CN102716474A - 蛋白Rh054_01780在抗黑龙江立克次体的免疫保护中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了蛋白Rh054_01780在抗黑龙江立克次体的免疫保护中的应用。本发明保护蛋白Rh054_01780在制备远东斑点热疫苗中的应用、在制备针对黑龙江立克次体的疫苗中的应用、在制备针对远东斑点热的保护性抗原中的应用或在制备针对黑龙江立克次体的保护性抗原中的应用。蛋白Rh054_01780为如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白质。用蛋白Rh054_01780为为疫苗与菌体蛋白疫苗相比，具有制备方法简便、成本低、产量高、更安全等优点。本发明对于远东斑点热的防疫和治疗具有重大价值。

Description

蛋白Rh054_01780在抗黑龙江立克次体的免疫保护中的应用

技术领域

本发明涉及一种蛋白Rh054_01780在抗黑龙江立克次体的免疫保护中的应用。

背景技术

立克次体病是一种严重威胁人类健康的人兽共患自然疫源性疾病，在两次世界大战期间曾给人类带来深重的灾难。斑点热病是立克次体病的一种，由斑点热群立克次体引起，经蜱传播的传染性疾病。

黑龙江立克次体（Rickettsia heilongjiangensis）是1983年在我国黑龙江绥芬河地区森林革蜱中新分离到的立克次体株，为专性细胞内寄生的革兰氏阴性小杆菌。该菌引起的斑点热病被WHO正式命名为远东斑点热。远东斑点热是一种人兽共患病，主要分布于中国东北地区、俄罗斯西伯利亚地区和日本，近年在广东也有发现。

制备斑点热疫苗通常方法为采用灭活菌体或化学提取亚单位疫苗，而这些方法需要鸡胚或者细胞大量培养立克次体，但是提取纯化立克次体的防护要求高，工艺复杂，成本昂贵，因此难以大量制备和推广使用。

发明内容

本发明的目的是提供蛋白Rh054_01780在抗黑龙江立克次体的免疫保护中的应用。

本发明保护蛋白Rh054_01780在制备远东斑点热疫苗中的应用。

本发明还保护蛋白Rh054_01780在制备针对黑龙江立克次体（Rickettsiaheilongjiangensis）的疫苗中的应用。

本发明还保护蛋白Rh054_01780在制备针对远东斑点热的保护性抗原中的应用。

本发明还保护蛋白Rh054_01780在制备针对黑龙江立克次体（Rickettsiaheilongjiangensis）的保护性抗原中的应用。

本发明还保护一种远东斑点热疫苗，它的活性成分包括蛋白Rh054_01780。所述活性成分可由所述蛋白Rh054_01780和佐剂组成。

本发明还保护一种黑龙江立克次体（Rickettsia heilongjiangensis）的疫苗，它的活性成分包括蛋白Rh054_01780。所述活性成分可由所述蛋白Rh054_01780和佐剂组成。

本发明还保护一种针对远东斑点热的保护性抗原，它的活性成分包括蛋白Rh054_01780。所述活性成分可由所述蛋白Rh054_01780和佐剂组成。

本发明还保护一种针对黑龙江立克次体（Rickettsia heilongjiangensis）的保护性抗原，它的活性成分包括蛋白Rh054_01780。所述活性成分可由所述蛋白Rh054_01780和佐剂组成。

以上任一所述佐剂可为弗氏佐剂、氢氧化铝佐剂、明矾佐剂、脂质体佐剂等。

以上任一所述佐剂具体可为弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂。

以上任一所述蛋白Rh054_01780为如下（a）或（b）：

（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（b）将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白质。

本发明的发明人发现黑龙江立克次体的蛋白Rh054_01780可以作为一种抗原蛋白，能够刺激机体产生免疫应答对抗黑龙江立克次体毒株攻击，为具有远东斑点热疫苗功能的保护性抗原。蛋白Rh054_01780可通过基因工程制备，用蛋白Rh054_01780作为疫苗与菌体蛋白疫苗相比，具有制备方法简便、成本低、产量高、更安全等优点。本发明对于远东斑点热的防疫和治疗具有重大价值。

附图说明

图1为蛋白电泳检测图。

图2为实时荧光定量PCR检测免疫小鼠脾组织内黑龙江立克次体拷贝数评价蛋白Rh054_01780的免疫保护效果。

图3为实时荧光定量PCR检测免疫小鼠肝组织内黑龙江立克次体拷贝数评价蛋白Rh054_01780的免疫保护效果。

图4为实时荧光定量PCR检测免疫小鼠肺组织内黑龙江立克次体拷贝数评价蛋白Rh054_01780的免疫保护效果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例中利用仪器Nanodrop 1000分光光度计（购自ThermoScientific公司）进行蛋白质浓度的测定。

载体pET-32a(+)：购自Novagen公司，产品目录号为69015。

大肠杆菌BL21：购自Novagen公司，产品目录号为69450。

C3H/HeN小鼠（周龄为3-4周，雄性小鼠）：购自北京维通利华公司。

弗氏完全佐剂：购自Sigma公司，产品目录号为：F-5881。

弗氏不完全佐剂：购自Sigma公司，产品目录号为：F-5506。

实施例中所用的黑龙江立克次体（Rickettsia heilongjiangensis）均为黑龙江立克次体054型株：在文献“Changsong Duan,Yanfen Meng,Xile Wang,Xiaolu Xiong,and Bohai Wen.2011.Exploratory Study on Pathogenesis of Far-Eastern SpottedFever.Am.J.Trop.Med.Hyg,85(3),2011,pp.504–509.”中公开过，公众可从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得。

每1升裂解缓冲液按照如下方法制备：将50mmol NaH₂PO₄·H₂O、300mmol NaCl、10mmol咪唑和水混合，用NaOH调节pH至8.0，用水定容至1L，得到裂解缓冲液。

0.1mol/L Tris-Cl缓冲液配制：将12.11g Tris、800mL ddH₂O和49mL HCl混合，滴加浓盐酸调pH至8.0，用ddH₂O定溶至1000mL，得到0.1mol/L Tris-Cl缓冲液。

每1升回收缓冲液按照如下方法制备：将100mmol NaH₂PO₄·H₂O、0.1LTris-Cl缓冲液、8mol尿素和水混合，用NaOH调节pH至8.0，用水定容至1L，得到回收缓冲液。

每1升洗涤缓冲液按照如下方法制备：将100mmol NaH₂PO₄·H₂O、0.1LTris-Cl缓冲液、8mol尿素和水混合，调节pH至6.5，用水定容至1L，得到洗涤缓冲液。

每1升洗脱缓冲液按照如下方法制备：将100mmol NaH₂PO₄·H₂O、0.1LTris-Cl缓冲液、8mol尿素和水混合，调节pH至4.5，用水定容至1L，得到洗脱缓冲液。

每1升LB液体培养基组成：将10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10g氯化钠和水混合，用水定容至1L，得到LB液体培养基。

实施例1、重组质粒和蛋白的制备

一、重组质粒的构建

1、重组质粒甲的构建

（1）提取黑龙江立克次体的基因组DNA。

（2）以步骤（1）提取的基因组DNA为模板，用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

F1:5'-GTGGATCCGGAGAAAGCGAAACTA-3'；

R1:5'-ATCTCGAGCTTGGATGCAGCAGTT-3'。

F1和R1的靶序列为序列3所示的双链DNA分子（编码序列表的序列1所示的蛋白Rh054_01780）。

PCR扩增条件：94℃预变性5min；95℃30sec、55℃30sec、72℃1.5min，循环35次；72℃延伸7min。

（3）用限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切步骤（2）的PCR扩增产物，回收酶切产物。

（4）用限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切载体pET-32a(+)，回收载体骨架（约5850bp）。

（5）将步骤（3）的酶切产物和步骤（4）的载体骨架连接，得到重组质粒甲。根据测序结果，对重组质粒甲进行结构描述如下：在载体pET-32a(+)的BamHI和XhoI酶切位点之间插入了序列表的序列3所示的双链DNA分子（所述双链DNA分子与载体骨架上的His标签形成融合基因，表达融合蛋白，从而可用Ni-NTA进行纯化）。

二、重组质粒乙的构建

（1）提取黑龙江立克次体的基因组DNA。

（2）以步骤（1）提取的基因组DNA为模板，用F2和R2组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

F2:5'-CAGGATCCAAAGGCGGTGAAGTA-3'；

R2:5'-ATCTCGAGTCCGGCTTTGTTGTC-3'。

F2和R2的靶序列为序列表的序列4所示的双链DNA分子（编码序列表的序列2所示的蛋白PrsA。

PCR扩增条件：94℃预变性5min；95℃30sec、55℃30sec、72℃1.5min，循环35次；72℃延伸7min。

（3）用限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切步骤（2）的PCR扩增产物，回收酶切产物。

（4）用限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切载体pET-32a(+)，回收载体骨架（约5850bp）。

（5）将步骤（3）的酶切产物和步骤（4）的载体骨架连接，得到重组质粒乙。根据测序结果，对重组质粒乙进行结构描述如下：在载体pET-32a(+)的BamHI和XhoI酶切位点之间插入了序列表的序列4所示的双链DNA分子。

三、蛋白Rh054_01780（又称蛋白甲）的制备

1、重组菌的制备

将重组质粒甲导入大肠杆菌BL21，得到重组菌。

重组菌的验证方法：将菌株接入LB固体培养基平板（含有200mg/L氨苄青霉素），挑取单克隆并转接入LB液体培养基，培养并提取质粒进行测序，如果提取的质粒为重组质粒甲，即为目的重组菌。

2、蛋白甲的表达

将重组菌接入LB液体培养基（含有200mg/L氨苄青霉素），37℃震摇过夜，次日按1：100的体积比接种至新鲜的LB液体培养基（含有200mg/L氨苄青霉素），37℃震摇至OD600＝0.4，加入诱导剂IPTG（使其浓度为0.4mM），37℃继续震摇4小时，得到发酵液。

3、蛋白纯化

（1）取步骤2的发酵液100ml，8000rpm离心5min，收集菌体沉淀。

（2）用30ml裂解缓冲液重悬步骤（1）得到的菌体，以25%振幅超声破碎（超声3s，停9s）1小时，然后12000rpm离心20min，收集上清液。

（3）取10ml步骤（2）得到的上清液，与2mlNi-NTA混合，室温200rpm振荡混匀4h，使目的蛋白（蛋白甲）与Ni-NTA完全结合，倒入纯化空柱中，用洗涤缓冲液洗涤3次（每次10ml，流速为3ml/min），然后用洗脱缓冲液洗脱5次（每次0.5ml，流速为3ml/min），将每次收集的洗脱液合并，即得到目的蛋白溶液（蛋白甲溶液）。

四、蛋白PrsA（又称蛋白乙）的制备

用重组质粒乙代替重组质粒甲，其它同步骤三，得到蛋白乙溶液。

五、蛋白的鉴定

将蛋白甲溶液和蛋白乙溶液进行15%聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果见图1。蛋白甲溶液只显示一条42KD的条带，与预期相符。蛋白乙溶液只显示一条46KD的条带，与预期相符。

实施例2、抗原蛋白Rh054_01780的保护性评价

将20只雄性3-4周龄C3H/HeN小鼠随机分为四组，每组5只，分别进行如下平行处理（以下免疫剂量指的均为免疫用溶液与弗氏佐剂的总体积）：

第一组（Rh054_01780组）：取实施例1制备的蛋白甲溶液，用洗脱缓冲液调整蛋白浓度为0.6mg/ml，作为免疫用溶液；第0天，将免疫用溶液与弗氏完全佐剂等体积混合均匀并超声制备成乳浊液，进行第一次免疫（免疫剂量为100μl/只）；第28天，将免疫用溶液与弗氏不完全佐剂等体积混合均匀并超声制备成乳浊液，进行第二次免疫（免疫剂量为100μl/只）；第42天，将免疫用溶液与弗氏不完全佐剂等体积混合均匀并超声制备成乳浊液，进行第三次免疫（免疫剂量为100μl/只）；第一次免疫和第二次免疫的接种方式为背部皮下多点注射接种，第三次免疫的接种方式为腹腔注射接种；

第二组（PrsA组）：取实施例1制备的蛋白乙溶液，用洗脱缓冲液调整蛋白浓度为0.6mg/ml，作为免疫用溶液；第0天，将免疫用溶液与弗氏完全佐剂等体积混合均匀并超声制备成乳浊液，进行第一次免疫（免疫剂量为100μl/只）；第28天，将免疫用溶液与弗氏不完全佐剂等体积混合均匀并超声制备成乳浊液，进行第二次免疫（免疫剂量为100μl/只）；第42天，将免疫用溶液与弗氏不完全佐剂等体积混合均匀并超声制备成乳浊液，进行第三次免疫（免疫剂量为100μl/只）；第一次免疫和第二次免疫的接种方式为背部皮下多点注射接种，第三次免疫的接种方式为腹腔注射接种；

第三组（菌体蛋白组）：取56摄氏度灭活纯化的黑龙江立克次体菌体，用洗脱缓冲液稀释至8*10⁸个/ml，作为免疫用溶液；第0天，将免疫用溶液与弗氏完全佐剂等体积混合均匀并超声制备成乳浊液，进行第一次免疫（免疫剂量为100μl/只）；第28天，将免疫用溶液与弗氏不完全佐剂等体积混合均匀并超声制备成乳浊液，进行第二次免疫(免疫剂量为100μl/只)；第42天，将免疫用溶液与弗氏不完全佐剂等体积混合均匀并超声制备成乳浊液，进行第三次免疫(免疫剂量为100μl/只)；第一次免疫和第一次免疫的接种方式为背部皮下多点注射接种，第三次免疫的接种方式为腹腔注射接种；

第四组(空白对照组)：取洗脱缓冲液，作为免疫用溶液；第0天，将免疫用溶液与弗氏完全佐剂等体积混合均匀并超声制备成乳浊液，进行第一次免疫(免疫剂量为100μl/只)；第28天，将免疫用溶液与弗氏不完全佐剂等体积混合均匀并超声制备成乳浊液，进行第二次免疫(免疫剂量为100μl/只)；第42天，将免疫用溶液与弗氏不完全佐剂等体积混合均匀并超声制备成乳浊液，进行第三次免疫(免疫剂量为100μl/只)；第一次免疫和第一次免疫的接种方式为背部皮下多点注射接种，第三次免疫的接种方式为腹腔注射接种；

第56天，用黑龙江立克次体对各组小鼠进行攻毒，攻毒剂量为4×10⁷拷贝数/只。攻毒84小时后处死小鼠，取10mg脾组织、20mg肝组织、20mg肺组织提取基因组DNA，采用实时荧光定量PCR检测其脾、肝、肺三种组织中黑龙江立克次体的载量。

实时荧光定量PCR所用的引物及探针序列如下：

Fp：5′-ATCTGAAGCGGGAGCAATACC-3′；

Rp：5′-CATCAGTATAGAAAGGTTTTGCCCATA-3′；

TaqMan MGB探针：FAM-TACATTATCAACAGCCTCGTCAP(TAQMAN-MGB基团)。

通过对照标准曲线将各个实时荧光定量PCR结果换算为黑龙江立克次体的拷贝数。标准品序列如下：5′-TACATTATCAACAGCCTCGTCA-3′。与脾组织进行同一批次实时荧光定量PCR的标准曲线方程为Ct＝-3.15×logC0+40.79。与肝组织进行同一批次实时荧光定量PCR的标准曲线方程为Ct＝-2.97×logC0+39.50。与肺组织进行同一批次实时荧光定量PCR的标准曲线方程为Ct＝-3.05×logC0+39.98。三个标准曲线方程中，C0均代表拷贝数。三个标准曲线方程的R2值均大于98％。

实验结果数据以

表示。对实时荧光定量PCR的结果运用SAS9.1软件进行单因素多水平方差分析及两两比较。

脾组织中的结果见表2和图2。肝组织中的结果见表3和图3。肺组织中的结果见表4和图4。结果如表3、表4、表5和图2、图3、图4所示。

表3  10mg脾组织中检测结果

组别	黑龙江立克次体拷贝数
		第四组	380000±136559
第一组	19000±11567

第二组	270000±13873
		第三组	3430±2615

表420mg肝组织中检测结果

组别	黑龙江立克次体拷贝数
		第四组	16600±7684
第一组	987±609
		第二组	12200±4142
第三组	610±292

表520mg肺组织中检测结果

组别	黑龙江立克次体拷贝数
		第四组	62000±16072
第一组	17700±12713
		第二组	52100±22599
第三组	10200±4694

统计学分析显示：蛋白Rh054_01780组（第一组）和全菌蛋白组（第三组）小鼠的脾脏、肝脏及肺脏中立克次体平均载量均显著少于空白对照组（第四组）和对照蛋白PrsA组（第二组），P<0.05；对照蛋白PrsA组（第二组）小鼠的脾脏、肝脏及肺脏立克次体平均载量与空白对照组（第四组）无显著性差异；蛋白Rh054_01780组（第一组）和全菌蛋白组（第三组）小鼠的脾脏、肝脏及肺脏中立克次体平均载量无显著性差异。结果表明：蛋白Rh054_01780能诱发针对黑龙江立克次体的特异性免疫，具有良好的免疫保护性能，为远东斑点热的保护性抗原。

与空白对照组（第四组）相比，蛋白Rh054_01780组（第一组）可减少立克次体菌体在脾组织、肝组织及肺组织中增值的95%、94%和71%，全菌蛋白组（第三组）可减少立克次体菌体在脾组织、肝组织及肺组织中增值的99%、96%和84%，因而蛋白Rh054_01780的免疫保护性可达到全菌蛋白免疫保护性的85%以上（脾脏中：95%/99%=96%；肝脏中：94%/96%=98%；肺脏中：71%/84%=85%）。

Claims (10)

1.蛋白Rh054_01780在制备远东斑点热疫苗中的应用；

所述蛋白Rh054_01780为如下（a）或（b）：

（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（b）将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白质。

2.蛋白Rh054_01780在制备针对黑龙江立克次体（Rickettsiaheilong jiangensis）的疫苗中的应用；

所述蛋白Rh054_01780为如下（a）或（b）：

（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（b）将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白质。

3.蛋白Rh054_01780在制备针对远东斑点热的保护性抗原中的应用；

所述蛋白Rh054_01780为如下（a）或（b）：

（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（b）将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白质。

4.蛋白Rh054_01780在制备针对黑龙江立克次体（Rickettsiaheilong jiangensis）的保护性抗原中的应用；

所述蛋白Rh054_01780为如下（a）或（b）：

（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（b）将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白质。

5.一种远东斑点热疫苗，它的活性成分包括蛋白Rh054_01780；

所述蛋白Rh054_01780为如下（a）或（b）：

（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（b）将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白质。

6.一种黑龙江立克次体（Rickettsia heilong jiangensis）的疫苗，它的活性成分包括蛋白Rh0540_1780；

所述蛋白Rh054_01780为如下（a）或（b）：

（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（b）将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白质。

7.如权利要求5或6所述的疫苗，其特征在于：它的活性成分由所述蛋白Rh054_01780和佐剂组成。

8.一种针对远东斑点热的保护性抗原，它的活性成分包括蛋白Rh054_01780；

所述蛋白Rh054_01780为如下（a）或（b）：

（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（b）将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白质。

9.一种针对黑龙江立克次体（Rickettsia heilong jiangensis）的保护性抗原，它的活性成分包括蛋白Rh054_01780；

所述蛋白Rh054_01780为如下（a）或（b）：

（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（b）将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白质。

10.如权利要求8或9所述的保护性抗原，其特征在于：它的活性成分由所述蛋白Rh054_01780和佐剂组成。

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