KR20050038856A - 지알오이엘 유전자를 이용한 리케챠의 동정방법 - Google Patents

지알오이엘 유전자를 이용한 리케챠의 동정방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 리케챠 균의 동정 및 검출 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 세균의 groEL 유전자의 염기서열을 비교하여 리케챠 균종을 동정 및 검출하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 기존 16S rRNA, gltA, 또는 ompA 유전자 비교 분석을 이용한 방법보다 빠르고 간편하게 리케챠 균을 검출할 수 있다.

Description

지알오이엘 유전자를 이용한 리케챠의 동정방법 {Method for Identificating Rickettsia Using groEL Gene}
본 발명은 리케챠(Rickettsia) 균의 동정 및 검출 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 세균의 groEL 유전자의 염기서열을 비교하여 리케챠 균종을 동정 및 검출하는 방법에 관한 것이다.
리케챠는 이, 벼룩, 진드기(louse, mite, tick) 등의 절지동물(Arthropod)에서 살고 있다가 우발적으로 사람에게 전파되어 리케챠 질환을 일으킨다. 리케챠 질환은 작은 동맥, 정맥, 모세혈관의 내피세포(endothelial cell)에서 증식하면서 혈관염을 일으킨다. 증상은 열이 나고 두통이 있으며 특징적인 피부발진을 동반한다.
리케챠는 크게 세 가지 군으로 나누어지는데, 유행성 발진티푸스(epidemic typus)를 일으키는 R. prowazekii, 뮤린 티푸스(murine typus: 발진열)를 일으키는 R. typhi가 포함된 티푸스 그룹(TG), 약 20개의 균종이 포함된 반점열 그룹(Spotted fever group: SFG) 및 쭈쭈가무시병을 일으키는 Orientia tsutsugamushi가 포함된 스크럽 티푸스 그룹(Scrub typhus group: STG)이다. Rickettsia는 6개의 질환이 지난 12년 동안 발생했을 정도로 지금도 새로운 질환 (균종)이 발생되고 있다.
그러나 Rickettsia 균들에 의한 리케치아증과 Orientia tsutsugamushi가 포함된 스크럽 티푸스 그룹(Scrub typhus group)에 의해 일어나는 쯔쯔가무시병은 감염시 유사한 임상증상을 나타내 임상적으로 감별하기는 매우 힘들다. 이들의 치료를 위하여는 Rickettsia와 Orientia tsutsugamushi 감별하는 것이 절대적으로 필요하다. 원인균이 어떤 균군에 속하는지 확인되면 치료제의 선택을 달리해야 하므로, 초기 대응책으로 Rickettsia의 존재여부를 탐지하는 것과 더불어 원인균이 Rickettsia 인지, Orientia tsutsugamushi 인지를 빨리 감별하는 것이 필수적인 것이다.
우리나라에서는 현재 리케챠 질환 중, 쭈쭈가무시병, 발진열, 발진티푸스만 보고되고 있다. 발진티푸스는 R. prowazekii에 의해 발생되는 질환으로 해방직후까지 큰 유행이 있었고, 1952년 이후에는 유행적 발생은 없었다. 발진열은 1959년에 처음으로 보고되었고, 1962년, 1986년에도 보고가 있었다. 이후 열성환자의 혈청검사에서 양성자가 있으나 환자인지 교차반응인지 아직 확실하지 않다. 쭈쭈가무시병은 O. tsutsugamushi에 의해 일어나는 질환으로, 한국, 일본, 중국 등을 포함한 동남아시아 전역에서 발생하고 있다. 우리나라에서는 1951년 처음 보고 된 이래, 우리나라 전역에서 발생하고 있으며 9월과 11월 사이에 발생하고 있다. 특히, 우리나라 가을에 발생하는 환자의 30%가 쭈쭈가무시 병으로 진단될 만큼 많은 환자가 발생되고 있다.
본 발명자들에 의하여 1990년부터 1994년 사이에 수집한 5,803개의 급성 열성질환 환자의 혈청으로 O. tsutsugamushi 외의 8가지 리케챠과에 속하는 균들의 항체보유율 조사 결과 균종에 따라 11.1% (R. typhi)에서 6.3% (R. japonica)의 높은 항체 양성율을 보였다. 특히, O. tsutsugamush 양성 혈청 중 19.6%의 혈청에서 발진열 그룹에 속하는 리케챠와 교차반응을 보였다. 이는 그동안 발진열 그룹의 리케챠가 일부 쭈쭈가무시병으로 잘못 진단되었을 가능성을 보여주고 있다. 이는 국내 발생보고가 없었던 여러 리케챠 질환이 우리나라에도 있을 가능성이 높음을 보여주는 결과이다.
이러한 Rickettsia 진단에는 혈청학적 진단이 가장 많이 쓰인다. 리케챠가 프로테우스(Proteus) 균주와 공통항원을 가지는 것을 이용한 Weil-Felix법은 검사의 특이도나 민감도가 떨어져 최근에는 사용하지 않고, 면역형광항체법, 면역효소법이 가장 흔히 사용되고 있다. 그러나 이 방법 또한 다른 박테리아와의 교차 반응으로 위양성 반응이 많고, 발진열(spotted fever) 그룹의 리케챠 균종을 구분할 수 없는 단점이 있다. 웨스턴 블럿 면역분석법은 발진열 그룹의 리케챠 균종 구분에 유용하나, 리케챠 균주의 배양이 쉽지 않아, 검사에 시간이 많이 걸리는 단점이 있다.
동정에 있어서도 리케챠는 세포내에서 증식하므로 전통적인 동정법을 사용할 수 없다. 따라서, 16S rRNA 염기서열을 이용하는 방법을 많이 사용하지만, 이 방법은 염기서열이 너무 유사해, 균종 구분은 되지만 같은 균종 내 구분에는 적합하지 않다.
대안으로, citrate synthase(gltA)와 rOmpA(ompA)를 코딩하는 유전자의 염기서열을 이용하는 방법들을 많이 사용하고 있다. 하지만 ompA 유전자의 염기서열을 이용하는 방법은 동정에 아주 유용하기는 하나, R. akari, R. australis, R. helvetica, R. bellii, R. canada, R. typhi, R. prowazekii의 동정에는 사용할 수 없다.
따라서 상기 7 가지 균종은 gltA 유전자의 염기서열을 이용하는 방법을 따로 사용해야 하는 번거로움이 있었다. 또한 STG 균주들에게는 gltA와 ompA 유전자가 없어 TG 균주와 SFG 균주들과 구분할 수 없다는 문제점이 있다.
이에 본 발명자들은 기존의 리케챠(Rickettsia) 동정법의 단점을 보완할 수 있는 새로운 유전학적 분류·동정법을 개발하고자 노력한 결과, GroEL 단백질이 샤페론(chaperone)으로써 모든 생물체에서 보존되어 있고, 세포 및 박테리아의 생존에 절대 필요하며, 특히 스트레스에 저항하는 단백질로 알려져 있어 리케챠 균주들의 진화를 잘 반영할 수 있는 점에 착안하여, groEL 유전자 염기서열을 이용해서 리케챠(Rickettsia) 균주들을 빠르게 동정할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 세균의 groEL 유전자 염기서열을 이용하여 리케챠(Rickettsia) 균주들을 동정하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 리케챠(Rickettsia) 균의 groEL 유전자 염기서열 중 일부를 포함하는 프라이머를 이용하는 것을 특징으로 하는 리케챠(Rickettsia) 균의 검출방법을 제공하는데 있다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 세균의 groEL 유전자 서열을 비교하는 것을 특징으로 하는 리케챠(Rickettsia) 균의 동정방법을 제공한다.
상기 groEL 유전자는 서열 1과 서열 2의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭된 DNA인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, 리케챠 (Rickettsia) 균의 groEL 유전자 서열을 비교하는 것을 특징으로 하는 리케챠(Rickettsia) 균의 분류방법을 제공한다.
상기 groEL 유전자는 서열 1과 서열 2의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭된 DNA인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, 리케챠(Rickettsia) 균의 groEL 유전자 서열에서 유래된 것을 특징으로 하는 리케챠(Rickettsia) 균 검출용 프라이머 쌍을 제공한다.
상기 프라이머 쌍은 서열 1 및 서열 2의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, (a) 리케챠(Rickettsia) 균 감염 의심 환자 유래의 임상 샘플에서 추출된 DNA를 상기의 프라이머 쌍을 이용한 PCR을 통하여 증폭하는 단계; 및 (b) 리케챠 표준균주의 groEL 유전자와 상기 증폭된 DNA 간의 상동성을 비교·분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 리케챠(Rickettsia) 균의 검출방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 리케챠(Rickettsia) 균 감염 의심 환자 유래의 임상 샘플에서 추출된 DNA를 상기의 프라이머 쌍을 이용한 PCR을 통하여 증폭하는 단계; 및 (b) 리케챠 표준균주의 groEL 유전자와 상기 증폭된 DNA 간의 상동성을 비교·분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 리케챠 감염증의 진단방법을 제공한다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
특히, 하기 실시예에서는 리케챠의 분류· 동정 방법 만을 예시하였으나, 본 발명의 groEL 유전자 서열을 포함하는 프라이머를 이용하여 리케챠 균주를 검출하는 방법 및 리케챠 균의 감염여부 확인을 통하여 리케챠 감염증의 진단방법은 당업자에게 있어 자명하다 할 것이다.
실시예 1. 균배양 및 게놈 DNA 분리
본 발명에 사용된 리케챠 균주의 목록을 표 1에 나타내었다.
본 실험에서 사용한 외국 참조 균주와 국내 분리 균주
종 Strain 분리처 위 치 입수처 GenBank Acession No.
groEL 16S rDNA
O.tsutsuga mushi Karp 사람 뉴기 니아 ATCC VR-150 M31887 D38623
Kato 사람 일본 ATCC VR-609 AY191586 D38624
Kawasaki 사람 일본 National Institute of InfectionDiseases, Japan AY191587 D38625
Gilliam 사람 버마 국립보건원 AY191585 D38622
Boryong 사람 한국 국립보건원 AY059015
Yongworl 사람 한국 국립보건원 AY191588
Hwasung 사람 한국 국립보건원 AY191589
R.typhi Wilmington 사람 미국 ATCC VR-148 AY191590 U12463
87-91 혈액(사람) 한국 한림대 의대 AY191591
87-100 혈액(사람) 한국 한림대 의대
R.prowazekii Breinl 사람 폴란드 ATCC VR-142 Y15783 M21789
R.rickettsii R Dermacentor andersonii 미국 Bitterroot U96733 L36217
R.akari MK 혈액(사람) 미국 ATCC VR-148 AY059013 L36099
R.japonica YH 혈액(사람) 일본 ATCC VR-1363 AF432181 L36213
R.conori Indian Tick Typhus Rhipiceohalussanguineus 인도 ATCC VR-597 AY059012 U12460
R.sibirica 246 Dermacentor nuttalli 러시아 ATCC VR-151 AY059014 D38628
SFG 균주(R. rickettsii, R. japonica, R. conorii, R. sibirica, R. akari)와 TG 균주(R. typhi, R. prowazekii)를 ATCC L929 fibroblast 세포 (CRL-2148)에서 4% 우태아혈청(Gibco BRL)과 2mM L-글루타민이 포함된 EMEM(Earle's minimun essential medium : Gibco BRL)배지를 공급하며 배양하였다. SFG 균주는 32℃에서 배양하고 TG 리케챠 균주는 35℃에서 배양하였다. 그 이후에 매 3~4일 마다 배지를 갈아 주며 10~14일간 배양하다가 세포의 70-90% 정도가 감염되었을 때에 세포를 수확하여 -70℃에 보관하였다.
상기 균주로부터 High Pure PCR Template Preparation kit (Roche Diagnostics Co., Indianapolis, Ind)를 이용하여 DNA를 분리하였다.
실시예 2. groEL 유전자 염기서열 결정
실시예 1에서 분리한 DNA를 주형으로 하고, RF 프라이머(서열 1, GenBank Accession No. U96733(R. rickettsii의 groEL유전자)의 650-666 영역)와 RR 프라이머(서열 2, GenBank Accession No. U96733의 1183-1166)를 이용한 PCR을 수행하여 534-546bp의 groEL 유전자를 증폭시켰다.
서열 1: 5'-GTTGAAGTWGTTAAAGG-3'
서열 2: 5'-TTTTTCTTTWTCATAATC-3'
상기 프라이머의 염기서열에서 W는 T 또는 A를 나타낸다.
증폭된 PCR 산물을 1.5% 아가로스 젤에 전기 영동한 후, QIAEXⅡ Gel Extraction Kit (QIAGEN, Hilden, Germany)을 이용하여 용출하였다. DNA 20ng과 pGEM-T 벡터를 42℃에서 5분간 반응시킨 뒤 1㎕ 의 T4 DNA 라이게이즈를 첨가하여 16℃에서 18시간 반응시켰다. 라이게이션 혼합액을 CaCl2 방법으로 대장균 XL1-blue를 이용하여 형질전환한 뒤, 형질전환된 대장균 XL1-blue를 50 ㎕/㎖의 암피실린이 함유된 LB 평판배지에 도말 후, 37℃에서 16 시간 동안 배양하고, 암피실린에 대해 내성이 있는 집락을 채취하여 플라스미드를 분리하였다.
염기서열 분석은 CEQ 2000XL DNA Analysis System과 CEQ 2000 Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Beckman Coulter Inc., Fullerton, U.S.A.)를 이용하였다. 플라스미드 115 ng, 프라이머 10 pmol, 10X 시퀀싱 반응 완충액 2㎕, dNTP 혼합액 1㎕, ddUTP, ddGTP, ddCTP, ddATP 각각 2 ㎕, DNA 폴리머라아제 1 ㎕를 DW와 혼합하여 20 ㎕를 만든 다음, 사이클링 시퀀싱을 수행하였다. 반응은 Perkin Elmer Cetus 9600을 사용하여, 96℃ 20초, 50℃ 20초, 60℃ 4분으로 30 사이클을 시행하였다.
실시예 3. 리케챠 표준균주의 groEL 유전자 유사도 또는 상동성 분석
11개 표준균주 모두 결손이나 첨가 없이 잘 보존되어 있었고, 기존에 같은 종으로 알려진 균주들 간은 매우 높은 유사도를 보여 주고 있다. 즉 SFG 균주에 속하는 균주들 간에는 99.6% 이상의 유사도를 보여주고 있고, TG 균주와 STG 균주에 속하는 균주들은 각각 97.0%이상, 그리고 99.1% 이상의 유사도를 보여주고 있다. 따라서 이 염기서열을 이용하여 종의 구별이 가능함을 알 수 있었다.
또한 리케챠와 리케챠의 outgroup인 Ehrlichia 균주 간에는 75.7-79.4%의 유사도를 보이고 있어 groEL 유전자의 염기서열 비교를 통하여 리케챠 균을다른 균주들과 잘 구분할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 4. groEL 유전자 염기서열의 계통도의 구축
리케챠의 groEL 유전자 염기서열을 DNASTAR 프로그램을 사용하여 클러스트 방법으로 multialignment하고, 각 염기서열을 MEGA 프로그램을 사용하여 Jukes-Cantor distance, UPGMA method로 계통도를 완성하였다.
리케챠 11개 표준균주의 groEL 유전자 염기서열을 바탕으로 계통도를 구성하였다. 리케챠는 outgroup인 Ehrlichia 균주에 대해 하나의 클러스터를 형성하고 있다.
리케챠는 3개의 그룹 (SFG, STG, TG)으로 나뉘어져 있는데, 본 계통도는 전반적으로 리케챠의 계통적 관계를 잘 반영하고 있다. 즉, SFG에 속한 5개 균주(R. rickettsii, R. japonica, R. conorii, R. sibirica, R. akari)와 TG에 속하는 2개 균주 (R. typhi, R. prowazekii)는 STG에 대하여 하나의 클러스터를 형성하고, STG에 속하는 4개 균주 (O. tsutsugamushi Kato, Karp, Kawasakii, Gilliam)는 리케챠 속에 속하는 SFG 균주와 TG 균주에 대하여 하나의 클러스터를 형성하고 있다. 그리고 SFG 균주는 STG 균주와 Ehrlichia 보다 TG 균주에 더 가까움을 보여주고 있다 (도 1). 도 1에서 "-"는 sequence distance를 나타내며, 하나의 "-"는 0.004504이다. 이와 같은 계통도는 groEL 유전자 염기서열을 이용하여 리케챠를 동정할 수 있음을 보여주고 있다.
실시예 5. 국내 분리 균주의 groEL 유전자 계통도
O. tsutusgamushi인 Yongworl과 Hwasung은 STG 균주와 클러스터를 형성하고, R. typhi 인 87-91과 87-100은 R. typhi Wilmington과 클러스터를 형성하고 R. prowazekii Breinl과 가깝게 나타나고 있다 (도 2). 도 2에서 "-"는 sequence distance를 나타내며, 하나의 "-"는 0.004538이다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명은 세균의 groEL 유전자 염기서열을 이용해서 리케챠 균주들을 동정하는 방법을 제공하는 효과가 있으며, 리케챠 균의 groEL 유전자 염기서열을 이용해서 리케챠를 3가지 group으로 분류하는 방법을 제공하는 효과가 있다.
본 발명에 따르면, 기존 16S rRNA, gltA, 또는 ompA 유전자 비교 분석을 이용한 방법보다 빠르고 간편하게 리케챠 균을 검출할 수 있어, 리케챠 균의 감염에 의한 질환을 신속하고 정확하게 진단할 수 있다.
도 1은 외국 표준균주의 groEL 유전자를 기초로 한 리케챠 균의 계통도이다.
도 2는 외국 표준 균주와 국내 분리균주의 groEL 유전자를 기초로 한 리케챠 균의 계통도이다.
<110> KonKuk University <120> Method for Identificating Rickettsia Using groEL Gene <130> KU03-034 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 1 gttgaagtwg ttaaagg 17 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 2 tttttctttw tcataatc 18

Claims (8)

  1. 세균의 groEL 유전자 서열을 비교하는 것을 특징으로 하는 리케챠(Rickettsia) 균의 동정방법.
  2. 제1항에 있어서, groEL 유전자는 서열 1과 서열 2의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭된 DNA인 것을 특징으로 하는 리케챠(Rickettsia) 균의 동정방법.
  3. 리케챠(Rickettsia) 균의 groEL 유전자 서열을 비교하는 것을 특징으로 하는 리케챠(Rickettsia) 균의 분류방법.
  4. 제3항에 있어서, groEL 유전자는 서열 1과 서열 2의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭된 DNA인 것을 특징으로 하는 리케챠(Rickettsia) 균의 분류방법.
  5. 리케챠(Rickettsia) 균의 groEL 유전자 서열에서 유래된 것을 특징으로 하는 리케챠(Rickettsia) 균 검출용 프라이머 쌍.
  6. 제5항에 있어서, 서열 1 및 서열 2의 염기서열을 가지는 프라이머 쌍.
  7. (a) 리케챠(Rickettsia) 균 감염 의심 환자 유래의 임상 샘플에서 추출된 DNA를 제5항 또는 제6항의 프라이머 쌍을 이용한 PCR을 통하여 증폭하는 단계; 및
    (b) 리케챠 표준균주의 groEL 유전자와 상기 증폭된 DNA 간의 상동성을 비교·분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 리케챠(Rickettsia) 균의 검출방법.
  8. (a) 리케챠(Rickettsia) 균 감염 의심 환자 유래의 임상 샘플에서 추출된 DNA를 제5항 또는 제6항의 프라이머 쌍을 이용한 PCR을 통하여 증폭하는 단계; 및
    (b) 리케챠 표준균주의 groEL 유전자와 상기 증폭된 DNA 간의 상동성을 비교·분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 리케챠 감염증의 진단방법.
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