CN103278627B

CN103278627B - 一种检测非洲猪瘟病毒抗体的多抗原elisa试剂盒

Info

Publication number: CN103278627B
Application number: CN201310193976.0A
Authority: CN
Inventors: 张鑫宇; 孙怀昌; 夏晓莉
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2013-05-22
Filing date: 2013-05-22
Publication date: 2015-09-02
Anticipated expiration: 2033-05-22
Also published as: CN103278627A

Abstract

本发明的一种检测非洲猪瘟病毒（ASFV）抗体的多抗原酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒属于生物技术和动物传染病诊断研究领域，包括三种ASFV重组抗原表达与纯化、ASFV抗体阳性和阴性对照血清制备、最佳包被抗原组合及浓度确定、多抗原ELISA（MA-ELISA）反应参数优化、ASFV抗体阴性血清临界值确定以及MA-ELISA检测人工感染和田间血清样品的灵敏性、特异性、可重复性测定。通过大量已知血清样品检测证明，本发明的MA-ELISA检测血清ASFV抗体的灵敏性、特异性和可重复性显著高于世界动物卫生组织推荐的ELISA方法和国外同类试剂盒，可用于ASFV血清学诊断、流行病学调查和生猪进出口检疫检验。

Description

一种检测非洲猪瘟病毒抗体的多抗原ELISA试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术和动物传染病诊断研究领域。

背景技术

非洲猪瘟（ASF）是猪的一种高度致死性传染病，该病一直在许多非洲国家流行，目前已传播到格鲁齐亚、亚美尼亚、阿塞拜疆和俄罗斯等邻国，对我国养猪业的威胁越来越大。目前ASF无疫苗用于防疫，因此快速、准确诊断对防止该病传入及其控制十分重要。世界动物卫生组织（OIE）最近推荐的ASF诊断技术包括病原鉴定和血清学试验。

在病原鉴定技术中，血吸附试验是经典的ASF鉴定方法之一，敏感性较高，但需要临时制备和培养猪骨髓细胞，不仅费时、操作繁琐，而且不能用于非血吸附性毒株的诊断；检测ASFV抗原的荧光抗体试验可用于可疑病猪组织和白细胞样品的检测，不仅适用于非血吸附性毒株的鉴定，而且能与其他病毒感染进行鉴别诊断，但需要制备冰冻切片、技术难度较大，而且仅能在专门的ASF诊断实验室进行；聚合酶链式反应（PCR）和实时定量PCR具有快速、灵敏等优点，还适合腐败样品的病毒检测，已成为ASF诊断技术的发展方向，但需要较昂贵的仪器设备和防污染措施，有时检测结果需用序列测定等方法验证；敏感猪接种试验也是经典的ASF诊断技术之一，但需时较长、成本较高，而且仅能在专门的动物设施内进行，现已不再推荐使用。

在血清学检测技术中，ASFV感染猪在感染后7-10天即可产生特异抗体，并能维持很长时间，所以可用间接免疫荧光和酶联免疫吸附法（ELISA）等方法检测。其中，ELISA是OIE规定的国际贸易检验方法，但检测抗原需从病毒感染细胞制备，病毒培养有导致病毒扩散风险，诊断可靠性也有待提高，结果需用免疫印迹（Western-blotting）等方法验证；为了解决这些问题，国内外都在进行重组抗原ELISA的尝试，法国和西班牙已有商品化试剂盒供应，但因重组抗原制备难度较大，不仅试剂盒供应有限、价格昂贵，而且不同地区病毒株的检测结果有待进一步验证。

本发明用重组大肠杆菌表达与组氨酸标签融合的三种ASFV重组抗原，重组抗原不仅可用成本较低、可重复使用的镍亲和柱纯化，解决了重组抗原的批量生产问题；通过优化组合，将三种重组抗原以最佳比例混合，建立的检测ASFV抗体的多抗原ELISA（MA-ELISA）试剂盒，其特异性显著高于OIE推荐ELISA和进口同类试剂盒，而且扩大了毒株检测范围；以ProClin300作为防腐剂，使酶标板可在普通冰箱中稳定保存。该试剂盒不仅可用于ASFV血清学诊断和流行病学调查，而且可用于生猪的国际贸易检疫检验。

发明内容

本发明的目的在于：建立特异性强、敏感性高、操作简单、成本低廉、适合非疫区国家（地区）使用的ASFV抗体检测MA-ELISA试剂盒，用于ASFV血清学诊断、流行病学调查和生猪国际贸易检疫检验。

本发明一种检测非洲猪瘟病毒抗体的多抗原ELISA试剂盒，包括有抗原包被的酶标板、酶标二抗、阳性对照血清、阴性对照血清、稀释液、10×洗涤液、OPD与过氧化脲片剂、终止液。

上述试剂盒中，所述包被酶标板的抗原为重组大肠杆菌中表达和纯化的ASFV pB602L、pK205R和p54重组蛋白。

所述酶标二抗为商品化的辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG抗体，经方阵实验校正后按10000倍稀释，稀释液为：NaCl8g，KCl0.2g，Na₂HPO₄1.44g，KH₂PO₄0.24g，溶于800mL蒸馏水，调pH7.4，加5mL Tween-20、50mg脱脂乳定容至1L，0.45μm滤膜过滤除菌后，加入ProClin300至终浓度0.01%。

所使用的阳性对照血清为重组蛋白pB602L、pK205R和p54分别免疫猪获得的血清，再等体积混合，加入0.01%硫柳汞防腐；所使用的阴性对照血清为非免疫健康猪血清，加入0.01%硫柳汞防腐。

所述10×洗涤液为：NaCl80g，KCl2g，Na₂HPO₄14.4g，KH₂PO₄2.4g，溶于800mL蒸馏水，调pH7.4，加5mL Tween-20和1mL ProClin300，定容至1L。使用时用去离子水稀释成1×洗涤液。

所述OPD与过氧化脲片剂分别标记为A和B，使用时各取A、B一片，加入20mL的去离子水，溶解后作为底物溶液。

所述终止液为1M的H₂SO₄。

本发明所述试剂盒检测程序为：

（1）从试剂盒中取出酶标板，平衡至室温（16-26℃），避免阳光直射。

（2）用稀释液稀释待检血清、阳性和阴性对照血清，稀释倍数为200倍，再分别加样至对应的检测孔和本底对照孔（表1），100μL/孔，37℃作用1h；

表1检测加样孔示意

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

C＋

S7

S15

S23

S31

S39

B

C－

S8

S16

S24

S32

S40

C

S1

S9

S17

S25

S33

S41

D

S2

S10

S18

S26

S34

S42

E

S3

S11

S19

S27

S35

S43

F

S4

S12

S20

S28

S36

S44

G

S5

S13

S21

S29

S37

S45

H

S6

S7

S14

S22

S30

S38

S46

注：C＋，表示阳性对照血清；C－，表示阴性对照血清；S，表示待检血清样品。

（3）洗涤液洗涤酶标板，200μL/孔×4次，3min/次，吸水纸上拍干孔中液体；

（4）加入稀释的酶标二抗，37℃作用1h；

（5）洗涤液洗涤酶标板，200μL/孔×4次，3min/次，吸水纸上拍干孔中液体；

（6）加入新鲜配制的底物溶液，100μL/孔，室温下避光静置15min；

（7）加入终止液终止反应，50μL/孔；

（8）酶标仪读取每孔490nm（OD₄₉₀）波长吸光值，每份血清样品OD₄₉₀净值=检测孔OD₄₉₀值－本底对照孔OD₄₉₀值；

（9）在符合阳性对照血清OD₄₉₀净值＞1.5，阴性对照血清OD₄₉₀净值≤0.1的前提条件下，待检血清样品OD₄₉₀净值＞阴性血清临界值，判定为ASFV抗体阳性；待检血清样品OD₄₉₀净值≤阴性血清临界值，判定为ASFV抗体阴性；阴性血清临界值为0.163。

本发明的技术方案的建立，包括以下步骤：三种ASFV重组抗原表达与纯化、ASFV抗体阳性和阴性对照血清制备、MA-ELISA反应条件优化以及检测人工感染和田间血清样品的灵敏性、特异性测定。

1、重组抗原表达与纯化：将ASFV pB602L、pK205R和p54基因分别插入原核表达载体pET-30a(+)，转化大肠杆菌BL21(DE3)，用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导重组蛋白表达，按照Ni-NTA琼脂糖层析柱说明书纯化重组蛋白，用ASFV自然感染康复猪血清对重组蛋白进行Westernblot验证，证实表达重组蛋白表达正确，纯化效果好。

2、阳性和阴性对照血清制备：用加弗氏佐剂的重组蛋白pB602L、pK205R和p54免疫猪，采集猪血清，用重组抗原包被酶标板，用常规间接ELISA测定针对3种抗原的抗体效价均≥10⁵，三种抗体等体积混合后，加入0.01%硫柳汞防腐，作为阳性对照血清-20℃保存；采集正常健康猪血清，加入0.01%硫柳汞防腐，作为阴性对照血清，-20℃保存。

3、ELISA检测板的抗原包被

将重组蛋白pB602L、p54及pK205R溶液10000rpm离心3min，吸取上清紫外分光光度计定量其浓度，用0.05mol/L碳酸盐缓冲液（pH9.6）将三种蛋白稀释成2.0μg/mL、0.5μg/mL、2.0μg/mL混合溶液，加入酶标板横排奇数孔（检测孔），横排偶数孔加包被液为本底对照孔，100μL/孔，37℃作用2h；用洗涤液（NaCl8g，KCl0.2g，Na₂HPO₄1.44g，KH₂PO₄0.24g，溶于800mL蒸馏水，调pH7.4，加5mL Tween-20定容至1L，再加入ProClin300至终浓度0.01%）洗板，200μL/孔×2次；加入封闭液，200μL/孔，37℃作用1h；洗涤液洗板，200μL/孔×2次；吸水纸上拍干孔中的液体。

4、间接ELISA操作及结果判定

加入封闭液200倍稀释待检血清、抗体阳性和阴性对照血清于检测孔和本底对照孔，100μL/孔，37℃作用1h，洗涤液洗板，200μL/孔×4次，吸水纸上拍干孔中的液体；加入稀释液（NaCl8g，KCl0.2g，Na₂HPO₄1.44g，0.24g，溶于800mL蒸馏水，调pH7.4，加5mLTween-20、50mg脱脂乳定容至1L，再加入ProClin300至终浓度0.01%）稀释酶标二抗（Earthox公司），37℃作用1h，同前洗板；加入新鲜配制底物溶液（按SIGMAFAST^TM OPD说明书配制），100μL/孔，室温避光静置15min；加入终止液，50μL/孔,在酶标仪读取各孔OD₄₉₀值，血清OD₄₉₀净值=检测孔OD₄₉₀值－本底对照孔OD₄₉₀值；在符合阳性对照血清OD₄₉₀净值＞1.5，阴性对照血清OD₄₉₀净值≤0.1的前提条件下，以OD₄₉₀=0.163为临界值，将OD₄₉₀净值＞0.163的血清样品判定为抗体阳性，≤0.163的判定为抗体阴性。

与OIE推荐ELISA和进口同类试剂盒相比，本发明建立的ASFV抗体检测MA-ELISA试剂盒具有特异性强、敏感性高、操作简单和成本低廉等优点，适合包括我国在内的ASF非疫区国家（地区）使用，不仅可用于ASFV血清学诊断、流行病学调查和生猪国际贸易检疫检验，而且具有较强的产业化开发前景和国际市场竞争优势。

附图说明

图1纯化ASFV重组蛋白的Western-blotting鉴定

1.蛋白分子质量标准SM0441，2.重组蛋白pB602L，3.重组蛋白p54，4.重组蛋白pK205R。

具体实施方式

生物材料来源：

pGEX-4T-1-B602L：含E70株ASFV B602L基因，由葡萄牙Gulbenkian de Cie^ncia研究所RM Parkhouse博士惠赠（Reis,A.L.,R.M.Parkhouse,A.R.Penedos,C.Martins,and A.Leitao.2007.Systematic analysis of longitudinal serological responses of pigs infected experimentally withAfrican swine fever virus.J.Gen.Virol.88:2426-2434.）；

pGEX-4T-1-E183L：含E70株ASFV E183L（p54）基因，由葡萄牙Gulbenkian de Cie^ncia研究所RM Parkhouse博士惠赠（Reis,A.L.,R.M.Parkhouse,A.R.Penedos,C.Martins,and A.Leitao.2007.Systematic analysis of longitudinal serological responses of pigs infectedexperimentally with African swine fever virus.J.Gen.Virol.88:2426-2434.）；

pGEX-4T-1-K205R：含E70株ASFV K205R基因，由葡萄牙Gulbenkian de Cie^ncia研究所RM Parkhouse博士惠赠（Reis,A.L.,R.M.Parkhouse,A.R.Penedos,C.Martins,and A.Leitao.2007.Systematic analysis of longitudinal serological responses of pigs infectedexperimentally with African swine fever virus.J.Gen.Virol.88:2426-2434.）；

pET30a（+）：大肠杆菌表达载体，从美国Novogen公司引进（Cat No.69909.3）；

BL21(DE3)大肠杆菌（E.coli）：从海基生（HaiGene）物科技有限公司引进（Cat No，K10127）；

检测的ASFV抗体阳性、阴性猪血清：由Pirbright研究所OIE ASF参考实验室LK Linda博士提供。

具体操作步骤如下：

1.重组大肠杆菌构建

用限制性内切酶EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切pGEX-4T-1-K205R，琼脂糖凝胶电泳分离后，用DNA凝胶回收试剂盒（Qiagen公司）回收618bp DNA片段，与同酶消化pET-30a（+）载体连接，获得重组质粒pET-K205R，转化BL21(DE3)E.coli感受态细胞，获得pET-K205R重组菌。

以pGEX-4T-1-E183L为模板，用p54基因（GenBank ACCESSION：FJ174389）引物PCR扩增不包括N端50个氨基酸的p54编码序列。

正向引物：5-TAGAATTCGACCCGTCTTCAAGAAAG-3（SEQ ID NO.1）

反向引物：5-TACTCGAGTTACAAGGAGTTTTCTAGG-3（SEQ ID NO.2）

扩增产物用EcoR Ⅰ、Xho Ⅰ酶切后，与同酶消化的pET-30a（+）载体连接，获得重组质粒pET-E183L，转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，获得pET-E183L重组菌。

以pGEX-4T-1-B602L为模板，用B602L基因（GenBank Accession:U18466）引物进行PCR扩增。

正向引物：5-CTGAATTCATGGCAGAATTTAATATTGATGAGCTTC-3（SEQ ID NO.3）

反向引物：5-CTGCGGCCGCTTACAATTCTGCTTTTGTATATAAA ATT-3（SEQ ID NO.4）

扩增产物用EcoR Ⅰ、Not Ⅰ酶切后，与同酶消化pET-30a（+）载体连接，用重组质粒pET-B602L转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，获得pET-B602L重组菌。

2.重组抗原表达与纯化

按1∶100体积比，将pET-K205R、pET-E183L和pET-B602L重组菌培养物接种含50μg/mL卡那霉素的2×YT培养基（参考文献1），37℃培养至OD₆₀₀=0.8，加入1mmol/L IPTG，37℃诱导4h；8000rpm离心2min，收集菌体用PBS（pH7.6）离心洗涤2次；沉淀菌体用超声波仪裂解（功率50W，10s/次，共10min），4℃、12000rpm离20min，收集上清液或沉淀；按照Ni-NTA琼脂糖柱（Qiagen,Cat No:30210）说明书纯化重组蛋白pK205R（变性条件）、pB602L（非变性条件）和p54（非变性条件）；取三种重组蛋白各5μg，12%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，用蛋白转印仪（BioRad公司）转印Protran BA83硝酸纤维素膜（Whatman公司），用ASFV抗体阳性血清进行Western-blotting验证（图1）。

3.ASFV抗体阳性与阴性对照血清制备

用0.01M PBS（pH7.6）将纯化的重组蛋白pB602L、p54和pK205R浓度调整为1mg/mL，分别与等体积弗氏完全佐剂（Sigma公司）混合，超声波仪（Bandelin公司）充分乳化（功率30W，5min）；每重组抗原肌肉注射2月龄姜曲海猪（江苏省畜牧兽医技术学院种猪场提供）2头，2mL（1mg蛋白）/头；第一次免疫后10天，用弗氏不完全佐剂混合的同样剂量抗原加强免疫1次；10天后再用同样剂量的重组抗原加强免疫1次；在第三次免疫后第7天，无菌采集猪血分离血清；按照常规间接ELISA方法，分别以5μg/mL重组蛋白pB602L、p54或pK205R包被酶标板，与连续10倍稀释重组蛋白免疫猪血清反应，测得三种重组蛋白免疫猪血清的ELISA抗体效价均大于10⁵；将分三种重组蛋白免疫猪血清等体积混合，加入0.01%硫柳汞，分装后-20℃保存，作为ASFV抗体检测阳性对照血清；从2头2月龄非免疫姜曲海猪（江苏省畜牧兽医技术学院种猪场提供）采集血液分离血清，用上述ELISA测定ASFV抗体为阴性，加入0.01%硫柳汞，分装后-20℃保存，作为ASFV抗体检测阴性对照血清。

4.ELISA操作程序与结果判定

（1）基本操作程序

用0.05mol/L碳酸盐缓冲液（pH9.6）稀释的重组抗原包被96孔酶标板（NUNC公司）横排奇数各孔，横排偶数孔加碳酸盐缓冲液作为本底对照孔，100μL/孔，37℃作用2h，甩去抗原包被液，用洗涤液（含0.01ProClin300和0.05%Tween-20的0.01mol/L PBS，pH7.4）洗板2次，200μL/孔；加入封闭液，200μL/孔，37℃作用1h，用PBST洗板2次，吸水纸上拍干孔中液体；加入稀释液（NaCl8g，KCl0.2g，Na₂HPO₄1.44g，0.24g，溶于800mL蒸馏水，调pH7.4，加5mL Tween-20、50mg脱脂乳定容至1L，再加入ProClin300至终浓度0.01%）200倍稀释的血清，100μL/孔，37℃作用1h，用洗涤液洗板4次，吸水纸上拍干孔中液体；加入稀释液稀释的酶标二抗（辣根过氧化物酶标记羊抗猪IgG，Earthox公司），37℃作用1h，用洗涤液洗板4次，吸水纸上拍干孔中液体；按SIGMAFAST^TM OPD（Sigma公司）说明书新鲜配制底物溶液，加入酶标板各孔，100μL/孔，室温下避光静置15min；加入1mol/L H₂SO₄终止反应，50μL/孔；用酶标仪读取各孔OD₄₉₀值，将检测孔OD₄₉₀值－本底对照孔OD₄₉₀值确定为每份血清样品的OD₄₉₀净值，将OD₄₉₀净值□阴性血清临界值的血清样品判定为ASFV抗体阳性，将OD₄₉₀净值≤阴性临界值的血清样品判为ASFV抗体阴性。

（2）单抗原ELISA

分别以梯度稀释的ASFV重组蛋白pB602R、p54和pK205R为包被抗原，与1∶200稀释ASFV人工感染后第6、13、27天猪血清进行间接ELISA，同时设抗体阴性血清对照，以辣根过氧化物酶标记羊抗猪IgG为二抗，测定人工感染猪血清病毒抗体的产生时间。结果显示：ASFV重组蛋白pB602R、p54和pK205R最佳包被浓度为2μg/mL、0.5μg/mL、2μg/mL，在病毒感染后第6天，pB602R抗原可检测到低水平病毒抗体；感染后第13天，pB602R、p54和pK205R抗原均可检测到病毒抗体，其中p54抗原检测的抗体滴度最高；感染后第27天，pB602R、p54和pK205R检测抗体滴度继续上升，其中pK205R检测的抗体滴度最高。

（3）MA-ELISA的建立

①包被抗原及酶标抗体浓度确定：将pB602L、pK205R和p54抗原以4:1:4混合，先与1∶200稀释ASFV抗体阳性及阴性血清反应，再与不同倍数稀释的酶标抗体反应，以样品孔OD₄₉₀净值/阴性孔OD₄₉₀净值为判断标准（最大值所对应的抗原包被浓度为最佳浓度），测得混合抗原最佳包被浓度为4.5μg/mL，酶标抗体使用浓度为1:10000。

②封闭液及抗体稀释液的选择：分别以含3%冷水鱼皮明胶、1%牛血清白蛋白、5%脱脂乳粉的稀释液作为封闭液和抗体稀释液，用上述混合抗原包被板分别与1∶200ASFV抗体阳性和阴性血清反应，结果显示：用含5%脱脂乳粉PBST作为封闭液和抗体稀释液，测得抗体阳性孔OD₄₉₀净值/阴性孔OD₄₉₀净值最大，表明以5%脱脂乳作为封闭液和抗体稀释液效果最佳。

③阳性、阴性对照血清ELISA定量：按照ELISA检测程序，对制备的阳性、阴性血清分别进行10次重复检测，以阳性对照血清OD₄₉₀净值的平均值-2×SD（标准差）公式，计算阳性对照血清OD₄₉₀净值的下限为1.5；以阴性对照血清OD₄₉₀净值的平均值＋2×SD（标准差）公式，计算阴性对照血清OD₄₉₀净值的上限为0.1。从而确定阳性对照血清OD₄₉₀净值＞1.5，阴性对照血清OD₄₉₀净值≤0.1的前提条件下，MA-ELISA体系有效。

④ASFV抗体阴性血清临界值确定：先以Western-blot试验测得ASF V抗体阴性和阳性血清各101份和113份，然后用MA-ELISA检测，用Medcalc软件（Version11.4.2）对阴、阳性血清OD₄₉₀净值进行ROC分析，结果显示ASFV抗体阴性血清的OD₄₉₀临界值为0.163（表2）。

表2Medcalc Version11.4.2ROC分析结果

Criterion	Sensitivity	95%CI	Specificity	95%CI
					>=0	100.00	96.8-100.0	0.00	0.0-3.6
>0.103	100.00	96.8-100.0	77.23	67.8-85.0
					>0.104	99.12	95.2-100.0	77.23	67.8-85.0
>0.144	99.12	95.2-100.0	90.10	82.5-95.1
					>0.148	98.23	93.8-99.8	90.10	82.5-95.1
>0.163*	98.23	93.8-99.8	92.08	85.0-96.5
					>0.204	92.92	86.5-96.9	92.08	85.0-96.5
>0.213	92.92	86.5-96.9	93.07	86.2-97.2
					>0.238	91.15	84.3-95.7	93.07	86.2-97.2
>0.363	91.15	84.3-95.7	99.01	94.6-100.0
					>0.583	84.07	76.0-90.3	99.01	94.6-100.0
>0.589	84.07	76.0-90.3	100.00	96.4-100.0
					>2.218	0.00	0.0-3.2	100.00	96.4-100.0

5.MA-ELISA试剂盒批内重复性试验

选取3块同一批次混合抗原包被的酶标板，在相同试验条件下分别对20份阴性、10份弱阳性和10份强阳性血清进行MA-ELISA平行试验，结果显示混合抗原包被酶标板的批内变异系数小于7.8%（表3）。

表3批内重复性试验结果

6.MA-ELISA试剂盒批间重复性试验

选取3块不同批次包被的微量板，室温平衡后在相同试验条件下，分别对20份阴性、10份弱阳性和10份强阳性血清进行MA-ELISA平行试验，结果显示混合抗原包被酶标板的批间变异系数小于8%（表4）。

表4批间重复性试验结果

7.MA-ELISA试剂盒灵敏性与特异性试验

选取经Western-blotting验证的ASFV抗体阴性血清74份、弱阳性血清19份和强阳性血清27份，同时用MA-ELISA、OIE推荐ELISA（抗原由英国Pirbright研究所提供）、西班牙Ingenasa公司ELISA试剂盒（INGEZIM PPA COMPAC）、法国ID-Vet公司ELISA试剂盒（IDScreen African Swine Fever Indirect ELISA kit）进行平行检测，结果显示：MA-ELISA的检测敏感性和特异性分别为95.7%和91.9%，显著高于其他方法，尤其是抗体弱阳性血清的检测（表5）。

表5不同方法检测结果比较

8.MA-ELISA试剂盒田间血清样品检测

从ASF疫区刚果民主共和国采集猪血清样品共201份，在相同条件下分别用OIE推荐ELISA和本发明的MA-ELISA试剂盒进行平行检测，结果不一致样品用Western-blotting验证。结果在201份血清样品中，MA-ELISA试剂盒检测阳性65份，OIE ELISA检测阳性86份，其中两种检测方法检测均为阳性57份。MA-ELISA试剂盒检测阳性而OIE ELISA检测阴性的8份血清中，5份为Western-blotting验证阳性，3份为Western-blotting验证阴性；OIE ELISA检测阳性而MA-ELISA试剂盒检测阴性的29份血清样品中，1份为Western-blot验证阳性，28份为Western-blot验证阴性（表6），

表6田间血清样品检测结果

表明本发明的MA-ELISA试剂盒检测临床猪血清样品ASFV抗体较OIE推荐ELISA更准确。

Claims

1.一种检测非洲猪瘟病毒抗体的多抗原ELISA试剂盒，其特征在于：试剂盒中有抗原包被的酶标板、酶标二抗、阳性对照血清、阴性对照血清、稀释液、10×洗涤液、OPD与过氧化脲片剂、终止液；

其中，包被酶标板的抗原为重组大肠杆菌中表达和纯化的ASFV pB602L、pK205R和p54重组蛋白，其质量比为4：1：4；混合抗原的包被浓度为4.5μg/mL。

2.根据权利要求1所述的一种检测非洲猪瘟病毒抗体的多抗原ELISA试剂盒，其特征在于，酶标二抗为商品化的辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG抗体，经方阵实验校正后按10000倍稀释，稀释液为：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄ 1.44g，KH₂PO₄ 0.24g，溶于800mL蒸馏水，调pH7.4，加5mL Tween-20、50mg脱脂乳定容至1L，0.45μm滤膜过滤除菌后，加入ProClin300至终浓度0.01％。

3.根据权利要求1所述的一种检测非洲猪瘟病毒抗体的多抗原ELISA试剂盒，其特征在于，所使用的阳性对照血清为重组蛋白pB602L、pK205R和p54分别免疫猪获得的血清，再等体积混合，加入0.01％硫柳汞防腐；所使用的阴性对照血清为非免疫健康猪血清，加入0.01％硫柳汞防腐。

4.根据权利要求1所述的一种检测非洲猪瘟病毒抗体的多抗原ELISA试剂盒，其特征在于，10×洗涤液为：NaCl 80g，KCl 2g，Na₂HPO₄ 14.4g，KH₂PO₄2.4g，溶于800mL蒸馏水，调pH7.4，加5mL Tween-20和1mL ProClin300，定容至1L，使用时用去离子水稀释成1×洗涤液。

5.根据权利要求1所述的一种检测非洲猪瘟病毒抗体的多抗原ELISA试剂盒，其特征在于，OPD与过氧化脲片剂分别标记为A和B，使用时各取A、B一片，加入20mL的去离子水，溶解后作为底物溶液。

6.根据权利要求1所述的一种检测非洲猪瘟病毒抗体的多抗原ELISA试剂盒，其特征在于，终止液为1M的H₂SO₄。