CN103627718B

CN103627718B - 表达ibv s1和n双抗原蛋白重组质粒及其构建方法和应用

Info

Publication number: CN103627718B
Application number: CN201310470341.0A
Authority: CN
Inventors: 韦平; 李孟; 何坤
Original assignee: Guangxi University
Current assignee: Guangxi University
Priority date: 2013-10-10
Filing date: 2013-10-10
Publication date: 2016-08-17
Anticipated expiration: 2033-10-10
Also published as: CN103627718A

Abstract

本发明公开了一种表达IBV的S1和N双抗原蛋白重组质粒及其构建方法和应用，发明人根据GenBank中注册的鸡传染性支气管炎病毒S1、N和Ub基因序列设计引物，通过PCR扩增鸡传染性支气管炎病毒中国分离株GX‑YL5株的S1、N和鸡的Ub基因，并用分子生物学方法将鸡传染性支气管炎病毒中国分离株GX‑YL5株N和S1基因与鸡Ub基因插入真核表达载体pVAX1中，构建了表达N和S1基因与鸡Ub基因共表达质粒，研制了DNA疫苗pVAX1‑Ub‑linker‑N‑S1。实验证明，该疫苗预防IBV疗效显著。应用本发明可同时将IBV的S1、N和鸡Ub基因串联插入pVAX1载体，用于预防鸡传染性支气管炎。

Description

表达IBV S1和N双抗原蛋白重组质粒及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于动物医药生物工程研究领域，尤其涉及一种表达IBV S1和N双抗原蛋白重组质粒及其构建方法和应用。

背景技术

鸡传染性支气管炎（infectious bronchitis，IB）为国际兽医局及我国规定的家禽二类传染病之一，是目前分布最广泛、发病最普遍的疫病之一。该病是由鸡传染性支气管炎病毒（IBV）引起的鸡的一种急性、高度接触传染性的呼吸道疾病，不同日龄、性别、品种鸡均可易感。IBV主要侵害鸡的呼吸道、肠道、输卵管及肾脏，可引起相应器官的病变和损伤，更重要的是容易引起细菌及其它病原的继发感染，引起更大的损失，是造成目前生产上最普遍而且危害最大的鸡呼吸道综合症的重要病因之一。由于IBV在鸡群中感染的广泛性和普遍性，加之病毒基因组RNA复制过程的不连续性以及RNA聚合酶的不完全校对机制，造成其基因组十分容易发生点突变、缺失、插入和不同毒株基因组间的同源重组，使得病毒的血清型、基因型、致病性、免疫原性等极易发生变异，因而病毒临床表现复杂、血清型众多，而各血清型之间仅有部分或完全没有交叉保护作用，从而给本病的免疫防控带来很大的困难。

IBV有三个主要结构蛋白，即纤突（S）蛋白、膜（M）蛋白、核衣壳（N）蛋白。S蛋白由S1和S2两个糖蛋白亚基组成，其中S1糖蛋白是IBV蛋白中变异程度最大的结构蛋白，系IBV的主要保护性抗原和致病相关基因，IBV的抗原性和致病性的改变主要与S1基因的变异有关。S1基因5'端起始密码后第159～444nt处存在一个高变区（HVR），在HVR内第330～357nt处又存在一个所谓的相对保守处，因而将HVR分隔为上游的HVR I和下游的HVRⅡ。大多IBV血清型抗原决定簇位于S蛋白的S1亚单位的N端，即S1的前300个氨基酸残基内。那些遗传起源接近血清型不同的毒株大多可从HVR区编码的抗原簇表位的差异得到反映。N蛋白位于病毒的内部，相对于S1基因而言则比较保守，它在病毒复制及组装过程中具有重要作用，而且具有很好的免疫原性，在体内可诱导产生高水平的抗体并介导细胞毒性T细胞效应（CTL）。防控IB的关键在于避免早期的感染，这样能大大减少IBV对鸡体的侵害。

疫苗预防仍是控制IB的最有效措施之一，针对IB病毒的基因变异与血清型变化，怎样使用疫苗来有效预防该病是我们当前迫切要解决的难题。现有的研究针对载体和佐剂的单基因疫苗居多，研制能产生高的特异性细胞免疫和体液免疫且广谱的新型疫苗仍是当前研究的难点和热点。DNA疫苗具有一般重组病毒活载体疫苗抗原合成和提呈及类似自然感染的优点，其在安全性和有效性上具有突出的优点而且可以将多个抗原基因构建在同一表达载体上形成多价疫苗。但是，常规DNA疫苗的免疫原性较传统疫苗弱，主要原因是大部分质粒在未发挥作用之前就降解了，而且表达的蛋白只有小部分能达到靶器官发挥免疫诱导作用。针对此问题，提高DNA疫苗效果的一个令人振奋的途径是DNA疫苗的靶向策略，即将DNA疫苗或其表达的蛋白产物定向于抗原递呈细胞（APC），特别是树突状细胞（DC）。APC内部靶向策略之一就是增强MHC-Ⅰ类途径，使用微小基因疫苗将抗原表位直接转运进内质网。

泛素（Ubiquitin，Ub）是由76个氨基酸组成，高度保守，普遍存在于真核细胞内的小分子多肽。泛素及其对蛋白质的标志修饰（泛素化，ubiquitination orubiquityrmtion）参与细胞内ATP依赖的选择性蛋白质降解过程，泛素-蛋白酶体途径的发现，引起了研究者的广泛关注。研究表明，26S蛋白酶体与主要组织相容性复合物（MHC）限制性类抗原的处理有密切关系，泛素-蛋白酶体途径是MHC-Ⅰ限制性类抗原提呈所必需的环节。Ub可通过共价键结合将外源性抗原转化为内源性抗原并促进内源性抗原在胞浆内的降解，有利于使抗原导向到蛋白酶体中，并且加速它的循环及通过MHC-Ⅰ类途径的递呈。近年来，国内外已有学者利用泛素来提高DNA疫苗的免疫效果，研究结果表明Ub融合质粒DNA能够诱生较强的细胞免疫反应。目前关于泛素增强禽类病原免疫应答研究报道甚少，尤其是针对病毒抗原的研究还未见报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种表达IBV的S1和N双抗原蛋白重组质粒及其构建方法和应用。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：表达IBV的S1和N双抗原蛋白重组质粒，主要由鸡传染性支气管炎病毒的S1、N基因、鸡的Ub基因和真核表达载体pVAX1组成。

Ub基因通过一段编码（G3S）4多肽的linker与将鸡的Ub基因与S1和N基因连接。

上述表达IBV的S1和N双抗原蛋白重组质粒具有序列表SEQ.ID.No.1的碱基序列。

鸡传染性支气管炎病毒来自中国分离株GX-YL5株。

上述表达IBV的S1和N双抗原蛋白重组质粒的构建方法，用PCR方法扩增鸡传染性支气管炎病毒的S1、N和鸡的Ub基因，将鸡的Ub基因与鸡传染性支气管炎病毒的S1和N基因通过引入一段编码（G3S）4多肽的linker采用酶切位点相连的方法连接并将PCR产物经HindIII和XhoI双酶切定向插入以HindIII和XhoI双酶切处理的真核表达载体pVAX1中，即得Ub介导的鸡传染性支气管炎病毒的S1和N基因真核表达质粒pVAX1-Ub-linker-N-S1。

上述表达IBV的S1和N双抗原蛋白重组质粒在制备预防鸡传染性支气管炎DNA疫苗方面的应用。

针对目前鸡传染性支气管炎缺乏有效预防疫苗的问题，发明人根据GenBank中注册的鸡传染性支气管炎病毒S1、N和Ub基因序列设计引物，通过PCR扩增鸡传染性支气管炎病毒中国分离株GX-YL5株的S1、N和鸡的Ub基因，并用分子生物学方法将鸡传染性支气管炎病毒中国分离株GX-YL5株N和S1基因与鸡Ub基因插入真核表达载体pVAX1中，构建了表达N和S1基因与鸡Ub基因共表达质粒，研制了DNA疫苗pVAX1-Ub-linker-N-S1。实验证明，该疫苗预防IBV疗效显著。应用本发明可将不同IBV S1、N和鸡Ub基因串联插入pVAX1载体，用于预防鸡传染性支气管炎。

附图说明

图1是pVAX1-Ub-linker-N-S1双酶切鉴定结果图，图中：M为DL5000DNA Marker；1为pVAX1-Ub-linker-N-S1质粒Xho I+Hind III双酶切结果。

图2是免疫荧光方法检测结果图，图中：左图为pVAX1-Ub-linker-N-S1在Vero细胞中瞬时表达结果；右图为pVAX1空载体转染对照结果。

具体实施方式

1.1病毒株

IBV毒株GX-YL5（GenBank NO.HQ848267.1）。

1.2方法

1.2.1构建质粒引物的设计

参照GenBank中已知的GX-YL5全基因和鸡泛素基因的序列设计引物，不同的引物上分别有EocR I、Apa I、Hind III、BamH I和Xho I的酶切位点，所有内切酶均购自宝生物工程（大连）有限公司。Ub、N和S1基因扩增引物序列见表1。

表1引物序列

表1中，斜体部分为酶切位点，括号部分为连接两段基因的linker。

在质粒pVAX1-Ub-linker-N-S1构建过程中，人为地删除了IBV N基因末端终止密码子“TGA”,IBV S1基因放入末端人为地添加了终止密码子“TAA”使其能够正常表达。

1.2.2Ub、N和S1基因的RT-PCR扩增

Ub基因的获取：提取鸡肌肉组织的总RNA，然后以总RNA为模板参照MLV逆转录酶（宝生物工程（大连）有限公司，TaKaRa MLV，10000units）说明书进行RT，反应条件为42℃水浴1h。PCR体系配置参照说明书，PCR反应条件为94℃预变性5min，94℃30s，62℃45s，72℃30s，35个循环，最后72℃延伸10min。

毒株GX-YL5通过接种SPF鸡胚进行增殖。N和S1基因的获取：提取含有GX-YL5病毒的鸡胚尿囊液总RNA，参照MLV逆转录酶（宝生物工程（大连）有限公司，TaKaRa MLV，10000units）说明书及EXTaq聚合酶（宝生物工程（大连）有限公司，TaKaRa EXTaq，250units）说明书进行操作。PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃50s，50℃45s，72℃2min，35个循环，最后72℃延伸10min。

1.2.3各个目的基因的PCR及pVAX1双酶切产物的纯化与回收

载体pVAX1双酶切的体系如下：

酶切反应的条件：37℃3h。

酶切后的Ub基因PCR产物和pMD18-T载体充分混匀，16℃温浴过夜转化E.coli感受态细胞，将Ub基因克隆到pMD18-T载体上。

将含有Ub基因的质粒分别用Hind III和BamH I双酶切，双酶切的体系如下：

酶切反应的条件为：37℃3h。

回收pVAX1-Ub酶切产物，-20℃保存备用。

S1基因与N基因串联：用N1/N2引物扩增N基因，S1/S2引物扩增S1基因。将二者的PCR产物用PCR产物回收试剂盒进行回收浓缩去除影响酶切反应的因素，然后将回收产物分别进行进行双酶切，接着切胶回收用T4连接酶进行连接。

将含有S1和N基因的PCR产物分别用Apa I和BamH I及Apa I和Xho I双酶切，酶切的体系如下：

酶切反应的条件为：37℃3h。

连接体系：

在16℃连接过夜。

以2μL连接产物为模板，分别以N1/S2引物为上下引物进行PCR扩增得到N-S1的PCR产物，然后将其克隆入pMD18-T载体中。提取质粒后进行双酶切反应进行鉴定：

酶切反应的条件为：37℃3h。

再将质粒pMD-N-S1酶切产物与质粒PVAX1-Ub酶切产物用T4DNA连接酶进行连接。然后进行转化将连接产物克隆到PVAX1载体上得到重组质粒pVAX1-Ub-linker-N-S1。

1.2.4重组质粒的双酶切鉴定

用双酶切方法将得到的重组质粒pVAX1-Ub-linker-N-S1进行酶切。酶切反应结束后的产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，根据电泳结果判断重组基因是否插入载体。结果见图1，目的基因插入载体中且片段大小与预期一致。

1.2.5重组质粒的测序鉴定

对酶切鉴定的阳性重组质粒送测序公司进行测序进一步鉴定重组质粒构建是否正确及其目的片段是否准确无误的插入表达载体中。测序结果见序列表SEQ.ID.No.1的碱基序列，结果表明目的片段正确插入载体中且测序结果与预期完全一致。

1.2.6构建重组质粒的体外表达及其产物的检测

1.2.6.1构建重组质粒的体外转染

将pVAX1-Ub-linker-N质粒转染Vero细胞，其方法按转染试剂（Invitrogen公司，Lipofectamine2000，1.5mL）说明书进行。

1.2.6.2免疫荧光方法检测转染重组质粒的基因表达

（1）转染了不同质粒的Vero细胞在转染后48h，用0.01mol/L PBS漂洗3次，每次5min。（2）用配置好的固定液（丙酮）室温固定10min，PBS漂洗3次，每次5min。

（3）分别滴加适当稀释的鸡抗IBV多克隆抗体，放置于37℃的湿盒作用60min，PBS漂洗3次，每次5min。

（4）分别在各孔内滴加适当稀释的鼠抗鸡IgG（FITC标记），放置于37℃的湿盒避光作用45min，PBS漂洗3次，每次5min。

（5）封片用配置的中性甘油，然后用倒置的荧光显微镜观察并进行拍照。

结果见图2，左图是转染了重组质粒pVAX1-Ub-linker-N-S148h后的Vero细胞，出现了特异性的荧光信号；右图是转染了空载体pVAX148h后的Vero细胞，未出现特异性的荧光信号。

1.2.6.3RT-PCR方法检测重组质粒在Vero细胞中的表达

（1）将待检测细胞用胰酶从培养板上消化下来，将消化下来的细胞用PBS制成悬液移至离心管中，离心5min，漂洗两次去上清。

（2）加750μL Trizol于收集到的细胞，剧烈震荡均匀，4℃12000×g离心10min。

（3）取上清加0.5倍无水乙醇混匀。

（4）将溶液一起转入吸附柱，12000×g离心1min。

（5）弃去外套管中的液体，向吸附柱加入350μL去蛋白液，12000×g离心1min。

（6）弃去外套管中的液体，向吸附柱中加配置好的80μL DNase I，室温下作用15min后加入去蛋白液350μL于吸附柱中，12000×g离心1min。

（7）加入500μL去漂洗液，12000×g离心1min。

（8）重复上述的步骤一次。

（9）弃去液体将吸附柱套回原内套管，12000×g离心2min

（10）将吸附柱套入新的DEPC处理过干净的EP管中，在吸附柱的膜中央加入适量DEPC水，室温作用2min后12000×g离心2min。

RNA模板按MLV逆转录酶（宝生物工程（大连）有限公司，TaKaRa MLV，10000units）使用说明书合成第一链cDNA。以此cDNA为模板，用EXTaq聚合酶对N基因进行扩增，反应体系按EXTaq聚合酶（宝生物工程（大连）有限公司，TaKaRa EXTaq，250units）使用说明进行配制。

1.2.7重组质粒免疫效果的检测

1d龄SPF鸡20只，饲养至14d龄每组10只分成免疫组和对照组。免疫组雏鸡的DNA质粒免疫可分别经胸部进行多点肌肉注射，对照组用相同体积的PBS进行免疫。用鸡传染性支气管炎病毒GX-YL5株于35d进行点眼滴鼻攻毒，所有试验鸡于40d龄全部进行剖杀。

对照组鸡在感染IBV GX-YL5毒株4d后开始出现较为明显的临床症状，鸡群主要表现为呼吸啰音和鼻孔流鼻液，严重感染着出现张口呼吸和甩鼻等症状，符合IB发病的典型特征。免疫组在感染鸡传染性支气管炎病毒GX-YL5株后未出现临床症状，说明该重组质粒能用于预防鸡传染性支气管炎。

Claims

1.一种表达IBV的S1和N双抗原蛋白重组质粒，其特征在于由鸡传染性支气管炎病毒的S1、N基因、鸡的Ub基因和真核表达载体pVAX1组成,所述Ub基因通过一段编码(G₃S) ₄多肽的linker与将鸡的Ub基因与S1和N基因连接,该重组质粒的碱基序列如序列表SEQ.ID.No.1所示。

2.根据权利要求1所述的表达IBV的S1和N双抗原蛋白重组质粒，其特征在于：所述鸡传染性支气管炎病毒来自中国分离株GX-YL5株。

3.根据权利要求1所述表达IBV的S1和N双抗原蛋白重组质粒的构建方法，其特征在于用PCR方法扩增鸡传染性支气管炎病毒的S1、N和鸡的Ub基因，将鸡的Ub基因与鸡传染性支气管炎病毒的S1和N基因通过引入一段编码(G₃S)₄多肽的linker采用酶切位点相连的方法连接并将PCR产物经HindIII和XhoI双酶切定向插入以HindIII和XhoI双酶切处理的真核表达载体pVAX1中，即得Ub介导的鸡传染性支气管炎病毒的S1和N基因真核表达质粒pVAX1-Ub-linker-N-S1。

4.权利要求1所述表达IBV的S1和N双抗原蛋白重组质粒在制备预防鸡传染性支气管炎DNA疫苗方面的应用。