CN108794636A - 一种表位多肽串联混合物在抗立氏立克次体的免疫保护中的应用 - Google Patents

一种表位多肽串联混合物在抗立氏立克次体的免疫保护中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种表位多肽串联混合物在抗立氏立克次体的免疫保护中的应用。本发明的发明人发现立氏立克次体的一种表位多肽串联混合物作为一种抗原，能够刺激机体产生免疫应答对抗立氏立克次体毒株攻击，为具有落基山斑点热疫苗功能的保护性抗原。此表位多肽串联混合物可通过基因工程制备，其与菌体蛋白疫苗相比，具有制备方法简单、成本低、产量高、更安全等优点。本发明对于落基山斑点热的防疫和治疗具有重大价值。

Description

一种表位多肽串联混合物在抗立氏立克次体的免疫保护中的 应用
技术领域
本发明涉及一种表位多肽串联混合物在抗立氏立克次体的免疫保护中的应用。
背景技术
立氏立克次体(Rickettsia rickettsii)作为一种革兰氏阴性染色的胞内寄生小杆菌，是斑点热群立克次体(spotted fever group rickettsia,SFGR)中毒力最强的一个种，为落基山斑点热(Rocky Mountain Spotted Fever,RMSF)的病原菌，RMSF在自然界主要通过蜱叮咬传播，在北美地区分布广泛。由于立氏立克次体的高致病性、致死率以及可经气溶胶形式传播，它已被列为生物战剂之一和潜在的生物恐怖剂。
落基山斑点热是一种严重威胁人类健康的人兽共患自然疫源性疾病，最早在美国被发现。RMSF患者的早期临床表现主要有高热、头痛和肌肉酸痛，如若治疗不及时，立氏立克次体在体内迅速扩散，后期病情严重者可出现血压下降、急性肺水肿、肾衰和/或循环衰竭，并发心和脑后遗症，在暴发型病例可因心跳突然停止而死亡。在无有效抗生素治疗的情况下，RMSF致死率高达60-80％。并且RMSF早期症状缺乏特异性，很难与其他疾病相区分，难以做到早发现早治疗。有效疫苗预防接种诱导机体产生持久的抗立氏立克次体特异性免疫是预防RMSF发生和流行的最有效手段。
二十世纪内，RMSF疫苗的研制主要集中在灭活疫苗上。初期，研究人员主要采用立氏立克次体感染蜱的内脏匀浆或纯化鸡胚卵黄囊中培养的立氏立克次体后制备甲醛灭活的立氏立克次体全菌疫苗(whole cell vaccine,WCV)，但研究表明免疫保护效果并不理想。1975年美国陆军传染病研究所用鸡胚成纤维细胞培养立氏立克次体后通过蔗糖密度梯度离心纯化，将纯化菌体用甲醛灭活后制成灭活疫苗，在随后进行的人体保护性试验中证明该疫苗可以保护1/4的接种者，接种后患者的发热反应减轻，四环素的治疗更有效，但是该灭活疫苗仅提供有限的保护作用，远没有达到有效疫苗保护标准。另外制备立氏立克次体灭活疫苗通常需要细胞或鸡胚大量培养立克次体，其纯化的防护要求高、工艺复杂、费时费力，因此难以大量制备和推广使用。
随着分子生物学和蛋白质组学技术的快速发展以及对RMSF疫苗研究的不断深入，人们将目光转向了亚单位疫苗研究。研究发现立氏立克次体外膜蛋白A(OmpA)、外膜蛋白B(OmpB)免疫产生的抗体可以中和立克次体对小鼠的致死毒性，给予OmpA及OmpB的单克隆抗体可以保护豚鼠有效抵抗致死剂量的立氏立克次体的感染并交叉保护小鼠抵抗死剂量的康氏立克次体(R.conorii)的感染。另外，研究证明立氏立克次体YbgF免疫也能提供小鼠抗立氏立克次体的特异性免疫保护。这些单一表面蛋白尽管具有一定的免疫保护作用，但是其免疫保护效果有限苗。因此，鉴定立氏立克次体的保护性抗原表位，研发更加安全、有效、持久的亚单位疫苗对预防RMSF具有重大的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种表位多肽串联混合物在抗立氏立克次体的免疫保护中的应用。
本发明首先保护一种重组多表位肽，包括序列表的序列1至序列12所示的表位肽。
所述重组多表位肽由序列表的序列1至序列12所示的表位肽组成。
所述重组多表位肽是如下(a)或(b)：
(a)由序列表中序列13所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)将序列13的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列13衍生的蛋白质。
本发明还保护编码所述重组多表位肽的基因。
所述基因为如下(1)-(3)中任一所述的DNA分子：
(1)序列表中序列14所示的DNA分子；
(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白的DNA分子；
(3)与(1)或(2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白的DNA分子。
本发明还保护所述重组多表位肽，或，所述基因，在制备预防和/或治疗立氏立克次体引起的疾病的产品中的应用。
所述疾病为落基山斑点热。
本发明还保护一种产品，其活性成分为以上任一所述重组多表位肽；所述产品的用途为预防和/或治疗立氏立克次体引起的疾病。
所述疾病为落基山斑点热。
本发明还保护一种用于预防和/或治疗立氏立克次体引起的疾病的疫苗，其活性成分为以上任一所述重组多表位肽。
所述疾病为落基山斑点热。
本发明的发明人发现立氏立克次体的一种表位多肽串联混合物作为一种抗原，能够刺激机体产生免疫应答对抗立氏立克次体毒株攻击，为具有落基山斑点热疫苗功能的保护性抗原。此表位多肽串联混合物可通过基因工程制备，其与菌体蛋白疫苗相比，具有制备方法简单、成本低、产量高、更安全等优点。本发明对于落基山斑点热的防疫和治疗具有重大价值。
附图说明
图1为ELISPOT法筛选出的免疫优势CD4+T细胞表位肽。
图2为ELISPOT法筛选出的免疫优势CD8+T细胞表位肽。
图3为立氏立克次体T细胞表位嵌合基因PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果。
图4为立氏立克次体攻击后免疫小鼠的生存曲线。
图5为立氏立克次体攻击后免疫小鼠的体重变化。
图6为表位多肽串联混合物等免疫小鼠攻毒后脏器病理变化。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
以下实施例中利用仪器AT-Spot 3000ELISPOT读取仪读取ELISPOT板孔内斑点数。
ELISPOT试剂盒：瑞典Mabtech公司。
C3H/HeN小鼠：北京维通利华公司。
立氏立克次体Sheila Smith株(Rickettsia rickettsii，Sheila Smithstrain)：在文献“Ellison DW,Clark TR,Sturdevant DE,Virtaneva K,Porcella SF,Hackstadt T.Genomic comparison of virulent Rickettsia rickettsii Sheila Smithand avirulentRickettsiarickettsii Iowa.Infect Immun.2008Feb；76(2):542-50.Epub2007Nov 19”中公开，公众可从中国人民解放军军事科学院军事医学研究院获得。
减毒的单核细胞增生性李斯特杆菌(the attenuated Listeriamonocytogenesvaccine strain)：参考文献：Brockstedt DG,Giedlin MA,Leong ML,etal.Listeria-based cancer vaccines thatsegregate immunogenicity fromtoxicity.ProcNatlAcadSci U S A.2004Sep21；101(38):13832–7.公众可以从中国人民解放军军事科学院军事医学研究院获得。
实施例1、ELISPOT方法筛选阳性表位肽
1、从NCBI数据库中获取A1G_006050、A1G_06030和A1G_06990的蛋白序列，用在线分析工具IEDB和SYFPEITHI预测其CD4+T细胞表位，MHC限制性为H-2I-Ak和H-2I-Ek，肽长度为15个氨基酸。优先选择在各个数据库中得分较高的肽序列并合成CD4+T细胞表位。随后利用立氏立克次体全菌抗原(WCA)分别免疫C3H/HeN小鼠，利用CD4+T淋巴细胞分选试剂盒分离出致敏的CD4+T淋巴细胞，通过ELISPOT技术检测上述96孔板中CD4+T淋巴细胞分泌IFN-γ的水平，待斑点达到要求后读板，扫描。筛选刺激指数SI值＝实验组斑点数均值/阴性对照组斑点数均值≥2.0且实验组斑点数均值>40的表位肽的表位肽(图1)。
2、从NCBI数据库中获取A1G01245、A1G01790、A1G04555、A1G05165的蛋白序列，用在线分析工具IEDB、NETMHC和SYFPEITHI预测它们的CD8+T细胞表位，MHC限制性为H-2Dk和H-2Kk，肽长度为9个氨基酸。优先选择在各个数据库中得分较高的肽序列并合成CD8+T细胞表位。随后利用立氏立克次体分别感染C3H/HeN小鼠，利用CD8+T淋巴细胞分选试剂盒分离出致敏的CD8+T淋巴细胞，通过ELISPOT技术检测上述96孔板中CD8+T淋巴细胞分泌IFN-γ的水平。筛选刺激指数SI值＝实验组斑点数均值/阴性对照组斑点数均值≥2.0且实验组斑点数均值>40的表位肽(图2)。
3、通过上述方法，共筛选出4个免疫优势CD4+T细胞表位肽(A1G_00605190-204、A1G_00605232-246、A1G_06030399-413、A1G_069901439-1453)和8个免疫优势CD8+T细胞表位肽(A1G_01245330-338、A1G_01790230-238、A1G_04555533-541、A1G_0516515-23、A1G_05165240-248、A1G_05165525-533、A1G_05165569-577和A1G_05165592-600)。
每个免疫优势CD4+T表位肽含有15个氨基酸，每个免疫优势CD8+T表位肽含有9个氨基酸，具体信息见表1。
表1表位肽信息
实施例2、立氏立克次体T细胞表位串联混合物的制备
一、嵌合串联表位肽的制备
将实施例1中所述4个免疫优势CD4+T细胞表位肽和8个免疫优势CD8+T细胞表位肽基因串联，得到嵌合串联表位肽，如序列表的序列13所示，其编码基因如序列表的序列14所示。
二、立氏立克次体T细胞表位串联混合物的制备
1、采用序列表的序列14所示的双链DNA分子替代pLAD02穿梭质粒(序列表的序列15所示的环状质粒)的BamHI和Bgl II位点间的片段，得到重组质粒(已经测序验证)。
2、将步骤1得到的重组质粒导入大肠埃希菌SM10(上海康朗生物科技有限公司，货号：A0049)中，得到立氏立克次体T细胞表位重组大肠杆菌。
3、将步骤2得到的立氏立克次体T细胞表位重组大肠杆菌接种于含有10μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，37℃、180rpm培养至OD值为1，得到立氏立克次体T细胞表位重组大肠杆菌菌液。
4、将减毒的单核细胞增生性李斯特杆菌接种于含有200μg/mL链霉素的BHI液体培养基中，33℃、180rpm培养OD值为1，得到减毒的单核细胞增生性李斯特杆菌菌液。
5、分别取步骤3得到的菌液和步骤4得到的菌液各100μl涂布于含有10μg/mL氯霉素和200μg/mL链霉素的BHI固体培养基中，置于33℃培养48小时，得到重组李斯特杆菌。
6、挑取步骤5得到的单菌落，提取菌落DNA，以菌落DNA为模板，采用上游引物和下游引物组成的引物对进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。
上游引物：5'-CCTAAAATGAAAGGCTTC-3'；
下游引物：5'-GTGTTTTCTTCGATAACG-3'。
PCR扩增反应体系如表2所示。
PCR扩增反应程序如表3所示。
表2 PCR扩增反应体系
组分 体积/μl
TaKaRa Premix Taq 12.5
上游引物 1
下游引物 1
模板DNA 2
H2O 8.5
合计 25
表3 PCR扩增反应程序
结果如图3所示。结果表明，重组李斯特杆菌表达立氏立克次体T细胞表位。
实施例3、表位多肽串联混合物免疫保护性评价
一、小鼠免疫
实验动物：C3H/HeN小鼠(雌性6周龄)。
将实验动物随机分为如下3组，每组10只。
实验组(表位多肽串联混合物免疫组)：每只小鼠腹腔注射100μl实施例2步骤二的6鉴定的表达制备的立氏立克次体T细胞表位的重组李斯特杆菌菌液(含5×106PFU重组李斯特杆菌)。
阳性对照组(李斯特杆菌空载体免疫组)：每只小鼠腹腔注射100μl减毒的单核细胞增生性李斯特杆菌菌液(含5×106PFU减毒的单核细胞增生性李斯特杆菌)。
阴性对照组(PBS免疫组)：每只小鼠腹腔注射100μl PBS。
首次免疫2周后，以相同剂量、相同免疫原加强免疫1次。
二、立氏立克次体攻毒
完成步骤一的末次免疫4周后，每只小鼠经尾静脉注射立氏立克次体SheilaSmith株菌液100μl(含2.5×106PFU立氏立克次体Sheila Smith株)，每日观察各组小鼠生存状态及体重变化直至感染后2周。
三、制备病理切片
1、完成步骤二后，断颈法处死各组尚存活的小鼠，解剖后取肝脏、脾脏和肺，将小鼠脏器置于4％多聚甲醛溶液固定48小时。
2、完成步骤1后，取出各脏器，依次用浓度80％、90％、95％、100％的乙醇进行脱水，每次2小时，然后将脏器放入二甲苯中静置1h。
3、完成步骤2后，将脏器放入55℃液体石蜡中，待石蜡自然凝固后即成蜡块。
4、完成步骤3后，将蜡块切成4-6μm厚的蜡带，用镊子轻轻夹起蜡带并将其放置在40℃～45℃的水面上，待切片完全自然展开后将其轻轻捞起放置在干净载玻片上，倾去载玻片上的余水，置入60℃～65℃恒温箱内烘烤30min，HE染色，显微镜下观察组织细胞变化。
结果如图4-图6所示。
结果显示，PBS免疫组小鼠攻毒的第二天全部死亡；李斯特杆菌空载体免疫组小鼠在攻毒2天后开始发病，出现耸毛、蜷缩、食量减少、活动减少、体重减轻等症状，5天后症状逐渐减轻，在攻毒后的第2、3、4、5天分别死亡1只、3只、1只、1只；表位多肽串联混合物免疫组小鼠在攻毒2天后开始出现感染症状，5天后症状逐渐减轻，在攻毒的第5天死亡2只。
在感染后14天，李斯特杆菌空载体免疫组(Lm)生存率为40％，表位多肽串联混合物免疫组(Lm-R.r)生存率为80％，它们之间有显著差异(P<0.05)(图4)。
李斯特杆菌空载体免疫组(Lm)和表位多肽串联混合物免疫组(Lm-R.r)小鼠体重均在攻毒的第2天迅速下降，第四天降到最低值，之后体重缓慢恢复(图5)。
病理切片结果如图6所示。图6中，横向黑色箭头所示为炎性细胞；斜向黑色箭头所示为巨噬细胞；横向白色箭头所示为局灶性坏死；斜向白色箭头所示为肺泡壁增厚；圆圈所示为出血灶。结果显示，李斯特杆菌空载体免疫组小鼠肝脏炎性细胞浸润明显，脾脏有局灶性坏死，并有较多的巨噬细胞浸润，肺的肺泡明显增厚并有出血，有较多的炎性细胞浸润，表位多肽串联混合物免疫组小鼠脏器病理改变不明显或明显轻于李斯特杆菌空载体免疫组。
序列表
<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
<120> 一种表位多肽串联混合物在抗立氏立克次体的免疫保护中的应用
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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Asp Phe Gly Asn Leu Ala Ala Gln Ile Lys Val Pro Asn Asp Asn Asp
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Asp Glu Gly Ile Val Ile Leu Asn Ser Val Thr Ala Ile Glu Glu Met
50 55 60
Leu Met Met Gly Leu Gly Glu Val Lys Trp Asn Phe Glu Phe Ala Glu
65 70 75 80
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agtgaaaatg aaggccgaat tttccttgtt ctaaaaaggt tgtattagcg tatcacgagg 360
agggagtata agtgggatta aatagattta tgcgtgcgat gatggtagtt ttcattactg 420
ccaactgcat tacgattaac cccgacataa tatttgcagc gacagatagc gaagattcca 480
gtctaaacac agatgaatgg gaagaagaaa aaacagaaga gcagccaagc gaggtaaata 540
cgggcccaag atacgaaact gcacgtgaag taagttcacg tgatattgag gaactagaaa 600
aatcgaataa agtgaaaaat acgaacaaag cagacctaat agcaatgttg aaagcaaaag 660
cagagaaagg tggatcctta caattagctg gtactccaac tttctcttct ttattagctt 720
ctatctcttt aaacactatc cgtaacatga tgccattacg tgcttctaaa aacttattaa 780
actacttcca aatctctaac ccaccatact tatctgttaa ctctaactct ggttctttcg 840
ttgctatcaa atcttaccgt aaattctctg gtatctgttc tgttgctact tacttctgtt 900
accaaaacca tacttacttc tctggtttag aaaacgcttt agaagttatc gttgtttaca 960
ctttctctgg tttagcttct atcatcccag ttttagcttt aaaaccagct aacttcttcg 1020
ttcgtttctc tgttgttaac tacgctactt tattcttcgt tccaaaattc ttcttaactt 1080
tccgtgttaa agttttctta actcatttct ctaactactc ttaccgtact cgtttacgtc 1140
attacttcat gaacaacgtt ttcactgtta ctcatcgttt agctcgttta gctcaaatct 1200
taaacggtga taaattaaac tacgctactc ataaagcttc ttacaacgct ttattagatg 1260
aagaaactat ctactctgct caaaacgaaa tctctttctc tggtttcgtt acttctttag 1320
ttttcatcac tgctgttatc gctgttgttt taactgtttt attacgtact ccattattcg 1380
ttgctttatt catcttaact catttaatct ctttattacg tactttacgt tacgctcaag 1440
cttctttcca aaactacaga tcttacccat acgatgttcc agattacgct taaggatcca 1500
caagttataa atttgaaagt gttgctgcag atcaagccag agagctcatc aattcctggg 1560
tagaaagtca gacaaatgga attatcagaa atgtccttca gccaagctcc gtggattctc 1620
aaactgcaat ggttctggtt aatgccattg tcttcaaagg actgtgggag aaagcattta 1680
aggatgaaga cacacaagca atgcctttca gagtgactga gcaagaaagc aaacctgtgc 1740
agatgatgta ccagattggt ttatttagag tggcatcaat ggcttctgag aaaatgaaga 1800
tcctggagct tccatttgcc agtgggacaa tgagcatgtt ggtgctgttg cctgatgaag 1860
tctcaggcct tgagcagctt gagagtataa tcaactttga aaaactgact gaatggacca 1920
gttctaatgt tatggaagag aggaagatca aagtgtactt acctcgcatg aagatggagg 1980
aaaaatacaa cctcacatct gtcttaatgg ctatgggcat tactgacgtg tttagctctt 2040
cagccaatct gtctggcatc tcctcagcag agagcctgaa gatatctcaa gctgtccatg 2100
cagcacatgc agaaatcaat gaagcaggca gagaggtggt agggtcagca gaggctggag 2160
tggatgctgc aagcgtctct gaagaattta gggctgacca tccattcctc ttctgtatca 2220
agcacatcgc aaccaacgcc gttctcttct ttggcagatg tgtttcccct taactcgagc 2280
aattcgccct atagtgagtc gtattgacgt cgctatttaa cgaccctgcc ctgaaccgac 2340
gaccgggtcg aatttgcttt cgaatttctg ccattcatcc gcttattatc acttattcag 2400
gcgtagcaac caggcgttta agggcaccaa taactgcctt aaaaaaatta cgccccgccc 2460
tgccactcat cgcagtactg ttgtaattca ttaagcattc tgccgacatg gaagccatca 2520
caaacggcat gatgaacctg aatcgccagc ggcatcagca ccttgtcgcc ttgcgtataa 2580
tatttgccca tggtgaaaac gggggcgaag aagttgtcca tattggccac gtttaaatca 2640
aaactggtga aactcaccca gggattggct gagacgaaaa acatattctc aataaaccct 2700
ttagggaaat aggccaggtt ttcaccgtaa cacgccacat cttgcgaata tatgtgtaga 2760
aactgccgga aatcgtcgtg gtattcactc cagagcgatg aaaacgtttc agtttgctca 2820
tggaaaacgg tgtaacaagg gtgaacacta tcccatatca ccagctcacc gtctttcatt 2880
gccatacgga attccggatg agcattcatc aggcgggcaa gaatgtgaat aaaggccgga 2940
taaaacttgt gcttattttt ctttacggtc tttaaaaagg ccgtaatatc cagctgaacg 3000
gtctggttat aggtacattg agcaactgac tgaaatgcct caaaatgttc tttacgatgc 3060
cattgggata tatcaacggt ggtatatcca gtgatttttt tctccatttt agcttcctta 3120
gctcctgaaa atctcgataa ctcaaaaaat acgcccggta gtgatcttat ttcattatgg 3180
tgaaagttgg aacctcttac gtgccgatca acgtctcatt ttcgccaaaa gttggcccag 3240
ggcttcccgg tatcaacagg gacaccagga tttatttatt ctgcgaagtg atcttccgtc 3300
acaggtattt attcggcgca aagtgcgtcg ggtgatgctg ccaacttact gatttagtgt 3360
atgatggtgt ttttgaggtg ctccagtggc ttctgtttct atcagctgtc cctcctgttc 3420
agctactgac ggggtggtgc gtaacggcaa aagcaccgcc ggacatcagc gctagcggag 3480
tgtatactgg cttactatgt tggcactgat gagggtgtca gtgaagtgct tcatgtggca 3540
ggagaaaaaa ggctgcaccg gtgcgtcagc agaatatgtg atacaggata tattccgctt 3600
cctcgctcac tgactcgcta cgctcggtcg ttcgactgcg gcgagcggaa atggcttacg 3660
aacggggcgg agatttcctg gaagatgcca ggaagatact taacagggaa gtgagagggc 3720
cgcggcaaag ccgtttttcc ataggctccg cccccctgac aagcatcacg aaatctgacg 3780
ctcaaatcag tggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg 3840
cggctccctc gtgcgctctc ctgttcctgc ctttcggttt accggtgtca ttccgctgtt 3900
atggccgcgt ttgtctcatt ccacgcctga cactcagttc cgggtaggca gttcgctcca 3960
agctggactg tatgcacgaa ccccccgttc agtccgaccg ctgcgcctta tccggtaact 4020
atcgtcttga gtccaacccg gaaagacatg caaaagcacc actggcagca gccactggta 4080
attgatttag aggagttagt cttgaagtca tgcgccggtt aaggctaaac tgaaaggaca 4140
agttttggtg actgcgctcc tccaagccag ttacctcggt tcaaagagtt ggtagctcag 4200
agaaccttcg aaaaaccgcc ctgcaaggcg gttttttcgt tttcagagca agagattacg 4260
cgcagaccaa aacgatctca agaagatcat cttattaatc agataaaata tttctagatt 4320
tcagtgcaat ttatctcttc aaatgtagca cctgaagtca gccccatacg atataagttg 4380
taattctccg ccgcttgccc tcatctgtta cgccggcggt agccggccag cctcgcagag 4440
caggattccc gttgagcacc gccaggtgcg aataagggac agtgaagaag gaacacccgc 4500
tcgcgggtgg gcctacttca cctatcctgc ccggctgacg ccgttggata caccaaggaa 4560
agtctacacg aaccctttgg caaaatcctg tatatcgtgc gaaaaaggat ggatataccg 4620
aaaaaatcgc tataatgacc ccgaagcagg gttatgcagc ggaaaagcgc tgcttccctg 4680
ctgttttgtg gaatatctac cgactggaaa caggcaaatg caggaaatta ctgaactgag 4740
gggacaggcg agaggcatgc gtggagggaa agaagaacgc tgttgaaaaa atcttctctg 4800
gactacttga aacaaaagaa ttaaagtcat tttataaaaa ccttgagaaa aaacatcttg 4860
atataaaaac tatttataac gaatatttat ttcaatgtaa taataaataa tatttattat 4920
tacataaaat gtttgtggta ttatttgtgg tatatatatc ctaaatggct ttatatcagt 4980
gtgtgttaat ccctctcagg acgttaaata gtaatgtaaa gaaatctcta aaacgttgaa 5040
aagccttgat attaaagggc ggatgaatgt tttggagttt tttttatatc gtataatacc 5100
cgttttattc cgttgttttt gtggcatttg tggtaaaatt tgtggtattt tcatctgttt 5160
ttagtgtgaa aaaagcatct actttggact gattatgttg tcttaaatta gagcttagat 5220
gactatagta ttttaatgtt gtattaatgt catcatgacc aagcctatca gctacataaa 5280
taatatccat acccgcttct acacataagc ctgtatgcgt atgtcgtagc ttgtgtaatg 5340
tcactggttc agaattgatt gtactacata tcttcttcaa agctttatta caagacgcgt 5400
tgtctactgg cttattgtgg taagtgatga ataataacat caatggattc ttaatagcat 5460
gttccttcat atattcagta tgccaattta aatacgaatg taaatattga gcggtagagt 5520
tatcaatata gatcactcgt gatttttttg ttttggtatc aatgaatgta ttagtgtact 5580
tgtaatccca agctttattc acagttattg aacgtttagt gaaattaata tccttctttg 5640
ttagtgcaat aatttcttcg aacctcatgc ctgtctggac agctagaaag ataactgctc 5700
gtgatataga atgaaatttt gcaagttctt ctaatagtaa atgaactttg tctgtttcca 5760
taaattgtgc tttatttttc gctacgtcct gtccgcttat atgagcccct atagtggggt 5820
ttttcttcat gtaacctaaa tgaacagcct tgttaaaaat cgctctaatt ttgcggtgtc 5880
tggtgtctac agtggatatt gcatagtcta cagataaatg attaataaat tgttgatatt 5940
gaaccgcatc aatcgaatta aatttaattt tttcatcgaa ataatcaacg aattgattat 6000
aagcaagatc gtataaatta atagtagatt gactactttt cccatcttta aatgttttca 6060
tgaatagcgt ataaaattct ttgaagttcc attctttcag agaactacta tcatgctgaa 6120
cttgttttaa taatttagat gctttataca ttaagtttgt ttcacttgta tctgtcaaac 6180
gcttttcttt ccattcacca tcgactttta tacgtaggcg aacacaatat ttaccgtttg 6240
ctaatttttt tatcttcatt aataccacca cctgtttatt tttggagatc tttttttcag 6300
aaaatcccag tacgtaatta agtatttgag aattaatttt atattgatta atactaagtt 6360
tacccagttt tcacctaaaa aacaaatgat gagataatag ctccaaaggc taaagaggac 6420
tataccaact atttgtaata attctgtaac agttgaaaag cgaacgtgta ttcttagggc 6480
ttgagatgta ttgctgggta aacctttata gtgtaagtgg gatgtgaacg ttaatcaaca 6540
actttcgcta tgggaaacct attgtttttt gttaatagaa aaacttaata catttgtaat 6600
ataaaaaccg gcagtttttc cgttcttcgt gactcgaaat gaattgccag atgagtttat 6660
ggtattctat aatagaaggt atggaggatg ttatataatg agacagaatt atgatgatcg 6720
aaagctagct tggcactggc cgtcgtttta caacgtcgtg actgggaaaa ccctggcgtt 6780
acccaactta atcgccttgc agcacatccc cctttcgcca gctggcgtaa tagcgaagag 6840
gcccgcaccg atcgcccttc ccaacagttg cgcagcctga atggcgaatg gcgcctgatg 6900
cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc gcatatgaat tcctgttata 6960
aaaaaaggat caattttgaa ctctctccca aagttgatcc cttaacgatt tagaaatccc 7020
tttgagaatg tttatataca ttcaaggtaa ccagccaact aatgacaatg attcctgaaa 7080
aaagtaataa caaattacta tacagataag ttgactgatc aacttccata ggtaacaacc 7140
tttgatcaag taagggtatg gataataaac cacctacaat tgcaatacct gttccctctg 7200
ataaaaagct ggtaaagtta agcaaactca ttccagcacc agcttcctgc tgtttcaagc 7260
tacttgaaac aattgttgat ataactgttt tggtgaacga aagcccacct aaaacaaata 7320
cgattataat tgtcatgaac catgatgttg tttctaaaag aaaggaagca gttaaaaagc 7380
taacagaaag aaatgtaact ccgatgttta acacgtataa aggacctctt ctatcaacaa 7440
gtatcccacc aatgtagccg aaaataatga cactcattgt tccagggaaa ataattacac 7500
ttccgatttc ggcagtactt agctggtgaa catctttcat catataagga accatagaga 7560
caaaccctgc tactgttcca aatataattc ccccacaaag aactccaatc ataaaaggta 7620
tatttttccc taatccggga tcaacaaaag gatctgttac tttcctgata tgttttacaa 7680
atatcaggaa tgacagcacg ctaacgataa gaaaagaaat gctatatgat gttgtaaaca 7740
acataaaaaa tacaatgcct acagacatta gtataattcc tttgatatca aaatgacctt 7800
ttatccttac ttctttcttt aataatttca taagaaacgg aacagtgata attgttatca 7860
taggaatgag tagaagatag gaccaatgaa tataatgggc tatcattcca ccaatcgctg 7920
gaccgactcc ttctcccatg gctactatcg atccaataag accaaatgct ttacccctat 7980
tttcctttgg aatatagcgc gcaactacaa ccattacgag tgctggaaat gcagctgcac 8040
cagccccttg aataaaacga gccataataa gtaaggaaaa gaaagaatgg ccaacaaacc 8100
caattaccga cccgaaacaa tttattataa ttccaaatag gagtaacctt ttgatgccta 8160
attgatcaga tagctttcca tatacagctg ttccaatgga aaaggttaac ataaaggctg 8220
tgttcaccca gtttgtactc gcaggtggtt tattaaaatc atttgcaata tcaggtaatg 8280
agacgttcaa aaccatttca tttaatacgc taaaaaaaga taaaatgcaa agccaaatta 8340
aaatttggtt gtgtcgtaaa ttcgattgtg aataggatgt attcacattt caccctccaa 8400
taatgagggc agacgtagtt tatagggtta atgatacgct tccctctttt aattgaaccc 8460
tgttacattc attacacttc ataattaatt cctcctaaac ttgattaaaa cattttacca 8520
catataaact aagttttaaa ttcagtattt catcacttat acaacaatat ggcatatggt 8580
gcactctcag tacaatctgc tctgatgccg catagttaag ccagccccga cacccgccaa 8640
cacccgctga cgcgccctga cgggcttgtc tgctcccggc atccgcttac agaca 8695

Claims (10)

1.一种重组多表位肽，包括序列表的序列1至序列12所示的表位肽。
2.如权利要求1所述的重组多表位肽，其特征在于：
所述重组多表位肽是如下(a)或(b)：
(a)由序列表中序列13所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)将序列13的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列13衍生的蛋白质。
3.编码权利要求1或2所述重组多表位肽的基因。
4.如权利要求3所述的基因，其特征在于：
所述基因为如下(1)-(3)中任一所述的DNA分子：
(1)序列表中序列14所示的DNA分子；
(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白的DNA分子；
(3)与(1)或(2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白的DNA分子。
5.权利要求1或2所述重组多表位肽，或，权利要求3或4所述基因，在制备预防和/或治疗立氏立克次体引起的疾病的产品中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述疾病为落基山斑点热。
7.一种产品，其活性成分为权利要求1或2所述重组多表位肽；所述产品的用途为预防和/或治疗立氏立克次体引起的疾病。
8.如权利要求7所述的产品，其特征在于：所述疾病为落基山斑点热。
9.一种用于预防和/或治疗立氏立克次体引起的疾病的疫苗，其活性成分为权利要求1或2所述重组多表位肽。
10.如权利要求9所述的疫苗，其特征在于：所述疾病为落基山斑点热。
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