CN104694667B - 一种鸡传染性支气管炎活疫苗效力检测方法 - Google Patents

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Abstract

一种鸡传染性支气管炎活疫苗效力检测方法，它包括以下步骤：⑴设计引物；⑵病毒稀释、接种及培养；⑶病毒收获；⑷PCR检测；⑸毒价计算。本发明操作简单，测定条件均一，可控性强，批间误差小，缩短了鸡传染性支气管炎病毒效价的检测周期，适用范围广。

Description

一种鸡传染性支气管炎活疫苗效力检测方法
技术领域
本发明涉及一种疫苗效力的检测方法，尤其是一种鸡传染性支气管炎活疫苗效力检测方法，属于生物技术领域。
背景技术
鸡传染性支气管炎病（Infectious Bronchitis，IB），是一种由冠状病毒科的传染性支气管炎病毒（Infectious Bronchitis Virus，IBV）引起的鸡的急性、高度接触性传染病，给全世界养鸡业带来了巨大损失。目前，接种疫苗是防治该病的有效措施。因此鸡传染性支气管炎活疫苗半成品毒液和成品疫苗的效力检测（效价检测）非常重要。
目前，鸡传染性支气管炎活疫苗效力检测的标准方法是鸡胚感染法（半数鸡胚感染量，EID50），《中华人民共和国兽药典》（三部，2010年版）（以下简称《中国兽药典》）中具体描述：按瓶签注明羽份，将疫苗用无菌生理盐水稀释成1羽份/0.1ml，然后作10倍系列稀释，取3个适宜稀释度，各尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚5枚，每胚0.1ml，置37℃下孵育144h，24h以内死亡的鸡胚弃去不计，根据接种后24～144h的死胚及144h活胚中具有胎儿失水、蜷缩、发育小（接种胎儿比对照最轻胎儿重量低2g以上）等特异性病痕者的鸡胚总数计算EID50。每羽份应不低于103.5EID50。鸡胚感染法是当前精确定量的常用方法，已成为病毒学研究和活病毒生物制品质量监测的重要方法。
大多数IBV致鸡胚病变，病毒经尿囊腔途径接种到10～11日龄鸡胚后生长良好，病毒接种后数天可看到特征性的鸡胚变化，在照蛋时矮小胚仅有轻微的活动，打开鸡胚的气室端，可见鸡胚缩成球状，爪畸形，压在头上，羊膜增厚并与胚体粘连。经系列稀释病毒接种鸡胚后，鸡胚出现规律性的死亡和特征性的鸡胚病变，这类IBV效价测定时适用鸡胚感染法。国内常用的疫苗毒株H120株、H52株、M41株、W93株均适用。
但有一部分IBV不致鸡胚病变或病变不明显。病毒经尿囊腔途径接种到10～11日龄鸡胚后数天，鸡胚很少有死亡，且病变不明显，数次传代后，病变依旧不明显，经系列稀释病毒接种鸡胚后，病变鸡胚数量少且不规律。这样给鸡胚感染法结果判定带来直接的影响，效价测定结果大相径庭，是毒价低还是该种方法对其不适用？这为该病毒的研究带来了巨大的困难。鉴于当前鸡胚感染法存在的不足以及近几年部分新发现流行毒株的特点，找到一种适合检测该类病毒（罕见胚胎死亡，不致鸡胚病变或病变不明显，无法依据鸡胚病变判定效价）效价的有效方法刻不容缓。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有效力检测方法之缺陷、提供一种PCR与鸡胚感染法相结合来测定鸡传染性支气管炎活疫苗效力的检测方法，以提高效力检测精确度。
本发明所述技术问题是由以下技术方案解决的。
一种鸡传染性支气管炎活疫苗效力的检测方法，它包括以下步骤：
⑴设计引物：引物对1，其上游引物F1、下游引物R1序列分别为：
F1： SEQ ID NO.1；（5’- GACAAGCAGAGTCTTGT -3’）；
R1： SEQ ID NO.2；（ 5’- GCAACCCACACTATACC -3’）；
引物对2，其上游引物F2、下游引物R2序列分别为：
F2： SEQ ID NO.3；（5’- AACAAGGTAGTTGTCCATTG -3’）；
R2： SEQ ID NO.4；（5’- CCATTAATAAAGTAGGCTAGGGC -3’）；
引物对3，其上游引物F3、下游引物R3序列分别为：
F3： SEQ ID NO.5；（5’- CAGGTATGGCTTGGTCTAGCAG -3’）；
R3： SEQ ID NO.6；（5’- CTGAGCTGTTTGTGTTTGGTAAGT -3’）；
⑵病毒稀释、接种及培养：鸡传染性支气管炎病毒待检样品作10倍系列稀释，取3个适宜稀释度，各尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚5枚，每胚0.1ml，置37℃下继续孵育；
⑶病毒收获：病毒接种后，24h时照蛋1次，弃去死胚不用，72h时将鸡胚置于2～8℃中冷却4～24h，气室向上直立。无菌收集尿囊液，标记，-20℃保存备用；
⑷PCR检测：
a.提取总RNA：将待检样品尿囊液、阴性对照和阳性对照分别取样300µl，提取总RNA，以20µl无RNA酶水溶解；
b.RT-PCR反应：RT-PCR反应体系为25µl，包括：10×PCR buffer 2.5µl；dNTPMixture(10mM each) 2.5µl；25mM MgCl2 5µl；RNA酶抑制剂0.5µL；反转录酶0.5µL；Taq酶0.5µl；上游引物(10µM) 1µl；下游引物(10µM) 1µl；总RNA溶解液 3.5µl；ddH2O 8µl。RT-PCR反应程序为：50℃30min； 95℃预热2min；94℃变性40s，51℃复性30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min。
c.电泳分析：取5µl PCR产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳，而后以凝胶成像系统进行分析，出现特定大小的目的条带者即判断为阳性（该鸡胚鸡传染性支气管炎病毒感染阳性）。
⑸ 毒价计算：统计接种后72h时的鸡胚尿囊液（包括24～72h死亡胚和72h活胚）PCR检测阳性的鸡胚总数，按照Reed-Muench法计算病毒液或活疫苗的效价。
步骤⑴、⑷中，使用的引物对1设计在鸡传染性支气管炎病毒基因组保守区N蛋白基因上，扩增目的片段大小为438bp；引物对2设计在鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白基因上，目的片段大小为292bp；引物对3设计在鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白基因上，目的片段大小为635bp。
步骤⑵中，待检样品为鸡传染性支气管炎病毒毒液或活疫苗。若待检样品为病毒毒液，直接用无菌生理盐水或PBS作10倍系列稀释；若待检样品为活疫苗，按瓶签注明羽份将疫苗用无菌生理盐水或PBS稀释成1羽份/0.1ml，然后作10倍系列稀释。
步骤⑷中三对引物的RT-PCR反应体系和反应程序相同。
步骤⑸中，如果孵育24～36h各稀释度毒液接种的鸡胚均60%以上（包括60%）存活；且计算的病毒效价落在各个稀释度之间，阳性/阴性比率反映出系列稀释的效果，检测结果视为有效。
由于采用如上所述的技术方案，本发明具有如下优点：
（1）本发明PCR与鸡胚感染法相结合，同传统鸡胚感染法相比，避免了目测的误差和人为因素导致的结果误差，使得测定条件均一、可控性强，特异性强，敏感度高，批间误差小。
（2）本发明既可以检测致鸡胚病变类鸡传染性支气管炎病毒，又可以检测不致鸡胚病变或病变不明显类鸡传染性支气管炎病毒，适用范围更广。
（3）传统的鸡胚感染法中结果判定依赖于病变和胚胎体重变化，要求检测用蛋大小均匀一致。本发明方法检测用蛋为任意选择的普通SPF鸡胚，不限定大小差异，材料选择范围更宽。
（4）与传统的检测方法相比，检测周期缩短了66～68h，大大提高了检测效率。
（5）本发明不直接检测待检毒液，检测的是各梯度稀释病毒培养产物鸡胚尿囊液，不受待检毒液中失活病毒影响，避免了普通PCR方法假阳性（PCR方法既能检测活病毒，又能检测失活病毒），检测结果更准确。
（6）本发明三对引物的RT-PCR反应条件完全相同，可同时检测几种不同毒株的效价，大大节省了时间成本，降低了对试验设备的要求，且使用普通PCR仪即可，不需使用梯度PCR仪。
（7）本发明PCR方法既有通用引物，能用于区分传支病毒和其它禽类病毒；又有特异性引物，能用于鸡传染性支气管炎病毒分型鉴定。
附图说明
图1 第一组接毒72h时PCR凝胶电泳图；
图2 第一组接毒144h时PCR凝胶电泳图；
图3 引物对2的PCR凝胶电泳图；
图4 引物对3的PCR凝胶电泳图；
图5 第一组引物对1的PCR凝胶电泳图；
图6 第一组引物对2的PCR凝胶电泳图；
图7 第一组引物对3的PCR凝胶电泳图；
图8 引物对1特异性试验PCR凝胶电泳图；
图9 引物对2特异性试验PCR凝胶电泳图；
图10 引物对3特异性试验PCR凝胶电泳图。
图1～图4坐标中标号：M为DL2000 Marker；＋为阳性对照；－为阴性对照；1～5为10-3稀释度5个样；6～10为10-4稀释度5个样；11～15为10-5稀释度5个样；
图5～图7坐标中标号：M为DL2000 Marker；＋为阳性对照；－为阴性对照；1～5为10-5稀释度5个样；6～10为10-6稀释度5个样；11～15为10-7稀释度5个样；
图8和图10坐标中标号：M为DL2000 Marker；1为H120株；2为H52株，3为M41株；4为W93株；5为RP-1；6为NDV LaSota株；7为AIV Hp株；8为 IBDV B87株；－为阴性对照；
图9坐标中标号：M为DL2000 Marker；1为RP-1；2为H120株；3为H52株，4为M41株；5为W93株；6为NDV LaSota株；7为AIV Hp株；8为 IBDV B87株；－为阴性对照；
图1～图10坐标中标号：a：2000bp；b：1000bp；c：750bp；d：500bp；e：250bp；f：100bp。
具体实施方式
为使本发明更容易理解，下面结合具体实施例进一步阐述本发明，本实施例仅用于说明本发明而不是为了限定本发明权利的保护范围。
实施例所用实验材料如下：
（1）Trizol（总RNA提取试剂）、一步法RNA PCR试剂盒（One Step RNA PCR Kit(AMV)）、6×Loading Buffer均购自宝生物工程（大连）有限公司。
（2）溴化乙锭购自SIGMA公司。
（3）TAE：40mmol/L Tris-乙酸盐，1mmol/L EDTA。
（4）0.8%琼脂糖凝胶：将0.8g琼脂糖溶解于100mlTAE（琼脂糖凝胶电泳缓冲液），加热溶解，冷却凝固配制而成。
（5））氯仿、异丙醇、乙醇为分析纯。
（6）SPF种蛋购自济南赛斯家禽科技有限公司。
（7）RT-PCR引物如下：
引物对1：F1: 5’- GACAAGCAGAGTCTTGT -3’，
R1: 5’- GCAACCCACACTATACC -3’
引物对2：F2: 5’- AACAAGGTAGTTGTCCATTG -3’，
R2: 5’- CCATTAATAAAGTAGGCTAGGGC -3’
引物对3：F3: 5’- CAGGTATGGCTTGGTCTAGCAG -3’，
R3: 5’- CTGAGCTGTTTGTGTTTGGTAAGT -3’，
引物由北京擎科新业生物技术有限公司合成产品。
实施例1
鸡传染性支气管炎活疫苗（H120株）效力检测对比试验
1、材料
鸡传染性支气管炎活疫苗（H120株）：瑞普（保定）生物药业有限公司生产，1000羽份/瓶，批号为140504。
2、方法
（1）病毒稀释接种及培养
按瓶签注明羽份将疫苗用无菌生理盐水稀释成1羽份/0.1ml，然后作10倍系列稀释。取10-3、10-4、10-5 3个稀释度，分别经尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚，每个稀释度接种5枚，每胚0.1ml，同一稀释度平行接种2组，并设生理盐水阴性对照，置37℃下继续孵育。接种后24h时照蛋1次，弃去死胚。
（2）病毒收获
第一组：本发明方法 病毒接种后72h时无菌抽取鸡胚尿囊液0.4ml（包括24～72h死亡胚和72h活胚），-20℃保存，标记备用，并保证鸡胚正常存活。继续孵育，至144h时将剩余鸡胚置于2-8℃中冷却24h，气室向上直立，无菌收集尿囊液（包括24～144h死亡胚和144h活胚）于离心管。标记备用。同时对24～144h死胚及144h活胚，判定鸡胚病变和胎儿称重。
第二组：鸡胚感染法 病毒接种后144h时将鸡胚置于2-8℃中冷却24h，气室向上直立。判定鸡胚病变和胎儿称重。
（3）提取总RNA：将第一组两批待检尿囊液和对照分别取样300µl，应用Trizol法提取总RNA，以20µl无RNA酶水溶解，即得总RNA溶解液。
（4）RT-PCR反应
① PCR引物选用引物对1。
② RT-PCR反应
RT-PCR反应体系（25μl）配制如下表1所示：
表1 PCR反应体系（25µl）
RT-PCR反应程序为：50℃30min； 95℃预热2min；94℃变性40s，51℃复性30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min。
（5）电泳分析：取5μl PCR产物，加入6×Loading Buffer 1μl；DL 2000 Marker 5μl，0.8%琼脂糖凝胶中进行电泳，凝胶成像系统观察结果，出现约438bp的目的条带者即判断为阳性（该鸡胚鸡传染性支气管炎病毒感染阳性）。
（6）毒价计算：
第一组统计接种后24～72h的死胚及72h活胚尿囊液PCR检测阳性的鸡胚总数。如果孵育24～36h各稀释度毒液接种的鸡胚均60%以上（包括60%）存活，且计算的病毒效价落在各个稀释度之间，阳性/阴性比率反映出系列稀释的效果，检测结果视为有效。按照Reed-Muench法计算病毒液的效价。144h收获的尿囊液用类似的方法计算毒价。
第二组根据接种后24～144h死胚及144h活胚中，其胎儿具有失水、蜷缩、发育小（接种胎儿比对照最轻胎儿重量低2g以上）等特异性病痕者的总和，按照Reed-Muench法计算EID50。
3、试验结果
（1）第一组接毒后72h时PCR凝胶电泳图见图1，接毒后144h时PCR凝胶电泳图见图2，统计结果见表2。
表2 第一组接毒后72h、144h结果统计
。
第一组按本发明方法，病毒接种后72h取样测定，计算鸡传染性支气管炎活疫苗（H120株）效价为103.9EID50/羽份。病毒接种后144h取样测定，计算鸡传染性支气管炎活疫苗（H120株）效价为103.9EID50/羽份。
同时对第一组用鸡胚感染法判定鸡胚病变和胎儿称重，发现用鸡胚感染法判定为感染的鸡胚，其PCR检测结果均为阳性，且一一对应。
（2）第二组鸡胚感染法效价测定结果
表3 第二组鸡胚感染法结果统计
。
第二组鸡胚感染法， 接种后24～144h 10-3稀释度死亡鸡胚4枚，10-4稀释度死亡鸡胚1枚，死亡胚胚体出血，个体小；144h活胚中，10-3稀释度有1枚鸡胚蜷缩成球状，体重较轻；10-4稀释度有1枚鸡胚干缩，爪弯曲，呈抱头姿势，体重较轻。以上有死亡、有病变、有体重减轻的鸡胚判为感染，计算鸡传染性支气管炎活疫苗（H120株）效价为103.9EID50/羽份。
4、结论
（1）标准的鸡胚感染法和本发明方法检测鸡传染性支气管炎活疫苗（H120株）效力，结果基本一致；本试验结果显示，与常规认识不同，鸡传染性支气管炎病毒H120株具有在感染导致病变和增殖导致感染两方面一致性表现的特性。
（2）本发明方法在病毒接种后72h和接种后144h 进行PCR检测，效价一致，均为103.9EID50/羽份，病毒收获时间提前到72h，不影响效价判定的准确性。
实施例2
3对引物对鸡传染性支气管炎活疫苗（H120株）效力检测对比试验
1、材料同实施例1。
2、方法：
按照实施例1第一组的方法，接毒后72h时无菌收集尿囊液进行检测。用引物对1、引物对2、引物对3分别对同一尿囊液的总RNA进行RT-PCR检测。
3、试验结果
（1）引物对1的检测结果同实施例1；引物对2的PCR凝胶电泳图见图3；引物对3的PCR凝胶电泳图见图4。
（2）3对引物效价测定结果见表4。
表4 3对引物效价测定结果统计
。
4、结论
本发明方法引物对1和引物对3检测鸡传染性支气管炎活疫苗（H120株），结果完全一致，效价均为103.9EID50/羽份，引物对1和引物对3均可用于鸡传染性支气管炎病毒H120株效价的测定。引物对2检测样品均为阴性，疫苗效价为0，不能用于鸡传染性支气管炎病毒H120株效价的测定。
实施例3
鸡传染性支气管炎活疫苗（H52株）效力检测对比试验
鸡传染性支气管炎活疫苗（H52株）：瑞普（保定）生物药业有限公司生产，1000羽份/瓶。
同实施例1、2方法，用标准的鸡胚感染法和本发明方法（3对引物）同时测定鸡传染性支气管炎活疫苗（H52株）效价。引物对1、引物对3和鸡胚感染法检测结果相一致，均为104.3EID50/羽份；引物对2检测效价为0，不能用于鸡传染性支气管炎病毒H52株效价的测定。
实施例4
鸡传染性支气管炎病毒M41株病毒液效力检测对比试验
鸡传染性支气管炎病毒M41株，购自中国兽医药品监察所。
同实施例1、2方法，用标准的鸡胚感染法和本发明方法（3对引物）同时测定鸡传染性支气管炎病毒M41株毒液效价。引物对1、引物对3和鸡胚感染法检测结果相一致，均为106.9EID50/0.1ml；引物对2检测效价为0，不能用于鸡传染性支气管炎病毒M41株效价的测定。
实施例5
鸡传染性支气管炎活疫苗（W93株）效力检测对比试验
鸡传染性支气管炎活疫苗（W93株）：购自辽宁益康生物股份有限公司，1000羽份/瓶。
同实施例1、2方法，用标准的鸡胚感染法和本发明方法（3对引物）同时测定鸡传染性支气管炎活疫苗（W93株）效价。引物对1、引物对3和鸡胚感染法检测结果相一致，均为103.9EID50/羽份；引物对2检测效价为0，不能用于鸡传染性支气管炎病毒W93株效价的测定。
实施例6
鸡传染性支气管炎病毒RP-1株效力检测对比试验
1、材料
鸡传染性支气管炎病毒RP-1株（IBV RP-1株）是瑞普（保定）生物药业有限公司2010年由河北省某发病鸡场分离得到，经分子生物学试验、血清学试验等方法，鉴定为鸡传染性支气管炎病毒，命名为鸡传染性支气管炎病毒RP-1株，于2014年11月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：V201436。
经与Genbank上已发表的鸡传染性支气管炎病毒4/91(UK)株序列JN192154.1比对，发现IBV RP-1株与IBV 4/91(UK)株同源性较高，S1基因核苷酸相似性99.0%以上。根据血清学和气管环交叉中和试验证实IBV 4/91高免血清对RP-1株有很高的中和指数。研究中发现，IBV RP-1株很少致死鸡胚，且鸡胚病变不明显，特征性侏儒胚较少，应用鸡胚感染法测定效价时，病变鸡胚数量少且呈现散在不规律分布。
IBV RP-1株F5代毒液接种10日龄SPF鸡胚复壮得F6代毒液。
2、方法
（1）病毒稀释接种及培养
F6代毒液用无菌生理盐水作10倍系列稀释，第一组（本发明方法组）取10-5、10-6、10-7 3个稀释度，第二组（鸡胚感染法组）取10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7 7个稀释度，分别经尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚，每个稀释度接种5枚，每胚0.1ml，并设生理盐水阴性对照，置37℃下继续孵育。接种后24h时照蛋1次，弃去死胚。
（2）病毒收获
第一组：72h时将鸡胚置于2～8℃中冷却24h，气室向上直立。无菌收集尿囊液，标记，-20℃保存备用；
第二组：病毒接种后144h时将鸡胚置于2～8℃中冷却24h，气室向上直立。判定鸡胚病变和胎儿称重。
（3）PCR检测
同实施例2方法，用引物对1、引物对2、引物对3分别对第一组收获尿囊液和对照进行PCR检测。
3、结果
（1）第一组引物对1的PCR凝胶电泳图见图5，引物对2的PCR凝胶电泳图见图6，引物对3的PCR凝胶电泳图见图7。
（2）第二组鸡胚感染法检测结果见表5。
表5 鸡胚感染法检测结果统计
。
第二组鸡胚感染法，接种后24～144h，各稀释度均无鸡胚死亡。144h活胚中10-1稀释度有1枚鸡胚表现蜷缩，体重较轻；10-2稀释度有1枚鸡胚表现肌肉干缩、爪弯曲；10-3稀释度有2枚鸡胚表现失水，个体小，体重轻；10-5稀释度有1枚鸡胚表现个体小，体重略轻；其它稀释度鸡胚表现无异常。计算IBV RP-1株毒液效价为101.5EID50/0.1ml。
（3）两组测定效价结果对比见表6
表6 两组测定效价结果对比
。
4、结论
（1）本发明方法检测IBV RP-1株效价远高于鸡胚感染法效价。IBV RP-1株致鸡胚病变不明显，病变鸡胚数量少且不规律，鸡胚感染法检测结果阳性/阴性比率不能反映出系列稀释的效果，鸡胚感染法不适用于检测IBV RP-1株。
（2）本发明方法检测IBV RP-1株，引物对1和引物对2检测结果一一对应，保持一致，效价测定结果均为106.9EID50/0.1ml，引物对1和引物对2均可用于IBV RP-1株效价的测定。引物对3检测样品均为阴性，毒液效价为0，不能用于该毒株效价的测定。
实施例7
重复性试验
应用本发明方法，对实施例1中鸡传染性支气管炎活疫苗（H120株）疫苗进行3次重复检测，3次结果均为103.9EID50/羽份，重复性较好。
实施例8
3对引物的特异性实验
1、材料
鸡传染性支气管炎病毒（IBV）RP-1株、H120株、H52株、M41株、鸡新城疫病毒LaSota株（NDV LaSota株）、禽流感病毒Hp株（AIV Hp株）、鸡传染性法氏囊病毒B87株（IBDV B87株）均由瑞普（保定）生物药业有限公司种毒室提供，IBV W93株购自辽宁益康生物股份有限公司疫苗。
2、方法
3对引物同时进行，提取总RNA、RT-PCR反应、电泳分析均同实施例1。
3、结果
（1）引物对1特异性试验结果见图8；应用引物对1，所有IBV毒株均可扩增出目的条带，NDV LaSota株、AIV Hp株、IBDV B87株扩增结果均为阴性。
（2）引物对2特异性试验结果见图9；应用引物对2，仅IBV RP-1株可扩增出目的条带，其它扩增结果均为阴性。
（3）引物对3特异性试验结果见图10。应用引物对3，IBV H120株、H52株、M41株、W93株可扩增出目的条带，IBV RP-1株、NDV LaSota株、AIV Hp株、IBDV B87株扩增结果均为阴性。
4、结论
引物对1适合于各型鸡传染性支气管炎病毒效价的测定，通用性强；引物对2适合于不致鸡胚病变的RP-1株效价的测定；引物对3适用于国内常用的疫苗毒株H120株、H52株、M41株、W93株效价的测定，不能用于RP-1株效价的测定。3对引物对其它几种常见的禽类病毒均检测阴性，特异性好。

Claims (4)

1.一种鸡传染性支气管炎活疫苗效力检测方法，其特征是，包括以下步骤：
⑴设计引物：引物对1，其上游引物F1、下游引物R1序列分别为：
F1：SEQ ID NO.1；
R1：SEQ ID NO.2；
引物对2，其上游引物F2、下游引物R2序列分别为：
F2：SEQ ID NO.3；
R2：SEQ ID NO.4；
引物对3，其上游引物F3、下游引物R3序列分别为：
F3：SEQ ID NO.5；
R3：SEQ ID NO.6；
所述引物对1～引物对3分别用于不同的RT-PCR反应；
⑵病毒稀释、接种及培养：鸡传染性支气管炎病毒待检样品作10倍系列稀释，取3个适宜稀释度，各尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚5枚，每胚0.1ml，置37℃下继续孵育；
⑶病毒收获：病毒接种后，24h时照蛋1次，弃去死胚不用，72h时将鸡胚置于2～8℃中冷却4～24h，气室向上直立；无菌收集尿囊液，标记，-20℃保存备用；
⑷PCR检测：
a.提取总RNA：将待检样品尿囊液、阴性对照和阳性对照分别取样300μl，提取总RNA，以20μl无RNA酶水溶解；
b.RT-PCR反应：RT-PCR反应体系为25μl，包括：10×PCR buffer 2.5μl；dNTP Mixture2.5μl，浓度为10mmol/L；25mM MgCl2 5μl；RNA酶抑制剂0.5μL；反转录酶0.5μL；Taq酶0.5μl；10μmol/L的上游引物1μl；10μmol/L的下游引物1μl；总RNA溶解液3.5μl；ddH2O 8μl；RT-PCR反应程序为：50℃30min；95℃预热2min；94℃变性40s，51℃复性30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min；
c.电泳分析：取5μl PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳，而后以凝胶成像系统进行分析，出现特定大小的目的条带者即判断为阳性；
⑸毒价计算：统计接种后72h时鸡胚尿囊液PCR检测呈阳性的鸡胚总数，所述鸡胚尿囊液源自24～72h死亡胚和72h活胚，按照Reed-Muench法计算病毒液或活疫苗的效价；
如果孵育24～36h各稀释度毒液接种的鸡胚均60％以上存活；且计算的病毒效价落在各个稀释度之间，阳性/阴性比率反映出系列稀释的效果，检测结果视为有效。
2.根据权利要求1所述的一种鸡传染性支气管炎活疫苗效力检测方法，其特征是：步骤⑴和步骤⑷中，使用的引物对1设计在鸡传染性支气管炎病毒基因组保守区N蛋白基因上，扩增目的片段大小为438bp；引物对2设计在鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白基因上，目的片段大小为292bp；引物对3设计在鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白基因上，目的片段大小为635bp。
3.根据权利要求2所述的一种鸡传染性支气管炎活疫苗效力检测方法，其特征是：步骤⑵中，待检样品为鸡传染性支气管炎病毒毒液或活疫苗；若待检样品为病毒毒液，直接用无菌生理盐水或PBS作10倍系列稀释；若待检样品为活疫苗，按瓶签注明羽份将疫苗用无菌生理盐水或PBS稀释成1羽份/0.1ml，然后作10倍系列稀释。
4.根据权利要求3所述的一种鸡传染性支气管炎活疫苗效力检测方法，其特征是：步骤⑷中三对引物的RT-PCR反应体系和反应程序相同。
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