DE69822510T2

DE69822510T2 - Identifizierung und charakterisierung von interagierenden molekülen

Info

Publication number: DE69822510T2
Application number: DE69822510T
Authority: DE
Inventors: Erich Wanker; David Bancroft; Hans Lehrach; Niels Wedemeyer; Elmar Maier; Sebastian Meier-Ewert
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 1997-11-27
Filing date: 1998-11-27
Publication date: 2005-03-24
Anticipated expiration: 2018-11-28
Also published as: EP1036324A1; IL136394A0; IL136393A0; JP2002508517A; GB2338711A; AU1757599A; US6664048B1; EP1036324B1; DE69824757T2; AU2050599A; GB9923293D0; AU760908B2; GB2338711A8; CA2311896A1; ATE269974T1; WO1999028745A1; CA2311705A1; JP2001525186A; DE69822510D1; EP1042670A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Identifizierung und gegebenenfalls zur Charakterisierung von miteinander wechselwirkenden Molekülen, das dazu entworfen wurde, positive Clone aus der relativ großen Anzahl von falsch-positiven Clonen nachzuweisen, die mit Zwei-Hybrid-Systemen isoliert wurden. Das Verfahren der Erfindung basiert auf einer neuartigen Kombination von Selektionsschritten, die dazu verwendet werden, Clone, die wechselwirkende Moleküle exprimieren, gegenüber falsch-positiven Clonen nachzuweisen. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Kit, das zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung nützlich ist. Die vorliegende Erfindung stellt parallele, mit hohem Durchsatzmögen versehene oder automatisierte Wechselwirkungs-Durchmusterungsverfahren zur zuverlässigen Identifizierung von miteinander wechselwirkenden Molekülen bereit.
Protein-Protein-Wechselwirkungen sind für fast alle biologischen Vorgänge essentiell, wie zum Beispiel für die Replikation, Transkription, Sekretion, Signaltransduktion und den Stoffwechsel. Die klassischen Verfahren zur Identifizierung solcher Wechselwirkungen, wie z. B. die Co-Immunopräzipitation oder die Kreuzvernetzung, sind nicht für alle Proteine verfügbar, oder sind unter Umständen nicht ausreichend empfindlich. Diese Verfahren besitzen weiterhin den Nachteil, dass potenziell miteinander wechselwirkende Partner und die entsprechenden Nucleinsäurefragmente oder -sequenzen nur mit großem Arbeitsaufwand identifiziert werden können. Gewöhnlich geschieht dies durch Proteinsequenzierung oder durch die Herstellung von Antikörpern, gefolgt von der Durchmusterung einer Expressions-Genbank.
Eine wichtige Entwicklung zur bequemen Identifizierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen war das Hefe-Zwei-Hybrid-(2H)-System, das durch Fields und Song (1989) vorgestellt wurde. Dieses genetische Verfahren erlaubt nicht nur das rasche Aufzeigen von in vivo-Wechselwirkungen, sondern auch die einfache Isolierung der entsprechenden Nucleinsäuresequenzen, die die miteinander wechselwirkenden Partner codieren. Das Hefe-Zwei-Hybrid-System benutzt die Eigenschaften einer großen Anzahl der eukaryontischen Transkriptionsfaktoren, die zwei voneinander trennbare funktionelle Domänen tragen: eine DNA-bindende Domäne, sowie eine zweite Domäne, welche den RNA-Polymerase-Komplex aktiviert (die Aktivierungsdomäne). Im klassischen 2H-System werden ein sogenanntes „Köder"-Protein, das eine DNA-Bindedomäne (GAL4bd oder lexA) und ein Protein „X" von Interesse umfaßt, als Fusionsprotein in der Hefe exprimiert. Die gleiche Hefezelle exprimiert gleichzeitig ein sogenanntes „Fisch"-Protein, das eine Aktivierungsdomäne (GAL4ad oder VP16) und ein Protein „Y" umfaßt. Bei der Wechselwirkung eines Köder-Proteins mit einem Fisch-Protein werden die DNA-Binde- und die Aktivierungsdomäne der Fusionsproteine in enge Nachbarschaft zueinander gebracht, und der so entstehende Proteinkomplex löst die Expression der Reportergene aus, wie zum Beispiel HIS3 oder lacZ. Diese Expression kann durch die Anzucht der Hefezellen auf selektivem Medium ohne Histidin, sowie über die Aktivierung des lacZ-Gens leicht überwacht werden. Die Gensequenz, die zum Beispiel ein unbekanntes Fisch-Protein codiert, kann durch die Isolierung des entsprechenden Plasmids und eine anschließende Sequenzanalyse leicht identifiziert werden. Inzwischen wurden eine Anzahl an Varianten des 2H-Systems entwickelt. Die weitaus Wichtigsten davon sind das „Ein-Hybrid"-System zur Identifizierung von Promotor-bindenden Proteinen und das „Drei-Hybrid(„tri-hybrid")-System" zur Identifizierung von RNA-Protein-Wechselwirkungen (Li und Herskowitz, 1993; SenGupta et al., 1996; Putz et al., 1996). Im Fachgebiet wird vorausgesetzt, dass zur Identifizierung, zum Nachweis oder zum Testen der Vielzahl an Wechselwirkungen, die in biologischen Systemen angetroffen werden, unterschiedliche 2H-Systeme angewendet werden müssen. Tatsächlich wurden andere 2H-Technologien entwickelt, um es zu ermöglichen, Protein-Protein-Wechselwirkungen in anderen Organismen und/oder unterschiedlichen Zellkompartimenten zu untersuchen. Zum Beispiel in Säugerzellen (Rossi et al., 1997; PNAS 94: 8405–8410), in Bakterienzellen (Karimova et al., 1998; PNAS 95: 5752–5756), im Cytoplasma von Hefezellen (Johnsson & Varshavsky, 1996; US 5503977 ) und im periplasmatischen Raum von Hefezellen (Fowlkes et al., 1998; US 5789184).
Diese 2H-Systeme zur Identifizierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen wurden bis heute nur im Labormaßstab durchgeführt. Die zahlreichen Schritte dieser Systeme müssen der Reihe nach durchgeführt werden. Daher sind sie sehr zeitaufwendig. Als Folge haben sich diese 2H-Systeme bisher zur Analyse von eukaryontischen Banken vs. Bank-Durchmusterungen zur Untersuchung von Protein-Protein-Netzwerken als ungeeignet erwiesen. Obwohl neuere Entwicklungen diese Nachteile berücksichtigt haben (Bartel et al., 1996), wurde eine erfolgreiche Suche nach miteinander wechselwirkenden Proteinen in großem Maßstab, wie zum Beispiel auf Basis einer Durchmusterung einer eukaryontischen Genbank gegen Genbank, nicht berichtet. Noch wichtiger ist darüber hinaus, dass 2H-Systeme unter dem schwerwiegenden Nachteil leiden, dass viele falsch-positive Clone isoliert werden, die keine Wechselwirkungen zwischen den bindenden Partnern darstellen. Dies ist besonders unbequem in den Fällen, bei denen große Zahlen an Clonen untersucht werden sollen, da im Falle der Durchmusterung einer eukaryontischen Genbank mit einer Genbank es typisch ist, dass mehrere Hunderte oder Tausende an Clonen zur Untersuchung eines Protein-Protein-Netzwerks analysiert werden müssen. WO 97/47763 offenbart ein Verfahren, das nur eine Selektion auf falsch-positive Protein-Protein-Wechselwirkungen umfaßt.
Das technische Problem, dem die vorliegende Erfindung zu Grunde liegt, war es daher, diese Schwierigkeiten im Fachgebiet zu überwinden und ein System zusammenzustellen, dass zuverlässig Clone liefert, die miteinander wechselwirkende Moleküle exprimieren. Diese System sollte darüber hinaus zur Durchmusterung einer Genbank gegen Genbank im Großmaßstab unter Verwendung eines parallelen, mit einem hohen Durchsatz versehenen, oder automatisierten Anwendungsverfahrens geeignet sein.
Die Lösung dieses technischen Problems wird durch die Bereitstellung der Ausführungsformen erreicht, die in den Ansprüchen beschrieben sind.
Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung von mindestens einem Mitglied eines Paares oder eines Komplexes miteinander wechselwirkender Moleküle, umfassend:

(a) die Bereitstellung von Wirtszellen, die mindestens zwei genetische Elemente mit unterschiedlichen selektierbaren und gegenselektierbaren Markern enthalten, wobei die genetischen Elemente jeweils eine genetische Information umfassen, die eines der Mitglieder näher bestimmt, und wobei die Wirtszellen weiterhin ein Auswertungssystem („Readout-System") enthalten, das durch die Wechselwirkung der Moleküle aktiviert wird;
(b) gegebenenfalls dem Zulassen des Eintretens von mindestens einer Wechselwirkung;
(c) dem Selektieren auf die Wechselwirkung durch Übertragen von Nachkommen der Wirtszellen auf:
(ca) mindestens zwei verschiedene selektive Medien, wobei jedes dieser selektiven Medien das Wachstum der Wirtszellen nur in Abwesenheit von mindestens einem gegenselektierbaren Marker und in Anwesenheit eines selektierbaren Marken erlaubt; und
(cb) ein weiteres selektives Medium, das die Identifizierung der Wirtszellen nur nach Aktivierung des Auswertungssystems erlaubt;
(d) dem Identifizieren der Wirtszellen, die wechselwirkende Moleküle enthalten, die
(da) das Auswertungssystem nicht auf einem der in (ca) näher beschriebenen selektiven Medien aktivieren; und
(db) das Auswertungssystem auf dem in (cb) näher beschriebenen selektiven Medium aktivieren; und
(e) dem Identifizieren von mindestens einem Mitglied des Paares oder des Komplexes miteinander wechselwirkender Moleküle.

Diese Wechselwirkung ist bevorzugt eine spezifische Wechselwirkung.
Die Begriffe „Identifizierung" und „Identifizieren", wie sie gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, beziehen sich auf die Fähigkeiten der Fachleute, aufgrund der Aktivierung des Auswertungssystems auf dem selektiven Medium, positive Clone, die miteinander wechselwirkende Moleküle exprimieren, gegenüber falsch-positiven Clonen nachzuweisen und gegebenenfalls zusätzlich mindestens eines der miteinander wechselwirkenden Moleküle durch eine oder eine Reihe eindeutige/r Eigenschaft/en zu charakterisieren. Diese Moleküle werden bevorzugt durch die DNA-Sequenzen, die sie codieren, nach Nucleinsäure-Hybridisierung oder Isolierung und Sequenzierung der entsprechenden DNA-Moleküle charakterisiert. Alternativ und weniger bevorzugt können diese Moleküle durch unterschiedliche Eigenschaften, wie z. B. das Molekulargewicht, den isoelektrischen Punkt und im Falle von Proteinen, der N-terminalen Aminosäuresequenz, usw., charakterisiert werden. Verfahren zur Bestimmung solcher Parameter sind im Fachgebiet wohlbekannt.
Vorzugsweise werden die Mitglieder, die durch diese genetischen Elemente näher bestimmt sind, mit einer weiteren Einheit verbunden, die nach der Wechselwirkung die Aktivierung des Auswertungssytems auslöst oder dazu mit beiträgt. Es wird weiterhin bevorzugt, dass diese Einheit für jede Art eines genetischen Elements konserviert ist, und dass die unterschiedliche Arten der genetischen Elemente unterschiedliche Einheiten umfassen. Es wird zusätzlich bevorzugt, dass ein Mitglied eines Paares oder eines Komplexes miteinander wechselwirkender Molekülformen, wenn es als RNA von diesem genetischen Element transkribiert wird, ein RNA-Transkript bildet, das mit einer RNA fusioniert ist, die die Einheit näher bestimmt. Am meisten wird bevorzugt, dass dieses fusionierte RNA-Transkript translatiert wird, um ein Fusionsprotein zu bilden, das dieses Mitglied an die Einheit fusioniert enthält. Wie im Folgenden hierin nachstehend weiter ausgeführt wird, kann diese Einheit in einer Art eines genetischen Elements eine DNA-Sequenz sein, die eine DNA-bindende Domäne codiert, und in einer anderen Art eines genetischen Elements eine transaktivierende Proteindomäne sein. Vorzugsweise sind die genetischen Elemente Vektoren, wie z. B. Plasmide. Alternativ kann die Wechselwirkung zwischen zwei Fusionsproteinen zu einer funktionellen Einheit mit einer wieder hergestellten enzymatischen Aktivität führen, wie z. B. das bakterielle Chloramphenicol-Acetytransferase-Protein (CAT) (Seed & Sheen, 1988, Gene 67: 271–277). Die mindestens zwei in der Wirtszelle enthaltenen genetischen Elemente sind bevorzugt Vektoren aus einer Genbank, wie z. B. aus einer cDNA- oder einer genomischen Genbank. Daher erlaubt das Verfahren der Erfindung die Durchmusterung einer Vielzahl an Wirtszellen, wobei der Vektoranteil des genetischen Elements für jede Art eines genetischen Elements bevorzugt der Gleiche ist, aber wohingegen die potenziell miteinander wechselwirkenden Moleküle, Repräsentanten einer Genbank darstellen und somit in der Regel, und im Falle, dass die Genbank vorher nicht amplifiziert wurde, in jeder Wirtszelle unterschiedlich sein können. Diesbezüglich bezieht sich der Ausdruck „Art eines genetischen Elements" auf ein Element, das die gleiche Einheit, sowie die gleichen selektierbaren und gegenselektierbaren Marker umfaßt.
Die „Wechselwirkung" der Moleküle ist bevorzugt spezifisch und durch eine hohe Bindungskonstante charakterisiert. Der Ausdruck „Wechselwirkung" kann sich jedoch auch auf die Bindung zwischen Molekülen mit einer niedrigeren Bindungskonstante beziehen, die jedoch ausreichend sein muß, um das Auswertungssystem zu aktivieren. Die Wechselwirkung, die durch das Verfahren der Erfindung nachweisbar ist, führt bevorzugt zur Bildung einer funktionellen Einheit, die eine biologische, physikalische oder chemische Aktivität aufweist, welche in der Wirtszelle vor dem Auftreten der Wechselwirkung nicht vorlag.
Diese Wechselwirkung kann zur Bildung eines funktionellen Transkriptionsaktivators führen, der eine DNA-bindende und eine transaktivierende Proteindomäne umfaßt, und der in der Lage ist, eine darauf reagierende Einheit (Antworteinheit) zu aktivieren, die die Aktivierung des Auswertungssystems steuert. Zum Beispiel kann es sich bei der Einheit um einen Promotor handeln.
Alternativ kann die Wechselwirkung zu einer nachweisbaren Fluoreszenz-Resonanz-Energieübertragung führen, die durch die Wechselwirkung von Fusionsproteinen erhalten wird, die zum Beispiel die fluoreszierenden Proteine GFP-Typ a und GFP-Typ b enthalten (Cubbitt et al., 1995; Heim & Tsien, Curr. Biol, 6: 178–182, 1996). Die Wechselwirkung kann alternativ zur Wiederherstellung eines funktionellen Enzyms führen, wie zum Beispiel der β-Galactosidase (Rossi et al., 1997) oder der Adenylat-Cyclase (Karimova et al., 1998). Diese Ausführungsformen werden zum Studium der Wechselwirkungen in anderen Arten von Wirtszellen als Hefe bevorzugt.
In einer weiteren Ausführungsform kann die Wechselwirkung zu einer nachweisbaren Modifizierung eines Substrats durch ein Enzym führen, wie z. B. einer Farbreaktion, die durch die Abspaltung eines Propeptids durch ein Enzym erfolgen kann. Bei allen diesen Ausführungsformen der Erfindung wird vorausgesetzt, dass die miteinander wechselwirkenden Moleküle bevorzugt direkt mit den Molekülen fusioniert sind, die das Auswertungssystem steuern.
Der Ausdruck „Wachstum" auf selektiven Medien „in Abwesenheit von mindestens einem der gegenselektierbaren Marker" bezieht sich auf die Tatsache, dass eine Population an Wirtszellen, die mindestens eines dieser genetischen Elemente enthält, auf diese selektierbaren Medien plaziert wird, aber nur diejenigen Nachkommen der Wirtszellen der Gesamtpopulation in der Lage sind zu wachsen, die die relevanten genetischen Elemente verloren haben. Wenn zum Beispiel ein Hefestamm, der gegenüber dem Arzneimittel Canavanin resistent ist (can^r), und der auch ein Plasmid enthält, das das CAN1-Wildtyp-Gen (Hoffmann, 1985) trägt, auf ein selektives Medium plaziert wird, das Canavanin enthält, sind nur diejenigen Nachkommen des Hefestammes in der Lage zu wachsen, die das das CAN1-Gen tragende Plasmid verloren haben, da dieses Gen den Hefezellen eine Empfindlichkeit gegenüber Canavanin verleiht.
In Bezug auf Schritt (ca) sollte angemerkt werden, dass jedes der mindestens zwei Selektionsmedien mindestens eine gegenselektierbare Verbindung wie z. B. Cycloheximid enthält, wobei die gegenselektierbare Verbindung in den verschiedenen Selektionsmedien unterschiedlich ist; ihnen fehlt typischerweise zusätzlich eine Verbindung, die einen auxotrophen Marker komplementiert, oder sie enthalten ein Antibiotikum. Diese Verbindung oder das Antibiotikum kann für die zahlreichen Selektionsmedien das Gleiche sein. Es wird bevorzugt, dass mindestens Eines unterschiedlich ist.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung stellt ein sehr wirksames Werkzeug zur Selektion gegen falsch-positive Clone bereit, von denen sich herausgestellt hat, dass sie die allgemeine Nützlichkeit des Zwei-Hybrid-Systems drastisch vermindern. Zum Beispiel können durch den Einschluß eines Markers, der auf die Abwesenheit eines genetischen Elements hin gegenselektiert, das ein Mitglied eines Paares der potenziell miteinander wechselwirkenden Partner bestimmt, Clone, die wachsen und daher nur das zweite genetische Element tragen, das den zweiten Partner bestimmt, nun auf die Aktivierung des Auswertungssystems hin untersucht werden. Wenn der Clon, der nur das Fusionsprotein enthält, das durch das zweite genetische Element codiert wird, das Auswertungssystem bei Abwesenheit des anderen genetischen Elements aktiviert, wird er als falsch-positiv klassifiziert. Durch die Gegenselektion auf die Abwesenheit des zweiten genetischen Elements wird die gleiche Untersuchung auf das erste genetische Element angewendet. Somit werden nur diejenigen Clone, die das Auswertungssystem bei Anwesenheit sowohl beider oder aller genetischen Elemente aktivieren, die aber das Auswertungssystem nicht aktivieren, wenn eines der genetischen Elemente verlorengegangen ist, als positive Clone klassifiziert.
Die Vorteile, die mit dem Verfahren der Erfindung verbunden sind, besitzen insbesondere einen signifikanten Einfluß auf die Zahl der Clone, die potenziell miteinander wechselwirkende Partner exprimieren, die bequem untersucht werden können. Zum Beispiel wird sogar die Arbeit im Labormaßstab effektiver, da positive Clone, die miteinander wechselwirkende Partner exprimieren, leicht und eindeutig von falsch-positiven Clonen ohne die Erzeugung von weiteren Stämmen unterschieden werden können. Im Gegensatz dazu müssen, um falsch-positive Clone unter Verwendung des derzeit gebräuchlichen Hefe-Zwei-Hybrid-Systems nachzuweisen, Plasmide, die Fisch-Proteine codieren, gewöhnlich isoliert und wieder neu in Hefezellen transformiert werden, die Plasmide tragen, die nicht verwandte Köder-Proteine codieren. Darüber hinaus schließt die enorme Zahl an falsch-positiven Clonen, die isoliert werden würden, wenn das klassische Zwei-Hybrid-System in großem Maßstab angewendet werden würde, die jedoch durch das Verfahren dieser Erfindung unterschieden werden, nicht mehr länger eine wirksame Analyse von Clonen mit hohem Durchsatz aus. Langfristig wird erwartet, dass das Verfahren der vorliegenden Erfindung besonders für die Analyse einer großen Anzahl ans Hefeclonen, die wechselwirkende Moleküle enthalten, mit hohem Durchsatz vorteilhaft ist, da viele spezifische Wechselwirkungen und die individuellen Mitglieder dieser Wechselwirkungen in einem parallelen und automatisierten Anwendungsansatz identifiziert werden können.
Einige Forscher haben das Problem der Identifizierung von falsch-positiven Clonen bemerkt, wenn sie das Hefe-Zwei-Hybrid-System in der Vergangenheit angewendet haben, Bartel et al. (1996) beschrieben ein Verfahren zum Ausschluß von falsch-positiven Clonen durch wiederholte Plattierung (Replika-Plattierung) von Clonen, die ein Fusionsprotein exprimieren, von SD-Leu- und SD-Trp-Platten auf SD-His-Platten. Clone, die auf den SD-His-Platten Wachstum zeigten, wurden als falsch-positive Clone identifiziert und wurden anschließend für die Wechselwirkungspaarung nicht verwendet. Der Nachteil dieses Verfahrens liegt darin, dass das Verfahren arbeitsintensiv ist, da Hefestämme, die die Fisch-Proteine, die Köder-Proteine und die potenziell miteinander wechselwirkenden Fisch- und Köder-Proteine exprimieren, alle erzeugt und analysiert werden müssen. Die Verwendung des gegenselektierbaren Systems, das in dieser Erfindung beschrieben wird, besitzt den Vorteil, dass nur ein Stamm, der die potenziell miteinander wechselwirkenden Fusionsproteine exprimiert, erzeugt wird und analysiert werden muß.
Um falsch-positive Clone aus 2H-Systemen auszuschließen, wurden auch andere Strategien vorgeschlagen (Vidal et al., 1996a; Nandabalan et al., 1997). Diese Systeme erfordern jedoch alle, dass das Auswertungssystem, das auf die Aktivität hin untersucht wird, mindestens ein Reportergen umfaßt, das nach der Wiederherstellung der DNA-bindenden und transaktivierenden Fusionsproteine transkribiert wird. Tatsächlich wurden, obwohl sie meist beanspruchen, für alle Zellarten anwendbar zu sein, diese Systeme in Richtung der speziellen Eigenschaften des Hefe-Zwei-Hybrid-Systems hin entworfen. Das hierin beschriebene Verfahren der Erfindung ist nicht auf den Ausschluß falsch-positiver Clone beschränkt, die einzelne Fusionsproteine mit DNA-Binde- oder Aktivierungsdomäne exprimieren, die das Reportersystem aktivieren können. Im Gegenteil, es kann dazu verwendet werden, auch falsch-positive Clone in anderen 2H-Systemen als dem Hefe-Zwei-Hybrid-System auszuschließen, was von Vorteil ist, wenn die Wechselwirkungs-Durchmusterungen zum Beispiel in anderen Arten von Wirtszellen durchgeführt werden.
Ein schematische Übersicht einer Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung wird in 6 gezeigt. Zur parallelen Untersuchung eines Netzwerks von Protein-Protein-Wechselwirkungen mit dem Verfahren der Erfindung, wird eine Genbank von Plasmid-Konstrukten bereitgestellt, die Fusionsproteine mit der DNA-Bindedomäne und der Aktivierungsdomäne exprimieren. Diese Genbanken können aus spezifischen DNA-Fragmenten oder einer Vielzahl an unbekannten DNA-Fragmenten bestehen, die in die verbesserten Plasmide mit der Bindedomäne und der Aktivierungsdomäne der Erfindung ligiert wurden, welche unterschiedliche selektierbare und gegenselektierbare Marker enthalten. Beide Genbanken werden durch Transformation oder Wechselwirkungspaarung in Hefezellen kombiniert, und Hefestämme, die potenziell miteinander wechselwirkende Proteine exprimieren, werden auf einem Selektionsmedium ohne Histidin selektiert. Die Selektionsmarker TRP1 und LEU2 erhalten die Plasmide in den Hefestämmen aufrecht, die auf Selektionsmedien wachsen, wohingegen CAN1 und CYH2 die gegenselektierbaren Marker darstellen, die auf den Verlust jedes Plasmids hin selektieren. HIS3 und lacZ stellen Selektionsmarker dar, die in das Hefegenom integriert sind, und die nach der Aktivierung durch miteinander wechselwirkende Fusionsproteine exprimiert werden.
Das Auswertungssystem besteht im vorliegenden Fall sowohl in dem Wachstum auf einem Medium, dem Histidin Fehlt, als auch in der enzymatischen Aktivität der β-Galactosidase, auf welche anschließend durchmustert werden kann. Dies sollte jedoch so verstanden werden, dass das Auswertungssystem auch nur auf einem Marker basieren kann, wie z. B. HIS3. Die Kombination der beiden Bestandteile, die das Auswertungssystem bilden, erlaubt jedoch in vielen Fällen eine schnellere Interpretation der Ergebnisse, insbesondere, wenn einer der Bestandteile nach der Aktivierung eine Farbveränderung bewirkt. Ein Kolonien pickender Roboter wird dazu verwendet, die so entstandenen Hefekolonien in die individuellen Vertiefungen von Mikrotiterplatten mit 384 Vertiefungen zu picken, die Selektionsmedium ohne Histidin enthalten, und die so erhaltenen Platten werden bei 30°C inkubiert, tun das Wachstum der Zellen zu erlauben. Die Wechselwirkungs-Genbank, die in den Mikrotiterplatten enthalten ist, kann gegebenenfalls repliziert (Replika-plattiert) und gelagert werden. Die so erhaltene Wechselwirkungs-Genbank wird untersucht, um positive Clone nachzuweisen, die miteinander wechselwirkende Proteine enthalten, und um sie von falsch-positiven Clonen unter Verwendung des Verfahren der Erfindung zu unterscheiden. Unter Verwendung eines Tüpfel(Spotting)-Roboters werden die Zellen auf Replika-Membranen übertragen, die anschließend auf jedes der selektiven Medien SD-Leu-Trp-His, SD-Leu+CAN und SD-Trp+CHX plaziert werden. Nach der Inkubation auf den selektiven Platten, werden die auf den Membranen gewachsenen Clone einem β-Gal-Testansatz unterzogen, und es wird ein digitales Bild jeder Membran mit einer CCD-Kamera aufgenommen, welches dann im Computer gespeichert wird. Unter Verwendung der digitalen Bildverarbeitung und -analyse können Clone, die miteinander wechselwirkende Fusionsproteine exprimieren, unter Berücksichtigung des Musters der β-Gal-Aktivität der Clone, die auf den verschiedenen Selektionsmedien angezogen wurden, identifiziert werden. Die individuellen Mitglieder, aus den sich die Wechselwirkung zusammensetzt, können dann durch eines oder mehrere Verfahren identifiziert werden, umfassend PCR, Sequenzierung, Hybridisierung, Qligofingerprinting oder Antikärperreaktionen. Ein tatsächliches Experiment, das nach dem in 6 schematisch aufgezeigten Weg durchgeführt wurde, wird in den 5 bis 22 gezeigt.
Die hier und vorstehend näher bestimmten genetischen Elemente können weiterhin und vorteilhaft mit mindestens zwei weiteren Selektionsmarkern ausgestattet sein, die in Bakterien, wie z. B. in E. coli funktionell sind. Solche Selektionsmarker, wie z. B. aphA (Pansegrau et al., 1987) oder bla, erlauben die leichte Trennung dieser genetischen Elemente nach der Retransformation in E. coli-Stämme.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung wird das Paar oder der Komplex miteinander wechselwirkender Moleküle ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus RNA-RNA-, RNA-DNA-, RNA-Protein-, DNA-DNA-, DNA-Protein-Protein-Protein-, Protein-Peptid- oder Peptid-Peptid-Wechselwirkungen.
Demgemäß ist das Verfahren der Erfindung in einem großen Spektrum biologischer Wechselwirkungen anwendbar. Zum Beispiel wird die Erfindung durch die Verwendung synthetischer Peptid-Genbanken (Yang et al., 1995) bei der Identifizierung von Peptid-Protein- oder Peptid-Peptid-Wechselwirkungen nützlich sein.
Zwei Anwendungen von Interesse sind die Anwendung eines Zwei-Hybrid-Systems in großem Maßstab zum Nachweis von Protein-Protein-Wechselwirkungen, die an medizinisch bedeutenden Wegen beteiligt sind, welche als diagnostische oder therapeutische Ziele zur Behandlung von Krankheiten nützlich sein können, sowie ein Drei-Hybrid-System in großem Maßstab, das ein Beispiel für einen Komplex an miteinander wechselwirkenden Molekülen darstellt, und das hierin vorstehend zur Identifizierung von zum Beispiel neuartigen postranskriptionellen Regulatoren und ihrer Bindestellen erwähnt wurde (SenGupta et al., 1996; Putz et al., 1996). In dieser Hinsicht sollte angemerkt werden, dass ein Komplex in Übereinstimmung mit der Erfindung mehr als drei miteinander wechselwirkende Moleküle umfassen kann. Weiterhin kann ein solcher Komplex aus biologisch oder chemisch unterschiedlichen Mitgliedern zusammengesetzt sein. Um zum Beispiel miteinander wechselwirkende RNA-bindende Proteine und RNA-Moleküle zu identifizieren, können ein Plasmid, das ein LexA-HIV-1Rev-Protein exprimiert, ein Plasmid, das eine RNA-Sequenz in Fusion mit dem auf Rev reagierenden Element transkribiert, und ein Plasmid, das ein potenzielles, mit RNA wechselwirkendes Protein, in Fusion mit einer Aktivierungsdomäneexprimiert, in einer Zelle vorliegen. Die Plasmide, die das RNA-Fusionsmolekül codieren, und diejenigen, die das Fusionsprotein mit der Aktivierungsdomäne codieren, müssen gemäß dem Verfahren der Erfindung unterschiedliche selektierbare und gegenselektierbare Marker enthalten. Wenn das RNA-Fusionsmolekül mit den entsprechenden beiden Fusionsproteinen in Wechselwirkung tritt, wird das Auswertungssystem aktiviert. Um zu untersuchen, ob das RNA-Fusionsmolekül oder das Fusionsprotein mit der Aktivierungsdomäne in Wechselwirkung treten, wird das Verfahren der Erfindung dazu verwendet, die Aktivierung des Auswertungssystems in Abwesenheit jedes dieser Fusionsmoleküle untersucht.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den genetischen Elementen um Plasmide, künstliche Chromosomen, Viren oder andere extrachromosomale Elemente.
Obwohl aufgrund der leichten Handhabung bevorzugt wird, Plasmide zu verwenden, die die genetischen Elemente gemäß der Erfindung bestimmen, werden Fachleute in der Lage sein, andere Systeme zu ersinnen, die die genetischen Elemente tragen, welche vorstehend benannt worden sind.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Auswertungssystem um ein nachweisbares Protein. Im Fachgebiet sind eine Reihe von Auswertungssystemen bekannt, und diese können, wenn nötig, so angepasst werden, dass sie bei dem Verfahren der Erfindung nützlich sind.
Am meisten bevorzugt wird, dass das nachweisbare Protein durch die Gene lacZ, beziehungsweise HIS3, URA3, LYS2, sacB oder HPRT codiert wird. Wie im Fachgebiet wohlbekannt ist, kann die Expression des β-Gal-Enzyms in Hefe nach der Inkubation in X-Gal-Lösung zur Bildung einer nachweisbaren blauen Kolonie verwendet werden. Natürlich ist das Verfahren der Erfindung nicht auf die Verwendung nur eines Auswertungssystems beschränkt. Im Gegenteil können, wenn gewünscht, eine Reihe solcher Auswertungssysteme miteinander kombiniert werden. Diese Kombination einer Reihe von Auswertungssystemen ist gemäß der vorliegenden Erfindung ebenfalls in dem Begriff „Auswertungssystem" enthalten. Eine solche Kombination wird ein zusätzliches Sicherheitsmerkmal bei der Identifizierung von Clonen bereitstellen, die miteinander wechselwirkende Partner enthalten.
Obwohl das Zwei-Hybrid-System in Hefe entwickelt wurde, kann das Verfahren der Erfindung in einer Vielzahl von Wirtssystemen durchgeführt werden. Davon werden Hefezellen, Bakterienzellen (Karimova et al., 1998), Säugerzellen (Wu et al., 1996; Rossi et al., 1997, Insektenzellen oder Pflanzenzellen bevorzugt. Bei den Bakterienzellen handelt es sich bevorzugt um E. coli-Zellen. Natürlich können die genetischen Elemente in einem Wirtsorganismus gentechnisch verändert und hergestellt werden und dann z. B. durch die Verwendung von Austausch-Vektoren (shuttle vectors) in einen unterschiedlichen Wirtsorganismus übertragen werden, und dieser kann dann bei dem Verfahren der Erfindung verwendet werden.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfaßt das Verfahren der vorliegenden Erfindung die Transformation oder die Transfektion dieser Wirtszellen mit mindestens einem dieser genetischen Elemente vor Schritt (a).
Obwohl der Fachmann das Identifikationsverfahren der Erfindung mit vollständig transformierten oder transfizierten Wirtszellen beginnen kann, kann er wünschen, zuerst solche Wirtszellen zu erzeugen, die in Einklang mit dem Ziel seiner Forschung oder seinen kommerziellen Interessen stehen. Zum Beispiel kann er wünschen, zuerst eine bestimmte Art einer Genbank zu erzeugen, bevor er beabsichtigt, diese mit einer zweiten Genbank zu durchmustern, die bereits in den Wirtszellen vorliegt. Alternativ kann er beabsichtigen, zwei oder mehrere unterschiedliche Genbanken zu erzeugen, die er gegeneinander zu durchmustern wünscht. In diesem Fall müßte er zuerst die Wirtszellen mit beiden oder allen Arten der genetischen Elemente gleichzeitig oder nacheinander transformieren.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform werden die Wirtszellen mit den genetischen Elementen durch Zellfusion, Konjugation oder Wechselwirkungspaarung erzeugt.
Das biologische Prinzip der Gegenselektion, auf das sich vorstehend bezogen wurde, ist im Fachgebiet wohlbekannt. Demgemäß können die Fachleute aus einer Vielzahl an solchen gegenselektierbaren Markern auswählen. Bevorzugt werden die Marker CAN1, CYH2, LYS2, URA3, HRPT oder sacB.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird weiterhin bevorzugt, dass es sich bei den selektierbaren Markern um auxotrophe oder antibiotische Marker handelt.
Es ist wichtig anzumerken, dass einige der Marker, die als Auswertungssystem verwendet werden, auch als selektierbare Marker verwendet werden können. Es ist weiterhin wichtig anzumerken, dass einer oder der gleiche Marker nicht gleichzeitig als selektierbarer Marker und als Teil des Auswertungssystems verwendet werden kann.
Am meisten bevorzugt wird, dass die auxotrophen oder die Antibiotika-Marker ausgewählt werden unter LEU2, TRP1, URA3, HIS3, ADE2, LYS2 und Zeocin.
Die Planung der Experimente kann erfordern, dass der Test auf die Wechselwirkung nicht unmittelbar nach der Bereitstellung der Wirtszellen und, möglicherweise, dem Auftreten der Wechselwirkungen durchgeführt werden kann. In solchen Fällen, kann der Forscher wünschen, die transformierten Wirtszellen bis zur weiteren Verwendung zu lagern. Demgemäß betrifft eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ein Verfahren, in dem die Nachkommenschaft der Wirtszellen, die in Schritt (b) erhalten wurden, in ein Speicherkompartiment übertragen wird.
Besonders in Fällen, bei denen ein große Zahl an Clonen analysiert werden soll, wird diese Übertragung vorteilhaft durch Automatisierung oder einen Pickroboter bewirkt oder unterstützt. Natürlich können auch andere Automatisierungs- oder Robotersysteme verwendet werden, die die Nachkommenschaft der Wirtszellen verläßlich in vorbestimmte Anordnungen in den Speicherkompartimenten picken.
Die Wirtszellen werden bei dieser Ausführungsform in diesen Speicherkompartimenten vermehrt und liefern weitere Nachkommen für die weiteren Untersuchungen. Es werden bevorzugt Replika-Plattierungen dieser Speicherkompartimente angelegt, in denen die Anordnung der Clone beibehalten wird. Diese Speicherkompartimente, welche die transformierten Wirtszellen und die geeigneten Medien umfassen, können gemäß den herkömmlichen Anzuchtprotokollen weiter aufrecht erhalten werden. Alternativ können diese Speicherkompartimente ein Gefrierschutzmittel enthalten und daher zur Aufbewahrung in einer Gefriertruhe geeignet sein. Diese Ausführungsform ist besonders nützlich, wenn die Bewertung der potentiell miteinander wechselwirkenden Partner aufgeschoben werden muß. Wie im Fachgebiet wohlbekannt ist, können eingefrorene Wirtszellen nach dem Auftauen leicht wiedergewonnen werden und gemäß der Erfindung weiter untersucht werden. Am meisten bevorzugt handelt es sich bei dem Gefrierschutzmittel um Glycerin, das in dem Medium bevorzugt in einer Konzentration von 3–25% (Vol./Vol.) vorliegt.
In einer weiteren, besonders bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung ist das Speicherkompartiment eine Mikrotiterplatte. Am meisten wird bevorzugt, dass diese Mikrotiterplatte 384 Vertiefungen enthält. Mikrotiterplatten haben den besonderen Vorteil, dass sie eine vorgefertigte Anordnung bereitstellen, die eine leichte Replikation/Vermehrung von Clonen erlaubt, und darüber hinaus eine eindeutige Identifizierung und Zuordnung von Clonen während der verschiedenen Schritte des Experiments. Die Mikrotiterplatte mit 384 Vertiefungen ist aufgrund ihrer vergleichsweise geringen Größe und der großen Zahl an Kompartimenten besonders für Experimente geeignet, bei denen eine große Zahl von Clonen durchmustert werden muß.
In Abhängigkeit von der Planung des Experiments können die Wirtszellen in dem Speicherkompartiment, wie z. B. der vorstehend erwähnten Mikrotiterplatte, bis zur logarithmischen oder bis zur stationären Phase angezogen werden. Die Anzuchtbedingungen können durch Fachleute gemäß herkömmlichen Verfahren eingerichtet werden. Das Zellwachstum wird gewöhnlich zwischen 15 und 45 Grad Celsius durchgeführt.
Die Übertragung der Wirtszellen in Schritt (c) wird durch Automatisierung unter Verwendung eines Tüpfelroboters oder durch die Verwendung eines Pipettier- oder eines Mikropipettiergeräts durchgeführt oder unterstützt. Wie ein solcher Tüpfelroboter konstruiert und ausgestattet ist, wird zum Beispiel in Lehrach et al. (1997) beschrieben. Natürlich können auch andere Automatisierungs- oder Robotersysteme verwendet werden, die verläßlich regelmäßige Anordnungen von Clonen erzeugen.
Am meisten bevorzugt wird diese Übertragung auf einen ebenen Träger durchgeführt, der anschließend auf die mindestens drei selektiven Medien plaziert wird, die in den Schritten (ca) und (cb) näher bestimmt wurden. Alternativ kann diese Übertragung der Wirtszellen auf einen ebenen Träger durchgeführt werden, der bereits auf dem Selektionsmedium plaziert ist, oder der Transfer kann direkt auf das Selektionsmedium erfolgen.
Am vorteilhaftesten erfolgt die Übertragung in einem regelmäßigen Gittermuster in einer Dichte von 1 bis 1000 Clonen pro Quadratzentimeter. Die Nachkommenschaft der Wirtszellen kann auf eine Vielzahl an ebenen Trägern übertragen werden. Am meisten wird eine Membran bevorzugt, die z. B. aus Nylon, Nitrocellulose oder PVDF hergestellt wurde.
Die Selektionsmedien, die zur Anzucht der geeigneten Clone verwendet werden, können in flüssiger oder in fester Form vorliegen. Die Selektionsmedien werden, wenn sie in Verbindung mit einem Tüpfelroboter und mit Membranen als ebenen Trägern verwendet werden, mit Agar verfestigt, auf den anschließend die betüpfelten Membran plaziert werden. Alternativ und ebenfalls bevorzugt werden die Selektionsmedien, wenn sie in flüssiger Form vorliegen, in Mikrotiterplatten angelegt und die Übertragung erfolgt durch Replika-Plattierung.
Unter Bezugnahme auf Schritt (d) des Verfahrens der Erfindung kann das Auswertungssystem auf mehreren Wegen analysiert werden. Zum Beispiel kann es durch Beobachtung (visuelle Beobachtung), radioaktive, chemilumineszente, fluoreszente, photometrische, spektrometrische, Infrarot-, kolorimetrische oder Resonanz-Nachweisverfahren analysiert werden.
Die Identifizierung der Wirtszellen, die miteinander wechselwirkende Fusionsproteine exprimieren, wird unter Berücksichtigung des Aktivierungszustandes des Auswertungssystems der Clone, die auf den mindestens drei Selektionsmedien angezogen wurden, die in den Schritten (ca) und (cb) näher bestimmt wurden, bevorzugt durch visuelle Mittel bewirkt.
Ebenfalls bevorzugt wird die Identifizierung von Wirtszellen, die miteinander wechselwirkende Fusionsproteine exprimieren, in Schritt (d) durch digitale Bildspeicherung, -analyse oder -verarbeitung bewirkt oder unterstützt. Bei dieser Ausführungsform werden die positiven Clone, die bevorzugt auf einem ebenen Träger angeordnet sind, wie z. B. einer Membran, durch den Vergleich der digitalen Bilder identifiziert, die von der Membran nach der Aktivierung des Auswertungssystems auf den Selektionsmedien erhalten wurden, die in den Schritten (ca) und (cb) näher bestimmt wurden.
Am meisten bevorzugt wird die Identität der positiven Wirtszellen und der falsch-positiven Wirtszellen in einem Computer gespeichert, zum Beispiel innerhalb einer relationalen Datenbank.
Die Identifizierung mindestens eines Mitglieds des Paars oder des Komplexes der miteinander wechselwirkenden Moleküle kann durch eine Vielzahl an Mitteln bewirkt werden. Zum Beispiel können die Moleküle durch Nucleinsäure-Hybridisierung, Oligonucleotid-Hybridisierung, Nucleinsäure- oder Protein-Sequenzierung, Restriktionsverdau, Spektrometrie oder Antikörperreaktionen charakterisiert werden. Nachdem das erste Mitglied einer Wechselwirkung identifiziert wurde, können das zweite Mitglied oder weitere Mitglieder ebenfalls durch die vorstehend erwähnten Verfahren identifiziert werden. Die Identifizierung mindestens eines Mitglieds einer Wechselwirkung wird durch Nucleinsäure-Hybridisierung, Antikörper-Bindung oder Nucleinsäure-Sequenzierung vorgenommen.
Wenn eine Nucleinsäure-Hybridisierung durchgeführt werden soll, werden die Nucleinsäuremoleküle, die in der Wirtszelle enthalten sind und mindestens eines der miteinander wechselwirkenden Moleküle codieren, bevorzugt auf einem ebenen Träger fixiert. Wie im Fachgebiet wahlbekannt ist, kann es sich bei diesem ebenen Träger, an den die Nucleinsäure befestigt werden kann, zum Beispiel um eine Nylon-, eine Nitrocellulose- oder eine PVDF-Membran sowie um ein Glas- oder ein Kieselgel-Substrat handeln (DeRisi et al., 1996; Lockhart et. al., 1996). Die Wirtszellen, die diese Nucleinsäure enthalten, können auf den ebenen Träger übertragen werden und anschließend auf dem Träger lysiert werden, und die Nucleinsäure, die durch diese Lyse freigesetzt wird, wird an der gleichen Stelle durch eine geeignete Behandlung fixiert. Alternativ kann die Nachkommenschaft der Wirtszellen in einem Speicherkompartiment lysiert werden, und die so erhaltene rohe oder gereinigte Nucleinsäure wird dann auf den ebenen Träger übertragen und anschließend daran fixiert. Die Nucleinsäuren werden vorteilhaft vor dem Transfer auf den ebenen Träger über PCR amplifiziert. Am meisten bevorzugt wird, dass die Nucleinsäure in einem regelmäßigen Gittermuster parallel mit weiteren Nucleinsäuren fixiert wird, welche unterschiedliche genetische Elemente darstellen, die miteinander wechselwirkende Moleküle codieren. Wie im Fachgebiet wohlbekannt ist, können solche regelmäßigen Gittermuster in Dichten zwischen 1 und 50.000 Elementen pro Quadratzentimeter vorliegen und über eine Vielzahl an Verfahren hergestellt werden. Solche regelmäßigen Gittermuster werden bevorzugt unter Verwendung der Automation oder eines Tüpfelroboters hergestellt, wie in Lehrach et al. (1997) und Maier et al. (1997) beschrieben, und mit definierten Tüpfelmustern, einem Strichcode und Möglichkeiten zur Datenaufzeichnung ausgestattet. Damit ist es möglich, korrekt und eindeutig zu einer aufbewahrten Wirtszelle zurückzufinden, die die Nucleinsäure aus einer bestimmten aufgetüpfelten Position auf dem ebenen Träger enthält. Es wird ebenfalls bevorzugt, dass die regelmäßigen Gittermuster durch Pipettiersysteme hergestellt werden, oder über Technologien zur Mikroanordnung, wie sie z. B. durch Shalon et al. (1996), Schober et al. (1993) oder Lockart et al. (1996) beschrieben wurden. Die Identifizierung wird am Günstigsten erneut durch Nucleinsäure-Hybridisierung vorgenommen.
Unter Verwendung einer Nucleinsäure-Sonde von Interesse, können homologe Nucleinsäuren, die auf dem ebenen Träger fixiert sind, durch Hybridisierung identifiziert werden. Aus der aufgetüpfelten Position dieser identifizierten, homologen Nucleinsäure auf dem ebenen Träger, kann die entsprechende Wirtszelle, die beide oder alle Mitglieder der Wechselwirkung enthält, in dem Speicherkompartiment identifiziert werden. Das, zum Beispiel, zweite Mitglied der Wechselwirkung, kann nun durch irgendeines der vorstehend beschriebenen Verfahren identifiziert werden. Zum Beispiel können durch die Verwendung einer radioaktiv markierten Ras-Sonde, homologe Nucleinsäuren auf dem ebenen Träger durch Hybridisierung identifiziert werden. Die mit Ras wechselwirkenden Proteine können nun aus der entsprechenden Wirtszelle identifiziert werden, die sowohl das erste genetische Element, das zu der Ras-Sonde homolog ist, als auch das zweite genetische Element enthält, das diese, mit Ras wechselwirkenden Proteine codiert.
Wenn mehrfache Oligonucleotid-Hybridisierungen mit den Nucleinsäuren, die an den ebenen Träger fixiert wurden, durchgeführt werden, können Oligo-Fingerprints aller genetischen Elemente erhalten werden, die die miteinander wechselwirkenden Proteine codieren. Diese Oligo-Fingerprints können dazu verwendet werden, alle Mitglieder der Wechselwirkung zu identifizieren, oder diejenigen Mitglieder, die zu spezifischen Genfamilien gehören, wie in Maier et al. (1997) beschrieben.
Die Nucleinsäuremoleküle, die die miteinander wechselwirkenden Proteine codieren, werden günstigerweise vor der Identifizierung, wie z. B. über DNA-Sequenzierung, durch PCR oder in den genetischen Elementen in den Wirtszellen und bevorzugt in E. coli amplifiziert. Die Amplifikation der genetischen Elemente wird durch die Vermehrung der E. coli-Zellen und die Isolierung der genetischen Elemente durchgeführt. Verfahren zur Identifizierung der Nucleinsäuren, die miteinander wechselwirkende Proteine codieren, durch DNA-Sequenzierung, und die Analyse, sind im Fachgebiet wohlbekannt. Durch die Amplifikation und die Sequenzierung der Nucleinsäuren, die beide oder alle Mitglieder einer Wechselwirkung codieren, aus dem gleichen Clon, kann die Identität beider oder aller Mitglieder der Wechselwirkung bestimmt werden.
Wenn ein spezifischer Antikörper verwendet werden soll, um zu bestimmen, ob ein Protein von Interesse als Fusionsprotein in einer Wechselwirkungs-Genbank exprimiert wird, ist es vorteilhaft, alle Fusionsproteine, die in der Wechselwirkungs-Genbank exprimiert werden, auf einem ebenen Träger zu fixieren. Zum Beispiel können Clone der Wechselwirkungs-Genbank, die Fusionsproteine exprimieren, auf einen ebenen Träger unter Verwendung eines Tüpfelroboters übertragen werden, wie in Lehrach et al. (1997) beschrieben. Die Clone werden anschließend auf dem Träger lysiert, und die freigesetzten Proteine werden an der gleichen Stelle fixiert. Zum Beispiel können unter Verwendung eines Anti-HIP1-Antikörpers (Wanker et al., 1997) Clone aus der Wechselwirkungs-Genbank identifiziert werden, die HIP1-Fusionsproteine und ein unbekanntes mit ihnen wechselwirkendes Fusionsprotein enthalten. Das unbekannte Mitglied des miteinander wechselwirkenden Molekülpaars kann nun aus der entsprechenden Wirtszelle durch irgendeines der vorstehend erwähnten Verfahren identifiziert werden. Die Antikörper, die als Sonden verwendet werden, können mit einer direkt nachweisbaren Markierung versehen sein, Alternativ können diese Antikörper über eine zweite Sonde nachgewiesen werden oder über einen Antikörper, der für den Erstantikörper spezifisch ist. Es können zahlreiche alternative Ausführungsformen, die zum Beispiel Drittantikörper verwenden, durch die Fachleute je nach Kenntnis ersonnen werden.
Am günstigsten ist, wenn die Identifizierung von Mitgliedern, die an einer Wechselwirkung beteiligt sind, unter der Verwendung der regelmäßigen Gitter vorgenommen wird, dann ein digitales Bild des ebenen Trägers nach der Hybridisierung oder der Antikörperreaktion aufgenommen wird, und die Analyse durch die digitale Bildspeicherung-, verarbeitung, oder -analyse unter Verwendung eines automatisierten oder halbautomatisierten Bildanalysesystems erfolgt, wie in Lehrach et al. (1997) beschrieben.
Am meisten bevorzugt wird, dass die Information, die die Identität der Wirtszelle und die Identität der miteinander wechselwirkenden Moleküle enthält, die durch die genetischen Elemente exprimiert werden, welche in der Wirtszelle enthalten sind, in einem Computer aufbewahrt wird, zum Beispiel innerhalb einer relationalen Datenbank.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird weiterhin vor Schritt (a) bevorzugt, dass eine Vorselektion gegen Clone, die ein einzelnes Molekül exprimieren, das in der Lage ist, das Auswertungssystem zu aktivieren, auf einem Anzuchtmedium durchgeführt wird, das eine gegenselektierbare Verbindung enthält, wie zum Beispiel 5-Fluor-Orotsäure, Canavanin, Cycloheximid oder α-Aminoadipat.
Bei dieser Ausführungsform wird zum Beispiel das URA3-Gen als Bestandteil des Auswertungssystems mit eingebaut. Clone, die nur eines der genetischen Elemente enthalten, werden auf ein selektives Medium plaziert, das 5-Fluor-Orotsäure (5-FOA) enthält. In dem Fall, in dem Clone, die ein einzelnes Molekül exprimieren, das in der Lage ist, das Auswertungssystem zu aktivieren, wird 5-FOA in das toxische 5-Fluor-Uracil umgewandelt. Demgemäß werden Wirtszellen, die autoaktivierende Moleküle enthalten, auf dem selektiven Medium mit 5-FOA sterben.
Es ist weiterhin wichtig anzumerken, dass der für diese Vorselektion verwendete Marker nicht gleichzeitig als selektierbarer oder gegenselektierbarer Marker verwendet werden kann.
Ein Inhibitor der Wechselwirkung der miteinander wechselwirkenden Moleküle, die durch das Verfahren der Erfindung identifiziert wurden, kann gemäß herkömmlichen Vorschriften identifiziert werden. Des weiteren können Moleküle, die bestehende Protein-Protein-Wechselwirkungen hemmen, mit dem Hefe-Zwei-Hybrid-System unter Verwendung des URA3-Auswertungssystems isoliert werden. Hefezellen, die miteinander wechselwirkende GAL4ad- und LexA-Fusionsproteine exprimieren, die das URA3-Auswertungssystem aktivieren, sind nicht in der Lage, auf einem Selektionsmedium zu wachsen, das 5-FOA enthält. Wenn jedoch ein weiteres Molekül in diesen Zellen vorhanden ist, das die Wechselwirkung der Fusionsproteine unterbricht, wird das URA3-Auswertungssystem nicht aktiviert, und die Hefezellen können auf einem Selektionsmedium wachsen, das 5-FOA enthält. Unter Verwendung dieses Verfahrens, können potenzielle Inhibitoren einer Protein-Protein-Wechselwirkung aus einer Genbank isoliert werden, die diese Inhibitoren enthält. Es können dem URA3-System entsprechende Systeme durch Fachleute auf der Grundlage der Lehren der vorliegenden Erfindung ersonnen werden, und diese sind dadurch ebenfalls in die Erfindung mit eingeschlossen.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Kit, das mindestens einen der folgenden Bestandteile umfaßt:

(f) Wirtszellen, wie in einem der Schritte (a)–(e) identifiziert, und mindestens ein genetisches Element, das die genetische Information umfaßt, die mindestens eines der potenziell miteinander wechselwirkenden Moleküle näher bestimmt, das einen gegenselektierbaren Marker enthält und hierin vorstehend näher beschrieben wurde;
(g) Wirtszellen, wie in einem der Schritte (a)–(e) identifiziert, und mindestens ein genetisches Element, das die genetische Information nicht umfaßt, die mindestens eines der potenziell miteinander wechselwirkenden Moleküle näher bestimmt, das einen gegenselektierbaren Marker enthält und hierin vorstehend näher beschrieben wurde;
(h) mindestens ein genetisches Element, das die genetische Information umfaßt, die mindestens eines der potenziell miteinander wechselwirkenden Moleküle näher bestimmt, das einen gegenselektierbaren Marker enthält und hierin vorstehend näher bestimmt wurde;
(i) mindestens ein genetisches Element, das die genetische Information nicht umfaßt, die mindestens eines der potenziell miteinander wechselwirkenden Moleküle näher bestimmt, das einen gegenselektierbaren Marker enthält und hierin vorstehend näher bestimmt wurde;
(j) Wirtszellen, die mindestens einen und bevorzugt mindestens zwei der genetischen Elemente umfassen, die in (h) oder (i) näher bestimmt wurden;
(k) mindestens einen ebenen Träger, der Nucleinsäure oder Protein aus den Wirtszellen trägt, die mindestens ein Mitglied der genetischen Elemente umfassen, die hierin vorstehend näher bestimmt wurden, wobei die Nucleinsäure oder das Protein an den Träger in einem Gitterraster fixiert ist, und gegebenenfalls Lösungen, um die Hybridisierung oder die Bindung von Nucleinsäuresonden oder von Proteinen an die Moleküle zu bewirken, die an das Gitterraster fixiert sind;
(l) mindestens ein Speicherkompartiment, einen ebenen Träger oder eine Computerdiskette, die die genetischen Elemente, Wirtszellen, Speicherkompartimente oder Träger, die in (f) bis (k) näher bestimmt wurden, umfaßt und/oder charakterisiert; und/oder
(m) mindestens einen Hefestamm, der eine can1- und eine cyh2-Mutation trägt.

Der Kit umfaßt oder umfaßt gegebenenfalls bevorzugt mindestens ein Speicherkompartiment, das die Wirtszellen aus (f), (g) oder (j) enthalt, und/oder umfaßt oder umfaßt gegebenenfalls mindestens ein Speicherkompartiment, das die genetische Information enthält oder die potenziell miteinander wechselwirkenden Moleküle, die durch die genetische Information codiert werden, wie in (f) oder (h) näher bestimmt wurde.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung eines beliebigen der Hefestämme, die hierin vorstehend und in den angehängten Beispielen beschrieben wurden, zur Identifizierung mindestens eines Mitglieds eines Paares potenziell miteinander wechselwirkender Moleküle.
Die Moleküle, die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung als mit vielen unterschiedlichen Molekülen in Wechselwirkung tretend identifiziert wurden, werden günstigerweise registriert. Diese Information kann die Arbeit vermindern, die benötigt wird, bestimmte Wechselwirkungen näher zu charakterisieren, da diese Wechselwirkungen, die aus einem Molekül bestehen, das mit vielen anderen Molekülen im 2H-System in Wechselwirkung tritt, im Verdacht stehen, künstlich (unspezifisch) zu sein (Bartel et al., 1993).
Auf die Daten, die durch die Verwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung erhalten werden, kann bevorzugt durch die Verwendung von Software-Hilfsprogrammen oder graphischen Benutzer-Oberflächen zugegriffen werden, die es erlauben, das errichtete Netzwerk aus Wechselwirkungen mit einer biologischen Fragestellung zu abzufragen oder das errichtete Netzwerk durch die Zufügung weiterer Daten zu entwickeln.
Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung weiterhin ein in einem Computer eingerichtetes Verfahren zur Aufbewahrung und Analyse von Daten, das sich auf potenzielle Mitglieder mindestens eines Paares oder eines Komplexes miteinander wechselwirkender Moleküle bezieht, welche durch Nucleinsäuren codiert werden, die aus biologischen Proben stammen, wobei das Verfahren umfaßt:

(n) Erhalten der Information über eine erste Nucleinsäure aus einer ersten Datentabelle, wobei die Information umfaßt;
(oa) eine erste Kombination aus Buchstaben und/oder Zahlen, die eindeutig die Nucleinsäure identifizieren, und
(ob) die Art des genetischen Elements identifizieren, das diese Nucleinsäure enthält, und
(oc) eine zweite Kombination aus Buchstaben und/oder Zahlen, die eindeutig einen Clon identifizieren, in dem ein potenzielles Mitglied, das durch diese Nucleinsäure codiert wird, auf die Wechselwirkung mit mindestens einem anderen potenziellen Mitglied eines Paares oder eines Komplexes miteinander wechselwirkender Moleküle untersucht worden ist;
(p) der Verwendung der zweiten Kombination aus Buchstaben und/oder Zahlen, um aus der ersten Datentabelle oder gegebenenfalls aus weiteren Datentabellen die Information zu ziehen, die weitere Nucleinsäuren identifiziert, die dieses mindestens eine andere potenzielle Mitglied aus Schritt (oc) codiert.

Eine bevorzugte Ausführungsform dieses Verfahrens umfaßt weiterhin die Verwendung der zweiten Kombination aus Buchstaben und/oder Zahlen aus Schritt (oc), um aus einer zweiten Datentabelle weitere Information zu ziehen, wobei diese weitere Information mindestens die Wechselwirkungsklasse des Clons umfaßt, und gegebenenfalls zusätzliche Informationen, umfassend:

(q) den physikalischen Lagerort des Clons; und
(r) vorbestimmte experimentelle Einzelheiten, die zur Erzeugung des Clons gehören, umfassend mindestens eines der Folgenden:
(ra) Gewebe, Krankheitszustand oder zelluläre Herkunft der Nucleinsäure;
(rb) Einzelheiten zur Clonierung; und
(rc) Mitgliedschaft zu einer Genbank mit anderen Clonen.

Es wird zusätzlich bevorzugt, dass das Verfahren die Verwendung der Information aus Schritt (o) mit der ersten Information und/oder der Information aus Schritt (p) über weitere Nucleinsäuren umfaßt, um sie mit einer dritten Datentabelle in Beziehung zu setzen, die die erste und/oder weitere Nucleinsäuren näher charakterisiert, wobei die weitere Charakterisierung mindestens eines der Folgenden umfaßt:

(s) Daten zur Hybridisierung,
(t) Daten über Oligonucleotid-Fingerprints,
(u) die Nucleotidsequenz,
(v) die Translation der Nucleinsäuren im Leseraster, und
(w) das Gewebe, den Krankheitszustand oder Daten über die Genexpression in der Zelle, aus der die Nucleinsäure stammt; und

Das Verfahren umfaßt bevorzugt auch die Feststellung, ob diese potenziellen Mitglieder, die durch die Nucleinsäuren codiert werden, miteinander in Wechselwirkung treten, dies erfolgt unter Berücksichtigung der Wechselwirkungsklasse des Clons, in dem die Nucleinsäuren auf die Wechselwirkung in Schritt (oc) hin untersucht wurden.
Noch stärker bevorzugt beziehen sich diese Daten auf einen oder mehrere von 10 bis 100 potenziellen Mitgliedern, aber noch stärker bevorzugt auf 100 bis 1000 potenzielle Mitglieder, und noch stärker bevorzugt auf 1000 bis 10.000 potenzielle Mitglieder, und am stärksten bevorzugt auf mehr als 10.000 potenzielle Mitglieder.
In einer bevorzugten Ausführungsform wurden die Daten durch das vorstehend erwähnte Verfahren zur Identifizierung von Mitgliedern eines Paares oder eines Komplexes miteinander wechselwirkender Moleküle erzeugt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfaßt die Wechselwirkungsklasse eines der Folgenden: positive oder negative oder falsch-positive Clone.
Es wird weiterhin bevorzugt, dass klebrige Proteine unter Berücksichtigung der Anzahl des Erscheinens eines bestimmten Mitgliedes identifiziert werden, das als mit vielen unterschiedlichen Mitgliedern in unterschiedlichen Clonen der positiven Wechselwirkungsklasse in Wechselwirkung tretend identifiziert wurde.
Noch bevorzugter bildet die erste Datentabelle einen Teil einer ersten Datenbank und die zweite und die dritte Datentabelle bilden einen Teil mindestens einer zweiten Datenbank.
Aber noch mehr bevorzugt, wird die zweite Datenbank in einem computerlesbaren Speicher aufbewahrt, der von dem computerlesbaren Speicher getrennt ist, der die erste Datenbank enthält, und auf diese Datenbank wird über ein Datenaustausch-Netzwerk zugegriffen.
Es wird weiterhin bevorzugt, dass die zweite Datenbank Nucleinsäure- oder Proteinsequenzen, Sekundär- oder Tertiärstrukturen, biochemische und bibliographische Daten oder Informationen zur Genexpression umfaßt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die Dateneingabe in die erste, zweite oder weitere Datentabellen automatisch von der ersten Datenbank aus kontrolliert, dies erfolgt durch Zugriff auf weitere Computerdaten, Programme oder durch Computergesteuerte Roboter.
Es wird noch stärker bevorzugt, dass mindestens ein Arbeitsablauf-Organisations-System (Workflow-Management-System) um bestimmte Datensammlungen herum eingerichtet wird, um das Fortschreiten des vorstehend beschriebenen Verfahrens zur Identifizierung von Mitgliedern eines Paares oder eines Komplexes miteinander wechselwirkender Moleküle zu unterstützen.
Am stärksten bevorzugt handelt es sich bei dem Arbeitsablauf-Organisations-System um eine Software, die die weitere Identifizierung von Mitgliedern eines Paares oder eines Komplexes miteinander wechselwirkender Moleküle unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Verfahrens der Hybridisierung von Nucleinsäuren unterstützt.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform werden die Daten durch bestimmte Abfragefenster (Queries) untersucht, die für einen Forscher von Interesse sind.
Noch bevorzugter umfassen die Abfragefenster mindestes eines der Folgenden:

(aa) die Identifizierung der Wechselwirkung oder des Wechselwirkungsweges zwischen einem ersten und einem zweiten Mitglied eines Wechselwirkungsnetzwerks,
(ab) die Identifizierung des Wechselwirkungsweges zwischen einem ersten und einem zweiten Mitglied eines Wechselwirkungsnetzwerks, und durch mindestens ein weiteres Mitglied,
(ac) die Identifizierung der Wechselwirkung oder des Wechselwirkungsweges zwischen mindestens zwei Mitgliedern, die durch Nucieinsäure- oder Proteinsequenzen, Sekundär- oder Tertiärstrukturen charakterisiert sind, und
(ad) die Identifizierung der Wechselwirkungen oder der Wechselwirkungswege, die für das unterschiedliche Gewebe, den Krankheitszustand oder die zelluläre Herkunft unterschiedlich sind.

Noch mehr bevorzugt werden die Teile der Information in einem kontrollierten Format aufbewahrt, um die Verfahren zur Datenabfrage zu unterstützen.
Sogar noch stärker bevorzugt wird ein Verfahren, bei dem die Ergebnisse der Datenabfrage dem Forscher auf graphische Weise dargestellt werden.
Noch vorteilhafter ist ein Verfahren, bei dem eine Untergruppe an Daten, die Daten umfaßt, welche die Nucleinsäuren charakterisieren, die als codierende Mitglieder eines Paares oder eines Komplexes miteinander wechselwirkender Moleküle identifiziert wurden, in einer weiteren Datentabelle oder Datenbank gelagert wird.
Doch nach stärker bevorzugt wird ein Verfahren, bei dem die Berücksichtigung der Anzahl des Auftretens eines bestimmten Mitglieds, das als mit einem zweiten oder weiteren Mitgliedern in Wechselwirkung tretend identifiziert wurde, dazu verwendet wird, um zu entscheiden, ob die Daten, die die Nucleinsäuren charakterisieren, einen Teil der Untergruppe der Daten bilden.
Sogar noch stärker bevorzugt wird das Verfahren, bei dem zusätzliche Informationen oder experimentelle Daten dazu verwendet werden, die Daten auszuwählen, um den Teil der Untergruppe zu bilden.
Um bestimmte Datenabfrage-Verfahren zu beschleunigen, wird am stärksten bevorzugt, die Struktur zu modifizieren, in der die Daten im computerlesbaren Speicher gelagert werden.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform werden die Daten in relationalen oder in objektorientierten Datenbanken aufbewahrt.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Schema zu Datenaufbewahrung, umfassend eine Datentabelle, die die Information über jedes Mitglied einer Wechselwirkung enthält, wobei eine Aufzeichnung in dieser Datentabelle jedes Mitglied einer Wechselwirkung darstellt, und in der die Mitglieder, die eine Wechselwirkung bilden, durch einen gemeinsamen Namen gekennzeichnet werden.
In diesem Schema zur Datenaufbewahrung ist dieser gemeinsame Name bevorzugt der Name eines Clons, oder eine eindeutige Kombination aus Buchstaben und/oder Zahlen, aus denen sich der Name des Clons zusammensetzt.
Ein in den Computer eingebautes Verfahren zur Handhabung von gesammelten Daten stellt eine stabile und wirkungsvolle Lösung zur Handhabung der großen Menge an Protein-Protein-Wechselwirkungen bereit, die durch das Verfahren der Erfindung hergestellt werden. Es liefert die Möglichkeit, mit anderen Datenbanken zu kommunizieren und verschiedene Datenbanken und/oder andere Systeme zur Datenaufbewahrung über ein Intranet, das Internet oder Schnittstellen zu nutzen, um Abfragen der Datenbank durch einen Forscher zu ermöglichen und die Ergebnisse der Abfrage visuell darzustellen. Relationale oder objektorientierte Datenbanken mit Programmen, die die Datenbank unterstützen und welche die Daten untergliedern und darstellen, sichern eine leichte Handhabung. Zum Beispiel stellt 2 ein Schema und die Eigenschaften einer Gruppe an Datentabellen dar, das/die zur Handhabung solcher Wechselwirkungsdaten geeignet ist/sind. Die primären Verbindungen zwischen den Tabellen-Schlüsseln werden angezeigt, sowie die Eingabefelder oder die Elemente, die in jeder Tabelle enthalten sein sollten. Wenn gewünscht, können die Elemente einer Tabelle zu einer weiteren Tabelle erweitert werden, die zusätzliche baten enthält. Auf ähnliche Weise können bestimmte Tabellen zur einer weiteren Datenbank erweitert werden, um weitere Daten aufzubewahren oder handzuhaben. Diese zusätzliche Datenbank kann in dem gleichen oder in weiter entfernten Computern gelagert werden. Die Elemente der Tabelle können in einem numerischen, einem beschreibenden oder in einem vorgegebenen Format aufgezeichnet werden, je nach dem, was zur Aufzeichnung der entsprechenden Daten am besten geeignet ist. Um effiziente Abfragen zu ermöglichen, werden, wenn geeignet, die Elemente in einem kontrollierten Wörterbuch aufgezeichnet. 3 zeigt bei welchem Teil des Arbeitsablaufs während eines Wechselwirkungsexperiments jede Tabelle am Wichtigsten ist und wo sie die grundlegende Datensammlung bildet, auf dem die Arbeitsablauf-Organisations-Software für diesen Teil des Vorgang basiert.
Es können andere, auf Computern basierende, Verfahren zur Erzeugung visueller Darstellungen spezifischer Wechselwirkungen, teilweiser oder vollständiger Protein-Protein-Wechselwirkungs-Netzwerke angewendet werden, um automatisch die gewünschten Wechselwirkungen am wirkungsvollsten zu berechnen und darzustellen. Wie im Fachgebiet wohlbekannt ist, sind Computerdatenbanken eine wertvolle Quelle für die biologische und die molekularbiologische Forschung im Großmaßstab.
Zusammenfassend besteht ein signifikanter Vorteil des Verfahrens der Erfindung über bereits bestehende Hefe-2H-Systems in der Größenordnung, mit der eine solche Identifizierung von Wechselwirkungen und Mitgliedern der Wechselwirkung vorgenommen werden kann. Bei dem Verfahren der Erfindung werden bevorzugt die Wechselwirkungen einer Genbank mit einer Genbank unter Verwendung von angeordneten Wechselwirkungs-Genbanken durchmustert. Daher erlaubt das Verfahren der Erfindung in wirkungsvoller Weise eine vollständigere und umfassendere (stärker ausschöpfende) Erzeugung von Protein-Protein-Wechselwirkungs-Netzwerken als bestehende Verfahren. Ein einmal etabliertes und erschöpfendes Netzwerk von Protein-Protein-Wechselwirkungen wird, wie in 1 gezeigt, für viele Zwecke von Nutzen sein. Zum Beispiel kann es dazu verwendet werden, die Existenz von neuen biologischen Wechselwirkungen oder Wechselwirkungswegen vorherzusagen, oder, um Verbindungen zwischen biologischen Netzwerken zu bestimmen. Des Weiteren kann mit diesem Verfahren durch die Bestimmung ihrer Wechselwirkungspartner, die Funktion und die Lokalisierung bislang unbekannter Proteine vorhergesagt werden. Es kann auch dazu verwendet werden, die Antwortreaktion einer Zelle auf Veränderungen der Expression bestimmter Mitglieder eines Netzwerks vorherzusagen. Schließlich können diese Daten dazu verwendet werden, Proteine oder Wechselwirkungen zwischen Proteinen in einer medizinisch relevanten Wirkungskette zu identifizieren, die für einen therapeutischen Eingriff, für die Diagnose oder für die Behandlung einer Krankheit geeignet sind.
Die Figuren zeigen:
1
Die Anwendungen eines errichteten und erschöpfenden Netzwerks von Protein-Protein-Wechselwirkungen. Die Identität der positiven Clone und die Identität der Mitglieder, die die Wechselwirkungen für die gesamte Wechselwirkungs-Genbank umfassen, werden in einer Datenbank aufbewahrt. Diese Daten werden dazu verwendet, ein Netzwerk an Protein-Protein-Wechselwirkungen zu errichten, das für eine Vielzahl an Zwecken verwendet werden kann. Zum Beispiel, um die Existenz neuer biologischer Wechselwirkungen oder Wechselwirkungswege vorherzusagen oder, um Verbindungen zwischen biologischen Netzwerken zu bestimmen. Darüber hinaus kann mit diesem Verfahren die Funktion und die Lokalisierung bislang unbekannter Proteine durch die Bestimmung ihrer Wechselwirkungspartner vorhergesagt werden. Es kann auch dazu verwendet werden, die Antwortreaktion einer Zelle auf Veränderungen der Expression bestimmter Mitglieder des Netzwerks vorherzusagen. Schließlich können diese Daten dazu verwendet werden, Proteine in einer medizinisch relevanten Wirkungskette zu identifizieren, die für die Therapie, die Diagnose und die Behandlung einer Krankheit geeignet sind.
2
Ein Schema und die Eigenschaften für eine Gruppe an Datentabellen, die zur Aufbewahrung, Handhabung und Wiedergewinnung von Daten aus einer im Großmaßstab angelegten Protein-Protein-Wechselwirkungs-Durchmusterung geeignet sind. Das Schema kann entweder in relationale oder in objektorientierte Datenbanken eingebaut werden. Die primären Verbindungen zwischen den Tabellenschlüsseln sind angezeigt, ebenso wie Vorschläge für die Felder oder die Elemente, die in jeder Tabelle zur Verfügung stehen sollten.
3
Ein Arbeitsablaufschema, das den experimentellen Ablauf und den Informationsfluß während einer in großem Maßstab angelegten Durchmusterung von Protein-Protein-Wechselwirkungen darstellt. Die Figur zeigt bei welchem Teil der experimentellen Schritte jede Tabelle aus der vorstehend beschriebenen Datenbank am Besten angewendet wird. Jede Tabelle bildet eine grundlegende Datensammlung, auf dem die Software für die Organisation des Arbeitsablaufs für diesen Teil des Vorgangs basiert.
4(I)
Plasmide, die für das verbesserte Zwei-Hybrid-System konstruiert wurden. Die Plasmidkarten der pBTM118 a, b und c-DNA-Bindedomäne-Vektorenreihe und der pGAD428 a, b, und c-Aktivierungsdomäne-Vektorenreihe. Beide Plasmide enthalten Schnittstellen für nur die einmal vorhandenen Restriktionsenzyme SalI und NotI, die dazu verwendet werden können, ein Genfragment in die multiple Clonierungsstelle zu clonieren. Die Plasmide werden in den Hefezellen durch die selektierbaren Marker TRP1, beziehungsweise LEU2 aufrecht erhalten. Auf den Verlust der Plasmide kann durch die gegenselektierbaren Marker CAN1, beziehungsweise CYH2 selektiert werden.
4(II)
Polylinker, die in den multiplen Clonierungsstellen (a, b, c) verwendet werden, um die Expression des genetischen Fragments in jedem der drei Leseraster zu ermöglichen.
5
Die Struktur des URA3-Auswertungssystems, das im Plasmid pLUA enthalten ist. Wichtige Eigenschaften von pLUA umfassen das URA3-Gen, das sich unter der Transkriptionskontrolle des lexAop-GAL1-Promotors befindet, den Selektionsmarker ADE2, der ade2-auxotrophen Hefen erlaubt auf selektivem Medium ohne Adenin zu wachsen, und das β-Lactamase-Gen (bla), das Ampicillinresistenz in E. coli verleiht. Das pLUA-Plasmid repliziert sich sowohl in Hefe unter Verwendung des 2 μ-Replikationsursprungs als auch in E. coli durch Verwendung des ColE1-Replikationsursprungs autonom.
6
Eine schematische Übersicht über eine Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung. Zur parallelen Analyse eines Netzwerks von Protein-Protein-Wechselwirkungen unter Verwendung des Verfahrens der Erfindung, wird eine Genbank an Plasmidkonstrukten bereitgestellt, die Fusionsproteine mit der DNA-Bindedomäne und Fusionsproteine mit der Aktivierungsdomäne exprimieren. Diese Genbanken können aus spezifischen DNA-Fragmenten bestehen, oder eine Vielzahl an unbekannten DNA-Fragmenten umfassen, die in die verbesserten Plasmide mit der Bindedomäne und der Aktivierungsdomäne der Erfindung ligiert wurden, welche unterschiedliche selektierbare und gegenselektierbare Marker enthalten. Beide Genbanken werden durch Transformation oder Wechselwirkungspaarung in Hefezellen kombiniert, und Hefestämme, die potenziell miteinander wechselwirkende Proteine exprimieren, werden auf Selektionsmedium ohne Histidin selektiert. Die selektierbaren Marker TRP1 und LEU2 erhalten die Plasmide in den Hefestämmen aufrecht, die auf Selektionsmedium angezogen werden, wohingegen CAN1 und CYH2 die gegenselektierbaren Marker darstellen, die auf den Verlust des betreffenden Plasmids hin selektieren. HIS3 und lacZ stellen selektierbare Marker im Hefegenom dar, die nach der Aktivierung durch miteinander wechselwirkende Fusionsproteine exprimiert werden. Das Auswertungssystem besteht im vorliegenden Fall sowohl in der Anzucht auf Medium ohne Histidin als auch in der enzymatischen Aktivität der β-Galactosidase, auf die anschließend hin durchmustert werden kann. Ein Kolonien-Pick-Roboter wird dazu verwendet, die erhaltenen Hefekolonien in die individuellen Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit 384 Vertiefungen zu überführen, und die so erhaltenen Platten werden bei 30°C inkubiert, um das Wachstum der Zellen zu erlauben. Die Wechselwirkungs-Genbank, die in den Mikrotiterplatten aufbewahrt wird, kann gegebenenfalls repliziert (Replika-plattiert) und gelagert werden. Die Wechselwirkungs-Genbank wird untersucht, um positive Clone nachzuweisen, die miteinander wechselwirkende Fusionsproteine exprimieren, und sie von falsch-positiven Clonen unter der Verwendung des Verfahrens der Erfindung zu unterscheiden. Unter Verwendung eines Tüpfel-Roboters werden die Zellen auf Replika-Membranen übertragen, die anschließend jeweils auf eine Platte mit den Selektionsmedien SD-Leu-Trp-His, SD-Leu+CAN und SD-Trp+CHX plaziert werden. Nach der Inkubation der selektiven Platten werden die Clone, die auf den Membranen gewachsen sind, einem β-Gal-Testansatz unterzogen, und es wird ein digitales Bild jeder Membran mit einer CCD-Kamera aufgenommen, das dann im Computer aufbewahrt wird. Unter Verwendung der digitalen Bildverarbeitung und -analyse können die Clone, die miteinander wechselwirkende Fusionsproteine exprimieren, unter Berücksichtigung des Musters der β-Gal-Aktivität der Clone identifiziert werden, die auf den unterschiedlichen Selektionsmedien angezogen wurden. Die individuellen Mitglieder, aus denen sich die Wechselwirkungen zusammensetzen, können dann durch eines oder mehrere Verfahren identifiziert werden, einschließlich PCR, Sequenzierung, Hybridisierung, Oligonucleotid-Fingerprinting oder Antikörperreaktionen.
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Eine schematische Übersicht über eine Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung. Zur parallelen Analyse eines Netzwerks von Protein-Protein-Wechselwirkungen unter Verwendung des Verfahrens der Erfindung, werden zwei Genbanken an Plasmidkonstrukten bereitgestellt, die die DNA-Bindedomäne- und die Aktivierungsdomäne-Fusionsproteine exprimieren. Diese Genbanken können aus spezifischen DNA-Fragmenten bestehen, oder aus einer Vielzahl an unbekannten DNA-Fragmenten, die in die verbesserten Bindedomäne- und Aktivierungsdomäne-Plasmide ligiert wurden, die die selektierbaren Marker TRP1 und LEU2 und gegebenenfalls die gegenselektierbaren Marker CAN1, beziehungsweise CYH2 enthalten. Die Genbanken werden entweder in Mata oder Matα-Hefestämme transformiert, die das URA3-Auswertungssystem enthalten, und werden anschließend auf Selektionsmedium plattiert, das 5-Fluor-Orotsäure (5-FOA) enthält. In Gegenwart von 5-FOA werden nur diejenigen Hefestämme wachsen, die Fusionsproteine exprimieren, welche nicht in der Lage sind, das URA3-Auswertungssystem zu autoaktivieren. Die so erhaltenen Hefestämme, die nur die nicht autoaktivierenden Proteine exprimieren, können dann direkt in einer automatisierten Wechselwirkungspaarung verwendet werden, um geordnete Gitter an diploiden Stämmen zu erzeugen, die auf die Aktivierung des lacZ-Auswertungssystems hin untersucht werden können.

a) Individuelle Hefezellen, die einzelne Fusionsproteine exprimieren, die nicht in der Lage sind, das URA3-Auswertungssystem zu aktivieren, werden in die Vertiefungen einer 384 Vertiefungen umfassenden Mikrotiterplatte unter Verwendung eines modifizierten Pick-Roboters übertragen. Die in den Mikrotiterplatten aufbewahrten Hefestämme können gegebenenfalls Replika-plattiert und gelagert werden. Die Mikrotiterplatten enthalten ein Anzuchtmedium ohne bestimmte Aminosäuren, das dazu geeignet ist, die entsprechenden Plasmide in den Hefestämmen aufrecht zu erhalten. Die Wechselwirkungspaarungen werden anschließend durch die automatische Übertragung eines Mata- und eines Matα-Hefestammes an die gleiche Position auf einer Nylonmembran durchgeführt, dies erfolgt unter Verwendung der durch Lehrach et al. (1997) beschriebenen automatisierten Systeme. Alternativ kann ein Pipettier- oder ein Mikropipettiersystem (Schober et al., 1993) dazu verwendet werden, kleine Volumina individueller Flüssigkulturen eines Hefestammes zu übertragen, auf die ein Rasen an Hefezellen des entgegengesetzten Paarungstyps gesprüht oder aufgetragen wurde, der aus mindestens einem Hefeclon des anderen Paarungstyps stammt. Die Hefestämme können einzeln oder als eine vereinigte Sammlung vieler Clone angewendet werden. Die durch die beiden möglichen Verfahren angeordneten Raster an Hefeclonen werden über Nacht bei 30°C inkubiert, um die Wechselwirkungspaarung stattfinden zu lassen. Die so erhaltenen diploiden Zellen werden dann mit einem β-Gal-Testansatz untersucht, wie in Breeden & Nasmyth (1985) beschrieben.
b) Hefestämme, die auf 5-FOA enthaltendem Selektionsmedium wuchsen, werden gesammelt, und es wird eine Wechselwirkungspaarung zwischen den Mata- und den Matα-Stämmen in flüssigem YPD-Medium durchgeführt. Diejenigen diploiden Hefestämme, die miteinander wechselwirkende Proteine exprimieren, werden durch Ausplattieren auf Selektionsmedium ohne Histidin und Uracil selektiert. Die selektiven Marker TRP1 und LEU2 erhalten die Plasmide in den Hefestämmen aufrecht, die auf Selektionsmedien angezogen wurden. HIS3, URA3 und lacZ stellen die Reportergene in den Hefezellen dar, die nach der Aktivierung der miteinander wechselwirkenden Fusionsproteine exprimiert werden. Das Auswertungssystem besteht im vorliegenden Fall aus der Anzucht auf Medium ohne Histidin und/oder Uracil und der enzymatischen Aktivität der β-Galactosidase, die zu einem späteren Zeitpunkt durchmustert werden kann. Ein modifizierter Kolonien-Pickroboter wird dazu verwendet, die diploiden Hefekolonien in individuelle Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit 384 Vertiefungen zu picken, die Selektionsmedium enthält, und die so erhaltenen Platten werden bei 30°C inkubiert, um das Wachstum der Zellen zu erlauben. Die Wechselwirkungs-Genbank kann gegebenenfalls Replika-plattiert und gelagert werden. Unter Verwendung eines Tüpfelroboters werden die diploiden Zellen auf Replika-Membranen übertragen, die anschließend auf Anzuchtmedium planiert werden. Die Replika-Membranen werden auf die gegenselektierbaren Medien SD-Trp+CHX oder SD-Leu+CAN planiert. Die so erhaltenen gleichmäßigen Anordnungen an diploiden Hefeclonen werden auf β-Gal-Aktivität hin untersucht, wie durch Breeden & Nasmyth (1985) beschrieben.

In jedem Fall a) und b) wird ein digitales Bild jeder getrockneten Membran mit einer CCD-Kamera aufgenommen, das dann im Computer aufbewahrt wird. Unter Verwendung der digitalen Bildverarbeitung und -analyse können die Clone, die miteinander wechselwirkende Fusionsproteine exprimieren, unter Berücksichtigung der β-Gal-Aktivität der in einem definiertem Muster aufgetüpfelten Clone identifiziert werden, die auf den Membranen wuchsen und die auf den unterschiedlichen Selektionsmedien planiert worden waren. Die individuellen Mitglieder aus denen die Wechselwirkung besteht, können dann durch eines oder mehrere Verfahren identifiziert werden, einschließlich PCR, Sequenzierung, Hybridisierung, Oligonucleotid-Fingerprinting oder Antikörperreaktionen.
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Vorhergesagte Wechselwirkungen zwischen Fusionsproteinen, die dazu verwendet wurden, die definierte Wechselwirkungs-Genbank zu erzeugen. Von den Fusionsproteinen, die in fett gedruckten, runden Umrahmungen stehen, wird angenommen, dass sie wie gezeigt, miteinander in Wechselwirkung treten. Von den LexA-HIP1- und den GAL4ad-LexA-Fusionsproteinen, die in den dünn gedruckten, rechteckigen Umrahmungen stehen, wurde gezeigt, dass sie das lacZ-Auswertungssystem ohne die Hilfe eines mit ihnen wechselwirkenden Fusionsproteins aktivieren. Von den beiden Proteinen LexA und GAL4ad und den drei Fusionsproteinen GAL4ad-HIPCT, GAL4ad-14-3-3 und LexA-MJD1 (alle nicht umrahmt) wird angenommen, dass sie nicht miteinander, oder mit anderen Fusionsproteinen, die in diesem Beispiel verwendet werden, in Wechselwirkung treten.
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Die Identifizierung positiver Clone, die miteinander wechselwirkende Fusionsproteine enthielten, gegenüber falsch-positiven Clonen unter Verwendung der Erfindung. Drei unterschiedliche Hefeclone, von denen jeder ein Paar von Plasmidkonstrukten enthielt (positive Kontrolle: pBTM117c-SIM1 & pGAD427-ARNT; negative Kontrolle: pBTM117c & pGAD427 und falsch-positive Kontrolle: pBTM117c-HIP1 & pGAD427), wurden per Hand auf vier Agarplatten übertragen, von denen jede ein unterschiedliches Selektionsmedium (SD-Leu-Trp, SD-Leu-Trp-His, SD-Leu+CAN und SD-Trp+CHX) enthielt, und 48 Stunden bei 30°C inkubiert. Die Hefekolonien wurden anschließend auf eine Nylonmembran übertragen und auf β-Gal-Aktivität durch das Verfahren von Breeden & Nasmyth (1985) hin untersucht.
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Digitale Aufnahmen von β-Gal-Testansätzen, die von den Replika-Nylonmembranen aufgenommen wurden, die die definierte Wechselwirkungs-Genbank enthielten, die von den Selektionsmedien (a) SD-Leu-Trp-His, (b) SD-Trp+CHX und (c) SD-Leu+CAN erhalten wurde. In jedem der drei Fälle enthält die linke Seite der Membran Kontrollclone und Clone aus der definierten Wechselwirkungs-Genbank, aber und die rechte Seite enthält nur Clone aus der definierten Wechselwirkungs-Genbank. Die Gesamtgröße jeder Membran beträgt 22 × 8 cm, und sie enthält 6912 Tüpfelstellen mit einem Tüpfelabstand von 1,4 mm.
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Vergrößerung von Clonen aus der Wechselwirkungs-Genbank, die aus den gleichen Bereichen der drei Membranen aufgenommen wurde, die von den Selektionsmedien SD-Leu-Trp-His, SD-Trp+CHX und SD-Leu+CAN erhalten und auf β-Gal-Aktivität hin untersucht wurden:

a) Clone, die aus einem Bereich der rechten Seite der Membran aufgenommen wurden, die die definierte Wechselwirkungs-Genbank enthält. Die Clone aus der definierten Wechselwirkungs-Genbank, die miteinander wechselwirkende Proteine exprimieren, sind umringt und entsprechen den Adressen 06L22 und 08N24 in der Mikrotiterplatte.
b) Clone, die aus einem Bereich der linken Seite der gleichen Membranen aufgenommen wurden, und die Kontrollclone und Clone aus der Wechselwirkungs-Genbank enthalten, wobei die Clone um jeden Markierungs-Tintenfleck wie gezeigt angeordnet sind und entsprechen: 00 Markierungs-Tintenfleck; 01 falsch-positiver Kontrollclon, der das Fusionsprotein GAL4ad-LexA exprimiert; 02 falsch-positiver Clon, der das Fusionsprotein LexA-HIP1 exprimiert; 03 positiver Kontrollclon, der die miteinander wechselwirkenden Fusionsproteine LexA-SIM1 & GAL4ad-ARNT exprimiert; 04 Clon aus der definierten Wechselwirkungs-Genbank. Der pasitive Kontrollclon (Tüpfel-Position 03) ist umringt.

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a) Eine Untergruppe der Liste an Clonen, die durch Computerabfrage von Daten identifiziert wurden, die durch automatische Bildanalyse und Quantifizierung der Aktivität der β-Galactosidase hergestellt wurden. Jede Aufzeichnung stellt die β-Galactosidase-Aktivität eines bestimmten Clons dar, der auf drei selektiven Medien angezogen wurde, Dieses Programm fragte die Daten ab, die dazu dienten, alle Clone aus der Wechselwirkungs-Genbank zu identifizieren, die das Reportergen bei Anzucht auf Minimalmedium ohne Leucin, Tryptophan und Histidin (SD-Leu-Trp-His) aktiviert hatten (Werte > 0), jedoch nicht auf einem der Gegenselektionsmedien (die Werte für beide Medien betragen 0).
b) Die positiven Clone 06L22 und 08N24, die durch Hybridisierung charakterisiert wurden, sind in der Computerdatei vorhanden.

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Charakterisierung der genetischen Fragmente, die in den Clonen 06L22 und 08N24 enthalten sind, durch Hybridisierung. Es wurden ein 1,3 kb großes SIM1- und ein 1,4 kb großes ARNT-DNA-Fragment als Nucleinsäuresonden zur Hybridisierung mit in hoher Dichte betüpfelten Membranen verwendet, die DNA aus der definierten Wechselwirkungs-Genbank enthielten. Diese Clone wurden durch Hybridisierung als diejenigen Clone charakterisiert, die die genetischen Fragmente SIM1 und ARNT enthalten. Die Bilder sind aus dem gleichen Bereich der Membranen wie diejenigen, die in 11a gezeigt werden. Die Tüpfel-Positionen der Clone 06L22 und 08N24 sind umringt.
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Identifizierung der DNA-Fragmente SIM1 und ARNT aus dem Hefe-Zwei-Hybrid-Plasmid, das im Clon 06L22 enthalten ist, durch Duplex-PCR. Die Plasmid-DNA wurde aus einer Flüssigkultur des Clons 06L22 über das QiaPrep-Verfahren (Hilden) isoliert, und die in den Plasmiden enthaltenen inserierten Fragmente wurden durch PCR unter Verwendung der folgenden Primerpaare amplifiziert, 5'-TCG TAG ATC TTC GTC AGC AG-3' & 5'-GGA ATT AGC TTG GCT GCA GC-3' für das Plasmid pBTM117c und 5'-CGA TGA TGA AGA TAC CCC AC-3' & 5'-GCA CAG TTG AAG TGA ACT TGC-3' für pGAD427. Bahn 1 enthält mit BstEII verdaute Lambda-DNA als Größenmarker; Bahn 2 enthält den Duplex-PCR-Reaktionsansatz mit den Plasmiden, die aus dem Clon 06L22 isoliert wurden; die Bahnen 3 und 4 enthalten jeweils PCR-Kontrollamplifikationen mit dem Plasmid pBTM117c-SIM1, beziehungsweise pGAD427-ARNT.
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Die Aktivierung des Auswertungssystems für Clone aus einer Wechselwirkungs-Genbank, die in einem regelmäßigen Gittermuster angeordnet sind. Es wurden 23 Mikrotiterplatten mit 384 Vertiefungen einer Seeigel-Wechselwirkungs-Genbank in einem regelmäßigen „duplizierten 3 × 3"-Gittermuster um einen Markierungs-Tintenklecks herum auf eine 222 × 222 mm große poröse Membran (Hybond N+, Amersham, UK) unter Verwendung eines Tüpfelroboters aufgetragen. Die Membran wurde 3 Tage in SD-Leu-Trp-His-Medium inkubiert, dann unter Verwendung des β-Gal-Testansatzes, wie durch Breeden & Nasmyth (1985) beschrieben, auf die Expression von lacZ hin untersucht und über Nacht an der Luft getrocknet. Es wurde ein digitales Bild unter Verwendung eines Standard-A3-Computerscanners aufgenommen.
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Hybridisierung eines Genfragments (Sonde A), das für ein Protein A codiert, mit einer DNA-Anordnung aus einer Wechselwirkungs-Genbank. Die Sonde wurde durch Standardverfahren radioaktiv markiert, und die bei der Hybridisierung positiven Clone der Wechselwirkungs-Genbank wurden über das automatisierte Bildanalysesystem identifiziert. Die Position des Clons 5K20, aus dem das Genfragment isoliert worden war, ist angezeigt. Es tragen auch andere bei der Hybridisierung positiven Clone dieses Genfragment, und durch die Wiedergewinnung der miteinander wechselwirkenden Mitglieder aus diesen Clonen kann ein Protein-Protein-Wechselwirkungsweg für das Protein A aufgedeckt werden.
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Eine graphische Darstellung der bei der Hybridsierung positiven Clone, die durch Hybridisierung der Sonde A mit der DNA-Anordnung erzeugt wurden, die die Wechselwirkungs-Genbank darstellt.
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Eine graphische Darstellung der bei der Hybridsierung und bei der Wechselwirkung positiven Clone, die durch eine anschließende Hybridisierung mit der Sonde B (isoliert aus dem Clon, der durch ein graues Kästchen markiert ist) erzeugt wurden. Es werden auch die Positionen der bei der Hybridisierung mit der Sonde A positiven Clone gezeigt. Die bei der Wechselwirkung positiven Clone, die beide Genfragmente tragen, wurden als mit beiden Sonden hybridisierend identifiziert.
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Eine graphische Darstellung der bei der Hybridsierung und bei der Wechselwirkung positiven Clone, die durch eine weitere Hybridisierung mit der Sonde C erzeugt wurden, die aus dem Clon 6D18 isoliert worden war (markiert durch ein graues Kästchen und „B/C"). Es werden auch die Hybridisierungssignale der Sonden A und B gezeigt. Durch die Berücksichtigung gemeinsamer Hybridisierungssignale der bei der Wechselwirkung positiven Clone und der anschließenden DNA-Sequenzierung, der in diesen Clonen enthaltenen inserierten Fragmente, können Protein-Protein-Wechselwirkungen aufgedeckt werden. Die Figur zeigt auch einen Wechselwirkungsweg, der zwischen den Proteinen A, B und C aufgedeckt wurde, und der auf diesen Daten basiert.
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Automatisierte visuelle Unterscheidung von Hefezellen, die einzelne Fusionsproteine exprimieren, die in der Lage sind, das LacZ-Auswertungssystem zu aktivieren. Eine definierte Genbank von L40ccu-Hefeclonen, die unterschiedliche Fusionsproteine exprimieren und die im Plasmid pBTM117c cloniert worden waren, wurde auf Minimalmedium ohne Tryptophan ausplattiert, das mit Kaliumphosphat auf den pH-Wert 7,0 gepuffert war und das 2 μg/ml X-Gal enthielt (SD-Trp/X-GAL). Weiße Kolonien, die das LacZ-Reportergen nicht autoaktiviert haben, werden automatisch erkannt und mit einem roten horizontalen Kreuz markiert. Eine Kolonie, die sieh aufgrund der Expression eines einzelnen Fusionsproteins blau färbte, das in der Lage war, das LacZ-Reportergen autozuaktiviern, wird aufgrund ihrer dunkleren Färbung und dem Vorliegen eines „Loches" automatisch erkannt. Diese Kolonie ist durch einen Pfeil angezeigt. Alle Kolonien, die für die weitere Analyse und das Picken ungeeignet sind (einschließlich zu kleiner oder einander berührender Kolonien), werden automatisch erkannt und mit einem blauen diagonalen Kreuz markiert.
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Ergebnisse einer automatisierten Wechselwirkungspaarung, um diploide Hefestämme zu identifizieren, die miteinander wechselwirkende Fusionsproteine exprimieren.

a) Die Nachkommenschaft der Hefestämme x1a und x2a wurden unter Verwendung eines Tüpfelroboters, wie er in Lehrach et al. (1997) beschrieben wurde, an den Positionen 1 und 2 auf eine Nylonmembran aufgetüpfelt. Die Hefestämme y1α und y2α des entgegengesetzten Paarungstyps wurden anschließend an den Positionen 1 und 2 aufgetüpfelt, die bereits die Zellen der Stämme x1a und x2a enthielten. Um die Erkennung des duplizierten Tüpfelmusters zu unterstützen, wurde Tinte in Position 2 direkt rechts neben den aufgetüpfelten Hefeclonen aufgetragen.
b) Die Membran wurde auf YPD-Agarplatten übertragen und bei 30°C über Nacht inkubiert, um die Wechselwirkungspaarung stattfinden zu lassen.
c) Die diploiden Hefestämme, die auf der Membran gewachsen waren, wurden anschließend unter der Verwendung des Verfahrens von Breeden & Nasmyth (1985) auf ihre β-Galactosidase-Aktivität hin untersucht.

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Die beiden Vektoren, die dazu konstruiert worden waren, weitere genetische Eigenschaften bereitzustellen, um das Verfahren der Erfindung in einem prokaryontischen Zwei-Hybrid-System anwenden zu können. Die Vektoren basieren auf der pBAD-Vektorenreihe, die eine enge induzierbare Kontrolle der Expression von clonierten Genen unter Verwendung des Arabinose-Operons ermöglicht (Guzman et al., 1995; J. Bact. 177: 4141–4130), und sie können in der gleichen E. coli-Zelle aufgrund kompatibler Replikationsursprünge aufrecht erhalten werden.
Das Plasmid pBAD18-αRNAP exprimiert unter der Kontrolle des Arabinose-Promotors Fusionsproteine zwischen der α-aminoterminalen Domäne (NTD) der α-Untereinheit der RNA-Polymerase und DNA-Fragmenten, die in die multiple Clonierungsstelle cloniert wurden. Auf die Anwesenheit dieses Plasmids in Kanamycinempfindlichen Zellen kann durch Ausplattieren auf Anzuchtmedium selektiert werden, das mit Kanamycin ergänzt wurde, oder es kann auf seine Abwesenheit durch das gegenselektierbare rpsL-Allel hin selektiert werden, und zwar durch Ausplattieren auf Medium, das mit Streptomycin ergänzt wurde (Murphy et al., 1995).
Das Plasmid pBAD30-cI exprimiert unter der Kontrolle des Arabinose-Promotors Fusionsproteine zwischen dem λcI-Protein und DNA-Fragmenten, die in die multiple Clonierungsstelle cloniert wurden. Auf die Anwesenheit dieses Plasmids in Ampicillinempfindlichen Zellen kann durch Ausplattieren auf Anzuchtmedium selektiert werden, das mit Ampicillin ergänzt wurde, oder es kann auf seine Abwesenheit durch das gegenselektierbare lacY-Gen hin selektiert werden, und zwar durch Ausplattieren auf Medium, das mit 2-Nitrophenyl-β-D-thiogalactosid (tONPG) ergänzt wurde (Murphy et al., 1995). Darüber hinaus ermöglicht die oriT-Sequenz den unidirektionalen genetischen Austausch des pBAD30-cI-Plasmids und seiner Nachkömmlinge von E. coli-Zellen, die den F'-Fertilitätsfaktor enthalten, hin zu F^–-Stämmen, denen der Fertilitätsfaktor fehlt.
Beispiele
Beispiel 1: Konstruktion von Vektor-Hefe-Stämmen und des Auswertungssystems für ein verbessertes Hefe-Zwei-Hybrid-System
1.1. Die Konstruktion von Vektoren
Die Plasmide pBTM118 a, b und c und pGAD428 a, b und c, die für ein verbessertes Hefe-Zwei-Hybrid-System konstruiert wurden, werden in 4 gezeigt. Beide Vektorenreihen können zur Konstruktion von Hybrid-(Fusions-)Proteinen verwendet werden. Die Vektoren enthalten die jeweils einmal vorhandenen Restriktionsschnittstellen SalI und NotI, die sich jeweils im Bereich der multiplen Clonierungsstelle (MCS) am 3'-Ende des offenen Leserasters der lexA codierenden Sequenz oder der GAL4ad-Sequenz befinden (4b).
Mit den beiden Reihen der Plasmide werden Fusionsproteine in hohen Spiegeln in den Hefe-Wirtszellen durch den konstitutiven ADH1-Promotor (P) exprimiert, und die Transkription wird am ADH1-Transkriptions-Terminations-Signal (T) beendet. Die beiden Zwei-Hybrid-Plasmide, die in 4a gezeigt werden, sind Austausch-Vektoren, die sich sowohl in E. coli als auch in S. cerevisiae autonom replizieren.
Die drei Plasmide pBTM118 a, b und c werden dazu verwendet, Fusionen zwischen dem LexA-Protein (Aminosäuren 1-220) und einem Protein von Interesse zu erzeugen, das in die MCS in der korrekten Orientierung und im korrekten Leseraster cloniert wurde. Die Plasmide pBTM118 a, b und c wurden von pBTM117c (Wanker et al., 1997) durch die Insertion der Adapter, die in Tabelle 1 gezeigt werden, in die Restriktionsenzym-Schnittstellen SalI und NotI abgeleitet, um die verbesserten Vektoren mit drei unterschiedlichen Leserastern zu erzeugen.
Die Plasmide pBTM118 a, b und c enthalten das Wildtyp-Hefegen CAN1 zur Gegenselektion, das transformierten Hefezellen eine Empfindlichkeit gegenüber Canavanin verleiht (Hoffmann, 1985). Die Plasmide enthalten auch den Selektionsmarker TRP1, der trp1-auxotrophen Hefen erlaubt, auf selektivem synthetischem Medium ohne Tryptophan zu wachsen, sowie den Selektionsmarker bla, der Ampicillin-Resistenz in E. coli verleiht.
Die Plasmide pGAD428 a, b und c werden dazu verwendet, Fusionsproteine zu erzeugen, die die GAL4-Aktivierungsdomäne (Aminosäuren 768-881) enthalten, die mit einem Protein von Interesse funktionell verbunden ist. Die Plasmide pGAD428 a, b und c tragen das Wiltyp-Hefegen CYH2, das transformierten Zellen eine Empfindlichkeit gegenüber Cycloheximid verleiht (Kaeufer et al., 1983), den Selektionsmarker LEU2, der leu2-auxotrophen Hefen erlaubt, auf selektivem synthetischem Medium ohne Leucin zu wachsen, sowie den bakteriellen Marker aphA (Pansegrau et al., 1987), der Kanamycin-Resistenz in E. coli verleiht. Die Plasmide pGAD428 a b, und c wurden aus pGAD427 durch Ligierung der Adapter, die in Tabelle 1 gezeigt werden, in die MCS erzeugt, um die verbesserten Vektoren mit drei unterschiedlichen Leserastern zu konstruieren.
Zur Konstruktion von pGAD427 wurde ein 1,2 kb großes DdeI-Fragment, das das aphA-Gen enthielt, aus pFG101u (Pansegrau et al., 1987) isoliert und in die PvuI-Schnittstelle von pGAD426 unter Verwendung der Oligonucleotid-Adapter 5'-GTCGCGATC-3' und 5'-TAAGATCGCGACAT-3' subcloniert. Das Plasmid pGAD426 wurde durch Insertion eines 1,2 kb großen EcaRV-CYH2-Genfragments, das aus pAS-1 (Clontech) isoliert worden war, in die PvuII-Schnittstelle von pGAD425 (Han und Collicelli, 1985) erzeugt.
1.2. Die Konstruktion der Hefestämme
Um die Konstruktion des verbesserten Hefe-Zwei-Hybrid-System zu ermöglichen, wurden die drei Saccharomyces cerevisiae-Stämme L40cc, L40ccu und L40ccuα erzeugt. S. cerevisiae L44cc wurde durch ortsspezifisches Ausschalten des CYH2- und des CAN1-Gens von L40 (Hollenberg et al., Mol. Cell. Biol. 15: 3813–3822) erzeugt, und L40ccu wurde durch ortsspezifisches Ausschalten des URA3-Gens von L40cc erzeugt (Current Protocols in Malecular Biology, Hrsg. Ausubel et al., John Wiley & Sons, 1992). Der Stamm L40ccuα wurde durch die Durchführung einer Paarungstyp-Umschaltung (mating-type switch) des Stammes L40ccu über Standardverfahren erzeugt (Ray BL, White CI, Haber JE (1991)). Der Genotyp des Stammes L44cc ist: Mata his3Δ200 trp1-901 leu2-3,112 ade2 LYS2::(lexAop)₄-HIS3 URA3::(lexAop)₈-lacZ GAL4 can1 cyh2. Der Genotyp des Stammes L40ccu ist: Mata his3Δ200 trp1-901 leu2-3,112 ade2 LYS2::(lexAop)₄-HIS3 ura3::(lexAop)₈-lacZ GAL4 can1 cyh2 und der von L40ccuα ist: Matα his3Δ200 trp1-901 leu2-3,112 ade2 LYS2::(lexAop)₄-HIS3 ura3::(lexAop)₈-lacZ GAL4 can1 cyh2.
1.3. Das Auswertungssystem
5 zeigt das im Plasmid pLUA enthaltene URA3-Auswertungssystem. Dieses URA3-Auswertungssystem unter der Kontrolle einer bakteriellen, stromaufwärts liegenden LexAop-Aktivierungssequenz (UAS, upstram activation sequence) kann im Hefe-2-Hybrid-System sowohl als gegenselektierbares Reportergen wie auch als Reportergen zu positiven Selektion verwendet werden, um falsch-positive Clone zu eliminieren. Das Plasmid enthält die Eigenschaften des UAS_lexAop-URA3-Auswertungssystems, den Selektionsmarker ADE2, der ade2-auxotrophen Hefen erlaubt, auf Selektionsmedium ohne Adenin zu wachsen, sowie das bla-Gen, das Ampicillin-Resistenz in E. coli verleiht. Das Plasmid pLUA ist ein Austausch-Vektor (shuttle vector), der sich in E. coli und in der Hefe autonom repliziert.
Zur Konstruktion von pLUA wurde ein 1,5 kb großes SacI/ClaI-UAS_lexAop-URA3-Fragment aus pBS-lexURA isoliert und zusammen mit einem 2,4 kb großen SacI/ClaI-ADE2-Fragment in mit ClaI verdautes pGAD425Δ ligiert. pBS-lexURA wurde durch Ligierung des URA3-Fragments zusammen mit einem UAS_lexAop-Fragment in pBluescript SK+ erzeugt. Das URA3- und das UAS_lexAop-Fragment wurden durch PCR unter Verwendung genomischer DNA aus dem S. cerevisiae-Stamm L40c unter Verwendung von Standardverfahren und Ankerprimern erhalten, die komplementäre Überhänge zwischen den beiden aufeinanderfolgenden Fragmenten erzeugten, die anschließend einander angelagert wurden, um die chimäre Sequenz zu erzeugen (vergleiche zum Beispiel mit Current Protocols in Molecular Biology, Hrsg., Ausubel et al., John Wiley & Sons, 1992). Das ADE2-Gen wurde durch PCR unter Verwendung genomischer DNA aus SEY6210α isoliert. pGAD425Δ wurde durch Deletion eines 1,2 kb großen SphI-Fragments aus pGAD425 (Han und Colicelli, 1995) und der Religierung des Vektors erzeugt.
1.4. Die Erzeugung einer definierten Wechselwirkungs-Genbank
Um zu bestimmen, ob die Erfindung in einem verbesserten Zwei-Hybrid-System für Hefe, wie in 6 oder in 7 gezeigt, verwendet werden kann, wurde eine definierte Wechselwirkungs-Genbank von Plasmiden, die verschiedene LexA- und GAL4ad-Fusionsproteine von Interesse exprimierten, unter Verwendung der Vektoren und der Stämme konstruiert, die in den Abschnitten 1.1. und 1.2. beschrieben wurden. Die Orientierung der inserierten Fragmente wurde durch Restriktionsanalyse bestimmt, und das Leseraster wurde durch Sequenzierung kontrolliert. Die erzeugten Konstrukte und die Original-Plasmide, die vorstehend beschrieben wurden, sind in der Tabelle 2 aufgelistet. Die Konstruktion von pBTM117c-HD1.6, -HD3.6 und -SIM1 wurde anderenorts beschrieben (Wanker et al., 1997; Probst et al., 1997). pBTM117c-HIP1 und pGAD427-HIP1 wurden durch Ligierung eines 1,2 kb großen SalI-HIP1-Fragments, das aus pGAD-HIP1 (Wanker et al., 1997) isoliert worden war, in pBTM117c, beziehungsweise in pGAD427 erhalten. pBTM117c-MJD wurde durch Insertion eines 1,1 kb großen SalI/NotI-MJD1-Fragments (Kawagushi et al., 1994) in pBTM117c erzeugt, und pGAD427-14-3-3 wurde durch die Insertion eines 1,0 kb großen EcoRI/NotI-Fragments aus pGAD10-14-3-3 in pGAD427 erzeugt. Zur Konstruktion von pGAD427-HIPCT wurde ein 0,5 kb großes EcoRI-HIP1-Fragment, das aus pGAD-HIPCT (Wanker et al., 1997) isoliert worden war, mit pGAD427 ligiert. pGAD427-lexA und pGAD427-ARNT wurden durch Insertion eines 1,2 kb großen, mit SalI/NotI verdauten lexA-PCR-Fragments, beziehungsweise eines 1,4 kb großen SalI/NotI-ARNT-Fragments in pGAD427 erzeugt.
Es wurde gezeigt, dass die Fusionsproteine LexA-SIM1 und GAL4ad-ARNT im Hefe-Zwei-Hybrid-System spezifisch miteinander in Wechselwirkung treten (Probst et al., 1997), da, wenn beide Hybride in einem Saccharomyces cerevisiae-Stamm zusammen exprimiert werden, der die beiden integrierten Reporterkonstrukte, d. h. das HIS3-Hefegen und das bakterielle lacZ-Gen enthält, die beide Bindestellen für das LexA-Protein im Promotorbereich enthalten, die Wechselwirkung zwischen diesen beiden Fusionsproteinen zur Transkription der Reportergene führte. Die Fusionsproteine alleine waren nicht in der Lage, die Transkription zu aktivieren, da GAL4ad-ARNT die DNA-Bindedomäne und LexA-SIM1 die Aktivierungsdomäne fehlt (Probst et al., 1997). Dagegen wurde vor Kurzem gezeigt, dass die Fusionsproteine LexA-HIP1 und GAL4ad-LexA in der Lage sind, das HIS3- und das lacZ-Reportergen ohne Wechselwirkung mit einem spezifischen GAL4ad-, beziehungsweise LexA-Fusionsprotein zu aktivieren. Daher müssen die Hefeclone, die das LexA-HIP1-Protein exprimieren, als falsch-positive Clone bezeichnet werden, da falsch-positive Clone hier als Clone definiert werden, in denen ein GAL4ad-Fusionsprotein oder ein LexA-Fusionsprotein alleine ohne entsprechende Partnerproteine die Transkription der Reportergene aktivieren, ohne dass sie dazu irgendwelcher mit ihnen wechselwirkender Partnerproteine bedürfen.
Die vorhergesagten Protein-Protein-Wechselwirkungen dieser Fusionsproteine werden in 8 gezeigt. Es wurde gezeigt, dass die Fusionsproteine LexA-SIM1 & GAL4ad-ARNT, LexA-HD1.6 & GAL4ad-HIP1 und LexA-HD3.6 & GAL4ad-HIP1 spezifisch im Hefe-Zwei-Hybrid-System miteinander in Wechselwirkung treten, weil sie die Reportergene HIS3 und lacZ nur dann aktivieren, wenn beide Proteine in einer Zelle vorliegen (Probst et al., 1997; Wanker et al., 1997). Im Gegensatz dazu wurde gezeigt, dass das LexA-HIP1- und das GAL4ad-LexA-Fusionsprotein in der Lage sind, die Reportergene ohne Bedarf an irgendeinem mit ihnen wechselwirkenden Fusionsprotein zu aktivieren. Die Proteine LexA und GAL4ad und die Fusionsproteine LexA-MJD1 und GAL4ad-14-3-3, die ebenfalls in der definierten Wechselwirkungs-Genbank vorliegen, sind nicht in der Lage, die Reportergene zu aktivieren, weder alleine, noch wenn sie in der gleichen Zelle mit irgendeinem anderen der Fusionsproteine vorliegen, aus denen sich die Genbank zusammensetzt.
Beispiel 2: Nachweis von Clonen, die bekannte miteinander wechselwirkende Proteine exprimieren, gegenüber falsch-positiven Clonen unter Verwendung des verbesserten Zwei-Hybrid-Systems
Paare der Hefe-Zwei-Hybrid-Plasmide pBTM117c-SIM1 & pGAD427-ARNT, pBTM117c & pGAD427 und pTM117c-HIP1 & pGAD427 wurden in den Hefestamm L40cc transformiert, und Trp+Leu+-Transformanten, die mindestens eines der beiden Plasmide enthielten, wurden auf SD-Leu-Trp-Platten selektiert. Zwei Transformanten aus jeder Transformation wurden auf das Vorliegen von Protein-Protein-Wechselwirkungen hin untersucht, dies erfolgte durch Austesten der Fähigkeit der Hefezellen auf SD-Leu-Trp-, SD-Leu-Trp-His-, SD-Leu+CAN und SD-Trp+CHX-Platten zu wachsen, sowie durch den β-Galactosidase-Testansatz (Breeden und Nasmyth, 1985). 9 zeigt, dass die Zellen der Hefestämme, die sowohl die Plasmide pBTM117c-SIM1 & pGAD427-ARNT als auch pBTM117c-HIP1 & pGAD427 trugen, auf SD-Leu-Trp-His-Platten wuchsen und sich nach der Inkubation in X-Gal-Lösung blau färbten, was anzeigt, dass das HIS3- und das LacZ-Reportergen in diesen Stämmen aktiviert sind. Zum Vergleich war der Hefestamm, der die beiden negativen Kontrollplasmide pBTM117c & pGAD427 trug, nicht in der Lage, auf diesem Medium zu wachsen, und er zeigte ebenfalls keine lacZ-Aktivität. Nach der Selektion der Hefestämme, die die verschiedenen Kombinationen der Zwei-Hybrid-Plasmide trugen, auf SD-Leu+CAN und SD-Leu+CHX, wurden die so erhaltenen Stämme ebenfalls mit dem β-Galactosidase-Testansatz untersucht. Nach der Inkubation der Membran, die alle drei Stämme enthielt, auf SD-Trp-CHX-Medium, färbte sich nach der Inkubation in X-Gal-Lösung nur die Nachkommenschaft des Hefestammes blau, der ursprünglich die beiden Plasmide pBTM117c-HIP1 & pGAD427 trug, der jedoch das pGAD427-Plasmid durch Gegenselektion verloren hatte. Dieses Ergebnis zeigt an, dass dieser Clon ein falsch-positiver Clon ist, da er, obwohl er einen lacZ+-Phänotyp zeigt wenn er auf SD-Leu-Trp-His-Medium angezogen wird, das LexA-HIP1-Fusionsprotein auch in der Lage war, das HIS3- und das lacZ-Gen auf SD-Trp+CHX-Medium zu aktivieren, ohne irgendein anderes in Wechselwirkung tretendes Fusionsprotein zu benötigen. Im Vergleich dazu, handelt es sich bei dem Hefestamm, der die beiden Plasmide pBTM117c-SIM1 & pGAD427-ARNT enthält, um einen positiven Clon, der miteinander wechselwirkende LexA- und GAL4ad-Fusionsproteine exprimiert, da sowohl das LexA-, als auch das GAL4ad-Fusionsprotein zur Aktivierung der Reportergene benötigt wird. Wenn entweder das Plasmid pBTM117c-SIM1 oder das Plasmid pGAD4ad-ARNT durch Gegenselektion auf SD-Trp+CHX, beziehungsweise SD-Leu+CAN aus dem Stamm verloren geht, sind die so erhaltenen Zellen nicht mehr in der Lage, das lacZ-Reportergen zu aktivieren und färben sich nach der Inkubation in X-Gal-Lösung nicht mehr blau. Mit den Membranen der SD-Leu+CAN-Platten wurden falsch-positive Clone, die ein autoaktivierendes GAD4ad-LexA-Fusionsprotein exprimierten, ebenfalls durch den β-Galactosidase-Testansatz nachgewiesen.
Beispiel 3: Die Erzeugung regelmäßiger Gittermuster von Wirtszellen, die potenziell miteinander wechselwirkende Fusionsproteine exprimieren
3.1. Die Erzeugung eines regelmäßigen Gittermusters von Clonen aus einer Wechselwirkungs-Genbank in Mikrotiterplatten unter Verwendung der Automatisierung
Um die wohldefinierte Wechselwirkungs-Genbank zu erzeugen, wurden die Konstrukte zur Expression der Fusionsproteine, die in 8 gezeigt werden, vereinigt, und es wurden 3 μg des Gemisches in den Hefestamm L40cc durch das Verfahren von Schiestel & Gietz (1989) kotransformiert. Die mit den in Tabelle 2 beschriebenen Konstrukten kotransformierten Hefezellen wurden aus große 24 × 24 cm-Agarschalen (Genetix, UK) plattiert, die Minimalmedium ohne Tryptophan, Leucin und Histidin (SD-Trp-Leu-His) enthielten. Die Agarschalen wurden unter Verwendung eines Agar-Autoklaven und einer Pumpe (Integra, Schweiz) gegossen, um Variation in der Farbe und der Tiefe des Agars von Schale zu Schale zu minimieren. Um die Wirksamkeit des automatisierten Pickens zu maximieren, wurde das Transformationsgemisch so plattiert, dass zwischen 200 und 2000 Kolonien pro Agarschale nach Inkubation bei 30°C über 4 bis 7 Tage erhalten wurden.
Es wurden geeignete Veränderungen an der Hardware und der Software eines Standard-Pickroboters vorgenommen, der zum Picken von E. coli-Zellen, wie in Lehrach et al. (1997) beschrieben, entworfen worden war, um den speziellen Anforderungen der Hefezellen Rechnung zu tragen. Die Beleuchtung der Agarschalen, die die plattierten Kolonien trugen, wurde von einer Dunkelfeld-Beleuchtung von unten zur einer Dunkelfeld-Beleuchtung von oben verändert, um die Hefekolonien von dem Rasen aus nicht transformierten Zellen unterscheiden zu können. Das bestehende, durch Sicht geleitete, Bewegungssystem (Krishnaswamy & Agapakis, 1997) wurde modifiziert, um einen größeren Bereich an „Klümpchen"-Größen („blob" size, Koloniengrößen) auswählen zu können, wenn bei der Auswahl der Hefekolonien, die nach einer Kolonie-Eigenschaften-Tabelle zu picken waren, diese durch die Verbindungs-Algorithmen (cannectivity algorithms) zurückgewiesen wurden, wenn diese auf ein digitales Bild der Agarschale angewendet wurden, die die Kolonien enthielt. Das Clon-Beimpfungs-Routineprogramm wurde neu programmiert, um abzusichern, dass Zellmaterial, das aus den Picknadeln im Verlauf des Pickprogramms angetrocknet war, zuerst durch 10 Sekunden Eintauchen in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte wieder befeuchtet wurde, bevor die aktive Bewegung der Nadel in der Vertiefung stattfand. Dieses robotisierte Verfahren sicherte ab, dass ausreichend Zellmaterial von jeder Picknadel in eine individuelle Vertiefung einer Mikrotiterplatte angeimpft wurde. Die Picknadeln wurden nach jeder Beimpfung sterilisiert, um den Pickzyklus wiederholen zu können, dies erfolgte durch die Programmierung des Roboters in der Weise, dass die Picknadeln in einer 0,3%igen (Vol./Vol.) Lösung aus Wasserstoffperoxid abgebürstet wurden, darauf folgte eine Spülung in 70% Ethanol in einem zweiten Waschbad und eine abschließende Trocknung unter Verwendung eines Hitze-Gewehrs, um alle Reste von Ethanol von den Nadeln zu verdampfen. Des Weiteren wurde ein Algorithmus eingebaut, um durch Bezugnahme auf die Höhe der Oberfläche des Agars in drei Ecken, die Variation in der Höhe des Agars automatisch korrigieren zu können, und aus diesen Punkten wurde automatisch die Oberflächenebene des Agars berechnet. Der Roboter wurde weiterhin so programmiert, dass er sowohl die Bild- als auch die Pickhöhe entsprechend der Höhe der Oberfläche des Agars automatisch justierte, so dass, wenn eine Nadel in eine Kolonie eingestochen wurde, sie nur die Zellen von der Oberfläche der Kolonie entfernte und nicht die ganze Kolonie in das Anzuchtmedium eindrückte. Schließlich bauten wir weitere Auswahlkriterien ein, die zuverlässig zwischen weißen und blauen Kolonien aussortierten. Obwohl der Roboter ein Verfahren bereitstellte, mit dem nur diejenigen „Klümpchen" (Kolonien) ausgewählt wurden, die sich in einem bestimmten Bereich einer Durchschnitts-Grauskala (z. B. > 80 für weiße Kolonien) befanden, stellte sich dies als nicht verläßlich heraus, da der tatsächliche Wert der Durchschnitts-Grauskala, der für eine korrekte Unterscheidung erforderlich war, aufgrund leichter Variationen in der Beleuchtungsintensität über die Agarplatte variierte. Daher wurde ein neues Verfahren eingebaut, das automatisch diesen Unterscheidungswert modifizierte und das auf dem durchschnittlichen Beleuchtungswert eines (kleinen) Bereichs der Agarschale basierte, wie er durch die Kamera auf der Grundlage von Rahmen (Bereich) zu Rahmen (Bereich) gemessen wurde. Oft war eine „blaue" Kolonie, die das Auswertungssystem aktivierte, über ihre gesamte Fläche nicht einheitlich blau, sondern es war nur das Zentrum blau, und das umgebende Zellmaterial war weiß. In solchen Fällen entdeckten die Verbindungs-Algorithmen zwei „Klümpchen" – einen (das blaue Zentrum), das direkt auf dem anderen (der weißen Umgebung) lag, und obwohl das Erste ignoriert wurde, weil es blau war, wurde das Letztere ausgewählt, da sein durchschnittlicher Grauwert größer als der Unterscheidungswert war. Solche Fälle wurde erfolgreich durch Ignorieren jeglicher Kolonien selektiert, die „Löcher" besaßen, dies erfolgte unter Verwendung einer „Zahl-an-Löchern"-Funktion des Bildanalyseprogramms, das diejenigen Klümpchen markierte, die innerhalb ihrer Grenzen ein zweites Klümpchen aufwiesen.
Unter Verwendung dieser Modifikationen an einem Labor-Pickroboter wurden individuelle Hefekolonien automatisch aus den Agarschalen in individuelle Vertiefungen einer sterilen Mikrotiterplatte mit 384 Vertiefungen (Genetix, UK) gepickt, die steriles Minimalmedium ohne Leucin und Tryptophan (SD-Leu-Trp) und 7% (Vol./Vol.) Glycerin enthielt. Die so erhaltenen Mikrotiterplatten wurden 36 Stunden bei 30°C inkubiert, die abgesetzten Kolonien wurden durch kräftiges Mischen unter Verwendung eines Plastik-Werkzeugs zu Replikaherstellung aus 384 Vertiefungen (Genetix, UK) verteilt und dann weitere 2 bis 4 Tage inkubiert. Es wurde ein Pickerfolg von über 90% der Vertiefungen erreicht, die wachsende Hefekulturen enthielten. Nach der Anzucht der Hefestämme in den Mikrotiterplatten wurde jede Platte mit einer unverwechselbaren Nummer und einem Strichcode markiert. Von jeder Platte wurden außerdem zwei Replikaplatten hergestellt, um zwei weitere Kopien zu erzeugen, dies erfolgte unter Verwendung eines sterilen Plastik-Replikators mit 384 Nadeln (Genetix, UK), der dazu verwendet wurde, eine kleine Menge an Zellmaterial aus jeder Vertiefung in vormarkierte Mikrotiterplatten mit 384 Vertiefungen zu übertragen, die mit SD-Leu-Trp-His/7% Glycerin-Flüssigmedium vorher gefüllt worden waren. Die Replikaplatten wurden 3 Tage bei 30°C inkubiert, wobei eine Durchmischung der Zellen nach 36 Stunden vorgenommen wurde, anschließend wurden sie eingefroren und bei –70°C zusammen mit den ursprünglich gepickten Mikrotiterplatten der Wechselwirkungs-Genbank gelagert.
Auf diese Weise wurde ein regelmäßiges Gittermuster an Hefezellen, die potenziell wechselwirkende Hefeclone exprimierten, unter Verwendung eines robotisierten und automatisierten Pick-Systems erzeugt. Die Mikrotiterplatten mit 384 Vertiefungen besitzen alle 4,5 mm eine Vertiefung in einer Anordnung von 16 auf 24 Vertiefungen. Daher wurde für jede Mikrotiterplatte mit 384 Vertiefungen ein regelmäßiges Gittermuster mit einer Dichte von mehr als 4 Clonen pro Quadratzentimeter automatisch erzeugt.
3.2. Die Erzeugung eines regelmäßigen Gittermusters mit erhöhter Dichte
Um Anordnungen mit einer höheren Dichte zu erzeugen, wurde ein Computerkontrolliertes Pipettiersystem für 96 Vertiefungen (Opal-Jena) mit automatischer Plattenstapelung, Spitzen-Waschung, Flüssigabfall-Entsorgung und exakter x-y-Positionierung der Mikrotiterplatte, die gerade mit den Spitzen bearbeitet wird, verwendet. Die Hefe-Zwei-Hybrid-Zellen, die sich am Boden der Vertiefungen der vorstehend beschriebenen Wechselwirkungs-Genbank abgesetzt hatten, wurden resuspendiert, und ein Stapel dieser Platten mit 384 Vertiefungen wurde in den Eingabe-Stapler des Pipettiersystems gestellt. Das System wurde so programmiert, dass es eine einzelne Mikrotiterplatte mit 384 Vertiefungen entnahm, die die angeordneten Hefe-Zwei-Hybrid-Clone enthielt, und parallel 10 μl Kulturmedium und Zellen in jede der 96 Pipettenspitzen aus 96 Vertiefungen der Platte mit 384 Vertiefungen absaugte. Der Abstand zwischen den 96 Spitzen betrug 9 mm und der Abstand zwischen den Vertiefungen der Mikrotiterplatte mit 384 Vertiefungen betrug 4,5 mm, so dass die Zellen jeweils nur aus jeder zweiten Vertiefung entlang jeder Dimension der Mikrotiterplatte mit 384 Vertiefungen entfernt wurden. 8 μl der 96 abgesaugten Proben, die in den Spitzen enthalten waren, wurden dann parallel in eine Reihe an Vertiefungen einer sterilen Mikrotiterplatte mit 1536 Vertiefungen (Greiner, Deutschland) pipettiert. Da der Abstand zwischen den Vertiefungen dieser Mikrotiterplatte mit 1536 Vertiefungen 2,25 mm betrug, wurden die Hefezellen nur in jeder vierten Vertiefung entlang der Dimensionen der Mikrotiterplatte mit 1536 Vertiefungen hinterlegt. Die verbleibenden 2 μl an Kulturmedium und Zellen wurden in den Abfall abgesaugt, bevor die 96 Spitzen parallel sterilisiert wurden. Die Sterilisation erfolgte durch zweimaliges Ansaugen und Waschen mit 50 μl 0,3% (Vol./Vol.) Wasserstoffperoxid, das in einem ersten, wieder auffüllbaren Waschbad im System gelagert war, sowie der Entsorgung im Abfall, und dann durch Ansaugen und Waschen mit 50 μl sterilem Wasser, das in einem zweiten, wieder auffüllbaren Waschbad im System lagerte, sowie der Entsorgung im Abfall.
Dieser Pipettierzyklus von Platte zu Platte wurde 3 weitere Male wiederholt, wobei, durch die Bewegung der Mikrotiterplatten relativ zu den 96 Spitzen unter Verwendung der exakten x-y-Positionierung des Systems, jedesmal eine unterschiedliche Reihe von 96 Clonen aus der Anordnung mit 384 Vertiefungen der Hefe-2-Hybrid-Clone in eine unterschiedliche Reihe von 96 Vertiefungen der Mikrotiterplatte mit 1536 Vertiefungen abgesaugt bzw. überführt wurde. Wenn alle Clone der ersten Mikrotiterplatte mit 384 Vertiefungen in einer Platte mit 1536 Vertiefungen gesammelt und angeordnet waren, wurde die erste Mikrotiterplatte mit 384 Vertiefungen automatisch gegen die nächste Mikrotiterplatte mit 384 Vertiefungen ausgetauscht, und die in dieser zweiten Mikrotiterplatte mit 384 Vertiefungen angeordneten Hefe-2-Hybrid-Clone wurden in ähnlicher Weise in der Mikrotiterplatte mit 1536 Vertiefungen angeordnet. Wenn die in vier Mikrotiterplatten mit 384 Vertiefungen enthaltenen Hefe-2-Hybrid-Clone automatisch in der ersten Platte mit 1536 Vertiefungen angeordnet und alle Vertiefungen gefüllt waren, wurde die Platte mit 1536 Vertiefungen automatisch gegen eine zweite sterile Platte mit 1536 Vertiefungen ausgetauscht, die in der zweiten Stapeleinheit des Pipettierssystem lagerte. Der ganze Vorgang wurde wiederholt, bis alle Hefe-2-Hybrid-Clone der Wechselwirkuags-Genbank aus Mikrotiterplatten mit 384 Vertiefungen in Mikrotiterplatten mit 1536 Vertiefungen automatisch überführt worden waren.
Auf diese Weise wurde ein regelmäßiges Gittermuster an Hefezellen, die potenziell miteinander wechselwirkende Hefeclone exprimierten, unter Verwendung eines Computerkontrollierten Pipettiersystems erzeugt. Die Mikrotiterplatten mit 1536 Vertiefungen besitzen alle 2,25 mm eine Vertiefung in einer Anordnung von 32 auf 48 Vertiefungen. Daher erzeugten wir für jede Mikrotiterplatte mit 1536 Vertiefungen automatisch ein regelmäßiges Gittermuster mit einer Dichte von mehr als 19 Clonen pro Quadratzentimeter.
3.3. Die Erzeugung eines regelmäßigen Gittermusters von Clonen aus einer Wechselwirkungs-Genbank auf porösen Trägern unter Verwendung der Automation
Ein Tüpfelroboter mit hohem Durchsatzvermögen, wie z. B. der von Lehrach et al. (1997) beschriebene, wurde dazu verwendet, poröse, ebene Träger mit einem regelmäßigen Gittermuster mit einer hoher Dichte von Hefeclonen aus der definierten Wechselwirkungs-Genbank zu konstruieren, die in den Mikrotiterplatten mit 384 Vertiefungen enthalten war. Der Roboter zeichnete die Position individueller Clone in dem Gittermuster hoher Dichte durch die Verwendung eines vordefinierten duplizierten Tüpfelmusters und des Strichcodes der Mikrotiterplatte auf. Die individuell nummerierten Membranlagen mit einer Größe von 222 × 80 mm (Hybond N+, Amersham, UK) wurden vorher in SD-Leu-Trp-His-Medium angefeuchtet, vorsichtig auf eine Lage 3 mm dicken Filterpapiers (Whatman) gelegt, das im gleichen Medium vorher angefeuchtet worden war, und in die Aufnahmeeinheit des Roboters gelegt. Die Wechselwirkungs-Genbank wurde als Replikakopie auf den Membranen unter Verwendung eines Tüpfel-Werkzeugs mit 384 Nadeln, das am Roboter befestigt war, automatisch angeordnet. Es wurden fünf unterschiedliche Mikrotiterplatten der ersten Kopie der Wechselwirkungs-Genbank als Replika in einem „3 × 3 duplizierten" Muster um einen zentralen Tinten-Markierungsfleck auf 10 Nylonmembranen aufgetüpfelt – was etwa 1900 aufgetüpfelten Clonen in einer Dichte von etwa 40 Tüpfelpositionen pro cm² entspricht. Auf jede Replikamembran wurden drei unterschiedliche Kontrollclone aufgetragen, die jeweils einer anderen Mikrotiterplatte entnommen wurden, die den gleichen Kontrollclon in jeder Vertiefung enthielt. Ein Kontrollclon exprimierte die Fusionsproteine LexA-SIM1 & GAL4ad-ARNT, ein zweiter Kontrollclon exprimierte das Fusionsprotein LexA-HIP1, während ein Dritter das Fusionsprotein GAL4ad-LexA exprimierte, und alle wurden aufgetüpfelt, um die Eigenschaften der Selektion, der Gegenselektion und des β-Gal-Testansatzes des Verfahrens zu testen. Um abzusichern, dass die Anzahl der Hefezellen in jedem Tüpfel für die Membranen ausreichend war, die auf die Gegenselektions-Medienplatten plaziert werden sollten, wurde der Roboter so programmiert, dass er auf jede Tüpfelposition 5 Mal aus einer leicht unterschiedlichen Position in den Vertiefungen der Mikrotiterplatten auftüpfelte, bzw. die Zellen entnahm. Der Roboter erzeugte eine Datei der Daten in der das hergestellte Tüpfelmuster und der Stichcode, der automatisch von jeder Mikrotiterplatte abgelesen worden war, aufgezeichnet wurden, Jede Membran wurde vorsichtig auf etwa 300 ml Festagarmedium in 24 × 24 cm großen Agarschalen gelegt. Es wurden sechs Membranen auf SD-Leu-Trp-His-Medium überführt, und von den beiden verbleibenden Membranen wurde jeweils eine auf SD-Trp+CHX- oder auf SD-Leu+CAN-Medium überführt. Die Hefekolonien wurden auf der Oberfläche der Membranen 3 Tage durch Inkubation bei 30°C angezogen.
3.4. Die Erzeugung eines regelmäßigen Gittermusters von Clonen aus einer Wechselwirkungs-Genbank auf nicht-porösen Trägern unter Verwendung der Automation
Das Plasmid pGNG1 (MoBiTec, Deutschland) trägt eine Variante des grün-fluoreszierenden Proteins unter der Kontrolle des LexA-Operators. Diese Variante, GFPuv ist bis zu 16-fach heller als die Wildtyp-Variante, die aus Aequora victoria isoliert wurde (Ausubel et al., 1995; Short Protocols in Molecular Biology, 3. Ausgabe, John Wiley & Sons, NY). Der Replikationsursprung des 2 μm-Plasmids der Hefe und der auxotrophe Marker URA3 erhält das Plasmid in ura3-mutierten Hefestämmen aufrecht. Dieses Plasmid sollte als Auswertungssystem dienen, um einzelne Fusionsproteine oder miteinander wechselwirkende Fusionsproteine nachzuweisen, die in der Lage sind, das Auswertungssystem bei dem hierin beschriebenen Verfahren der Erfindung zu aktivieren. Wie im Fachgebiet bekannt ist, werden das grün-fluoreszierende Protein und seine Varianten als geeignete Reportergene in den meisten Wirtszelltypen angesehen. Daher sollte es für Fachleute möglich sein, dieses Gen in andere Wirtzelltypen und Wechselwirkungssysteme als diejenigen einzubauen, die in dieser Erfindung offenbart werden.
Der Hefestamm L40ccu wurde mit dem Plasmid pGNG1 (MoBiTec, Deutschland) unter Verwendung des Verfahrens von Schiestel & Gietz (1989) transformiert, und es wurde ein so erhaltener, stabil transformierter Clon in Minimalmedium ohne Uracil angezogen und anschließend dazu verwendet, zwei weitere Hefeclone zu erzeugen, von denen jeder zwei genetische Elemente enthielt. Der erste Stamm, GNGp, wurde durch Kotransformation eines Gemisches der Plasmide pBTM117c-SIM1 und pGAD4ad-ARNT in L40ccu erzeugt, der bereits das Reporter-Plasmid pGNG1 enthielt. Der zweite Stamm, GNGn, wurde durch Kotransformation eines Gemisches der Plasmide pBTM117c-MJD und pGAD427-14-3-3 in L40ccu erzeugt, der bereits das Reporter-Plasmid pGNG1 enthielt. In beiden Fällen wurde die Transformation unter Verwendung des Verfahrens von Schiestel & Gietz (1989) durchgeführt, und die Transformanten wurden durch Plattierung auf Minimalmedium ohne Uracil, Tryptophan und Leucin selektiert.
Individuelle Kolonien aus den beiden Transformationen wurden in die individuellen Vertiefungen von Mikrotiterplatten mit 384 Vertiefungen wie in Abschnitt 3.1. beschrieben gepickt, mit der Ausnahme, dass die Mikrotiterplatten flüssiges Minimalmedium ohne Uracil, Tryptophan und Leucin enthielten. Es wurde eine Mikrotiterplatte erzeugt, die individuelle Kolonien des GNGp-Hefestammes enthielt, und eine andere, die Kolonien des GNGn-Stammes enthielt. Unter Verwendung eines Tüpfelroboters (Lehrach et al., 1997), der mit einem hochpräzisen Tüpfel-Werkzeug ausgerüstet war, das 16 Nadeln in einem 4 × 4-Muster trug, wurden die Clone auf mit Polylysin beschichteten Glas-Objektträgern (Sigma, US) angeordnet. Die Clone wurden in einem Abstand von 440 μm mit einem Tüpfeldurchmesser von etwa 300 μm aufgetragen, was eine Dichte von über 490 Clonen pro Quadratzentimeter ergab. Um die Menge an Zellmaterial zu erhöhen, die in jedem Tüpfel hinterlegt wurde, wurde der Roboter so programmiert, dass er jeden Tüpfel 10 Mal aus einer leicht unterschiedlichen Position aus den Vertiefungen der Mikrotiterplatten betüpfelte bzw. die Zellen entnahm. Es ist im Fachgebiet wohlbekannt, dass Piezo-Tintenstrahl-Mikropipettiersysteme (Kietzmann et al., 1997, Schober et al., 1993) ein regelmäßiges Gittermuster an Clonen sogar mit einer noch höheren Dichte erzeugen können. Tatsächlich wurden Gitterdichten von über 1600 Tüpfeln pro Quadratzentimeter mit solchen Systemen erreicht.
Das Fluoreszenz-Auswertungssystem der Zellen im regelmäßigen Gittermuster der Zellen wurde dann unter Verwendung einer empfindlichen CCD-Kamera (LAS1000, Fuji, Japan) sichtbar gemacht. Es wurde das geeignete Anregungslicht bereitgestellt, und ein Emissionsfilter, der sich für das Emissionsspektrum des GFP_uv eignete, wurde an der Linse befestigt. Es können auch andere bilderzeugende Systeme verwendet werden, um das regelmäßige Gittermuster der Clone zu untersuchen. Zum Beispiel werden Beobachtungssysteme mit Laserabtastung (laser-scanning systems) einschließlich mit Laserlicht abtastende konfokale Mikroskope bevorzugt, wenn die Bilderzeugung mit regelmäßigen Gittermustern sehr hoher Dichte durchgeführt wird, oder bei denjenigen Mustern, die aus einer kleinen Zahl an Wirtszellen gebildet werden, die an jeder Position hinterlegt sind.
Es würde gezeigt, dass die Fusionsproteine LexA-SIM1 und GAL4ad-ARNT miteinander in Wechselwirkung treten und ein Auswertungssystem unter Kontrolle des LexA-Operators aktivieren können. Da sich das GNG_uv-Reportergen unter der Kontrolle des LexA-Operators befindet, sollte eine Zelle, die das pGNG1-Plasmid trägt und diese Fusionsproteine exprimiert, unter UV-Licht fluoreszieren. Im Gegensatz dazu wurde gezeigt, dass die Fusionsproteine LexA-MJD und GAL4-14-3-3 nicht in der Lage waren, das gleiche Auswertungssystem zu aktivieren. Die Bildanalyse der digitalen Aufnahme des regelmäßigen Gittermusters der Hefezellen zeigte tatsächlich, dass der GNGp-Hefestamm fluoreszierte, während der GNGn-Stamm dies nicht tat.
Als Alternative zu pGNG1 könnte ein Fachmann eine verbesserte GFP-Mutante subclonieren, wie z. B. in Anderson et al. (1996) beschrieben wurde. Der Ersatz der URA codierenden Sequenz in pLUA durch das GFP wird unter Verwendung eines geeigneten Ankerprimers durchgeführt, um die GFP-Mutante zu amplifizieren. Unter Verwendung des geeigneten Anzuchtmediums kann die Analyse wie vorstehend beschrieben durchgeführt werden.
Beispiel 4: Nachweis des Auswertungssystems in einem regelmäßigen Gittermuster
4.1. Nachweis der Aktivierung des Auswertungssystems in einem regelmäßigen Gittermuster von Clonen aus einer Wechselwirkungs-Genbank auf ebenen Trägern unter Verwendung der digitalen Bildaufzeichnung, -verarbeitung und -analyse
Es wurden zwei Membranen von jedem der Selektionsmedien, die in Abschnitt 3.3. beschrieben wurden, auf die Expression von lacZ unter Verwendung des β-Gal-Testansatzes, wie durch Breeden & Nasmyth (1985) beschrieben, hin untersucht und über Nacht an der Luft getrocknet. Für jede Membran wurde ein digitales 24-Bit-BMP(Bitmap)-Bild des β-Gal- Testansatzes unter Verwendung eines Standard-A3-Computerscanners aufgezeichnet, und die Bilder wurden im Computer aufbewahrt. Der Hefestamm, der dazu verwendet worden war, die definierte Wechselwirkungs-Genbank zu erzeugen, war eine ade2-auxotrophe Mutante, und diejenigen Kolonien, die wuchsen, aber das Auswertungssystem nicht aktivierten, besagen im reifen Zustand eine rosa Färbung. Da die Bildanalyseprogramme, die zu Analyse von DNA-Gittern verwendet werden, Einkanal (Grauwertskala)-Bilder verwenden, war es nötig, dieses Farbbild in ein 8-Bit-Grauwertskala-Bild umzuwandeln. Die rosa Färbung der Kolonien, die das β-Gal-Reportergen nicht aktivierten, vermindert jedoch den Kontrast zwischen positiven und negativen Aktivierungszuständen des Auswertungssystems, wenn die (Bilder der Kolonien) in eine Grauwertskala umgewandelt werden. Daher wurden die rosarötlichen Farben eines Bildes zu schwach gelb hin neukartiert (umgewandelt), bevor das neukartierte 24-Bit-Farbbild zu einer farbumgekehrten 8-Bit-Grauwertskala-TIFF-Datei (tagged image file format) unter Verwendung der Software Photo Magic (Micrografix, USA) weiter verarbeitet wurde. Ein nicht farbumgekehrtes 8-Bit-Grauwertskala Bild der definierten Wechselwirkungs-Genbank, die auf Membranen angezogen worden war, die auf jedes der 3 Selektionsmedien plaziert und anschließend auf β-Gal-Aktivität hin untersucht worden war, wird in 10 gezeigt.
Es können individuelle Clone der Wechselwirkungs-Genbank identifiziert werden und ihre Position auf dem in hoher Dichte betüpfelten Filter kann spezifischen Vertiefungen in den Mikrotiterplatten unter Verwendung eines automatisierten Bildanalyse-Systems, wie in Lehrach et al. (1997) beschrieben, zugeordnet werden. Hierbei wird die grundlegende Gitter- und Knoten-Position jedes Clons durch ein iteratives Probensammelschema bestimmt, wie es von Geman & Geman (1984) vorgeschlagen wurde. Nachdem die Knotenpositionen bestimmt worden sind, wird der durchschnittliche Grauskalenwert einer Pixelmaske, die auf den durchschnittlichen Koloniedurchmesser in der Größe angepasst wurde, für jede Kolonie auf dem Filter aus dem Bild aufgezeichnet. Aus diesen Intensitätsdaten, werden anhand des allgemeinen und des Blockbereich-spezifischen Hintergrunds Korrekturen vorgenommen, die dem örtlichen Blockbereich-Hintergrund ein größeres Gewicht verleihen. Jede Kolonie wird dann in eine von vier β-Galactosidase-Aktivitätsklassen durch die geeigneten Binnen-Werte (?) der auf den Hintergrund korrigierten Intensitäten, eingeordnet.
Positive Clone, die miteinander wechselwirkende Fusionsproteine exprimierten, wurden gegenüber falsch-positiven Clonen nachgewiesen, dies erfolgte unter Berücksichtigung der Aktivität der β-Galactosidase der Clone, die auf den betüpfelten Membranen gewachsen waren, die auf die unterschiedlichen Selektionsmedien gelegt worden waren. Positive Clone sollten das LacZ-Reportergen auf SD-Leu-Trp-His-Medium aktivieren und sich bei der Inkubation in X-Gal-Lösung blau färben, aber nicht auf irgendeinem der beiden anderen Gegenselektionsmedien. Falsch-positive Clone sollten das Reportergen aktivieren und sich bei der Inkubation in X-Gal-Lösung auf mindestens einen Gegenselektionsmedium, sowie auf SD-Leu-Trp-His-Medium blau färben.
11 zeigt vergrößerte Aufnahmen eines β-Gal-Testansatzes von Clonen, die auf den Membranen gewachsen waren, die auf die drei selektiven Medien gelegt worden waren. Im vergrößerten Bereich der Membranen, die in 11a gezeigt werden, wurden zwei Clone als positive Clone nachgewiesen, die miteinander wechselwirkende Fusionsproteine exprimieren, da diese das lacZ-Reportergen auf SD-Leu-Trp-His-Medium aktivierten, aber nicht auf irgendeinem der beiden Gegenselektionsmedien, und ihre aufgetüpfelten Positionen sind umringt. Die beiden Clone wurden durch ihre Adresse auf der Mikrotiterplatte in der Wechselwirkungs-Genbank als 06L22, beziehungsweise als 08N24 identifiziert. Alle anderen Clone, die in diesem Bereich der Membran aufgetüpfelt worden waren, wurden als falsch-positive Clone nachgewiesen, da sie die β-Galactosidase sowohl auf SD-Trp+CHX-Medium als auch auf SD-Leu-Trp-His-Medium exprimierten.
Die Expression des LacZ-Reportergens der drei Kontrollclone, die auf die gleichen Membranen aufgetragen worden waren, bestätigen diese Ergebnisse. Der positive Kontrollclon, der die miteinander wechselwirkenden Fusionsproteine LexA-SIM1 & GAL4ad-ARNT exprimierte, sollte einen LacZ+-Phänotyp bei Anzucht auf SD-Leu-Trp-His-Medium aufweisen, aber einen LacZ(minus)-Phänotyp, wenn er auf irgendeinem der beiden Gegenselektionsmedien angezogen wird. Dieser Kontrollclon wurde an der Position 03 im Bereich der Membranen aufgetragen, die in 11b gezeigt werden, ein Beispiel ist umringt. Das Muster der β-Gal-Aktivität dieses positiven Kontrollclons auf den drei Selektionsmedien ist wie vorhergesagt. Der falsch-positive Clon, der das Fusionsprotein LexA-HIP1 exprimiert, und der falsch-positive Clon, der das Fusionsprotein GAL4ad-LexA exprimiert, sind an Position 02, beziehungsweise 01 aufgetragen. Beide falsch-positiven Kontrollclone zeigen einen LacZ+-Phänotyp, wenn sie auf SD-Leu-Trp-His-Medium angezogen werden, aber sie werden als falsch-positive Clone durch das Verfahren der Erfindung nachgewiesen, da sie auch auf SD-Leu+CAN-, beziehungsweise SD-Trp+CHX- Medium einen LacZ+-Phänotyp aufweisen. Die Clone, die an Position 04 aufgetüpfelt wurden, sind aus der definierten Wechselwirkungs-Genbank, und aus ihrem LacZ+-Phänotyp kann nach Anzucht auf SD-Leu+CAN-Medium vorhergesagt werden, dass es sich um falsch-positive Clone handelt.
Das Bildanalyse-System, das vorstehend beschrieben wurde, wurde dazu verwendet, automatisch diejenigen individuellen Clone auf jedem regelmäßigen Gittermuster hoher Dichte zu identifizieren, die das LacZ-Auswertungssystem aktiviert hatten. Dies wurde für jede der Membranen durchgeführt, die auf die drei Selektionsmedien gelegt worden waren, und die Intensität der β-Galactosidase-Aktivität jedes Clon, der auf den drei Medien angezogen worden war, wurde durch das Programm unter Verwendung einer Skala von 0 bis 3 (keine Aktivität, schwache Aktivität, mittlere Aktivität, hohe Aktivität) automatisch aufgezeichnet. Diese Daten für alle Clone einer bestimmten Membran würden in einer Computerdatei gespeichert, und die β-Galactosidase-Aktivität eines bestimmten Clons wurde zu seiner Aktivität bei der Anzucht auf den beiden anderen Selektionsmedien unter Verwendung des Computerprogramms in Beziehung gesetzt. Dieses Programm wurde dazu verwendet, alle Clone der Wechselwirkungs-Genbank abzufragen und zu identifizieren, die das Reportergen aktiviert hatten, wenn sie auf SD-Leu-Trp-His gewachsen waren (Werte über 0), aber nicht auf irgendeinem der Gegenselektionsmedien (Werte auf beiden Medien gleich 0). 12a zeigt eine Untergruppe dieser Clone, die unter Verwendung dieses Daten-Abfrage-Verfahrens identifiziert wurden, und 12b zeigt, dass die beiden Clone 06L22 und 08N24 innerhalb dieser automatisch identifizierten Datengruppe positiver Clone zu finden sind.
4.2. Nachweis der Aktivierung des Auswertungssystems in einem regelmäßigen Gittermuster von Clonen aus einer Wechselwirkungs-Genbank in Mikrotiterplatten unter Verwendung der digitalen Bildaufzeichnung, -verarbeitung und -analyse
Die Wechselwirkungs-Genbank, die die Hefezellen wie in Abschnitt 3.1. beschrieben, umfaßte, wurde im Mikrotiterplatten-Format durchmustert, um diejenigen Zellen zu identifizieren, die miteinander wechselwirkende Fusionsproteine exprimierten. Zuerst wurden die Mikrotiterplatten, die die Wechselwirkungs-Genbank enthielten, aus dem Gefrierlager entnommen und auf Zimmertemperatur aufgetaut. Zum Zweiten wurde jede Platte Replikaplattiert und markiert, wie in Abschnitt 3.1. beschrieben, um zusätzliche Kopien für die Durchmusterung jeder Platte in den 3 getrennten Selektionsmedien zu erzeugen. Die Zellen wurden in Mikrotiterplatten mit 384 Vertiefungen übertragen, die mit 40 μl der flüssigen Selektionsmedien SD-Leu-Trp, SD-Leu+CAN oder SD-Trp+CHX vorher gefüllt worden waren. Zum Dritten wurden nach der Anzucht bei 30°C über 4 Tage 10 μl eines Ein-Schritt-Hefe-Lysepuffers zugegeben, der Galacton-Star und Sapphire II (Tropix, US) enthielt, die Zellen wurden unter Verwendung eines Plastik-Replika-Werkzeuges verteilt, und die Platten wurden 40 Min. bei 37°C inkubiert. Abschließend wurde eine digitale Aufnahme von sechs Platten gleichzeitig unter Verwendung einer LAS1000-CCD-Kamera (Fuji, Japan) gemacht, wobei die Platten Seite an Seite in einer 2 × 3-Anordnung angeordnet wurden. Die β-Galactosidase-Substrate, Galacton-Star in Kombination mit Sapphire II (Tropix, US), erzeugen nach der Aktivierung des β-Gal-Reportergens ein nachweisbares lumineszentes Licht in den Hefezellen, und es wurde eine Belichtungszeit von 5 Minuten verwendet, um ein ausreichendes Signal zu erhalten. Die Grauwertskala-Digitalbilder wurden aufgenommen, auf einem Computer gespeichert und anschließend unter Verwendung des Bildanalyse-Systems analysiert, das in Abschnitt 4.1. beschrieben wurde. In diesem Fall war jedoch die Position jedes Clons aufgrund der geringeren Dichte des regelmäßigen Gittermusters der Clone in der Mikrotiterplatte viel einfacher zu bestimmen. Zweitens betrug die Größe der Pixelmaske, die dazu verwendet wurde, die durchschnittliche Pixel-Intensität zu messen, in etwa der Größe einer Vertiefung in der Mikrotiterplatte. Die positiven Clone in den sechs Mikrotiterplatten wurden durch eine Bildanalyse der Digitalaufnahmen der Clone identifiziert, die in den drei Selektionsmedien angezogen worden waren, und diese Daten wurden durch das in Abschnitt 4.1. beschriebene Computerprogramm weiter verarbeitet.
Beispiel 5: Die Identifizierung individueller Mitglieder der Wechselwirkung
Die Wechselwirkungs-Genbank, die für dieses Beispiel konstruiert wurde, setzte sich aus bekannten Fusionsproteinen mit vorhergesagten Wechselwirkungen zusammen, wie sie in 8 gezeigt werden. Von einem wirklich positiven Clon aus dieser definierten Wechselwirkungs-Genbank wird daher erwartet, dass er die wechselwirkenden Fusionsprotein-Paare LexA-SIM1 & GAL4ad-ARNT, LexA-HD1.6 & GAL4ad-HIP1 oder LexA-HD3.6 & GAL4ad-HIP1 exprimiert und daher die entsprechenden Paare der Plasmidkonstrukte enthält, d. h. pBTM117c-SIM1 & pGAD427-ARNT, beziehungsweise pBTM117c-HD1.6 & pGAD427-HIP1 oder pBTM117c-HD3.6 & pGAD427-HIP1. Die Identifizierung dieser individuellen Mitglieder, aus denen sich eine Wechselwirkung zwischen Fusionsproteinen zusammensetzt, die in einer einzelnen Zelle exprimiert werden, kann über eine Vielzahl an Mittel erfolgen, wie in 1, 6 und 7 dargelegt. Es wurden drei voneinander unabhängige Verfahren angewendet, d. h. die Nucleinsäure-Hybridisierung, die PCR und die DNA-Sequenzierung, um die individuellen Plasmidkonstrukte, die die miteinander wechselwirkenden Fusionsproteine exprimierten, in den positiven Clonen 06L22 und 08N24 zu identifizieren.
5.1. Die Identifizierung individueller Mitglieder der Wechselwirkung durch Nucleinsäure-Hybridisierung
Die vier Membranen, die auf SD-Leu-Trp-His-Medium plaziert und nicht für die Untersuchung der β-Gal-Aktivität verwendet worden waren, wurden gemäß der in Larin & Lehrach (1990) beschriebenen Prozedur weiter verarbeitet, um die DNA, die in den Clonen der Wechselwirkungs-Genbank enthalten war, auf die Oberfläche der Membran zu fixieren. Ein 1,1 kb großes SIM1-DNA-Fragment und ein 1,3 kb großes ARNT-DNA-Fragment wurden zur Verwendung als Hybridisierungssonde durch das Standard-Verfahren mit zufallsverteilten Primern (random priming) radioaktiv markiert (Feinberg & Vogelstein, 1983). Jede Probe wurde 10 Min. bei 95°C hitzedenaturiert und über Nacht bei 65°C in 15 ml 5% SDS/0,5 M Natriumphosphat (pH 7,2)/1 mM EDTA mit einer in hoher Dichte betüpfelten Membran mit DNA aus der Wechselwirkungs-Genbank hybridisiert, die wie vorstehend beschrieben an sie fixiert worden war. Die Membranen wurden einmal 20 Min. in 40 mM Natriumphosphat/0,1% SDS bei Zimmertemperatur und einmal 20 Min. bei 65°C gewaschen, bevor jede Membran in Zellophanfolie eingeschlagen und über Nacht gegenüber einer Phosphor-Speicher-Folie (Molecular Dynamics, USA) exponiert wurde. Durch Scannen der Phosphor-Speicher-Folie unter Verwendung eines Phosphor-Imagers (Molecular Dynamics, USA) wurde eine digitale Aufnahme jeder hybridisierten Membran erhalten. Die digitale Aufnahme wurde im Computer gespeichert und analysiert, dies erfolgte unter Verwendung des Bildanalyse-Systems zur Analyse von DNA-Anordnungen, das positive Hybridisierungssignale mit quadratischen Kästchen markierte, wie in Lehrach et al., 1997 beschrieben. 13 zeigt einen vergrößerten Bereich jeder hybridisierten Membran, der demjenigen entspricht, der in 11a gezeigt wurde, und der die Clone 06L22 und 08N24 enthält, deren die aufgetüpfelte Positionen umringt sind. Es wurde vorhergesagt, dass diese Clone die wechselwirkenden Paare der Fusionsproteine exprimieren, d. h. entweder LexA-SIM1 & GAL4ad-ARNT, LexA-HD1.b & GAL4ad-HIP1 oder LexA-HD3.6 & GAL4ad-HIP1, und die Hybridisierung mit der spezifischen SIM1- und der ARNT-Sonde zeigten, dass beide Clone die Plasmidkonstrukte pBTM117c-SIM1 und pGAD427-ARNT enthielten.
5.2. Die Identifizierung der individuellen Mitglieder der Wechselwirkung durch Nucleinsäure-Amplifikation und Sequenzierung
Der individuelle Clon 06L22 wurde aus den eingefrorenen Platten der Original-Wechselwirkungs-Genbank entnommen und in SD-Leu-Trp-His-Flüssigmedium augeimpft. Diese Kultur wurde 3 Tage bei 30°C wachsen gelassen, und die entsprechenden Plasmide, die in dem Clon enthalten waren, wurden unter Verwendung des QiaPrep-Verfahrens (Qiagen, Hilden) isoliert. Eine Duplex-PCR wurde dazu verwendet, die inserierten Fragmente, die in den Plasmidkonstrukten enthalten waren, unter Verwendung von Primerpaaren, die entweder für das pBTM117- oder das pGAD427-Plasmid spezifisch waren, gleichzeitig zu amplifizieren. Die Anwesenheit der SIM1- und der ARNT-Insertion wurde für Clon 06L22 durch Elektrophorese der amplifizierten PCR-Produkte mit getrennten Kontrollamplifikationen der inserierten Fragmente der Plasmide pBTM117c-SIM1 und pGAD427-ARNT als Größenmarkern bestätigt (14).
Die PCR der individuellen inserierten Fragmente der individuellen Plasmide, die im Clon 06L22 enthalten waren, wurde wie vorstehend beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, dass nur das entsprechende Primerpaar für ein bestimmtes Plasmid verwendet wurde. Die individuellen inserierten Fragmente wurden unter Verwendung eines Gesamt-Hefezellen-PCR-Kits (Bio 101, USA) auch direkt aus der Hefekultur amplifiziert. Das Paar der inserierten Fragmente, die aus dem Clon 06L22 entweder durch Amplifikation aus der extrahierten Plasmid-DNA oder durch direkte PCR des Hefeclons amplifiziert worden war, wurde einer DNA-Sequenzierung nach Standardprotokollen unterzogen.
Das 1,26 kb große inserierte Fragment, das unter Verwendung der für das Plasmid pBTM117 spezifischen Primer amplifiziert worden war, wurde durch Vergleich mit der bekannten Sequenz für dieses Gen (Probst et al., 1997) als das erwartete Fragment des SIM1- Gens bestätigt. In ähnlicher Weise wurde das 1,37 kb große inserierte Fragment, das unter Verwendung der für das Plasmid pGAD427 spezifischen Primer amplifiziert worden war, als das erwartete Fragment des ARNT-Gens bestätigt.
Beispiel 6: Nachweis und Identifizierung miteinander wechselwirkender Proteine unter Verwendung einer automatisierten Anwendung des verbesserten 2-Hybridsystems im Großmaßstab
Ein Schema, das das Verfahren der Erfindung in einem im Großmaßstab angelegten und automatisierten Ansatz zum parallelen Nachweis von Clonen, die miteinander wechselwirkende Fusionsproteine exprimieren, und der Identifizierung von Mitgliedern, aus denen sich die Wechselwirkungen zusammensetzten, verwendet, wird in 6 gezeigt. Hefeclone aus einer „Wechselwirkungs-Genbank", die miteinander wechselwirkende Proteine exprimieren, werden im Großmaßstab durch die Verwendung der visuellen Inspektion oder der digitalen Bildverarbeitung und -analyse von in hoher Dichte gerasterten Membranen identifiziert, auf denen ihre β-Galactosidase-Aktivität nach der Anzucht auf verschiedenen selektiven Medien untersucht worden ist. Die in den vorangegangenen Beispielen beschriebenen automatisierten Verfahren werden dazu verwendet, die Herstellung der Wechselwirkungs-Genbank und der in hoher Dichte betüpfelten Membranen, sowie die Analyse der digitalen Aufnahmen des β-Gal-Testansatzes und der Aufnahmen der Hybridisierung(ergebnisse) zu vorzunehmen.
6.1. Die Herstellung einer Wechselwirkungs-Genbank für einen höheren Eukaryonten
Eine durch Verwendung von zufällig verteilten Primern hergestellte und größenselektierte (1–1,5 kb) cDNA-Genbank von Seeigel-Embryonen (Strongylocentrotus purpuratus) im Entwicklungsstadium 40 Stunden nach der Befruchtung, die in die NotI/SalI-Schnittstellen von pSport1 (Life Technologies, USA) durch Standardverfahren cloniert worden war, wurde als Geschenk von A. Poustka erhalten. 100 ng dieser Genbank, die die geschätzten 6000 unterschiedlichen Transkripte repräsentiert, die in diesem Entwicklungsstadium exprimiert werden (Davidson, 1986), wurde in elektrokompetente E. coli-Zellen durch Standard-Elektroporationsverfahren transformiert. Die rekombinierten Clone wurden durch die Plattierung des Transformationsgemisches auf 2 × YT/100 μg/ml Ampicillin selektiert, das in 24 × 24 cm großen Agarschalen (Genetix, UK) enthalten war. Nach 18 Stunden Anzucht bei 37°C wurden die so erhaltenen rekombinanten Kolonien (schätzungsweise 20.000 pro Schale) mit 50 ml flüssigem LB-Medium für jede Schale von den 5 Schalen abgewaschen. Die amplifizierte cDNA-Genbank, die in pSport cloniert worden war, wurde aus diesem Wasch-Gemisch durch das QiaPrep-Plasmid-Extraktionsverfahren (Qiagen, Deutschland) isoliert. Dann wurden etwa 1 μg der inserierten Fragmente der Genbank aus der Plasmid-DNA durch Verdau mit NotI/SalI isoliert und durch Reinigung über ein Agarosegel unter Verwendung von Standardverfahren der Größe nach selektiert (1–1,5 kb).
Durch NotI/SalI-Verdau und Vereinigung von jeweils 1 μg der Vektoren pGAD428 a, b & c, beziehungsweise pBTM118 a, b & c wurden zwei Sammlungen hergestellt, die alle drei Leseraster der beiden Vektorenreihen pGAD428 und pBTM118 repräsentierten. Das Gemisch der inserierten Fragmente, das wie vorstehend isoliert worden war, wurde in zwei gleiche Fraktionen aufgeteilt, und 300 ng wurden mit 50 ng jeder hergestellten Sammlung der Vektorenreihen ligiert. Nach der Ligierung wurde dann jedes Reaktionsgemisch getrennt in elektrokompetente E. coli-Zellen transformiert, und rekombinierte Clone jeder Genbank wurden auf fünf 24 × 24 cm große Platten unter Verwendung von Kanamycin für die pGAD428-, beziehungsweise Ampicillin für die pBTM118-Genbank selektiert. Etwa 500 μg der pBTM118- und 500 μg der pGAD428-Genbank wurden aus den beiden Reihen der E. coli-Transformanten durch Abwaschen der ausplattierten Zellen und eine anschließende QiaPrep-Plasmid-Extraktion des Wasch-Gemisches wie vorstehend beschrieben extrahiert.
Um die Wechselwirkungs-Genbank zu erzeugen, wurden äquivalente molare Mengen der DNA-Binde- und der Aktivierungs-Domäne-Genbank vereinigt, und 20 μg dieses Gemisches wurden in den Hefestamm L40cc durch das Verfahren von Gietz et al. (1992) kotransformiert. Das so erhaltene Transformationsgemisch wurde auf eine einzelne 24 × 24 cm große Agarschale ausplattiert. Die Agarschalen wurden wie in Abschnitt 1.3.1. beschrieben hergestellt. Insgesamt wurden 20 Transformationen hergestellt und auf getrennte Agarschalen plattiert, was durchschnittlich 1500 Hefekolonien pro Schale nach 7 Tagen Inkubation bei 30°C ergab.
6.2. Die Erzeugung eines regelmäßigen Gittermusters einer Wechselwirkungs-Genbank in Mikrotiterplatten
Um ein regelmäßiges Gittermuster der Wechselwirkungs-Genbank zu erzeugen, wurden die Agarschalen, die die Hefekolonien enthielten, in den modifizierten Labor-Pickroboter gestellt, und individuelle Clone wurden wie in Abschnitt 3.1. beschrieben automatisch gepickt. Insgesamt wurden 30 Mikrotiterplatten mit 384 Vertiefungen erzeugt, und diese stellten eine Wechselwirkungs-Genbank mit mehr als 10.000 Clonen des untersuchten Organismus dar. Nach der Anzucht der Hefeclone in den Vertiefungen der Mikrotiterplatten, wurde die Genbank Replika-plattiert, um 3 weitere Kopien zu erzeugen, dann wurden diese markiert, und alle Kopien wurden bei –70°C gelagert, um sie für eine Analyse zu einem späteren Zeitpunkt bereitzuhalten, wie in Abschnitt 3.1. beschrieben.
6.3. Die Erzeugung eines regelmäßigen Gittermusters einer Wechselwirkungs-Genbank auf ebenen Trägern
Um eine wirkungsvolle Analyse der Wechselwirkungs-Genbank bereitzustellen, wurden die Clone, aus denen sie sich zusammensetzte, in hoher Dichte auf 222 × 222 mm große poröse Membranen (Hybond N+, Amersham, UK) unter Verwendung des in Abschnitt 3.3. beschriebenen Verfahrens angeordnet. Insgesamt wurden zwanzig Replika-Membranen, von denen jede in einem regelmäßigen „duplizierten 3 × 3" Gittermuster der Clone angeordnet war, unter Verwendung von 23 Mikrotiterplatten mit 384 Vertiefungen aus einer aufgetauten Kopie der aufbewahrten Wechselwirkungs-Genbank angefertigt. Auf jeder Replika-Membran wurde zusätzlich eine Mikrotiterplatte in Position 24 angeordnet, die 8 unterschiedliche Kontrollclone enthielt, die bekannte positive, negative und falsch-positive Clone repräsentierten. Dieses Muster entspricht über 9.000 Hefe-Zwei-Hybrid-Clonen, die in einer Dichte von etwa 40 Clonen pro cm² aufgetragen wurden. Um abzusichern, dass die Zahl der Hefezellen in jedem Tüpfel für die vier Membranen ausreichte, die auf die Platten mit Gegenselektions-Medien gelegt werden sollten, wurde der Roboter so programmiert, dass er auf jede Tüpfelposition 5 Mal aus einer leicht unterschiedlichen Position in den Vertiefungen der Mikrotiterplatten auftüpfelte bzw. die Zellen entnahm. Der Roboter erzeugte eine Datei der Daten, in der das hergestellte Tüpfelmuster und der Strichcode, der automatisch von jeder Mikrotiterplatte abgelesen wurden, aufgezeichnet wurde.
Jede Membran wurde vorsichtig auf etwa 300 ml Festagarmedium in 24 × 24 cm großen Agarschalen gelegt. Es wurden vierzehn Membranen auf SD-Leu-Trp-His-Medium übertragen und jeweils drei der Membranen, die fünfmal betüpfelt worden waren, wurden entweder auf SD-Trp+CHX- oder auf SD-Leu+CAN-Medium übertragen. Die Hefekolonien wurden durch 3 Tage Inkubation bei 30°C auf der Oberfläche der Membran angezogen.
6.4. Nachweis des Auswertungssystems in einem regelmäßigen Gittermuster und Analyse unter Verwendung der digitalen Bildanalyse, zur Identifizierung positiver Clone
Um die wirkungsvolle Identifizierung individueller Clone bereitzustellen, die miteinander wechselwirkende Fusionsproteine exprimierten, wurde der Aktivierungszustand der individuellen Clone, die auf den porösen Trägern angezogen worden waren, in hochgradig paralleler Weise untersucht. Die Replika-Anordnungen der Wechselwirkungs-Genbank, die auf den sechs Membranen angezogen worden waren, welche auf die Gegenselektionsmedien gelegt worden waren, sowie drei weitere Membranen, die, wie vorstehend beschrieben, auf SD-Leu-Trp-His-Medium gelegt worden waren, wurden auf ihre lacZ-Aktivität hin untersucht, und es wurde von jeder Membran ein digitales Bild aufgenommen und wie in Abschnitt 1.4.1. beschrieben weiter verarbeitet. 15 zeigt ein Grauwertskala-Bild der Aktivierung des Auswertungssystems für individuelle Clone aus der Wechselwirkungs-Genbank, die in einem regelmäßigen Gittermuster auf einem Membranfilter angeordnet und auf SD-Leu-Trp-His-Medium angezogen worden waren.
Der Aktivierungszustand des Auswertungssystems für jeden individuellen Clon in dem regelmäßigen Gittermuster, der auf den drei selektiven Medien angezogen worden war, wurde aus jeder digitalen Aufnahme unter Verwendung des in Abschnitt 4.1. beschriebenen Bildanalyse-Systems aufgezeichnet. Diese Daten wurden für die Wechselwirkungs-Genbank, die auf den drei Replikamembranen angezogen worden war, für jedes der drei Selektionsmedien SD-Leu-Trp-His, SD-Leu+CAN und SD-Trp+CHX gesammelt, und sie (die Daten) wurden für jeden individuellen Clon unter Verwendung des in 12a gezeigten Computerprogramms zueinander in Beziehung gesetzt.
Dieses Programm wurde dazu verwendet, die Daten abzufragen und diejenigen Clone zu identifizieren, die das Auswertungssystem aktiviert hatten, wenn sie auf zwei von drei SD-Leu-Trp-His-Replika-Membranen gewachsen waren, aber nicht, wenn sie auf irgendeiner der beiden Reihen der drei Replika-Membranen gewachsen waren, die auf die beiden Gegenselektionsmedien SD-Leu+CAN oder SD-Trp+CHX plaziert worden waren. Die Datenbank identifizierte die acht verschiedenen Kontrollclone korrekt, von denen jeder in 48 Vertiefungen der 24. Mikrotiterplatte angeordnet worden war. Insgesamt wurden 7.539 Clone aus der Wechselwirkungs-Genbank, die in 23 Mikrotiterplatten mit 384 Vertiefungen angeordnet war, als positive Clone identifiziert – Clone, die das Auswertungssystem nur dann aktiviert hatten, wenn beide Plasmide (und somit die Fusionsproteine) in der Zelle exprimiert worden waren. 3983 Clone wurden als falsch-positive Clone identifiziert, da sie das Auswertungssystem auch dann aktiviert hatten, wenn sie auf SD-Trp+CHX-Medium angezogen worden waren, d. h. dem Anzuchtmedium, das die Plasmide eliminierte, die das Fusionsprotein mit der Aktivierungsdomäne exprimierten. 113 Clone wurden durch Aktivierung des Auswertungssystems als falsch-positive Clone identifiziert, wenn sie auf SD-Leu+CAN-Medium angezogen worden waren, d. h. dem Anzuchtmedium, das die Plasmide eliminierte, die das Fusionsprotein mit der DNA-Bindedomäne exprimierten. Diese Daten wurden automatisch in einer Tabelle der relationalen Datenbank zur Verfügung gestellt, die, wie in Beispiel 7 beschrieben, die Information über jeden Clon der Wechselwirkungs-Genbank enthielt.
Die relativ hohe Anzahl an falsch-positiven Clonen, die nach der SD-Trp+CHX-Selektion identifiziert wurde, kann damit erklärt werden, dass nach dem Ausschluß des Plasmids mit der Aktivierungsdomäne, das Fusionsprotein mit der DNA-Bindedomäne ohne irgendein Partnerprotein auf seine Fähigkeit hin ausgetestet wird, das Auswertungssystem zu aktivieren. Es ist bekannt, dass viele Transkripte, die in Seeigel-Embryonen exprimiert werden, Transkriptionsfaktoren darstellen (codieren), und dass Fragmente von Transkriptionsfaktoren üblicherweise zu falsch-positiven Clonen im Hefe-Zwei-Hybrid-System führen, wenn sie als Fusionsproteine mit der DNA-Bindedomäne exprimiert werden. Daher zeigen diese Ergebnisse, dass das vorstehende Verfahren große Mengen falsch-positiver Clonen bei einer im Großmaßstab angelegten Durchmusterung auf Wechselwirkungen einer Genbank mit einer Genbank wirkungsvoll ausschließen kann.
6.5. Die Identifizierung individueller Mitglieder der Wechselwirkung durch Nucleinsäure-Amplifikation und -Sequenzierung
Insgesamt 96 positive Clone wurden aus der Datenbank zufällig ausgewählt, und einer eingefrorenen Kopie der Clone der Wechselwirkungs-Genbank entnommen, die in Mikrotiterplatten mit 384 Vertiefungen gelagert worden war. Die DNA-Sequenzen, die im pGAD428- und im pBTM118-Vektor cloniert worden waren, die in jedem Clon enthalten waren, wurden, wie in Abschnitt 5.2. beschrieben, direkt amplifiziert, mit der Ausnahme, dass die direkten PCR-Reaktionen unter Verwendung einer Wasserbad-Thermozyklus-Maschine mit hohem Durchsatzvermögen (Maier et al., 1994) in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen durchgeführt wurde.
Im Anschluß an die vorstehend beschriebene pBTM428-spezifische PCR in 96 Vertiefungen wurden Standard-Sequenzierungs-Ansätze durchgeführt, um die Nucleinsäuren zu charakterisieren, die die DNA-Bindedomäne-Fusionsproteine der positiven Clone codierten. In ähnlicher Weise wurden die Sequenzen der inserierten Fragmente, die für Fusionsproteine mit der Aktivierungsdomäne codierten, nach der pGAD118-spezifischen PCR bestimmt. Durch einen Sequenzvergleich dieser inserierten Fragmente mit veröffentlichten DNA-Sequenzen unter Verwendung von Standard-Sequenzvergleichs-Programmen (z. B. BLAST) stellte sich heraus, dass eine Wechselwirkung zwei bislang unbekannte Genfragmente umfaßte, die durch den positiven Clon exprimiert wurden, der sich in Platte 5 in der Vertiefung K20 befand. Nach der vorhergesagten Proteinsequenz wurden diese beiden Gen(produkte) als Protein A und Protein B bezeichnet.
6.6. Die Identifizierung individueller Mitglieder der Wechselwirkung durch Nucleinsäure-Hybridisierung
Es wurden regelmäßige Gittermuster der Nucleinsäuren konstruiert, die die Fusionsproteine der Wechselwirkungs-Genbank codierten. Die Membranen, die auf SD-Leu-Trp-His-Medium gelegt und nicht für die Untersuchung der β-Gal-Aktivität benutzt worden waren, wurden gemäß dem in Larin & Lehrach (1990) beschriebenen Verfahren weiter verarbeitet, um die DNA, die in den Clonen der Wechselwirkungs-Genbank enthalten war, auf der Oberfläche der Membran zu fixieren. Das DNA-Fragment, das das Protein A codierte und das wie vorstehend beschrieben isoliert worden war, wurde durch das Verfahren von Feinberg & Vogelstein (1983) radioaktiv markiert. Diese markierte Sonde wurde mit einer Anordnung von DNA aus der Wechselwirkungs-Genbank hybridisiert, und die Anordnung wurde gewaschen und wie in Abschnitt 5.1. beschrieben untersucht.
Die Anzahl und die Identität der bei der Hybridisierung positiven Clone wurde für jede Hybridisierung unter Verwendung des Standard-Bildanalyse-Systems bestimmt, das in Lehrach et al. (1997) beschrieben wurde. Sieben Clone aus der Wechselwirkungs-Genbank wurden als positive Clone identifiziert, die mit der das Protein A codierenden Sonde hybridisierten. 16 zeigt ein digitales Bild einer DNA-Anordnung, die mit einem Genfragment hybridisiert worden war, das das Protein A codierte, zusammen mit den bei der Hybridisierung positiven Clonen, die durch das automatisch Bildanalyse-System identifiziert und markiert worden waren, und 17 stellt eine graphische Darstellung der positiven Clone dar, die durch diese Analyse gefunden wurden. Die in Beispiel 7 beschriebene Datenbank wurde verwendet, um sich auf die Liste der Clone zu beziehen, die durch das Bildanalyse-Programm erzeugt worden war, und um diejenigen, bei der Hybridisierung positiven Clone zu identifizieren, die bei der Wechselwirkung positive Clone waren, und somit alle falsch-positiven Clone aus der weiteren Analyse auszuschließen. Wie erwartet, war der Clon 5K20, aus dem die Protein A entsprechende Sonde stammte, ein bei der Hybridisierung positiver Clon.
Um den Wechselwirkungs-Weg von Protein A ab zu erweitern, wurde ein zweiter Filter mit einer radioaktiv markierten Sonde hybridisiert, die aus dem Fragment erzeugt wurde, das das Protein B codierte. Die Analyse der Hybridisierungssignale mit der in Beispiel 7 beschriebenen Datenbank führte zu der Identifizierung von acht bei der Wechselwirkung positiven Clonen, die das für das Protein B codierende Genfragment enthielten. 18 zeigt eine graphische Darstellung der Hybridisierungs-positiven und der Wechselwirkungs-positiven Clone, die durch Sonde B (offene Kreise) und Sonde A (gefüllte Kreise) identifiziert wurden. Zwei Clone (5K20 und 3L11, die durch „A/B" markiert sind) ergaben ein Hybridisierungssignal sowohl mit Sonde A, als auch mit Sonde B, was anzeigt, dass diese positiven Clone die gleichen miteinander wechselwirkenden Fusionsproteine exprimierten.
Um die Wechselwirkungs-Wege von Protein A und B weiter fortzusetzen, wurden die Plasmide mit der DNA-Bindedomäne und der Aktivierungsdomäne aus einem Wechselwirkungs-positiven Clon extrahiert, der nur mit Sande B ein Hybridisierungssignal lieferte (Clon 6D18). Die DNA-Sequenzierung der inserierten Fragmente, die in diesen genetischen Elementen enthalten war, bestätigte die Anwesenheit eines Genfragments, das für Protein B in dem Plasmid mit der DNA-Bindedomäne codierte. Die Sequenzanalyse zeigte, dass das Plasmid mit der Aktivierungsdomäne ein Fragment für ein anderes unbekanntes Gen enthielt, das für ein Protein C codierte. Dieses Genfragment wurde als Sonde verwendet, um eine andere Anordnung zu untersuchen, und die Daten wurden wie vorstehend analysiert. 19 zeigt die Ergebnisse dieser Hybridisierung (markiert mit Rauten), zusammen mit denen der vorangegangenen beiden Hybridisierungen. Insgesamt wurden sechs Wechselwirkungs-positive Clone identifiziert, die genetische Elemente trugen, die das Protein C codierten. Von dreien dieser Wechselwirkungs-positiven Clone wurde vorher gezeigt, dass sie mit Sonde B hybridisierten (4G19; 1D7; 6D18), und von zwei Clonen, dass sie mit Sonde A hybridisierten (1C22; 3A11). Eine graphische Darstellung der Wechselwirkungen, die durch diese drei einfachen Hybridisierungen identifiziert wurden, ist in 19 skizziert. Die Fragezeichen stellen mögliche weitere Schritte im Netzwerk dar, die durch eine ähnliche Untersuchung der genetischen Elemente, die durch die verbleibenden, für die Sonden A, B und C Hybridisierungs-positiven Clone, weiter untersucht werden könnten. Tatsächlich wurden durch die Befolgung dieses gezielten Hybridisierungs-Ansatzes 14 unterschiedliche Protein-Protein-Wechselwirkungen durch insgesamt neun Hybridisierungen und anschließende Sequenzierung der inserierten Fragmente identifiziert, die miteinander wechselwirkende Mitglieder codierten. Alle Daten wurden in die in Beispiel 7 beschriebene Datenbank eingetragen.
6.7. Die automatische Neuanordnung positiver Clone
Die 3443 positiven Clone, die wie vorstehend beschrieben identifiziert worden waren, waren über alle 23 Mikrotiterplatten der Wechselwirkungs-Genbank verteilt. Um die weitere Analyse der positiven Clone bedeutend zu erleichtern, war es von Vorteil, die Clone per Hand individuell zu isolieren und ein zweites, neu angeordnetes, regelmäßiges Gittermuster der positiven Clone zu erzeugen, was vorzugsweise in einer weiteren Reihe an Platten mit 384 Vertiefungen stattfand.
Bereits existierende Systeme der Neuanordnungs-Roboter, wie sie z. B. durch Stanton et al. (1996) oder durch Lehrach et al. (1997) beschrieben wurden, oder solche, die durch kommerzielle Hersteller (Genetix, UK) verkauft werden, waren nicht in der Lage, eine zufriedenstellende Beimpfung bereitzustellen, wenn die Hefezellen aus den individuellen Vertiefungen einer Ursprungs („Mutter")-Platte mit 384 Vertiefungen, die die Original-Wechselwirkungs-Genbank enthielt, in die Vertiefungen einer neuen, sterilen Ziel(„Tochter")-Platte mit 384 Vertiefungen, die Anzuchtmedium enthielt, übertragen wurden. Daher wurden die vorhandenen Nadeln durch gerade Nadeln mit 2 mm Durchmesser ersetzt, die in ein flaches Ende besaßen. Zweitens wurde das Animpfverfahren modifiziert, um die Menge an angetrocknetem Zellmaterial zu maximieren, das die Nadel trug und das in eine neue Vertiefung einer Tochterplatte übertragen wurde, wie für das automatisierte Picken von Hefekolonien in Abschnitt 3.1. beschrieben. Die Nadeln wurden zwischen den Neuanordnungs-Zyklen durch ein Waschbad mit 0,3% Wasserstoffperoxid, ein Waschbad mit 70% Ethanol und ein Hitzetrocknungs-Verfahren sterilisiert, wie in Abschnitt 3.1. beschrieben.
Die Liste der positiven Clone wurde zusammen mit ihren Platten- und Vertiefungs-Ortsdaten aus der in Beispiel 7 beschriebenen Datenbank erzeugt und automatisch als Computerdatei in den Neuanordnungs-Roboter geladen. Der Roboter nahm durch Bezugnahme auf die Datei der Daten automatisch die Mutterplatte, die die ersten positiven Hefe-Zwei-Hybridclone enthielt, las den Strichcode der Platte und registrierte ihn. Die individuellen und aufeinander folgenden Nadeln des Neuanordnungskopfes mit 96 Nadeln wurden darüber plaziert und in die erforderlichen Vertiefungen dieser ersten Platte herunter gelassen, und die Mutterplatte wurde automatisch ausgetauscht, wenn alle positiven Clone gesammelt worden waren. Wenn alle 96 Nadeln benutzt worden waren, um Impfmaterial der positiven Clone zu sammeln, wurde der Kopf automatisch zur ersten Tochterplatte mit 384 Vertiefungen hinüber bewegt, die SD-Leu-Trp/7% Glycerin enthielt, und mit allen 96 Nadeln wurde die erste Reihe der Vertiefungen wie vorstehend beschrieben beimpft. Dann wurde die Datenausgabedatei auf den neuesten Stand gebracht, wodurch die neuen Platte/Vertiefungs-Ortsdaten eines bestimmten positiven Clons in der neu angeordneten Genbank mit seinen alten Platte/Vertiefungs-Ortsdaten der ursprünglichen Wechselwirkungs-Genbank in Beziehung gesetzt wurden. Dann wurden alle Nadeln wie beschrieben sterilisiert, und der Zyklus wurde vervollständigt, bis alle positiven Clone aus der Wechselwirkungs-Genbank an einen neuen Platten/Vertiefungs-Ort übertragen worden waren, welcher die neu angeordnete Genbank bildete. Die Datenausgabedatei wurde dann in die zentrale Computerdatenbank übertragen und einer Tabelle in der Datenbank hinzugefügt, die in Beispiel 7 beschrieben wurde, um so die korrekten Ortsdaten eines bestimmten positiven Clons in der neu angeordneten Wechselwirkungs-Genbank aufzuzeichnen. Die so erhaltenen Clone in den Tochterplatten wurden zu zwei weiteren Kopien Replika-plattiert und bei –70°C gelagert, wie in Abschnitt 3.1. beschrieben.
Beispiel 7: Die Erzeugung einer Datenbank der Wechselwirkungen
Zentral für das Schema (2) ist eine Datentabelle, die die relevante Information über jedes Mitglied einer Wechselwirkung enthält – die cDNA-Tabelle – wobei eine getrennte Registrierung in der Tabelle jedes Mitglied einer Wechselwirkung repräsentiert, und durch einen gemeinsamen Clonnamen wird angezeigt, dass die Mitglieder Wechselwirkungen bilden. Es ist aus mehreren Gründen von Vorteil, die Kern-Datentabelle in dieser Weise zu strukturieren. Erstens kann die gleiche Kerntabelle dazu verwendet werden, die Daten über die cDNAs aus unterschiedlichen Arten genetischer Banken zu enthalten (zum Beispiel, eine Standard-cDNA- oder eine genomische Genbank), die während einer umfassenden Analyse unter Verwendung verschiedener genomischer Verfahren erzeugt werden können, und wobei es sich nicht nur um Daten zur Wechselwirkung handeln muß. Zweitens kann jedes Mitglied einer Wechselwirkung, oder die genetischen Fragmente, durch eine Reihe an Wegen für unterschiedliche Datensammlungen weiter charakterisiert werden. Von direkter Bedeutung für eine Protein-Protein-Wechselwirkung für ein bestimmtes genetisches Fragment in der cDNA_Tabelle ist zuerst die Gen_Tabelle, die eine direkte Beziehung zu der DNA-Sequenz des Fragments, den Nucleotid(sequenz)-Homologie-Übereinstimmungen (zum Beispiel durch eine Suche mit BLAST) und den entsprechenden Gennamen bereitstellt. Zweitens stellt die Domäne_Tabelle eine Möglichkeit dar, um direkt auf die Daten der Translation der Leseraster des Fragments, die Aminosäure(sequenz)-Homologie-Übereinstimmungen (zum Beispiel durch eine Suche mit BLASTN) und alle 2- oder 3-dimensionalen Strukturinformationen, die bekannt oder vorhergesagt werden können, zuzugreifen. Wie in der Molekularbiologie allgemein bekannt ist, gibt es viele Wege, auf denen ein bestimmtes genetisches Fragment charakterisiert werden kann, und diese Struktur der Datenbank bietet die Möglichkeit, sich von der zentralen cDNA_Tabelle auf jede andere Tabelle zu beziehen, die Daten enthält, welche diese Charakterisierung je nach Bedarf beschreibt. Zum Beispiel auf diejenigen Tabellen, welche Daten über Informationen zur Genetik, Expression, Richtigkeit der Zielsequenz, Proteinbiochemie oder zur Konstruktion der Genbank enthalten. Von besonderer Relevanz für das Verfahren der Erfindung ist die Beziehung eines bestimmten cDNA-Fragments zu einer Tabelle, die Informationen über Oligofingerprinting-Daten enthält. Solche Oligofingerprinting-Daten können dazu verwendet werden, jedes Mitglied einer Wechselwirkung in einer hochgradig parallelen Weise zu identifizieren, und es umfaßt Felder für Daten, wie z. B. die Gruppennummer, den Sicherheitsgrad mit dem ein Mitglied einer Gruppe angehört und die vorhergesagte Genhomologie für diese Gruppe (Maire et al., 1994). Drittens wird eine solche Datenbankstruktur es eher erlauben, tertiäre oder Wechselwirkungen höherer Ordnung in die gleiche Datenbank mit aufzunehmen. Dies steht im Gegensatz zu einer Struktur, bei der eher die Wechselwirkungen statt die Mitglieder einer Wechselwirkung das grundlegende Objekt oder einer Aufzeichnung in einer Datentabelle darstellen, und für die bei jeder Wechselwirkung höherer Ordnung eine neue Datentabelle benötigt oder eine bereits bestehende Datentabelle modifiziert werden muß.
Im Falle einer Durchmusterung einer Hefe-Zwei-Hybrid-Wechselwirkung wäre eine dazu in Beziehung stehende Tabelle die H2H_Tabelle (Y2H_Table). Diese Tabelle kann Informationen für einen bestimmten Clon umfassen, die zur Clonierung und zu den experimentellen Einzelheiten seiner Erzeugung gehören, sowie zu dem Gewebe und der Genbank aus der er stammt, seinen physikalischen Ortsdaten, um einen leichten Zugriff für weitere Studien zu ermöglichen, und ab er aus der Paarung bestimmter Mata und Matα-Stämme stammt. Es ist wichtig, dass die H2H_Tabelle Informationen enthält, die zu der Wechselwirkungsklasse des Clons gehören, wobei die Wechselwirkungsklasse danach definiert ist, ob es sich bei dem Clon um einen positiven Clon, einen negativen Clon oder einen falsch-positiven Clon handelt, jeweils im Hinblick auf das Fusionsprotein mit der Aktivierungsdomäne (AD) oder das mit der Bindedomäne (BD). Der Wert für diese Wechselwirkungsklasse kann leicht für eine große Zahl an Clonen durch das in den vorangegangenen Beispielen beschriebene Verfahren der Erfindung abgeleitet werden.
Um jeden zielgerichteten Ansatz zur Identifizierung von Mitgliedern, die eine Wechselwirkung bilden, zu unterstützen, wird die Hyb_Tabelle bereitgestellt. Diese Tabelle stellt für einen bestimmten Clon eine Beziehung zu der Hybridisierungsintensität her, die mit einer bestimmten Sonde in einem Hybridisierungsexperiment unter Verwendung einer bestimmten Anordnung mit hoher Dichte erhalten wurde. Diese Anordnung hoher Dichte, die mit Tabellen in Beziehung gebracht werden soll, die Daten aus dem Tüpfelroboter enthalten, wie z. B. das definierte verwendete Tüpfelmuster, das Verfahren, durch das die Anordnung hergestellt wurde, und die Identität der Genbank und der Clone, die in dieser Anordnung angeordnet sind. Der Einbau dieser Tabellen in eine Benutzeroberfläche erlaubt es, dass diese Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung leicht durchgeführt werden kann, dies erfolgt durch die Angabe der physikalischen Ortsdaten eines bestimmten positiven Hefe-Zwei-Hybrid-Clons, der mit einer bestimmten Sonde hybridisierte, für den Benutzer. Dieser Zwei-Hybrid-Clon kann dann entnommen werden, und die Mitglieder, aus denen sich die Wechselwirkung zusammensetzt, können durch PCR isoliert und sequenziert werden. Diese sequenzierten Mitglieder einer Wechselwirkung liefern dann die Daten, die in die cDNA_Tabelle und andere verwandte Tabellen bei der weiteren Analyse eingetragen werden, Ein solches Mitglied kann dann als zweite Hybridisierungssonde mit einer Anordnung dazu verwendet werden, durch das gleiche Verfahren den nächsten Schritt in einem Wechselwirkungsweg zu identifizieren.
Nach der Sammlung einer größeren Zahl an miteinander wechselwirkenden Mitgliedern in der cDNA_Tabelle, können diese Daten per Hand und/oder mit Hilfe von Expertensystem-Programmen kuriert werden, um eine definitive Datentabelle, wie z. B. die WegCode_Tabelle (PathCode_Table) aus den neuesten Stand zu bringen. Diese definitive Datenbank dient dazu, die Information mit der größten Qualität über die Wechselwirkungen aus der c_DNA-Tabelle aufzunehmen, wobei die Information mit der größten Qualität über die Wechselwirkungen diejenige aus der cDNA_Tabelle ist, die einen bestimmten Grad an „Sicherheit" erreicht hat, der durch den Kurator und/oder das Expertensystem-Programm definiert worden ist. Um den Vorgang der Entscheidungsfindung zu unterstützen, werden alle relevanten Daten, insbesondere diejenigen über das translatierte Leseraster der cDNA und die entsprechende Proteindomäne, mit anderen Tabellen in Beziehung gesetzt und in einer für den Kurator und/oder das Expertensystem-Programm verwendbaren Form dargestellt. Diese Darstellung erlaubt die leichte Erkennung und den Ausschluß oder die Korrektur grundlegender Fehler in den Daten, wie z. B. eine schlechte Qualität der Sequenzierung, oder nicht korrekt clonierte cDNA-Fragmente. Diese können z. B. verunreinigende Fragmente umfassen, die z. B. als aus einem Organismus stammend identifiziert werden konnten, der nichts mit der cDNA-Genbank zu tun hat.
Eine bestimmte cDNA wird nur einmal für jede Wechselwirkung, in der sie gefunden wurde, in die WegCode_Tabelle aufgenommen, zusammen mit einer Aufzeichnung über die entsprechende mit ihr in Wechselwirkung tretende cDNA (oder die cDNAs bei multimeren Komplexen). Wenn jedoch eine cDNA unterschiedliche Wechselwirkungen besitzt, zum Beispiel mit unterschiedlichen Proteinen, oder wenn unterschiedliche Proteindomänen der cDNA mit verschiedenen Proteinen in Wechselwirkung treten, wird für jeden Fall eine neue Aufzeichnung für die cDNA erzeugt. Diese unterschiedlichen Aufzeichnungen werden über eine allgemeine und unverwechselbare „Wechselwirkungs-ID" miteinander verbunden. Eine bestimmte Wechselwirkung wird daher nur einmal in der WegCode_Tabelle dargestellt, und sie bezieht sich auf vorangegangene Tabellen der Datenbank über den Wirtszellen-Clon, der die Wechselwirkung repräsentiert, und die ID jeder cDNA der Wechselwirkung. Die Wirtszelle, die die Wechselwirkung repräsentiert, wird unter Berücksichtigung und Kurierung aller Wirtszellen und der wechselwirkenden Fragmente ausgewählt, die diese Wechselwirkung darstellen, die in der cDNA_Tabelle enthalten sind.
Es kann eine Reihe an Kriterien eingebaut werden, um die Kurierung und die Auswahl zu unterstützen, und um daraus ein Maß an Sicherheit und Vertrauen in die Wechselwirkung abzuleiten. Zum Beispiel können solche Kriterien einen abnehmenden Informationswert besitzen, und sie umfassen die Folgenden. Erstens, wenn eine bestimmte Wechselwirkung in beiden Richtungen des Experiments beobachtet wird, d. h. ProteinA-AD tritt mit ProteinB-BD in Wechselwirkung und ProteinA-BD tritt mit ProteinB-AD in Wechselwirkung. Zweitens, wenn unterschiedliche Beispiele für die gleiche Wechselwirkung beobachtet werden. D. h. wenn unterschiedliche Beispiele der gleichen Wechselwirkung als Proteinfragmente mit deutlich unterschiedlicher Länge und Lage (zum Beispiel mit einem Unterschied von mehr als 10%), aber aus der gleichen der Wechselwirkung zu Grunde liegenden Proteindomäne stammend, definiert werden, und es wird herausgefunden, dass sie ebenfalls miteinander in Wechselwirkung treten. Drittens, wenn die gleichen Beispiele für die gleiche Wechselwirkung beobachtet werden, zum Beispiel durch mehrfache Clonierung der gleichen Fragmente, wobei die gleichen Fragmente im Wesentlichen die gleiche Länge und die gleiche Lage der zu Grunde liegenden Proteindomäne aufweisen. Viertens, wenn die miteinander wechselwirkenden Proteindomänen eine biologische Bedeutung haben. Das heißt, dass ähnliche Domänen oder Gene aus der veröffentlichten Literatur als miteinander in Wechselwirkung tretend bekannt sind, oder es ist bekannt, dass beide Gene exprimiert werden, oder es ist wahrscheinlich, dass sie am gleichen Ort in der Zelle exprimiert werden. Dieses Kriterium kann auch als interne Qualitätskontrolle für die Clonierung der Genbank, des Wechselwirkungsexperiments und der anschließenden Identifizierung miteinander wechselwirkender Mitglieder verwendet werden, da jedes Wechselwirkungsexperiment eine bestimmte Reihe an bereits veröffentlichten „Haushalts-Wechselwirkungen" identifizieren sollte, und die Identifizierung solcher Wechselwirkungen kann daher als ein Maß für die Qualität des gesamten Wechselwirkungsexperiments dienen.
Ein Kriterium von besonderer Bedeutung ist die optionale Überprüfung einer bestimmten Wechselwirkung durch weitere Experimente. Zum Beispiel können die cDNA-Fragmente, die die miteinander wechselwirkenden Proteine repräsentieren, subcloniert werden, und es können zusätzliche Wechselwirkungsexperimente durchgeführt werden. Diese zusätzlichen Wechselwirkungsexperimente können die Untersuchung jedes Proteins auf eine Wechselwirkung gegen eine Reihe nicht verwandter Proteine beinhalten, um die Spezifität dieser Wechselwirkung zu untersuchen. Diese Untersuchung kann unter Verwendung des gleichen Wechselwirkungs-(Test)verfahrens vorgenommen werden, mit dem die Wechselwirkung identifiziert wurde, wie z. B. dem Hefe-Zwei-Hybrid-System, aber bevorzugt handelt es sich um ein anderes unabhängiges Verfahren. Es wird bevorzugt, dass wenn eine bestimmte Wechselwirkung unter Verwendung von biochemischen Verfahren überprüft wird, diese z. B. eine Go-Northern-Analyse des Gewebe, eine Co-Lokalisierung des zellulären (Aufenthaltortes) oder Ko-Präzipitationsuntersuchungen umfassen.
Alle diese Kriterien werden durch den Kurator und/oder das Expertensystem-Programm berücksichtigt, um die Entscheidung zu unterstützen, welche cDNA-Fragmente und welche ihrer Wechselwirkungen in die WegCode_Tabelle eingegeben werden. Es können auch andere bekannte oder in der wissenschaftlichen Literatur veröffentlichte Wechselwirkungen in diese Datenbank während des Kurierungsverfahrens mit aufgenommen werden, und daher stellt ein Feld der Tabelle die Herkunft einer Wechselwirkung dar, wobei es sich um eine interne oder eine externe Referenz handeln kann. Die WegCode_Tabelle besitzt relationale Verbindungen zu nachgeordneten oder externen Datenbanken, die Daten über die Nucleotid- und die Proteinsequenzen und biochemische, strukturelle, biologische und bibliographische Informationen enthalten. Diese Daten, welche die vollständigen Beziehungen zwischen allen Tabellen und Datenbanken darstellen, können unter Verwendung einfacher Benutzeroberflächen, wie sie zum Beispiel durch die Verwendung von Java entworfen werden können, oder durch kompliziertere Kommandos, wie z. B. solche, die durch SQL bereitgestellt werden, abgefragt werden. Mögliche Abfragen umfassen diejenigen, die aus diesen Daten Wechselwirkungen, Wege oder Netzwerke für eine bestimmte Nucleotid- oder Aminosäuresequenz oder ein Sequenzmotiv oder für eine bestimmte 3-dimensionale Struktur oder ein Strukturmotiv lokalisieren können. Zweitens können für bereits gut etablierte Netzwerke diese Daten abgefragt werden, um einen bestimmten Weg zwischen zwei vorgegebenen Punkten abzufragen. Es kann sein, dass einige Abfragen unter Verwendung einer grundlegend anderen Konstruktion der WegCode_Tabelle wirkungsvoller durchgeführt werden können, zum Beispiel, indem eine bestimmte Wechselwirkung statt eines bestimmten Mitglieds einer Wechselwirkung als grundlegende Aufzeichnung dargestellt wird. Die Fachleute werden in der Lage sein, die Daten von einer Tabellenkonstruktion auf ein anderes unter Verwendung von Standard-Zergliederungs-Systemen zu übertragen, um eine wirkungsvollere Durchführung der Abfragen zu ermöglichen.
Das Ergebnis dieser Abfragen wird unter Verwendung graphischer Verfahren dargestellt, um es dem Forscher zu ermöglichen, diese Daten am Wirkungsvollsten zu interpretieren. Diese graphischen Verfahren umfassen Elemente, die durch Anklicken der Computer-Maus aktiviert werden können, wie z. B. wichtige Verknüpfungen (hotlinks), um diese Daten nahtlos mit anderen Datenquellen zu verbinden, oder um weitere Ebenen der Wechselwirkungen abzufragen und darzustellen. Es können auf Computern basierende Verfahren zur Erzeugung visueller Darstellungen spezieller Wechselwirkungen und teilweiser oder vollständiger Protein-Protein-Wechselwirkungs-Netzwerke angewendet werden, um die erforderlichen Wechselwirkungen in der wirkungsvollsten Weise automatisch zu berechnen und darzustellen. Sowohl das Auffinden der Wege des Netzwerk, als auch die Berechnung der optimalen Darstellung der aufgefundenen Wege, kann auf Algorithmen basieren, die im Fachgebiet der mathematischen Graphentheorie wohlbekannt sind. Zum Beispiel kann es sich um Algorithmen handeln, die ähnlich denjenigen sind, die dazu verwendet wurden, andere biologische Verwandtschaftsbeziehungen darzustellen, wie z. B. die genetische Nachkommenschaft und stammesgeschichtliche Verwandtschaftsbeziehungen.
Eine einmal errichtete Computer-Datenbank von Protein-Wechselwirkungen besitzt viele nützliche Anwendungen. Zum Beispiel kann sie dazu verwendet werden, die Existenz neuer biologischer Wechselwirkungen oder Wege vorherzusagen, oder Verbindungen zwischen biologischen Netzwerken zu bestimmen. Des Weiteren können mit diesem Verfahren die Funktion und die Lokalisierung bislang unbekannter Proteine über die Bestimmung ihrer Wechselwirkungspartner vorhergesagt werden. Sie kann auch verwendet werden, um die Antwortreaktion einer Zelle auf Veränderungen der Expression bestimmter Mitglieder des Netzwerks vorherzusagen, ohne ein molekularbiologisches, zellbiologisches oder ein Tier-Experiment durchführen zu müssen. Schließlich können diese Daten dazu verwendet werden, Proteine oder Wechselwirkungen zwischen Proteinen eines medizinisch relevanten Weges zu identifizieren, die für einen therapeutischen Eingriff, die Diagnose oder zur Behandlung von Krankheiten geeignet sind.
Beispiel 8: Die Vorselektion von falsch-positiven Clonen und die automatisierte Erzeugung eines regelmäßigen Gittermusters aus Hefezellen, die ein Fusionsprotein exprimieren
8.1. Die genetische Vorselektion falsch-positiver Clone
Es wurden drei Hefestämme mit dem Paarungstyp a unter Verwendung des Verfahrens von Schiestel & Gietz (1989) in L40ccu konstruiert, dies erfolgte durch Kotransformation mit dem Plasmid pLUA, das das URA3-Auswertungssystem enthielt, und den Plasmiden pBTM117c, beziehungsweise pBTM117c-SIM1 oder pBTM117c-HIP1. Die Transformanten, die sowohl das pLUA-Plasmid als auch ein Plasmid mit der DNA-Bindedomäne enthielten, wurden auf SD-Trp-Ade-Medium selektiert. In ähnlicher Weise wurden drei Hefestämme des Paarungstyps a in L40ccuα konstruiert, dies erfolgte durch Kotransformation mit pLUA und den Plasmiden pGAD427, beziehungsweise pGAD427-ARNT oder pGAD427-LexA. Die Transformanten, die sowohl das pLUA-Plasmid als auch jeweils eines der Plasmide mit der Aktivierungsdomäne enthielten, wurden auf SD-Leu-Ade-Medium selektiert. Die so erhaltenen Hefestämme sind in Tabelle 3 aufgelistet.
Die Hefestämme x1a, x2a und x3a wurden auf die selektiven Medien SD-Trp-Ade, SD-Trp-Ade mit 0,2% 5-FOA und SD-Trp-Ade-Ura Replika-plattiert, während die Hefestämme y1α, y2α und y3α auf die selektiven Medien SD-Leu-Ade, SD-Leu-Ade mit 0,2% 5-FOA und SD-Leu-Ade-Ura Replika-plattiert wurden. Die Tabelle 4 zeigt, dass die beiden Hefestämme x3a und y3α, die die Fusionsproteine LexA-HIP1, beziehungsweise GAL4ad-LexA exprimierten, nicht in der Lage waren, auf den entsprechenden Medien zu wachsen, die 5-FOA enthielten, jedoch in der Lage waren, auf den entsprechenden Medien ohne Uracil zu wachsen. Im Gegensatz dazu konnten alle Hefestämme, die Plasmide enthielten, die Fusionsproteine exprimierten, welche alleine nicht in der Lage waren, das Auswertungssystem zu aktivieren, auf den entsprechenden Medien wachsen, die 5-FOA enthielten, aber sie konnten nicht auf den Selektionsmedien ohne Uracil wachsen. Dies zeigt, dass es möglich ist, durch eine Selektion auf einem 5-FOA enthaltendem Medium, Hefeclone zu eliminieren, die einzelne Fusionsproteine exprimieren, die das Auswertungssystem autoaktivieren. Somit eliminierte das URA3-Auswertungssystem vor der Wechselwirkungspaarung erfolgreich Clone, die autoaktivierende Fusionsproteine enthielten.
8.2. Die Erzeugung eines regelmäßigen Gittermusters genetisch vorselektierter Hefezellen, die ein Fusionsprotein exprimierten
Es wurden zwei definierte Genbanken von Clonen erzeugt, die Fusionsproteine exprimierten. Zuerst wurde der Hefestamm L40ccu mit dem Plasmid pLUA transformiert, und eine so erhaltene, stabil transformierte Kolonie wurde in Minimalmedium ohne Adenin angezogen. Die Zellen aus dieser Kultur wurden kompetent gemacht und mit 3 μg eines vereinigten Gemisches aus allen sechs pBTM117c-Konstrukten transformiert, die in Tabelle 2 gezeigt werden. Zweitens wurde der Hefestamm L40ccuα mit dem Plasmid pLUA transformiert, und eine so erhaltene, stabil transformierte Kolonie wurde in Minimalmedium ohne Adenin angezogen. Die Zellen aus dieser Kultur wurden kompetent gemacht und mit 3 μg eines vereinigten Gemisches aus allen sechs pGAD427-Konstrukten transformiert, die in Tabelle 2 gezeigt werden. In allen Fällen erfolgte die Herstellung der kompetenten Zellen und die Transformationen unter Verwendung des Verfahrens von Schiestel & Gietz (1989).
Die beiden Transformationsgemische wurden 2 Stunden bei 30°C in 10 ml YPD-Flüssigmedium inkubiert, bevor sie auf große 24 × 24 cm-Agarschalen (Genetix, UK) plattiert wurden. Die Mata-Zellen, die die pBTM117c-Fusions-Genbank enthielten, wurden auf Minimalmedium ohne Tryptophan und Adenin aber mit 0,2% 5-FOA (SD-Trp-Ade+FOA) plattiert, während die Matα-Zellen, die die pGAD427-Fusions-Genbank enthielten, auf Minimalmedium ohne Leucin und Adenin aber mit 0,2% 5-FOA (SD-Leu-Ade+FOA) plattiert wurden. Die Agarschalen wurden unter Verwendung eines Agar-Autoklaven und einer Pumpe (Integra, Schweiz) gegossen, um Variationen in der Färbung und der Tiefe des Agars von Schale zu Schale zu minimieren. Nach dem Ausplattieren wurden die Kolonien durch Inkubation der Schalen bei 30°C über 4 bis 7 Tage angezogen, was etwa 1500 Kolonien pro Schale ergab.
Die Mata-Clone, die das Plasmid pBTM117c-HIP1 enthielten, und die Matα-Stämme, die das Plasmid pGAD427-LexA enthielten, exprimierten die Fusionsproteine LexA-HIP1, beziehungsweise GAL4ad-LexA. Es wurde gezeigt, dass diese Fusionsproteine das URA3-Auswertungssystem ohne irgendwelche andere mit ihnen in Wechselwirkung tretende Fusionsproteine aktivierten. Daher sollten die Zellen, die diese Plasmide enthielten, nicht in der Lage sein, auf Selektionsmedium mit 5-FOA zu wachsen. Somit werden nur diejenigen Hefeclone, die ein einzelnes Fusionsprotein exprimieren, das nicht in der Lage ist, das URA3-Reportergen zu aktivieren, Kolonien bilden, die durch das modifizierte Roboter-System gepickt werden können.
Unter Verwendung des modifizierten Labor-Pick-Roboters wurden individuelle Hefekolonien automatisch aus den Agarschalen in individuelle Vertiefungen steriler Mikrotiterplatten mit 384 Vertiefungen wie in Abschnitt 1.3.1. beschrieben gepickt, mit der Ausnahme, dass die Mata-Hefestämme in Mikrotiterplatten gepickt wurden, die das Anzuchtmedium SD-Trp-Ade und 7% Glycerin (Vol./Vol.) enthielten, während die Matα-Hefestämme in Mikrotiterplatten gepickt wurden, die das Anzuchtmedium SD-Leu-Ade und 7% Glycerin (Vol./Vol.) enthielten. Die so erhaltenen Mikrotiterplatten wurden 4 Tage bei 30°C inkubiert, wobei nach 36 Stunden eine Durchmischung der Zellen stattfand (Abschnitt 3.1.). Nach der Inkubation wurde jede Platte Replika-plattiert, um zwei weitere Kopien in markierten Mikrotiterplatten mit 384 Vertiefungen zu erzeugen, die mit dem flüssigen Anzuchtmedium und 7% Glycerin, das für jeden Hefestamm geeignet war, vorher gefüllt worden waren. Die Replika-Platten wurden 4 Tage bei 30°C inkubiert, wobei nach 36 Stunden wie vorstehend eine Durchmischung der Zellen stattfand, anschließend eingefroren und bei –70°C zusammen mit den ursprünglich gepickten Mikrotiterplatten der Genbanken der Zellen gelagert, die Fusionsproteine exprimierten.
Es ist klar, dass regelmäßige Gittermuster einer solchen Wechselwirkungs-Genbank mit höherer Dichte leicht durch Fachleute aus diesen Mikrotiterplatten der diploiden Hefezellen unter Verwendung der Verfahren erzeugt werden können, die in den Abschnitten 3.2., 3.3. und 3.4. dieser Erfindung offenbart wurden.
8.3. Visuelle Unterscheidung von falsch-positiven Clonen bei einem verbesserten Hefe-Zwei-Hybrid-System
Durch die Transformation jedes der in Tabelle 2 beschriebenen pBTM117c-Plasmidkonstrukte in L40ccu nach dem Verfahren von Schiestel & Gietz (1989) wurden sechs Hefestämme erzeugt. Jeder Stamm wurde auf selektives Anzuchtmedium ohne Tryptophan plattiert, das mit Kaliumphosphat auf den pH-Wert 7,0 gepuffert war und 2 μg/ml des β- Galactosidase-Substrats X-Gal enthielt (SD-Trp/X-GAL). In ähnlicher Weise wurden durch die Transformation jedes der in Tabelle 2 beschriebenen pGAD427-Plasmidkonstrukte in L40ccuα sechs weitere Stämme konstruiert. Diese Stämme wurde auf selektives Anzuchtmedium ohne Leucin plattiert, das mit Kaliumphosphat auf den pH-Wert 7,0 gepuffert war und 2 μg/ml X-Gal enthielt (SD-Leu/X-GAL). Nach 7 Tagen Inkubation bei 30°C wurden die Stämme auf Wachstum und Blaufärbung hin untersucht, Tabelle 5 zeigt, dass, obwohl alle Hefestämme in der Lage waren, auf den selektiven Medien zu wachsen, sich nur der L40ccu-Stamm, der das Fusionsproteine LexA-HIP1 exprimierte, und der L40ccuα-Stamm, der das Fusionsprotein GAL4ad-LexA exprimierte, blau färbten. Im Gegensatz dazu, konnten alle anderen Hefestämme, die Plasmide enthielten, welche Fusionsproteine exprimierten, die nicht in der Lage waren, alleine das Auswertungssystem zu aktivieren, auf den Selektionsmedien wachsen, färbten sich aber nicht blau. Es wurde herausgefunden, dass für die hier beschriebenen Fusionsproteine, die durch Auto-Aktivierung des β-Galactosidase-Auswertungssystems erzeugte Blaufärbung sich schneller entwickelte als die Rosafärbung der anderen Clone, die aufgrund der ade2-Mutation erfolgte. Die Blaufärbung kann sich jedoch bei einigen Fusionsproteinen langsamer entwickeln als die Rosafärbung, die die Verläßlichkeit der visuellen Unterscheidung bei der Verwendung eines automatisierten Systems mit einem Grauwertskala-Beobachtungssystem beeinflussen kann. Daher werden Fachleute in der Lage sein, Farberkennungssysteme oder Farbfilter einzubauen, oder einen Hefestamm zu konstruieren, der keine Rosafärbung entwickelt. Dies kann zum Beispiel durch die Verwendung eines Stammes geschehen, der das ADE2-Wildtypgen oder die komplementäre ade3-Mutation trägt.
8.4. Die Verwendung der Automation zur visuellen Unterscheidung der falsch-positiven Hefeclone und die Erzeugung eines regelmäßigen Gittermusters an Zellen
Es wurden zwei definierte Fusionsprotein-Genbanken erzeugt. Die in Tabelle 2 gezeigten sechs pBTM117c-Konstrukte wurden vereinigt, und 3 μg des Gemisches wurden in den Hefestamm L40ccu kotransformiert. Die so erhaltenen Transformanten wurden durch Plattierung des Gemisches auf fünf 24 × 24 cm große Agarschalen (Genetix, UK) selektiert, die Minimalmedium ohne Tryptophan enthielten, das mit Kaliumphosphat auf den pH-Wert 7,0 gepuffert war, sowie 2 μg/ml X-Gal (SD-Trp/X-GAL). Zweitens wurden die in Tabelle 5 gezeigten sechs pGAD427-Konstrukte vereinigt, und 3 μg des Gemisches wurden in den Hefestamm L40ccuα kotransformiert. Die so erhaltenen Transformanten wurden durch Plattierung des Gemisches auf fünf 24 × 24 cm große Agarschalen (Genetix, UK) selektiert, die Minimalmedium ohne Leucin enthielten, das mit Kaliumphosphat auf den pH-Wert 7,0 gepuffert war, sowie 2 μg/ml X-Gal (SD-Leu/X-GAL). Diese Agarschalen wurden unter Verwendung eines Agar-Autoklaven und einer Pumpe (Intergra, Schweiz) gegossen, um Variationen in der Farbe und der Tiefe des Agars von Schale zu Schale zu minimieren. Die Agarschalen wurden 7 Tage inkubiert, um das Wachstum und die Blaufärbung derjenigen Hefeclone zu ermöglichen, bzw. sich entwickeln zu lassen, die in der Lage waren, das β-Galactosidase-Reportergen zu aktivieren. In allen Fällen erfolgte die Herstellung der kompetenten Zellen und die Transformation unter Verwendung des Verfahrens von Schiestel & Gietz (1989).
Unter Verwendung des modifizierten Labor-Pick-Roboters wurden, wie in Abschnitt 3.1. beschrieben, individuelle Hefekolonien automatisch aus den Agarschalen in individuelle Vertiefungen einer sterilen Mikrotiterplatte mit 384 Vertiefungen gepickt, mit der Ausnahme, dass die Mata-Hefestämme in Mikrotiterplatten gepickt wurden, die das Anzuchtmedium SD-Trp und 7% (Vol./Vol.) Glycerin enthielten, wehrend die Matα-Hefestämme in Mikrotiterplatten gepickt wurden, die das Anzuchtmedium SD-Leu und 7% (Vol./Vol.) Glycerin enthielten.
Die automatisierte visuelle Unterscheidung erfolgte unter Verwendung der Blau/Weiß-Sortierungsparameter, die in Abschnitt 3.1. beschrieben wurden. Der Roboter wurde programmiert, nur die weißen Kolonien in Mikrotiterplatten zu picken, und alle Kolonien zu ignorieren, die sich durch die Aktivierung des β-Galactosidase-Reportergens blau gefärbt hatten. 20 zeigt die automatisierte visuelle Unterscheidung falsch-positiver Clone unter Verwendung des modifizierten Pick-Systems, das vorstehend beschrieben wurde. Die so erhaltenen Mikrotiterplatten wurden 4 Tage bei 30°C inkubiert, wobei nach 36 Stunden eine Durchmischung der Zellen stattfand (Abschnitt 3.1.). Nach der Inkubation wurde jede Platte in markierte Mikrotiterplatten mit 384 Vertiefungen Replika-plattiert, die vorher mit dem für jeden Hefestamm geeigneten Flüssigmedium mit 7% Glycerin gefüllt worden waren, um zwei zusätzliche Kopien zu erzeugen. Die Replika-Platten wurden 4 Tage bei 30°C inkubiert, wobei nach 36 Stunden wie vorstehend beschrieben eine Durchmischung der Zellen durchgeführt wurde, anschließend wurden sie eingefroren und bei –70°C zusammen mit den ursprünglich gepickten Mikrotiterplatten der Genbanken der Zellen gelagert, die Fusionsproteine exprimierten.
Es ist klar, dass regelmäßige Gittermuster mit höherer Dichte einer solchen Wechselwirkungs-Genbank durch Fachleute aus diesen Mikrotiterplatten mit diploiden Hefezellen unter Befolgung der Verfahren leicht erzeugt werden können, die in den Abschnitten 3.2., 3.3. und 3.4. der Erfindung offenbart wurden.
Es sollten nur diejenigen Kolonien, die das Fusionsprotein LexA-HIP1 oder das Fusionsprotein GAL4ad-LexA exprimierten, in der Lage sein, das LacZ-Gen zu aktivieren und sich daher bei der Anzucht auf Selektionsmedium blau färben. Deshalb wurde von blauen Kolonien der Mata-Genbank erwartet, dass sie das pBTM117c-HIP1-Konstrukt trugen, während von weißen Kolonien erwartet wurde, dass sie die anderen pBTM117c-Plasmidkonstrukte enthielten. Ebenso wurde von blauen Kolonien der Matα-Genbank erwartet, dass sie das pGAD427-LexA-Konstrukt trugen, während von weißen Kolonien erwartet wurde, dass sie die anderen pGAD427-Plasmidkonstrukte enthielten. Um diese Hypothese zu beweisen, wurden 10 weiße und 10 blaue Kolonien aus einer bereits gepickten Agarschale der Mata-Genbank, sowie 20 Kolonien aus einer Mikrotiterplatte mit 384 Vertiefungen, die von dieser Platte automatisch gepickt worden waren, zufällig ausgewählt. Alle 40 Kolonien wurden per Hand in individuelle 1 ml-Flüssigkulturen mit SD-Trp-Medium angeimpft, und die Kulturen wurden 3 Tage bei 30°C angezogen. Das inserierte Fragment, das jeder Clon trug, wurde durch direkte PCR Amplifikation der pBTM117c-Insertionen aus den Hefekulturen und durch DNA-Sequenzierung nach Standardverfahren kontrolliert. Alle 10 Hefekolonien, die das Auswertungssystem aktiviert und sich blau gefärbt hatten, trugen das 1,2 kb große HIP1-Fragment, während die weißen Kolonien die 1,6 kb große HD1.6- oder die 1,1 kb große SIM-Insertion trugen oder mit dem nicht rekombinierten Vektor kein Amplifikations(produkt) ergaben. Von den 20 Clonen, die aus der Mikrotiterplatte mit 384 Vertiefungen ausgewählt worden waren, die automatisch visuell unterschieden worden waren, trug keiner das 1,2 kb große HIP1-Fragment. Ein ähnliches Experiment mit Clonen, die manuell ausgewählt und automatisch aus der Mata-Genbank gepickt worden waren, bestätigte, dass die blauen Kolonien die LexA-Insertion des pGAD427-LexA-Konstrukts enthielten, und dass keine automatisch gepickten Kolonien diese Insertion trugen. Von dem pBTM117c-HIP1-Plasmid, das das LexA-HIP1-Fusionsprotein codierte, und dem pGAD427-LexA-Plasmid, das das GAL4ad-LexA-Fusionsprotein codierte, war bekannt, dass sie das Auswertungssystem ohne ein Partnerprotein autoaktivieren können. Somit hatte die automatische visuelle Unterscheidung diese falsch-positiven Clone vorselektiert und automatisch ein regelmäßiges Gittermuster an Hefeclonen erzeugt, die ein einzelnes Fusionsprotein exprimierten, das nicht in der Lage war, das Auswertungssystem zu aktivieren.
Beispiel 9: Automatisierte Wechselwirkungspaarung zur Kombination genetischer Elemente in Hefezellen
9.1. Automatisierte Wechselwirkungspaarung auf einem festen Träger in einem regelmäßigen Muster
Die Hefestämme, die in Abschnitt 8.1. keine autoaktivierenden Fusionsproteine exprimierten, wurden unter Verwendung eines automatisierten Ansatzes miteinander gepaart. Jeder der Hefestämme x1a, x2a, y1α und y2α wurde in jeder Vertiefung einer von vier Mikrotiterplatten angezogen, die SD-Trp-Ade-Medium für die Mata-Stämme und SD-Leu-Ade-Medium für die Matα-Stämme enthielten. Jede Platte wurde mit einem unverwechselbaren Strichcode unter Verwendung eines Tüpfel-Roboters markiert, wie durch Lehrach et al. (1997) beschrieben, und die Hefestämme x1a und x2a wurden in einem definierten duplizierten 2 × 2 Muster mit einem Tüpfelabstand von 2 mm auf eine Hyband-N+-Membran (Amersham) übertragen, die vorher in YPD-Medium eingetaucht worden war. Der Tüpfel-Roboter übertrug dann automatisch die Hefestämme y1α und y2α auf die gleichen entsprechenden Tüpfelpositionen auf jede Membran, die bereits die x1a- und x2a-Clone enthielt. Der Roboter sterilisierte automatisch das Tüpfelwerkzeug, wechselte die Mikrotiterplatten zwischen jeder Reihe übertragener Clone und erzeugte eine Datei der Daten, in der das hergestellte Tüpfelmuster und der Strichcode, der automatisch von jeder Mikrotiterplatte abgelesen worden war, aufgezeichnet wurden. Die betüpfelten Membranen wurden auf YPD-Platten übertragen und über Nacht bei 34°C inkubiert, um die Paarung und das Wachstum stattfinden zu lassen. Jede Membran wurde unter Verwendung des Verfahrens von Breeden & Nasmyth (1985) auf β-Gal-Aktivität hin untersucht und anschließend über Nacht an der Luft getrocknet. Unter Verwendung eines Standard-A3-Computerscanners wurde ein digitales Bild jedes getrockneten Filters aufgenommen, und das Bild wurde wie in Abschnitt 4.1. beschrieben weiter verarbeitet. Das verarbeitete Bild wurde im Computer gespeichert, und die Identität der Clone, die die β-Galactosidase exprimierten, wurde unter Verwendung des in Abschnitt 4.1. beschriebenen Bildanalysesystems bestimmt. 21 zeigt die Ergebnisse einer automatisierten Wechselwirkungspaarung zwischen den Stämmen x1a & y1α und x2a & y2α. Beide so erhaltenen diploiden Stämme wuchsen auf YPD-Medium, jedoch nur der diploide Stamm, der aus der Wechselwirkungspaarung zwischen x2a & y2α stammte, und der die Plasmide enthielt, die die miteinander wechselwirkenden Fusionsproteine LexA-SIM1, beziehungsweise GAL4ad-ARNT codierten, wies einen LacZ+-Phänotyp auf und färbte sich nach der Inkubation mit X-Gal blau. Für den diploiden Stamm, der aus der Wechselwirkungspaarung zwischen den Stämmen x1a & y1α stammte, und der die Plasmide enthielt, die die Proteine LexA und GAL4ad codierten, wurde keine β-Galactosidase-Aktivität beobachtet.
9.2. Automatisierte Wechselwirkungspaarung auf Grundlage der Flüssigkultur
Es wurden zwei definierte Genbanken von Clonen erzeugt, die Fusionsproteine exprimierten. Zuerst wurde der Hefestamm L40ccu mit dem Plasmid pLUA transformiert, und eine so erhaltene, stabil transformierte Kolonie wurde in Minimalmedium ohne Adenin angezogen. Die Zellen aus dieser Kultur wurden kompetent gemacht und mit 3 μg eines vereinigten Gemisches aller sechs pBTM117c-Konstrukte transformiert, die in Tabelle 2 gezeigt werden. Zweitens wurde der Hefestamm L40ccuα mit dem Plasmid pLUA transformiert, und eine so erhaltene, stabil transformierte Kolonie wurde in Minimalmedium ahne Adenin angezogen. Die Zellen aus dieser Kultur wurden kompetent gemacht und mit 3 μg eines vereinigten Gemisches aller sechs pGAD427-Konstrukte transformiert, die in Tabelle 2 gezeigt werden In allen Fällen erfolgte die Herstellung der kompetenten Zellen und die Transformation unter Verwendung des Verfahrens von Schiestel & Gietz (1989).
Die Zellen in den beiden so erhaltenen Transformationsgemischen wurden durch 2 Stunden Inkubation in YPD-Flüssigmedium bei 30°C erlaubt sich zu erholen, bevor sie auf große 24 × 24 cm-Agarschalen (Genetix, UK) ausplattiert wurden. Die Mata-Zellen, die die pBTM117c-Fusions-Genbank enthielten, wurden auf Minimalmedium ohne Tryptophan und Adenin aber mit 0,2% 5-FOA (SD-Trp-Ade+FOA) plattiert, während die Matα-Zellen, die die pGAD427-Fusions-Genbank enthielten, auf Minimalmedium ohne Leucin und Adenin aber mit 0,2% 5-FOA (SD-Leu-Ade+FOA) plattiert wurden.
Die Kolonien in den Agarschalen wurden durch 4 bis 7 Tage Inkubation bei 30°C angezogen. Um (die Zahn der falsch-positiven Kolonien zu minimieren, die aus ruhenden Zellen entstehen können, wurden die Kolonien aus den beiden Agarschalen unter Verwendung der Standard-Replika-Plattierung mit Samttuch auf neue Agarschalen Replikaplattiert, die die gleichen entsprechenden Selektionsmedien wie die entsprechende Originalschale enthielten. Dieses Replikaverfahren überführte nur die Zellen aus der Spitze einer wachsenden Kolonie und verminderte somit die Übertragung von ruhenden Zellen und damit die Anzahl falsch-positiver Clone im Hefe-Zwei-Hybrid-System. Diese Replika-Agarschalen wurden 4 bis 7 Tage bei 30°C inkubiert, um die Hefezellen anzuziehen.
Um die Wechselwirkungspaarung in Flüssigmedium durchzuführen, wurden die so erhaltenen Mata- und Matα-Kolonien von den beiden Replika-Schalen durch Abwaschen mit jeweils 20 ml flüssigem Minimalmedium getrennt gesammelt. Diese beiden Gemische aus Hefeclonen wurden vorsichtig resuspendiert, dann sedimentiert und mit sterilem, destilliertem Wasser gewaschen, bevor sie in 100 ml YPD-Medium inkubiert wurden, um sicherzustellen, dass die Zellen in beiden Gemischen paarungskompetent waren. Die beiden Populationen der paarungskompetenten Zellen wurden in 500 ml flüssigem YPD-Medium vereinigt, das in einer 10-Liter-Flasche mit flachem Boden enthalten war, und bei 30°C unter sehr sanftem Schütteln (< 60 UpM) über Nacht inkubiert, um die Wechselwirkungspaarung stattfinden zu lassen. Das so erhaltene Gemisch aus diploiden Zellen wurde 5 Min. durch eine sanfte Zentrifugation bei 3.000 UpM sedimentiert, zweimal mit 50 ml sterilem destilliertem Wasser gewaschen, und anschließend wurden 10 ml der so erhaltenen Zellsuspension auf jeweils eine von fünf 24 × 24 cm großen Agarschalen ausplattiert, die 300 ml Minimalmedium ohne Leucin, Tryptophan, Adenin, Histidin und Uracil enthielten (SD-Leu-Trp-Ade-His-Ura). Die Agarschalen wurden unter Verwendung eines Agar-Autoklaven und einer Pumpe (Integra, Schweiz) gegossen, um Variationen in der Farbe und der Tiefe des Agars von Schale zu Schale zu minimieren. Nach dem Plattieren wurden die Kolonien 4 bis 7 Tage durch Inkubation der Schalen bei 30°C angezogen.
Nach der Inkubation wurden die so erhaltenen Hefezellen, die miteinander wechselwirkende Fusionsproteine exprimierten, unter Verwendung unseres modifizierten Picksystems, wie in Abschnitt 3.1. beschrieben, automatisch gepickt, mit der Ausnahme, dass die gepickten Kolonien in Mikrotiterplatten angeimpft wurden, die das flüssige Selektionsmedium SD-Leu-Trp-Ade/7% Glycerin enthielten. Die Wechselwirkungs-Genbank, die die diploiden Hefezellen umfaßte, die in den Mikrotiterplatten enthalten waren, wurden durch Inkubation bei 30°C wie in Abschnitt 3.1. beschrieben angezogen. Es wurden zwei weitere Kopien der Wechselwirkungs-Genbank in neuen Mikrotiterplatten angefertigt, die SD-Leu-Trp-Ade/7% Glycerin-Anzuchtmedium enthielten, alle Platten wurden individuell mit einem unverwechselbaren Strichcode markiert und bei –70°C gelagert, bis sie für die weitere Analyse wie in Abschnitt 3.1. beschrieben benötigt wurden.
Es ist klar, dass regelmäßige Gittermuster einer solchen Wechselwirkungs-Genbank mit höherer Dichte leicht durch Fachleute aus diesen Mikrotiterplatten mit diploiden Hefezellen unter Befolgung der Verfahren erzeugt werden können, die in den Abschnitten 3.2., 3.3. und 3.4. dieser Erfindung offenbart wurden. Die Erzeugung regelmäßiger Gittermuster mit hoher Dichte an diploiden Hefezellen kann unter Verwendung der Verfahren durchgeführt werden, die in vorangegangenen Abschnitten beschrieben wurden. Dieses Anordnungen können verwendet werden, um die Aktivität eines Reportergens zu testen oder zur Erzeugung von Nucleinsäure-Anordnungen für eine Hybridisierung. Es können Modifikationen des Selektionsmediums erforderlich sein, die die Fachleute erkennen werden.
Beispiel 10: Die Anwendung des verbesserten Hefe-Zwei-Hybrid-Systems auf ein prokaryontisches Zwei-Hybrid-System
10.1. Stämme, Auswertungssysteme und Vektoren
Es wurden zwei E. coli-Stämme, KS1-OR2HF⁺ und KS1-OR2HF^–' erzeugt, die den gegenselektierbaren Marker sacB unter der Kontrolle des placO_R2-62-Promotors trugen, sowie das selektierbare Tetracyclin-Gen unter der Kontrolle eines zweiten placO_R2-62-Promotors. Beide Stämme besitzen das gegenselektierbare Reportergen sacB stabil das in das E. coli-Chromosom inseriert, dies erfolgte durch Ausschalten („knock-out") des Arabinose-Operons, um durch Arabinose kontrollierte, induzierbare Promotoren verwenden zu können. Das selektierbare Tet-Reportergen wurde in das Chromosom durch knock-out des Lactose-Operons stabil inseriert, wodurch zusätzlich ein lacY-gegenselektierbarer Marker verwendet werden kann. Der Stamm KS1-OR2HF⁺ wurde durch Transformation des Fertilität verleihenden F'-Plasmids in KS1-OR2HF^– erzeugt. KS1-OR2HF^– wurde durch ortsspezifisches Ausschalten und Insertion des sacB-Reportergen-Konstrukts in das Arabinose-Operon des Stammes KS1-ORTet durch Transformation mit dem Plasmid pKO3-araOrsacB und anschließende Selektion aus eine stabile Insertion unter Verwendung des Verfahrens von Link et al. (1997) erzeugt. pKO3-araOrsacB wurde durch Ligierung der glatten Enden eines 1,4 kb großen OrsacB-Fragments in mit StuI verdautes pKO3-ARA hergestellt, um eine Insertion des OrsacB-Fragments herzustellen, die von 2,5 kb und 1,0 kb des 3'-, beziehungsweise des 5'-Endes des E. coli-Arabinose-Operons flankiert wurde. pKO3-ARA enthält das vollständige E. coli-Arabinose-Operon, das über PCR aus der genomischen DNA von E. coli unter Verwendung von mit Überhängen versehenen Primern amplifiziert, mit SalI verdaut und in die SalI-Schnittstelle von pKO3 unter Verwendung von Standardverfahren cloniert worden war. Das OrsacB-Fragment wurde durch Ligierung des PCR-Fragments des placO_R2-62-Promotors mit dem Fragment des sacB-Gens erzeugt. Das placO_R2-62-Promotor- und das sacB-PCR-Fragment wurden unter Verwendung von Standardverfahren und Ankerprimern amplifiziert, die komplementäre Überhänge zwischen den beiden aufeinander folgenden Fragmenten erzeugten, welche anschließend einander angelagert wurden, um die chimäre Sequenz (vergleiche zum Beispiel mit Current Protocols in Molecular Biology, Hrsg. Ausubel et al., John Wiley & Sons, 1992) aus den Plasmiden KJ306-31 und pKO3 zu erzeugen. Das Derivat placO_R2-62 des lac-Promotors, das im Plasmid KJ306-31 enthalten ist, wurde durch Spaltung des Plasmids KJ306 mit HincII und der Insertion einer 31 Bp langen verbindenden Sequenz erhalten (Dove et al., 1997). Der Stamm KS1-ORTet wurde durch ortsspezifisches Ausschalten und Insertion eines Tetracyclin-Reportergens unter Kontrolle des placO_R2-62-Promotors in das Lactose-Operon des Stammes KS1F^– erzeugt, sowie auch durch genomisches Ausschalten unter Verwendung des pKO3-Systems. Das Tetracyclin-Gen wurde durch PCR aus dem Plasmid pACYC184 erhalten. Es wurden Modifikationen des vorstehenden Ausschalt-Insertions-Verfahrens vorgenommen, um ein geeignetes pKO3-Konstrukt herzustellen, um eine Ausschalt-Insertion des chimären Tetracyclin-Reportergens in das Lactose-Operon zu ermöglichen, wie sie Fachleuten ebenso möglich sein werden. Der E. coli-Stamm KS1F^– wurde aus KS1 (Dove et al.) durch Entfernung des F'-Plasmids unter der Verwendung von Standard-Kurierungsverfahren konstruiert.
Die beiden Vektoren pBAD18-αRNAP und pBAD30-cI wurden konstruiert, um weitere genetische Eigenschaften bereitzustellen, die dazu dienten, das Verfahren der Erfindung zu ermöglichen (22). Die Vektoren basieren auf der pBAD-Vektorenreihe, die eine strenge induzierbare Kontrolle der Expression clonierter Gene unter der Verwendung des Promotors des Arabinase-Operons (Guzman et al., 1995, J. Bact. 177: 4141–4130) bereitstellen, und in der gleichen E. coli-Zelle aufgrund kompatibler Replikationsursprünge aufrecht erhalten werden können. Das Plasmid pBAD18-αRNAP exprimiert unter Kontrolle des Arabinose-Promotors Fusionsproteine zwischen der α-aminoterminalen Domäne (NTD) der α-Untereinheit der RNA-Polymerase und DNA-Fragmenten, die in die multiple Clonierungsstelle cloniert wurden. Auf die Anwesenheit dieses Plasmids in Kanamycin-sensitiven Zellen, kann durch Planierung auf Anzuchtmedium hin selektiert werden, das mit Kanamycin ergänzt wurde, oder auf seine Abwesenheit durch das gegenselektierbare rpsL-Allel, durch Planierung auf mit Streptomycin ergänztem Medium (Murphy et al., 1995). Das Plasmid pBAD30-cI exprimiert unter der Kontrolle des Arabinose-Promotors Fusionsproteine zwischen dem λcI-Protein und DNA-Fragmenten, die in die multiple Clonierungsstelle cloniert wurden. Auf die Anwesenheit dieses Plasmids in Ampicillin-sensitiven Zellen, kann durch Planierung auf Anzuchtmedium hin selektiert werden, das mit Ampicillin ergänzt wurde, oder auf seine Abwesenheit durch das gegenselektierbare lacY-Gen, durch Plattierung auf mit 2 Nitrophenyl-β-D-thiogalactosid (tONPG) ergänztem Medium (Murphy et al., 1995). Zusätzlich ermöglicht die 288 Bp lange oriT-Sequenz den unidirektionalen genetischen Austausch des pBAD30-cI-Plasmids und seiner Derivate aus E. coli-Zellen, die den F'-Fertilitätsfaktor enthalten, hin zu F^–-Stämmen, denen der Fertilitätsfaktor fehlt.
Das Plasmid pBAD18-αRNAP wurde durch Clonierung eines 0,7 kb großen DNA-Fragments, das die α-aminotermiale Domäne (NTD) (Reste 1-248) der α-Untereinheit der RNA-Polymerase (α-NTD) codiert, in mit EcoRI verdautes pBAD18-CS konstruiert. Das 0,7 kb große α-NTD-Fragment wurde über PCR aus dem Plasmid pHTf1α (Tang et al., 1994, Genes Dev. 8: 3058–3067) isoliert. Das Plasmid pBAD18-CS wurde durch eine ortsspezifische Insertion, die durch PCR-Clonierng des 400 Bp großen codierenden Bereichs und der Translations-Startstelle des rpsL-Allel unterstützt wurde, in pBAD18-Kan (Guzman et al., 1995) vor das Transkriptions-Terminationssignal des Kanamycin-Gens erhalten, um die polycistronische Transkription des gegenselektierbaren und des selektierbaren Markers zu ermöglichen. Das rpsL-Allel wurde durch PCR-Amplifizierung aus dem Plasmid pNO1523 (Murphy et al., 1995) erhalten.
Das Plasmid pBAD30-cI wurde durch Clonierung eines 730 Bp langen DNA-Fragments, das das λcI-Protein codiert, in mit EcoRI verdautes pBAD30-TCS konstruiert. Das 730 Bp große Fragment, das das λcI-Protein codiert, wurde über PCR aus dem Plasmid pACλcI (Dove et al., 1997) isoliert. Das Plasmid pBAD30-TCS wurde durch eine ortsspezifische Insertion, die durch PCR-Clonierung des 1,3 kb großen codierenden Bereichs und der Translations-Startstelle des lacY-Gens in pBAD30-T vor das Transkriptions-Terminationssignal des Ampicillin-Gens erhalten, um die polycistronische Transkription des gegenselektierbaren und des selektierbaren Markers zu ermöglichen. Das lacY-Gen wurde über PCR-Amplifikation aus dem Plasmid pCM10 (Murphy et al., 1995) erhalten. Das Plasmid pBAD30-T wurde durch ortsspezifische Insertion einer 288 Bp langen oriT-Sequenz hergestellt, die durch PCR zwischen dem intergenischen Bereich von M13 und dem cat'-Locus von pBAD30 (Guzman et al., 1995) aus dem F'-Plasmid erhalten worden war.
10.2. Nachweis und Identifizierung miteinander wechselwirkender Proteine unter Verwendung eines im Großmaßstab angelegten und automatisierten prokaryontischen Zwei-Hybrid-Systems
· Die Erzeugung einer Genbank von E. coli-Zellen, die Fusionsproteine exprimieren
Es wurde ein Extrakt des pSport1-Plasmids verwendet, das die amplifizierte cDNA-Genbank von Strongylocentrotus purpuratus enthielt, die in Abschnitt 6.1. beschrieben wurde. Etwa 1 μg der inserierten Fragmente der Genbank wurden aus der Plasmid-DNA durch Verdau mit HindIII/SalI und einer nach Größen (1–1,5 kb) selektierenden Reinigung über ein Agarosegel unter Verwendung von Standardverfahren isoliert.
Die beiden Plasmide pBAD18-αRNAP und pBAD30-cI wurden durch Verdau mit HindIII/SalI hergestellt. Das Gemisch der inserierten Fragmente, das wie vorstehend isoliert worden war, wurde in zwei gleich große Fraktionen aufgeteilt, und 300 ng wurden mit jeweils 50 ng der beiden hergestellten Plasmide ligiert. Nach der Ligierung wurde das pBAD18-αRNAP-Reaktionsgemisch in kompetente KS1-OR2HF^–-E. coli-Zellen transformiert, und pBAD30-cI wurde in kompetente KS1-OR2HF⁺-E. coli-Zellen transformiert.
· Die genetische Vorselektion falsch-positiver Clone und die automatisierte Erzeugung eines regelmäßigen Gittermusters aus E. coli-Zellen, die ein Fusionsprotein exprimierten
Die beiden Transformationsgemische wurden auf große 24 × 24 cm-Agarschalen (Genetix, UK) plattiert, die Selektionsmedien enthielten. Die F^–-Zellen, die die pBAD18-αRNAP-Fusionsgenbank enthielten, wurden auf selektives LB-Medium plattiert, das mit Kanamycin (50 μg/ml), Arabinose (0,2% Gew./Vol.) und Saccharose (5% Gew./Vol.) ergänzt worden war. Die F⁺-Zellen, die die pBAD30-cI-Fusions-Genbank enthielten, wurden auf selektives LB-Medium plattiert, das mit Ampicillin (100 μg/ml), Arabinose (0,2%) und Saccharose (5%) ergänzt worden war. Die Agarschalen wurden unter Verwendung eines Agar-Autoklaven und einer Pumpe (Integra, Schweiz) gegossen, um Variationen in der Farbe und der Tiefe des Agars von Schale zu Schale zu minimieren. Mach dem Ausplattieren wurden die Kolonien durch Inkubation der Schalen bei 37°C über 18 bis 24 Stunden angezogen. Die E. coli-Zellen exprimierten die Fusionsproteine unter der Kontrolle des Arabinose-Promotors, und diejenigen Zellen, die ein einzelnes Fusionsprotein exprimierten, das in der Lage war, das sacB-Reportergen zu autoaktivieren, waren nicht in der Lage zu wachsen, da die Expression des sacB-Gens eine Empfindlichkeit gegenüber Saccharose verleiht, die dem Anzuchtmedium in einer hohen Konzentration zugesetzt worden war.
Das automatisierte Picken der E. coli-Clone für die DNA-Analyse unter Verwendung Sicht-kontrollierter Robotersysteme, wie z. B. in Lehrach et al. (1997) beschrieben, ist im Fachgebiet wohlbekannt. Solche Systeme sollten auch zu Analyse von E. coli-Zellen geeignet sein, die miteinander wechselwirkende oder potenzielle miteinander wechselwirkende Fusionsproteine exprimieren. Daher wurde ein Labor-Pick-Roboter verwendet, um individuelle E. coli-Kolonien aus den selektiven Agarschalen in die individuellen Vertiefungen einer sterilen Mikrotiterplatte mit 384 Vertiefungen (Genetix, UK) automatisch zu picken, die steriles Flüssigmedium enthielt. Die Zellen, die die pBAD18-αRNAP-Fusions-Genbank exprimierten, wurden in flüssiges LB-Selektionsmedium angeimpft, das mit Kanamycin (50 μg/ml) und 10% (Vol./Vol.) Glycerin ergänzt worden war (LB+KAN/10% Gly), während die Zellen, die die pBAD30-cI-Fusions-Genbank exprimierten, in LB-Selektionsmedium angeimpft wurden, das mit Ampicillin (100 μg/ml) und 10% (Vol./Vol.) Glycerin ergänzt worden war (LB+Amp/10% Gly). Die so erhaltenen Mikrotiterplatten wurden 18 bis 24 Stunden bei 37°C inkubiert, und nach dem Wachstum der E. coli-Stämme in den Mikrotiterplatten wurde jede Platte mit einer unverwechselbaren Nummer und einem Strichcode markiert. Die Platten wurden ebenfalls Replika-plattiert, um zwei weitere Kopien zu erzeugen, dies erfolgte unter Verwendung eines sterilen Plastik-Replikators mit 384 Nadeln (Genetix, UK), der dazu verwendet wurde, eine kleine Menge Zellmaterial aus jeder Vertiefung in vormarkierte Mikrotiterplatten mit 384 Vertiefungen zu übertragen, die vorher mit dem für jeden E. coli-Stamm geeigneten flüssigen Selektionsmedium gefüllt worden waren, das 10% Glycerin enthielt. Die Replika-plattierten Platten wurden 18 bis 24 Stunden bei 37°C inkubiert, anschließend markiert, dann eingefroren und bei –70°C zusammen mit den ursprünglich gepickten Mikrotiterplatten der Genbanken der E. coli-Zellen gelagert, welche die Fusionsproteine exprimierten.
Auf diese Weise erzeugten wir unter Verwendung eines automatisierten Roboter-Picksystems ein regelmäßiges Gittermuster an E. coli-Zellen, die Fusionsproteine exprimierten. Mikrotiterplatten mit 384 Vertiefungen besitzen alle 4,5 mm eine Vertiefung in einer Anordnung von 16 auf 24 Vertiefungen. Daher erzeugten wir für jede Mikrotiterplatte mit 384 Vertiefungen automatisch ein regelmäßiges Gittermuster mit einer Dichte von mehr als 4 Clonen pro Quadratzentimeter. Es ist klar, dass regelmäßige Gittermuster mit höherer Dichte einer solchen Wechselwirkungs-Genbank leicht durch Fachleute aus diesen Mikrotiterplatten der E. coli-Zellen unter Befolgung der Verfahren erzeugt werden können, die in den Abschnitten 3.2., 3.3. und 3.4. dieser Erfindung offenbart werden. Zum Beispiel können Dichten von mehr als 19 Clonen pro Quadratzentimeter durch Pipettieren von Clonen mit einem Roboter in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit 1536 Vertiefungen erhalten werden.
· Die visuelle Unterscheidung falsch-positiver Clone und die automatische Erzeugung eines regelmäßigen Gittermusters von E. coli-Zellen, die ein Fusionsprotein exprimieren
Um zu zeigen, dass die visuelle Unterscheidung von Zellen, die einzelne Fusionsproteine exprimieren, die das Auswertungssystem autoaktivieren, auf ein prokaryontisches Zwei-Hybrid-System angewendet werden kann, wurden die Genbanken der Fusionsproteine verwendet, die in Abschnitt 10.2.1. beschrieben wurden. Die beiden Transformationsgemische wurden auf große 24 × 24 cm-Agarschalen (Genetix, UK) plattiert, die Selektionsmedien enthielten. Die F^–-Zellen, die die pBAD18-αRNAP-Fusions-Genbank enthielten, wurden auf selektives LB-Medium plattiert, das mit Kanamycin (50 μg/ml), Arabinose (0,2%) und X-Gal (2 μg/ml) ergänzt worden war. Die F⁺-Zellen, die die pBAD18-cI-Fusions-Genbank enthielten, wurden auf selektives LB-Medium plattiert, das mit Ampicillin (100 μg/ml), Arabinose (0,2%) und X-Gal (2 μg/ml) ergänzt worden war. Die Agarschalen wurden unter Verwendung eines Agar-Autoklaven und einer Pumpe (Integra, Schweiz) gegossen, um Variationen in der Farbe und der Tiefe des Agars von Schale zu Schale zu minimieren. Nach dem Plattieren wurden die Kolonien 18 bis 24 Stunden bei 37°C angezogen, um die Blaufärbung der Kolonien sich entwickeln zu lassen. Die E. coli-Zellen exprimierten die Fusionsprotein unter der Kontrolle des Arabinose-Promotors, und diejenigen Zellen, die Fusionsproteine exprimierten, die in der Lage waren, das lacZ-Reportergen zu autoaktivieren, färbten sich durch die enzymatische Reaktion des X-Gal-Substrats blau, wie im Fachgebiet wahlbekannt ist.
Unter Verwendung eines automatisierten Pick-Systems wurden weiße E. coli-Zellen, die einzelne Fusionsproteine exprimierten, die nicht in der Lage waren, das Auswertungssystem zu aktiveren, automatisch von falsch-positiven E. coli-Zellen visuell unterschieden, die sich blau gefärbt hatten, und es wurden nur weiße E. coli-Zellen in einem regelmäßigen Gittermuster angeordnet. Es wurde ein Standard-Labor-Pickroboter (Lehrach et al., 1997) verwendet, mit der Ausnahme, dass die Verbesserungen, die die zuverlässige Aussortierung der weißen von den blauen Hefeclonen betrafen, wie in Abschnitt 3.1. beschrieben wurde, ebenfalls dazu verwendet wurde, um zwischen weißen und blauen E. coli-Kolonien zu unterscheiden. Weiße E. coli-Kolonien aus den beiden Reihen der Agarschalen, die wie vorstehend beschrieben hergestellt worden waren, wurden automatisch gepickt und in Mikrotiterplatten mit 384 Vertiefungen und geeigneten Selektionsmedien angeimpft, wie in Abschnitt 10.2. beschrieben. Fachleute werden erkennen, dass regelmäßige Gittermuster dieser Clone mit höherer Dichte leicht hergestellt werden können.
· Die automatisierte Wechselwirkungs-Konjugation, um genetische Elemente in E. coli-Zellen zu kombinieren
Den Fachleuten ist offensichtlich, dass die automatisierte Wechselwirkungspaarung auf einer festen Unterlage, wie sie für die Hefezellen in Abschnitt 9.1. beschrieben wurde, ebenfalls für E. coli-Zellen mit unterschiedlichen Konjugationstypen geeignet ist, die durch die Verfahren der genetischen Vorselektion oder der visuellen Unterscheidung, wie in dieser Erfindung offenbart, selektiert wurden. In solchen Fällen sind geeignete Modifikationen der selektiven Medien erforderlich. Fachleute sind jedoch in der Lage, diese Modifikationen der Selektionsmedien unter Befolgung der hierin vorgelegten Offenbarungen zu erkennen und vorzunehmen.
Um einen automatisierten Ansatz zur Wechselwirkungs-Konjugation aufzuzeigen, der auf der Flüssigkultur basiert, wurden wie in Abschnitt 10.1. beschrieben zwei Genbanken der Clone hergestellt, die Fusionsproteine exprimierten. Die F^–-Zellen, die die pBAD18-αRNAP-Fusions-Genbank enthielten, wurden auf selektives LB-Medium ausplattiert, das mit Kanamycin (50 μg/ml), Arabinose (0,2%) und Saccharose (5%) ergänzt worden war. Die F⁺-Zellen, die die pBAD18-cI-Fusions-Genbank enthielten, wurden auf selektives LB-Medium ausplattiert, das mit Ampicillin (100 μg/ml), Arabinose (0,2%) und Saccharose (5%) ergänzt worden war.
Um die Wechselwirkungs-Konjugation in Flüssigkeit durchzuführen, wurden die so erhaltenen F^–- und F⁺-Kolonien von den Agarplatten durch Abwaschen mit jeweils 20 ml flüssigem LB-Medium getrennt gesammelt. Diese beiden Gemische der E. coli-Clone wurden vorsichtig resuspendiert, dann sedimentiert und mit LB-Medium gewaschen. Die beiden Zell-Populationen wurden in 500 ml LB-Flüssigmedium kombiniert und 6 Stunden bei 37°C unter sanftem Schütteln inkubiert, um die Wechselwirkungs-Konjugation ablaufen zu lassen. Das so erhaltene Gemisch der E. coli-Zellen wurde 5 Min. durch sanfte Zentrifugation bei 3.000 UpM sedimentiert, zweimal mit 50 ml flüssigem LB-Medium gewaschen, und abschließend wurden 10 ml der so erhaltenen Zellsuspension auf jeweils fünf 24 × 24 cm große Agarschalen plattiert, die 300 ml des festen LB-Selektionsmediums enthielten, das mit Ampicillin (100 μg/ml), Kanamycin (50 μg/ml), Arabinose (0,2%) und Tetracyclin (35 μg/ml) ergänzt worden war (LB+Amp+Kan+Tet+Ara). Die Agarschalen wurden unter Verwendung eines Agar-Autoklaven und eine Pumpe (Integra, Schweiz) gegossen, um Variationen in der Farbe und der Tiefe des Agars von Schale zu Schale zu minimieren. Nach dem Plattieren wurden die Kolonien durch Inkubation der Schalen bei 37°C über 18 bis 24 Stunden angezogen.
Nach der Inkubation wuchsen die so erhaltenen E. coli-Zellen, die miteinander wechselwirkende Fusionsproteine exprimierten, auf der Oberfläche des selektiven Agars, und sie wurden unter Verwendung eines Labar-Pick-Systems wie in Abschnitt 10.2. beschrieben automatisch gepickt, mit der Ausnahme, dass die gepickten Clone in Mikrotiterplatten angeimpft wurden, die flüssiges LB-Medium enthielten, das mit Ampicillin (100 μg/ml), Kanamycin (50 μg/ml) und 10% (Vol./Vol.) Glycerin ergänzt worden war (LB+AMP+Kan/10% Gly). Die Wechselwirkungs-Genbank, die die E. coli-Zellen umfaßte, die in dem Mikrotiterplatten enthalten waren, wurde durch 18 bis 24 Stunden Inkubation bei 37°C angezogen. Es wurden zwei weitere Kopien der Wechselwirkungs-Genbank in neuen Mikrotiterplatten hergestellt, die LB+Amp+Kan/10% Gly-Anzuchtmedium enthielten, alle Platten wurden mit einem unverwechselbaren Strichcode markiert und bei –70°C gelagert, bis sie für die weitere Analyse benötigt wurden, wie vorstehend beschrieben. Fachleute werden erkennen, dass regelmäßige Gittermuster mit einer höheren Dichte dieser Clone leicht hergestellt werden können.
· Die Erzeugung eines regelmäßigen Gittermusters an Clonen aus einer Wechselwirkungs-Genbank auf ebenen Trägeren unter Verwendung der Automatisierung
Ein Tüpfelroboter mit hohem Durchsatzvolumen, wie z. B. ein solcher, der durch Lehrach et al. (1997) beschrieben wurde, wurde dazu verwendet, poröse ebene Träger mit einem regelmäßigen Gittermuster mit hoher Dichte von E. coli-Clonen aus der definierten Wechselwirkungs-Genbank zu konstruieren, die in den Mikrotiterplatten mit 384 Vertiefungen enthalten war, die vorstehend beschrieben wurde. Der Roboter registrierte die Positionen individueller Clone in dem Gittermuster hoher Dichte durch die Verwendung eines vordefinierten duplizierten Tüpfelmusters und des Strichcodes der Mikrotiterplatte. Die individuell nummerierten Membranlagen mit der Abmessung 222 × 222 mm (Hybond N+, Amersham, UK) wurden vorher in LB-Medium eingetaucht, dann auf eine Lage 3 MM-Filterpapier (Whatman, UK) gelegt, die ebenfalls vorher in LB-Medium eingetaucht worden war, und dann in die Aufnahmeeinheit des Roboters gelegt. Die Wechselwirkungs-Genbank wurde automatisch als Replika-Kopie auf diesen Membranen unter Verwendung eines Tüpfel-Werkzeuges mit 384 Nadeln angeordnet, das an dem Roboter befestigt war. Die Mikrotiterplatten aus der ersten Kopie der Wechselwirkungs-Genbank wurden in einem „duplizierten 5 × 5"-Muster um einen zentralen Markierungs-Tintenfleck herum auf 10 Nylon-Membranen Replika-getüpfelt, was Positionen für über 27.000 Clonen entspricht, die in einer Dichte von über 100 Tüpfeln pro cm² aufgetüpfelt wurden. Der Roboter erzeugte eine Datei der Daten, in der das hergestellte Tüpfelmuster und der Strichcode, der automatisch von jeder Mikrotiterplatte abgelesen worden war, aufgezeichnet wurde.
Jede Membran wurde vorsichtig auf etwa 340 ml festes Agarmedium in 24 × 24 cm großen Agarschalen gelegt. Sechs Membranen wurden auf LB+Amp+Kan-Tet-Agar überführt, der 0,2% Arabinose enthielt, und jeweils zwei der verbliebenen Membranen wurden entweder auf LB-Agar gelegt, der mit Kanamycin (50 μg/ml), Arabinose (0,2%) und tONPG (1 mM) ergänzt worden war (LB+Kan+Ara+tONPG), oder auf LB-Agar gelegt, der mit Ampicillin (100 μg/ml), Arabinose (0,2%) und Streptomycin (mit einer zur Gegenselektion geeigneten Konzentration) ergänzt worden war (LB+Amp+Ara+Sm). Die E. coli-Kolonien wurden durch 18 bis 24 Stunden Inkubation bei 37°C auf der Oberfläche der Membranen angezogen.
· Nachweis des Auswertungssystems in einem regelmäßigen Gittermuster
Zwei Membranen aus jedem der Selektionsmedien wurden weiter verarbeitet, um die Aktivität der β-Galactosidase unter Verwendung des Verfahrens von Breeden & Nasmyth (1985) nachzuweisen, und es wurde ein digitales Bild aufgenommen und im Computer gelagert, wie in Abschnitt 4.1. beschrieben. Unter Verwendung der Bildanalyse- und Computer-Systeme, die in Abschnitt 4.1. beschrieben wurden, wurden positive E. coli-Clone unter Berücksichtigung des Aktivierungszustandes des β-Galactosidase-Auswertungssystems identifiziert, nachdem die Clone auf den unterschiedlichen Selektionsmedien gewachsen waren. Die positiven Clone wurden als diejenigen identifiziert, die sich nach der Anzucht auf dem Selektionsmedium, das LB+Amp+Kan+Tet+Ara enthielt, blau färbten, aber nicht, wenn sie auf einem der Gegenselektionsmedien LB+Kan+Ara+tONPG oder LB+Amp+Ara+Sm gewachsen waren.
· Die Identifizierung individueller Mitglieder der Wechselwirkung
Ein positiver E. coli-Clon (als 15F09 identifziert), der miteinander wechselwirkende Fusionsproteine exprimierte, und der durch die Computersysteme wie vorstehend beschrieben nachgewiesen worden war, wurde einer aufbewahrten, eingefroren Kopie der Wechselwirkungs-Genbank entnommen. Beide Mitglieder, aus denen sich die Wechselwirkung zusammensetzte, wurden über eine spezifische PCR Amplifikation der inserierten Fragmente, die in den Plasmiden pBAD-αRNAP und pBAD30-cI enthalten waren, direkt aus der E. coli-Kultur unter Verwendung Plasmid-spezifischer Primer wiedergewonnen. Beide Mitglieder der Wechselwirkung wurden durch Standardverfahren sequenziert, und die Information wie in Beispiel 7 beschrieben in eine Datenbank eingetragen.
Wie in Abschnitt 4.1. beschrieben, können Anordnungen an DNA mit hoher Dichte, die Wechselwirkungs-Genbanken darstellen, oder Mitglieder, die eine Wechselwirkungs-Genbank umfassen, durch die Übertragung auf feste Träger über eine Vielzahl an Mitteln hergestellt werden. Um die Anwendbarkeit der DNA-Hybridisierung zur Identifizierung von E. coli-Clonen aufzuzeigen, die Plasmide tragen, welche miteinander wechselwirkende Fusionsproteine codieren, wurde eine Membran, die dem LB+Amp+Kan+Tet+Ara-Anzuchtmedium entnommen wurden, weiter verarbeitet, um gemäß dem Verfahren von Hoheisel et al. (1991) die DNA zu fixieren, die in den E. coli-Zellen enthalten war, aus denen sich die Wechselwirkungs-Genbank zusammensetzte. Das im pBAD-cI-Plasmid enthaltene inserierte Fragment des Clons 15F09 wurde durch das Verfahren von Feinberg & Vogelstein (1983) radioaktiv markiert und als Hybridiserungssonde zur Durchmusterung der DNA-Anordnung verwendet, und positive Signale wurden wie in Abschnitt 4.1. beschrieben identifiziert. Es wurde ein Clon (22C11) als mit der Sonde hybridisierend identifiziert, und durch Abfrage der in Abschnitt 4.1. beschriebenen Datenbank wurde gezeigt, dass es sich um einen positiven Clon handelte. Auf diese Weise können die weiteren Schritte eines Protein-Protein-Wechselwirkungs-Weges unter Berücksichtigung der Aktivierung des Reportergens in Hybridisierungs-positiven Clonen und der Wiedergewinnung der Plasmide, die die Mitglieder codieren, welche die Wechselwirkungen bilden, durch Hybridisierung identifiziert werden. Die Wiedergewinnung der Plasmide erlaubt weitere Untersuchungen, wie z. B. die DNA-Sequenzierung, um die Mitglieder zu identifizieren, oder die wiederholte Hybridisierung, um weitere Schritte des Protein-Protein-Wechselwirkungs-Weges zu identifizieren und somit ein Protein-Protein-Wechselwirkungs-Netzwerk wie in Abschnitt 6.6. beschrieben zu entwickeln.
Beipiel 11: Die Anwendung des verbesserten Zwei-Hybrid-Systems auf ein Säuger-Zwei-Hybrid-System
11.1. Stämme, Auswertungssysteme und Vektoren
Die aus menschlichen embryonalen Nieren-Fibroblasten stammende Zelllinie HEK 293 (oder einfacher 293-Zellen) ist für 2H-Studien in Säugern aufgrund ihrer hohen Empfänglichkeit für DNA während der Transfektion besonders geeignet (Graham, F. L. und Van der Eb, A. J. (1973), Virol. 54: 536–539; Graham, F. L., Smiley, J., Russel, W. C. und Nairn, R. (1977), J. Gen. Virol. 36: 59–72). Die Zelllinie ist von der ATCC erhältlich.
Es wurden die Plasmide mit den Namen pG5E1bEGFPneo, pG5E1bEGFPhyg oder pG5E1bEGFPpur verwendet, die Säuger-Auswertungssysteme tragen. Diese Plasmide enthalten das TATA-Element des adenoviralen E1b-Gens und fünf Tandem-Kopien des auf GAL4-reagierenden Elements (GAL4 responsive element) UAS_G (5'-CGGAGTACTGTCCTGCG-3') (Sadowski, I., Ma., J., Treizenberg, S. und Ptashne, M. (1988), Nature 335: 559–560), das direkt stromaufwärts der codierenden Sequenz für das verstärkte Grün-Floureszierende-Protein (EGFP; Yang, T. T., Cheng, L. und Kain, S. R. (1996), Nucl. Acids Res. 24(22): 4592–4593) positioniert ist. Diese Reporter-Plasmide werden durch den Ersatz der für die CAT codierenden Sequenz in pG5E1bCAT (Dang, C. V, Barrett, J., Villa-Garcia, M., Resar, L. M. S., Kato, G. J. und Fearon, E. R. (1991), Mol. Cell. Biol. 11: 954–962) durch die EGFP codierende Sequenz und dem Einbau entweder des Neomycin-, des Hygromycin- oder des Puromycin-Resistenzmarkergens (neo^r, hyg^r oder pur^r) unter Verwendung von Standard-Subclonierungsverfahren erzeugt.
Die Plasmide pMneo1, 2, 3 oder pMhyg1, 2, 3, die aus pM1, 2, 3 (Sadowski, I., Bell, B., Broad, P. und Hollis, M. (1992), Gene 118: 137–141) durch Insertion der neo^r- oder des hyg^r-Markergens unter Verwendung von Standard-Subclonierungsverfahren abgeleitet wurden, sind Reihen (1, 2, 3 entspricht den drei möglichen Leserastern) verbesserter Gal4p-Fusionsvektoren, die aus dem Plasmid pSG424 abgeleitet wurden, welches zur Expression von Fusionsproteinen in Säugern entworfen wurde, die die DNA-Bindedomäne des Hefe-Gal4-Proteins tragen (Sadowski, I. und Ptashne, M. (1989), Nucl. Acids Res. 17: 7539). Dieser Vektor enthält einen Polylinker, dem die codierende Sequenz für die Aminosäuren 1-147 des Gal4p vorangestellt ist. Daher kann durch Einbau von cDNA-Sequenzen in den Polylinker-Bereich der pSG424/pM-Vektoren ein Hybrid-Leseraster erzeugt werden, das ein Gal4p- Fusionsprotein codiert. Die Transkripte des Hybrid-Leserasten werden am frühen SV40-Promotor initiiert, und ihre Prozessierung wird durch das Polyadenylierungssignal aus SV40 erleichtert. Alternativ werden die Hybrid-Leseraster in pLXSN oder irgendeinen ähnlichen retroviralen Vektor subcloniert, um die durch Verpackungszelllinien unterstützte Infektion der Zielzellen zu ermöglichen.
Die Plasmide pVP-Nconeo und pVP Ncohyg wurden von dem Vektor pVP-Nco abgeleitet (Tsan, J., Wang, Z., Jin., Y., Hwang. L., Bash, R. O., Baer, R.: The Yeast Two-Hybrid System, 1. Ausgabe, Hrsg.: Bartel, P. L., Fields, S., New York, Oxford University Press (1997), S. 217–232), dies erfolgte durch den Einbau des neo^r- oder des hyg^r-Markergens unter Verwendung von Standard-Subclonierungsverfahren. pVP-Neo wiederum ist eine verbesserte Version des Plasmids pNLVP16, das zur Expression von Fusionsproteinen mit dem Herpes-simplex-Virus-Protein VP16 für Säugerzellen konstruiert wurde (Dang, C. V, Barrett, J., Villa-Garcia, M., Resar, L. M. S., Kato, G. J. und Fearon, E. R. (1991), Mol. Cell. Biol. 11: 954–962). Der Polylinker-Sequenz ist eine künstliches Leseraster vorangestellt, das die elf aminoterminalen Reste von Gal4p (MKLLSSIEQAC), das Kern-Lokalisierungs-Signal des großen T-Antigens von SV40 (PKKKRKVD) und die saure transaktivierende Domäne (Aminosäuren 411-456) des VP16-Proteins umfaßt. Alternativ werden die Gal4 (1-147) umfassenden Hybrid-Leseraster und individuelle Sequenzen aus einer cDNA-Genbank in pLXSN oder irgendeinen ähnlichen retroviralen Vektor subcloniert, um die durch Verpackungszelllinien unterstützte Infektion der Zielzellen zu ermöglichen.
11.2. Nachweis und Identifizierung miteinander wechselwirkender Proteine
Eine Anzahl monoclonaler 293-Zelllinien, die das pG5E1bEGFPneo-, das pG5E1bEGFPhyg- oder das pG5E1bEGFPpur-Auswertungssystem stabil enthalten, werden durch das Verfahren der Calciumphosphat-Transfektion (Chen, C. und Okayama, H. (1987), Mol. Cell. Biol. 7: 2745–2752), über Lipofektamin-Transfektion oder irgendein anderes übliches Transfektionsverfahren erzeugt, darauf erfolgt die Selektion mit G418, beziehungsweise mit Hygromycin B (HygB) oder Puromycin enthaltendem Medium. Anschließend wird untersucht, welcher spezielle Clon sich besonders gut für das Verfahren der Erfindung eignet (die Anzahl der Kopien des Auswertungssystems und der/die Ort/e des Einbaus in ein/die Wirtschromosomen können die Expressionsspiegel und die Induzierbarkeit des Reportergens beeinflussen).
Die ausgewählte 293-G5E1bEGFPneo-, 293-G5E1bEGFPhyg- oder 293-G5E1bEGFPpur-Reporter-Zelllinie wird als „modifizierter Wirtszell-Stamm" dazu verwendet, das Verfahren der Erfindung (Nachweis und Identifizierung miteinander wechselwirkender Proteine) durchzuführen.
Zwei Sammlungen, die alle drei Leseraster der beiden Vektorenreihen pMneo oder pMhyg und pVP-Nconeo oder pVP-Ncohyg repräsentierten, wurden durch Verdau mit NotI/SalI und Vereinigung von jeweils 1 μg der Vektoren pMneo/pMhyg 1, 2, 3, beziehungsweise pVP-Nconeo/pVP-Ncohyg 1, 2, 3 hergestellt. 300 ng eines cDNA-Insertionen-Gemisches, das wie in Abschnitt 6.1. isoliert worden war, wurde in zwei gleiche Fraktionen aufgeteilt und mit jeweils 50 ng jeder Sammlung der hergestellten Vektorenreihen ligiert. Nach der Ligierung wurde jede Reaktion getrennt in elektrokompetente E. coli-Zellen transformiert, und es wurden rekombinierte Clone jeder Genbank auf fünf 24 × 24 cm großen Platten mit Ampicillin selektiert. Durch Abwaschen der plattierten Zellen und anschließende QiaPrep-Plasmid-Extraktion des Waschgemisches wurden wie vorstehend beschrieben etwa 500 μg der pVP-Nconeo/pVP-Ncohyg- und 500 μg der pMneo/pMhyg-Genbank aus den E. coli-Transformanten extrahiert. 16 μg jedes Vektors wurden dazu verwendet, eine 10 cm-Platte mit 293-Zellen zu transfizieren.
11.3. Die Vorselektion falsch-positiver Clone durch visuelle Unterscheidung
Die pMneo1, 2, 3- oder die pMhyg1, 2, 3-Plasmide, die die mit der Gal4-DNA-Bindedomäne fusionierte cDNA-Genbank enthielten, wurden in die ausgewählte 293-Reporter-Zellline transfiziert. Zur Infektion mit Retroviren werden konstruierte Verpackungs-Zelllinien mit den entsprechenden retroviralen Vektoren transfiziert, und der die Viren enthaltende Überstand solcher Kulturen wird dann dazu verwendet, die Reporter-Zellinie zu infizieren (gemäß Standardvorschriften; z. B. Redemann, N., Holzmann, v. Rüden, T., Wagner, E. F., Schlessinger, J. und Ullrich, A. (1992), Mol. Cell. Biol., 12: 491–498). Die Transfektions- und die Infektionsvorschriften können durch die Einstellung der Plasmidkonzentration zur Transfektion oder des Virus-Titers während der Infektion auf solche Weise optimiert werden, dass im Durchschnitt nur jeweils ein Plasmid pro Zelle eingeführt wird. Die Antibiotika G418 oder HygB werden verwendet, um erfolgreich transfizierte/infizierte Reporterzellen zu selektieren.
Zu diesem Zeitpunkt ist es nötig, diejenigen Zellen auszuschließen, die als Folge davon, dass sie nur ein DNA-Bindedomäne-Fusionsprotein exprimieren, eine Aktivierung des Auswertungssystems zeigen (in diesem Fall wird das Fusionsprotein als „Autoaktivator" bezeichnet), statt dass sie die gleichzeitige Expression eines geeigneten (mit ihnen in Wechselwirkung tretenden) Fusionsproteins mit der transaktivierenden Domäne benötigen. Daher wird die so erhaltene polyclonale Sammlung der stabil transfizierten/infizierten Reporter-Zellen unter Verwendung des Auswertungssystems einer Vorselektions-Durchmusterung unterworfen, um visuell Zellen zu unterscheiden, die autoaktivierende Fusionsproteine exprimieren. Bei dem auf EGFP basierenden Auswertungssystem können Zellen, die Autoaktivatoren exprimieren, durch Durchmusterung auf die Expression von EGFP hin identifiziert werden, d. h. folglich auf die Fähigkeit der entsprechenden Zellen, grünes Fluoreszenz-Licht (507 nm) nach Anregung mit der geeigneten Anregungs-Wellenlänge (488 nm) abzustrahlen (Yang, T. T., Cheng, L. und Kain, S. R. (1996), Nucl. Acids Res. 24(22): 4592–4593). Die Überwachung und die Aufzeichnung der Aktivierung des Auswertungssystems erfolgt entweder über das Auge unter Verwendung eines Fluoreszenz-Mikroskops oder durch ein automatisiertes Nachweisgerät. Die Zellen, die das GFP-Reportersystem aktivierten, wurden visuell unterschieden und von anderen Zellen aussortiert, die das Reportersystem nicht aktivieren, dies erfolgte unter Verwendung eines Fluoreszenzunterstützten Zellsortierungs-Geräts (FACS). Alternativ kann die Eliminierung falsch-positiver Zellen, die Autoaktivatoren exprimieren, entweder manuell oder durch Entfernung/Abtötung von Zellen mittels einer Saugpumpe oder eines Mikromanipulators erfolgen oder durch ein mit einem Detektor verbundenen automatisierten System, das Mikromanipulatoren oder eine Laser-Abtragungs-Vorrichtung benutzt.
Nach dem Ausschluß der Zellen, die autoaktivierende Fusionproteine exprimieren, wird die verbleibende polyclonale Sammlung der 293-Reporterzellen, die DNA-bindende Fusionsproteine exprimieren, dann einem zweiten Transfektions/Infektions-Schritt unterzogen, wie vorstehend beschrieben wurde, dies erfolgt unter Verwendung der pVP-Nconeo- oder der pVP-Neohyg-Plasmide oder der entsprechenden retroviralen Derivate, die die cDNA-Genbank enthalten, die mit der VP16-Transaktivator-Sequenz fusioniert ist. Hiernach ist die Selektion erfolgreich transfizierter/infizierter Zellen unter Verwendung der Antibiotika G418 oder HygB optional. Wenn eine Selektion gewünscht wird, muß sichergestellt sein, dass der Resistenzmarker, der einen Teil des Auswertungssystems darstellt, sich von den Markergenen in den Vektoren unterscheidet, mit denen vorher transfiziert/infiziert wurde. Die Zugabe der Antibiotika, die auf den zweiten Transfektions/Infektions-Vektor hin selektieren, kann notwendig sein, wenn die anschließenden Durchmusterungsverfahren und die Verfahren zur abschließenden Selektion mehrere Tage zur Fertigstellung benötigen, um einen Verlust oder eine Ausdünnung der Plasmide bei Abwesenheit des Selektionsdrucks zu verhindern. Eine vollständige Selektion eliminiert auch Zellen, die nicht erfolgreich kotransfiziert wurden (d. h. ein pVP-Nco-Plasmid nicht erhalten haben), obwohl solche Zellen kein Hauptproblem darstellen (so lange die Transfektions/Infektions-Effizienz hoch ist), da sie durch die Wechselwirkungs-Durchmusterung sowieso nicht identifiziert werden würden. Man sollte auch anmerken, dass je länger die Zellen bis zur Zelllyse (und der molekularen Analyse der miteinander wechselwirkenden Proteine und ihrer entsprechenden cDNA-Sequenzen) in Kultur gehalten werden, es immer wahrscheinlicher wird, dass diejenigen cDNAs verloren gehen, die für mehr oder weniger toxische Fusionsproteine codieren.
11.4. Die automatisierte Identifizierung von Zellen, die miteinander wechselwirkende Proteine exprimieren
Die so erhaltene polyclonale Sammlung doppelt transfizierter Reporterzellen wird dann der visuellen Durchmusterung auf miteinander wechselwirkende Proteine unterworfen, wie sie für die visuelle Vorselektion beschrieben wurde. Grün fluoreszierende („positive") Zellen, die die Expression der beiden miteinander wechselwirkenden Proteine anzeigt, wurden automatisch aussortiert, dies erfolgte unter Verwendung eines FACS-Systems, um die Zellen in einem regelmäßigen Gittermuster in den Vertiefungen einer Mikrotiterplatte anzuordnen. Anschließend wurde eine PCR der einzelnen Zellen und eine DNA-Sequenzierung durchgeführt, um die Mitglieder zu identifizieren, aus denen sich die Wechselwirkungen zusammensetzen. Alternativ können die positiven Zellen auf einer Kulturschale in einer regelmäßigen Anordnung, bzw. einem Gittermuster ausgesät werden. Die Zellen können auch jede für sich in die kleinen Vertiefungen einer Schale mit mehreren Vertiefungen gegeben werden und mit einem geeigneten, mit Wachstumsfaktor ergänzten, Medium oder mit einem konditionierten Medium versorgt werden, um den Zellen in Abwesenheit von anderen Zellen, Überleben und Wachstum zu ermöglichen.
11.5. Die doppelte Vorselektion und die Zellfusion
Die Vorschrift zur Kotransfektion, die vorstehend beschrieben wurde, umfaßt nur eine einzige Vorselektion (anstelle einer doppelten Vorselektion). Sie enthält nicht die Möglichkeit einer Vorselektion falsch-positiver Clone, die durch die pVP-Nco-Plasmide (die cDNA-Fusions-Genbank mit der transaktivierenden Domäne) entstehen. Obwohl die Zahl der falsch-positiven Clone mit den pVP-Nco-Plasmiden gewöhnlich viel geringer ist, als die mit den pM1, 2, 3-Vektoren (d. h. der cDNA-Fusions-Genbank mit der DNA-Bindedomäne), kann es unter Umständen nötig sein, eine doppelte Vorselektion vorzunehmen.
Zu diesem Zweck werden zwei unterschiedliche polyclonale Sammlungen stabiler Zelllinien, die entweder Mitglieder der pM- oder Mitglieder der pVP-Nco-cDNA-Fusions-Genbank exprimieren, durch Transfektion/Infektion der 293-Reporter-Zelllinie erzeugt und mittels der entsprechenden (unterschiedlichen) Antibiotika (G418 und HygB) wie vorstehend beschrieben selektiert. Beide Sammlungen der Zelllinien werden dann getrennt der Vorselektion und dem Ausschluß der falsch-positiven Clone unterzogen, wie vorstehend in Einzelheiten beschrieben wurde.
Um beide Fusionsvektoren und ihre entsprechenden exprimierten Fusionsproteine in einer Zelle zu kombinieren, werden individuelle Zellen beider Sammlungen der Zelllinien unter Verwendung von auf dem neuesten Stand befindlichen Zellfusions-Vorschriften fusioniert, dies umfaßt die PEG-unterstützte Elektrofusion, wie in Li, L.-H. und Hui, S. W. (1994), Biophys. J. 67: 2361–2366; Hui, S. W., Stoicheva, N. und Zhao, Y.-L (1996), Biophys. J. 71: 1123–1130 und in Stoicheva, N. und Hui, S. W. (1994), Membrane Biol. 140: 177–182 beschrieben. Gewünscht wird die Fusion zwischen einer Zelle aus jeder Sammlung. Zu diesem Zweck wird, wie vorstehend beschrieben, eine Zelle aus jeder Sammlung in eine Vertiefung einer Schale mit mehreren Vertiefungen planiert. Nach der Zellfusion werden die kombinierten Zellen der visuellen Auswahl unterzogen. Die Zellen werden in der gleichen Schale zur visuellen oder zur automatisierten Durchmusterung belassen oder gesammelt und über FACS sortiert.
11.6. Die doppelte Vorselektion und die Zellfusion unter Verwendung eines induzierbaren Expressionssystems
Ein Nachteil der vorstehend beschriebenen doppelten Vorselektion besteht darin, dass Proteine mit toxischen oder die Zellteilung hemmenden Wirkungen, und ihre entsprechenden cDNAs im Verlauf des langwierigen Selektionsvorgangs verloren gehen, der notwendig ist, um polyclonale Sammlungen stabiler Zelllinien für beide cDNA-Fusions-Genbank-Sequenzen zu errichten. Um den Ausschluß der cDNA-Sequenzen zu verhindern, die für toxische oder die Zellteilung hemmende Proteine codieren, kann man die doppelte Vorselektions-Strategie mit dem folgenden induzierbaren System verbinden.
Der Wirtszell-Stamm ist eine 293-Zelllinie, die einen durch Tetracyclin(Tet)-kontrollierten Transaktivator (tTA) exprimiert, der eine Fusion der Aminosäuren 1-207 des Tetracyclin-Repressors (TetR) mit der C-terminalen Aktivierungsdomäne (130 Aminosäuren) des VP16-Proteins des Herpes-Simplex-Virus darstellt. Die Zelllinie wird als 293-Tet-Aus (293-Tet-Off) bezeichnet, da tTA in der Lage ist, die Transkription eines durch die Tet-Operator-Sequenz (tetO) kontrollierten Gens nur bei Abwesenheit von Tet zu aktivieren. Die umgekehrte Situation besteht in der 293-Tet-Ein(293-Tet-On)-Zelllinie, die einen reversen tTA ((r)tTA) stabil exprimiert, der die Anwesenheit von Tet erfordert, um die Transkription der durch tetO regulierten Gene zu induzieren. Sowohl die 293-Tet-Aus als auch die 293-Tet-Ein-Zelllinie ist resistent gegenüber G418 (neo^r). Diese Zelllinien sind über Clontech Inc. erhältlich. Die tTA-Plasmide, die dazu verwendet wurden, die 293-Tet-Aus und die 293-Tet-Ein-Zelllinie zu erzeugen, werden in Gossen, M. und Bujard, H. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci USA 89: 5547–5551 und in Gossen, M., Freundlieb, S., Bender, G., Müller, G., Hillen, W. und Bujard, H. (1995), Science 268: 1766–1769 beschrieben.
Die 293-Tet-Ein oder -Aus-Zelllinie werden dann mit einem Auswertungssystem (beschrieben in 11.1.) transfiziert, und es werden die Reporter-Zelllinien 293-Tet-Ein- oder Aus-pG5E1bEGFPhyg/pur durch Selektion mit G418 oder mit HygB erzeugt.
Die Sequenzen der Gal4-DNA-Bindedomäne und der SV40-Kern-Lokalisierungs-Signal/VP16-transaktivierenden Domäne (Einzelheiten und Referenzen wie in 11.1. beschrieben) werden aus dem pM- und dem pVP-Nco-Plasmid erhalten und getrennt in den Polylinker von pREV-TRE subcloniert, einem retroviralen Vektor (Clontech Inc.), um pREV-TRE-Gal4 und pREV-TRE-VP16 zu erzeugen. pREV-TRE enthält das retrovirale erweiterte Verpackungssignal Ψ+, das die Herstellung infektiöser, aber zur Replikation unfähiger Viren in Verbindung mit einer Verpackungszelllinie wie z. B. PT67 erlaubt, gefolgt von einem hyg^r-Gen (Selektionsmarker) und sieben Kopien von tetO, die an den minimalen Promotor des Cytomegalovirus (CMV) direkt 5' des Polylinkers fusioniert sind. Ψ+ und die Polylinker-Sequenzen werden 5', beziehungsweise 3' von LTRs flankiert. pREV-TRE ist von Clontech Inc. erhältlich. Die cDNA-Genbanken werden in den Polylinker von pREV-TRE cloniert.
Die vorstehend beschriebenen Reporter-Zelllinien werden getrennt mit entweder aus pREV-TRE-Gal4 oder mit aus pREV-TRE-VP16 stammenden retroviralen Partikeln infiziert. Eine polyclonale Sammlung neuer stabiler Zelllinien wird in beiden Fällen unter Verwendung des Resistenz-Selektions-Markergens hyg^r selektiert. Die vorübergehende (transiente) Expression der Fusionsproteine von den pREV-TRE-Plasmiden muß durch Entzug (Tet-Aus) oder durch Zugabe (Tet-Ein) von Tet induziert werden, um die doppelte Vorselektion und den Ausschluß falsch-positiver Clone wie vorstehend beschrieben zu ermöglichen.
11.7. Die Zellfusion und die Selektion von Zellen, die miteinander wechselwirkende Proteine exprimieren
Die verbleibenden polyclonalen Sammlungen der Zelllinien werden dann wie vorstehend beschrieben der Zellfusion unterworfen. Die Konzentration an HygB im Anzuchtmedium wird erhöht, um einen möglichen Verlust jedes Bestandteils des Paares der Fusionsprotein-cDNA-Sequenzen, die in allen fusionierten Zellen vorliegen, zu minimieren. Zum Nachweis positiver Clone, d. h. der Zellen, die ein Paar an miteinander wechselwirkenden Proteinen exprimieren (wie in Einzelheiten vorstehend beschrieben), muß die Expression der Fusionsproteine durch Zugabe oder durch Entzug von Tet induziert werden.
Literaturreferenzen

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Tabelle 1 Oligonucleotid-Adaptoren zur Konstruktion der neuen Hefe-Zwei-Hybrid-Vektoren pBTM118 a, b und c sowie pGAD428 a, b und c
Tabelle 2 Zwei-Hybrid-Vektoren, die zur Expression von Fusionsproteinen verwendet wurden
Tabelle 3 Hefestämme, die zur Gegenselektion mit 5-FOA und der automatisierten Wechselwirkungs-Paarung verwendet wurden
Tabelle 4 Identifizierung von Fusionsproteinen, die das URA3-Auswertungssystem aktivierten

SD-Trp-Ade: Selektionsmedium ohne Tryptophan und Adenin.
SD-Trp-Ade+5-FOA: Selektionsmedium mit 0,2% 5-FOA.
SD-Trp-Ade-Ura: Selektionsmedium ohne Tryptophan, Adenin und Uracil.

SD-Leu-Ade: Selektionsmedium ohne Leucin und Adenin.
SD-Leu-Ade+5-FOA: Selektionsmedium mit 0,2% 5-FOA.
SD-Leu-Ade-Ura: Selektionsmedium ohne Leucin, Adenin und Uracil.

Tabelle 5
Identifizierung von Fusionsproteinen, die das LacZ-Auswertungssystem aktivierten
A. L40ccu-Hefezellen, die mit den pBTM117c-Plasmidkonstrukten transformiert worden waren und die ein Fusionsprotein exprimierten, das die LexA-DNA-Bindedomäne umfaßt, wurden auf Minimalmedium ohne Tryptophan plattiert, das mit Kaliumphosphat auf den pH-Wert 7,0 gepuffert war und 2 μg/ml X-Gal enthielt (SD-Trp/X-Gal): Ergebnisse über den Zustand des Auswertungssystems für verschiedene autoaktivierende und nicht autoaktivierende Fusionsproteine.
Tabelle 5 – Fortsetzung
B. L40ccuα-Hefezellen, die mit den pGAD427-Plasmidkonstrukten transformiert worden waren und die ein Fusionsprotein exprimierten, das die GAL4ad-Aktivierungsdomäne umfaßt, wurden auf Minimalmedium ohne Leucin plattiert, das mit Kaliumphosphat auf den pH-Wert 7,0 gepuffert war und 2 μg/ml X-Gal enthielt (SD-Leu/X-Gal): Ergebnisse über den Zustand des Auswertungssystems für verschiedene autoaktivierende und nicht autoaktivierende Fusionsproteine.

Claims

Verfahren zur Identifizierung von mindestens einem Mitglied eines Paares oder Komplexes wechselwirkender Moleküle, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Bereitstellen von Wirtszellen, die mindestens zwei genetische Elemente mit unterschiedlichen selektierbaren und gegenselektierbaren Markern enthalten, wobei die genetischen Elemente jeweils eine genetische Information umfassen, die eines der Mitglieder näher bestimmt, wobei die Wirtszellen weiterhin ein Auswertungssystem ("Readout-System") tragen, das durch die Wechselwirkung der Moleküle aktiviert wird; (b) gegebenenfalls Zulassen des Eintretens von mindestens einer Wechselwirkung; (c) Selektieren auf die Wechselwirkung durch Übertragen von Nachkommen der Wirtszellen auf: (ca) mindestens zwei verschiedene selektive Medien, wobei jedes dieser selektiven Medien das Wachstum der Wirtszellen nur in Abwesenheit von mindestens einem gegenselektierbaren Marker und in Anwesenheit eines selektierbaren Markers erlaubt; und (cb) ein weiteres selektives Medium, das die Identifizierung der Wirtszellen nur nach Aktivierung des Auswertungssystems erlaubt; (d) Identifizieren der Wirtszellen, die wechselwirkende Moleküle enthalten, die (da) das Auswertungssystem nicht auf einem der in (ca) näher beschriebenen selektiven Medien aktivieren; und (db) das Auswertungssystem auf dem in (cb) näher beschriebenen selektiven Medium aktivieren; und (e) Identifizieren von mindestens einem Mitglied des Paares oder Komplexes wechselwirkender Moleküle.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Paar oder der Komplex wechselwirkender Moleküle ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus RNA-RNA-, RNA-DNA-, RNA-Protein-, DNA-DNA-, DNA-Protein-, Protein-Protein-, Protein-Peptid- oder Peptid-Peptid-Wechselwirkungen.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die genetischen Elemente Plasmide, künstliche Chromosomen, Viren oder andere extrachromosomale Elemente sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Wechselwirkungen zur Bildung eines funktionellen Transkriptionsaktivators führen, der eine DNA-bindende und eine transaktivierende Proteindomäne umfasst und eine reagierende Einheit aktivieren kann, die die Aktivierung des Auswertungssystems auslöst.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Auswertungssystem ein nachweisbares Protein ist.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das nachweisbare Protein von mindestens einem der Gene lacZ, HIS3, URA3, LYS2, sacB, tetA, gfp oder HRPT codiert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Wirtszellen Hefezellen, Bakterienzellen, Säugerzellen, Insektenzellen oder Pflanzenzellen sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, weiterhin umfassend das Transformieren oder Transfizieren der Wirtszellen mit den genetischen Elementen vor Schritt (a).
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei Zellfusion, Konjugation oder Wechselwirkungspaarung zur Herstellung der Wirtszellen mit den genetischen Elementen vor Schritt (a) verwendet werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die gegenselektierbaren Marker, gegen die in Schritt (ca) selektiert wird, ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus CAN1, CYH2, LYS2, URA3, lacY, rpsL, HPRT und sacB.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei der selektierbare Marker ein auxotropher oder antibiotischer Marker ist.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei der auxotrophe oder antibiotische Marker LEU2, TRP1, URA3, ADE2, HIS3, LYS2 oder Zeocin ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die Nachkommen der Wirtszellen von Schritt (b) auf ein Speicherkompartiment übertragen werden.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Übertragung durch Automation oder einen Pickroboter durchgeführt oder unterstützt wird.
Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, wobei das Speicherkompartiment ein Frostschutzmittel umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 15, wobei das Speicherkompartiment eine Mikrotiterplatte ist.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Mikrotiterplatte 384 Vertiefungen umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei die Übertragung in Schritt (c) durch Automation, einen Tüpfel ("Spot")-Roboter, ein Pipettier- oder Mikropipettiergerät durchgeführt oder unterstützt wird.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei die Übertragung auf einen ebenen Träger erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, wobei die Übertragung in einem regelmäßigen Gittermuster mit Dichten von 1 bis 1000 Clonen pro cm² stattfindet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 19 oder 20, wobei der ebene Träger eine Membran ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21, wobei die Identifizierung der Wirtszellen in Schritt (d) durch visuelle Mittel unter Berücksichtigung des Aktivierungszustands des Auswertungssystems erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22, wobei die Identifizierung der Wirtszellen in Schritt (d) durch digitale Bildspeicherung, -analyse oder -verarbeitung erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 23, wobei die Identifizierung des mindestens einen Mitglieds des Paars wechselwirkender Moleküle durch Nuc leinsäurehybridisierung, Antikörperbindung oder Nucleinsäuresequenzierung erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei die durch die Antikörperreaktion oder die Hybridisierung durchgeführte Identifizierung unter Verwendung regelmäßiger Gitter von dem mindestens einen Mitglied oder von der genetischen Information, die das mindestens eine Mitglied codiert, erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei die Bildung der regelmäßigen Gitter durch Automation oder einen Tüpfelroboter erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 26, wobei die Identifizierung durch digitale Bildspeicherung, -verarbeitung oder -analyse durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 27, wobei die Nucleinsäuremoleküle vor der Identifizierung mittels PCR oder als Teil der genetischen Elemente, bevorzugt in Bakterien, besonders bevorzugt in E. coli, amplifiziert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 28, wobei vor Schritt (a) eine Vorauswahl gegen Clone, die ein einzelnes Molekül exprimieren, das das Auswertungssystem aktivieren kann, auf Kulturmedien durchgeführt wird, die eine gegenselektive Verbindung umfassen.
Verfahren nach Anspruch 29, wobei die gegenselektive Verbindung 5-Fluor-Orotsäure, Canavanin, Cycloheximid, Saccharose, tONPG, Streptomycin oder α-Aminoadipat ist.
Kit, umfassend (f) Wirtszellen wie in einem der vorangehenden Ansprüche identifiziert, die mindestens zwei genetische Elemente enthalten, wobei die genetischen Elemente jeweils genetische Information umfassen, die eines der möglicherweise wechselwirkenden Moleküle näher bestimmen, und einen gegenselektierbaren Marker und ein Auswertungssystem umfassen; (g) ein Medium, das auf die Abwesenheit des ersten der gegenselektierbaren Marker, die Anwesenheit des zweiten der gegenselektierbaren Marker und die Aktivierung des Auswertungssystems selektiert; und (h) ein Medium, das auf die Anwesenheit des ersten der gegenselektierbaren Marker, die Abwesenheit des zweiten der gegenselektierbaren Marker und die Aktivierung des Auswertungssystems selektiert.
Kit nach Anspruch 31, wobei die Wirtszellen in Form von Kolonien vorliegen, die auf einem Träger in einem regelmäßigen Gittermuster getüpfelt wurden.
Kit nach Anspruch 31 oder 32, wobei das Auswertungssystem so ausgewählt ist, dass der Aktivierungszustand des Auswertungssystems in den Wirtszellen durch visuelle Mittel bestimmt werden kann, wobei der Kit weiterhin Mittel zur parallelen Bestimmung des Zustands des Auswertungssystems von mehr als einer der Wirtszellen durch visuelle Mittel umfasst.