DE69808060T2

DE69808060T2 - Verfahren zur identifizierung von nukleinsäuren, welche agenzien kodieren, die zelluläre phenotypen beeinflussen

Info

Publication number: DE69808060T2
Application number: DE69808060T
Authority: DE
Inventors: Alexander Kamb
Original assignee: Deltagen Proteomics Inc
Current assignee: Deltagen Proteomics Inc
Priority date: 1997-03-04
Filing date: 1998-02-27
Publication date: 2003-04-30
Anticipated expiration: 2018-02-28
Also published as: US5955275A; DK0973943T3; CA2283261A1; NO994290L; US20020098503A1; EP0973943B1; US6579675B2; AU745827B2; EP0973943A1; NO994290D0; ATE224457T1; CA2283261C; IL131583A0; US20020018992A1; WO1998039483A1; DE69808060D1; AU6543898A; JP2001514510A

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung umfasst ein allgemeines Verfahren, das in eigentlich jedem Zelltyp zur Identifizierung von Nucleinsäuresequenzen, die biochemische Wege in einer Zelle stören, anwendbar ist.

Hintergrund

Genetische Verfahren spielten eine Hauptrolle bei Bemühungen, die molekulare Grundlage für biologische Phänomene zu verstehen. So verschaffte z. B. die genetische Analyse der Fruchtfliege, D. melanogaster, die Eintrittsstelle zur Isolation zahlreicher Gene, die die Entwicklung des Fliegenkörpers regulieren. Diese Gene wiederum dienten als Sonden für die Isolierung von Säugerhomologen, die die primären Werkzeuge molekularer Studien der Wirbeltierentwicklung waren.
Eine Reihe genetischer und biochemischer Studien zeigten, dass nahezu jeder biologische Prozess (d. h. Zellverhalten und ähnliches) in Teileinheiten aufgelöst werden kann. Dieser reduktionistische Ansatz der biologischen Untersuchung zielt darauf ab, den größeren Teil der Komplexität des Lebens an den vergleichsweise einfachen chemischen Begriffen von Molekülen und molekularer Wechselwirkung zu begreifen. In der Mitte des zwanzigsten Jahrhunderts, zeigten einige Wissenschaftler, von denen vielleicht am bemerkenswertesten George Beadle ist, dass der Stoffwechsel als eine Folge an Enzymen verstanden werden kann, die nacheinander tätig werden, um Vorläuferverbindungen in die metabolischen Endprodukte umzuwandeln. Diese Erkenntnis gab Anlass zur Vorstellung von genetischen oder biochemischen Wegen, die zelluläre Vorgänge kontrollieren. Schwierigere zelluläre Verhalten, wie z. B. die Differentierung, wurden kürzlich in Begriffen genetischer Programme und Wege definiert. Sogar von Krankheitsvorgängen kann in solchen Begriffen gedacht werden. Krebs zum Beispiel ist eine Krankheit, die durch den Verlust der zellulären Wachstumskontrolle gekennzeichnet ist. Eine effektive Strategie, Krebs zu studieren, umfasst die Beleuchtung von Wegen, die das zelluläre Wachstum regulieren. Viele Gene, die in die Wachstumskontrolle involviert sind, sind identifiziert worden und ein wesentlicher Fortschritt wurde gemacht durch das Verstehen der genetischen/biochemischen Schaltung dieser zusammengesetzten Gene.
Manche Organismen sind in genetischen Studien besonders leicht zu bearbeiten. Diese Organismen sind typischerweise entweder einzellig oder haben kurze Lebenszyklen, kleine Genome und eine Reihe anderer nützlicher Eigenschaften. Andere Organismen, wie z. B. Menschen, sind weniger leicht zu bearbeiten. Für leicht zu bearbeitende experimentelle Organismen stehen zwei grundlegende Ansätze der Mutantenisolierung zur Verfügung. Das erste Verfahren, als Screening bezeichnet, umfasst die manchmal mühselige Untersuchung tausender einzelner Organismen oder -Zellklone. Jene, die den passenden mutanten Phänotypen haben, werden von den anderen getrennt und es wird ihnen ermöglicht, isoliert zu wachsen. Auf diese Weise können homogene Populationen an Mutanten vermehrt und analysiert werden. Der zweite Ansatz umfasst das Wachstum von Organismen unter Bedingungen, die das Überleben von Phänotypvarianten gegenüber den Wildtyp-Phänotypen begünstigen. In dem Fall von Mikroorganismen umfassen die Selektionsbedingungen oftmals Nährstofferfordernisse oder Arzneimittelresistenzen.
Die klassischen Modelle genetischer Studien schließen E. coli, S. cerevisiae, D. melanogaster und M. musculus ein. Diese Organismen teilen gewisse Merkmale, die genetische Studien erleichtern. Erstens können sie verwendet werden, um nach phänotypischen Varianten (Mutanten) von Interesse zu screenen und/oder zu selektieren. Zweitens können sie auf eine Weise manipuliert werden, so dass die zu Grunde liegenden Gene, die für die spezifischen mutierten Phänotypen verantwortlich sind, durch molekulare Klonierverfahren lokalisiert und isoliert werden können. Diese Eigenschaften erlauben die Analyse von Genen in Fällen, in welchen detaillierte biochemische Informationen über die untersuchten Prozesse nicht zur Verfügung stehen. Alles was zu Beginn erforderlich ist, ist ein leicht zu bearbeitender experimenteller Organismus und ein Phänotyp, der markiert oder selektiert werden kann.
Bei gewissen Organismen, wie z. B. Menschen, die von besonderem Interesse sind, aber bei denen die klassischen genetischen Verfahren der selektiven Züchtung nicht angewendet werden können, ist es immer noch möglich, genetische Analysen zu verwenden, um Gene zu identifizieren. Die Techniken unterscheiden sich etwas und schließen rückschauende phänotypische und genotypische Analysen von Verwandten ein, die Merkmale von Interesse segregieren. Solche Verwandten können dazu verwendet werden, die ungefähre Lage von Genen zu bestimmen, die das Merkmal von Interesse beeinflussen. Dieser Ansatz baut stark auf Aspekte der Vererblichkeit, welche sexuelle Reproduktion, Segregation und Rekombination umfassen. Ausgehend von der groben Kartierungsinformation kann das (können die) verantwortliche(n) Gen(e) oftmals isoliert werden (Miki Y., Swensen J. et al., Science 266: 66-71 (1994)).
Kultivierte Zellen vielzelliger Organismen ebenso wie einzellige Organismen bieten den großen Vorteil, dass genetische Studien an der einfachsten Einheit des Lebens, der Zelle, durchgeführt werden können. In vielen Mikroorganismen sind genetische Verfahren geeignet verbessert worden, so dass detaillierte genetische Analysen einer breiten Vielfalt phänotypischer Merkmale möglich sind. In anderen Organismen, wie z. B. Menschen, sind jedoch genetische Studien kultivierter Zellen immer noch sehr schwierig. Obwohl kultivierte somatische Zellen den Weg zur Identifizierung mehrerer wichtiger menschlicher Gene bereitet haben, haben somatische Zellen Merkmale, die ihre Nützlichkeit ernsthaft beschränken. Sie sind diploid; folglich werden Mutanten mit einem rezessiven Phänotypen selten beobachtet. Sie reproduzieren klonal; folglich ist es im Allgemeinen nicht möglich, Mutationen von Interesse zu kartieren. Sie sind oftmals heterogen; folglich kann sich jede Zelle einer vermeintlich identischen Zellpopulation im Phänotypen von einer anderen Zelle leicht unterscheiden aus einer Vielzahl an genetischen und epigenetischen Gründen. Sie eignen sich nicht für eine große Anzahl an Selektionsschemata. Genetische Verfahren, die diese Probleme in menschlichen Zellen mildern können, wären besonders wertvoll.
Gene regulieren einige der medizinisch und kommerziell wichtigsten Vorgänge in der Biologie. Eine lange Liste menschlicher Krankheiten werden durch Mutationen oder Funktionsstörungen spezifischer Gene verursacht. Krebs mag das bekannteste Beispiel sein, da es die sequentielle Veränderung von Proto-Onkogenen und Tumorsuppressorgenen umfasst, während die Tumoren durch Stadien der Malignität fortschreiten (Fearon E. R. und Vogelstein B., Cell 61: 759-767 (1990)). Verfahren, die dazu in der Lage sind, die zu Grunde liegenden Gene zu identifizieren, die wichtige biologische Prozesse, wie z. B. die Tumorprogression regulieren, wären demzufolge von großem Wert, wie auch in WO98/32880 betont wurde, die zum Stand der Technik gemäß Art. 54 (3) EPÜ gehört.
Auf Grund der vorangehenden Gründe wird ein allgemeines Verfahren der genetischen Analyse kultivierter Zellen benötigt. Das Verfahren sollte einfach und schnell sein und die Identifizierung von Bestandteilen genetischer Wege ermöglichen, die Merkmale von Interesse regulieren. Es sollte viele der Hindernisse umgehen, die die genetische Analyse gewisser Zellen und Organismen stören. Es sollte kein Verständnis der detaillierten Grundlagen eines bestimmten Phänotypen oder der Mechanismen, die einem bestimmten zellulären Verhalten zu Grunde liegen, erfordern. Das Verfahren sollte für eine große Vielzahl an Zellen, einschließlich Zellen, die aus somatischen Geweben vielzelliger Organismen kultiviert wurden, allgemein anwendbar sein, und es sollte gewissen Nachteilen der Genetik somatischer Zellen ausweichen, einschließlich dem diploiden Charakter der meisten Zellen, der Schwierigkeit der Isolierung mutierter Gene sobald Mutationen induziert wurden, und der Heterogenität vieler Zellpopulationen.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren der genetischen Analyse, das das Bedürfnis nach einem einfachen, schnellen und allgemeinen Weg, Komponenten genetischer Wege zu identifizieren, die Merkmale von Interesse regulieren, befriedigt. Das Verfahren umfasst die Verwendung dreier Grundwerkzeuge: (1) ein Reportergen, das den phänotypischen Zustand einer bestimmten Zelle reflektiert; (2) eine Selektionsvorrichtung oder ein -verfahren, das die schnelle quantitative Bestimmung der Expressionslevels des Reportermoleküls auf einer Zelle-für-Zelle-Grundlage erlaubt; und (3) eine Perturbagenexpressionsbibliothek, die in die gewählte Zellpopulation (Wirtszellen) eingeführt werden kann. Das Reportergen ist typischerweise in einem Konstrukt enthalten, das es unter die Kontrolle eines spezifischen cis-regulatorischen Elementes stellt, dessen Aktivität mit dem Merkmal von Interesse korreliert. Dieses Konstrukt wird in eine Wirtszellpopulation eingebracht, so dass es stabil aufrechterhalten und exprimiert wird. Eine genetische Bibliothek, die in einem zweiten Expressionsvektor gebildet wird, wird in die Wirtszellen eingeführt, die das Reportergenkonstrukt beherbergen. Diese zweite Expressionsbibliothek erzeugt Perturbagene in den Wirtszellen. Die Wirtszellen werden unter Verwendung eines Verfahrens oder einer Vorrichtung analysiert, die quantitativ Reporterexpressionslevels detektiert. Zellen mit Reportergenexpressionslevels, die reduziert oder erhöht sind im Vergleich zur Expression, die in Zellen beobachtet wird, welche nur den stabil exprimierten Reporter ohne die Perturbagene enthalten, werden selektiert und ihre Bibliotheksinserts werden isoliert.
Der Reporter dient als ein Ersatz für den zellulären Phänotypen und muß folglich sorgfältig ausgewählt werden, um den relevanten phänotypischen Zustand so nah wie möglich wiederzugeben. Der Reporter kann ein endogenes Gen sein, das vorzugsweise einen Zelloberflächenmarker kodiert und das von Zellen mit dem Phänotypen von Interesse exprimiert wird oder es kann ein Fremdgen sein, das unter die Kontrolle eines Zelltyp-spezifischen oder Zellstatus-spezifischen Promotors gestellt wird, der in den erforschten Zellen aktiv ist. Der Reporter ist in den Wirtszellen in einem Maß exprimiert, das ausreicht, um seine schnelle und quantitative Bestimmung zu ermöglichen.
Perturbagene sind Moleküle, die auf eine transdominante Weise wirken, um mit der Funktion endogener zellulärer Komponenten zu interferieren. In der vorliegenden Erfindung sind Perturbagene typischerweise proteinisch: Proteine, Proteinfragmente oder Peptide; obwohl Perturbagene auch Nucleinsäuren sein können. Durch die Exprimierung von Perturbagenen in Zellen ist es möglich, spezifische normale Wechselwirkungen zu unterbrechen und folglich eine "Phänokopie" eines mutierten Phänotypen zu erzeugen; das heißt, dass obwohl durch das Verfahren Keine Mutationen erzeugt werden, wird die Funktion spezifischer zellulärer Bestandteile beeinflusst, als ob die Gene, die diese Proteine kodieren, durch Mutation geändert wären. Genetische Perturbagenbibliotheken werden in die Wirtszellen, die das Reporterexpressionskonstrukt beherbergen, so eingeführt, dass ein einziger Typ jedes Perturbagens (oder eine geringe Zahl unterschiedlicher Perturbagene) in einer Wirtszelle exprimiert wird.
Die Selektionsvorrichtung oder das -verfahren wird dazu verwendet, schnell durch Millionen von Zellen, die das Reportergenkonstrukt beherbergen, nach Varianten zu screenen, die geänderte Levels des Reporters exprimieren, und es wird dazu verwendet, jene varianten Zellen aus der Mehrheit an Zellen auszusortieren (oder zu selektieren), die normale Levels exprimieren. Diese selektierte Population, die geänderte Levels des Reporters exprimiert, wird wiederum verwendet, um die vorhandenen Perturbagene mit z. B. PCR zu isolieren (Ausubel F. M., Brent R. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York (1996)). Der Selektionsvorgang resultiert in der Anreicherung der Ausgangszellpopulation, die die Perturbagenbibliothek für Zellen beherbergt, die Perturbagenfragmente enthalten, die die Reportergenexpression beeinträchtigen. Die Unterbibliothek der Perturbagenfragmente, die die Reportergenexpression beeinflussen, kann in die Wirtszellen wieder eingeführt werden und der Vorgang des Screenings/Selektierens kann wiederholt werden. Der gesamte Zyklus wird so oft wie nötig wiederholt, um eine vergleichsweise reine Unterbibliothek an Perturbagen-kodierenden Inserts zu erhalten, welche, wenn sie in die Wirtszellen eingeführt werden, eine geänderte Reportergenexpression verursachen. Jedes dieser Perturbagenfragmente kann einzeln isoliert und erforscht werden.
Da sich die Selektion auf der Stufe der Population ereignet und weitere Anreicherungszyklen einfach durchzuführen sind, wird die Zeit, die mit der Genisolierung verbunden ist, stark reduziert. Zusätzlich verringert dieser Ansatz die Wahrscheinlichkeit, dass ein bestimmtes Perturbagen, das gemäß den hierin beschriebenen Verfahren isoliert wurde, in einer Minderheit der Wirtszellen idiosynkratisch wirkt. Screenings/Selektionen nach eigentlich jedem Phänotypen sind möglich und nur durch die Zuverlässigkeit, mit der das Reportergen den zellulären Phänotypen von Interesse repräsentiert, begrenzt.
Perturbagenfragmente, die auf diese Weise isoliert wurden, erzeugen Phänokopien, d. h. sie erzeugen das Äquivalent genetischer Mutationen. Jedes Fragment kodiert ein Perturbagen, das die Expression des Reporters beeinflusst. Prinzipiell ist jeder Bestandteil des genetischen Weges, der zur Reportergenexpression führt, empfindlich für eine Perturbagenunterbrechung. So kann zum Beispiel das Reportergen nur bei Vorhandensein eines bestimmten Transkriptionsfaktors exprimiert werden. Wenn das Perturbagen diesen Faktor abtrennt oder stromaufwärts von dem Faktor wirkt, um dessen Aktivität zu reduzieren, so wird die Reportergenexpression reduziert sein. Die vorliegende Erfindung kann auch dazu verwendet werden, eine Perturbagenunterbrechung zu erzeugen, die eine phänotypische Transformation erzeugt, solchermaßen, dass der ursprüngliche Zelltyp in einen anderen Zelltypen umgewandelt wird, in welchem das Reportergen nicht exprimiert wird. Solch ein Perturbagen identifiziert einen Hauptschalter; ein einzelnes Molekül, das in der Lage ist, den Phänotypen der Zelle vorzuschreiben.
Eine klonierte Perturbagen-kodierende Sequenz kann schnell direkte und indirekte Information über den Weg, den sie beeinflusst, geben. Wenn das Perturbagen von einem Gen oder Genfragment abgeleitet wird, kann es in Beziehung stehen zu einer kürzlich identifizierten Komponente des Weges und seine Sequenz kann seine Identität offenbaren. Das Ziel des Perturbagens kann eine zweite Komponente des Weges sein, auf dessen Identität geschlossen werden kann. Alternativ kann das Zielmolekül durch im Stand der Technik bekannte Techniken identifiziert werden, wie z. B. das Hefe-Zwei- Hybrid-Screening-Verfahren (siehe Fields S. und Song O.-K., U. S. Patent Nr. 5,283,173) oder durch "Suppressor"-Perturbagen-Verfahren, wie unten umrissen (Jarvik J. und Botstein D., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 72: 2738-2742 (1975)). Folglich sollten wenige Selektionsexperimente, die an mehreren Millionen Zellen durchgeführt werden, die Identifizierung der meisten oder aller Komponenten eines bestimmten Weges, die angreifbar sind durch diese Art der Spaltung, ermöglichen. Wenn diese Komponenten in einen Vorgang von kommerzieller Bedeutung verwickelt sind, stellt das Perturbagen schließlich ein Werkzeug zur Verfügung, um wertvolle Reagenzien entweder direkt oder als ein Substrat für Screening zu entwickeln.
Diese und andere Merkmale, Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden besser verstanden werden im Hinblick auf die folgende Beschreibung, die anhängenden Ansprüche und die begleitenden Zeichnungen.

Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1: Perturbagen-Illustration. Drei Beispiele intermolekularer Wechselwirkungen zeigen: erstens einen Komplex aus zwei nativen Proteinen in der Zelle; zweitens einen Komplex mit einem kleinen Small-Molecule-Inhibitor, der die Wechselwirkung zwischen den nativen Proteinen hemmt; und drittens einen Komplex mit einem Proteinfragment-Perturbagen, das aus dem nativen Protein gewonnen wurde, welches der normale Bindungspartner des anderen ist. Von diesem Perturbagen wird erwartet, dass es sich auf eine Art und Weise verhält, die der des Small-Molecule-Inhibitors ähnlich ist. Darüber hinaus dient der Perturbagen/Ziel-Komplex als die Grundlage für ein Screening, um Nachahmer von Small-Molecules zu identifizieren.
Fig. 2: Perturbagenexpressionsvektoren von Säugern, die autofluoreszierende Proteine (GFP oder BFP) als Fusionspartner für die exprimierten Proteine verwenden. MCS ist eine multiple Klonierstelle für die Insertion von Einzelsequenzen oder genetischen Bibliotheken. Jeder der dargestellten Vektoren kann für die Erstellung der Perturbagenexpressionsbibliothek verwendet werden.
Fig. 3: Reportergenexpressionsvektor für Säugerzellen mit einem "verkrüppelten" Promotor, der nur die TATA-Box des CMV-Promotors aufweist und dem ein Enhancer fehlt: cis-regulatorische Elemente können stromaufwärts der TATA- Box in den BgIII- oder BamH1-Stellen eingefügt werden.
Fig. 4: Flussdiagramm des genetischen Analyseverfahrens, das in der Erfindung offenbart ist. Das Reporterexpressionskonstrukt (in diesem Fall das GFP-Gen) (1) wird in die ausgewählten Wirtszellen eingeführt und ein stabiler Exprimierer wird ausgewählt (2). Diese Reporter-exprimierende Linie wird klonal erweitert, um eine Population zu erzeugen, die in diesem Falle hellgrün ist (4). Eine Perturbagenbibliothek (3) wird in die Wirtszellen eingeführt, um eine Population an Reportergen-enthaltenden Zellen (5) zu erzeugen, von denen viele ebenfalls Perturbagene exprimieren. Diese Population wird unter Verwendung einer Durchflusssortiervorrichtung (6) untersucht und die Zellen werden in zwei Populationen eingeteilt: Zellen (7), die weiterhin Reporterproteinlevels ähnlich der Zelle in #4 exprimieren; und Zellen (8), die in diesem Fall reduzierte Levels des Reporters exprimieren. Die Perturbageninserts (9) solcher "dunkler" Zellen werden isoliert und entweder dazu verwendet, ihre DNA-Sequenzen (10) zu bestimmen oder in die Reporter enthaltenden Wirtszellen (11) wieder eingeführt zu werden für einen weiteren Zyklus der Selektion und Anreicherung.
Fig. 5: Durchflusssortiergerät-Profildiagramm. Eine Illustration, die die Fluoreszenzintensitätsverteilung einer Wirtszellpopulation zeigt, die Perturbagene vor der Selektion enthält. Diese vorsortierte Population wird dazu verwendet, Zellen auf dem linken Rand der Verteilung oder auf dem rechten Rand auszuwählen. Wenn zum Beispiel die dunklen Zellen auf der Linken ausgewählt werden und Perturbagene aus diesen Zellen in die ursprünglichen Wirtszellen wieder eingeführt werden, so wird die Verteilung der Fluoreszenzintensität, die sich aus den Zellen ergibt, welche solch eine Unterbibliothek an Sequenzen beherbergen, nach links verschoben (d. h. die mittlere Fluoreszenzintensität nimmt ab).
Fig. 6: Genetischer Weg, der in die α-Faktor-Hemmung von S. cerevisiae α-Zellen involviert ist. Die Zell- und Kernmembranen sind als graue Kreise dargestellt; die Proteinkomponenten des Weges sind als gerundete Objekte unterschiedlicher Arten, einschließlich Rechtecken und Dreiecken gezeichnet. Der α-Faktor ist das Dreieck, das mit "α" außerhalb der a-Zelle beschriftet ist. Wechselwirkungen zwischen Komponenten, die zur Aktivierung führen, sind als Pfeile dargestellt; Wechselwirkungen, die zur Hemmung führen, sind als stumpf-endende Linien gezeichnet.
Fig. 7: Expressionsvektor, der in Hefe als ein. Reporter dazu verwendet wird, Perturbagene, die die α-Faktorreaktionsbereitschaft beeinträchtigen, zu identifizieren. Drei mögliche Inserts stromaufwärts des GFP-Gens, die von der verwendeten Strategie abhängen, sind gezeichnet. Die erste Strategie umfasst die Verwendung von vier tandemartig angeordneten α-Faktorantwortelementen; die zweite verwendet den Promotor des FUS1-Gens; die dritte verwendet genomische DNA, die ausgewählt wird, um eine α-Faktorreaktionsbereitschaft zu übertragen.
Fig. 8: Expressionsvektor, um Perturbagene in Hefe zu exprimieren. "Genomische DNA" bezieht sich auf die Perturbagen-kodierenden Inserts. Vier Strategien werden verwendet, um Fusionsproteine mit den Perturbagen-Inserts zu generieren: 1. Blaufluoreszierendes Protein (BFP); 2. GAL4-Sequenzen; 3. Invertase-Sequenzen; 4. Sequenz ohne Fusionspartner.

Definitionen

Die Begriffe "genetische Bibliothek" oder "Bibliothek" sind austauschbar verwendet, um sich auf eine Sammlung aus Nucleinsäurefragmenten zu beziehen, die individuell in der Größe schwanken können von ungefähr einigen wenigen Basenpaaren bis zu ungefähr einer Million Basenpaaren. Diese Fragmente sind als Inserts in Vektoren enthalten, die dazu befähigt sind, sich in gewissen Wirtszellen, wie z. B. Bakterien-, Pilz-, Pflanzen-, Insekten- oder Säugerzellen zu vermehren.
Der Begriff "Unterbibliothek" bezieht sich auf einen Teil einer genetischen Bibliothek, die durch Anwendung eines spezifischen Screenings- oder Selektionsverfahrens isoliert worden ist.
Der Begriff "Deckung" im Zusammenhang mit einer genetischen Bibliothek bezieht sich auf den Grad der Redundanz der Bibliothek. Diese Redundanz steht wiederum in Beziehung zu der Wahrscheinlichkeit, dass eine bestimmte Sequenz innerhalb der Nucleinsäuresequenzen, die die Bibliothek repräsentieren soll, tatsächlich vorhanden ist. Deckung ist das Verhältnis der Anzahl der Bibliotheksinserts multipliziert mit der durchschnittlichen Insertgröße zu der Gesamtkomplexität der Nucleinsäuresequenzen, die die Bibliothek repräsentiert.
Der Begriff "Vektor" bezieht sich auf eine Nucleinsäuresequenz, die dazu fähig ist, sich in bestimmten Wirtszellen zu vermehren und die Inserts einer fremden Nucleinsäure beherbergen kann. Typischerweise können Vektoren in vitro manipuliert werden, um fremde Nucleinsäuren einzufügen und die Vektoren können in Wirtszellen eingebracht werden, so dass die inserierte Nucleinsäure vorübergehend oder stabil in den Wirtszellen vorhanden ist.
Der Begriff "Expressionsvektor" bezieht sich auf einen Vektor, der dazu bestimmt ist, inserierte Nucleinsäuresequenzen zu exprimieren. Solche Vektoren können einen starken Promotor, der sich stromaufwärts der Insertionsstelle befindet, enthalten.
Der Begriff "Expression" im Zusammenhang mit Nucleinsäuren bezieht sich auf Transkription und/oder Translation von Nucleinsäuren in mRNA und/oder Proteinprodukte.
Der Begriff "Expressionsbibliothek" bezieht sich auf eine Bibliothek von Nucleinsäurefragmenten, die als Inserts in einem Expressionsvektor enthalten sind.
Der Begriff "stabile Expression" bezieht sich auf das fortwährende Vorhandensein und die fortwährende Expression einer Nucleinsäuresequenz in einer Wirtszelle für einen Zeitraum, der wenigstens so lang ist, wie der Zeitraum, der dazu benötigt wird, die Verfahren der vorliegenden Erfindung durchzuführen. Eine stabile Expression kann erreicht werden durch die Integration des Konstrukts in ein Wirtszellchromosom, oder durch den Bau des Konstrukts, so dass es Elemente aufweist, die seine fortwährende Replikation und Segregation in dem Wirt (d. h. einem künstlichen Chromosom) sicherstellen, oder alternativ kann das Konstrukt einen auswählbaren Marker enthalten (z. B. ein Arzneimittelresistenzgen), so dass eine stabile Expression des Konstrukts durch Wachsen der Wirtszellen unter selektiven Bedingungen (z. B. in Arzneimittelhaltigen Medien) sichergestellt wird.
Der Begriff "Sammlung an Nucleinsäurefragmenten" bezieht sich auf einen Satz an Nucleinsäuremolekülen jeglicher Quelle. So kann zum Beispiel eine Sammlung an Nucleinsäurefragmenten die gesamte genomische DNA, genomische DNA von einem oder mehreren Chromosomen, cDNA, die revers transkribiert wurde aus der gesamten zellulären RNA oder aus Messenger-RNA (mRNA), die gesamte zelluläre RNA, mRNA, oder einen Satz an Nucleinsäuremolekülen, die in vitro entweder einzeln oder unter Verwendung kombinatorischer Verfahren synthetisiert wurden, enthalten. Solange nicht anderweitig eingeschränkt, schließt der Begriff Nucleinsäuremoleküle ein, die bekannte Analoge natürlicher Nucleotide enthalten, die ähnlich wie natürlich vorkommende Nucleotide funktionieren können.
Der Begriff "Insert" im Zusammenhang mit einer Bibliothek bezieht sich auf ein bestimmtes DNA-Fragment, das ein einzelnes Glied der Bibliothek ausmacht.
Der Begriff "Wirtszelle" bezieht sich auf eine Zelle prokaryotischen, archaebakteriellen oder eukaryotischen Ursprungs, die als ein Rezipient für einen Vektor dienen kann, der durch irgendeines von mehreren Verfahren eingeführt wurde. Die Wirtszelle ermöglicht oft Replikation und Segregation des Vektors, der in ihr wohnt. In bestimmten Fällen sind jedoch Replikation und/oder Segregation irrelevant; die Expression des Vektors oder der Insertions-DNA ist das Ziel. Typische bakterielle Wirtszellen schließen E. coli und B. subtilis ein; archaebakterielle Wirtszellen schließen S. acidocaldarius und H. salinarium ein; Pilzwirtszellen schließen S. cerevisiae und S. pombe ein; pflanzliche Zellen schließen jene ein, die aus A. thaliana und Z. mays isoliert worden sind; Insektenwirtszellen schließen jene ein, die aus D. melanogaster, A. aegypti und S. frugiperda isoliert worden sind; und Säugerzellen schließen jene ein, die aus menschlichen Geweben und Tumorgeweben, einschließlich Melanozyten (Melanom), Colon (Karzinom), Prostata (Karzinom) und Gehirn (Gliom, Neuroblastom, Astrozytom), isoliert wurden.
Der Begriff "Reportergen" bezieht sich auf Nucleinsäuresequenzen für die Screenings oder Selektionen erdacht werden können. Reportergene können Proteine ("Reporter") kodieren, die dazu fähig sind, Licht zu emittieren, wie z. B. GFP (Chalfie M., Tu Y. et al., Science 11. Feb.; 263: 802-805 (1994)) oder Luciferase (Gould S. J. und Subramani S., Anal. Biochem. 15. Nov.; 175: 5-13 (1988)), oder Gene, die intrazelluläre Proteine oder Zelloberflächenproteine kodieren, die durch Antikörper, wie z. B. CD20, detektierbar sind (Koh J., Enders G. H. et al., Nature 375: 506-510 (1995)). Vorzugsweise ermöglichen Reporter, die Aktivität cis-regulatorischer Sequenzen auf eine quantitative Art und Weise zu überwachen. Alternativ können Reportergene eine Antibiotikaresistenz verleihen, wie z. B. Hygromycin- oder Neomycin-Resistenz (Santen-e R. F. et al., Gene 30: 147-156 (1984)).
Die Begriffe "hell" und "dunkel" im Zusammenhang mit einem Zellsortiergerät bezieht sich auf die Intensitätslevels der Fluoreszenz (oder anderer Arten der Lichtemission), die durch bestimmte Zellen gezeigt wird. Helle Zellen haben eine hohe Intensität der Emission im Vergleich zur Hauptmenge der Zellpopulation, und demzufolge hohe Levels an Reportergenexpression; dunkle Zellen haben eine niedrige Intensität der Emission im Vergleich zur Hauptmenge der Population.
Der Begriff "genetischer Weg" bezieht sich auf eine Gruppe an Proteinen (oder die Gene, die diese kodieren), die gemeinsam oder nacheinander wirken, um eine spezifische biochemische Funktion zu erfüllen oder ein spezifisches zelluläres Verhalten zu zeigen.
Die Begriffe "cis-regulatorisch Sequenz", "cis-Sequenz", "regulatorische Sequenz" oder "regulatorisches Element" sind austauschbar verwendet, um sich auf eine Nucleinsäuresequenz zu beziehen, die ihre eigene Expression oder die anderer Sequenzen, die physisch miteinander auf dem selben Nucleinsäuremolekül verbunden sind, beeinflusst. Solche Sequenzen können die Genexpression verändern, indem sie solche Dinge wie Transkription, Translation oder RNA-Stabilität beeinflussen. Beispiele cis-regulatorischer Sequenzen schließen Promotoren, Enhancer oder negativregulatorische Sequenzen ein (Alberts B., Bray D. et al. (Eds.), Molecular Biology of the Cell, Second Edition, Garland Publishing, Inc., New York und London, (1989); Lewin B., Gene V, Oxford University Press, Oxford, U. K. (1994)).
Der Begriff "Perturbagen" bezieht sich auf ein Agens, das auf eine transdominante Weise wirkt, um spezifische biochemische Vorgänge in Zellen zu stören. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung sind Perturbagene typischerweise entweder Proteine, Proteinfragmente oder Peptide, obwohl der Begriff auch Nucleinsäuren und andere organische Moleküle mit ähnlichen Eigenschaften umfasst.
Der Begriff "transdominant" beschreibt einen Wechselwirkungstypus, bei welchem das Agens (zumeist typischerweise ein Perturbagen) eine diffundierbare Substanz ist, die ihr Ziel in Lösung binden kann. Folglich ist ein transdominantes Agens dominant im Gegensatz zu rezessiv in einem genetischen Sinne, weil es z. B. auf Genprodukte wirkt und nicht auf die Allelen von Genen. Die Wirkungen eines Perturbagens sind bei Vorhandensein von Wildtypallelen seines Zieles sichtbar.
Der Begriff "Phänokopie" bezieht sich auf einen phänotypischen Zustand oder Erscheinung, die den Zustand, der durch Mutation eines spezifischen Gens oder spezifischer Gene induziert wird, nachahmt oder ihm gleicht. Dieser Zustand kann zum Beispiel induziert sein durch die Expression von Perturbagenen in einer bestimmten Wirtszelle.
Der Begriff "Ziel" im Zusammenhang mit einem Perturbagen bezieht sich auf das Molekül in der Zelle (typischerweise ein Protein), an das das Perturbagen bindet, um seine Wirkung auf den zellulären Phänotypen auszuüben.
Der Begriff "Durchflusssortiergerät" bezieht sich auf eine Maschine, die die Lichtemissionsintensität von Zellen oder anderen Objekten analysiert und diese Zellen oder Objekte nach Parametern, wie z. B. der Lichtemissionsintensität, abtrennt.

Detaillierte Beschreibung bevorzugter Ausführungsbeispiele Überblick

Die vorliegende Erfindung enthält Verfahren, um Komponenten genetischer Wege in kultivierten Zellen von Pflanzen und Tieren oder einzelligen Organismen, wie z. B. Hefen, Bakterien und Pilzen, zu identifizieren. Drei Grundwerkzeuge sind damit verbunden: (1) ein Reportergen unter der Kontrolle eines spezifischen cis- regulatorischen Elements, das den phänotypischen Zustand einer bestimmten Zelle widerspiegelt; (2) eine Selektionsvorrichtung oder -verfahren, das eine schnelle quantitative Messung der Expressionlevels des Reportermoleküls auf einer Zelle-für- Zelle-Grundlage erlaubt; und (3) eine Expressionsbibliothek aus Proteinen, Proteinfragmenten oder Peptiden ("Perturbagene"), die in die gewählte Zellpopulation eingeführt werden kann. Sequenzen werden aus der Expressionsbibliothek selektiert auf der Grundlage ihrer Fähigkeit, die Aktivität der cis-regulatorischen Sequenz zu verändern, wie durch den Grad der Reporterexpression ausgelesen. Das Verfahren enthält folglich einen Satz an Werkzeugen und Techniken, die gemeinsam die Identifizierung von Komponenten genetischer Wege unter Verwendung eines pseudogenetischen Ansatzes erlauben. Das Verfahren der Erfindung kann in menschlichen Zellen verwendet werden, aber es kann auch leicht für die Verwendung in anderen Säugerzellen, in Pflanzenzellen, in Arthropodenzellen und in Pilzen, Archaebakterien und Bakterien modifiziert werden.

Reportergene

Zahlreiche Reportergene sind dazu bestimmt worden, für die Verwendung bei der Expressionsüberwachung und beim Promotor/Enhancer-Abfang bereitgestellt zu werden. Ein Reporter umfasst jedes Genprodukt, für welches Screenings oder Selektionen angewendet werden können. Die im Stand der Technik verwendeten Reportergene schließen das LacZ-Gen von E. coli ein (Shapiro S. K., Chou J. et al., Gene Nov.; 25: 71-82 (1983)), das CAT-Gen von Bakterien (Thiel G., Petersohn D. und Schoch S., Gene 12. Feb.; 168: 173-176 (1996)), das Luciferasegen der Leuchtkäfer (Gould S. J. und Subramani S., 1988) und das GFP-Gen der Qualle (Chalfie M. und Prashner D. C., U. S. Patent Nr. 5,491,084). Diese Gruppe wurde primär dazu verwendet, die Expression von Genen im Cytoplasma zu überwachen. Eine andere Genfamilie wurde verwendet, um die Expression auf der Zelloberfläche zu überwachen, z. B. das Gen für das Lymphocytenantigen CD20. Normalerweise wird ein markierter Antikörper verwendet, der an den Zelloberflächenmarker (z. B. CD20) bindet, um den Level des Reporters zu quantifizieren (Koh J., Enders G. H. et al., 1995).
Unter diesen Reportern bieten die autofluoreszierenden Proteine (z. B. GFP) und die Zelloberflächenreporter möglicherweise den größten Nutzen bei der Überwachung von lebenden Zellen, da sie als "Vitalfarbstoffe" wirken. Ihre Expression kann in lebenden Zellen abgeschätzt werden und die Zellen können intakt wiedergewonnen werden für die nachfolgende Analyse. Vitalfarbstoffe sind jedoch nicht spezifischerweise für die Verfahren der vorliegenden Erfindung benötigt. Es ist ebenfalls sehr nützlich, Reporter zu verwenden, deren Expression schnell und mit hoher Sensitivität quantifiziert werden kann. Folglich sind Fluoreszenzreporter (oder Reporter, die direkt oder indirekt mit einem Fluorophor markiert werden können) besonders bevorzugt. Diese Eigenschaft erlaubt ein Hochdurchsatzscreenen auf einer Durchflusssortiermaschine, wie z. B. einem Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierer (FACS).
GFP ist ein Mitglied einer Familie von natürlicherweise vorkommenden fluoreszierenden Proteinen, deren Fluoreszenz sich primär im grünen Bereich des Spektrums befindet. GFP wurde umfassend entwickelt zur Verwendung als ein Reporter und zahlreiche mutierte Formen des Proteins wurden charakterisiert, die veränderte spektrale Eigenschaften haben (Cormack B. P., Valdivia R. H. und Falkow S., Gene 173: 33-38 (1996)). Hohe Levels der GFP-Expression wurden in Zellen, die von Hefezellen zu menschlichen Zellen reichen, erzielt. Es ist ein robuster Allzweckreporter, dessen Expression im Cytoplasma quantitativ unter Verwendung eines Durchflusssortierinstrumentes, wie z. B. einem FACS, gemessen werden kann.

Genetische Bibliotheken

Genetische Bibliotheken umfassen typischerweise eine Sammlung an DNA- Fragmenten, gewöhnlich genomische DNA oder cDNA, aber manchmal auch synthetische DNA oder RNA, die gemeinsam das gesamte oder irgendeinen Teil eines Genoms, einer Population an mRNAs oder irgendeiner anderen Nucleinsäuregruppe, die Sequenzen von Interesse enthält, darstellen. Typischerweise enthalten genetische Bibliotheken Sequenzen in einer Form, die manipuliert werden kann. Eine gesamtgenomische DNA-Bibliothek umfasst prinzipiell alle im Genom eines Organismus vorhandenen Sequenzen, die als eine Sammlung klonierter Sequenzen vermehrt werden. Es ist oftmals wünschenswert, eine Bibliothek zu erzeugen, die so repräsentativ für die zugeführte Nucleinsäurepopulation ist wie möglich. Zum Beispiel sind Sequenzen, die in eins-zu-eins-Verhältnissen in der zugeführten Population (z. B. Genom) vorhanden sind, in der Bibliothek im selben Verhältnis vorhanden. Um eine angemessene (z. B. > 99% der vorhergesagten) Vertretung der Nucleinsäuresequenzen, die die Bibliothek-enthalten soll, zu erzielen, sollte eine Bibliothek wenigstens eine 5- fache Deckung haben; dies bedeutet, dass die Bibliothek wenigstens einen 5-fachen Überschuss der gesamten Inserts über die Gesamtzahl hinaus enthalten sollte, die theoretisch dazu benötigt würde, die Sammlung an Nucleinsäuresequenzen einmal abzudecken. Zum Beispiel muß, wenn die Bibliothek das Genom eines Organismus darstellen soll, die Deckung, d. h. die Gesamtzahl der Inserts multipliziert mit der mittleren Insertgröße geteilt durch die Genomkomplexität, wenigstens fünf betragen. Typischerweise werden Bibliotheken in Vektoren vermehrt, die in bakteriellen Zellen wachsen, obwohl eukaryotische Zellen, wie z. B. Hefe und sogar menschliche Zellen, ebenso als Wirte dienen können.
Die mittlere Insertgröße einer Bibliothek ist eine Variable, die innerhalb ziemlich breiter Grenzen, die u. a. vom Vektor und den Zelltypen abhängen, beeinflusst werden kann. Zum Beispiel beherbergen einige Vektoren, wie z. B. bakterielle Plasmide, kleine Inserts, die von einigen wenigen Nucleotiden bis zu einigen wenigen Kilobasenpaaren reichen, wohingegen andere, wie z. B. künstliche Hefechromosomen, Insertgrößen beherbergen können, die 1.000 Kilobasenpaare übersteigen.
Die vorliegende Erfindung verwendet vorzugsweise genetische Bibliotheken, die Inserts am kleineren Ende des Spektrums enthalten. Diese Inserts würden am typischsten meistens von Genomen oder Transkripten bestimmter Organismen oder von synthetischer DNA abgeleitet werden und würden von z. B. 10 Basenpaaren bis 10 Kilobasenpaaren reichen. Die Bibliotheken könnten am typischsten meistens eine Deckung haben, die, wenn möglich, fünffach übersteigt. Die Details der Bibliothekserrichtung, -manipulation und -aufrechterhaltung sind im Stand der Technik bekannt (Ausubel F., Brent R. et al., 1996; Sambrook J., Fritsch E. F. und Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, CHSL Press, New York (1989)). In einem Ausführungsbeispiel der Erfindung wird eine Bibliothek gemäß der folgenden Vorgehensweise unter Verwendung von Verfahren, die im Stand der Technik wohl bekannt sind, geschaffen. Doppelsträngige cDNA wird aus zufällig geprimter mRNA, die aus einem bestimmten Zelltyp oder Gewebe isoliert wird, präpariert. Diese Fragmente werden mit Enzymen behandelt, um ihre Enden zu reparieren, und werden in den unten beschriebenen Expressionsvektor ligiert. Das ligierte Material wird in E. coli eingebracht und Klone werden ausgewählt. Eine Anzahl von Einzelklonen, die ausreicht, um eine vernünftige Deckung der mRNA-Population zu erzielen (z. B. eine Million Klone), wird gesammelt und in Massenkultur vermehrt für die Isolierung der vorhandenen Vektoren und ihrer Inserts. Dieses Verfahren ermöglicht es, große Mengen der Bibliotheks-DNA, in Vorbereitung für darauffolgende, unten beschriebene Verfahren zu erhalten.
In besonderen Ausführungsbeispielen der Erfindung wird bevorzugt, nicht-natürliche Nucleinsäure als das Ausgangsmaterial für die Bibliothek zu verwenden. Zum Beispiel kann es wünschenswert sein, eine Population synthetischer Oligonucleotide, die alle möglichen Sequenzen der Länge N repräsentieren, oder eine Untergruppe aller möglicher Sequenzen, als Eingangsnucleinsäure für die Bibliothek zu verwenden. Weiterhin kann es wünschenswert sein, Mischungen natürlicher oder nicht-natürlicher Nucleinsäuren für Bibliothek-Inserts zu verwenden.

Nucleinsäuretransfer

Während der letzten zwei Jahrzehnte wurden zahlreiche Grundlagenverfahren entwickelt, um exogene Nucleinsäure in kultivierte Wirtszellen zu transferieren. Diese Verfahren sind im Stand der Technik wohlbekannt (Ausubel F., Brent R. et al., 1996; Sambrook J. et al., 1989). Einige Verfahren verursachen primär eine vorübergehende Expression in Wirtszellen; d. h. die Expression geht nach und nach von der Zellpopulation verloren. Andere Verfahren können auch Zellen erzeugen, die stabil die transferierte Nucleinsäure exprimieren, obwohl der Prozentsatz stabiler Exprimierer typischerweise niedriger ist als der der vorübergehenden Exprimierer. Solche Verfahren umfassen virale und nicht-virale Mechanismen für den Nucleinsäuretransfer.
Im Falle des viralen Transfers wird ein viraler Vektor verwendet, um Nucleinsäureinserts in die Wirtszelle zu befördern. In Abhängigkeit vom spezifischen Virustyp kann die eingebrachte Nucleinsäure als ein extrachromosomales Element verbleiben (z. B. Adenoviren, Amalfitano A., Begy C. R. und Chamberlain J. S., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 93: 3352-3356 (1996)) oder kann in ein Wirtschromosom integriert werden (z. B. Retroviren, lida A., Chen S. T. et al., J. Virol. 70: 6054-6059 (1996)).
Im Falle des nicht-viralen Nucleinsäuretransfers stehen viele Verfahren zur Verfügung (Ausubel F., Brent R. et al., 1996). Eine Technik für den Nucleinsäuretransfer ist die CaPO&sub4;-Copräzipitation von Nucleinsäure. Dieses Verfahren beruht auf der Fähigkeit der Nucleinsäure mit Calcium- und Phosphationen in den relativ unlöslichen CaPO&sub4;-Grieß zu copräzipitieren, der sich auf der Oberfläche anhaftender Zellen auf dem Boden der Kulturschalen absetzt. Das Präzipitat wird, aus Gründen, die nicht klar verstanden werden, von einigen Zellen absorbiert und die copräzipitierte Nucleinsäure wird im Inneren der Zelle freigesetzt und exprimiert. Eine zweite Verfahrensklasse verwendet lipophile Kationen, die in der Lage sind, DNA durch Ladungswechselwirkungen unter Bildung von Lipidmicellen zu binden. Diese Micellen können mit Zellmembranen fusionieren, wobei ihre DNA-Last in die Wirtszelle entleert wird, wo sie exprimiert wird. Ein drittes Verfahren des Nucleinsäuretransfers ist die Elektroporation, eine Technik, die die Entladung von Spannung von den Platten eines Kondensators durch einen Puffer, der DNA und Wirtszellen enthält, erfordert. Dieses Verfahren stört die Doppelschicht so weit, dass in der Badlösung enthaltene DNA die Zellmembran durchdringen kann. Ein viertes Verfahren umfasst kationische Polymere, wie z. B. DEAE-Dextran, die den DNA-Eintritt und -Expression in kultivierten Zellen vermittelt. Ein fünftes Verfahren verwendet die ballistische Übergabe von DNA, die in Eiskristallen enthalten ist, oder auf der Oberfläche von Miniaturprojektilen adsorbiert ist, die in Zellen geschossen werden. Schließlich kann die Mikroinjektion von DNA verwendet werden, obwohl das typischerweise ziemlich langsam und arbeitsintensiv ist.
Etliche dieser Verfahren resultieren oftmals in dem Transfer von multiplen DNA- Fragmenten in Einzelzellen. Es ist oftmals schwierig, die Menge der DNA, die von einer einzelnen Zelle aufgenommen wird, auf ein Fragment zu begrenzen. Es sind im Stand der Technik jedoch Verfahren bekannt, um den Transfer multipler Fragmente zu minimieren. Zum Beispiel können die Probleme des multiplen Fragmenteintritts reduziert werden, indem "Träger"-Nucleinsäure verwendet wird (z. B. DNA, wie z. B. Heringssperma-DNA, die keine für das Experiment relevanten Sequenzen enthält) oder indem die Gesamtmenge der DNA, die für die Wirtszellen verwendet wird, reduziert wird. Ferner benötigt die Erfindung nicht spezifisch, dass jede Empfängerzelle einen einzelnen Typ einer Bibliothekssequenz enthält. Multiple Passagen der Bibliothek durch die Wirtszellen (siehe unten) ermöglichen es, interessierende Sequenzen endgültig von Sequenzen abzutrennen, die anfänglich als Begleiter vorhanden waren. Alternativ kann es nützlich sein, einen Vorteil aus der Eigenschaft zu ziehen, dass viele Verfahren des Gentransfers in somatische Zellen mehrere Kopien liefern. Diese Eigenschaft kann es ermöglichen, mehrere Bibliothekssequenzen in einer kleineren Anzahl an Zellen zu screenen, insbesondere da Perturbagene auf eine transdominante Weise wirken; d. h., wenn eine bestimmte Zelle mehrere verschiedene Perturbagene enthält, von denen eines die Expression des Reporters verändert, dann sollte diese Zelle während des Screenings gesammelt werden und das aktive Perturbagen sollte wiedergewonnen werden (zusammen mit anderen, die keine Wirkung haben).
Falls es wünschenswert ist, genetische Experimente an Bakterien- oder Pilzzellen durchzuführen, so sind ebenfalls eine Reihe an Techniken für den Gentransfer vorhanden. Die Elektroporation ist ein besonders flexibles Verfahren der Nucleinsäurezufuhr, das für die meisten Zelltypen anwendbar ist, einschließlich Prokaryonten-, Pilz-, Pflanzen- und Tierzellen. Zusätzlich können gewisse Mischungen spezifischer Salze bei einigen Zellen verwendet werden, um den DNA-Eintritt zu erleichtern. Zum Beispiel wirkt CaCl&sub2; gut bei E. coli und LiOAc bei S. cerevisiae.

Perturbagene

Eine der größten Unzulänglichkeiten somatischer Zellgenetik beinhaltet die Schwierigkeit, rezessive Mutationen feststellen zu können. Das Problem kann mit statistischen Begriffen ausgedrückt werden. Falls Mutationen in einem Allel mit einer Häufigkeit von z. B. eins zu einer Million geschehen, dann ist die Möglichkeit, dass zwei unabhängige Mutationen, jeweils eine in jedem Allel, geschehen werden das Produkt davon: eins zu einer Billion. Folglich sind dominante oder kodominante Mutationen im Allgemeinen viel leichter festzustellen. Wegen der rezessiven Natur der überwiegenden Mehrzahl der Mutationen ist die Genetik somatischer Zellen weitgehend auf das Studium dominanter Veränderungen, wie z. B. der Überexpression, beschränkt.
Perturbagene sind typischerweise Proteine, Proteinfragmente oder Peptide (obwohl sie auch Nucleinsäuren sein können), die andere Proteine in der Zelle binden und dabei spezifische biochemische Wege unterbrechen (siehe Fig. 1). Die Natur erzeugt Perturbagen-ähnliche Moleküle zufällig im Falle einer bestimmten Klasse von dominanten Mutationen, bei denen eine Funktion hinzugewonnen wird (gain-of-function- Mutationen), und in spezifischen Fällen wurden dominant negativ mutierte Gene entworfen (Herskowitz I., Nature 329: 219-222 (1987)). In der vorliegenden Erfindung wurde diese Art der biochemischen/genetischen Unterbrechung nutzbar gemacht und in einer gerichteten Weise angewandt, um wichtige Gene zu identifizieren und wiederzugewinnen.
Perturbagene können auf vielfältigen Wegen gebildet werden. Sie können aus zufällig geprimter, nach Größe ausgewählter cDNA, abgescherter oder aufgeschlossener genomischer DNA, synthetischer DNA oder anderen Nucleinsäurequellen erzeugt werden. Sie können in Zellen ohne irgendwelche zusätzlichen Proteinsequenzen, die an sie gebunden sind, exprimiert werden. Alternativ können sie mit anderen Proteinen, z. B. GFP oder Hefe-GAL4, durch Standardverfahren molekularer Klonierung (Ausubel et al., 1996) fusioniert werden. Weiterhin können sie als Insertionssequenzen in spezifischen Proteinen dargestellt werden.
Perturbagenbibliotheken können unter Verwendung von Techniken gebildet werden, die der Bildung gewöhnlicher Gen- und Expressionsbibliotheken, wie oben beschrieben, ähnlich sind. Solche Bibliotheken verhalten sich, wenn sie in Zellen mit Standardvektoren wie z. B. Viren oder mit anderen Mitteln eingebracht werden, auf eine Weise, die analog zu Mutagenen ist; das heißt, dass die Perturbagene einen Phänokopiezustand in den Wirtszellen induzieren, der den mutierten Zustand nachahmt, aber nicht direkt Veränderungen der Wirtszell-DNA-Sequenzen zur Folge hat. Der Wert der Perturbagene basiert auf der Bequemlichkeit, mit der sie erzeugt und gescreent werden können, und auf der Leichtigkeit, mit der die Perturbagensequenzen wiedergewonnen werden können und verwendet werden können, um Elemente im genetischen Weg von Interesse zu identifizieren. Weiterhin wirken sie auf eine Weise, die der von Small-Molecule-Therapeutika ähnlich ist. Tatsächlich sind sie einfach das proteinische Äquivalent eines Small-Molecules und sie können in Verbindung mit ihren Zielen (Bindepartner) verwendet werden, um nach Nachahmern von Small-Molecules zu screenen, die Zellen auf eine Weise beeinflussen, die der des ursprünglichen Protein-Perturbagens ähnlich ist.
In der vorliegenden Erfindung werden Perturbagenexpressionsbibliotheken, die z. B. fragmentierte genomische DNA, zufällig-geprimte cDNA oder synthetische DNA mit zufälliger Sequenz enthalten, in Wirtszellen eingeführt, die so angelegt sind, dass sie ein Reportergen unter der Kontrolle einer Zelltyp-spezifischen cis-regulatorischen Sequenz enthalten. Alternativ kann ein natürlicher Reporter verwendet werden, der aus einem Membranprotein (oder einem intrazellulären Protein) besteht, für das gute spezifische Antikörper erhältlich sind, unter der Voraussetzung, dass die Expression dieses Proteins mit einem Phänotypen von Interesse korreliert. Zellen, die Perturbagene beherbergen, werden mit einem schnellen und quantitativen Verfahren oder Vorrichtung gescrennt, wie z. B. einem Durchflusssortiergerät, z. B. einem FACS, um die Population von Zellen zu identifizieren, die eine veränderte Expression des Reporters aufweisen. Diese werden für die unten beschriebene Analyse gesammelt.

Cis-regulatorische Elemente

Um die Perturbagenexpression in Wirtszellen eines bestimmten Typs zu lenken, wird ein generischer Promotor, der dazu fähig ist, eine kräftige, hohe oder mäßig hohe Expression zu verleihen, benötigt. Diese Promotoren sind typischerweise von konstitutiven Genen, die in ziemlich hohem Maße in den meisten oder allen Zelltypen des Organismus exprimiert werden, oder von Viren abgeleitet. Zahlreiche solcher cis- regulatorischer Sequenzen sind im Stand der Technik bekannt, die dazu geeignet sind die Expression in Säugerzellen, Insektenzellen, Pflanzenzellen, Pilzen oder Bakterien zu lenken (Ausubel et al., 1996; Vektordatenbank, die zu finden ist unter: http://www.atcg.com/vectordb/). Zum Beispiel ist in Eukaryonten der Promotor für beta- Aktin nützlich (Qin Z., Kruger-Krasagakes S. et al., J. Exp. Med. 178: 355-360); in Pflanzen der Blumenkohlmosaikvirus-35S-Promotor (Goddijn O. J., Pennings E. J. et al., Transgenic Res. 4: 315-323 (1995)); und im Allgemeinen kann ein Promotor, der die Hochexpression z. B. eines konstitutiven oder viralen Gens lenkt, mit vergleichsweiser Leichtigkeit ermittelt werden unter Verwendung gängiger molekular-genetischer Verfahren.
Um cis-regulatorische Sequenzen, die die Reportergenexpression lenken, nachzuweisen, ist es notwendig, Sequenzen zu wählen oder auszulesen, die die passenden Merkmale aufweisen; das heißt, da der Reporter dazu ausersehen ist, als ein Surrogat für die phänotypischen Merkmal(e), die untersucht werden, zu wirken, muss er auf eine Weise reguliert werden, die dem Phänotypen so nahe wie möglich kommt. Viele solcher Sequenzen sind im Stand der Technik als Gewebe-spezifische regulatorische Elemente bekannt (Lewin B., (1994)). Alternativ können solche regulatorischen Sequenzen durch folgende Standardverfahren identifiziert werden: erstens Isolierung Zell- oder Gewebe-spezifischer Gene unter Verwendung von Verfahren der differentiellen Darstellung, Subtraktionshybridisierung, repräsentativer Differenzanalyse und anderen (Ausubel et al. 1996; und siehe zur Diskussion: Kamb A., Feldhaus M. J., "Method for the comparative assessment of relative amounts of nucleic acids" (WO 98/26098)); zweitens können die cis-regulatorischen Elemente, die für das Muster der Genexpression verantwortlich sind, beleuchtet werden unter Anwendung von Standardverfahren der Promotor/Enhancer-Analyse; einschließlich der Erzeugung von Deletions- und Linker-Scanning-Mutanten, und der Expressionsassays in Zellen (Lewin B., 1994; Latchman D. S., Eukaryotic Transcription Factors, 2. Auflage, Academic Press, London (1996); McKnight S. L. und Yamamoto K. R., Transcriptional Regulation, CHSL Press, New York, (1992)). Zusätzlich können genetische Verfahren verwendet werden, die unter die allgemeine Bezeichnung Enhancer/Promotor-Fallen fallen, um cis-Sequenzen mit besonderen Eigenschaften zu finden (vergleiche die Diskussion in Ruley und von Melchner, U. S. Patent Nr. 5,364,783; Bellen H. J., O'Kane C. J. et al., Genes Dev. 3: 1288-1300 (1989)). Schließlich können auch Verfahren für genetische Selektionen regulatorischer Sequenzen, die vorbestimmte Eigenschaften haben, wie beschrieben in der Patentanmeldung von Kamb C. A. und Caponigro G. M., bezeichnet als "Methods for identifying, characterizing, and evolving cell-type specific cis regulatory elements" (WO 98/36097), angewendet werden, um nützliche cis- Sequenzen für die Lenkung der Reportergenexpression zu bestimmen. Ziel ist, eine cis- regulatorische Sequenz, die unter den Bedingungen von Interesse wirksam ist, entweder durch genetische Verfahren, biochemische Verfahren oder durch Verweisen auf bekannte Gene, die die gewünschten Expressionseigenschaften haben, auszuwählen. Wenn zum Beispiel jemand den Vorgang der Pathogenese in einem bestimmten pathogenen Organismus zu untersuchen wünscht, dann kann es nützlich sein, einen Promotor beizutreiben, der nur in Zellen wirksam ist, die zuständig sind für die pathogene Invasion des Wirts.

Expressionsvektoren

Expressionsvektoren werden in der Erfindung verwendet, um RNA, Proteine, Proteinfragmente oder Peptide zu erzeugen, die von Sequenzen (Genen und Genfragmenten), die in Wirtszellen eingeführt werden, abgeleitet werden. Die Sequenzen schließen Reportergene ein, die als ein Surrogat für den phänotypischen Zustand der Zelle verwendet werden, und Sequenzen, die die Perturbagene kodieren.
Im Stand der Technik sind zahlreiche Expressionsvektoren bekannt, die leicht zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung erhältlich sind (Ausubel F. M., Brent R. et al., 1996; Sambrook J. et al., 1989). Einige von diesen sind für die Verwendung in spezifischen Zelltypen maßgeschneidert, aber die meisten sind gestaltet, um in einer breiten Vielfalt an Zelltypen verwendet zu werden. In Säugerzellen sind virale regulatorische Elemente der Transkription eine typische Wahl, um die Expression exogener Gene zu steuern. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung, die die Perturbagenexpression in Säugetier-Wirtszellen einschließt, kann ein Expressionsvektor, der ein Reportergen enthält, das stromabwärts von einer Poly(A)- Additionssequenz flankiert wird, abgeleitet z. B. von dem SV40-TAg-Gen, verwendet werden. Dieser Expressionsvektor-Typ ist in Fig. 2 dargestellt. Die Perturbagenkodierende Sequenz kann stromaufwärts von seinem Startcodon von einer TATA-Box flankiert sein, die RNAPolymerase II (Pol II) binden kann, und von einem Enhancer, der vorzugsweise den verbundenen Perturbagen-kodierenden Sequenzen eine hohe Expression verleiht. Zusätzlich zu den cis-regulatorischen Sequenzen, die konstitutiv wirksam sind, wie z. B. jene in starken viralen Promotoren, enthält der Expressionsvektor vorzugsweise eine Stelle, die für die Insertion der Perturbagenkodierenden Bibliothekssequenzen geeignet ist. Solche Bibliothekssequenzen umfassen vorzugsweise die Erzeugung eines Fusionsproteins mit z. B. BFP, obwohl native Proteindomänen oder Proteinfragmente ebenso verwendet werden können. Die Wahl, wenn überhaupt, welcher Perturbagen-Fusionspartner verwendet werden muß, hängt davon ab, ob z. B. cytoplasmatische, nucleäre oder extrazelluläre Expression des Perturbagens gewünscht wird. Der Vektor mag, wenn er viralen Ursprungs ist, die Vermehrung in einem bakteriellen Wirt nicht benötigen. Es ist jedoch eher typisch, dass der Vektor die Vermehrung in z. B. E. coli braucht und Sequenzen enthält, die für die Replikation und Selektion in E. coli notwendig sind, wie z. B. ein colE1-Replikon und ein Antibiotikaresistenzgen.
Für prokaryotische Wirtszellen und Wirtszellen in Form von Archaebakterien, werden cis-regulatorische Sequenzen an Hand von ähnlichen Kriterien gewählt, wie oben diskutiert. Für den Perturbagen-Expressionsvektor sind cis-regulatorische Sequenzen stromaufwärts von den Perturbagen-kodierenden Sequenzen enthalten, die kräftige, vorzugsweise hohe Expressionslevels verursachen. Diese Sequenzen sind folglich vorzugsweise in einer generischen Art vorhanden, z. B. stromaufwärts von konstitutiven Genen. In E. coli ist zum Beispiel eine geeignete Sequenz der Consensus-Promotor, der aus einer - 10-Box und einer - 35-Box besteht (Alberts B., Bray D. et al., 1989; Lewin B., 1994).
Im Gegensatz zum Perturbagen-Expressionsvektor ist der Reportervektor individuell zugeschnitten, so dass die Expression des Reporters den phänotypischen Zustand der Wirtszelle, die untersucht wird, so gut wie möglich widerspiegelt. Folglich ist der Expressionsvektor so gestaltet, dass das Reportergen (z. B. GFP) unter die Kontrolle cis-regulatorischer Sequenzen gestellt wird, die eine Zelltyp-spezifische Expression verleihen, und/oder die Aktivierung spezifischer biochemischer Wege in der Zelle widerspiegeln. Fig. 3 zeigt zum Beispiel einen Säuger-Expressionsvektor, der dazu verwendet werden kann, fremde cis-regulatorische Sequenzen stromaufwärts der TATA-Box des CMV-Promotors zu inserieren, wobei eine GFP-Expression unter der Kontrolle des gewählten regulatorischen Elements erzeugt wird. Solche regulatorischen Sequenzen sind im Stand der Technik bekannt (Lewin B., 1994 und siehe oben) oder sie können identifiziert werden unter Verwendung der Verfahren, die offenbart sind in der ebenfalls anhängigen US-Patentanmeldung von Carl Alexander Kamb und Giordano M. Caponigro, angemeldet am 14.02.1997 und bezeichnet mit "Methods for identifying, characterizing, and evolving cell-type specific cis regulatory elements" (Anwaltsakte Nr. 20410-701).

Anreicherung der durch Perturbagen-Expression induzierten Phänokopievarianten

Die Kombination genetischer Bibliotheken mit genetischen Selektions- oder Screening- Techniken erlaubt die Identifikation spezifischer Sequenzen aus Bibliotheken, die auf deren Funktionen in lebenden Zellen basiert. Diese Strategie wurde in der Molekularbiologie häufig verwendet, um Gene basierend auf der Expression zu klonieren, z. B. durch Komplementation eines mutierten Phänotypen (z. B. Yocum R. R. und Johnston M., Gene 32: 75-82 (1984)). Die Voraussetzung für diese Strategie ist, dass eine passend gestaltete Bibliothek in geeignete Wirtszellen eingeführt werden kann und dass die Auswirkungen der Bibliothekssequenzen überwacht werden können. Zum Beispiel kann eine bestimmte Wirtszelle in einer bestimmten Umgebung in der Abwesenheit eines bestimmten Gens sterben; die Wirtszelle wird nur wachsen, wenn ein Bibliotheksinsert, das dieses Gen umfasst, vorhanden ist. Alternativ können Screenings angewendet werden, um die Bibliothekssequenzen auszuwählen, die einen bestimmten Phänotypen verleihen. Zum Beispiel wurde das T8 (Leu-2) Gen isoliert nach einem Protokoll, das die Expression in kultivierten Zellen, Markierung mit einem fluoreszierenden Antikörper und Anreicherung von T8-exprimierenden Zellen durch FACS einschließt (Kavanthes P., Sukhatme V. P. et al., Proc. Natl: Acad. Sci. (USA) 81: 7688-7692(1984)).
Die vorliegende Erfindung kann ein Durchflusssortiergerät wie z. B. ein FACS oder eine entsprechende Vorrichtung verwenden, um große Zahlen an Wirtszellen zu screenen, die die Perturbagen-Bibliotheksinserts beherbergen, um jene zu identifizieren, die einen bestimmten Phänotypen aufweisen; nämlich Zellen, die reduzierte oder erhöhte Levels der Reportermolekül-Expression haben. Wenn die Perturbagen-Bibliothek in Wirtszellen eingeführt wird, die so ausgebildet sind, dass sie den Reporter (z. B. GFP) in einer stabilen Umgebung exprimieren, wird von der großen Mehrheit der Zellen, die durch FACS analysiert werden, erwartet, dass sie normale (z. B. hohe) Levels der Reporterexpression aufweisen. Eine kleine Zahl jedoch kann eine reduzierte Expression zeigen, was bei dem FACS als Zellen detektiert wird, die auf die dunklere Seite der Zellfluoreszenz-Verteilung treffen. Diese dunklen Zellen können gesammelt werden und getrennt von den anderen vermehrt werden; siehe Fig. 3 und 4. Solch ein Verfahren resultiert in der Anreicherung von jenen Zellen aus der Ausgangspopulation der Perturbagen-enthaltenden Zellen, die den Level der Reporterexpression reduzieren. Diese ausgewählten, dunklen Zellen können verwendet werden, um die Perturbagenfragmente mittels, z. B. PCR erneut zu isolieren, unter der Verwendung von Primerstellen, die die Bibliotheksinserts flankieren, um eine Unterbibliothek an Perturbagenfragmenten zu bilden, die angereichert sind mit jenen, die eine reduzierte Reporterexpression verursachen. Die Unterbibliothek der Fragmente kann erneut kloniert werden (unter Verwendung von z. B. demselben Expressionsvektor) und wieder in die Wirtszellen eingeführt werden und der Screening/Selektionsvorgang kann so oft wie nötig wiederholt werden.
Nach einer ausreichenden Anzahl an Zyklen sollte ein wesentlicher Unterschied in der Fluoreszenzintensitätsverteilung der ursprünglichen Reporter enthaltenden Wirtszellen im Vergleich zu den Wirtszellen, die die angereicherten Perturbagen- Unterbibliothekinserts beherbergen, beobachtet werden. Vorzugsweise sollte das Verfahren wiederholt werden bis eine minimale Überlappung zwischen diesen beiden Fluoreszenzintensitätsverteilungen beobachtet wird. Letztendlich sollte der Vorgang des FACS-Sortierens und Wiederholens in einer Population von Perturbagenfragmenten resultieren, die z. B. die Expression des Reporters inhibieren. Diese können isoliert werden und einzeln durch molekulares Klonieren und DNA-Sequenzanalyse untersucht werden. Wenn eine ausreichende Anzahl an Zyklen durchgeführt worden ist, sollten viele, vorzugsweise die meisten, der abgesonderten Fragmente ungefähr die selbe Wirkung auf die Reporterexpression in den Wirtszellen haben, wie die Wirkung, die durch die angereicherte Population hervorgerufen wird, aus denen sie isoliert wurden.

Perturbagenziele

Die Ziele der Perturbagene in Zellen sind so interessant, wie die Perturbagene selber. Es wird erwartet, dass die meisten Perturbagene ihre phänotypische Wirkung auf Zellen durch die Bindung eines anderen spezifischen Proteins ausüben und so dessen Funktion hemmen. Das andere Protein kann ein Wildtyp-Gegenstück des Perturbagens sein (z. B. im Falle von Proteinhomomultimeren) oder es kann ein anderes nicht verwandtes Protein sein. In jedem Fall stellt das Perturbagen eine kritische Sonde für die Isolierung des Zielproteins bereit.
Mit heutiger Technologie, wie z. B. dem Hefe-Zwei-Hybrid-System oder anderen genetischen oder biochemischen Ansätzen, die im Stand der Technik bekannt sind, ist es möglich die relevanten Zielmoleküle in der Zelle zu identifizieren (Fields S. und Song O.-K., U. S. Patent Nr 5,283,173; Serrano M., Hannon G. J. et al., Nature 366, 704-707 (1993); Ausubel et al., 1996). Es ist auch möglich, dass die Perturbagensequenz die mögliche Identität des Ziels offenbart, wobei dieses auf dem vorhandenen Wissen über biochemische Wege und Vergleiche mit Sequenzdatenbanken basiert; zum Beispiel kann die Sequenz eines spezifischen Perturbagens verwendet werden, um eine öffentliche Datenbank, wie z. B. GenBank, zu durchsuchen. Alle "Treffer", die Datenbanksequenzen mit Homologien offenbaren, die eine Schwelle der statistischen Signifikanz überschreiten, können sorgfältig erforscht werden und ihre biologischen Rollen können in der veröffentlichten Literatur ermittelt werden. In einigen Fällen werden Perturbagene von Komponenten eines gut nachgewiesenen biochemischen Wegs gewonnen werden und starke Kandidaten für die Ziele der Perturbagene können von der Identität der Perturbagene selber abgeleitet werden.
In gewissen Fällen können zusätzliche Perturbagenexperimente die Identitäten der Ziele enthüllen. Zum Beispiel kann ein zweites Perturbagenexperiment, bei dem Zellen verwendet werden, die ein Perturbagen exprimieren, das die Reportergenexpression inhibiert, einen Anhaltspunkt geben. Wenn Zellen, die das Reporterkonstrukt und das Ausgangsperturbagen (nun stabil exprimiert unter Verwendung von Verfahren, die jenen ähnlich sind, mit denen die ursprünglichen Reporter enthaltenden Wirtszellen erzeugt wurden) beherbergen, als Wirtszellen für eine weitere Runde der Perturbagengenetik verwendet werden, ist es manchmal möglich, Rückmutanten zu selektieren, die noch einmal hohe Levels des Reporters exprimieren. Dieser Revertantenphänotyp kann unter anderem verursacht werden durch die Präsenz eines zweiten Perturbagens in den Zellen, das das Verhalten des Ziels des ersten Perturbagens nachahmt, d. h. ein kompensatorischer Effekt, der mit der Überexpression des Ziels oder eines Zielfragments verbunden ist. Folglich kann der Satz an rückmutierten Perturbagenen ("Anti-Perturbagene") Anhaltspunkte für die Eigenart der Perturbagenziele geben.

Genetische Wege

Der Perturbagenansatz, der in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, hat das Vermögen, mehrere Komponenten spezifischer genetischer Wege in einem einzelnen Selektionsexperiment zu identifizieren. Das ist deswegen, weil der Assay durchgeführt wird unter Verwendung einer Zellpopulation ohne die Notwendigkeit, einzelne Mutanten zu isolieren und zu vermehren. Alle Zellen, die Perturbagene beherbergen, die dazu fähig sind, die Reportergenexpression zu erhöhen oder zu senken, werden zusammen gesammelt und die Famile der vorhandenen Perturbagene kann amplifiziert werden, z. B. mit PCR, für die nachfolgende Analyse. Das Klonieren einzelner Nucleinsäurefragmente geht viel schneller als das Klonieren einzelner Zellen und das Lokalisieren chromosomaler Mutationen in ihnen. Genetik wird gewissermaßen eher an der Perturbagenbibliothek durchgeführt als an den Wirtszellen selber.
Einzelne Perturbagen-kodierende Fragmente können genauer untersucht werden, indem andere Assays als der Reportergenexpressionsassay ihrer Isolierung verwendet werden. Die mechanistische Grundlage der Perturbagenaktivität ist wahrscheinlich von beträchtlichem Interesse. Zum Beispiel kann das Perturbagen mit der Reportergenexpression interferieren, indem es die Aktivität eines Transkriptionsfaktors, der für die Reportergenexpression erforderlich ist, inhibiert. Alternativ kann es stromaufwärts des Transkriptionsfaktors in einen biochemischen Weg eingreifen, was zur Aktivierung des Transkriptionsfaktorensatzes, der für die Reportergenexpression erforderlich ist, führt. Schließlich kann das Perturbagen eine Veränderung im Zellschicksal verursachen, dergestalt, dass die Wirtszelle nicht länger dem elterlichen Ausgangszelltyp ähnelt, sondern stattdessen in einen anderen Zelltyp umgewandelt wurde. Andere mögliche Weisen der Perturbagenunterbrechung, die zu einer reduzierten oder erhöhten Reportergenexpression führen, kann man sich vorstellen. Diese können später aussortiert werden, unter der Verwendung von im Stand der Technik bekannten zellbiologischen, genetischen und biochemischen Verfahren (Ausubel et al., 1994; Sambrook et al., 1989).
Während dem Ablauf eines bestimmten Experiments, können etliche Perturbageninserts isoliert werden, die die Reportergenexpression beeinflussen. Unter Verwendung von weiteren Runden der Perturbagenselektion ist es möglich, die Perturbagene in Gruppen (verwandt mit den klassischen "Komplementationsgruppen") basierend auf dem Schritt in dem Weg, den sie beeinflussen, einzuteilen und sogar diese Schritte zu ordnen. Die erste Stufe dieses Verfahrens beeinhaltet die Erzeugung einer neuen Gruppe von Anti-Perturbagenen, die die Reporterexpression erhöhen. Wenn das ursprüngliche Reportergen konstitutiv in Abwesenheit der Perturbagene exprimiert wird, dann können zum Beispiel Anti-Perturbagene als helle Revertanten der dunklen Zellen, die ein Perturbagen enthalten, das während der ersten Runde der oben beschriebenen Selektionsexperimente isoliert wurde, selektiert werden. Wenn das ursprüngliche Reportergen induzierbar ist (siehe unten Beispiel 1), dann kann es einfacher sein, Perturbagene auszuwählen, die bei Abwesenheit des induzierenden Signals hell sind (d. h. sie fördern die konstitutive Aktivierung). In jedem Fall sind nun zwei Gruppen an Perturbagenen mit entgegengesetzten Phänotypen vorhanden; die eine Klasse macht Zellen dunkel und die andere kehrt diesen Phänotypen um. Indem alle möglichen Paare an "dunkel-" und "hell-"induzierenden Perturbagenen in die Wirtszellen eingeführt werden und die resultierenden Reporterexpressionslevels untersucht werden, ist es möglich Perturbagene (und folgliche ihre zellulären Ziele) durch ihre gewöhnliche Antwort in Gruppen einzuteilen. Falls es wünschenswert ist, den Weg im Detail zu ordnen, so können Verfahren eingesetzt werden, die konditionelle Perturbagene (heiß und kalt sensitive) verwenden, entsprechend der Strategie, die beschrieben ist von Jarvik J. und Botstein D. (Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 70: 2046- 2050 (1973); Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 72: 2738-2742 (1975)).
Es ist zu bemerken, dass nach der hier beschriebenen Art isolierte Perturbagene direkt zu neuen therapeutischen Molekülen führen können. Das Ziel ist nicht notwendigerweise, Perturbagene zu identifizieren, die eine spezifische Einzelwirkung auf die Expression des Reportergens haben, z. B. indem sie die Funktion des Reporters selber stören. Ziel ist eher, mit diesen Mitteln Perturbagene zu identifizieren, die allgemeinere Wirkungen auf die Zellphysiologie haben, einschließlich aber nicht ausschließlich Zelltyptransformationen. Solche Perturbagene können für die Therapie von Krankheiten relevant sein, da sie spezifische Wege in Zellen unterbrechen, die tiefgreifende phänotypische und physiologische Konsequenzen haben. Diese Perturbagene und ihre assoziierten zellulären Ziele können dazu dienen, neue therapeutische Ziele in Zellen zu identifizieren; ein außerordentlich wertvolles Gut auf dem medizinischen Gebiet.

Zusätzliche Manipulationen, entworfen, um die Perturbagenspezifität zu verbessern

Perturbagene, die unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren isoliert wurden, können in zwei Richtungen weiter verfeinert werden. Erstens können Perturbagene, die verbesserte Varianten von Mitgliedern der Ausgangsperturbagenbibliothek sind, durch zufällige oder absichtliche Mutation oder Rekombination während dem Vorgang der Selektion und Anreicherung isoliert werden. Zweitens können die Perturbagene zusätzlichen genetischen Screenings und Selektionen unterzogen werden, bei denen jene anreichert werden, welche wünschenswertere Eigenschaften hinsichtlich der Zell-spezifischen Aktivität haben.
Die Amplifikation der DNA durch z. B. PCR ist im ersten Fall dafür bekannt, Sequenzänderungen während des Replikationsvorgangs einzuführen (Ohne J., Braman J. C. et al., Nucleic Acids Res. 24, 3546-3551 (1996)). In nachfolgenden Experimenten kann dies zu Sequenzvarianten führen, von denen einige nützliche Eigenschaften haben können. Zum Beispiel können sie wirksamer die Reportergenexpression beeinflussen als das ursprüngliche Perturbagen in der Bibliothek. Diese Perturbagene werden identifiziert werden, indem sie einen Phänotypen von z. B. sogar noch niedrigerer Reporterexpression verleihen. Alternativ kann es wünschenswert sein, verbesserte Varianten existierender Perturbagene zu entwickeln, indem das Amplifikationsverfahren absichtlich Bedingungen ausgesetzt wird, die die Mutation und/oder Rekombination der Nucleinsäure durch z. B. in vitro-Mutagenese, zu-Fehlern- neigende PCR oder rekombinante POR erhöht (Stemmer W. P., Nature 370, 389-391 (1994)). Solche Bedingungen sind im Stand der Technik bekannt (Ausubel et al., 1994) und stellen ein Mittel zur Entwicklung von Perturbagenen bereit, die z. B. bei niedrigeren Konzentrationen wirksam sind und/oder eine erhöhte Selektivität in Zellen zeigen im Vergleich zu Perturbagenen, die durch die Ausgangsbibliothek exprimiert wurden; folglich funktionieren sie besser als Perturbagene.
Im zweiten Fall kann es wünschenswert sein, die Unterbibliothek von Perturbagenfragmenten, die durch Anwendung der oben beschriebenen Grundsätze isoliert wurden, durch zusätzliche Screenings hindurchzuführen, um jene mit verbesserter Selektivität für bestimmte biochemische Wege anzureichern. Triviale Wirkungen auf die Reporterexpression oder allgemeine Wirkungen auf die Genexpression und/oder Zelllebensfähigkeit können z. B. durch entsprechende zweite Screenings detektiert oder eliminiert werden. Falls gewünscht können Reporter, die z. B. an einen zweiten Gewebe- oder Zelltyp-spezifischen Promotor gekoppelt sind, der sich in den Wirtszellen auf eine Weise, die dem ersten Reportergenpromotor ähnlich ist, verhält, verwendet werden, um Perturbagene, die die Wirtszellen auf eine Reporter- oder Promotor-spezifische Weise beeinflussen und keine tiefergreifende Wirkung auf den Zustand der Zelle haben, zu verwerten. Alternativ kann ein anderer Reporter, der mit dem ersten Promotor verknüpft ist, verwendet werden. Zusätzlich können Perturbagene, die allgemeine, nicht-spezifische Wirkungen auf die Genexpression haben, identifiziert und/oder entfernt werden, indem Perturbagen-Unterbibliotheken oder einzelne Perturbagen-kodierende Sequenzen durch eine andere Wirtszelle, die mit der ersten Wirtszelle nicht verwandt ist, mit einem anderen Wirtszell-spezifischen Promotor hindurchgeführt werden.

Small-Molecule-Verdrängungsscreening basierend auf Perturbagen-Ziel- Wechselwirkungen

Perturbagene, die wie oben isoliert wurden, verhalten sich auf eine transdominante Weise ähnlich den traditionellen pharmazeutischen Small-Molecule-Verbindungen. Folglich können sie in gewissen Fällen so ziemlich dieselbe Funktion erfüllen, wie die Small-Molecule-Therapeutika, obwohl es notwendig sein kann, die intrazelluläre Verteilung und Expression durch die Technologie der Gentherapie sicherzustellen. Weiterhin stellen Perturbagene in Verbindung mit ihren zellulären Zielen die Grundlage für in vitro Hochdurchsatzscreenings für Nachahmer der Small-Molecules dar, die Eigenschaften aufweisen, die denen des Ursprungsperturbagens ähnlich sind; namentlich binden sie spezifisch an das Perturbagenziel und unterbrechen die Funktion des Ziels in vivo. Solche Moleküle können auf Zellen Wirkungen haben, ähnlich zu den in dem Screening verwendeten Perturbagenen.
In einem besonderen Ausführungsbeispiel der Erfindung wird ein System zur Bewertung von Protein-Protein-Wechselwirkungen und deren Hemmung in einer Zelle in vivo, z. B. in einer Bakterien-, Pilz-, Pflanzen-, Insekten- oder Säugerzelle, oder in vitro verwendet. Dieses System, das als ein Small-Molecule-Verdrängungsassay bezeichnet wird, kann dazu verwendet werden, Bibliotheken von Small-Molecules zu screenen, um spezifische Verbindungen, die Perturbagen/Ziel-Wechselwirkungen unterbrechen, zu identifizieren. Diese Verwendung der Perturbagene und ihrer verwandten Ziele ist in der Patentanmeldung von Kamb, C. A. (WO 98/07886) beschrieben.

BEISPIEL 1

Identifizierung von Perturbagenen, die den α-Faktor-Signalweg in Hefe-a-Zellen modulieren

Die Bindung des Hefe-Paarungspheromons α-Faktor an einen spezifischen G-Proteingekoppelten Rezeptor, der sieben transmembranische Domänen enthält, (das Produkt des STE2-Gens) auf der Oberfläche von Hefezellen des a-Paarungstyps aktiviert einen Signalweg, der seinen Höhepunkt im Anhalten des Zellzyklus und der Vorbereitung der Zelle für eine Paarung mit einer α-Zelle findet (Fig. 6). Dieser gut charakterisierte Signalweg (einen Überblick geben Bardwell L., Cook J. G., Inouye C. J., Thorner J., Dev. Biol. 166: 2, 363-379 (1994); Herskowitz I., Cell 80: 2, 187-197, (1995)) umfasst die Aktivierung einer MAP-Kinase-Kaskade und die transkriptorische Induktion von wenigstens 6 Genen. Die Analyse der Promotoren einiger diese Gene hat ein Sequenzelement identifiziert, das notwendig und ausreichend für die Induktion ist. Das Verfahren der Erfindung kann angewandt werden, um Perturbagene zu identifizieren, die den α-Faktor-Signalweg blockieren und folglich die α-Faktor-abhängige Induktion spezifischer Gene verhindert.

Bildung eines auf α-Faktor ansprechenden GFP-Reporter-Plasmids

Das promotorlose Hefeplasmid pRS416-GFP (offenbart in WO 98/36097 von Carl Alexander Kamb und Giordano M. Caponigro, angemeldet am 14.02.1997 und bezeichnet als "Methods for identifying, characterizing, and evolving cell-type specific cis regulatory elements") enthält die GAL1-TATA-Box (ohne die von GAL stromaufwärts lokalisierten Aktivierungssequenzen UAS) stromaufwärts von der kodierenden Sequenz einer GFP-Variante, die gut in Hefe exprimiert. Dieses Plasmid kann in Hefe replizieren und selektiert werden (CEN und ARS, URA3) und E. coli (ColE1, AmpR) und hat eine einzelne BgIII-Stelle stromaufwärts von der GAL1-TATA-Box, um DNA-Fragmente, die einen Promotor enthalten, zu inserieren. Die GFP-Expression wird α-Faktor-reagierend gemacht, indem in die BgIII-Stelle vier Kopien des α-Faktor Antwortelements (als ein synthetisches Oligo), ein PCR-Fragment, das die Basen -259 stromaufwärts des Fus1- Gens enthält (Hagen D. C., McCaffrey G., Sprague G. F. Jr., Mol. Cell Biol. 11: 6, 2952- 61 (1991)) oder alternativ jedes andere auf den α-Faktor ansprechende cis- regulatorische Element kloniert werden, wobei das Element aus einer genomischen Bibliothek isoliert wurde, die gescreent wurde, um solche Elemente gemäß den Verfahren zu identifizieren, die in der Patentanmeldung von Carl Alexander Kamb und Giordano M. Caponigro, angemeldet am 14.02.97 und bezeichnet als "Methods for identifying, characterizing, and evolving cell-type specific cis regulatory elements" (WO 98/36097) beschrieben werden (siehe Fig. 7). Wenn dieses Konstrukt in Hefe eingebracht wird und die Zellen dem α-Faktor ausgesetzt werden, zeigen sie eine erhöhte Fluoreszenz entweder durch mikroskopische oder FACS-Analyse im Vergleich mit den selben Zellen, die in der Abwesenheit des α-Faktors vermehrt wurden. Folglich erfüllt dieses Konstrukt die Bedingungen, die für einen Reporter, der in der hier offenbarten Erfindung angewendet werden kann, notwendig sind; namentlich reagiert der Reporter in einer Weise, die den relevanten phänotypischen Zustand der Zelle und/oder der Zellumgebung widerspiegelt.
Als eine Alternative zum Einbringen des Reportergens in Hefe auf einem Centromerenthaltenden Plasmid, kann das Konstrukt in das Hefegenom eingeführt werden unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Techniken (Ausubel et al., 1996; Rothstein R. J., Methods Enzymol. 101: 202-211 (1983)). Kurz gesagt, werden endogene Wege homologer Rekombination in vivo verwendet, um einen Expressionsvektor zu inserieren, dem ein ARS/CEN fehlt, der aber einen selektierbaren Marker zusätzlich zur Reporterexpressionskassette enthält. Eine Region der Hefe-DNA- Homologie wird in den Vektor eingebracht und der Vektor wird mit einem Restriktionsenzym geschnitten, das ein lineares Molekül erzeugt, dessen Enden Homologie mit einer chromosomalen Heferegion aufweisen. Transformation mit diesem linearen Material resultiert in der Rekrutierung der homologen Rekombinationsmaschinerie und erzeugt eine große Zahl an Transformanten, die den Expressionsvektor, der in die chromosomale Homologieregion inseriert wurde, enthalten. Solch ein Expressionsvektor wird stabil mit dem Chromosom, in dem er ansässig ist, vererbt. Einzelne Transformanten können getestet werden, um sicherzustellen, dass sie weiterhin den Reporter exprimieren, wie von ihnen erwartet wird.

Bildung einer genomischen DNA-Perturbagen-Bibliothek von Hefe

Standardtechniken werden verwendet, um eine Bibliothek mit genomischen DNA- Fragmenten aus Hefe in einem Hefe/E. coli-Shuttlevektor wie z. B. pRS315 zu bilden (Sikorski R. S., Hieter P., Genetics 122: 1, 19-27 (1989)). Dieser Vektor enthält LEU2 als selektierbaren Marker in Hefe. Vier gesonderte Bibliotheken können erstellt werden, um das Perturbagen in unterschiedlichen Zusammenhängen oder zellulären Kompartimenten darzustellen. In allen vier Fällen befindet sich ein GAL1-Promotor stromaufwärts des inserierten genomischen Fragments, um seine Expression Galaktose-abhängig zu lenken.
In einem Vektor ist die kodierende Sequenz für Blaufluoreszierendes Protein (BFP) (Quantum Biotechnologies, Inc., Laval, Canada; Anderson M. T., Tjioe I. M., Lorincz M. C., Parks D. R., Herzenberg L. A., Nolan G. P., Herzenberg L. A., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 93: 16, 8508-8511 (1996)) stromabwärts des GAL-Promotors und stromaufwärts der Insertionsstelle lokalisiert, um translatorische Fusionen von BFP und der inserierten kodierenden Sequenz zu ermöglichen (siehe Fig. 8). In einem zweiten Fall ist die sezernierte Form der Invertase der Fusionspartner, dies ermöglicht den Export in den Sekretionsweg der Perturbagene und kann einen Mechanismus zur Isolierung von Perturbagenen bereitstellen, die Aktivität zeigen, wenn sie aus der Zelle heraus sezerniert wurden oder wenn sie anderweitig dem sekretorischen Weg übergeben wurden. In einem dritten Fall wird das GAL4-Protein, ein gut etablierter Fusionspartner (Fields S. und Song O.-K., U. S. Patent Nr. 5,283,173), mit dem Perturbagen fusioniert; dies erleichtert den Import des Perturbagens in den Kern. In einem vierten Fall gibt es keinen Fusionspartner für die Perturbagensequenz; dies ermöglicht die Herstellung "freistehender" Perturbagene.

Analyse der Bibliothek in (α-Faktor-ansprechenden) GFP-Reportertragenden a- Zellen

Jeder der oben beschriebenen Perturbagenbibliotheken wird in gesonderte Zellpopulationen eingeführt, die den α-Faktor-ansprechenden GFP-Vektor enthalten. Die selektierbaren Marker, die für das Perturbagen und die Reporterplasmide verwendet werden, sind unterschiedlich, so dass beide in der selben Zelle aufrechterhalten werden können (z. B. URA3 und LEU2). Alternativ kann das Reporterkonstrukt in das Chromosom integriert werden (was Vorteile wegen den einheitlicheren Levels der Reportergenexpression in der Zellpopulation hat).
Ein Perturbagen, das spezifisch den α-Faktor-Signalweg blockiert, sollte die Fluoreszenz dieser Zellen in einer Galaktose-abhängigen Weise reduzieren. Die Perturbagen-Unterbibliothek kann weiter getestet werden, um sicherzustellen, dass z. B. die Expression bestimmter Perturbagene nicht einfach Zellen abtötet. Diese Manipulation stellt ein praktisches Gegenscreening bereit, um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, dass die Perturbagene spezifisch für den anvisierten biochemischen Weg sind, der die α-Faktor-Hemmung umfasst.
Es ist auch möglich, den Selektionsprozess umzukehren und Perturbagene zu identifizieren, die die umgekehrte Wirkung haben; namentlich die Erhöhung der Reporterexpression bei Abwesenheit des α-Faktors und bei Vorhandensein von Galaktose. Solche Perturbagene können isoliert werden durch Screening nach Perturbagen-enthaltenden Zellen, die bei Vorhandensein von Galaktose und bei Abwesenheit des α-Faktors hell sind.
Es ist zu bemerken, dass es möglich ist, die BFP-Perturbagenbibliothek bei dieser Klasse (der zweite Fall oben) zu verwenden, da die Levels der GFP-Expression in einer Zelle unabhängig von der BFP-Expression in der selben Zelle überwacht werden können durch den angemessenen Gebrauch von Bandpassfiltern in der FACS- Maschine. Da die Exzitations- und Emissionsmaxima von GFP sich von denen von BFP unterscheiden, ist es notwendig angemessene Filter und Laser anzuwenden (Anderson, et al., 1996).

BEISPIEL 2

Weg, der zur Expression des Tyrosinase-Gens in Melanom-Zellen führt

Eine Reihe an menschlichen Melanom-spezifischen Genen wurde identifiziert, einschließlich dem DOPAchrom-Tautomerase/Tryrosinase-verwandten Protein 2 (TRP- 2) (Yokoyama K., Yasumoto K. et al., J. Biol. Chem. 269: 27080-27087 (1994)), Melanotransfernin (Mtf) (Duchange N., Ochoa A. et al., Nucleic Acids Res. 20: 2853- 2859 (1992)), Mikrophthalmie-assoziiertem Transkriptionsfaktor (MITF) (Fuse N., Yasumoto K. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 219: 702-707 (1996) und Tyrosinase (Shibata K., Muraosa Y. et al., J. Biol. Chem. 267: 20584-20588 (1992)). Die assoziierten regulatorischen Elemente dieser Gene stellen die Grundlage bereit, um Melanomzell-spezifische Reporter zu entwerfen, die die Fusion eines Reportergens mit den cis-regulatorischen Sequenzen eines Melanom-spezifischen Gens umfassen.

Bildung eines GFP-Expressionsvektors mit Tyrosinase-regulatorischen Elementen

Tyrosinase kodiert ein Enzym, das in die Umwandlung von Tyrosin in das polymere, Licht-absorbierende Pigment Melanin einbezogen ist. Regulatorische Sequenzen im menschlichen Tyrosinasegen sind besonders gut charakterisiert. Transfektionsexperimente haben herausgefunden, dass ein Promotorfragment, das sich zwischen 1,8-2,7 Kilobasenpaaren stromaufwärts der Tyrosinase-Transkriptions- Initiationsstelle befindet, ausreichend ist, um die Expression spezifisch auf Melanom Pigment-produzierenden Zellen zu übertragen (Shibata K., Muraosa Y. et al., 1992). Die weitere Deletionsanalyse identifizierte einen Pigmentzell-spezifischen Enhancer, der in einem 200-Basenpaar-Fragment enthalten ist, das 1,8-2,0 Kilobasenpaare stromaufwärts der Startstelle lokalisiert ist. Ein 39-Basenpaar-Kernelement war ausreichend, um die Melanomzell-spezifische Expression zu übertragen.
Die in der oben beschriebenen Experimentserie definierte Promotorregion wird dazu verwendet, die Expression eines Reportergens (in diesem Fall GFP) spezifisch in menschlichen Melanomzellen zu lenken. Zahlreiche solcher kultivierter Zelllinien sind erhältlich (Satyamoorthy K., DeJesus E. et al., Melanoma Res. (im Druck)), von denen viele (z. B. HS294T) in Kultur gut wachsen und in den in diesem Beispiel beschriebenen Experimenten verwendet werden können. Die Promotorregion kann die gesamten 2,7 - Kilobasenpaare stromaufwärts des menschlichen Tyrosinasegens enthalten oder das 200 Basenpaar-Fragment, das sich stromaufwärts der TATA-Boxsequenz befindet (Fig. 3). Basierend auf der veröffentlichten Literatur sollte solch ein Konstrukt selektiv in Melanomzellen aktiv sein und nicht in, z. B. Fibroblastenzellen.
Das Fusionskonstrukt, das aus Tyrosinase-regulatorischen Sequenzen besteht, die mit dem GFP-Reporter verbunden sind, wird in einen Expressionsvektor eingeführt, so dass GFP in hohen Maße in den Wirtszellen exprimiert wird. Die Selektion auf stabile Exprimierer wird angewendet werden, unter Verwendung von z. B. dem dominant selektierbaren Marker für die Neomycin-Resistenz, die von dem Expressionsvektor wie z. B. dem in Fig. 3 gezeigten, getragen wird. Stabile Exprimierer werden unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Techniken selektiert werden (Ausubel et al., 1996) und die Population der GFP-exprimierenden Zellen wird durch Durchflusszytometrie nachgewiesen werden. Ein geeigneter Klon, der durch einen hohe, stabile Expression des GFP gekennzeichnet ist, wird in den darauffolgenden Experimenten angewendet werden.

Screening auf Perturbagene, die die Tyrosinase-Expression inhibieren

Diese Wirtszelllinie wird als ein Rezipient für den Transfer einer Perturbagenbibliothek des oben beschriebenen Typs verwendet. Kurz gesagt, besteht die Bibliothek aus cDNA-Fragmenten (erhalten aus z. B. zufällig geprimter menschlicher fötaler Gehirn- mRNA) oder zufälligen Peptid-kodierenden Sequenzen, die von einem Expressionsvektor getragen werden, der z. B. von einem typischen Säugerexpressionsvektor, wie z. B. dem in Fig. 1 gezeigten, abgeleitet werden kann. In diesem Fall befindet sich die Bibliothek unter der Kontrolle von CMV-Sequenzen. Die Bibliothek wird in die Wirtszellen eingeführt unter der Verwendung von Standardprotokollen für die Elektroporation (Ausubel et al., 1996). Die spezifischen Bedingungen werden gewählt, um den Nucleinsäuretransfer zu optimieren (siehe Beispiel 3). Die Zellen werden dann durch eine Durchflusssortiervorrichtung, wie z. B. einem FACS, hindurchgeführt, um Zellen zu sammeln, die dunkel sind (d. h. die Levels von GFP exprimieren, die niedriger sind als der mittlere Level der GFP-Expression in den Wirtszellen, denen Perturbagene fehlen, oder die niedriger sind als der mittlere Level der GFP-Expression, die von der Massenpopulation der Wirtszellen, von denen viele Perturbagene exprimieren, ausgeübt wird). Die vorhandenen Perturbagenkodierenden DNA-Inserts, die in den dunklen Zellen enthalten sind, werden wiedergewonnen z. B. durch PCR-Amplifikation unter Verwendung von Primerstellen, die die Perturbageninsert-Sequenzen flankieren. Diese Perturbagenfragmente werden in dem Expressionsvektor rekloniert und die Unterbibliothek wird wieder in die Reportertragenden Wirtszellen eingeführt. Dieser zyklische Vorgang wird ausreichend oft wiederholt, um einen ziemlich reinen Satz an Perturbagenfragmenten zu erzeugen, die die Wirkung haben, dass sie, wenn sie einzeln in Wirtszellen eingeführt werden, die GFP-Expression senken. Solche Fragmente können weiter charakterisiert werden, einschließlich der Bestimmung ihrer DNA-Sequenzen und Untersuchung ihrer Wirkungen auf den Gesamtphänotypen der Zelle.

BEISPIEL 3

Weg, der zur Expression von Beta-3-Integrin im metastatischen Melanom führt

Ein gemeinsames Merkmal fortgeschrittener Melanome ist die Überexpression des Adhäsionsmoleküls beta-3-Integrin (Varner J. A. und Cheresh D. A., Curr. Opin. Cell Biol. 8: 724-730 (1996)). Dies stellt ein Beispiel dar, wie die hier offenbarte Erfindung verwendet werden kann, um Perturbagene (und Perturbagenziele) zu identifizieren, die in die Expression spezifischer Zelloberflächenmoleküle involviert sind.

Transfer von Perturbagenbibliotheken in Melanomzellen

Melanomzellen, die beta-3-Integrin überexprimieren, werden für diese Experimente als Ausgangspunkt verwendet. Wenn sie mit einem monoklonalen Antikörper, der beta-3- Integrin bindet, gefärbt werden, so zeigen diese Zellen ein reproduzierbar hohes Maß an Expression, die quantitativ von einer Reihe anderer Zelltypen unterschiedlich ist, die entweder niedrige Levels des beta-3-Integrin exprimieren oder gar keines, z. B. normale Melanocyten. Die aus einem Satz an beta-3-Integrin-überexprimierenden Linien, die beschrieben sind in Satyamoorthy K., DeJesus E. et al., Melanoma Res. (im Druck), ausgewählte Zelllinie wird zuerst getestet, um den Nucleinsäuretransfer unter Verwendung von z. B. Elektroporation zu optimieren. Standard-GFP- Expressionsvektoren, wie z. B. die von Clontech (Palo Alto Kalifornien) verkauften, stellen ein bequemes Verfahren bereit, die Ergebnisse unterschiedlicher Elektroporationsbedingungen zu bewerten. Die GFP-Expressionsvektoren werden in die Zellen eingeführt, unter Verwendung einer Reihe an Spannungen und Kapazitäten und die Zellen werden zurück in Kultur gebracht für einen Zeitraum (typischerweise ein Tag), der ausreichend ist, um die Erholung der Zellen und Expression der transferierten DNA zu ermöglichen. Die Zellen werden dann mit Hilfe eines Durchflusssortierers, wie z. B. einem FACS analysiert, um den Prozentsatz an Zellen zu bestimmen, die hell sind, d. h. die Fraktion, die transferierte DNA angenommen hat. Für weitere Experimente werden Bedingungen gewählt, die diese Zahl maximieren.

Durchflusssortierer-Analyse und Selektion der dunklen Zellen

Eine Perturbagen-Expressionsbibliothek des Typs, der in Beispiel 2 beschrieben ist, wird in die Melanomwirtszellen eingeführt unter Verwendung der oben definierten Bedingungen. Nach ein bis drei Tagen werden die Zellen gesammelt und mit dem monoklonalen Antikörper, der gegen beta-3-Integrin gerichtet ist, gefärbt und mit einem sekundären fluoreszenzmarkierten Antikörper markiert, der die indirekte Sichtbarmachung des beta-3-Integrins auf den Zellen durch Bindung der Fc-Domäne des ersten Antikörpers ermöglicht (Robinson J. P., Darzynkiewicz Z. et al. (Eds.), Current Protocols in Flow Cytometry, John Wiley and Sons, New York (1997); Ausubel et al., 1996). Diese gefärbten Zellen werden durch einen Durchflusssortierer, z. B. ein FACS, hindurchgeführt und die dunkle Zellfraktion wird gesammelt. Die gesammelten Zellen werden lysiert und ihre Perturbageninserts werden mit PCR wiedergewonnen für entweder einen weiteren Anreicherungszyklus oder für die Sequenzanalyse. In jedem Fall werden die Inserts in E. coli vor dem weiteren Vorgehen rekloniert. Einzelne Perturbagenfragmente, die durch das obige Verfahren identifiziert wurden, werden weiter analysiert, um sicherzustellen, dass viele (vorzugsweise die Mehrheit) die erwarteten Eigenschaften haben, wenn sie einzeln und nicht als Teil einer Population, getestet werden. Die Mehrheit solcher Fragmente sollten, wenn sie alleine in die Melanomzellen eingeführt werden, eine Abnahme des Levels an beta-3-Integrinprotein, das an der Zelloberfläche exprimiert wird, verursachen. Die DNA-Sequenzen dieser Fragmente können bestimmt werden und dazu verwendet werden, die öffentlichen Sequenzdatenbanken zu durchsuchen, um herauszufinden, ob sie mit einem bekannten Protein übereinstimmen. Die Ergebnisse solch einer Recherche können eine wertvolle Information über die Natur der Perturbagenwechselwirkung in Zellen bereitstellen (d. h. den Mechanismus der Wirkung) und können auf das Perturbagenziel in vivo weisen. Das Perturbagenziel kann auch aufgefunden werden, unter Verwendung des Verfahrens der Zwei-Hybrid-Analyse in S. cerevisiae, wie beschrieben in Fields S. und Song O.-K., U. S. Patent Nr. 5,283,173; Serrano et al., 1993).
Die obigen Beispiele sind bereitgestellt, um die Erfindung zu erläutern, aber nicht um ihren Umfang zu limitieren. Andere Varianten der Erfindung werden leicht für den Durchschnittsfachmann augenscheinlich und sind von den angehängten Ansprüchen umfasst.

Claims

1. Verfahren zur Identifizierung von Nucleinsäuresequenzen, die Agenzien kodieren, welche einen Phänotypen von Interesse verändern, umfassend:

(a) Aufrechterhalten eines Surrogatreportergens in einer Vielzahl an Wirtszeilen, in denen das Surrogatreportergen operabel mit einer Zelltypspezifischen oder Zellstatus-spezifischen, cis-regulatorischen Sequenz verbunden ist, die das Ausmaß der Reportergenexpression in den Wirtszellen mit einem Phänotypen von Interesse korreliert;

(b) Einführen einer Perturbagen-Expressionsbibliothek in die Wirtszellen;

(c) Auswählen von einer oder mehreren, die Bibliothek-enthaltenden Wirtszelle(-n) mit einem vorbestimmten Ausmaß an Surrogatreportergenexpression aus der Vielzahl der Wirtszellen;

(d) Wiedergewinnen einer Unterbibliothek aus Nucleinsäurefragmenten, die ein oder mehrere Fragment(-e) enthält, die das Ausmaß der Surrogatreportergenexpression in Wirtszellen verändern, aus den ausgewählten, die Bibliothek-enthaltenden Wirtszellen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Perturbagen-Expressionsbibliothek Nucleinsäuresequenzen enthält, die translatiert werden, um Proteine, Polypeptide oder Peptide in der Wirtszelle zu erzeugen.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, weiterhin umfassend die Wiedereinführung der Unterbibliothek aus den in Schritt (d) wiedergewonnenen Fragmenten in die Vielzahl der Wirtszellen und Wiederholen der Schritte (c) und (d).

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die wiedergewonnenen Unterbibliothekfragmente vor dem Wiedereinführungsschritt in vitro behandelt werden.

5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Expressionsbibliothek Inserts enthält in Größen, die von 10 Basenpaaren bis 10.000 Basenpaaren variieren.

6. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Auswahlschritt die Verwendung eines Durchflusssortiergerätes umfaßt.

7. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Reportergen ein Molekül kodiert, welches geeignet ist, Licht zu emittieren oder ein Molekül, das fähig ist, zu fluoreszieren oder ein Molekül, das fähig ist, sich in die Wirtszellmembran oder in ein intrazelluläres Molekül einzufügen.

8. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Expressionsbibliothek eine auswählbare Markersequenz enthält.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die auswählbare Markersequenz den Wirtszellen Antibiotikaresistenz verleiht.

10. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Wirtszellen Bakterien, Archaebakterien oder Pilze sind oder von einer Pflanze, einem Insekt oder einem Säuger stammen.

11. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Expressionsbibliothek Sequenzen, die Fusions- oder Insertionsprodukte aus den kodierenden Sequenzen der Bibliotheksinserts kodieren, und eine Nucleinsäuresequenz enthält, die eine Aminosäuresequenz mit vorbestimmten Eigenschaften kodiert.

12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Aminosäuresequenz mit vorbestimmten Eigenschaften ein zweites Reportermolekül kodiert.

13. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Aminosäuresequenz mit vorbestimmten Eigenschaften den Export der Fusionsprodukte aus der Wirtszelle oder in den Sekretionsweg, oder den Import des Fusionsproduktes in den Kern der Wirtszelle fördert.

14. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Zelltyp- oder Zellstatusspezifische, cis-regulatorische Element isoliert wird durch ein Verfahren, das die folgenden Schritte umfaßt:

(a) Einführen einer zweiten Expressionsbibliothek aus Nucleinsäurefragmenten, die ein zweites Reportermolekül enthalten, das wirksam mit Cis-Sequenzen verbunden ist, die zur Expressionsbeeinflussung des zweiten Reportermoleküls fähig sind, in eine Vielzahl zweiter Wirtszellen;

(b) Auswählen einer oder mehrerer, Bibliothek-enthaltenden, zweiten Wirtszelle(-n) mit einem zweiten, vorbestimmten Ausmaß an Reporterexpression aus der Vielzahl zweiter Wirtszellen;

(c) Wiedergewinnen einer Unterbibliothek aus Nucleinsäurefragmenten aus den ausgewählten, Bibliothek-enthaltenden zweiten Wirtszellen;

(d) Einführen der Unterbibliothek in eine Vielzahl dritter Wirtszellen;

(e) Auswählen einer oder mehrerer, Unterbibliothek-enthaltenden dritten Wirtszelle(-n) mit einem dritten, vorbestimmten Ausmaß an Reporterexpression aus der Vielzahl dritter Wirtszellen;

(f) Wiedergewinnen der Unterbibliothekfragmente aus den ausgewählten, dritten Wirtszellen.

15. Verfahren zur Identifizierung von Nucleinsäuresequenzen, die Agenzien kodieren, welche einen Phänotypen von Interesse verändern, umfassend:

(a) Aufrechterhalten eines Surrogatreportergens in einer Vielzahl an Wirtszellen, wobei das Surrogatreportergen operabel mit einer Zelltypspezifischen oder Zellstatus-spezifischen, cis-regulatorischen Sequenz verbunden ist, die das Ausmaß der Reportergenexpression in den Wirtszellen mit einem Phänotypen von Interesse korreliert;

(b) Exprimieren einer ersten Nucleinsäuresequenz in der Vielzahl an Wirtszellen, wobei die Expression der ersten Nucleinsäuresequenz ursächlich mit einem zweiten Ausmaß der Surrogatreportergenexpression in den Wirtszellen verbunden ist;

(c) Einführen einer Perturbagen-Expressionsbibliothek in die Wirtszellen;

(d) Auswählen einer oder mehrerer, Bibliothek-enthaltenden Wirtszelle(-n) mit einer vorbestimmten Veränderung des zweiten Ausmaßes der Surrogatreporterexpression aus der Vielzahl an Wirtszellen; und

(e) Wiedergewinnen einer Unterbibliothek an zweiten Nucleinsäurefragmenten, die ein oder mehrere Fragment(-e) enthält, welche(-s) dazu fähig ist/sind, die Auswirkungen der ersten Nucleinsäuresequenz auf das Ausmaß der Reporterexpression in den Wirtszellen wenigstens teilweise umzukehren oder zu verstärken, aus den ausgewählten, Bibliothek-enthaltenden Wirtszellen.

16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Perturbagen-Expressionsbibliothek Nucleinsäuresequenzen enthält, die translatiert werden, um Proteine, Polypeptide oder Peptide in den Wirtszellen zu erzeugen.

17. Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, weiterhin umfassend das Wiedereinführen der Unterbibliothek aus Fragmenten, die in Schritt (e) wiedergewonnen wurden, in die Vielzahl an Wirtszellen und Wiederholen der Schritte (d) und (e).

18. Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, wobei der Auswahlschritt die Verwendung eines Durchflusssortiergerätes umfaßt.

19. Verfahren nach Anspruch 17, wobei die wiedergewonnenen Unterbibliothekfragmente vor dem Wiedereinführungsschritt in vitro behandelt werden.