(序列中F代表报告荧光基团FAM,P代表淬灭基团TAQMAN-MGB);
标准品的序列:5’-TGTTGTTCATAACGCTCA-3’
取1ul标准品作为模板,以Fp和Rp为引物,以TaqMan MGB探针进行实时荧光定量PCR绘制标准曲线;同时,取1ul各组各小鼠脾组织(10mg)提取的DNA作为模板、以Fp和Rp为引物,以TaqMan MGB探针进行同一批次的实时荧光定量PCR。得到与脾组织进行同一批次实时荧光定量PCR的标准曲线方程为Ct=-3.25×logCO+36.43。通过标准曲线将各组小鼠脾组织的实时荧光定量PCR结果换算为立氏立克次体的拷贝数。
取1ul标准品作为模板,以Fp和Rp为引物,以TaqMan MGB探针进行实时荧光定量PCR绘制标准曲线;同时,取1ul各组各小鼠肝组织(20mg)提取的DNA作为模板、以Fp和Rp为引物,以TaqMan MGB探针进行同一批次的实时荧光定量PCR。与肝组织进行同一批次实时荧光定量PCR的标准曲线方程为Ct=-3.31×logCO+38.05。通过标准曲线将各组小鼠肝组织的实时荧光定量PCR结果换算为立氏立克次体的拷贝数。
取1ul标准品作为模板,以Fp和Rp为引物,以TaqMan MGB探针进行实时荧光定量PCR绘制标准曲线;同时,取1ul各组各小鼠肺组织(20mg)提取的DNA作为模板、以Fp和Rp为引物,以TaqMan MGB探针进行同一批次的实时荧光定量PCR。与肺组织进行同一批次实时荧光定量PCR的标准曲线方程为Ct=-3.21×logCO+37.94。通过标准曲线将各组小鼠肺组织的实时荧光定量PCR结果换算为立氏立克次体的拷贝数。
三个标准曲线方程中,CO均代表拷贝数。三个标准曲线方程的R2值均大于98%。
对各组织各组的实时定量PCR结果运用SAS9.1软件进行单因素多水平方差分析及SNK法进行两两之间的比较(相同字母表示组间没有显著性差异)。
脾组织中立氏立克次体拷贝数检测结果如表2和图3所示。
肝组织中立氏立克次体拷贝数检测结果如表3和图4所示。
肺组织中立氏立克次体拷贝数检测结果如表4和图5所示。
表2脾组织检测结果
表3肝组织检测结果
表4肺组织检测结果
图3、图4和图5中的PBS代表阴性对照组,A1G_01780代表实验组,WCA代表阳性对照组,tolC代表阴性蛋白组。
统计学分析显示,在脾脏的检测中,实验组和阳性对照组与阴性对照组及阴性蛋白组有显著性差异(P=0.0020),且实验组与阳性对照组之间也存在明显的差异,而阴性蛋白组与阴性对照组之间无显著性差异。
在肝脏的检测中,实验组和阳性对照组与阴性对照组及阴性蛋白组有显著性差异(P=0.0014),而阴性蛋白组与阴性对照组之间也有显著性差异。
在肺脏的检测中,实验组和阳性对照组与阴性对照组有显著性差异(P=0.0015),而阴性蛋白组与阴性对照组之间无显著性差异。
与阴性对照组相比,实验组可减少立式立克次体在脾组织、肝组织及肺组织中数量的86%、65%和59%,阳性对照组可减少立克次体菌体在脾组织、肝组织及肺组织中增值的95%、74%和80.0%,由此可知,脾脏中A1G_07050蛋白的免疫保护性占全菌蛋白免疫保护性的比例为:86%/95%=91%;肝脏中A1G_07050蛋白的免疫保护性占全菌蛋白免疫保护性的比例为:65%/74%=88%;肺脏中A1G_07050蛋白的免疫保护性占全菌蛋白免疫保护性的比例为:59%/80.0%=74%。综上可知,抗原A1G_07050的免疫保护性可达到全菌蛋白免疫保护性的74%以上。
Claims (9)
1.A1G_07050蛋白,为如下(1)-(3)中任一所示的蛋白:
(1)SEQ ID No.1中自N端起第164位至第381位氨基酸所示的蛋白;
(2)SEQ ID No.1所示的蛋白;
(3)将(1)或(2)所示的序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。
2.权利要求1所述蛋白的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因,其特征在于:所述编码基因为如下中至少一种:
1)SEQ ID No.3中自5’末端起第490位至第1143位核苷酸所示的DNA分子;
2)SEQ ID No.3所示的DNA分子;
3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子;
4)与1)或2)或3)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且编码所述蛋白质的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5.权利要求1所述的蛋白在制备预防和/或治疗立氏立克次体引起的疾病的产品中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于:所述疾病为落基山斑点热。
7.根据权利要求5或6所述的应用,其特征在于:所述产品为疫苗。
8.权利要求1所述的蛋白在制备降低被立氏立克次体感染的动物的脏器组织内立氏立克次体数量的产品中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用,其特征在于:所述脏器为脾脏、肝脏和/或肺脏。
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201310444429.5A CN103483430B (zh) | 2013-09-23 | 2013-09-23 | 蛋白a1g_07050在抗立氏立克次体的免疫保护中的应用 |
PCT/CN2013/001587 WO2015039270A1 (zh) | 2013-09-23 | 2013-12-17 | 蛋白a1g_07050在抗立氏立克次体的免疫保护中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201310444429.5A CN103483430B (zh) | 2013-09-23 | 2013-09-23 | 蛋白a1g_07050在抗立氏立克次体的免疫保护中的应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN103483430A true CN103483430A (zh) | 2014-01-01 |
CN103483430B CN103483430B (zh) | 2014-12-24 |
Family
ID=49824068
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201310444429.5A Expired - Fee Related CN103483430B (zh) | 2013-09-23 | 2013-09-23 | 蛋白a1g_07050在抗立氏立克次体的免疫保护中的应用 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN103483430B (zh) |
WO (1) | WO2015039270A1 (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106967174A (zh) * | 2017-03-21 | 2017-07-21 | 中国人民解放军第三〇九医院 | 多肽融合蛋白gwp在抗立氏立克次体的免疫保护中的应用 |
CN114231513A (zh) * | 2022-02-23 | 2022-03-25 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 一种可抑制蛋白酶体psmb5亚基活性的短肽及其在抗立克次体感染中的应用 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102716474A (zh) * | 2012-06-27 | 2012-10-10 | 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 | 蛋白Rh054_01780在抗黑龙江立克次体的免疫保护中的应用 |
-
2013
- 2013-09-23 CN CN201310444429.5A patent/CN103483430B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2013-12-17 WO PCT/CN2013/001587 patent/WO2015039270A1/zh active Application Filing
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102716474A (zh) * | 2012-06-27 | 2012-10-10 | 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 | 蛋白Rh054_01780在抗黑龙江立克次体的免疫保护中的应用 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
MADAN,A. ET AL.: "Accession number:NC_009882,REGION: complement(1180549..1181223),Rickettsia rickettsii str."Sheila Smith"chromosome, complete genome", 《GENBANK》 * |
MADAN,A. ET AL.: "Acession Number:YP_001495359,hypothetical protein A1G_07050 [Rickettsia rickettsii str. "Sheila Smith"]", 《GENBANK》 * |
高宁等: "普氏立克次体120kDa表面蛋白N端和C段重组蛋白的抗原特异性研究", 《寄生虫与医学昆虫学报》 * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106967174A (zh) * | 2017-03-21 | 2017-07-21 | 中国人民解放军第三〇九医院 | 多肽融合蛋白gwp在抗立氏立克次体的免疫保护中的应用 |
CN106967174B (zh) * | 2017-03-21 | 2019-09-06 | 中国人民解放军第三〇九医院 | 多肽融合蛋白gwp在抗立氏立克次体的免疫保护中的应用 |
CN114231513A (zh) * | 2022-02-23 | 2022-03-25 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 一种可抑制蛋白酶体psmb5亚基活性的短肽及其在抗立克次体感染中的应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2015039270A1 (zh) | 2015-03-26 |
CN103483430B (zh) | 2014-12-24 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN102864157B (zh) | 一种副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原 | |
CN101905018B (zh) | 治疗和预防幽门螺杆菌感染的重组融合蛋白疫苗及减毒活菌载体疫苗 | |
JPS60501689A (ja) | 連鎖球菌m蛋白質遺伝子及びその分子状プローブ | |
CN103118701A (zh) | Ospa嵌合体及其在疫苗中的用途 | |
US11020468B2 (en) | Compositions, methods and therapies for administering antigen peptide | |
CN105169381B (zh) | 一种幽门螺旋杆菌多价表位疫苗及其制备方法 | |
CN112979826B (zh) | 一种乙型脑炎病毒纳米颗粒疫苗及其制备方法和应用 | |
CN103304670B (zh) | 结核分枝杆菌特异性融合蛋白疫苗ab及其制备和应用 | |
CN104628865B (zh) | 一种伪狂犬表位多肽基因工程疫苗 | |
CN103450353B (zh) | 蛋白a1g_01780在抗立氏立克次体的免疫保护中的应用 | |
CN106967174B (zh) | 多肽融合蛋白gwp在抗立氏立克次体的免疫保护中的应用 | |
CN108066755A (zh) | 一种抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗及其制备方法和应用 | |
CN102716474B (zh) | 蛋白Rh054_01780在抗黑龙江立克次体的免疫保护中的应用 | |
CN113150086B (zh) | 幽门螺杆菌HefC重组蛋白及其应用 | |
CN103483430B (zh) | 蛋白a1g_07050在抗立氏立克次体的免疫保护中的应用 | |
CN111744003B (zh) | 趋化因子cx3cl1在制备疫苗中的应用和幽门螺旋杆菌疫苗 | |
CN104640563A (zh) | 包含嵌合的ospa分子的组合物及其使用方法 | |
CN101293098A (zh) | 一种重组牛o型口蹄疫病毒融合蛋白疫苗 | |
CN109021115A (zh) | 一种猪圆环病毒三价亚单位疫苗 | |
CN102406929A (zh) | 一种共表达分子佐剂加强型二价口蹄疫蛋白工程疫苗 | |
CN112159479B (zh) | 一种鸡毒支原体多抗原表位融合蛋白pMG-mEA及其应用 | |
CN107982527A (zh) | 外膜蛋白vp1243在防治弧菌感染中的应用 | |
CN112279925B (zh) | 一种融合蛋白及一种犬弓形虫亚单位疫苗及其疫苗组合物 | |
CN101961487A (zh) | 细粒棘球蚴基因工程疫苗候选分子p-29 | |
CN113980101A (zh) | 一种胸膜肺炎放线杆菌亚单位疫苗 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20141224 Termination date: 20160923 |