KR102570821B1

KR102570821B1 - 재조합 바이러스 벡터 및 이를 이용한 약학 조성물

Info

Publication number: KR102570821B1
Application number: KR1020200162825A
Authority: KR
Inventors: 남재환; 김재용
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2020-11-27
Filing date: 2020-11-27
Publication date: 2023-08-25
Also published as: KR20220074384A

Abstract

본 발명은 변이된 펩타이드를 암호화하는 염기 서열을 포함하는 재조합 바이러스 벡터와, 유전자 전달 컨스트럭트인 상기 바이러스 벡터의 약학적 유효량을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 재조합 바이러스 벡터는 중증열성혈소판감소증후군(SFTS)를 치료 또는 예방하기 위한 약학 조성물, 예를 들어 단백질 백신으로 활용될 수 있다.

Description

재조합 바이러스 벡터 및 이를 이용한 약학 조성물{RECOMBINANT VIRAL VECTOR AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION INCLUIDNG THEREOF}

본 특허출원은 대한민국정부 교육부의 산학공동기술개발과제(LINC) 사업의 일환으로서 "RNA 플랫폼을 기반으로 한 사이토카인 및 공동 자극이자 발현 면역증강제의 개발" (과제번호: LINCPLUS-2020-2, 과제수행기관: 가톨릭대학교 산학협력단) 과제의 연구 성과물에 관한 것이다.

본 발명은 재조합 벡터에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 중증열성혈소판감소증후군(SFTS)을 치료 또는 예방하는데 활용될 수 있는 재조합 바이러스 벡터 및 이를 이용한 약학 조성물에 관한 것이다.

중증열성혈소판감소증후군 (Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome, SFTS)은 혈소판 감소, 고열, 설사, 백혈구 감소 등의 증상을 나타낸다. 2009년에 중국에서 SFST 증상을 보이는 환자들이 집단으로 발생하였고 역학조사 결과 SFTS의 원인은 바이러스에 의해 유발되는 질병이라는 것을 확인하였다. 한국, 중국, 일본 등에서 지속적으로 환자가 발생하며 지역에 따라 10-30%정도의 사망률을 보이고 있다.

SFTS는 주로 SFTSV를 가지고 있는 참진드기에 의한 교상(咬傷)으로 매개되어지나 현재는 혈액이나 체액을 통한 사람 사이의 전파도 보고되어 있다. 최근 SFTSV는 Huaiyangshan banyangvirus로 재-명명되었으며, 진드기 유래 바이러스이다. 우리나라의 경우 2013년 첫 환자 보고 이후 2013년에 36명, 2014년에 55명, 2016년에 165건, 2017년과 2018년에는 270건 내외가 보고되었다. 야외 활동이 증가하고 진단법이 발전하고 있다는 점을 고려할 때, 연간 SFTS 감염 환자수는 조만간 300명을 넘을 것으로 판단된다. 우리나라의 경우 진드기가 활동하는 시기인 4~11월에 주로 SFTS 환자가 발생하는데, 환자들은 대부분 50대 이상이며, 성별에는 차이가 없는 것으로 보인다.

국내에서 2013년 이후 지속적으로 SFTS 감염 환자가 발생하고 있으며 사망률이 20% 가까이 됨에도 불구하고 현재까지 임상에 적용 가능한 치료제 및 예방용 백신이 개발되어 있지 않다. 국내에 서식하는 작은소피참진드기 및 SFTSV 환자 혈청에서 분리된 SFTS 전체 유전자의 염기서열이 이미 분석되었다. SFTSV는 이미 알려진 것처럼 3개의 유전자로 분절되어 있는 전형적인 Phlebovirus 속에 속하는 바이러스이다. 게놈은 크게 6368 뉴클레오타이드 길이의 L 분절, 3378 뉴클레오타이드 길이의 M 분절, 1746 뉴클레오타이드 길이의 S분절로 구성되어 있다. 국내에서 서식하는 SFTSV의 유전자형은 A, B, D, F 타입인 것으로 알려져 있으며, B 타입이 주로 발견된다.

중국을 비롯하여 대한민국 및 일본에서 SFTSV 유전자 구조를 기반으로 SFTS에 대한 백신 개발이 이루어지고 있다. 그러나 일반적으로 SFTSV에 감염된 환자들로부터 유도되는 대부분의 항체가 뉴클레오캡시드 단백질(NP)이기 때문에, SFTS에 대한 백신을 개발하기 위해서는 이러한 문제점을 극복할 수 있어야 한다.

현재까지 발표된 SFTSV 백신 후보 중에서 방어 효능을 보여 준 플랫폼은 DNA 백신 플랫폼과 재조합 VZV 바이러스 플랫폼뿐이고, 현재 임상에 적용되고 있는 SFTSV 백신은 없다. SFTSV는 국내에서 지속적으로 환자가 발생하는 전염병으로 한탄바이러스, 쯔쯔가무시병과 더불어 국내 야외 활동에서 감염되는 대표적인 전염병이다. 그러나 SFTSV는 감염자가 매년 증가함에도 불구하고 실질적인 백신이나 치료제가 개발되어 있지 않아 국민 보건을 위협하고 있다. 따라서 SFTS를 치료 또는 예방할 수 있는 백신이나 치료제의 개발이 시급한 실정이다.

본 발명의 목적은 중증열성혈소판감소증후군을 효율적으로 치료 또는 예방하는데 사용될 수 있는 재조합 바이러스 벡터를 제공하고자 하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 재조합 발현 컨스트럭트를 유효 성분으로 포함하는, 중증열성혈소판감소증후군을 치료 또는 예방하기 위한 약학 조성물을 제공하고자 하는 것이다.

일 측면에 따르면, 서열식별번호: 1의 펩타이드를 암호화하는 핵산 분자가 삽입된 재조합 바이러스 벡터가 개시된다.

상기 재조합 바이러스 벡터는 인간 아데노바이러스 기반일 수 있으며, 예를 들어, 인간 아데노바이러스 타입 5 기반인 것일 수 있다.

일례로, 외래 유전자로 삽입되는 상기 핵산 분자는 서열식별번호: 2의 뉴클레오타이드 서열로 이루어질 수 있다.

다른 측면에서, 유전자 전달 컨스트럭트로서, 제 1항 내지 제 4항 중에서 어느 하나의 항에 기재된 재조합 바이러스 벡터를 유효 성분으로 포함하는, 중증열성혈소판감소증후군을 예방 또는 치료하기 위한 약학 조성물이 개시된다.

예를 들어, 상기 약학 조성물은 백신 조성물을 포함할 수 있다.

다른 측면에서, 서열식별번호: 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드가 개시된다.

또 다른 측면에서, 서열식별번호: 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 암호화하는 핵산 분자가 개시된다.

SFTSV에 의한 중증열성혈소판감소증후군을 예방 또는 치료할 수 있는 약학 조성물은 변이된 핵산 분자로부터 발현되는 펩타이드를 암호화하는 핵산 분자가 삽입된 재조합 바이러스 발현 벡터를 포함한다.

재조합 바이러스 발현 벡터를 생체에 투여하여, 생체 내에서 Th1 면역 반응과 Th2 면역 반응을 효율적으로 유도할 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 재조한 바이러스 발현 벡터는 중증열성혈소판감소증후군을 효율적으로 예방 또는 치료할 수 있는 백신과 같은 약품의 유효성분으로 활용될 수 있다.

도 1a 내지 도 1d는 각각 본 발명의 예시적인 실시예에 따라 재조합 바이러스 벡터를 마우스에 주입, 면역시킨 뒤, 마우스 혈청에서 분비된 면역글로불린을 ELISA로 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 본 발명의 예시적인 실시예에 따라 재조합 바이러스 벡터를 마우스에 주입, 면역시킨 뒤, 마우스 혈청에서 생성된 바이러스 특이적 중화 항체를 FRNT50으로 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 3a 내지 도 3d는 각각 본 발명의 예시적인 실시예에 따라 재조합 바이러스 벡터를 마우스에 주입, 면역시킨 뒤, 마우스 혈청에서 분비된 면역글로불린을 ELISA로 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 본 발명의 예시적인 실시예에 따라 재조합 바이러스 벡터를 마우스에 주입, 면역시킨 뒤, 마우스 혈청에서 생성된 바이러스 특이적 중화 항체를 FRNT50으로 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 5a 내지 도 5d는 각각 본 발명의 예시적인 실시예에 따라 재조합 바이러스 벡터를 마우스에 주입, 면역시킨 뒤, 마우스 혈청에서 분비된 면역글로불린을 ELISA로 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 6은 본 발명의 예시적인 실시예에 따라 재조합 바이러스 벡터를 마우스에 주입, 면역시킨 뒤, 마우스의 체중 변화를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 예시적인 실시예에 따라 재조합 바이러스 벡터를 마우스에 주입, 면역시킨 뒤, 마우스 비장의 무게를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명의 예시적인 실시예에 따라 재조합 바이러스 벡터를 마우스에 주입, 면역시킨 뒤, 마우스 비장에서 바이러스 titer를 실시간 PCR을 이용하여 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

이하, 필요한 경우에 첨부하는 도면을 참조하면서 본 발명을 설명한다.

SFTSV는 감염자가 매년 증가함에도 불구하고 실질적인 백신이나 치료제가 개발되어 있지 않아 국민 보건을 위협하고 있다. 따라서 신속하게 백신을 개발하기 위해서는 불활화(Inactivated) 백신이 우선 고려될 수 있다. 불활화 백신의 경우, 한타바이러스 백신에서 볼 수 있듯이 면역 유도 반응에 문제점이 있을 수 있어 최적의 면역증강제(adjuvant)를 선택하여 불활화 백신의 단점을 보완 할 필요가 있다.

한편, 단백질 백신은 항원 단백질을 직접 몸에 주입하는 방식으로 백신 전략 중 가장 많이 사용되고 있는 기술이다. 이미 구제역 백신, 폐렴구균백신 등 사례가 많고 코로나19 백신 후보물질의 약 40%가 단백질 백신의 형태이다. 바이러스의 유전체가 존재하지 않아 안전성이 높고 개발 속도가 빠르다. 따라서 이러한 SFTSV에 대한 백신으로서 안전하고 효과적인 단백질 백신의 개발은 중요한 과제이다.

기존의 단백질 기반 백신 및 불활화 백신은 1회 면역만으로는 충분한 방어 효과가 없어 위급 상황 시에 백신 접종자가 빠르게 방어 면역 반응을 확보 할 수 없음. 2015년 MERS 사태를 예로 들면 첫 번째 환자발병 후 매우 빠르게 병원을 중심으로 감염 환자가 발생하고 있어 이런 경우 기존 백신처럼 일차 면역 후 boosting이 필요하다면, 위기 대응 백신으로 사용하기 어렵다. 따라서 1회 면역만으로도 충분한 방어면역 효과를 주는 백신을 개발하기 위해서는 안전하면서도 면역 반응 유도 효과가 강한 면역증강제를 사용하여야 한다.

백신 개발 방법 중 재조합 단백질을 기반으로 하는 항원 백신의 경우에도 개발을 빠르게 할 수 있는 장점이 있음에도 불구하고, Th1/Th2 반응이 약하게 유도되어 면역 반응이 강하지 않은 등 항원 특이 면역 유도 반응의 질이 낮아 방어 면역 효과가 낮을 수 있어 이를 극복하기 위해서 백신 보조제로서 다양한 면역증강제 (adjuvant)가 필요하다.

본 발명은 서열식별번호: 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 서열식별번호: 2의 뉴클레오타이드 서열)이 표적 서열로서 삽입된 재조합 바이러스 벡터가 SFST를 효율적으로 치료 또는 예방한다는 점에 근거한다.

본 명세서에서 용어 “아미노산”은 가장 넓은 의미로 사용되고, 자연-발생 L-아미노산 또는 잔기를 포함하는 것으로 의도된다. 자연-발생 아미노산에 대해 통상적으로 사용되는 1-문자 약어 및/또는 3-문자 약어가 본 명세서에 사용될 수 있다.

아미노산은 D-아미노산뿐만 아니라 화학적으로-변형된 아미노산, 예컨대 아미노산 유사체, 단백질에 통상적으로 혼입되지 않는 자연-발생 아미노산, 예컨대 노르류신과 같이 아미노산의 특징인 것으로 당업계에 공지된 특성을 갖는 화학적으로-합성된 화합물을 포함한다. 예를 들어, 천연 Phe 또는 Pro와 동일한 펩타이드 화합물의 입체형태 제한을 허용하는 페닐알라닌 또는 프롤린의 유사체 또는 모방체가 아미노산의 정의 내에 포함된다. 이러한 유사체 및 모방체는 본 명세서에서 아미노산의 "기능적 균등물"로서 지칭된다. 아미노산의 다른 예는 문헌 [Roberts and Vellaccio, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Eds. Gross and Meiehofer, Vol. 5, p. 341(Academic Press, Inc.: N.Y. 1983)]에 열거되어 있다.

예를 들어, 표준 고체-상 합성 기술에 의해 합성된 합성 펩타이드는 유전자에 의해 암호화되는 아미노산으로 제한되지 않으며, 이에 따라 주어진 아미노산에 대해 보다 광범위하게 다양한 치환을 허용한다. 유전자 코드에 의해 암호화되지 않는 아미노산은 본 명세서에서 "아미노산 유사체"로 지칭될 수 있다. 예를 들어, 아미노산 유사체는 Glu 및 Asp에 대한 2-아미노 아디프산 (Aad); Glu 및 Asp에 대한 2-아미노피멜산 (Apm); Met, Leu 및 다른 지방족 아미노산에 대한 2-아미노부티르산 (Abu); Met, Leu 및 다른 지방족 아미노산에 대한 2-아미노헵탄산 (Ahe); Gly에 대한 2-아미노부티르산 (Aib); Val, Leu 및 Ile에 대한 시클로헥실알라닌 (Cha); Arg 및 Lys에 대한 호모아르기닌 (Har); Lys, Arg 및 His에 대한 2,3-디아미노프로피온산(Dap); Gly, Pro 및 Ala에 대한 N-에틸글리신 (EtGly); Gly, Pro 및 Ala에 대한 N-에틸글리신 (EtGly); Asn 및 Gln에 대한 N-에틸아스파라긴 (EtAsn); Lys에 대한 히드록시리신 (Hyl); Lys에 대한 알로히드록시리신 (AHyl); Pro, Ser 및 Thr에 대한 3-(및 4-)히드록시프롤린 (3Hyp, 4Hyp); Ile, Leu 및 Val에 대한 알로-이소류신(AIle); Arg에 대한 4-아미디노페닐알라닌; Gly, Pro 및 Ala에 대한 N-메틸글리신 (MeGly, 사르코신); Ile에 대한 N-메틸이소류신 (MeIle); Met 및 다른 지방족 아미노산에 대한 노르발린 (Nva); Met 및 다른 지방족 아미노산을 위한 노르류신 (Nle); Lys, Arg 및 His에 대한 오르니틴 (Orn); Thr, Asn및 Gln에 대한 시트룰린 (Cit) 및 메티오닌 술폭시드 (MSO); 및 Phe에 대한 N-메틸페닐알라닌 (MePhe), 트리메틸페닐알라닌, 할로-(F-, Cl-, Br- 또는 I-)페닐알라닌 또는 트리플루오릴페닐알라닌을 포함한다.

본 명세서에서 용어 “펩타이드”는 자연적으로 존재하는 것으로부터 분리하였거나, 재조합 기술(recombinant technique)에 의하여 또는 화학적으로 합성된 단백질, 단백질 단편 및 펩타이드를 모두 포함한다.

하나의 측면에서, 펩타이드 변이체, 예컨대 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 펩타이드 변이체가 제공된다. 본 명세서에서 용어 “펩타이드 변이체(peptide variants)”란 하나 또는 그 이상의 아미노산이 펩타이드의 아미노산 서열에 치환(substitutions), 결실(deletions), 첨가(additions) 및/또는 삽입(insertions)되어 있으면서, 원래의 아미노산으로 구성된 펩타이드와 거의 동일한 생물학적 기능을 발휘하는 것을 말한다. 펩타이드 변이체는 원래의 펩타이드와 70% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 동일성(identity)을 가지고 있어야 한다.

이러한 펩타이드 변이체로서 “보존성”이라고 알려진 아미노산 변이체가 포함될 수 있다. 변이체는 또한 비-보존성(non-conservative)의 변화를 포함할 수도 있다. 예시적인 측면에서, 변이체 폴리펩타이드의 서열은 5개 또는 그 이하의 아미노산이 치환, 결실, 부가 또는 삽입되어, 원래의 서열과 달라진다. 변이체는 또한 펩타이드의 면역원성(immunogenicity), 2차 구조(secondary structure) 및 수치료성(hydropathic nature)에 최소한의 영향을 주는 아미노산들의 결실 또는 부가에 의해 변화될 수 있다.

“보존성” 치환이란 하나의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되었을 때에도 폴리펩타이드의 2차구조 및 수치료성(hydropathic nature) 등의 특성에 큰 변화가 없는 것을 의미한다. 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환기의 상대적 유사성, 예컨대 극성(polarity), 전하(charge), 수용성(solubility), 소수성(hydrophobicity), 친수성(hydrophilicity) 및/또는 양친화성(amphipathic nature) 등의 유사성을 기초로 하여 얻어질 수 있다.

예를 들어 아미노산은 공통적인 곁사슬 특성에 따라 ⅰ) 소수성(노르류신, 메티오닌, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신) ⅱ) 중성 친수성(시스테인, 세린, 트레오닌, 아스파라진, 글루타민), ⅲ) 산성(아스파르트산, 글루탐산), ⅳ) 염기성(히스티딘, 리신, 아르기닌), ⅴ) 쇄 방향에 영향을 미치는 잔기 (글리신, 프롤린), ⅵ) 방향족 (트립토판, 티로신, 페닐알라닌)으로 분류될 수 있다. 보존적 치환은 이들 각각의 클래스 중 하나의 구성원을 동일한 클래스의 다른 구성원으로 교환하는 것을 수반할 것이다.

아미노산 곁사슬 치환기의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 리신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글리신과 세린은 유사한 크기를 가지며; 페닐알라닌, 트립토판과 티로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글리신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 티로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.

변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스 (hydropathic idex)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 이소류신 (+4.5); 발린 (+4.2); 류신 (+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인 (+2.5); 메티오닌 (+1.9); 알라닌 (+1.8); 글리신 (-0.4); 트레오닌(-0.7); 세린 (-0.8); 트립토판 (-0.9); 티로신 (-1.3); 프롤린 (-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루탐산 (-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스파르트산 (-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 라이신 (-3.9); 및 아르기닌 (-4.5).

단백질의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.

한편, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌 (+3.0); 리신 (+3.0); 아스파르트산(+3.0±1); 글루탐산(+3.0±1); 세린 (+0.3); 아스파라긴 (+0.2); 글루타민 (+0.2); 글리신 (0); 트레오닌 (-0.4); 프롤린 (-0.5 ± 1); 알라닌 (-0.5); 히스티딘 (-0.5); 시스테인 (-1.0); 메티오닌 (-1.3); 발린 (-1.5); 리신(-1.8); 이소류신 (-1.8); 티로신 (-2.3); 페닐알라닌 (-2.5); 트립토판 (-3.4). 친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.

분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 또는 펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.

일반적으로, 본 명세서상에 언급되어 있는 펩타이드(융합 단백질 포함) 및 폴리뉴클레오타이드는 분리된(isolated) 것이다. “분리된(isolated)” 펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드란 원래의 환경으로부터 제거된 것이다. 예를 들어, 자연 상태로 존재하는 단백질은 그 상태에서 함께 존재하는 물질들 전부 혹은 일부를 제거함으로써 분리되는 것이다. 이러한 폴리펩타이드는 적어도 90% 이상의 순도를 지녀야 하며, 바람직하게는 95%, 더욱 바람직하게는 99% 이상의 순도를 가져야 한다. 폴리뉴클레오타이드는 벡터 내에서 클로닝 시킴으로써 분리된다.

펩타이드는 재조합 방법(recombinant means) 또는 화학적 합성을 통해 제조함으로써 분리될 수 있다. 본 명세서 상에 언급된 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화(encode)되는 재조합 펩타이드, 예를 들어 서열식별번호: 1 및/또는 서열식별번호: 2의 아미노산 서열로 이루어지는 펩타이드는 알려져 있는 많은 발현 벡터들 중 어느 것을 이용하든지 간에 공지의 방법으로 손쉽게 제조될 수 있다. 발현은 재조합 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 발현벡터로 형질전환 된 적절한 숙주 세포(host cell) 내에서 시킬 수 있다. 적절한 숙주 세포에는 원핵세포들(prokaryotes), 효모(yeast) 및 진핵세포들(eukaryotes)이 포함된다. 일례로, 효모, 곤충 세포 또는 포유동물 세포주(Cos 또는 CHO 등의)와 같은 진핵생물 유래의 세포주를 숙주세포로 이용하는 것이 바람직하다.

재조합 단백질의 정제를 위해서는 먼저 수용성의 숙주/벡터 시스템에서 얻은, 배양액으로 분비된 재조합 단백질을 포함하는 상등액을 시판되는 필터를 이용하여 농축시킨다. 다음 단계로 상기에서 얻은 농축액을 친화 매트릭스(affinity matrix) 또는 이온교환수지(ion exchange resin) 등의 적절한 정제 매트릭스(purification matrix)를 이용하여 정제한다. 마지막으로 한 단계 또는 여러 단계의 역상(reverse phase) HPLC 를 수행함으로써 순수한 재조합 단백질을 얻을 수 있다.

본 명세서에 기재된 펩타이드 또는 단백질은 숙주 세포의 주변 세포질로 분비되고 그로부터 회수될 수 있다. 전형적으로, 펩타이드 및/또는 단백질의 회수는 일반적으로 삼투압 충격, 초음파처리 또는 용해와 같은 수단에 의해 미생물을 분쇄하는 것을 포함한다. 세포가 파괴되면, 세포 잔해 또는 전-세포를 원심분리 또는 여과에 의해 제거할 수 있다. 펩타이드 및/또는 단백질은 예를 들어 친화성 수지 크로마토그래피에 의해 추가로 정제할 수 있다.

대안적으로, 펩타이드 및/또는 단백질을 배양 배지로 옮기고, 그로부터 단리할 수 있다. 세포를 배양물로부터 제거하고, 배양 상층액(supernatant)을 여과하고 농축하여 생산된 펩타이드 및/또는 단백질을 추가로 정제할 수 있다. 발현된 폴리펩타이드는 통상적으로 공지된 방법, 예컨대 면역친화성 또는 이온-교환 칼럼 상의 분별 증류; 에탄올 침전; 역상 HPLC; 실리카 또는 양이온 교환수지, 예컨대 DEAE 상의 크로마토그래피; 크로마토포커싱; SDS-PAGE; 황산암모늄 침전; 예를 들어 세파덱스 G-75를 사용하는 겔 여과; 소수성 친화도 수지, 매트릭스 상에 고정화된 적합한 항원을 사용하는 리간드 친화도 및 웨스턴 블롯 검정을 이용하여 추가로 단리 및 확인될 수 있다.

본 명세서에서 “폴리뉴클레오타이드” 또는 “핵산”은 교환 가능하게 사용되며, 임의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체를 지칭하고 DNA(예컨대 cDNA) 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함한다. 핵산 분자의 구성 단위인 “뉴클레오타이드”는 데옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드, 변형된 뉴클레오타이드 또는 염기, 및/또는 그 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 중합효소에 의해, 또는 합성 반응에 의해 중합체 내로 혼입될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드, 당 또는 염기가 변형된 유사체(analogue), 예컨대 메틸화 뉴클레오타이드 및 그 유사체를 포함할 수 있다.

뉴클레오타이드에서의 변이는 단백질에서 변이를 가져오지 않는 것도 있다. 이러한 핵산은 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 암호화하는 코돈 (예를 들어, 코돈의 축퇴성(degeneracy)에 의해, 아르기닌 또는 세린에 대한 코돈은 여섯 개이다), 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 암호화하는 코돈을 포함하는 핵산 분자를 포함한다.

또한, 뉴클레오타이드에서의 변이가 단백질 자체에 변화를 가져올 수도 있다. 단백질의 아미노산에 변화를 가져오는 변이인 경우에도 본 발명의 단백질과 거의 동일한 활성을 나타내는 것이 얻어질 수 있다.

본 발명의 핵산 또는 폴리뉴클레오타이드가 가지는 특징, 예를 들어 RNA 백신 및/또는 면역보강제로서의 효과를 갖는 범위에서, 본 발명의 펩타이드 및 핵산 분자는 서열목록에 기재된 아미노산 서열 또는 염기 서열에 한정되지 않는다는 것은 통상의 기술자에게 명확하다. 예를 들어, 본 발명의 재조합 단백질에 포함될 수 있는 생물학적 기능 균등물은 본 발명의 재조합 단백질과 균등한 생물학적 활성을 발휘하는 아미노산 서열의 변이를 가지는 펩타이드일 수 있다.

즉, 상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명에 따른 펩타이드 및/또는 단백질을 암호화하는 핵산 분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 정렬(align)하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 정렬된 서열을 분석한 경우에, 최소 61%의 상동성, 보다 바람직하게는 70%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 정렬 방법은 당업계에 공지되어 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 서열식별번호: 1의 펩타이드 및 서열식별번호: 3의 펩타이드 중에서 적어도 하나의 펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 발현 벡터에 관한 것이다.

본 명세서에서 사용된 용어 “벡터”는 숙주 세포에 전달이 가능하며 바람직하게는 하나 이상의 목적 유전자 또는 서열의 발현이 가능하도록 만들어진 구조물을 의미한다. 예를 들면 벡터에는 바이러스 벡터(viral vectors), DNA 또는 RNA 발현 벡터(expression vectors), 코스미드(cosmid) 또는 파지벡터(phage vectors), CCA(cationic condensing agents)와 연결된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 리포좀(liposomes)으로 포장된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 프로듀서 세포(producer cells)와 같은 특정 진핵세포(eukaryotic cells) 등이 포함된다.

본 명세서에서 "발현 조절 서열(expression control/regulation sequence)" 또는 "발현 조절 요소(expression control/regulation element)"는 핵산의 전사(transcription) 및/또는 전사체 형태의 핵산으로부터 번역(translation)을 조절하는 핵산 서열을 의미할 수 있다. 한편, "전사 조절 서열(transcription control/regulation sequence)" 또는 "전사 조절 요소(transcription control/regulation element)"는 핵산의 전사를 조절하는 핵산 서열을 의미한다. 전사 조절 서열은 구조 프로모터(constitutive promoter) 또는 유도 프로모터(inducible promoter)와 같은 프로모터 또는 인핸서(enhancer) 등이 있다. 또한, 전사체 형태의 핵산으로부터 단백질 또는 펩타이드로의 번역을 조절하는 핵산 서열에 대해서 "번역 조절 서열(translation control/regulation sequence)" 또는 "번역 조절 요소(translation control/regulation element)"라는 용어가 사용될 수 있다. 이들 발현 조절 서열/요소, 전사 조절 서열/요소 및/또는 번역 조절 서열/요소는 발현될 서열, 예를 들어 전사 또는 번역될 핵산 서열에 작동 가능하게 연결(operatively linked)되어 있다.

본 명세서에서 용어"작동 가능하게 연결된(operatively linked)"은 목적하는 핵산 분자의 발현 조절 부위(예: 프로모터, 시그널 서열, 라이보좀 결합부위, 전사 종결서열, 전사조절인자 결합 위치 등)과 다른 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절한다.

본 발명과 관련해서 전술한 펩타이드를 직접 숙주 세포 내로 트랜스펙션(transfection)할 수도 있으나, 그 펩타이드를 암호화하는 핵산이 숙주 세포 내로 도입되는 방법을 고려해 볼 수 있다. 예를 들어 본 발명에 따른 펩타이드를 암호화하는 핵산이 적절한 벡터 내에 클로닝(cloning)될 수 있도록 삽입될 수 있다.

본 발명에 따른 펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터로서는 염색체, 에피솜 및 유도된 바이러스와 같은 수많은 발현 시스템이 사용될 수 있다. 보다 구체적으로 사용할 수 있는 재조합 바이러스 발현 벡터로는 바큘로바이러스와 같은 바이러스, SV40과 같은 유두종바이러스, 백시니아 바이러스, 아데노바이러스, 아데노-부속 바이러스, 레트로바이러스, 계두 바이러스, 가성광견병 바이러스로부터 유래한 것이 사용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

예시적인 측면에서, 벡터의 한 유형은 파지 벡터이다. 또 다른 유형의 벡터는 추가의 DNA 절편이 바이러스 게놈 내로 라이게이션 될 수 있는 바이러스 벡터이다. 특정 벡터는 그것이 도입된 숙주 세포 내에서 자율 복제가 가능하다 (예를 들어, 에피솜 포유동물 벡터). 다른 벡터 (예를 들어, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포 내로 도입 시에 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있고, 이에 의해 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 특정 벡터는 벡터가 작동 가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터가 본 명세에서 "재조합 발현 벡터" (또는 간단히, "재조합 벡터")로서 지칭된다.

본 발명의 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 편입된다.

본 발명의 예시적인 측면에서, 서열식별번호: 1을 암호화하는 핵산은 바이러스 발현 시스템(백시니아 또는 다른 폭스 바이러스, 레트로 바이러스 또는 아데노바이러스)을 이용하여 숙주 세포로 삽입된다. 예시적으로, 바이러스 벡터에는 HIV, SIV, 설치류 레트로 바이러스(murine retroviruses), 기본 백혈병 바이러스(gibbon ape leukemia virus), AAVs(adeno-associated viruses) 및 아데노바이러스(adenoviruses) 등에서 유래된 레트로 바이러스 벡터가 포함되나 여기에 한정되는 것은 아니다(Miller et al., 1990, Mol. Cell Biol. 10:4239; J. Kolberg 1992, NIH Res. 4:43; Cornetta et al., 1991, Hum. Gene Ther. 2:215). 설치류 백혈병 바이러스 (murine leukemia virus, MuLV), 기본 백혈병 바이러스 (gibbon ape leukemia virus, GaLV), 에코트로픽 레트로바이러스 (ecotropic retroviruses), SIV (simian immunodeficiency virus), HIV (human immunodeficiency virus) 등에서 유래된 레트로 바이러스 벡터들이 널리 사용되고 있다.

이때, 예를 들어 펩타이드를 암호화하는 핵산이 DNA인 경우에는 이른바 ‘naked DNA’ 방법을 활용하거나 바이러스 벡터를 활용할 수 있으며, 바이러스 벡터로서 서열식별번호: 1의 펩타이드를 암호화하는 핵산, 예를 들어 서열식별번호: 2의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산이 발현 가능한 형태로 포함될 수 있다. 본 명세서에서 ‘발현 가능한 형태로’라는 용어는 핵산이 숙주 세포에 도입되면, SFTSV에 의한 면역을 유발하는 펩타이드가 생체 내에서 발현되는 것을 의미한다.

재조합 발현 벡터는 발현 표적 서열로서 서열식별번호: 1의 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열 이외에, 이들 발현 표적 서열의 발현을 위한 기능적 서열을 포함할 수 있다. 일례로, 재조합 바이러스 발현 벡터는 전사를 진행할 수 있는 강력한 프로모터(promoter)를 사용할 수 있다.

구성적 또는 유도성 프로모터는 통상의 기술자에 의해 확인될 수 있는 특정한 상황의 필요에 따라 본 발명에 사용될 수 있다. 다양한 가능한 숙주 세포에 의해 인식되는 다수의 프로모터가 널리 공지되어 있다. 선택된 프로모터는 제한 효소 인식 서열을 통해 공급원 DNA로부터 프로모터를 제거하고 단리된 프로모터 서열을 선택 벡터 내로 삽입함으로써 본 명세서에 기재된 펩타이드를 암호화하는 시스트론 DNA에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 천연 프로모터 서열 및 다수의 이종 프로모터를 둘 다 사용하여 표적 유전자의 증폭 및/또는 발현을 지시할 수 있다. 그러나, 이종 프로모터는 일반적으로 천연 표적 폴리펩타이드 프로모터와 비교하여 발현된 표적 유전자의 전사 및 발현 효율을 구현할 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵세포를 숙주로 하는 경우라면 포유동물 세포에서 유래된 프로모터(메탈로티아닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스에서 유래된 프로모터를 사용할 수 있다. 다시 말하면, 본 발명의 벡터로서 바이러스를 사용하고자 하는 경우, 서열식별번호: 1의 펩타이드를 암호화하는 핵산을 발현시키기 위해서 백시니아(vaccinia) 또는 플로폭스(flowpox)와 같이 약독화된 바이러스는 물론이고 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스(Adeno-associated virus) 벡터, 레트로바이러스 벡터, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 무독성 탄저병 독소 벡터 등을 사용할 수 있다.

이때, 재조합 발현 벡터는 예를 들어 CMV (cytomegalo virus) 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, HSV의 tk 프로모터, RSV 프로모터와 같은 포유동물 바이러스 유래의 프로모터, EF1 알파프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL-2 유전자의 프로모터, 인간 IFN 유전자의 프로모터, 인간 IL-4 유전자의 프로모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터, 인간 GM-CSF 유전자의 프로모터, 암세포 특이적 프로모터 (예컨대, TERT 프로모터, PSA 프로모터, PSMA 프로모터, CEA 프로모터, E2F 프로모터 및 AFP 프로모터), 조직 특이적 프로모터 (예컨대, 알부민 프로모터) 및 /또는 bacteriophage T7 프로모터가 사용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열(예: 소성장 호르몬 터미네이터 및 SV40 유래 폴리 아데닐화 서열)을 포함할 수 있다.

발현 벡터에 서브클론 된 서열을 증폭시키는 여러 가지 시험관내 증폭 기법들(in vitroamplification techniques)이 알려져 있다. 이러한 기법에는 PCR(polymerase chain reaction), LCR(ligase chain reaction), Qβ-복제효소 증폭(replicase amplification) 및 다른 RNA 중합효소를 이용한 기법들이 있다.

입수 가능하고 당업계에 공지된 다수의 벡터를 본 발명의 목적에 사용할 수 있다. 적절한 벡터의 선택은 주로 벡터에 삽입되는 핵산의 크기 및 벡터에 의해 형질전환 되는 특정한 숙주 세포에 따라 달라질 것이다. 각각의 벡터는 그의 기능(이종 폴리뉴클레오타이드의 증폭 또는 발현, 또는 둘 다) 및 벡터가 존재하는 특정한 숙주 세포와의 상용성에 따라 다양한 성분을 함유한다. 벡터 성분은 일반적으로 복제 기점 (특히 벡터가 원핵세포에 삽입되는 경우), 선택 마커 유전자, 프로모터, 리보솜 결합 부위 (RBS), 신호 서열, 이종 핵산 삽입물 및 전사 종결 서열을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

예를 들어, 본 발명의 재조합 벡터는 단백질의 발현에 영향을 미칠 수 있는 발현 조절 서열, 예를 들어, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서, 막 표적화 또는 분비를 위한 신호서열 등을 포함할 수 있다. 폴리아데닐화 시그널은 전사체의 안정성을 증가시키거나 세포질 수송을 용이하게 한다. 인핸서 서열은 프로모터에서 다양한 부위에 위치하여 인핸서 서열이 없을 때의 프로모터에 의한 전사 활성과 비교하여, 전사 활성을 증가시키는 핵산 염기서열이다. 신호 서열에는 숙주가 효모인 경우에는 MF-α 신호서열, SUC2 신호서열 등이, 숙주가 동물세포인 경우에는 인슐린 신호서열, a-인터페론 신호서열, 항체 분자 신호서열 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

하나의 예시적인 측면에서, 본 발명에 따라 서열식별번호: 1의 펩타이드를 암호화하는 핵산 분자가 삽입된 재조합 바이러스 발현 벡터는 인간 아데노바이러스 또는 인간 아데노-연관 바이러스, 예를 들어, 인간 아데노바이러스 serotype 5에 기반한 것일 수 있다.

아데노바이러스는 는 약 25~45kb의 크기의 이중가닥 DNA 게놈을 가지고 있으며, 유전적으로 다양성을 지니는 DNA 바이러스로서 생명의 위협을 가하는 감염성 바이러스가 아니다 (non-life threatening infective virus). 주로 호흡기관이나 위장관 기관의 표피 세포에 존재하는 바이러스이다.

아데노바이러스는 숙주 세포의 핵에서 에피솜 인자로서 복제한다. 아데노바이러스의 게놈은 주로 조절 기능을 가지며 바이러스 복제를 위한 숙주세포를 준비하는 4개의 초기 전사 단위 (early transcriptional unit) (E1, E2, E3 및 E4)를 포함한다. 게놈은 단일 프로모터의 제어 하에 있는 펜톤 (L2), 헥손 (L3), 스캐폴딩 단백질(scaffolding protein) (L4) 및 섬유 단백질 (L5)를 비롯한 구조적 단백질을 암호화하는 5개의 후기 전사 단위(late transcriptional unit) (L1, L2, L3, L4 및 L5)도 포함한다. 게놈의 각 말단부는 바이러스 복제에 필요한 역위 말단 반복(Inverted Terminal Repeat, ITR)을 포함한다.

아데노바이러스는 표적 숙주에 대한 백신 항원이나 유전자를 전달하는 벡터로서 최적의 플랫폼일 수 있다. 아데노바이러스 기반의 벡터의 경우 크기가 큰 외부유전자(transgene) DNA를 쉽게 받아 들일 수 있는 벡터 플랫폼이며, 면역증강제로서의 능력을 지니고 있다(adjuvant property). 아데노바이러스 발현 벡터는 강력한 이식 유전자 특이적인 T세포 반응 (robust transgene-specific T cell)을 유도하며, 항체반응 (antibody response)를 유도한다. 또한 숙주 내에서 자연적으로 복제가 되지 않는다.

뿐만 아니라, 아데노바이러스는 인간의 기존면역(pre-existing immunity)을 지니고 있고, 염증 반응을 유도할 수 있기 때문에 백신이나 유전자 치료 벡터로서 아데노바이러스 벡터 기반의 백신이 많은 장점을 지니고 있음에도 현재까지 백신으로서 이용되지 못하였다. 그 이유중의 하나는 HIV-1 Gag, Pol, Nef 유전자를 가진 재조합 adenovirus 5를 이용한 HIV용 백신 대규모 임상 시험을 수행 한 결과 사전에 존재하는 adenovirus 5 에 대한 중화항체가 그 효능을 감소 시킬 뿐만 아니라 HIV에 대한 감수성을 오히려 증가시켰다.

하지만, 최근 SARS-CoV-2에 의해서 유도되는 COVID-19 백신 개발을 위해 중국에서 개발된 Adenovirus 5를 기반으로 한 백신은 비록 adenovirus 5에 대한 사전 항체가 없는 그룹에 비하여 사전 항체가 잇는 그룹의 중화항체 수준이 2배 이상 낮음에도 불구하고 COVID-19 특이적인 항체가 유도 되었다. 더구나 임상 1상에서 나타난 부작용 역시 용인할 만한 수준이었다. 이처럼 adenovirus 5를 이용한 바이러스 벡터 백신의 임상이 대규모로 이루어지면서 이를 활용한 다른 바이러스 벡터 백신의 개발 가능성 역시 커졌다고 할 수 있다.

하나의 예시적인 측면에서, 재조합 바이러스 발현 벡터의 기반이 되는 아데노바이러스 벡터는 바이러스의 증식에 필수적인 게놈 영역을 제외한 나머지 게놈의 일부가 결실되거나 다른 뉴클레오타이드로 대체될 수 있다. 일례로, 기반이 되는 아데노바이러스 벡터는 E1 영역, E2 영역, E3 영역, L2 영역 중에서 적어도 하나의 영역의 적어도 일부가 결실될 수 있다.

다른 예시적인 측면에서, 재조합 바이러스 발현 벡터의 기반이 되는 아데노바이러스 벡터는 (a) 아데노바이러스 5'-말단; (b) 아데노바이러스 Ela 영역, 또는 13S, 12S 및 9S 영역 중에서 선택된 이의 단편; (c) 아데노바이러스 Elb 영역, 또는 스몰(small) T, 라지(large) T 및 IX 영역으로 이루어진 그룹 중에서 선택 된 이의 단편; (d) 아데노바이러스 E2b 영역, 또는 스몰 pTP, 폴리머라제 및 IVa2 영역으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 이의 단편; (e) 아데노바이러스 L1 영역, 또는 28.1 kD 단백질, 폴리머라제, 아그노단백질, 52/55 kDa 단백질 및 IIIa 단백 질로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아데노바이러스 단백질을 암호화하는 이의 단편; (f) 아데노바이러스 L2 영역, 또는 VII, V 및 Mu 단백질로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아데노바이러스 단백질 을 암호화하는 이의 단편; (g) 아데노바이러스 L3 영역, 또는 VI 단백질 및 엔도프로테아제로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아데노바이러 스 단백질을 암호화하는 이의 단편; (h) 아데노바이러스 E2a 영역; (i) 아데노바이러스 L4 영역, 또는 100 kD 단백질, 33 kD 동족체(homolog) 및 단백질 VIII로 이루어진 그룹 중 에서 선택된 아데노바이러스 단백질을 암호화하는 이의 단편; (j) 아데노바이러스 E3 영역, 또는 E3 ORF1, E3 ORF2, E3 ORF3, E3 ORF4, E3 ORF5, E3 ORF6, E3 ORF7, E3 ORF8 및 E3 ORF9로 이루어진 그룹 중에서 선택된 이의 단편; (k) 아데노바이러스 E4 영역, 또는 E4 ORF7, E4 ORF6, E4 ORF5, E4 ORF4, E4 ORF3, E4 ORF2 및 E4 ORF1으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 이의 단편; 및 (l) 아데노바이러스 3'-말단 중에서 적어도 하나를 가질 수 있다.

본 발명의 벡터는 발현되는 펩타이드의 정제를 용이하기 위해서 다른 서열과 융합(fusion)될 수 있다. 융합되는 서열은 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질 (NEB, USA), FLAG (IBI, USA) 및 6 x His (hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있고, 가장 바람직하게는 6 x His이다. 펩타이드의 정제를 위한 추가적인 서열 때문에, 숙주에서 발현된 펩타이드는 친화성 크로마토그래피를 통하여 신속하고, 용이하게 정제될 수 있다.

본 발명의 예시적인 측면에 따르면, 융합 서열이 포함되어 있는 벡터에 의해 발현된 융합 단백질은 친화성 크로마토그래피에 의해 정제된다. 예컨대, 글루타티온-S-트랜스퍼라제가 융합된 경우에는 이 효소의 기질인 글루타티온을 이용할 수 있고, 6x His이 이용된 경우에는 Ni-NTA His-결합 레진 컬럼 (Novagen, USA)을 이용하여 소망하는 재조합 단백질을 신속하고 용이하게 얻을 수 있다.

즉, 본 발명과 관련해서 서열식별번호 1의 펩타이드를 암호화하는 핵산 분자를 숙주 세포 내로 전달시키기 위해 사용되는 벡터는 일종의 유전자 전달체로서, 목적하는 핵산 분자는 발현 조절 부위에 작동 가능하게 연결된다.

본 발명에 따르면, 서열식별번호: 1의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 핵산을 숙주 세포 내로 도입할 수 있는 임의의 유전자 전달체를 포함한다. 이 유전자 전달체는 예를 들어 naked 재조합 DNA, 바이러스 벡터 또는 naked 재조합 핵산 또는 플라스미드를 내포하는 리포좀 또는 니오좀의 형태로 제작될 수 있다.

상술한 본 발명의 유전자 치료제는 목적의 핵산분자를 포함하는 유전자 전달체를 유효성분으로 포함한다. 유전자 전달체는 목적의 핵산분자를 운반 및 발현시키기 위하여 제작된 것으로서, 운반 객체인 목적의 핵산분자에 대한 상세한 내용은 위에 기재된 내용과의 중복기재를 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

한편, 본 발명에 따른 상술한 벡터를 안정적으로 발현시키기 위해서 당업계에서 통상적으로 사용되는 숙주 세포를 활용할 수 있다. 예를 들어, 사카로미세 세레비시아(Saccharomyce cerevisiae)와 같은 yeast 세포, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주 등이 이용될 수 있다. 이 숙주 세포는 서열식별번호: 1의 펩타이드를 발현시키는 분리된 세포이거나 배양된 세포일 수 있다. 이 숙주 세포는 생식 세포이거나 체세포일 수 있으며, 줄기 세포 또는 분화된 세포일 수 있으며, 일례로 포유동물의 눈에서 유래된 세포일 수 있다.

본 발명에 따라 서열식별번호: 1 의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 숙주 세포 내로 운반 또는 전달하기 위해서는 이미 공지된 다양한 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어 서열식별번호: 1의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 naked 재조합 DNA의 형태로 직접 또는 바이러스 벡터 등을 통해서 숙주 세포 내부로 운반하기 위해서는 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법 등을 통하여 핵산 분자를 세포 내로 유입시킬 수 있다. 뉴클레오타이드를 세포 내로 도입하는 기법으로서 또한 양이온성 리포좀을 사용하는 것을 고려해 볼 수 있다. 상업적으로 구입할 수 있는 양이온성 지질 제제에는 Tfx 50 (Promega 사) 또는 Lipofectamin 2000 (Life Technologies 사) 등이 있다.

예를 들어 본 발명에 따른 벡터를 진핵세포인 숙주 세포 내부로 운반하기 위해서, 칼슘포스페이트 침전법(Graham, F. L. & van der Eb, A. J. Virology 52: 456467 (1973)), 전기 천공법(Neueumann, E., M. Schaefer-Ridder, Y. Wang, and P. H. Hofschneider, EMBO (Eur. Mol. Biol. Organ.) J. 1:841-845 (1982)), DEAE-덱스트란 처리법(GOPAL, T. V., Mol. Cell. Biol. 5: 1188-1190 (1985)), 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 등의 방법을 사용할 수 있다.

벡터는 목적하는 다른 분자들을 암호화하는 하나 이상의 다른 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 필요에 따라, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 다른 폴리뉴클레오타이드와 결합하여 융합단백질을 암호화하기도 한다. 예시적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 포유동물 또는 곤충 세포 내로 들어가서 발현되도록 조성되어 있다. 이러한 조성은 치료 목적에 사용하는 데에 특히 유용하다. 폴리뉴클레오타이드를 숙주세포 내에서 발현시키는 데에는 많은 방법이 있으며 적절한 어느 방법도 사용 가능하다.

예를 들어, 서열식별번호: 1의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 아데노바이러스(adenovirus), 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus), 레트로 바이러스(retrovirus), 백시니아(vaccinia), 다른 폭스 바이러스(e.q., avian pox virus) 또는 배큘로바이러스 등의 바이러스 벡터에 삽입이 가능하다. DNA를 이러한 벡터에 삽입시키는 기술에 관해서는 이미 잘 알려져 있다. 이들 바이러스 벡터에는 형질도입 된 세포들의 확인 또는 선택을 쉽게 해 주는 선택 마커(selectable marker)에 대한 유전자 및/또는 특정한 표적 세포에 대한 수용체 역할을 하는 리간드(ligand)를 암호화하는 유전자와 같은 표적 부위(targeting moiety)를 부가적으로 삽입시킬 수 있다. 표적은 또한 항체를 이용한 공지의 방법에 의해서도 이루어질 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환 된 숙주 세포를 제공한다. 형질전환 된 숙주 세포는 본 발명의 폴리펩타이드를 생산하는 방법에 이용될 수 있다. 상기 방법은 숙주 세포의 배양 및 생산된 폴리펩타이드의 회수(recovering)를 포함한다. 회수된 폴리펩타이드는 배양 상등액으로부터 정제가 가능하다.

전술한 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지되어 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, 이스트 (Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포(예컨대 SF9 세포) 및 사람 세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 예시적인 실시예에 따르면, 아데노바이러스 serotype 5 벡터를 기반으로 서열식별번호: 1의 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열이 삽입된 재조합 바이러스 발현 벡터 플랫폼을 마우스에 주입하면, T cell을 자극하여 면역 증강 효과를 구현한다. 또한, 단백질 백신과의 적절한 순서의 이종항원 감작 반응 시 동종항원 감작 및 면역증가 효과보다 월등히 우수한 백신 효능을 보임을 확인 하였다.

즉, 본 발명의 예시적인 실시예에 따르면, 예를 들어 서열식별번호: 1의 펩타이드를 암호화하는 핵산이 삽입된 재조합 바이러스 발현 벡터는 SFTSV를 예방 또는 치료하기 위한 약학 조성물의 유효 성분으로 사용될 수 있다. 일례로, 본 발명에 따른 재조합 바이러스 발현 벡터는 면역원으로 기능하여, SFTSV를 예방 또는 치료하기 위한 백신 조성물의 유효 성분일 수 있다.

따라서, 본 발명의 다른 측면에 따르면, 서열식별번호: 1의 펩타이드를 암호화하는 핵산 분자가 삽입된 재조합 바이러스 발현 벡터를 유전자 전달 컨스트럭트로 포함하고, 필요에 따라 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 SFTS를 예방 또는 치료하기 위한 약학 조성물이 개시된다. 이는 유전자 치료를 목적으로 하는 것이다.

본 발명에 따른 재조합 바이러스 발현 벡터의 약학적 유효량을 포함하는 약학 조성물은 담체, 희석제 및/또는 부형제를 포함한다. 하나의 예시적인 측면에서, 재조한 바이러스 발현 벡터는 생리학상 허용되는 담체, 즉 생약 투여 형태로 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성인 담체와 함께, 주위 온도, 적절한 pH에서, 원하는 정도의 순도로 혼합됨으로써 제제화될 수 있다. 제제의 pH는 주로 화합물의 특정한 용도 및 농도에 따라 달라지지만, 바람직하게는 약 3 내지 약 8의 범위이다. 한 예에서, 펩타이드는 pH 5에서 아세테이트 완충제 중에서 제제화된다. 또 다른 실시양태에서, 화합물은 멸균된다. 화합물은 예를 들어 고체 또는 무정형 조성물, 동결건조 제제 또는 수용액으로서 저장될 수 있다.

필요에 따라, 백신 백신 조성물은 면역 반응을 강화시킬 수 있도록 적어도 하나의 면역증강제를 포함할 수 있다. 백신 조성물이 면역증강제를 포함하여, 백신의 면역원성을 더욱 향상시킬 수 있다.

하나의 예시적인 측면에서, 면역증강제는 프로타민, 뉴클레오린, 스페르민, 스페르미딘 및 양이온성 다당류와, 안정화 양이온성 펩타이드 또는 폴리펩타이드, 특히 키토산, TDM, MDP, 뮤라밀 디펩타이드, 플루로닉, 백반 (alum) 용액, 알루미늄 히드록시드, ADJUMER (폴리포스파젠); 알루미늄 포스페이트 겔; 조류 (algae)의 글루칸; 알가뮬린 (algammulin); 알루미늄 히드록시드 겔 (백반(alum)); 높은 단백질-흡착성 알루미늄 히드록시드 겔; 낮은 점성의 알루미늄 히드록시드 겔; AF 또는 SPT (스쿠알란(5%)의 에멀젼, Tween-80(0.2%), PLURONIC-L121(1.25%), 포스페이트-완충 식염수, pH 7.4); AVRIDINE (프로판디아민); BAY R1005 ((N-(2-데옥시-2-L-류실아미노-b-D-글루코피라노실)-N-옥타데실도데카노일-아미드 히드로아세테이트); CALCITRIOL (1α,25-디히드록시-비타민 D3); 칼슘 포스페이트 겔; CAPTM (칼슘 포스페이트 나노입자); 콜레라홀로톡신, 콜레라-독소-A1-단백질-A-D-절편 융합 단백질, 콜레라 독소의 서브 유닛 B; CRL 1005 (블록 코폴리머 P1205); 싸이토카인-포함 리포솜; DDA (디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드); DHEA (디히드로에피안드로스테론); DMPC (디미리스토일 포스파티딜콜린); DMPG (디미리스토일 포스파티딜글리세롤); DOC/백반 (alum) 복합체 (데옥시콜린산 소듐염); Freund 완전 애주번트; Freund 불완전 애주번트; 감마 이눌린; Gerbu 애주번트(N-아세틸글루코사미닐-(P1-4)-N-아세틸뮤라밀-L-알라닐-D-글루타민(GMDP), 디메틸디옥타데실암모늄 클로라이드(DDA), 징크-L-프롤린염 복합체 (ZnPro-8)의 혼합물; GM-CSF); GMDP (N-아세틸글루코사미닐-(b1-4)-N-아세틸뮤라밀-L-알라닐-D-이소글루타민); 미퀴모드 (1-(2-메틸프로필)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민); ImmTher(N-아세틸글루코사미닐-N-아세틸뮤라밀-L-Ala-D-이소Glu-L-Ala-글리세롤디팔미테이트); DRV(탈수-재수화 (re-hydration) 비히클 (vesicle)로부터 제조된 면역리포솜); 인터페론-감마; 인터류킨-1베타; 인터류킨-2; 인터류킨-7; 인터류킨-12; ISCOMS("면역증강 복합체 (Immunostimulating Complexes)"); ISCOPREP 7.0.3.; 리포솜; LOXORIBINE (7-알릴-8-옥소구아노신(구아닌)); LT 경구 애주번트 (E.coli 라이어블 (labile) 엔테로톡신-프로톡신); 조성물의 마이크로스피어 및 마이크로입자; MF59; (스쿠알렌-물의 에멀젼); MONTANIDE ISA 51 (정제된 불완전 Freund 애주번트); MONTANIDE ISA 720 (대사작용이 가능한 오일 애주번트); MPL (3-Q-데사실(desacyl)-4'-모노포스포릴 지질 A); MTP-PE 및 MTP-PE 리포솜 ((N-아세틸-L-알라닐-D-이소글루타미닐-L-알라닌-2-(1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-(히드록시포스포릴옥시))-에틸아미드, 모노소듐염); MURAMETIDE (Nac-Mur-L-Ala-D-Gln-OCH3); MURA PALMITINE 및 D-MURAPALMITINE (Nac-Mur-L-Thr-D-이소GIn-sn-글리세롤디팔미토일); NAGO (뉴라미니다아제-갈락토오스 옥시다아제); 조성물의 나노스피어 또는 나노 입자; NISV (비이온성 계면활성제 비히클(vesicle)); PLEURAN (베타-글루칸); PLGA, PGA 및 PLA (젖산과 글리콜산의 호모폴리머 및 코폴리머; 마이크로스피어/나노스피어); PLURONIC L121; PMMA (폴리메틸 메타크릴레이트); PODDS (프로테노이드 마이크로스피어); 폴리에틸렌 카바메이트 유도체; 폴리-rA: 폴리-rU (폴리아데닐산-폴리우리딜산 복합체); 폴리소르베이트 80 (Tween 80); 단백질 코크리트 (cochleate)(Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL); STIMULON (QS-21); Quil-A (Quil-A 사포닌); S-28463 (4-아미노-otec-디메틸-2-에톡시메틸-1H-이미다조[4,5-c]-퀴놀린-1-에탄올); SAF-1 ("신텍스 애주번트(adjuvant) 제제"); 센다이(Sendai) 프로테오리포솜 및 센다이 (Sendai)-함유 지질 매트릭스; Span-85 (소르비탄 트리올레이트); Specol (Marcol 52, Span 85 및 Tween 85의 에멀젼); 스쿠알렌 또는 Robane (2,6,10,15,19,23-헥사메틸테트라코산 및 2,6,10,15,19,23-헥사메틸-2,6,10,14,18,22-테트라코사헥산); 스테아릴티로신 (옥타데실티로신 히드로클로라이드); Theramid (N-아세틸글루코사미닐-N-아세틸뮤라밀-L-Ala-D-이소Glu-L-Ala-디팔미톡시프로필아미드); 트레오닐-MDP (Termurtide 또는 [thr-1]-MDP; N-아세틸뮤라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민); Ty 입자 (Ty-VLP 또는 바이러스-유사 입자); Walter-Reed 리포솜 (수산화 알루미늄에 흡착된 지질 A를 포함하는 리포솜), 및 이와 유사한 것 등을 포함한다.

일례로, 백신 조성물에 포함되는 면역증강제는 alum (Th2 면역 반응을 유도하여 체액성 면역 반응 강화); MF59, AS03, AS04 (TLR-4 agonist인 MPL과 alum 혼합, GSK), AddaVax (스쿠알렌 기반; InvivoGen)과 같은 oil-in-water 에멀션형 면역 증강제(항원성 면역 반응 강화하고, Th1 면역 반응을 균형 있게 유도); Toll-like receptors (TLRs), RIG-I-like receptors (RLRs), NOD-like receptors (NLRs)와 같은 pattern recognition receptors (PRRs) 등의 agonist인 LPS (지방다당류), Poly:C, imidazoquinolines (imiquinod나 R848), CpG oligonucleotides 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

다른 선택적인 측면에서, 면역증강제는 바이러스 유래의 IRES 서열로부터 전사(transcription)된 RNA 분자일 수 있다. 이러한 RNA 분자는 바이러스 유래의 IRES 요소를 가지는 5'UTR과 필요에 따라 3'UTR를 가질 수 있다. 바이러스성 IRES 요소는 피코나바이러스과(Picornaviridae), 토가바이러스과(Togaviridae), 디시스트로바이러스과(Dicistroviridae), 플라비바이러스과(Flaviridae), 레트로바이러스과(Retroviridae) 및/또는 헤르페스바이러스과(Herpesviridae)의 바이러스에서 유래할 수 있다.

피코나바이러스과에 속하는 바이러스성 IRES 요소는 엔테로바이러스속(Enterovirus) 바이러스, 카디오바이러스속(Cardiovirus) 바이러스, 아프토바이러스속(Apthovirus)에 바이러스, 헤파토바이러스속(Hepatovirus) 바이러스 및/또는 테스코바이러스속(Teschovirus) 바이러스에 유래할 수 있다. 일례로, 엔테로바이러스속 바이러스성 IRES 요소는 엔테로바이러스 A 내지 엔테로바이러스 J 유형과, 리노바이러스(Rhinovirus) A 내지 리노바이러스 C형으로 분류되는 바이러스에서 유래할 수 있다.

다른 예시적인 측면에서, 피코나바이러스과에 속하는 바이러스성 IRES 요소는 1) 폴리오바이러스(Poliovirus, PV), 리노바이러스(Rhinovirus, RV), 콕사키바이러스(Coxsachievirus), 예를 들면, 콕사키바이러스B3(Coxsachie virus B3, CVB3) 및/또는 엔테로바이러스71(Enterovirus71, EV71)와 같은 엔테로바이러스속 바이러스, 2) 뇌심근염바이러스(Encephalomyocarditis virus, EMCV) 및/또는 마우스뇌척수염바이러스(Theiler murine encephalomyelitis virus, TMEV)와 같은 카디오바이러스속(Cardiovirus) 바이러스, 3) 구제역 질병 바이러스(Foot-and-mouth disease virus, FMDV)와 같은 아프토바이러스속 바이러스, 4) A형 간염바이러스(Hepatitis A Virus, HAV)와 같은 헤파토바이러스속 바이러스 및/또는 5) 돼지테스코바이러스(Porcine teschovirus, PTV, 예를 들어 PTV-1)와 같은 테스코바이러스속 바이러스에서 유래한 IRES 활성을 가지는 염기 서열을 가질 수 있지만, 본 발명이 이에 한정되지 않는다.

다른 선택적인 측면에서, 토가바이러스과에 속하는 바이러스성 IRES 요소는 알파바이러스속(Alphavirus) 바이러스, 예를 들어, 신드비스 바이러스(Sindbis virus, SV)에서 유래할 수 있다. 또한, 디시스트로바이러스과에 속하는 바이러스성 IRES 요소는, 예를 들어, 크리파바이러스속(Cripavirus) 바이러스, 예를 들어, 갈색날개노린재장내바이러스(Plautia stali intestine virus, PSIV), 귀뚜라미 마비바이러스(Cricket paralysis virus, CrPV), 트리아토마바이러스(Triatoma virus), 및/또는 기장테두리진딧물바이러스(Rhopalosiphum padi virus, RXPD)에서 유래할 수 있다.

다른 예시적인 측면에서, 플라비바이러스과에 속하는 바이러스성 IRES 요소는 1) 헤파시바이러스속(Hepacivirus) 바이러스, 예를 들어, C형 간염바이러스(Hepatitis C virus, HCV), 2) 플라비바이러스속(Flavivirus) 바이러스, 예를 들어, 일본뇌염바이러스(Japanese Encephalitis Virus, JEV), 3) 페스티바이러스속(Pestivirus) 바이러스, 예를 들어, 돼지열병바이러스(Classical swine fever virus, CSFV) 및/또는 소바이러스성설사병바이러스(Bovine viral diarrhea virus, BVDV)에서 유래한 IRES 활성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다.

다른 예시적인 측면에서, 레트로바이러스과에 속하는 바이러스성 IRES 요소는 1) 감마레트로바이러스속(Gammaretrovirus)에 바이러스, 예를 들어, 프렌드 마우스레트로바이러스(Friend murine leukemia virus, FMLV), 몰로니마우스레트로

바이러스(Moloney murine leukemia virus, MMLV) 및/또는 2) 알파레트로바이러스속

(Alpharetrovirus) 바이러스, 예를 들어, 라우스육종바이러스(Rous sarcoma virus, RSV)에서 유래한 IRES 활성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 또한, 헤르페스바이러스과에 속하는 바이러스성 IRES 염기 서열은 마디바이러스속 (Mardivirus)에 속하는 마렉병바이러스(Marek's disease virus, MDV)에서 유래할 수 있지만, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

일례로, 바이러스성 IRES 염기 서열은 피코나바이러스과(Picornaviridae) 및/또는 디시스트로바이러스과(Dicistroviridae)에 속하는 바이러스에서 유래한 것일 수 있다. 이때, 피코나바이러스과 바이러스에서 유래한 IRES 요소는 엔테로바이러스속 바이러스, 카디오바이러스속 바이러스 및/또는 아프토바이러슥속 바이러스에서 유래한 IRES 활성을 가지는 염기 서열일 수 있다. 특히 바람직하게는 엔테로바이러스속 바이러스에서 유래한 IRES 활성을 가지는 염기 서열일 수 있다.

한편, 엔테로바이러스속 바이러스에서 유래한 IRES 요소는 CVB3와 같은 콕사키바이러스 등의 엔테로바이러스속 바이러스 및/또는 EMCV와 같은 카디오바이러스속 바이러스에서 유래한 IRES 활성을 가지는 염기 서열일 수 있다. 또한, 디시스트로바이러스과 바이러스에서 유래한 IRES 염기 서열은 크리파바이러스속 바이러스인 PSIV 및/또는 CrPV, 바람직하게는 CrPV에서 유래한 IRES 활성을 가지는 염기 서열일 수 있다.

본 발명에 따른 재조합 바이러스 발현 벡터와, 면역증강제를 혼합하는 경우에 이들의 배합 비율은 특별히 한정되지 않는다. 일례로, 본 발명에 따른 재조합 바이러스 발현 벡터와 면역증강제는 100:1 내지 1:100, 바람직하게는 10:1 내지 1:10, 더욱 바람직하게는 5:1 내지 1:5, 가장 바람직하게는 3:1 내지 1:3의 중량 비율로 배합될 수 있다.

필요한 경우, 약학 조성물은 지속-방출 제제를 제조할 수 있다. 지속-방출 제제의 적합한 예는 재조한 바이러스 발현 벡터를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 이 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 지속-방출 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 하이드로겔 (예를 들어, 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐알코올)), 폴리락티드, L-글루탐산 및 감마-에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산을 포함한다.

한 예에서, 용량당 비경구 투여되는 본 발명의 재조합 바이러스 발현 벡터의 약학적 유효량은 하루에 환자 체중을 기준으로 약 0.01-100 mg/kg, 대안적으로 약 0.1 내지 20 mg/kg의 범위일 것이며, 사용되는 펩타이드의 전형적인 초기 범위는 0.3 내지 15 mg/kg/일이다. 또 다른 실시양태에서, 경구 단위 투여 형태, 예컨대 정제 및 캡슐은 바람직하게는 본 발명의 화합물의 약 5-100 mg을 함유한다. 하나의 예시적인 측면에서, 재조한 바이러스 발현 벡터는 약학 조성물 중에 1 x 10⁷ IU 내지 1 x 10¹¹ IU의 양으로 함유될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 펩타이드는 임의의 적합한 수단, 예를 들어 경구, 국소 (협측 및 설하 포함), 직장, 질, 경피, 비경구, 피하, 복강내, 폐내, 피내, 경막내 및 경막외 및 비강내, 및 원하는 경우에 국부 치료, 병변내 투여를 위한 수단에 의해 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다.

본 발명의 펩타이드는 임의의 편리한 투여 형태, 예를 들어 정제, 분말, 캡슐, 용액, 분산액, 현탁액, 시럽, 분무제, 좌제, 겔, 에멀젼, 패치 등으로 투여될 수 있다. 이러한 조성물은 제약 제제에 통상적인 성분, 예를 들어 희석제, 담체, pH 조정제, 감미제, 벌킹제 및 추가의 활성제를 함유할 수 있다

전형적인 제제는 본 발명의 펩타이드와 담체 또는 부형제를 혼합하여 제조된다. 적합한 담체 및 부형제는 당업자에게 널리 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Ansel, Howard C., et al., Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems. Philadelphia: Lippincott, Williams & Wilkins, 2004; Gennaro, Alfonso R., et al. Remington: The Science and Practice of Pharmacy. Philadelphia: Lippincott, Williams & Wilkins, 2000; 및 Rowe, Raymond C. Handbook of Pharmaceutical Excipients, Chicago, Pharmaceutical Press, 2005]에 상세히 기재되어 있다.

예를 들어, 본 발명의 약학 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 제제는 또한 하나 이상의 완충제, 안정화제, 계면활성제, 습윤제, 윤활제, 유화제, 현탁화제, 보존제, 항산화제, 불투명화제, 활택제, 가공 보조제, 착색제, 감미제, 향료, 향미제, 희석제, 및 약물 (즉, 본 발명의 화합물 또는 그의 제약 조성물)의 멋진 외양을 제공하거나 제약 제품 (즉, 의약)의 제조에 도움이 되는 다른 공지된 첨가제를 포함할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

한편, 본 명세서에서 제제는 또한 치료할 특정한 적응증에 필요한 경우에는 하나 초과의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 유해한 영향을 미치지 않는 보완적 활성을 갖는 화합물을 함유할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 조성물은 그의 기능을 증진시키는 작용제, 예컨대 예를 들어 세포독성제, 시토카인, 화학요법제, 또는 성장-억제제, 또는 성장-증진제를 포함할 수 있다. 이러한 분자는 의도된 목적에 유효한 양으로 조합되어 적합하게 존재한다.

이하, 예시적인 실시형태를 통하여 본 발명을 설명하지만, 본 발명이 하기 실시예에 기재된 기술사상으로 한정되지 않는다.

실시예 1: SFTSV의 N glycoprotein (Gn) 결손 재조합 아데노바이러스-5 발현 벡터 제조

SFTSV의 N glycoprotein의 TM 도메인이 결실된 펩타이드(서열식별번호: 1)을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(서열식별번호: 2)이 삽입된 재조합 아데노바이러스-5 발현 벡터를 다음과 같이 제조하였다.

아데노바이러스 발현 시스템으로 AdenoX™-CMV를 사용하였고, 발현 시스템의 5' 말단에 SFTSV의 Gn 유전자의 일부가 결실된 서열식별번호: 2의 뉴클레오타이드(이하, 서열식별번호: 1의 펩타이드 또는 서열식별번호: 2의 뉴클레오타이드 서열에 대하여 "Gn(△TM)"이라고 명명될 수 있다)를 삽입하여, 재조합 아데노바이러스-5 발현 벡터를 제조하였다. Forward primer (5'- GTAACTATAACGGTCGCCACCATGATGAAAGTGATTTGGTTCTCCTCTCTGA -3')와 Reverse primer (5'- ATTACCTCTTTCTCCTCACTTCTTGGCGGGGTAGCACTG -3')를 사용하여, 서열식별번호: 2의 Gn(△TM) 뉴클레오타이드가 AdenoX™-CMV(Takara) vector를 구성하는 CMV promoter의 3' 쪽의 말단 서열에 위치하도록 합성하고, In-Fusion 효소를 사용하여 DNA의 상동서열끼리 fusion하여 Gn(△TM) 뉴클레오타이드가 벡터 안으로 들어가도록 cloning하였다.

이하, 본 실시예에서 제조된 재조합 아데노바이러스 벡터를 Ad5-Gn으로 명명한다. 최종적으로 제조된 재조합 아데노바이러스-5 발현 벡터는 다음과 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 있다.

서열식별번호: 5, 서열식별번호: 6 (SV40 Small t intron), 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 8 (SV40 NLS(Nuclear localization signal)), 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10 (SV40 polyA signal), 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12 (Lav2 primer), 서열식별번호: 13 (Ad Sa, Adenovirus major late transcript splice site를 포함하는 DNA 중합효소, 서열식별번호: 12와 일부 중첩), 서열식별번호: 14 (L1, 서열식별번호: 13과 일부 중첩), 서열식별번호: 15, 서열식별번호: 16 (E2b), 서열식별번호: 17, 서열식별번호: 18 (L1), 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 20 (ProⅦ), 서열식별번호: 21, 서열식별번호: 22 (pⅥ1), 서열식별번호: 23, 서열식별번호: 24 (L4), 서열식별번호: 25, 서열식별번호: 26 (endopeptidase), 서열식별번호: 27, 서열식별번호: 28 (DNA binding protein), 서열식별번호: 29, 서열식별번호: 30 (L5), 서열식별번호: 31, 서열식별번호: 32 (E4), 서열식별번호: 33, 서열식별번호: 34 (Inverted terminal repeat of human adenovirus serotype 5, ITR), 서열식별번호: 35, 서열식별번호: 36 (T7 promoter), 서열식별번호: 37, 서열식별번호: 38 (ITR), 서열식별번호: 39, 서열식별번호: 40 (Ad5Ψ, Packaging signal for adenovirus serotype 5), 서열식별번호: 41, 서열식별번호: 42 (Human cytomegalovirus immediate early enhancer), 서열식별번호: 43, 서열식별번호; 44 (Human cytomegalovirus promoter), 서열식별번호: 45, 서열식별번호: 46 (Kozak sequence), 서열식별번호: 2.

실시예 2: SFTS의 N glycoprotein (Gn) 결실 재조합 단백질 제조

서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 가지는 재조합 단백질을 다음과 같이 합성하였다. 곤충 세포에서 발현 효율을 높일 수 있도록 SFTS의 Gn의 일부를 결손, 최적화(optimization)한 서열식별번호: 4의 뉴클레오타이드 서열을 가지는 핵산을 발현 벡터에 삽입하였다 (이하, 서열식별번호: 4의 펩타이드 및 서열식별번호: 4의 뉴클레오타이드 서열을 가지는 핵산 분자를 "Gn△STEM" 또는 "Gn protein"으로 명명한다). 곤충 세포에서 생산된 재조합 단백질이 세포 외로 분비되도록 서열식별번호: 3의 뉴클레오타이드의 5'말단과 3' 말단에 각각 Choristoneura fumiferana nuclear polyhedrosis virus (CfMNPV)의 major envelope glycoprotein GP67의 secretory sequence를 암호화하는 뉴클레오타이드 (서열식별번호: 47)과, 정제의 편의를 위하여 6개의 히스티딘(H)을 암호화하는 뉴클레오타이드를 연결시킨 융합 단백질을 암호화하는 서열을 준비하였다. 설계된 유전자는 Baculovirus 발현 시스템인 pFastbac™ 1 벡터의 BamH I 과 Xho I 부위에 삽입되어 GeneScript로부터 전달받았다.

Gn△STEM 염기 서열을 가지는 재조합 Baculovirus 벡터를 제작하기 위하여, 1% 페니실린/스트렙토마이신(Invitrogen)이 들어 있는 무-혈청 Sf-900^tm II 배지 (Invitrogen)에 Sf9 세포(Spodoptera frugiperda)를 27℃ 온도로 설정된 쉐이킹 인큐베이터에서 현탁액 상태로 배양(suspension culture)하였다. GnSTEM 서열을 가지는 재조합 Baculovirus 벡터는 제조사(Invitrogen)의 프로토콜에 따라 Bac-to-Bac™ Baculovirus 발현 시스템을 이용하여 제작하였다. GnSTEM 서열을 가지는 pFastbac™ 1 벡터를 DH10Bac(Invitrgen)에 형질전환(transformation)하여 재조합 백미드(bacmid, Baculovirus shuttle vector)를 제조하였다. 재조합 된 백미드는 M13 프라이머 (Invitrogen)를 이용한 PCR을 수행하여, 재조합 백미드 내에 표적이 되는 재조합 서열을 확인하였다. 표적 서열이 삽입된 것이 확인된 재조합 백미드는 셀펙틴(Invitrogen)을 이용하여 sf9 세포에 형질감염(transfection)시켰다. 형질 감염 후 3일째에 세포에서 생성된 GnSTEM 서열을 가지는 재조합 Baculovirus (passage 1, P1)를 수집하고 새로운 sf9 세포에 두 번 반복적으로 감염시켜 높은 역가의 바이러스(P2~P3)를 생산하였다. sf9 세포의 형태 변화를 통해 백미드에 의해 형질감염된 것을 확인하였다. 생산된 재조합 Baculovirus는 소분하여 -80℃ 와 4℃ 냉장고에 보관하고 Sf9 세포에서 플라크 확인법을 통하여 역가를 확인하였다.

재조합 단백질의 발현 효율을 확인하기 위하여, 역가가 확인된 바이러스 1 MOI (multiplicity of infection) ~ 10 MOI를 동일한 수의 Sf9 세포에 감염시킨 후 27℃ 온도에서 3일~5일 동안 배양하고 배양액으로 웨스턴 블로팅(Western　blotting)을 수행하여, 최적 단백질 발현 조건을 확인하였다. 웨스턴 블로팅 실험에는 Anti-6X His tag® antibody [HIS.H8] (Abcam, ab18184) 항체를 1:1,000으로 희석하여 발현 조건을 확인하였다.

3 x 10⁶ cell/mL 로 준비된 sf9 세포에 GnSTEM 서열을 가지는 Baculovirus 5 MOI를 접종한 후 27℃ 온도에서 쉐이킹 인큐베이터로 3일 배양하여 재조합 단백질을 생산하였다. 생산된 배양액은 원심분리기를 통하여 세포와 배양액을 분리한 후 0.2 ㎛ 필터(Nalgene??)로 여과하였다. 배양액에서 GnSTEM 단백질을 정제하기 위하여, Akta start 기계(cytiva)에 HisTrap™ HP 5 mL(GE Healthcare) 컬럼을 사용하여 친화 크로마토그래피 (affinity chromatography) 정제방법에 따라 정제를 진행하였다.

A buffer(50 mM Na2HPO4, 300 mM NaCl, 10 % glycerol, PH 8.0)로 equalization시킨 HisTrap 컬럼에 배양액을 흘려 보내주고 35 mM A buffer (A buffer + imidazole 35 mM)로 세척을 한 다음 500 mM B buffer(A buffer + imidazole 500 mM)로 1 mL씩 30개의 정제 샘플을 받았다. 정제 샘플 중에서 SDS-PAGE로 깨끗하고 높은 농도의 단백질 샘플을 선택한 다음, Amicon ultra tube (MerckMillipore)에서 PBS (phosphate buffered saline)를 섞어가며 imidazole 제거 및 단백질 농축의 과정을 거쳤다. 농축된 단백질의 정량 및 순도를 확인하기 위하여 SDS-PAGE를 실시하였고 비교 단백질로 BSA를 사용하였다. 정제된 GnSTEM 단백질을 확인하였다. 위와 같이 제조된 SFTSV의 변이된 GnSTEM 재조합 단백질(이하, "Gn protein"으로 명명하는 경우가 있음)을 국제백신연구소로부터 제공받아, 후속 실험에 사용하였다.

실시예 3: in vivo 마우스 면역 및 항원 특이적 항체 측정

Wild type C57/BL6 6주령 마우스에 Ad5-Gn과 GnSTEM 재조합 단백질을 2주 간격으로 2회 근육주사 한 뒤, 마지막 면역 후 2주일 후에 마우스의 혈액을 채취하고, 혈청에서 항원 특이적 면역글로불린을 분비하는 정도를 측정하였다.

면역증강제의 하나인 RNA 면역증강제(이하, "RNA"로 명명되는 경우가 있음)는 pGH 플라스미드 벡터에 T7 프로모터 서열(서열식별번호: 48), Cricket paralysis virus (CrPV)의 IGR IRES 서열(서열식별번호: 49), BamH1 인식 부위(GGATCC) / EcoR1 인식 부위(GAATTC) / Pac1 인식 부위(TTAATTAA) / Sac1 인식 부위(GAGCTC)가 연속되는 MCS (multi-cloning site), SV40 poly A signal 서열 (서열식별번호: 50), Linearization을 위한 Not1 인식 부위(GDGGCCGC)로 이루어진 pCrPV를 pEMCV를 삽입한 뒤, in vitro transcription을 수행하여 합성하였다.

본 실시예에 사용된 마우스 그룹은 하기 표 1과 같고, 각 그룹 당 5마리의 마우스를 면역시켰다.

면역 그룹

그룹	1차 면역	2차 면역	용량
G1	PBS	PBS
G2	Adeno5-Gn	Adeno5-Gn	Adeno5-Gn: 1x10⁹ IU/ mouse
G3	Gn protein + Alum + RNA 면역증강제	Gn) protein + Alum + RNA	Gn protein: 10 ㎍/ mouse Alum: 240 ㎍/ mouse RNA 면역증강제: 20 ㎍/ mouse

1차 면역 후 2주, 2차 면역 후 2주가 경과된 시점에서 마우스를 마취시켜 얼굴에 있는 혈관에서 혈액을 채취하였다. 채취한 혈액은 상온에 2시간 이상 두어 혈구를 응집시킨 후 4000 g 에서 15분 동안 원심분리 하여 혈청을 따로 분리하였다. 96-well plate에 Gn 단백질 100 ㎕/well을 코팅하고, 4℃에서 overnight 또는 37℃에서 2시간 incubation하였다. 세척 및 PBS 200 ㎕/well로 blocking하고 상온에서 1시간 반응시킨 뒤, 다시 세척하였다. 1차 항체로서 마우스 혈청을 blocking buffer로 1:200으로 희석한 뒤, 100 ㎕/well에 넣고 상온에서 2시간 반응시키고, 0.5% PBST 200 ㎕로 3번 씻었다. 2차 항체로 goat anti-mouse IgG H+I HRP conjugated를 blocking buffer로 1:3000으로 희석하여 100 ㎕/well의 농도로 넣고, 상온에서 2시간 반응시키고 씻어준 후 TMB 용액을 100 ㎕씩 넣어주어 발색을 확인하였다. 발색이 충분히 진행되었으면 2N 황산을 50 ㎕/well씩 넣어 반응을 멈추고, 흡광도를 측정할 수 있는 spectrophotometer를 이용해 450 nm의 파장으로 흡광도를 측정한다. 본 실시예에 따른 ELISA 측정 결과를 도 1a 내지 도 1d에 나타낸다. 생리 식염수를 주사한 음성 대조군(G1, Nil)과 달리 재조합 아데노바이러스 벡터 또는 재조합 단백질로 면역한 그룹에서 특이적인 항체가 많이 생성되었다. 특히, 재조합 아데노바이러스로 면역한 그룹에서 Th1 면역 반응에 관여하는 IgG2c가 많이 생성되었다.

실시예 4: 바이러스 특이적 중화항체 생성 측정

실시예 3의 면역 스케줄에 따라 마우스를 희생할 때 채취한 혈청을 이용하여 SFTSV 특이적인 중화항체를 측정하였다. 첫째 날에 1.5Х10⁵ Vero E6 cells/well 24-well 배양 플레이트에 접종하고 5% CO₂ 환경 조건의 37

에서 밤새 incubation하였다. 면역시킨 마우스 혈청 60 ㎕를 56

에서 30분간 불활성화한 후 정상 배지 540 ㎕에 1:10으로 희석하였다. 희석한 혈청을 1:2로 계속 희석해서 1/10부터 1/320까지 총 6 단계의 희석한 혈청을 준비하였다. 불활성화 및 희석시킨 혈청 200 ㎕와 SFTSV (80 ffu/well)을 혼합하고, 성장 배지를 제거한 뒤, 혈청/바이러스 혼합물 100 ㎕를 각각의 well에 첨가하였다. 5% CO₂ 환경 조건의 37

에서 1시간 incubation하고 20분 간격으로 흔들어서 바이러스가 세포에 감염될 수 있도록 유도하였다. 바이러스를 제거하고, 1.5% 카르복시메틸셀룰로오스 용액을 넣어 고정하고, 5% 5% CO₂ 환경 조건의 37

에서 2일 동안 incubation하였다. 상층 배양액을 제거하고, PBS로 세척한 뒤, 4% 포름알데히드를 각각의 well에 첨가하여 세포를 고정시킨 뒤, 상온에서 10분 동안 incubation하였다. 고정액을 제거하고 다시 PBS로 세척하였다. PBS에 용해된 0.5% Triton X-100으로 희석(1:500)한 anti-SFTSV NP mAB 500 ㎕/well을 첨가하고 90분 동안 rocking incubation을 진행하였다. 용액을 제거하고 PBS로 다시 세척하였다. PBS에 용해된 0.5% Triton X-100으로 희석(1:2000)한 HRP-conjugated 2차 항체 500 ㎕/well을 첨가하고, 다시 90분 동안 incubation하였다. 용액을 제거하고 BPS로 세척하고, 갈색 foci를 관찰할 수 있도록 DAB 기질 500 ㎕/well을 추가하고, 반응을 종료하도록 DI로 세척하였다. 음성 컨트롤과 대비하여 foci가 얼마나 줄었는지 비율을 확인하고, 50% 감소 비율을 가지고 있는 희석 배율을 FRNT50 titer로 결정하였다. 재조합 단백질로만 면역한 그룹은 음성 대조 그룹과 마찬가지로 중화항체가 거의 생성되지 않았다. 재조합 단백질로만 면역한 그룹과 비교해서, 재조합 바이러스 벡터로 면역한 그룹에서 중화항체가 크게 증가한 것을 확인하였다.

실시예 5: in vivo 마우스 면역 및 항원 특이적 항체 측정

하기 표 2와 같이 면역 그룹을 구분한 것을 제외하고, 실시예 3과 동일한 절차에 따라 마우스를 면역하고, 항원 특이적 항체를 측정하였다.

면역 그룹

그룹	1차 면역	2차 면역	용량
G1	PBS	PBS
G2	Adeno5-Gn	Gn protein + Alum + RNA 면역증강제	Adeno5-Gn: 1x10⁹ IU/ mouse Gn protein: 10 ㎍/ mouse Alum: 240 ㎍/ mouse RNA 면역증강제: 20 ㎍/ mouse
G3	Gn protein + Alum + RNA	Adeno5-Gn	Adeno5-Gn : 1x10⁹ IU/ mouse Gn protein: 10 ㎍/ mouse Alum: 240 ㎍/ mouse RNA 면역증강제: 20 ㎍/ mouse
G4	Adeno5-Gn	Adeno5-Gn	Adeno5-Gn:1x10⁹ IU/ mouse
G5	Gn protein + Alum + RNA	Gn protein + Alum + RNA 면역증강제	Gn protein: 10 ㎍/ mouse Alum: 240 ㎍/ mouse RNA 면역증강제: 20 ㎍/ mouse

ELISA를 이용하여 면역된 마우스 혈청에서 얻어진 항원 특이적 항체의 분비량 측정 결과를 도 3a 내지 도 3d에 나타낸다. 재조한 단백질로 면역한 군(G5)과 비교하여, 실시예 1에서 제조된 재조합 아데노바이러스 벡터로 면역한 그룹(G2 내지 G4)에서 항원 특이적 항체의 분비량이 증가하였다. 1차 면역에서는 Gn protein은 Th2 면역 반응에 관여하는 IgG1의 분비가 더욱 잘 유도되었으며, 재조합 아데노바이러스 벡터(Adeno-Gn)은 Th1 면역 반응에 관여하는 IgG2c의 분비를 효율적으로 유도하였다. 2차 면역 결과에서 재조합 아데노바이러스 벡터와 재조합 단백질을 단독으로 2회 면역하는 그룹보다는 1차와 2차 면역 중에서 한 번은 재조합 아데노바이러스 벡터로 면역하고 다른 한 번은 재조한 단백질로 면역하는 그룹에서 항체 titer를 높게 유도하는 것을 확인하였다. 특히, IgG2c titer에 비추어 볼 때, 1차 면역에서 재조합 아데노바이러스 벡터(Adeno-Gn)으로 면역하고, 2차 면역에서 재조합 단백질(Gn protein)으로 면역한 그룹(G3)에서 Th1 면역 반응을 효율적으로 유도하였다.

실시예 6: 바이러스 특이적 중화항체 생성 측정

실시예 5의 스케줄에 따라 마우스를 희생할 때 채취한 혈청을 이용하여, 실시예 4와 동일한 절차에 따라 SFTSV 특이적 중화항체를 측정하였다. 측정 결과를 도 4에 나타낸다. 재조한 단백질(Gn protein)으로만 2회 면역한 그룹(G5)은 음성 대조 그룹(G1)과 마찬가지로 중화항체가 형성되지 않거나 매우 낮은 중화항체가 생성되었다. 반면, 재조합 아데노바이러스 벡터(Adeno5-Gn)만으로 면역한 그룹(G4)는 재조합 단백질로만 면역한 그룹과 비교해서 높은 중화항체가를 보여주었다.

한편, 재조합 단백질이나 재조합 아데노바이러스 벡터를 단독으로 면역시킨 그룹과 비교하면, 재조합 단백질과 재조합 아데노바이러스 벡터를 heterologous prime-boost한 그룹에서 높은 중화항체가를 보여주었다. 재조합 아데노바이러스 벡터로 1차 면역하고, 재조합 단백질로 2차 면역한 그룹에서 가장 높은 중화항체가를 보였다.

실시예 7: in vivo 마우스 면역 및 항원 특이적 항체 측정

하기 표 3과 같이 면역 그룹을 구분한 것을 제외하고, 실시예 3과 동일한 절차에 따라 마우스를 면역하고, 항원 특이적 항체를 측정하였다.

면역 그룹

그룹	1차 면역	2차 면역	용량
G1	PBS	PBS
G2	Adeno5-Gn	Gn protein	Adeno5-Gn : 1x10⁹ IU/ mouse Gn protein: 10 ㎍/ mouse
G3	Gn protein +	Adeno5-Gn	Adeno5-Gn: 1x10⁹ IU/ mouseGn protein: 10 ㎍/ mouse
G4	Gn protein	Gn protein + Alum + RNA 면역증강제	Gn protein: 10 ㎍/ mouse Alum: 240 ㎍/ mouse RNA 면역증강제: 20 ㎍/ mouse
G5	Gn protein	Gn protein + ASO4	Gn protein: 10 ㎍/ mouse ASO4: l0 ㎍/ mouse

ELISA를 이용하여 면역된 마우스 혈청에서 얻어진 항원 특이적 항체의 분비량 측정 결과를 도 5a 내지 도 5d에 나타낸다. 1차 면역 결과에서 재조합 단백질은 IgG1의 분비를 효율적으로 유도하고, 재조합 아데노바이러스 벡터가 IgG2c의 분비를 효율적으로 유도하는 것을 다시 확인하였다. 면역증강제로 AS04를 사용하면, 재조합 단백질만으로 면역하더라도 IgG2c의 분비를 유도할 수 있었다.

2차 면역 결과에서 재조합 아데노바이러스 벡터(Adeno5-Gn)을 1차로 면역한 뒤, 재조합 단백질(Gn protein)로 면역하면, heterologous prime-boost에 의한 효과로 Gn protein만 단독으로 면역 진행한 그룹과 비슷한 수준으로 IgG1 titer가 증가하는 것을 보여주었고, IgG2c titer는 다른 그룹과 비교하여 월등히 높은 수치를 보였다.

실시예 8: Anti IFNAR 항체를 주입 후 SFTSV로 공격

Wild type mouse (C57BL/6)를 실시예 7의 표 3과 같이 5개의 그룹으로 구분하여, Anti-IFNAR antibody를 피하 주사(subcutaneous injection)하여 IFNAR를 blocking하여 IFN를 blocking한 뒤, 2주 간격으로 5개의 그룹에 재조한 단백질(Gn protein) 또는 재조합 아데노바이러스 발현 벡터(Adeno-Gn)을 항원으로 주입하고, 필요에 따라 면역증강제를 함께 주입하여 면역시킨 뒤, 마우스의 체중 변화, 마우스 비장 세포의 무게 변화 등을 측정하였다. 면역시킨 마우스의 체중 변화 측정 결과를 도 6에 나타낸다. 재조합 아데노바이러스 벡터와 재조합 단백질을 heterologous하게 면역한 그룹에서는 몸무게가 줄지 않고 약간 증가하는 것을 보였고 Nil그룹과 Gn protein만을 면역한 그룹은 몸무게가 감소하는 경향을 보여주었다.

바이러스 감염 7일 후 부검하여 마우스 spleen의 무게를 측정하였다. 측정 결과를 도 7에 나타낸다. 다른 그룹과 비교해서, 재조합 아데노바이러스 벡터(Ad5-Gn)와 재조합 단백질(Gn protein)을 heterologous 하게 면역한 그룹에서 spleen의 무게가 낮은 것을 확인할 수 있고 Gn protein을 단독으로 면역한 그룹의 spleen 무게는 Nil그룹과 비슷하게 측정되었다.

부검하여 얻은 마우스의 spleen을 일부 잘라서 그 안에 있는 바이러스의 수 (viral titer)를 Real-time PCR로 측정하였다. 측정 결과를 도 8에 나타낸다. 마찬가지로 재조합 아데노바이러스 벡터(Ad5-Gn)와 재조합 단백질(Gn protein)을 heterologous 하게 면역한 그룹에서 Gn protein을 단독으로 면역한 그룹들보다 월등히 낮은 경향을 보여주었다.

이 결과를 통해 재조합 아데노바이러스 벡터와 재조합 단백질을 heterologous하게 면역을 진행했을 경우, heterologous prime-boost에 의한 효과로 Gn protein과 alum, AS04과 같은 면역증강제를 함께 면역하는 경우 (단백질 항원만 면역, homologous)보다 더 잘 SFTSV로부터 보호하는 것을 알 수 있었다.

상기에서는 본 발명의 예시적인 실시형태 및 실시예에 기초하여 본 발명을 설명하였으나, 본 발명이 상기 실시형태 및 실시예에 기재된 기술사상으로 한정되는 것은 아니다. 오히려 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 전술한 실시형태 및 실시예를 토대로 다양한 변형과 변경을 용이하게 추고할 수 있다. 하지만, 이러한 변형과 변경은 모두 본 발명의 권리범위에 속한다는 점은, 첨부하는 청구범위에서 분명하다.

<110> THE CATHOLIC UNIVERSITY OF KOREA INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> RECOMBINANT VIRAL VECTOR AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION INCLUIDNG THEREOF <130> 2919 <160> 50 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 452 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified SFTSV glycoprotein N <400> 1 Met Met Lys Val Ile Trp Phe Ser Ser Leu Ile Cys Leu Val Ile Gln 1 5 10 15 Cys Ser Gly Asp Ser Gly Pro Ile Ile Cys Ala Gly Pro Ile His Ser 20 25 30 Asn Lys Ser Ala Ser Ile Pro His Leu Leu Gly Tyr Ser Glu Lys Ile 35 40 45 Cys Gln Ile Asp Arg Leu Ile His Val Ser Ser Trp Leu Arg Asn His 50 55 60 Ser Gln Phe Gln Gly Tyr Val Gly Gln Arg Gly Gly Arg Ser Gln Val 65 70 75 80 Ser Tyr Tyr Pro Ala Glu Asn Ser Tyr Ser Arg Trp Ser Gly Leu Leu 85 90 95 Ser Pro Cys Asp Ala Asp Trp Leu Gly Met Leu Val Val Lys Lys Ala 100 105 110 Lys Gly Ser Asp Met Ile Val Pro Gly Pro Ser Tyr Lys Gly Lys Val 115 120 125 Phe Phe Glu Arg Pro Thr Phe Asp Gly Tyr Val Gly Trp Gly Cys Gly 130 135 140 Ser Gly Lys Ser Arg Thr Glu Ser Gly Glu Leu Cys Ser Ser Asp Ser 145 150 155 160 Gly Thr Ser Ser Gly Leu Leu Pro Ser Asp Arg Val Leu Trp Ile Gly 165 170 175 Asp Val Ala Cys Gln Pro Met Thr Pro Ile Pro Glu Glu Thr Phe Leu 180 185 190 Glu Leu Lys Ser Phe Ser Gln Ser Glu Phe Pro Asp Ile Cys Lys Ile 195 200 205 Asp Gly Ile Val Phe Asn Gln Cys Glu Gly Glu Ser Leu Pro Gln Pro 210 215 220 Phe Asp Val Ala Trp Met Asp Val Gly His Ser His Lys Ile Ile Met 225 230 235 240 Arg Glu His Lys Thr Lys Trp Val Gln Glu Ser Ser Ser Lys Asp Phe 245 250 255 Val Cys Tyr Lys Glu Gly Thr Gly Pro Cys Ser Glu Ser Glu Glu Lys 260 265 270 Ala Cys Lys Thr Ser Gly Ser Cys Arg Gly Asp Met Gln Phe Cys Lys 275 280 285 Val Ala Gly Cys Glu His Gly Glu Glu Ala Ser Asp Ala Lys Cys Arg 290 295 300 Cys Ser Leu Val His Lys Pro Gly Glu Val Val Val Ser Tyr Gly Gly 305 310 315 320 Met Arg Val Arg Pro Lys Cys Tyr Gly Phe Ser Arg Met Met Ala Thr 325 330 335 Leu Glu Val Asn Pro Pro Glu Gln Arg Ile Gly Gln Cys Thr Gly Cys 340 345 350 His Leu Glu Cys Ile Asn Gly Gly Val Arg Leu Ile Thr Leu Thr Ser 355 360 365 Glu Leu Lys Ser Ala Thr Val Cys Ala Ser His Phe Cys Ser Ser Ala 370 375 380 Thr Ser Gly Lys Lys Ser Thr Glu Ile Gln Phe His Ser Gly Ser Leu 385 390 395 400 Val Gly Lys Thr Ala Ile His Val Lys Gly Ala Leu Val Asp Gly Thr 405 410 415 Glu Phe Thr Phe Glu Gly Ser Cys Met Phe Pro Asp Gly Cys Asp Ala 420 425 430 Val Asp Cys Thr Phe Cys Arg Glu Phe Leu Lys Asn Pro Gln Cys Tyr 435 440 445 Pro Ala Lys Lys 450 <210> 2 <211> 1359 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified SFTSV glycoproein N <400> 2 atgatgaaag tgatttggtt ctcctctctg atttgtctgg tcattcagtg tagcggggat 60 tctggaccta ttatctgtgc tgggccaatc cacagcaaca agagcgcctc catcccccac 120 ctgctgggct actccgagaa gatctgccag atcgaccgcc tgatccacgt gagctcctgg 180 ctgcggaacc acagccagtt ccagggatac gtgggacaga ggggaggccg cagccaggtg 240 tcctactatc cagccgagaa ttcttatagc agatggtccg gcctgctgtc tccatgtgac 300 gcagattggc tgggcatgct ggtggtgaag aaggccaagg gctctgatat gatcgtgcct 360 ggcccaagct acaagggcaa 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gccctggtgg atggcacaga gttcaccttt 1260 gagggctcct gcatgttccc agacggctgt gatgccgtgg actgcacctt ctgtagagag 1320 tttctgaaga acccacagtg ctaccccgcc aagaagtga 1359 <210> 3 <211> 320 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified SFTSV Glycoprotein N <400> 3 Asp Thr Gly Pro Ile Ile Cys Ala Gly Pro Ile His Ser Asn Lys Ser 1 5 10 15 Ala Asn Ile Pro His Leu Leu Gly Tyr Ser Glu Lys Ile Cys Gln Ile 20 25 30 Asp Arg Leu Ile His Val Ser Ser Trp Leu Arg Asn His Ser Gln Phe 35 40 45 Gln Gly Tyr Val Gly Gln Arg Gly Gly Arg Ser Gln Val Ser Tyr Tyr 50 55 60 Pro Ala Glu Asn Ser Tyr Ser Arg Trp Ser Gly Leu Leu Ser Pro Cys 65 70 75 80 Asp Ala Asp Trp Leu Gly Met Leu Val Val Lys Lys Ala Lys Gly Ser 85 90 95 Asp Met Ile Val Pro Gly Pro Ser Tyr Lys Gly Lys Val Phe Phe Glu 100 105 110 Arg Pro Thr Phe Asp Gly Tyr Val Gly Trp Gly Cys Gly Ser Gly Lys 115 120 125 Ser Arg Thr Glu Ser Gly Glu Leu Cys Ser Ser Asp Ser Gly Thr Ser 130 135 140 Ser Gly Leu Leu Pro Ser Asp Arg Val Leu Trp Ile Gly Asp Val Ala 145 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ttgctggcct tttgctcaca tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg 2520 tattaccgcc tttgagtgag ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga 2580 gtcagtgagc gaggaagcgg aagagcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg 2640 gccgattcat taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg 2700 caacgcaatt aatgtgagtt agctcactca ttaggcaccc caggctttac actttatgct 2760 tccggctcgt atgttgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagcta 2820 tgaccatgat tacgccaagc tatttaggtg acactataga atactcaagc tagttaatta 2880 acgttaatta a 2891 <210> 38 <211> 103 <212> DNA <213> Human adenovirus type 5 <400> 38 catcatcaat aatatacctt attttggatt gaagccaata tgataatgag ggggtggagt 60 ttgtgacgtg gcgcggggcg tgggaacggg gcgggtgacg tag 103 <210> 39 <211> 87 <212> DNA <213> Human adenovirus type 5 <400> 39 tagtgtggcg gaagtgtgat gttgcaagtg tggcggaaca catgtaagcg acggatgtgg 60 caaaagtgac gtttttggtg tgcgccg 87 <210> 40 <211> 151 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Kozak sequence <400> 40 gtgtacacag gaagtgacaa ttttcgcgcg gttttaggcg gatgttgtag taaatttggg 60 cgtaaccgag taagatttgg ccattttcgc gggaaaactg aataagagga agtgaaatct 120 gaataatttt gtgttactca tagcgcgtaa t 151 <210> 41 <211> 99 <212> DNA <213> Human adenovirus type 5 <400> 41 ctctagcatc gtaactataa cggtcctaag tggctcgagt agttattaat agtaatcaat 60 tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccg 99 <210> 42 <211> 255 <212> DNA <213> Human cytomegalovirus <400> 42 cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 60 gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 120 atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 180 aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 240 catgacctta tggga 255 <210> 43 <211> 49 <212> DNA <213> Human adenovirus type 5 <400> 43 ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt agtcatcgct attaccatg 49 <210> 44 <211> 204 <212> DNA <213> Human cytomegalovirus <400> 44 gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc ggtttgactc acggggattt 60 ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac 120 tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg 180 tgggaggtct atataagcag agct 204 <210> 45 <211> 60 <212> DNA <213> Human adenovirus type 5 <400> 45 ggtttagtga accgtcagat ccgtcgacgc gtaactataa cggtcgtaac tataacggtc 60 60 <210> 46 <211> 6 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Kozak sequence <400> 46 gccacc 6 <210> 47 <211> 114 <212> DNA <213> Choristoneura fumiferana nucleopolyhedrovirus <400> 47 atggtcctgg tgaaccagtc ccaccagggt ttcaacaagg agcacacctc taagatggtg 60 tccgctatcg tcctgtacgt gctgctcgct gccgctgccc actctgcttt cgct 114 <210> 48 <211> 18 <212> DNA <213> bacteriophage T7 <400> 48 taatacgact cactatag 18 <210> 49 <211> 195 <212> DNA <213> Cricket paralysis virus <400> 49 aaagcaaaaa tgtgatcttg cttgtaaata caattttgag aggttaataa attacaagta 60 gtgctatttt tgtatttagg ttagctattt agctttacgt tccaggatgc ctagtggcag 120 ccccacaata tccaggaagc cctctctgcg gtttttcaga ttaggtagtc gaaaaaccta 180 agaaatttac ctgct 195 <210> 50 <211> 221 <212> DNA <213> Simian virus 40 <400> 50 agacatgata agatacattg atgagtttgg acaaaccaca acaagaatgc agtgaaaaaa 60 atgctttatt tgtgaaattt gtgatgctat tgctttattt gtaaccatta taagctgcaa 120 taaacaagtt aacaacaaca attgcattca ttttatgttt caggttcagg gggagatgtg 180 ggaggttttt taaagcaagt aaaacctcta caaatgtggt a 221

Claims

서열식별번호: 1의 펩타이드를 암호화하는 핵산 분자가 삽입된 재조합 바이러스 벡터.
제 1항에 있어서,
상기 재조합 바이러스 벡터는 인간 아데노바이러스 기반인 것을 특징으로 하는 재조합 바이러스 벡터.
제 1항에 있어서,
상기 재조합 바이러스 벡터는 인간 아데노바이러스 타입 5 기반인 것을 특징으로 하는 재조합 바이러스 벡터.
제 1항에 있어서,
상기 핵산 분자는 서열식별번호: 2의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 재조합 바이러스 벡터.
유전자 전달 컨스트럭트로서, 제 1항 내지 제 4항 중에서 어느 하나의 항에 기재된 재조합 바이러스 벡터를 유효 성분으로 포함하는, 중증열성혈소판감소증후군을 예방 또는 치료하기 위한 약학 조성물.
제 5항에 있어서, 상기 약학 조성물은 백신 조성물을 포함하는 약학 조성물.
제 6항에 있어서, 상기 백신 조성물은 적어도 하나의 면역 증강제를 더욱 포함하는 약학 조성물.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 핵산 분자와 작동 가능하게 연결되는 발현 조절 요소를 더욱 포함하는 재조합 바이러스 벡터.