CN103149365B - 一种用于诊断或辅助诊断远东斑点热病的蛋白组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于诊断或辅助诊断远东斑点热病的蛋白组合物。本发明提供了提供的蛋白组合物,由如下5种蛋白组成:RplA蛋白、RplY蛋白、OmpA蛋白、OmpB蛋白和GroEL蛋白;本发明的实验证明,本发明发现了由5种蛋白组成的蛋白组合物及将5这种蛋白点制在基底上的蛋白芯片,运用该组合物或芯片可以对远东斑点热病人或动物的血清进行快速、准确的血清学分析诊断,结果准确可靠,操作简便,样本用量少,省时省力,可以代替传统的繁琐、累人、耗时的血清学诊断方法做远东斑点热血清学诊断。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,尤其涉及一种用于诊断或辅助诊断远东斑点热病的蛋白组合物。
背景技术
立克次体病是一种严重威胁人类健康的人兽共患自然疫源性疾病,在历史上曾严重威胁人类的健康,当今仍是造成人类发病和死亡的重要病因之一,其由立克次体引起,经蜱传播的感染性疾病。黑龙江立克次体(Rickettsia heilongjiangensis)是我国新发现的斑点热群立克次体,引起蜱传远东斑点热(Far-eastern tick-borne spotted fever),其疫区主要分布在我国东北地区、俄罗斯远东及日本。
在我国,斑点热报告较少,其重要原因是误诊和漏诊现象相当普遍。斑点热常被误诊为上呼吸道感染、疟疾、钩端螺旋体病、斑疹伤寒、恙虫病等热性病。造成误诊和漏诊的原因其一是斑点热还未被大多数人所了解,包括医务人员在内;其二是实验室诊断方法,包括间接免疫荧光(IFA)技术,酶联免疫吸附(ELISA)技术等,这些检测方法特异性较高,但对样本需求量大、步骤较为繁琐费时、并且都需要纯化的立克次体全菌作为抗原,而培养、纯化立克次体的防护要求高,工艺复杂,成本昂贵,因此难以被广泛推广和使用。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种具有如下1)或2)功能的的蛋白组合物;1)用于诊断或辅助诊断远东斑点热病;
2)用于检测或辅助检测黑龙江立克次体(Rickettsia heilongjiangensis)感染样本。本发明提供的蛋白组合物,由如下5种蛋白组成:RplA蛋白、RplY蛋白、OmpA蛋白、OmpB蛋白和GroEL蛋白;
所述RplA蛋白为如下1-a)或1-b):
1-a)为序列表中序列1的氨基酸残基组成的蛋白质;
1-b)为将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1-a衍生的蛋白质;
所述RplY蛋白为如下2-a)或2-b):
2-a)为序列表中序列2的氨基酸残基组成的蛋白质;
2-b)为将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由2-a衍生的蛋白质;
所述OmpA蛋白为如下3-a)或3-b):
3-a)为序列表中序列3的氨基酸残基组成的蛋白质;
3-b)为将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由3-a衍生的蛋白质;
所述OmpB蛋白为如下4-a)或4-b):
4-a)为序列表中序列4的氨基酸残基组成的蛋白质;
4-b)为将序列表中序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由4-a衍生的蛋白质;
所述GroEL蛋白为如下5-a)或5-b):
5-a)为序列表中序列5的氨基酸残基组成的蛋白质;
5-b)为将序列表中序列5所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由5-a衍生的蛋白质。
上述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述蛋白组合物中,所述远东斑点热病是由黑龙江立克次体(Rickettsiaheilongjiangensis)引起的蜱传远东斑点热(Far-eastern tick-borne spotted fever)。在本发明的实施例中黑龙江立克次体(Rickettsia heilongjiangensis)为黑龙江立克次体(Rickettsia heilongjiangensis)054型株。
上述检测或辅助检测的样本为人或动物的血样本。
含有上述蛋白组合物的蛋白芯片也是本发明保护的范围。
上述蛋白芯片为用于诊断或辅助诊断远东斑点热病的蛋白芯片;
所述远东斑点热病具体是由黑龙江立克次体(Rickettsia heilongjiangensis)引起的蜱传远东斑点热(Far-eastern tick-borne spotted fever)。
本发明的另一个目的是提供一种制备所述蛋白芯片的方法。
本发明提供的蛋白芯片,将上述的蛋白组合物中的5种蛋白作为5种检测点与阳性质控点和阴性质控点一起点制在基底上,得到蛋白芯片。
上述蛋白芯片中,所述蛋白以蛋白溶液的形式点制在基底上;
上述蛋白溶液为将蛋白溶解于洗脱缓冲液得到的溶液;上述每1升洗脱缓冲液组成:将NaH2PO4·H2O、NaCl、咪唑、0.3L甘油和水混合,NaH2PO4·H2O终浓度为50mmol/L、NaCl终浓度为300mmol/L、咪唑终浓度为250mmol/L,用NaOH调节pH至8.0,用水定容至1L,得到洗脱缓冲液。
上述蛋白芯片检测的样本为人或动物的血样本。
上述蛋白芯片中,所述基底可为任何制备蛋白芯片时所用的基底,具体可如醛基化玻片。
上述蛋白芯片中,所述阴性质控对照可为任何本领域中常用的阴性质控对照,具体可如水、PBS缓冲液,还具体可为蛋白洗脱缓冲液或转入空载体pET-32a(+)的BL21(DE3)的细胞裂解液。
其中,转入空载体pET-32a(+)的BL21(DE3)的细胞裂解液按照如下方法制备:将转入空载体pET-32a(+)的BL21(DE3)接入氨苄青霉素抗性(Amp+)的LB液体培养基中,37℃震摇过夜,次日按1:100接种新鲜氨苄青霉素抗性(Amp+)的LB液体培养基,37℃震摇至OD600=0.4,加入诱导剂IPTG,浓度为0.4mM,于37℃继续震摇4小时,得到发酵液。取诱导表达的发酵液100ml,8000rpm/min离心5min,集菌,弃上清液。用30ml裂解缓冲液重悬菌体,以25%振幅超声破碎(超3s,停9s)1小时,得到转入pET-32a(+)的BL21(DE3)的细胞裂解液。
每1升裂解缓冲液按照如下方法制备:将NaH2PO4·H2O、NaCl、咪唑和水混合,NaH2PO4·H2O终浓度为50mmol/L、NaCl终浓度为300mmol/L、咪唑终浓度为10mmol/L,用NaOH调节pH至8.0,用水定容至1L,得到裂解缓冲液。
上述蛋白芯片中,所述阳性质控点由人源IgG或IgM或除人外的其它动物来源的IgG或IgM点制而成,本发明的实施例中阳性质控点为2个,为由鼠源IgG和人源IgG点制而成。
本发明的第三个目的是提供一种具有如下1)或2)功能的的试剂盒;
1)用于诊断或辅助诊断远东斑点热病;
2)用于检测或辅助检测黑龙江立克次体(Rickettsia heilongjiangensis)感染样本。
上述检测或辅助检测的样本为人或动物的血样本。
本发明提供的试剂盒,包括上述的蛋白组合物或上述的蛋白芯片。
上述试剂盒还包括荧光素标记的二抗、封闭液和漂洗液;
所述试剂盒为如下1)或2):
1)所述的试剂盒由是上述的蛋白组合物、所述封闭液、所述漂洗液和所述荧光素标记的二抗组成;
2)所述的试剂盒由上述的蛋白芯片、所述封闭液、所述漂洗液和所述荧光素标记的二抗组成。
所述封闭液按照如下方法制备得到:将BSA溶于pH值为7.4的PBS缓冲液中,BSA与pH值为7.4的PBS缓冲液的配比为1g:100ml,得到的溶液即为封闭液;
漂洗液:PBST缓冲液。
上述荧光素标记的二抗为Cy5标记的羊抗人IgG或Cy5标记的羊抗除人以外其它动物来源的IgG;在本发明的实施例中荧光素标记的二抗为Cy5标记的羊抗鼠IgG。
每1升磷酸盐缓冲液(pH值为7.4的PBS缓冲液)按照如下方法制备:将8g NaCl、0.2gKCl、3.53gNa2HPO4·12H2O、0.24g KH2PO4和水混合,用水定容至1升,得到的溶液的pH值为7.4,即得到PBS缓冲液。
每1升PBST缓冲液按照如下方法制备:将磷酸盐缓冲液(PBS)与Tween-20混合,磷酸盐缓冲液(PBS)与Tween-20的配比为1升:1ml,得到PBST缓冲液。
上述试剂盒中,所述远东斑点热病是由黑龙江立克次体(Rickettsiaheilongjiangensis)引起的蜱传远东斑点热(Far-eastern tick-borne spotted fever)。在本发明的实施例中黑龙江立克次体(Rickettsia heilongjiangensis)为黑龙江立克次体(Rickettsia heilongjiangensis)054型株。
上述的蛋白组合物在制备具有如下1)或2)功能的产品中的应用也是本发明保护的范围。上述应用中,上述产品为蛋白芯片或试剂盒;1)用于诊断或辅助诊断远东斑点热病;2)用于检测或辅助检测黑龙江立克次体(Rickettsia heilongjiangensis)感染样本。
上述的蛋白芯片在制备具有如下1)或2)功能的产品中的应用也是本发明保护的范围。上述应用中,上述产品为试剂盒;1)用于诊断或辅助诊断远东斑点热病;2)用于检测或辅助检测黑龙江立克次体(Rickettsia heilongjiangensis)感染样本。
上述检测或辅助检测的样本为人或动物的血样本。
上述应用中,所述远东斑点热病是由黑龙江立克次体(Rickettsia heilongjiangensis)引起的蜱传远东斑点热(Far-eastern tick-borne spotted fever)。在本发明的实施例中黑龙江立克次体(Rickettsia heilongjiangensis)为黑龙江立克次体(Rickettsiaheilongjiangensis)054型株。
本发明的实验证明,本发明发现了由5种蛋白组成的蛋白组合物及将这5种蛋白点制在基底上的蛋白芯片,运用该组合物或芯片可以对远东斑点热病人或动物的血清进行快速、准确的血清学分析诊断,结果准确可靠,操作简便,样本用量少,省时省力,可以代替传统的繁琐、累人、耗时的血清学诊断方法做远东斑点热血清学诊断。
附图说明
图1为蛋白的电泳结果
图2为蛋白RplA与各血清组中血清反应荧光信号值分布散点图
图3为蛋白RplY与各血清组中血清反应荧光信号值分布散点图
图4为蛋白OmpA与各血清组中血清反应荧光信号值分布散点图
图5为蛋白OmpB与各血清组中血清反应荧光信号值分布散点图
图6为蛋白GroEL与各血清组中血清反应荧光信号值分布散点图
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例中所用的黑龙江立克次体(Rickettsia heilongjiangensis)均为黑龙江立克次体054型株:在文献“Changsong Duan,Yanfen Meng,Xile Wang,Xiaolu Xiong,and BohaiWen.2011.Exploratory Study on Pathogenesis of Far-Eastern Spotted Fever.Am.J.Trop.Med.Hyg.,85(3),2011,pp.504–509.”中公开过,公众可在法律及军队相关规定允许的范围内从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得。
实施例中所用的立氏立克次体(Rickettsia rickettsii)均为立氏立克次体sheila smith型株:在文献“Ellison DW,Clark TR,Sturdevant DE,Virtaneva K,Porcella SF,et al.(2007)Genomic Comparisonof Virulent Rickettsia rickettsii Sheila Smith andAvirulent Rickettsia rickettsii Iowa.Infection and immunity76:542-550.”中公开过,公众可在法律及军队相关规定允许的范围内从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得。
实施例中所用的普氏立克次体(Rickettsia prowazekii)均为普氏立克次体Madrid E型株:在文献“J.-Z.Zhang,J.-F.Hao,D.H.Walker,X.-J.Yu.(2006)A mutationinactivating the methyltransferase gene in avirulent Madrid E strain of Rickettsiaprowazekii reverted to wild type in the virulent revertant strain Evir,Vaccine24:2317–2323.”中公开过,公众可在法律及军队相关规定允许的范围内从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得。
实施例中所用的Q热病原体(贝氏柯克斯体)(Coxiella burnetii)均为贝氏柯克斯体Xinqiao I相株:在文献“Xiong X,Wang X,Wen B,Graves S,Stenos J(2012)Potentialserodiagnostic markers for Q fever identified in Coxiella burnetii by immunoproteomicand protein microarray approaches.BMC Microbiol12:35.”中公开过,公众可在法律及军队相关规定允许的范围内从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得。
实施例中所用的恙虫病东方体(Orientia tsutsugamushi)均为恙虫病东方体Karp型株:在文献“余跃飞,温博海,牛东升等.恙虫病东方体Karp株47kDa蛋白成熟肽的克隆与表达[J].汕头大学医学院学报,2003,16(3):132-134.”中公开过,公众可在法律及军队相关规定允许的范围内从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得。
实施例中所用立氏立克次体(Rickettsia rickettsii)、普氏立克次体(Rickettsiaprowazekii)、Q热病原体(或贝氏柯克斯体)(Coxiella burnetii)、恙虫病东方体(Orientiatsutsugamushi)感染小鼠血清均为中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所保存。公众可在法律及军队相关规定允许的范围内从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得。
实施例1、5种抗原蛋白的制备
载体pET-32a(+)购自Novagen公司,产品目录号为69015
载体pQE-30购自Qiagen公司,产品目录号为33203。
大肠杆菌M15购自Novagen公司,产品目录号为34210。
大肠杆菌BL21(DE3)购自Novagen公司,产品目录号为69450。
一、5种抗原蛋白的蛋白序列及编码基因序列
5种抗原蛋白的蛋白的氨基酸序列及编码基因的核苷酸序列如表1所示。
表1为蛋白及基因序列
蛋白名称 | 蛋白序列 | 基因名称 | 编码基因序列 |
RplA | 序列1 | rplA | 序列6 |
RplY | 序列2 | rplY | 序列7 |
OmpA | 序列3 | ompA | 序列8 |
OmpB | 序列4 | ompB | 序列9 |
GroEL | 序列5 | groEL | 序列10 |
二、5种抗原蛋白的制备
1、蛋白OmpA的制备
蛋白OmpA为将蛋白OmpA的基因ompA(序列8)构建到出发载体pQE-30的SphI和SalI酶切位点间,得到重组载体;再将重组载体转入出发菌大肠杆菌M15中,得到重组菌;利用重组菌表达、纯化出OmpA蛋白溶液;具体步骤如下:
1)蛋白OmpA的基因ompA扩增
以黑龙江立克次体054株(Rickettsia heilongjiangensis)的基因组DNA为模板,用ompA基因的引物(见表2)进行PCR扩增,得到1451bpPCR扩增产物;PCR扩增的通用条件:94℃预变性5min,95℃30sec、55℃30sec、72℃1.5min,循环35次,72℃延伸7min。
2)重组载体的构建
用限制性内切酶SphI和SalI双酶切PCR扩增产物,回收目的基因片段;用限制性内切酶SphI和SalI双酶切出发载体pQE-30,回收1441bp载体大片段;将目的基因片段和载体大片段连接,得到重组载体。
表2为引物序列
3)重组菌的制备
将上述2)得到的重组载体转入出发菌大肠杆菌M15中,得到重组菌。验证:将重组菌接入含有氨苄青霉素抗性(Amp+)和卡那霉素抗性(Karn+)的固体LB平板培养基中,抗性筛选,挑取单性克隆;将单克隆接入LB液体培养基中,培养,提取质粒,进行测序,结果该质粒为在载体pET-32a(+)的SphI和SalI酶切位点间插入序列表中序列8所示的ompA基因,表明构建的载体正确。含有该质粒的重组菌为阳性重组菌。
4)蛋白诱导表达
将3)得到的阳性重组菌接入氨苄青霉素抗性(Amp+)和卡那霉素抗性(Karn+)的LB液体培养基中,37℃震摇过夜,次日按1:100接种新鲜氨苄青霉素抗性(Amp+)和卡那霉素抗性(Karn+)的LB液体培养基,37℃震摇至OD600=0.4,加入诱导剂IPTG,浓度为0.4mM,于37℃继续震摇4小时,得到发酵液。
5)蛋白纯化
取4)得到的发酵液100ml,8000rpm/min离心5min,集菌,弃上清。用30ml裂解缓冲液重悬菌体,以25%振幅超声破碎(超3s,停9s)1小时。取出超声裂解物,以12000rpm离心20min,弃掉沉淀,收集上清液。向上清液中加入10ml回收缓冲液后混匀,1h后以12000rpm离心20min,弃掉沉淀,收集上清液。将上清液与2ml Ni-NTA混合,室温(25℃)200rpm振荡混匀4h,使目的蛋白与Ni-NTA完全结合。吸掉上清,依次加入含6M~0M(6M、5M、4M、3M、2M、1M、0M)尿素的复性缓冲液逐级复性;每次加入复性缓冲液后混匀,室温静置作用4h。待加入含0M尿素的复性缓冲液作用4h后,倒入纯化空柱中,加入10ml洗涤缓冲液洗涤,并控制流速为3ml/min。待液体流净,加入洗脱缓冲液,共洗脱4次,每次0.5ml,将每次收集的洗脱液合并,即得到OmpA蛋白溶液。
每1升裂解缓冲液按照如下方法制备:将NaH2PO4·H2O、NaCl、咪唑和水混合,NaH2PO4·H2O终浓度为50mmol/L、NaCl终浓度为300mmol/L、咪唑终浓度为10mmol/L,用NaOH调节pH至8.0,用水定容至1L,得到裂解缓冲液。
0.1mol/L Tris-Cl缓冲液母液按照如下方法配制:将12.11gTris、800mL ddH2O和49mLHCl混合,滴加浓盐酸调pH至8.0,用ddH2O定容至1000mL,得到0.1mol/L Tris-Cl缓冲液。10mmol/L Tri s-Cl缓冲液和20mmol/L Tri s-Cl缓冲液均可稀释母液获得。
每1升回收缓冲液按照如下方法制备:将NaH2PO4·H2O、0.1LTris-Cl缓冲液母液(终浓度为10mmol/L的Tris)、尿素和水混合,NaH2PO4·H2O终浓度为100mmol/L、尿素终浓度为8mol/L,用NaOH调节pH至8.0,用水定容至1L,得到回收缓冲液。
复性缓冲液制备:每1升含6M尿素复性缓冲液按照如下方法制备:将NaCl、0.2L Tris-Cl缓冲液母液(终浓度为20mmol/L的Tris)、尿素、0.2L甘油和水混合,NaCl终浓度为500mmol/L、尿素终浓度为6mol/L,调节pH至7.4,用水定容至1升,得到含6M尿素复性缓冲液。
每1升无尿素复性缓冲液按照如下方法制备:将NaCl、0.2L Tris-Cl缓冲液、0.2L甘油和水混合,NaCl终浓度为500mmol/L,调节pH至7.4,用水定容至1升,得到无尿素复性缓冲液。5M-1M尿素复性缓冲液由6M尿素复性缓冲液和无尿素复性缓冲液不同体积配比得到。
每1升洗涤缓冲液组成:将NaH2PO4·H2O、NaCl、咪唑和水混合,NaH2PO4·H2O终浓度为50mmol/L、NaCl终浓度为300mmol/L、咪唑终浓度为20mmol/L,用NaOH调节pH至8.0,用水定容至1L,得到洗涤缓冲液。
每1升洗脱缓冲液组成:将NaH2PO4·H2O、NaCl、咪唑、0.3L甘油和水混合,NaH2PO4·H2O终浓度为50mmol/L、NaCl终浓度为300mmol/L、咪唑终浓度为250mmol/L,用NaOH调节pH至8.0,用水定容至1L,得到洗脱缓冲液。
每1升LB液体培养基组成:将10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10g氯化钠和水混合,用水定容至1L,得到LB液体培养基。
2、蛋白RplA、RplY、OmpB、GroEL的制备
蛋白RplA为将蛋白RplA的基因rplA(序列6)构建到出发载体pET-32a(+)的BamHI和XhoI酶切位点间,得到重组载体;再将重组载体转入出发菌大肠杆菌BL21(DE3)中,得到重组菌;利用重组菌表达、纯化出RplA蛋白溶液;
蛋白RplY为将蛋白RplY的基因rplY(序列7)构建到出发载体pET-32a(+)的BamHI和XhoI酶切位点间,得到重组载体;再将重组载体转入出发菌大肠杆菌BL21(DE3)中,得到重组菌;利用重组菌表达、纯化出RplY蛋白溶液;
蛋白OmpB为将蛋白OmpB的基因ompB(序列9)构建到出发载体pQE-30的SphI和SalI酶切位点间,得到重组载体;再将重组载体转入出发菌大肠杆菌M15中,得到重组菌;利用重组菌表达、纯化出OmpB蛋白溶液;
蛋白GroEL为将蛋白GroEL的基因groEL(序列10)构建到出发载体pQE-30的SphI和SalI酶切位点间,得到重组载体;再将重组载体转入出发菌大肠杆菌M15中,得到重组菌;利用重组菌表达、纯化出GroEL蛋白溶液;
上述制备各蛋白的具体步骤与步骤1的蛋白OmpA的制备方法基本相同,不同的是:引物、出发载体、限制性内切酶、出发菌株、重组菌抗性筛选方式不同;制备各蛋白所需要的引物、出发载体和限制性内切酶均见表2所示;
当所用出发载体为pET-32a(+)时,用的出发菌株为BL21(DE3),对应的抗性筛选采用氨苄青霉素抗性(Amp+);
当所用出发载体为pQE30时,用的出发菌株为M15,对应的抗性筛选采用氨苄青霉素(Amp+)和卡那霉素(Kan+)双抗性。
将得到的5种蛋白溶液进行电泳检测,结果如图1所示,蛋白的分子量大小为:RplA:24+17=41KD;RplY:21+17=38KD;OmpA:48KD;OmpB:68KD;GroEL:54KD;与预期一致,pET-32a载体表达的蛋白带有17KD的标签蛋白,所以RplA及RplY蛋白大小分别增加了17KD。
同时以转入空载体pQE-30的M15作为对照重组菌1;转入空载体pET-32a(+)的BL21(DE3)作为对照重组菌2;采用同样的方法发酵对照重组菌1和对照重组菌2,均没有得到目的蛋白。
综合以上结果,表明制备的目的蛋白RplA、RplY、OmpA、OmpB和GroEL正确。
实施例2、蛋白芯片及其制备
1、蛋白芯片的结构
蛋白芯片的结构:由醛基化玻片基底、检测点、阳性质控点和阴性质控点组成,检测点、阳性质控点和阴性质控点均点制在基底上。每种检测点、阳性质控点和阴性质控点均有5个重复。检测点、阳性质控点和阴性质控点在基底上呈矩阵式排列。
检测点分为5种:由蛋白RplA点制而成、由蛋白RplY点制而成、由蛋白OmpA点制而成、由蛋白OmpB点制而成、由蛋白GroEL点制而成;上述蛋白均以蛋白溶液形式点制。
阳性质控点(2个阳性质控点)由鼠源IgG(购自中科晨宇(北京)生物科技中心,产品目录号为161022)和人源IgG(购自中科晨宇(北京)生物科技中心,产品目录号为161001)点制而成;上述鼠源IgG和人源IgG均以溶液形式点制。
阴性质控点为由转入空载体pET-32a(+)的BL21(DE3)的细胞裂解液点制而成。
转入空载体pET-32a(+)的BL21(DE3)的细胞裂解液按照如下方法制备:将转入空载体pET-32a(+)的BL21(DE3)接入氨苄青霉素抗性(Amp+)的LB液体培养基中,37℃震摇过夜,次日按1:100接种新鲜氨苄青霉素抗性(Amp+)的LB液体培养基,37℃震摇至OD600=0.4,加入诱导剂IPTG,浓度为0.4mM,于37℃继续震摇4小时,得到发酵液。取诱导表达的发酵液100ml,8000rpm/min离心5min,集菌,弃上清液。用30ml裂解缓冲液重悬菌体,以25%振幅超声破碎(超3s,停9s)1小时,得到转入pET-32a(+)的BL21(DE3)的细胞裂解液。
每1升裂解缓冲液按照如下方法制备:将NaH2PO4·H2O、NaCl、咪唑和水混合,NaH2PO4·H2O终浓度为50mmol/L、NaCl终浓度为300mmol/L、咪唑终浓度为10mmol/L,用NaOH调节pH至8.0,用水定容至1L,得到裂解缓冲液。2、蛋白芯片的制备
每1升磷酸盐缓冲液(PBS)按照如下方法制备:将8g NaCl、0.2g KCl、3.53gNa2HPO4·12H2O、0.24g KH2PO4和水混合,用水定容至1升,得到的溶液的pH值为7.4,即得到PBS缓冲液。
鼠源IgG溶液的配制:将鼠源IgG溶于PBS缓冲液中,使鼠源IgG的浓度为300μg/ml,得到鼠源IgG溶液。
人源IgG溶液的配制:将人源IgG溶于PBS缓冲液中,使人源IgG的浓度为300μg/ml,得到人源IgG溶液。
蛋白芯片的制备:将实施例2得到5种蛋白溶液:RplA蛋白溶液、RplY蛋白溶液、OmpA蛋白溶液、OmpB蛋白溶液和GroEL蛋白溶液浓度均调整至300μg/ml,分别取蛋白溶液15μl至384孔板,用Ⅱ点样仪将蛋白点制在醛基化玻片上形成一个蛋白检测点,每个蛋白样品重复5次。以300μg/ml的鼠源IgG溶液和300μg/ml人源IgG溶液作为2个阳性质控,并作为矩阵的位置标识点。以转入空载体pET-32a(+)的BL21(DE3)的细胞裂解液作为阴性质控。点制完成后,在室温(25℃)放置1h,在4℃保存备用,得到蛋白芯片。
以上点制样品或对照均使用15μl溶液移至384孔板中,利用Ⅱ点样仪的圆形点样针点制到醛基化芯片上,每15μl蛋白样品(含约0.45μg蛋白样品)或对照(阳性对照与阴性对照)可点制80张×5=400个检测点,每个检测点蛋白量约为1ng。
实施例3、抗原蛋白及蛋白芯片在诊断远东斑点热中的应用
Cy5标记的羊抗鼠IgG购自美国KPL公司产品,产品目录号为072-02-18-06。
FITC标记的山羊抗小鼠IgG购自碧云天生物技术研究所,产品目录号A0568。
黑龙江立克次体抗原片、普氏立克次体抗原片、立氏立克次体抗原片、贝氏柯克斯体I相抗原片、恙虫病东方体抗原片;上述抗原片均按照如下方法制备:用灭活后的对应菌体涂在载玻片上,再通过丙酮固定15min即可。
每1升磷酸盐缓冲液(PBS)按照如下方法制备:将8g NaCl、0.2g KCl、3.53gNa2HPO4·12H2O、0.24g KH2PO4和水混合,用水定容至1升,得到的溶液的pH值为7.4,即得到PBS缓冲液。
每1升PBST缓冲液按照如下方法制备:将磷酸盐缓冲液(PBS)与Tween-20混合,磷酸盐缓冲液(PBS)与Tween-20的配比为1升:1ml,得到PBST缓冲液。
小鼠为6周龄雄性C3H/HeN小鼠,购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
一、诊断鼠的远东斑点热准确性鉴定
(一)诊断试剂盒组成:
由实施例2制备得到的蛋白芯片、Cy5标记的羊抗鼠IgG、封闭液和漂洗液组成。
封闭液:将BSA溶于PBS缓冲液中,牛血清白蛋白(BSA)与PBS缓冲液的配比为1g:100ml,得到的溶液即为封闭液;
漂洗液:PBST缓冲液。
(二)诊断应用
感染小鼠血清的制备:用黑龙江立克次体054株感染22只C3H/HeN小鼠(六周龄小鼠,重量为200±20g每只),每只小鼠腹腔注射2×107个菌体,于感染第4周取血,收集血清用于检测。以20只正常C3H/HeN小鼠的血清为对照。
取感染小鼠及正常小鼠血清,首先分别与转入空载体pET-32a(+)的BL21(DE3)的细胞裂解液在室温(25℃)共孵育2h,以15000×g离心10min,取上清液,为中和后的感染小鼠血清或中和后的正常小鼠血清。
将实施例2制备得到的蛋白芯片滴加封闭液,室温(25℃)封闭1h,然后加入1:100稀释的中和后血清50ul/孔,室温(25℃)作用1h。PBST缓冲液漂洗5次后加入1:500稀释的Cy5标记的羊抗鼠IgG,室温(25℃)作用1h,PBST缓冲液漂洗5次后再用去离子水漂洗后避光晾干,用芯片扫描仪进行扫描。扫描结果通过GenePix Pro6.0软件进行图像处理与数据分析,以样品荧光平均值减去背景荧光平均值作为每个检测点(蛋白点)的反应荧光值,每种蛋白所有重复点的反应荧光值的平均值作为该种蛋白的荧光信号值。计算正常小鼠血清样本与每种蛋白点的反应荧光值的平均值(即荧光信号值)和标准差(SD)。设定正常小鼠血清蛋白点对应的荧光信号平均值与3倍SD之和为cut-off值,感染小鼠血清蛋白点对应的荧光信号值大于正常小鼠血清蛋白点对应的荧光信号平均值与3倍SD之和,则认为此蛋白为阳性(见表3及图2-图6)。5种蛋白中60%以上(含60%)蛋白(或者至少3种蛋白为阳性)显示阳性时,诊断确定检测小鼠样本为或候选为远东斑点热病样本。
22只感染黑龙江立克次体054株的小鼠血清的结果见表4,可以看出,其中21份黑龙江立克次体感染血清样本与60%以上蛋白反应显示为阳性,确诊率达到21/22×100%=95.5%。
20份正常小鼠血清中有一份与OmpA反应阳性,但与60%以上蛋白反应阳性数为0,全部确诊为非感染血清,具体结果如表3所示。
因而诊断准确率(真阳性样品数21+真阴性样品数20/总样品数42)可达97.6%。
蛋白芯片的质控:为检测蛋白芯片的点样效果,将点制好的蛋白芯片与鼠抗His标签(1抗)的抗体反应稀释比例(1:100),具体过程如同蛋白芯片与小鼠血清反应。由于重组蛋白均含有his标签,均能与鼠抗His标签抗体反应,再加入Cy5标记的羊抗鼠IgG,即可显示荧光。
常规血清方法检测远东斑点热病通常利用间接免疫荧光(IFA)的方法测定血清中黑龙江立克次体抗体效价,血清效价高于64即确诊为远东斑点热。具体步骤为:所测血清利用PBS缓冲液倍比稀释2倍,4倍,8倍,……,32倍,64倍,100倍,200倍,……,1600倍,3200倍。取20μl未稀释血清(0倍稀释)及稀释后的血清与黑龙江立克次体抗原片37摄氏度孵育45分钟后,PBS缓冲液漂洗抗原片3次,每次5分钟。晾干后,取20μl利用PBS缓冲液200倍稀释的FITC标记山羊抗小鼠IgG滴加在抗原片上,37摄氏度孵育45分钟。经PBS缓冲液漂洗3次,每次5分钟,晾干后利用荧光显微镜观察。取在荧光显微镜下能观测到黑龙江立克次体菌体的血清最大稀释倍数作为血清效价。20份正常血清效价及22份黑龙江立克次体感染血清效价分别见表3、表4所示。结果表明20份正常血清效价均为0,即20份正常血清未患远东斑点热;22份感染黑龙江立克次体小鼠血清效价均高于64,即22份感染血清均患有远东斑点热。
表3为20份正常血清与蛋白芯片反应荧光信号平均值
表4为22份黑龙江立克次体感染小鼠血清与蛋白芯片反应荧光信号平均值
二、蛋白芯片的特异性鉴定
(一)诊断试剂盒组成:
诊断试剂盒与实验一中所述相同。
(二)诊断应用
检测方法与实验一中所述基本相同,不同的是检测样本不同。检测样本为9份立氏立克次体感染小鼠血清,29份普氏立克次体感染小鼠血清,29份Q热感染小鼠血清,15份恙虫病感染小鼠血清。结果如表5-表8及图2-图6所示:
共检测9份立氏立克次体感染小鼠血清样本,结果均判定为阴性,如表5,因而所述蛋白芯片在检测黑龙江立克次体与立氏立克次体感染小鼠血清样本的特异性(特异性=真阴性数9/(真阴性数9+假阳性数0)=100%。
共检测29份普氏立克次体感染小鼠血清样本,结果均判定为阴性,如表6,因而所述蛋白芯片在检测黑龙江立克次体与普氏立克次体感染小鼠血清样本的特异性为100%。
共检测29份Q热感染小鼠血清样本,结果均判定为阴性,如表7,因而所述蛋白芯片在检测黑龙江立克次体与Q热感染小鼠血清样本的特异性为100%。
共检测15份恙虫病感染小鼠血清样本,结果其中14份判定为阴性,1份判定为阳性,如表8,因而所述蛋白芯片在检测黑龙江立克次体与恙虫病感染小鼠血清样本的特异性为93.3%。
常规血清方法检测感染后的小鼠相关立克次体病(立氏立克次体引起的落基山斑点热,普氏立克次体引起的流行性斑疹伤寒,贝氏柯克斯体引起的Q热,恙虫病东方体体引起的恙虫病),利用间接免疫荧光的方法测定血清中相关立克次体(立氏立克次体,普氏立克次体,贝氏柯克斯体以及恙虫病东方体)抗体效价,血清效价高于64即确诊为相关立克次体病(立氏立克次体引起的落基山斑点热,普氏立克次体引起的流行性斑疹伤寒,贝氏柯克斯体引起的Q热,恙虫病东方体体引起的恙虫病)。具体步骤同上述测定黑龙江立克次体感染小鼠血清效价方法,唯一不同的是所使用抗原片为相关立克次体病原体抗原片(立氏立克次体抗原片、普氏立克次体抗原片、贝氏柯克斯体抗原I相抗原片、恙虫病东方体抗原片)。血清效价测定结果如表5-表8所示。结果表明立克次体感染小鼠血清效价均高于64(贝氏柯克斯体感染小鼠血清I相抗原抗体效价均高于64),可以确认感染小鼠均患相关立克次体病(9只小鼠患立氏立克次体引起的落基山斑点热,29只小鼠患普氏立克次体引起的流行性斑疹伤寒,29只小鼠患贝氏柯克斯体引起的Q热,15只小鼠恙虫病东方体体引起的恙虫病)。
综合以上黑龙江立克次体感染小鼠血清22份、立氏立克次体感染小鼠血清9份、普氏立克次体感染小鼠血清29份、Q热感染小鼠血清29份、恙虫病感染小鼠血清15份、正常小鼠血清20份,所述蛋白芯片在检测黑龙江立克次体的准确性为(21+20+9+29+29+14)/(22+20+9+29+29+15)×100%=98.4%,特异性为(20+9+29+29+14)/(20+9+29+29+15)×100%=99.0%。结果表明,该芯片检测结果是准确和特异的。
表5为9份立氏立克次体感染小鼠血清与蛋白芯片反应荧光信号平均值
表6为29份普氏立克次体感染小鼠血清与蛋白芯片反应荧光信号平均值
表7为29份Q热感染小鼠血清与蛋白芯片反应荧光信号平均值
表8为15份恙虫病感染小鼠血清与蛋白芯片反应荧光信号平均值
Claims (10)
1.一种具有如下1)或2)功能的蛋白组合物,由如下5种蛋白组成:RplA蛋白、RplY蛋白、OmpA蛋白、OmpB蛋白和GroEL蛋白;
1)用于诊断或辅助诊断远东斑点热病;
2)用于检测或辅助检测黑龙江立克次体(Rickettsia heilongjiangensis)感染样本;
所述RplA蛋白为序列表中序列1的氨基酸残基组成的蛋白质;
所述RplY蛋白为序列表中序列2的氨基酸残基组成的蛋白质;
所述OmpA蛋白为序列表中序列3的氨基酸残基组成的蛋白质;
所述OmpB蛋白为序列表中序列4的氨基酸残基组成的蛋白质;
所述GroEL蛋白为序列表中序列5的氨基酸残基组成的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的蛋白组合物,其特征在于:所述远东斑点热病是由黑龙江立克次体(Rickettsia heilongjiangensis)引起的蜱传远东斑点热(Far-eastern tick-bornespotted fever)。
3.含有权利要求1或2所述蛋白组合物的蛋白芯片。
4.一种制备权利要求3所述蛋白芯片的方法,包括如下步骤:将权利要求1或2所述的蛋白组合物中的5种蛋白作为5种检测点与阳性质控点和阴性质控点一起点制在基底上,得到蛋白芯片。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于:所述蛋白以蛋白溶液的形式点制在基底上。
6.一种具有如下1)或2)功能的试剂盒,包括权利要求1或2所述的蛋白组合物或权利要求3所述的蛋白芯片;
1)用于诊断或辅助诊断远东斑点热病;
2)用于检测或辅助检测黑龙江立克次体(Rickettsia heilongjiangensis)感染样本。
7.根据权利要求6所述的试剂盒,其特征在于:所述试剂盒还包括荧光素标记的二抗、封闭液和漂洗液;
所述试剂盒为如下1)或2):
1)所述的试剂盒由权利要求1或2所述的蛋白组合物、所述封闭液、所述漂洗液和所述荧光素标记的二抗组成;
2)所述的试剂盒由权利要求3或4所述的蛋白芯片、所述封闭液、所述漂洗液和所述荧光素标记的二抗组成。
8.根据权利要求6或7所述的试剂盒,其特征在于:
所述远东斑点热病是由黑龙江立克次体(Rickettsia heilongjiangensis)引起的蜱传远东斑点热(Far-eastern tick-borne spotted fever)。
9.权利要求1或2所述的蛋白组合物在制备具有如下1)或2)功能的产品中的应用;
或权利要求3所述的蛋白芯片在制备具有如下1)或2)功能的产品中的应用;
1)用于诊断或辅助诊断远东斑点热病;
2)用于检测或辅助检测黑龙江立克次体(Rickettsia heilongjiangensis)感染样本。
10.根据权利要求9所述的应用,其特征在于:所述远东斑点热病是由黑龙江立克次体(Rickettsia heilongjiangensis)引起的蜱传远东斑点热(Far-eastern tick-bornespotted fever)。
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