CN101961487A - 细粒棘球蚴基因工程疫苗候选分子p-29 - Google Patents

Abstract

一种细粒棘球蚴基因工程疫苗。从www.ncbi.nlm.nih.Gov的GenBank上检索细粒棘球蚴乌拉圭株诊断抗原P-29基因序列，以中国宁夏地区包虫病人的细粒棘球蚴病原体的总RNA为模板通过RT-PCR扩增P-29基因；扩增的基因DNA序列与乌拉圭株的基因序列一致。通过DNA重组技术，将克隆出的P-29基因与表达载体pET-28a重组，转化并构建大肠杆菌工程菌株；制备P-29重组蛋白，将获得的重组蛋P-29免疫小鼠后用宁夏地区包虫病人的原头蚴病原体攻击免疫小鼠，经过实验计算，EgP-29免疫保护力为96.6％。证明重组蛋白P-29具有疫苗的免疫学效应。

Description

细粒棘球蚴基因工程疫苗候选分子P-29 

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及人畜共患寄生虫病基因工程疫苗，特别针对肝包虫病的基因工程疫苗。 

背景技术

细粒棘球蚴虫病，俗称包虫病，是由细粒棘球蚴感染人和食草类家畜所引起的寄生虫疾病。由于细粒棘球蚴主要寄生于人的肝脏，故该病又称为肝包虫病。它呈世界性分布，严重危害人类的健康和农牧业经济的发展，是全球性的公共卫生问题。据近年普查，我国有25个省、市和自治区有该病的病例报道，其中以新疆、宁夏、甘肃、青海、西藏、四川、内蒙古7个省(区)流行最为严重，高发区约占全国面积的44％，受威胁人口约5千万。该病已被列为我国重点防治的寄生虫病之一。 

目前，对人包虫病的首选治疗方法是外科手术，但由于该病发病早期可无自觉症状，等到入院就诊时，相应的脏器已经受到严重的损伤并且手术本身对机体也有损伤，从而使患者在健康和经济上都蒙受了极大的损害。对于较早期小棘球蚴或有手术禁忌的病例可采用阿苯哒唑或甲苯咪唑等药物进行化疗，临床发现这些药物存在严重的毒副作用，部分患者不能耐受，同时某些化疗患者可产生耐药性。 

近年来，随着分子生物学技术的迅速发展及在医学科学中的广泛应用，利用基因工程技术对病原体进行分子疫苗的预防研究引起了人们的广泛观注。从目前的研究情况来看，国内外对细胞粒棘球蚴虫研究较为成功的重组疫苗有Eg95，它已在人工感染的牛和羊群获得了较好的免疫保护水平，免疫保护力达到96-98％。我们研究的细粒棘球蚴重组疫苗EgP-29的免疫保护力也达到了96.6％。因此，该疫苗候选分子将有望在肝包虫预防中发挥着巨大的作用。 

发明内容

本发明的目的是提供一种细粒棘球蚴重组疫苗候选分子，其具备安全、经济、有效、制备简单、性能稳定、使用方便、可产生较持久免疫保护效果等优点。从而有效控制人畜感染，减少人畜患病人数，使国家、人民减少财产损失，并带来巨大的经济效益。 

本发明通过利用生物信息学技术登陆NCBI/GenBank公共数据库，检索出已发表细粒棘球蚴(乌拉圭株)诊断抗原P-29基因序列(GenBank序列号：AF07893)，参照检索的基因序列设计并合成引物，以中国宁夏地区病人手术后获得的细粒棘球蚴原头蚴中提取的总RNA为模板，通过RT-PCR技术扩增出细粒棘球蚴的P-29基因；通过对扩增出的P-29基因DNA序列分析，证实该扩增基因与乌拉圭株P-29基因序列完全一致，表明我们成功克隆出的细粒棘球蚴(中国大陆株)P-29基因；通过DNA重组技术，将克隆出的P-29基因与表达载体pET-28a构建成重组质粒，并将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)plysS中，成功的构建出含细粒棘球蚴(中国大陆株)P-29基因的基因工程菌株；通过对工程菌株的诱导表达及通过含Ni²的His-bind树脂亲合柱纯化出重组蛋白rEgP-29。经免疫学鉴定 初步说明rEgP-29有较好的抗原性及免疫原性，具有抗包虫病疫苗候选分子的潜能。通过上述步骤获得的重组蛋白EgP-29背部多点注射免疫小鼠，每两周免疫1次，共3次。从宁夏医科大学附属医院肝胆外科住院包虫病患者手术摘除的完整包囊中，无菌条件分离原头蚴，用原头蚴攻击免疫小鼠(1.5×10⁴个原头蚴/ml悬液)，攻击感染20周后剖杀小鼠，切开小鼠腹部，计数肝脏及肠系膜处的棘球蚴包囊，根据Dempster计算免疫保护力，公式：免疫保护力(％)＝(1-免疫组平均包囊数/对照组平均包囊数)×100％。经计算用重组蛋白EgP-29免疫小鼠后，免疫保护力达到96.6％。 

附图说明

(图1)细粒棘球蚴重组疫苗候选分子制备流程图、(图2)重组表达质粒酶切鉴定(M1.200bp DNA marker；M2.Lander DNA HindIII marker；1.未酶切重组表达质粒；2.酶切重组表达质粒；3.RT-PCR产物；4.酶切空表达质粒；5.未酶切空表达质粒)、(图3)重组蛋白细粒棘球蚴中国大陆株P-29(EgP-29)表达及纯化电泳图谱(M.蛋白分子量Marker；1.重组蛋白纯化产物；2.EgP29/pET28a/BL21plysS诱导产物；3.BL21plysS诱导产物)。 

具体实施方式

细粒棘球蚴组疫苗候选分子的制备 

1.利用生物信息学技术检索目的基因片段 

首先登录GenBank(美国国立卫生研究院)数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GeneBank/)，输入物种名称-细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus)后，通过Entrez Nucleotide来查询已登载的细粒棘球蚴基因序列，通过检索，选取P-29基因序列作为基因工程疫苗的候选基因。 

2.合成引物 

根据P-29的碱基序列设计引物，引物序列分别列于序列表2至3。 

P-29基因之5’端引物见序列2；P-29基因之3’端引物见序列3。 

3.细粒棘球蚴原头蚴总RNA的提取 

取新鲜或液氮中冻存的原头蚴200mg，按总RNA提取试剂盒(Total RNAIsolation System)说明抽提总RNA。 

4.RT-PCR扩增及产物纯化 

4.1RT-PCR扩增 

按照RT-PCR试剂盒说明书指定的体积将无RNA酶水、AMV/TfI 5×buffer、dNTP混合物、特异性上、下游引物及25mM MgSO₄加入到预先置于冰上的0.2ml薄壁离心管中，配制成反应混合物。反复吹吸使混合物中各组分混合均匀。然后向反应体系中加入AMV逆转录酶和TfI DNA多聚酶。将反应管轻柔震荡10秒以混匀。最后加入RNA模板，经PCR仪扩增目的DNA。PCR反应组成为： 

5×buffer                10μl 

MgSO₄(25mM)              2μl 

dNTPs(10mmol)            1μl 

引物I                    2μl 

引物II              2μl 

逆转录酶AMV         1μl 

DNA聚合酶Tf I       1μl 

RNA(1ng/μl)        2μl 

DEPC水              29μl 

                              

合计                50μl 

在PCR仪按说明书上的要求设置反应条件： 

第一条：cDNA链的合成 

1个循环  48℃，45mins 反转录反应 

1个循环  94℃，2mins  反转录酶AMV失活RNA/DNA/引物变性 

第二条：cDNA链的合成及PCR扩增 

           94℃  30s      变性 

40个循环   60℃  1min     复性 

           68℃  2mins    延伸 

1个循环    68℃  7mins    最后延伸 

1个循环    4℃            储存 

4.2PCR产物的分离鉴定 

①灌胶：按1％琼脂糖浓度配制，称1g琼脂糖倒入250ml三角烧瓶中加入100ml 1×TAE缓冲溶液，放入微波炉，中火段，3mins将胶溶解，稍凉一下(约80℃时)加入2μl 10mg/ml溴化乙锭(EB)溶液并混匀(注意！溴化乙锭为强致癌诱变剂，使用时一定小心。)趁热倒入电泳槽，并加上相应的梳子。 

②加样：将凉透后的胶放入水平电泳槽，加入1×TAE缓冲溶液将槽子倒满。取10μl DNA样品于新的离心管中，加入2μl 6×上样缓冲液混匀，用40μl的加样器小心将样品加入到孔中。 

③电泳：将电泳装置按正负极安好，以94mA的电流进行电泳，观察溴酚兰的位置判断电泳的速度。 

④观察电泳结果：将凝胶从电泳槽取出后放到紫外灯下观察电泳结果，将胶放入凝胶成像仪中拍照，并将结果保存在计算机中。 

4.3PCR产物的纯化 

在紫外灯下用干净刀片切下含有目的片段的条带，用DNA回收试剂盒纯化PCR产物 

①溶胶：200-400mg琼脂糖凝胶中加入0.4ml纯化树脂(使用前充分混匀)，70℃水浴箱水浴10-15mins，每2mins颠倒混匀一次，使琼脂糖凝胶完全融化。 

②去胶：将溶化的Agarose液移入吸附柱，离心30s(13000rpm)，倒掉收集管中的废液，再将吸附柱放入同一个收集管。 

③洗胶：在吸附柱中加500μl80％乙醇，离心30s(13000rpm)，倒掉收集管中的滤液，再将吸附柱放入同一个收集管。 

④在吸附柱中加入500μl 80％乙醇，静置2min后，离心30s，倒掉收集管中的滤液，将吸附柱放入同一个收集管。 

⑤空柱离心2mins(13000rpm)。 

⑥洗脱DNA：将吸附柱放入一个干净的1.5ml EP管中，在吸附膜中央加入40μl T₁液(或ddH₂O)，静置2mins后，离心1min(13000rpm)。 

⑦保存：将1.5ml EP管放入-20℃冰箱中，备用。 

5.将所得的PCR产物P-29基因进行酶切后连接入真核表达载体pET-28a得到重组疫苗。 

目的片段与表达载体pET-28a在T4DNA连接酶的作用下，4℃连接反应过夜。以空载体做为对照，连接反应体系如下： 

                      EgP-29/pET-28a  pET-28a对照 

pET-28a               1μl            1μl 

目的片段EgP-29        2μl            0μl 

10×buffer            5μl            5μl 

T4DNA ligase(3ng/μl) 1μl            1μl 

ddH₂O                 1μl            3μl 

                                                  

总体积                10μl           10μl 

将两管混匀后，放4℃恒温水浴循环仪过夜。 

5.1重组质粒EgP-29/pET-28a转化大肠杆菌BL21plys 

(1)感受态大肠杆菌BL21plys的制备。 

a)将大肠杆菌BL21plys划盘于LB底琼脂平板中，37℃，倒置培养过夜。 

b)挑取单个菌落接种于3ml LB培养液(每ml LB培养液中加入2×Kana 2ul)， 

37℃振荡培养2-3h直至OD₆₀₀约为0.4，置于冰上降温。 

c)4℃，12000rpm离心15s，弃上清。 

d)加入500μl冰预冷的0.1mol/L的CaCl₂溶液重悬沉淀，置于冰上30mins。 

e)4℃，12000rpm离心15s，弃上清。 

f)加入180μl冰预冷的0.1mol/L的CaCl₂溶液重悬沉淀(要轻)，4℃备用。 

(2)重组质粒转化大肠杆菌BL21plysS 

g)将连接产物2μl分别与感受态大肠杆菌BL21plys混合后置于冰上30mins。 

h)热休克：42℃水浴90s后，立即置于冰上2mins。 

i)加入800μl YT培养液后，37℃，150rpm振荡培养1.5h。 

j)6000rpm离心15s去上清800μl，其余重悬沉淀。 

(3)铺板 

用两块LB底琼脂平板(含2×Kana 2μl/ml)，凝固后置于37℃培养箱1h后，将180μl转化后的菌液均匀涂布于平板上，于37℃培养箱倒置过夜。次日观察菌落生长情况。 

5.2重组质粒P-29/pET-28a酶切鉴定 

(1)挑取菌落 

挑取含Kana LB底琼脂平板上的单个白色菌落，同时挑取另一块空载体平板上的单个白色菌落做阴参，分别接种于5ml LB培养液中，37℃，180rpm振荡 培养过夜。 

(2)BamHI、NotI对相应的片段进行双酶切鉴定： 

反应体系如下： 

重组质粒     10μl(2μg) 

NotI         1μl 

BamHI        1μl 

ddH₂O        8μl 

                             

总体积       20μl 

置37℃水浴摇床，40rpm，1.5h。结束后1％琼脂糖凝胶电泳观察结果。 

(3)目的基因的核苷酸序列测定及分析： 

a.目的基因的核苷酸序列测定：经BamHI、NotI双酶切初步鉴定为阳性克隆的菌株送往大连宝生物公司再次进行核苷酸序列测定。 

b.目的基因的核苷酸序列分析：采用DNAman软件分析基因的核苷酸序列(碱基数目、组成及开放阅读框)，将测序结果在NCBI/GenBank数据库进行blast比较和分析，并与第一次插入基因片段的测序结果比对。 

5.3重组P-29/pET-28a蛋白的表达及鉴定 

将重组菌接种于含卡那霉素(终浓度为50ug/ml)的LB培养基中，37℃，220rmp，培养至OD600＝0.6时，收集诱导前的菌液后加入IPTG至终浓度为1mmol/l，分别调至25℃、28℃、30℃振荡培养过夜进而选择最优的表达条件。6000r/min离心5分钟，弃上清，收集细菌沉淀。将样本经SDS-PAGE、180V电压电泳1h，用0.2％考马斯亮蓝R250染色后，用脱色液脱至本底无色为止。 

6.表达鉴定 

纯化的P-29在宁夏医科大学中心实验室保存(保藏编号：01)。用纯化的P-29免疫动物，制备抗血清。通过western-blot及ELISA鉴定rEgP-29的免疫学特性。 

6.1动物免疫 

①动物6周龄雌性ICR小鼠，体重(18±2g)，实验随机分为两组：A组、B组，每组12只。 

②抗原制备A组：每只用纯化的EgP-29重组抗原10ug(用PBS调至100μl)与等体积弗氏佐剂充分混合(首次为弗氏完全佐剂，第二三次为弗氏不完全佐剂)。采用多点皮下注射方法，共3次，间隔2周。B组：为PBS对照组，注射弗氏佐剂加PBS的乳化剂。抗原定量根据Bio-Rad公司的Gel Doc1000凝胶分析软件对抗原进行定量。 

③制备抗血清0、2、4、6、8周各采血1次。最后，眼球取血杀小鼠。每次采完血放4℃冰箱静置约6h后，将鼠尾血液10000rpm，4℃离心10mins，提取上层血清，-85℃保存。 

6.2Western blot鉴定重组蛋白 

①洗玻璃 先用酒精棉球小心的将大小两片玻璃按一个方向擦干，再用甲醇棉球再擦一遍，并晾干。 

②胶的配制按操作要求将玻璃安装到胶架上，配方如下： 

10％分离胶            5％浓缩胶 

ddH₂O             3ml          1.8ml 

30％AA母液        2.5ml        300μl 

1.5molTris(pH8.8) 1.88ml       1molTris(pH6.8)750μl 

10％SDS           75μl        30μl 

10％APS           75μl        55μl 

TEMED             7.5μl       5.5μl 

取一干净的50ml烧杯，按顺序加入ddH₂O、30％母液、1.5mol Tris(pH8.8)、10％SDS(先预热溶解)并充分混匀，再加入10％APS 75μl和TEMED 7.5μl(二者均为促凝剂)后吹匀，迅速用枪加入到已安装好的两层玻璃之间，然后加入ddH₂O覆盖到上面，室温下静置，待胶凝后(胶和水面呈现出界限)，将水倒出，并用滤纸条将多余的水吸净。将现配好的浓缩胶加入到分离胶的上层，(注意不要产生气泡，)并迅速加上梳子。室温静置30mins。 

③样本的处理 各取20μl rEgP-29、BL21plysS的表达产物及原头蚴、囊液、囊壁分别加入20μl 2×电泳加样缓冲液并混匀后，室温静置30mins，放入沸水中煮沸5mins。 

④加样将凝好的胶安装进入电泳槽，向内、外槽分别加入电泳缓冲液，将梳子小心的水平取出。依次加入处理好的样本，并作好记录。 

⑤电泳(Electrophoresis)按正负极接好电源，打开开关，将电泳仪调至180V电压，电泳1h，直至指示剂染料溴酚蓝接近胶底部时停止电泳。 

⑥转印 电泳结束后，立即取出凝胶，取一大小与胶相似的硝酸纤维薄膜，在转移电泳液中浸湿后与胶对齐，两侧放两层滤纸，滤纸两侧各放一层海绵，膜在正极端，胶在负极端，放入电转移槽中，加满转移缓冲液，在300mA下对硝酸纤维膜进行印迹转移电泳1h。 

⑦封闭、一抗孵育 转移电泳结束后，取出硝酸纤维膜浸入5％的脱脂奶粉溶液中，37℃封闭2h或4℃过夜。以1×PBS-T(含0.5‰Tween-20)溶液洗3次每次5mins。再将硝酸纤维膜浸泡于(1∶100稀释)抗原免疫组的小鼠血清(一抗)中，4℃摇床上过夜。 

⑧二抗孵育、显色 次日将膜与1∶800稀释的羊抗鼠IgG-HRP结合，在37℃摇床上反应2h。再以1×PBS-T溶液洗膜4次，每次慢摇10mins。加入新配制的显色液(6mg 4-氯-1-奈酚，2ml冷甲醇，10ml 1×TBS，12μl H₂O₂)显色2mins，最后用蒸馏水冲洗终止反应。膜放入凝胶成像仪将结果保存在计算机中。 

6.3酶联免疫吸附实验(ELISA) 

①抗原包被 采用96孔酶标板，分别将囊液及原头蚴天然抗原1∶100稀释、rEgP-291∶200稀释后，按每孔100μl包被酶标板4℃过夜。 

②封闭 次日将96孔酶标板垂直向下弃去抗原，洗板机用1×PBS-T洗板4次，在吸水纸上拍干残液后，按每孔加100μl 5％脱脂奶粉封闭，放37℃温箱中，反应1h。 

③加一抗 反应1h后，取出96孔酶标板垂直向下弃去脱脂奶粉，洗板机用1×PBS-T洗板4次，在吸水纸上拍干残液后，每孔加入100μl按1∶100稀 释的相应A组、B组小鼠抗血清，4℃过夜。 

④加二抗后显色 第二天取出96孔酶标板垂直向下弃去一抗，洗板机用1×PBS-T洗板4次，在吸水纸上拍干残液后，每孔加入100ul按1∶400稀释的羊抗鼠IgG-HRP结合一抗，在37℃温箱中，反应2h。再以1×PBS-T溶液洗板机洗板4次。加入新配制的显色液(70ml基质液，700μl 6mgTMB/1ml DMSO，252μl H₂O₂)显色20mins，2M浓H₂SO₄每孔50μl停止反应后，将酶标板放入Bio-Rad公司550型酶标仪上读取数据。 

7.进行保护实验，经小鼠皮下接种疫苗，观察其诱导动物抗肝包虫攻击感染的能力，并研究疫苗抗感染的免疫机制。 

免疫保护力观察 

①免疫保护力：攻击感染20周后剖杀小鼠，切开小鼠腹部，称取小鼠脾脏，计算脾指数，公式：脾指数＝脾的重量(mg)/小鼠体重(g)；计数肝脏及肠系膜处的棘球蚴包囊，根据Dempster^|34|计算免疫保护力，公式：免疫保护力(％)＝(1-免疫组平均包囊数/对照组平均包囊数)×100。 

②常规ELISA检测小鼠血清特异性抗体水平：选用小鼠免疫前、攻击前(第三次免疫后)和剖杀前(眼眶取血)三次血清做ELISA检测IgG、IgG1、IgG3、IgG2a、IgG2b和IgE水平，测OD_150nm。 

③统计学处理：所有数据用SPSS统计软件包处理，用单因素方差分析(ANOVA)进行比较。 

8.实验结果 

(1)P-29免疫小鼠攻击感染后的棘球蚴包囊数、免疫保护力及脾指数(x±S) 

(2)P-29免疫前、后和攻击感染后小鼠血清抗体检测(x±S) 

序列表.txt 

1.ATGTCCGGATTTGACGTTACTAAGACTTTCAATAGATTTACCCAGCGGGCTGGTGAGCTT 60 

GTAAATAAGAATGAAAAGACCTCATATCCTACCCGAACCTCAGATCTTATCCATGAGATC  120 

GACCAAATGAAAGCATGGATCAGCAAGATCATCACCGCTACTGAGGAATTCGTAGACATC  180 

AACATTGCATCTAAAGTCGCGGATGCTTTCCAGAAGAATAAGGAGAAGATTACTACTACC  240 

GACAAACTGGGTACTGCTCTCGAGCAGGTTGCTTCCCAATCAGAAAAGGCAGCTCCCCAA  300 

CTTTCTAAAATGCTGACGGAAGCTTCTGATGTCCATCAGCGTATGGCCACTGCCAGAAAG  360 

AATTTCAATAGTGAGGTTAATACCACCTTCATTGAAGATTTGAAAAACTTCTTGAACACC  420 

ACGCTTAGCGAGGCCCAGAAAGCAAAGACCAAGCTGGAGGAGGTTCGACTAGATTTGGAC  480 

TCTGACAAGACTAAATTGAAGAATGCTAAGACTGCGGAACAGAAGGCCAAGTGGGAGGCC  540 

GAGGTGCGAAAAGACGAAAGTGACTTCGATCGAGTGCACCAAGAATCTCTTACTATCTTT  600 

GAGAAGACTTGCAAAGAATTCGATGGGTTGAGCGTTCAGCTGTTGGATCTGATCCGTGCA  660 

GAGAAGAATTACTACGAAGCCTGTGCCAAAGAGTGCAGTATGATGCTGGGCGAGTAG     717 

2Primer I：5’-ATGGATCCATGTCCGGATTTGACGTTAC-3’ 

3Primer II：5’-GTGCGGCCGCCTACTCGCCCAGCATCATA-3’ 

Claims (2)

1.一种细粒棘球蚴基因工程疫苗，其特征在于：成功克隆了细粒棘球蚴(中国大陆株)P-29基因并且构建了基因工程菌株EgP-29/pET-28a/BL21(DE3)plysS，表达并纯化出蛋白rEgP-29(分子量为31KD)。经免疫学鉴定初步说明：rEgP-29有较好的抗原性及免疫原性，具有抗包虫病疫苗候选分子的潜能。

2.根据权利要求1所述的细粒棘球蚴基因工程疫苗，其特征在于能诱导小鼠产生免疫保护力(免疫保护力达96.6％)，其保护性免疫主要通过诱导宿主产生体液免疫应答和细胞免疫应答，表明rEgP-29是具有保护机体免受细粒棘球蚴感染的效能。 

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