CN103319589B

CN103319589B - 一种抑制胃癌干细胞增殖的生物活性肽的制备方法

Info

Publication number: CN103319589B
Application number: CN201310158789.9A
Authority: CN
Inventors: 苏秀兰; 俞兰; 崔宏伟
Original assignee: Affiliated Hospital Of Inner Mongolia Medical University
Current assignee: Affiliated Hospital Of Inner Mongolia Medical University
Priority date: 2013-04-23
Filing date: 2013-04-23
Publication date: 2016-03-30
Anticipated expiration: 2033-04-23
Also published as: CN103319589A

Abstract

本发明公开了一种抑制胃癌干细胞增殖的生物活性肽的制备方法，其包括从动物脏器中提取分离生物活性肽的步骤。本发明的方法操作简单，易于规模化和工业化生产，而且通过本发明的方法所制备的生物活性肽，能够有效的抑制胃癌干细胞增殖。

Description

一种抑制胃癌干细胞增殖的生物活性肽的制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，其涉及的是从动物脏器中提取分离生物活性肽的方法，并证实其对胃癌干细胞的增殖抑制作用。

背景技术

肿瘤组织中存在不同层次的细胞，其中干细胞cancerstemcells(CSCs)是导致肿瘤治疗失败的重要原因。研制新的针对CSCs的药物，在不需要杀灭所有肿瘤细胞的情况下可达到根治肿瘤的目的。目前的抗癌治疗对于CSC克隆的消除是失败的，反而有利于干细胞池的扩张。对于肿瘤成功的消除要求不仅要影响到分化了的肿瘤细胞，也要考虑潜在的肿瘤干细胞群。目前传统的抗癌治疗包括：化疗放疗和免疫治疗。很快的杀死了增长期的分化的肿瘤细胞，从而减少了肿瘤的负荷、体积，但同时却留下了潜在的干细胞群。最终导致了肿瘤的复发及对治疗有抗性、更具有侵袭性的肿瘤细胞的增殖，导致病人的最终死亡。所以理想的药物应该在杀死分化肿瘤细胞的同时，特意的、选择性的靶向性的杀死肿瘤干细胞，同时要避免对于其他细胞的毒性副反应，也是世界范围内研究的热点。

目前生物活性肽制备的常用方法：

(1)消化过程中产生或体外水解蛋白质产生；化学合成法：按其合成介质可分为“液相合成”和“固相合成”。固相合成法在20世纪60年代才出现，与传统的液相合成法并驾齐驱，其优越性在于固相载体有利于合成中不断增长的肽链固定、环化、去保护和纯化，且易实现自动化。然而，由于昂贵的设备和试剂，严重限制了固定相合成法在规模化生产上应用。目前主要在合成含有10～100个残基的多肽或为筛选而快速建立多肽库时应用。虽然液相合成法是合成小分子肽的浓缩多肽片段的有效方法，但化学合成法本身具有下述缺点：①消旋化和副反应；②需要对肽侧链中的基因进行保护，尤其是固相合成时；③需过量的链接试剂和酰基载体；④链接试剂的毒性残留影响制品和环境。

(2)酶法：采用酶法生产是当前研究的热点，因其安全性极高、价廉、易于推广而引起人们的极大兴趣。

大多数活性肽的生产流程为：原料蛋白→预处理→酶解→分离→精制→成品。

酶的选择是生产活性肽的关键。目前商业用酶主要是微生物酶(酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶及复合酶)、植物蛋白酶及少量的动物蛋白酶，研究者常常要从大量的酶中进行筛选，虽能根据原料蛋白的组成和酶的专一性作为参考，但仍存在较大的盲目性。尽管人们在生产中已采用了复合酶系，但由于酶反应体系是一个复杂的体系，共同作用机理仍有待于深入的研究。

分析上述获得活性肽的途径，由于昂贵的设备和试剂，提取工艺复杂限制了在规模化生产上应用，不利于产业化。另一方面，对于肿瘤干细胞作用的生物活性肽目前未见产生的。

目前，由于化学药物在肿瘤治疗中的毒副作用，特别是对正常细胞的杀伤作用等安全性问题不断暴露，势必被生物药物和天然药物逐渐取代。

发明内容

本发明所有解决的技术问题是如何提供一种抑制胃癌干细胞增殖的生物活性肽的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

一、选取中低分化人胃癌肿瘤组织，无菌条件下清洗后加入生理盐水粉碎、研磨后离心取无细胞上清液备用；

二、取1-3岁雄性山羊，在背部、足趾部多位点注射胃癌组织提取液，每周一次，每个部位0.2微升，连续注射4-6周后宰杀放血，在相对无菌条件下剥取肝脏；

三、组织称重，低温(4度)条件下粉碎、研磨组织，9000-10000转/分离心(15分钟)，然后纱布+脱脂棉过滤(离心后的上清液过滤)，过滤后滤液采用F14超滤器进行超滤，收集分子量在1万以下的部分；

四、中低压(范围介于0.4--0.6兆帕之间)色谱进一步分离、纯化，获得三个成分(三个峰)，收集第三成份(即第三峰)为所要研究的生物活性肽。

其中中低压色谱分离条件为

(1)、流动相：

A液：0.1％三氟乙酸的水溶液；

B液：0.05％三氟乙酸的乙腈溶液；

(2)、固定相：ODS色谱柱。

在本发明的一个优选实施方式中，所述的中低分化人胃癌肿瘤组织来自于体外培养或者是无生命的人。

本发明另一方面还涉及采用上述方法所获得的生物活性肽。

本发明另一方面还涉及上述生物活性肽在制备治疗抑制胃癌干细胞增殖的药物中的应用。

附图说明

图1：干细胞分选：MKN45细胞的CD44流式细胞分析及分选.左上图为流式分析CD44的空白对照；上排中图为同型对照；右上为荧光标记的CD44分析图。下排为荧光激活细胞流式分选图：分选对象绿色为CD44强阳性的细胞，红色为CD44阴性的细胞。

图2：分选后细胞形成的球形克隆(×200)。分别取第21天、第28天以及第6周的球形克隆细胞仍存活。而培养CD44阴性细胞1周后即出现细胞死亡

图3：克隆形成率分析ACBP-3抑制球形克隆细胞在完全培养基中形成细胞克隆。上图为下图中红色方框标示区域放大图。下图中，每列分别为含有不同细胞数的培养皿，从左至右分别为500、1000、2000个细胞；第一排为对照组，第二排为ACBP-3处理组。

图4：超微结构分析：用不同剂量的ACBP-3处理球形克隆细胞之后和未处理的细胞的超微结构。未处理的球形克隆细胞表面微绒毛丰富，伪足发达，可以观察到伪足达到4～5级分支(图，control，左图)。细胞分裂旺盛，可见许多正处于分裂中的细胞，细胞分裂存在两种形式，对称分裂(图control，中图)和不对称分裂(图control，右图)。

图5：CD44阳性细胞的含量分析：不同剂量的ACBP-3处理细胞后CD44阳性细胞的含量分析。上排为不同剂量ACBP-3处理细胞后分析CD44阳性细胞；下排为对照组及同型对照组CD44阳性分析，右下为不同剂量ACBP-3处理细胞后，CD44阳性细胞的比例比较柱形图，*P＜0.05；**P＜0.001。

图6：色谱图，横坐标代表样本出峰时间，纵坐标代表峰吸收的OD值。分离获得三个峰，分别收集每个成份，对第三个成份展开研究。

图7：电泳图：所获得成分浓缩为淡黄色透明液体，命名为ACBP-3，对所获得的物质进行凝胶电泳。分别把ACBP-3从1.565、3.13、4.695μg浓缩到1μl，进行凝胶电泳。

电泳结果显示，以marker为参照，ACBP-3的电泳条带从上至下可见5-6个条带，其中，主要的条带分布与7到9kDa。

具体实施方式

制备方法：

一、选取中低分化人胃癌肿瘤组织，无菌条件下清洗后加入生理盐水粉碎(按照1∶1的比例加入生理盐水)、研磨后离心取无细胞上清液备用；

二、2岁雄性山羊饲养一周后在背部、足趾部多位点注射胃癌组织提取液，每周一次，每个部位0.2微升，连续五次后宰杀放血，在相对无菌条件下剥取肝脏；

三、组织称重，低温条件下粉碎、研磨组织，9500转/分离心，纱布+脱脂棉过滤，过滤后滤液采用F14超滤器进行超滤，收集分子量在1万以下的部分；

四、中低压色谱进一步分离、纯化，获得三个成分，收集第三成份(即第三峰)，并命名为ACBP-3

4.中低压色谱分离条件

(1)、流动相：

A液：0.1％三氟乙酸的水溶液；

B液：0.05％三氟乙酸的乙腈溶液；

(2)、固定相：ODS色谱柱

总过程共计38分钟。获得三个峰，分别对三个成分进行收集，并对第三峰展开研究。

生物学实验

流式细胞分离干细胞

培养MKN45细胞进入对数生长期并且达到70～80％细胞融合后，D-Hank’s液洗2次，吸净D-Hank’s液后，每个25cm²培养瓶中加入0.05％胰蛋白酶-0.02％EDTA1ml，定时9分钟，之后每个培养瓶中加入完全培养基2ml终止消化，轻柔吹打，将细胞悬液吸至15ml容量的塑料离心管中以800rcf离心5分钟，弃上清(尽量吸净)，加入PBS重悬细胞，并将细胞悬液调整至1×10⁷cells/ml。每100μl细胞悬液加入异硫氰酸荧光素标记的鼠抗人CD44抗体5μl，冰上避光孵育20分钟，孵育期间轻轻震荡防止细胞聚集。之后将细胞离心，弃上清，再用PBS清洗细胞2次，最后一次在PBS中重悬细胞，过300目过滤网将细胞悬液过滤为单细胞悬液，瞬即上机检测。细胞通过流式细胞仪(Becton-Dickinson)和Cellquest软件(Becton-Dickinson)进行分析。将新鲜制备的单细胞悬液(制备步骤同流式细胞分析的制备)经荧光激活细胞分选仪分选后分别用无菌流式细胞管接收CD44阳性和CD44阴性细胞，接收细胞的培养基为无血清培养基。

细胞球形克隆形成实验

研究表明，肿瘤细胞中的某些细胞在无血清、超低吸附的培养条件下形成球形克隆的能力是鉴定肿瘤干细胞的常用方法之一，待鉴定的细胞如果具有这种能力，表明其具有和肿瘤干细胞一致的自我更新能力。将刚分选的CD44阳性和CD44阴性的细胞计数，然后分别以每孔5个细胞的密度置于超低吸附96孔细胞培养板，每孔细胞保证200μl无血清培养基。培养环境：5％CO₂与95％空气、37℃恒温。每周光镜下观察细胞状态及细胞的球星克隆形成情况，并经过台盼蓝染色记录活细胞比例。

克隆形成率实验

细胞克隆形成能力与肿瘤细胞的群体依赖性和增殖能力密切相关，其大小可反映肿瘤细胞的成瘤能力和恶性程度。一般认为，克隆形成是由原癌基因所引发的信号通路替代了正常贴壁细胞生长的信号通路。细胞克隆形成实验是体外检测肿瘤细胞增殖能力的常用方法。本实验的具体操作步骤如下：挑出无血清培养基中的球形克隆，将其在完全培养基中重悬(作为对照组)，或在含有ACBP-3的完全培养基中重悬(作为实验组)，轻轻吹打均匀后进行细胞计数，两组细胞分别在100mm塑料培养皿中接种500、1000、2000个细胞，每日在光镜下观察，当任何一组的大部分细胞都形成大于50～100个细胞的时候，终止继续培养，PBS清洗细胞2次，4％的多聚甲醛固定15分钟，室温下用Giemsa染色30分钟，PBS清洗去除多余的染料，吸弃培养皿中剩余的PBS液，尽量吸净，将各皿置于空气中干燥，实验重复3次。

细胞增殖抑制实验

球形克隆的细胞在完全培养基中重悬，细胞计数，以每孔2000个细胞的密度接种于普通96孔细胞培养板，每孔补足100μl完全培养基。放入5％CO₂与95％空气、37℃恒温培养箱中培养24小时后，分别加入6种不同剂量的ACBP-3，剂量分别为10、13、16、19、22、25μg/ml。加入生理盐水作为空白对照，未处理的细胞作为对照。分别处理24、48、72小时后，每孔加入3-(4，5-二甲基噻唑-2基)-5-(3-羧甲酯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑，内盐.(MTS)20μl，放置5％CO₂与95％空气、37℃恒温培养箱中3小时后，在酶标仪于490nm处读光密度值。根据光密度值计算细胞生长曲线，细胞生长抑制率表示为(A-B)/A×100％(A，对照组的光密度值；B，ACBP-3处理组或空白对照组的光密度值)，并绘制ACBP-3处理的时间-剂量依赖曲线。ACBP-3降低CD44阳性细胞的比例

有研究证实人胃癌细胞系中，胃癌干细胞富集在CD44阳性的细胞群中。为探讨ACBP-3是否可以影响CD44阳性细胞群所占的比例，用不同剂量的ACBP-3处理CD44阳性细胞48小时。生理盐水处理的CD44阳性细胞作为对照。处理后重新经流式细胞分析鉴定。实验重复4次。CD44阳性细胞经过13μg/mlACBP-3处理后，阳性率降至68.3％；经19μg/mlACBP-3和25μg/mlACBP-3处理之后，CD44阳性率分别降至60.5％和56％。而对照组的细胞，CD44阳性细胞比例平均为90.7％；说明ACBP-3能够抑制CD44阳性细胞，促使其向CD44阴性细胞分化，导致ACBP-3处理后CD44阳性细胞比例下降，且该下降的程度呈剂量依赖性(P＜0.05)。

ACBP-3抑制球形克隆细胞在完全培养基中形成细胞克隆

进一步观察了ACBP-3对于形成球形克隆的细胞在完全培养基的普通培养条件下形成细胞克隆的能力。经过4次反复的实验，发现在持续低浓度的ACBP-3刺激的培养条件下，尽管将近55％的细胞经台盼蓝染色后证实为活细胞，但是却没有细胞克隆形成；而吉姆萨染色显示，没有经过活性肽处理的对照组在普通培养条件下形成大小不等的细胞克隆

动物体内试验：球形克隆细胞和CD44阴性细胞在免疫缺陷小鼠的成瘤能力实验

为验证细胞的成瘤能力，将8周龄大的NOD/SCID雌性小鼠分为2组，每组6只，经台盼蓝染色之后确认为活细胞的球形克隆细胞和新鲜分选的CD44阴性细胞进行细胞计数，将含有300个球形克隆细胞或5～10×10⁴个CD44阴性细胞的0.1mlPBS分别接种于小鼠腋下部位的皮下。每周观察异种移植瘤的生长情况，观察期为10周。验证球形克隆细胞的成瘤性之后，进一步验证经过ACBP-3处理的球形克隆细胞成瘤性。(1)将球形克隆细胞置于完全培养基12小时后，分为2组，实施不同的处理；(2)实验组中球形克隆细胞的培养基中加入19μg/mlACBP-3处理48小时；对照组的形克隆细胞的培养基中加入相同体积的生理盐水48小时；(3)将含有30000个经ACBP-3处理组细胞的PBS接种于NOD/SCID小鼠腋下部位的皮下；同时将含有30000个生理盐水处理组细胞的PBS接种于同只小鼠另一侧腋下与ACBP-3处理细胞接种对称位置的皮下；(4)共接种6只NOD/SCID小鼠。之后每2天检查双侧接种部位的肿瘤形成及生长情况；(5)当被接种小鼠任何一侧出现可触及的皮下肿物的时候开始记录肿瘤生长的数据；(6)当任何一只小鼠出现濒死状态的时候记录终止，6只小鼠同时处死。与对照组相比，ACBP-3治疗组在给药的第16天开始，其抑瘤效果与对照组相比有统计学差异；随着各组治疗时间延长，到治疗将近结束的时候，ACBP-3组呈现出小鼠带瘤生存状态良好。抑制率为43.32％

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。

Claims

1.一种抑制胃癌干细胞增殖的生物活性肽的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

三、组织称重，0-4℃低温条件下粉碎、研磨组织，9000-10000转/分离心10-25分钟，取上清液，使用纱布+脱脂棉过滤，过滤后滤液采用F14超滤器进行超滤，收集分子量在1万以下的部分；

四、进行中低压色谱进一步分离、纯化，获得三个成分，收集第三个色谱峰所代表的成份，即得生物活性肽；

其中中低压色谱分离条件为：

(1)、流动相：

A液：0.1％三氟乙酸的水溶液；

B液：0.05％三氟乙酸的乙腈溶液；

(2)、固定相：ODS色谱柱；所述的中低分化人胃癌肿瘤组织来自于体外培养或者是无生命的人。

2.权利要求1所述制备方法获得的生物活性肽。

3.权利要求1所述制备方法获得的生物活性肽在制备治疗抑制胃癌干细胞增殖的药物中的应用。