JP2001525186A - 相互作用分子の同定および特性決定 - Google Patents

相互作用分子の同定および特性決定

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マックス−プランク−ゲゼルシャフト ツール フォルデルング デル ヴィッセンシャフテン エー．ファウ．
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ツーハイブリッドシステムにより分離されたむしろ大多数の偽陽性クローンから陽性クローンを検出するように設計された、相互作用分子を同定し、任意に特徴付けるための改良方法に関する。本発明の方法は、偽陽性クローンから相互作用分子を発現するクローンを検出するために用いられる選択ステップの新規な組合せに基づいたものである。本発明はさらに、本発明の方法の実施に有用なキットに関する。本発明は、相互作用分子を確実に同定するための同時の、高スループットのまたは自動化された相互作用スクリーニング方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、従来のツーハイブリッドシステムにより分離されたむしろ大多数の
偽陽性クローンから陽性クローンを検出するように設計された、相互作用分子を
同定し、任意に特徴づけるための改良法に関する。本発明の方法は、偽陽性クロ
ーンから相互作用分子を発現するクローンを検出するために用いられる選択ステ
ップの新規な組合せに基づいたものである。本発明はさらに、本発明の方法を実
施するのに有用なキットに関する。本発明は、同時の、高スループットのまたは
自動化された、相互作用分子を確実に同定するための相互作用スクリーニングを
提供する。
【０００２】 タンパク質-タンパク質相互作用は、複製、転写、分泌、シグナル伝達および 代謝のような、ほとんど全ての生物学的プロセスにとって不可欠なものである。
共免疫沈降または架橋などの相互作用を同定するための古典的な方法は、全ての
タンパク質に適用できるとは限らず、また、十分な感度がない場合もある。上記
の方法にはさらに、相互作用する可能性のあるパートナーおよび対応する核酸の
断片もしくは配列を同定するには莫大なエネルギーが必要である、という難点が
ある。通常、これは、タンパク質の配列決定または抗体の産生と、それに続く発
現ライブラリーのスクリーニングにより実施される。
【０００３】 タンパク質-タンパク質相互作用の簡便な同定のための重要な進展は、Fields およびSong（1989）により提起された酵母のツーハイブリッド（2H）系であった
。この遺伝的手法は、in vivo相互作用の迅速な証明を可能にするだけでなく、 相互作用パートナーをコードする対応する核酸配列の簡易な単離も可能にする。
酵母ツーハイブリッド系は、２つの分離可能な機能性ドメイン（すなわち、一方
のDNA結合ドメインと、他方のRNA-ポリメラーゼ複合体を活性化するドメインで ある活性化ドメイン）を保有する多種多様な真核生物転写因子の特徴を利用する
。この古典的な2H系では、DNA結合ドメイン（GAL4bdまたはlexA）と関心のある タンパク質「Ｘ」とを含むいわゆる「ベイト」（bait：餌）タンパク質が酵母内
で融合タンパク質として発現される。同じ酵母細胞はまた、同時に、活性化ドメ
イン（GAL4adまたはVP16）およびタンパク質「Ｙ」を含むいわゆる「フィッシュ
」（fish：魚）タンパク質も発現する。ベイト・タンパク質とフィッシュ・タン
パク質とが相互作用すると、これらの融合タンパク質のDNA結合ドメインおよび 活性化ドメインが近接するようになり、その結果生じるタンパク質複合体がレポ
ーター遺伝子（例えばHIS3またはlacZ）の発現を誘発する。この発現は、ヒスチ
ジン不含の選択培地上での該酵母細胞の培養により、またはlacZ遺伝子の活性化
により容易にモニターできる。例えば未知のフィッシュ・タンパク質をコードす
る遺伝子配列は、対応するプラスミドを単離し、続いて配列分析を行うことによ
り容易に同定可能である。一方、2H系の改変系がいくつか開発されている。それ
らの中で最も重要なものは、プロモーター結合タンパク質を同定するための「ワ
ンハイブリッド（one-hybrid）」系、RNA-タンパク質相互作用を同定するための
「トリハイブリッド(tri-hybrid)」系（LiおよびHershowitz, 1993；SenGuptaら
, 1996；Putzら, 1996）である。生物学上の系に見られる様々な相互作用を同定
、検出およびアッセイするために異なる2Ｈ系を使用しなければならないことは 、当分野で理解されている。実際、その他の2Ｈ技術が発達し、タンパク質-タン
パク質相互作用を別の生物体および/また異なる細胞コンパートメントの中で調 査することが可能になった。例えば、哺乳動物細胞中（Rossiら、1997 ; PNAS 9
4:8405-8410)、細菌細胞中（Karimovaら、1998 ; PNAS 95:5752-5756)、酵母細 胞の細胞質中（Johnsson & Varshavsky ; 1996 US 5503977)および酵母細胞の周
辺孔中（Fowlkesら、1998 ; US 5789184)などである。
【０００４】 これらタンパク質-タンパク質相互作用を同定するための2Ｈ系は今日まで、ベ
ンチスケールでしか実施されなかった。これらの系の種々のステップは連続的に
実施する必要がある。従って、非常に時間がかかる。その結果、これらの2Ｈ系 はこれまでのところ、タンパク質-タンパク質ネットワークを調査するための真 核ライブラリー対ライブラリスクリーニングの分析に適していないことが明らか
となった。最近の進展においてはこれらの不利な点が考慮されているが（Bartel
ら、1996）、例えば、真核ライブラリー対ライブラリースクリーニングに基づい
た相互作用タンパク質の大規模な探索の成功例は報告されていない。また、さら
に重要なことに2Ｈシステムは、結合相手となんら相互作用を見せない偽陽性ク ローンが大量に単離されてしまうという重大な欠点を有している。これは、多数
のクローンを分析しなければならないような場合、特に都合が悪い。なぜなら、
真核ライブラリー対ライブラリースクリーニングの場合、数十万のクローンをタ
ンパク質-タンパク質ネットワークの調査のために分析しなければならないこと が典型的だからである。
【０００５】 従って、本発明の背景にある技術的問題は、これら従来技術の困難を克服し、
相互作用分子を発現するクローンを確実に産生する系を供給することであった。
さらにこの系は、同時の、ハイスループットまたは自動化されたアプローチを用
いた大規模なライブラリー対ライブラリースクリーニングに適しているはずであ
る。
【０００６】 上記の技術的問題の解決は、請求の範囲で特徴付けられる実施形態を提供する
ことにより達成される。
【０００７】 従って、本発明は相互作用分子のペア又は複合体の少なくとも1つのメンバー を同定する方法であって、 (a) 異なる選択マーカーおよび対抗選択マーカーを有する少なくとも２つの遺
伝的エレメントを含む宿主細胞を提供すること、ただし、該遺伝的エレメントの
それぞれは該メンバーの１つを特定する遺伝情報を含み、該宿主細胞は該分子の
相互作用時に活性化されるリードアウト系をさらに保有するものであること； (b) 少なくとも一つの相互作用を、もし存在するのであれば、生起させること
； (c) 該宿主細胞の子孫を、 (ca) 少なくとも２つの異なる選択培地、ここで該選択培地のそれぞれは 該対抗選択マーカーの少なくとも一つの不存在下かつ一つの選択マーカーの存在
下においてのみ該宿主細胞の増殖を可能にするものであること；および (cb) 該リードアウト系の活性化時にのみ該宿主細胞の同定を可能にする 更なる選択培地 に移すことにより、該相互作用を選択すること； (d) (da) (ca) で特定した選択培地のいずれにおいてもリードアウト系を活性
化せず、かつ (db) (cb)で特定した選択培地上でリードアウト系を活性化する 相互作用分子を含む宿主細胞を同定すること；ならびに (e) 該相互作用分子のペアまたは複合体の少なくとも１つのメンバーを同定す
ること、 を含む、上記方法に関する。
【０００８】 好ましくは、該相互作用は特異的な相互作用である。
【０００９】 本発明に従って用いられる、語句「同定」及び「同定する」は、選択培地上で
のリードアウト系の活性化による偽陽性クローンから相互作用分子を発現する陽
性クローンを検出する当業者の能力、及び任意追加的に、１つ又は1セットの明 白な特徴によって該相互作用分子の少なくとも１つを特徴付けることに関する。
好ましくは配列決定によって、それらをコードするDNA配列によって特徴付けら れる。あるいは、そしてより好ましくないのは、該分子が、分子量、等電点及び
、タンパク質の場合にはN-末端アミノ酸配列などの異なる特徴によって特徴付け
できる。そのようなパラメーターを決定する方法は、当分野で周知である。
【００１０】 好ましくは、該遺伝エレメントによって特定される該メンバーは、相互作用時
に該リードアウト系を活性化するか、活性化に寄与するであろうさらなる成分（
entity）に結合されている。さらに好ましくは、該成分は、遺伝的エレメントの
各タイプに対して保存されており、異なるタイプの遺伝的エレメントは、異なる
成分を含む。さらに好ましくは、相互作用分子のペアまたは複合体のメンバーが
、該遺伝的エレメントからRNAとして転写されたときに、該成分を特定するRNAと
融合されたRNA転写産物を形成する。最も好ましくは、融合RNA転写産物が翻訳さ
れて、該成分に融合された該メンバーを含む融合タンパク質を形成する。本明細
書中で下記にさらに詳述するように、該成分は、あるタイプの遺伝的エレメント
では、DNA結合ドメインをコードするDNA配列であり、別のタイプの遺伝的エレメ
ントでは、トランス活性化タンパク質ドメインであり得る。好ましくは、該遺伝
的エレメントは、プラスミドなどのベクターである。あるいは２つの融合タンパ
ク質間の相互作用が、再構成された酵素活性を有する機能性成分となるかもしれ
ない。例えば、細菌クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼタンパク
質（CAT）である（Seed & Sheen、1988 Gene 67:271-277)。該宿主細胞中に含ま
れる少なくとも２つの遺伝的エレメントは、優先的にcDNA又はゲノムライブラリ
ーなどのライブラリー由来のベクターである。このように、本発明の方法は、該
遺伝的エレメントのベクター部分が、好ましくは各タイプの遺伝的エレメントで
同一であるが、相互作用する可能性のある分子はライブラリーの代表であり、従
って、原則として、ライブラリーが増幅されていない場合には各宿主細胞中で異
なり得ることを特徴とし、多様な宿主のスクリーニングを可能にする。これに関
連して、語句「遺伝的エレメントのタイプ」は、同じ成分、選択マーカー及び、
任意に対抗選択マーカーを含むことによって特徴付けられたエレメントをいう。
【００１１】 好ましくは、該分子の「相互作用」は特異的で、高い結合定数によって特徴付
けられる。しかしながら、語句「相互作用」はまた、より低いが、しかしリード
アウト系を活性化するのに充分に違いない結合定数を有する分子間の結合をも言
うことがある。本発明の方法によって検出可能な相互作用は、好ましくは、該相
互作用が起こる前には、該宿主細胞中に存在しなかった生物学的、物理的又は化
学的活性を有する機能性成分の形成を導く。
【００１２】 該相互作用は、好ましくは、DNA結合及びトランス活性化するタンパク質ドメ インを含み、該リードアウト系の活性化を誘導する応答部分（responsive moiet
y）を活性化できる機能性転写アクチベーターの形成を導くことができる。例え ば、該部分は、プロモーターであってもよい。
【００１３】 あるいは、該相互作用は、例えば、GFPタイプa及びGFPタイプb蛍光タンパク質
（Cubbittら, 1995；Heim & Tsien, Curr Biol. 1996 6:178-182）を含む、融合
タンパク質の相互作用によって得られる検出可能な蛍光共鳴エネルギー転移を導
くことができる。あるいは該相互作用は、例えば、β-ガラクトシダーゼ(Rossi ら、1997）またはアデニレートシクラーゼ（Karimovaら、1998）などの機能的酵
素の再構築を導くこともできる。これらの実施形態は、酵母以外のタイプの宿主
細胞内の相互作用の研究に好ましいであろう。
【００１４】 さらなる実施形態では、該相互作用は、酵素によるプロペプチドの開裂によっ
て得られる呈色反応などの酵素による基質の検出可能な改質を導くことができる
。本発明のこれらの全ての実施形態では、相互作用分子は、リードアウト系を駆
動する分子に、好ましくは直接融合されていることが理解される。
【００１５】 「対抗選択マーカーの少なくとも1つの不存在下での」選択培地上での、語句 「増殖（growth）」とは、遺伝的エレメントの少なくとも１つを含む宿主細胞の
集団が、該選択培地上に置かれるが、関連の遺伝的エレメントを欠失した集団全
体の中で、その宿主細胞の子孫のみが、増殖できるという事実をいう。例えば、
薬物カナバニンに耐性であり（canr）、野生型CAN1遺伝子（Hoffmann, 1985）を
有するプラスミドをも含む酵母株が、カナバニンを含有する選択培地上に置かれ
たときに、CAN1遺伝子は、酵母細胞中にカナバニンに対する感受性を与えるので
、CAN1遺伝子を有するプラスミドを失っている酵母株の子孫のみが増殖できる。
【００１６】 ステップ(ca)を参照すると、少なくとも2つの選択培地のそれぞれが、シクロ ヘキシミドなどの少なくとも１つの対抗選択化合物を含むだろうことに注意すべ
きであり、対抗選択化合物は、異なる選択培地では異なるだろうし；それらはま
た、通常、栄養要求性マーカーを補完する化合物を欠いているか、又は抗生物質
を含むだろう。化合物又は抗生物質は、種々の選択培地で同じであってもよい。
好ましくは、少なくとも１つは、異なっている。
【００１７】 本発明の方法は、ツーハイブリッドシステムの全体的な有用性を劇的に減少さ
せることが示された偽陽性クローンを選択するための、高度に有効なツールを提
供するものである。例えば、相互作用する可能性のあるパートナーのペアの一方
を特定する遺伝的エレメントの不在についてのマーカー対抗選択を取り入れるこ
とによって、増殖するであろう、したがって第二のパートナーを特定する第二の
遺伝的エレメントのみを担持するであろうクローンを、リードアウト系の活性化
に関して試験することが現在可能である。もしも、第二の遺伝的エレメントによ
ってコードされている融合タンパク質のみを含むクローンが、他の遺伝的エレメ
ントの不在下でリードアウト系を活性化すれば、そのときはそれは偽陽性と分類
されるであろう。第二の遺伝的エレメントの不在に関する対抗選択によって、同
じ試験は第一の遺伝的エレメントへ応用される。このように、両方または全ての
遺伝的エレメントの存在下でリードアウト系を活性化するが、いずれかの遺伝的
エレメントが欠失した場合にはリードアウト系を活性化しないクローンのみが陽
性として分類される。
【００１８】 本発明の方法に関連した利点は、特に、簡単に分析可能である相互作用する可
能性のあるパートナーを発現するクローンの数に関して重要な影響を有する。例
えば、実験室規模の研究さえもより効果的となるであろう。なぜなら、相互作用
するパートナーを発現する陽性クローンを、追加の株を作成することなしに偽陽
性クローンから、容易かつ明白に区別できるからである。これとは対照的に、現
状の酵母ツーハイブリッドシステムの技術を使用して偽陽性クローンを判定する
ためには、通常は、フィッシュタンパク質をコードするプラスミドを、単離し、
非関連ベイトタンパク質をコードするプラスミドを有する（harboring）酵母細 胞中に再トランスフォーメーションする必要がある。さらに、古典的なツーハイ
ブリッドシステムを大規模で使用した場合に単離されるであろう莫大な数の偽陽
性クローンは、本発明の方法によってさらに区別され、クローンの効果的なハイ
スループット解析をもはや妨げない。長期的には、本発明の方法は、相互作用分
子を含む多数の酵母クローンのハイスループット解析に関してとりわけ有用であ
るが、それは数多くの特異的相互作用およびこれらの相互作用の個々のメンバー
が、並列的かつ自動化されたアプローチで同定できるからである。
【００１９】 幾人かの研究者が、過去に酵母ツーハイブリッドシステムを応用した場合の、
偽陽性クローンを同定する問題点に気づいてきた。Bartelら（1996）は、1つの 融合タンパク質を発現するクローンを、SD-leuおよびSD-trpプレートから、SD-h
isプレートへレプリカプレーティングすることにより偽陽性体を排除する方法を
記述した。偽陽性体として同定されるSD-hisプレート上で増殖を示したクローン
は、次いで相互作用接合に使用されなかった。この方法の不利益とは、フィッシ
ュ・タンパク質、ベイト・タンパク質および相互作用する可能性のあるフィッシュ
およびベイトタンパク質を発現する酵母株全てを作成し分析しなければならない
ためこの手順は労働集約的だということである。本発明において記載される対抗
選択システムの使用は、相互作用する可能性のある融合タンパク質を発現する株
1つのみを、作成し解析する必要があるのみであるという利点を有する。
【００２０】 2Hシステムから偽陽性クローンを排除するための他の戦略が提案されてきた（
Vidalら、1996a; Nandabalanら、1997）。しかしながら、これらのシステムは全
て、DNA結合およびトランス活性化融合タンパク質の再構成の際に転写される少 なくとも1つのレポーター遺伝子を含む、活性をアッセイするリードアウト系を 必要とする。事実、ほとんどのシステムが、全ての型の細胞へ応用が可能である
と主張しているが、これらのシステムは酵母ツーハイブリッドシステムの特異的
な生物学的性質に対して設計されている。本明細書に記載されている本発明の方
法は、レポーター系を活性化できる、単一のDNA結合または活性化ドメイン融合 タンパク質を発現する偽陽性クローンを排除することに限定されない。それどこ
ろか、本発明の方法は酵母ツーハイブリッド以外の2Hシステムにおける偽陽性ク
ローンを排除するために使用可能であり、このことは、例えば他宿主細胞型にお
いて相互作用スクリーニングが行われた場合に有用である。
【００２１】 本発明の方法の1つの態様の、模式的概略図を図6に供する。タンパク質-タン パク質相互作用のネットワークの、本発明の方法を用いた並列的解析のために、
DNA結合ドメインおよび活性化ドメイン融合タンパク質を発現するプラスミド構 築物のライブラリーを用意する。これらのライブラリーは、本発明の改良された
結合ドメインおよび活性化ドメインプラスミド（異なる選択可能および対抗選択
可能マーカーを含む）中に連結された、特定のDNA断片、または、多数の未知のD
NA断片からなるものであってもよい。両方のライブラリーは酵母細胞内で、形質
転換または相互作用接合によって組み合わせられ、相互作用する可能性のあるタ
ンパク質を発現する酵母株は、ヒスチジン欠失選択培地上で選択される。選択マ
ーカーTRP1およびLEU2は、選択培地で増殖した酵母株中でプラスミドを維持し、
一方でCAN1およびCYH2は、各々のプラスミドの欠失を選択する対抗選択マーカー
を特定する。HIS3およびlacZは、相互作用融合タンパク質による活性化の際に発
現される、酵母ゲノム中に組み込まれた選択マーカーを提示する。
【００２２】 この場合においては、リードアウト系は、ヒスチジン欠失培地での増殖と、次
いでスクリーニング可能なβ-ガラクトシダーゼの酵素活性との両方である。し かしながら、リードアウト系はHIS3等の唯一のマーカーに頼るものであってもよ
いことは理解されるべきである。しかしながら、リードアウト系を構成する2つ の構成要素を組み合わせることにより、多くの場合、より容易な結果の解釈が可
能となる（特に、1つの構成要素が、活性化された場合に色を変化させる場合） 。コロニーピッキングロボットを、結果として得られた酵母コロニーを、ヒスチ
ジン欠失選択培地を含む384ウェルのマイクロタイタープレートの個々のウェル 中にピッキングするために使用し、その結果得られるプレートを30℃でインキュ
ベートして細胞増殖させる。マイクロタイタープレート中に含まれる相互作用ラ
イブラリーは、任意にレプリカし貯蔵できる。その結果得られる相互作用ライブ
ラリーは、相互作用タンパク質を発現する陽性クローンを検出し、本発明の方法
を使用してそれらを偽陽性クローンから区別するために調べられる。スポッティ
ングロボットを使用し、細胞をレプリカ膜に移送し、次いでレプリカ膜を選択培
地SD-leu-trp-his、SD-leu+CANおよびSD-trp+CHXの各々1つの上に置いた。選択 プレート上でのインキュベーションの後、膜上で増殖させたクローンに対してβ
-galアッセイを行い、各々の膜からCCDカメラでデジタル画像を得、続いてそれ をコンピューターに記憶させた。デジタル画像処理および解析を使用して、相互
作用融合タンパク質を発現するクローンを、β-gal活性のパターンを考慮するこ
とにより、様々な選択培地で増殖させたクローンから同定できる。続いて、相互
作用を有する個々のメンバーを、PCR、配列決定、ハイブリダイゼーション、オ リゴフィンガープリンティングまたは抗体反応を含む1以上の技術により同定で きる。図6に表示された模式的経路に沿って行われた実際の実験を、図5から図22
に示す。
【００２３】 ここにおいて、および上記で特定される遺伝的エレメントは、さらに、有利に
は、大腸菌などの細菌中で機能性の少なくとも2つの異なる選択マーカーを備え ることができる。そのような選択マーカー、例えば、aphA（Pansegrauら, 1987 ）又はblaは、大腸菌株への再形質転換時の該遺伝的エレメントの分離を容易に する。
【００２４】 本発明の方法の好ましい態様では、該相互作用分子のペア又は複合体は、RNA-
RNA、RNA-DNA、RNA-タンパク質、DNA-DNA、DNA-タンパク質、タンパク質-タンパ
ク質、タンパク質-ペプチド、又はペプチド-ペプチド相互作用からなる群から選
択される。
【００２５】 従って、本発明の方法は、生物学的相互作用の広い範囲で適用できる。例えば
、本発明は、合成ペプチドライブラリー（Yangら, 1995）を利用してペプチド- タンパク質又はペプチド-ペプチド相互作用を同定するのに有用であろう。
【００２６】 関心のもてる２つの用途は、疾病の診断または治療のための治療標的として有
用であり得る医学上関連のある経路に含まれるタンパク質-タンパク質相互作用 の検出のための大規模ツーハイブリッドシステムの応用、及び例えば、新規な転
写後レギュレーター及びそれらの結合部位（SenGuptaら, 1996；Putzら, 1996）
の同定のための本明細書中の上記で述べた相互作用分子の該複合体の１つの例で
ある大規模トリハイブリッド（tri-hybrid）系である。これに関して、本発明に
よれば、複合体は3を超える相互作用分子を含むことができることに注意すべき である。さらに、そのような複合体は、生物学的に又は化学的に異なるメンバー
から構成され得る。例えば、相互作用RNA結合タンパク質及びRNA分子を同定する
には、LexA-HIV-1Revタンパク質を発現するプラスミド、Rev応答エレメントを有
する融合物中のRNA配列を転写するプラスミド及び活性化ドメインを有する融合 物中のRNAと相互作用する可能性のあるタンパク質を発現するプラスミドを、１ つの細胞中に存在させても良い。RNA融合分子及び活性化ドメイン融合タンパク 質をコードするプラスミドは、本発明の方法に従って、別の選択マーカー及び対
抗選択マーカーを含んでいなければならない。もし、RNA融合分子がそれぞれ２ つの融合タンパク質と相互作用するなら、リードアウト系は活性化される。RNA 融合分子又は活性化ドメイン融合タンパク質が相互作用するか否かを試験するに
は、本発明の方法を使用して、これらの融合分子のいずれかの不存在下でのリー
ドアウト系の活性化を研究する。
【００２７】 さらなる好ましい態様では、該遺伝的エレメントは、プラスミド、人工染色体
、ウイルス又は他の染色体外エレメントである。
【００２８】 容易に取り扱うことができるので、本発明に従って遺伝的エレメントを特定す
るプラスミドを利用するのが好ましいが、当業者であれば、該遺伝的エレメント
を有する他の系、および上記で同定された他の系を考え出すこともできるであろ
う。
【００２９】 好ましい付加的な態様では、リードアウト系は、１つの検出可能なタンパク質
である。多数のリードアウト系が当業者に公知であり、必要ならば、本発明の方
法で役立つように適合させることができる。
【００３０】 最も好ましくは、該検出可能なタンパク質は、それぞれ遺伝子lacZ、HIS3、UR
A3、LYS2、sacBまたはHPRTによってコードされているものである。当分野で周知
のように、酵母中でのβ-gal酵素の発現は、X-Gal溶液中でのインキュベーショ ン後に検出可能な青色コロニーを形成するために使用できる。勿論、本発明の方
法は、ただ１つのリードアウト系の使用に限定されない。反対に、所望ならば、
多数のそのようなリードアウト系を組み合わせることができる。該多数のリード
アウト系の組み合わせはまた、本発明によれば、用語「リードアウト系」に含ま
れる。そのような組み合わせは、相互作用パートナーを含むクローンの同定に関
して付加的な安全装置を提供するだろう。
【００３１】 ツーハイブリッドシステムは、酵母で発展してきたけれども、本発明の方法は
、多様な宿主系で実行できる。これらのうち好ましいのは、酵母細胞、細菌細胞
（Karimovaら、1998）、哺乳類細胞（Wuら, 1996, Rossiら、1997）、昆虫細胞 または植物細胞である。好ましくは細菌細胞は大腸菌細胞である。勿論、遺伝的
エレメントは、１つの宿主生物中で設計され、調製され、次いで、それが、本発
明の方法で利用される異なる宿主生物に、例えば、シャトルベクターを利用する
ことによって、転移され得る。
【００３２】 もう１つの好ましい態様では、本発明の方法は、ステップ(a)の前に、少なく とも１つの該遺伝的エレメントを有する該宿主細胞を形質転換またはトランスフ
ェクションさせることを含む。
【００３３】 当業者は、充分に形質転換され、またはトランスフェクションされた宿主細胞
から始まる本発明の同定方法を開始できるが、その研究又は商業目的に従ってそ
のような宿主細胞を最初に生成することを望むことができる。例えば、当業者は
、該宿主細胞中にすでに存在する第２のライブラリーをスクリーニングするつも
りの、あるタイプのライブラリーを最初に生成することを望むことができる。あ
るいは、当業者は、互いにスクリーニングしたい、2以上の異なるライブラリー を生成することを思い描くことができる。この場合、当業者は、最初に該宿主細
胞を、遺伝的エレメントの両方又は全てのタイプと同時に又は続いて形質転換す
る必要があるだろう。
【００３４】 もう１つの好ましい態様では、該遺伝的エレメントを有する該宿主細胞は、細
胞融合、接合又は相互作用接合によって生成される。
【００３５】 上述の対抗選択の生物学的原理は、当分野で周知である。従って当業者であれ
ば、多様なそのような対抗選択マーカーから選択することができる。好ましくは
、該マーカーは、CAN1、CYH2、LYS2、URA3、HRPTまたはsacBである。
【００３６】 本発明によれば、選択マーカーが、栄養要求性マーカー又は抗生物質マーカー
であるのがさらに好ましい。
【００３７】 リードアウト系として使用される幾つかのマーカーはまた、選択マーカーとし
ても使用できることに注意することが重要である。あるマーカーと同じマーカー
は、選択マーカー及びリードアウト系の部分として同時に使用できないことに注
意することがさらに重要である。
【００３８】 最も好ましくは、該栄養要求性マーカー又は抗生物質マーカーは、LEU2、TRP1
、URA3、HIS3、ADE2、LYS2、ゼオシン（Zeocin）から選択される。
【００３９】 実験計画は、相互作用の試験が宿主細胞の供給、そして、たぶん相互作用の発
生後直ちに行われなくてもよいことを要件としてもよい。このような場合、研究
者は、形質転換された宿主細胞を、さらなる使用のために貯蔵することを希望す
る場合もあろう。従って、本発明のさらに好ましい態様は、ステップ(b)で得ら れた宿主細胞の子孫が貯蔵コンパートメント（storage compartment）に移送さ れる方法に関する。
【００４０】 特に、多数のクローンが分析される場合には、該移送は、オートメーションま
たはピッキングロボットによって有利に実施又は支援される。勿論、該宿主細胞
の子孫を、貯蔵コンパートメント中の所定のアレイに確実にピッキングする他の
オートメーション又はロボットシステムもまた、採用できる。
【００４１】 宿主細胞は、この態様では、該貯蔵コンパートメント中で増殖し、さらなる試
験のための子孫をさらに提供することができる。好ましくは、クローンのアレイ
を維持する該貯蔵コンパートメントの複製が設定される。形質転換された宿主細
胞及び適当な培地を含む該貯蔵コンパートメントは、従来の培養プロトコールに
従って維持できる。あるいは、該貯蔵コンパートメントは、抗凍結剤（anti-fre
eze agent）を含むことができ、従って、急速冷凍庫中での保存に適する。この 態様は、相互作用する可能性がある分子の評価が延期されるときに、特に有用で
ある。当業界で周知のように、凍結された宿主細胞は、融解したときに容易に正
常な状態に戻ることができ、さらに、本発明に従って試験できる。最も好ましく
は、該抗凍結剤はグリセロールであり、これは、好ましくは、該培地中に3〜25 ％（v/v）の量で存在する。
【００４２】 本発明の方法のさらに特に好ましい態様では、該貯蔵コンパートメントは、マ
イクロタイタープレートである。最も好ましくは、該マイクロタイタープレート
は、384個のウエルを含んでいる。マイクロタイタープレートは、クローンの容 易なレプリケーティング、さらには実験の種々のステップの全体に渡るクローン
の明確な同定及び割り当てを可能にする、予め固定化されたアレイを提供すると
いう特別の利点を有する。384個のウエルのマイクロタイタープレートは、比較 的小さいサイズで、多数のコンパートメントであるため、多数のクローンをスク
リーニングする必要がある実験に特に好適である。
【００４３】 実験の計画によって、宿主細胞は、対数期又は静止期まで、上記のマイクロタ
イタープレートなどの貯蔵コンパートメント中で増殖され得る。増殖条件は、当
業者であれば、従来の手法に従って確立できる。細胞増殖は、通常、摂氏15度及
び45度の間で行われる。
【００４４】 ステップ(c)の該宿主細胞の移送は、スポッティングロボットを用いることに より、またはピペッティングもしくはマイクロピペッティング装置を用いること
によりオートメーションによって実施又は支援される。そのようなスポッティン
グロボットを、どのようにして考え出し、備え付けることができるかは、例えば
、Lehrachら（1997）に記載されている。勿論、クローンの規則正しいアレイを 確実に作製する他のオートメーション又はロボットシステムが採用できる。
【００４５】 最も好ましくは、該移送は平面キャリアーになされる。該キャリアーは、ステ
ップ(ca)及び(cb)で特定した少なくとも３つの選択培地上に順次置かれる。ある
いは、該宿主細胞の該移送は、選択培地上に既に置かれた平面キャリアーになさ
れるか、または該移送は選択培地に直接なされる。
【００４６】 最も有利には、該移送は、1cm2当たり1〜1000個のクローンの範囲の密度の規 則的なグリッドパターン中で実施される。該宿主細胞の子孫は、多様な平面キャ
リアーに移すことができる。最も好ましくは、例えば、ナイロン、ニトロセルロ
ース、又はPVDFから製造されたメンブランである。
【００４７】 適当なクローンの増殖に使用される選択培地は、液状又は固体状であり得る。
好ましくは、該選択培地は、スポッティングロボット及び平面キャリアーとして
のメンブランと共に使用するときは、寒天で固めて、続いてその上に該スポット
されたメンブランを置く。あるいは、そしてまた好ましくは、該選択培地が、液
状であるときは、マイクロタイタープレート内に保持され、該移送は、レプリケ
ーティングによってなされる。
【００４８】 さて、本発明の方法のステップ(d)を参照すると、リードアウト系は、多様な 手段で分析できる。例えば、それは、視覚的検査、放射活性、化学発光、蛍光、
光度、分光、赤外線、比色又は共鳴検出によって分析できる。
【００４９】 好ましくは、相互作用融合タンパク質を発現する宿主細胞の該同定は、ステッ
プ(ca)及び(cb)で特定した少なくとも３つの選択培地上で増殖するクローンの該
リードアウト系の活性化状態の考察から、視覚的手段を用いるオートメーション
によって実施される。
【００５０】 また好ましくは、ステップ(d)での相互作用融合タンパク質を発現する該宿主 細胞の同定は、デジタル画像記憶、解析又は処理によって実施又は支援される。
この態様では、好ましくは、メンブランなどの平面キャリアー上にアレイ化され
た陽性クローンは、(ca)及び(cb)で特定された該選択培地上での該リードアウト
系の活性化後のメンブランから得られるデジタル画像の比較によって同定される
。
【００５１】 最も好ましくは、陽性宿主細胞及び偽陽性宿主細胞の同一性は、コンピュータ
ー、例えばリレーショナルデータベース内に保存される。
【００５２】 相互作用分子のペア又は複合体の少なくとも１つのメンバーの同定は、多様な
手段によって実施できる。例えば、分子は、核酸ハイブリダイゼーション、オリ
ゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、核酸若しくはタンパク質配列決定、制
限酵素消化、分光法又は抗体反応によって特徴付けられる。一旦、相互作用の最
初のメンバーが同定されれば、第２のメンバー又はさらなるメンバーも、上記方
法のいずれかによって同定することができる。好ましくは、相互作用の少なくと
も１つのメンバーの同定は、核酸ハイブリダイゼーション、抗体結合又は核酸配
列決定によって実施される。
【００５３】 核酸ハイブリダイゼーションが行われる場合、宿主細胞中に含まれ、相互作用
分子の少なくとも１つをコードする核酸分子は、好ましくは、平面キャリアーに
固定されている（affixed）。当業界で周知のように、該核酸が固定され得る該 平面キャリアーは、例えば、ナイロン−、ニトロセルロース−若しくはPVDFメン
ブラン、ガラス又はシリカ支持体（DeRisiら, 1996；Lockhartら, 1996）であり
得る。該核酸を含む該宿主細胞は、該平面キャリアーに移され、続いて、キャリ
アー上で溶解され、該溶解によって放出される核酸は、適当な処理によって同じ
位置に固定される。あるいは、宿主細胞の子孫は、貯蔵コンパートメント中で溶
解され、次いで、得られる粗又は精製核酸は、該平面キャリアーに移され、続い
て固定される。有利には、該核酸は、平面キャリアーへの移動の前にPCRによっ て増幅される。最も好ましくは、該核酸は、相互作用分子をコードする種々の遺
伝的エレメントを示す追加の核酸と平行に規則的グリッドパターン中に固定され
る。当業界で周知のように、そのような規則的グリッドパターンは、1平方セン チメートル当たり、1及び50000エレメント（elements）の密度であり、多様な方
法によって作ることができる。好ましくは、該規則的グリッドパターンは、オー
トメーション又はLehrachら（1997）及びMaierら（1997）に記載のようなスポッ
ティングロボットを用いて構築され、規定のスポッティングパターン、バーコー
ド読み取り及びデータ記録能を備えている。このように、平面キャリアー上の所
定のスポッティング位置から該核酸を含む貯蔵された宿主細胞に、正確かつ明確
に戻すことができる。また、好ましくは、該規則的グリッドパターンは、ピペッ
ティングシステムによって、又はShalonら（1996）、Schoberら（1993）又はLoc
kartら（1996）によって記載されたマイクロアレイ（microarraying）技術によ って作ることができる。同様に、同定は、核酸ハイブリダイゼーションによって
有利に実施される。
【００５４】 目的の検出可能な核酸プローブを用いて、平面キャリアー上に固定された相同
な核酸は、ハイブリダイゼーションによって同定できる。平面キャリアー上の前
記の相同な同定された核酸のスポット位置から、相互作用の両方又は全てのメン
バーを含む、貯蔵コンパートメント中の対応する宿主細胞を同定できる。例えば
、相互作用の第２メンバーは、今や上記方法のいずれかによって同定できる。例
えば、放射性標識Rasプローブの使用によって、平面キャリアー上の相同な核酸 は、ハイブリダイゼーションによって同定できる。Ras相互作用タンパク質は、 今やRasプローブに相同な第１遺伝的エレメント及びこれらのRas相互作用タンパ
ク質をコードする第２遺伝的エレメントの両者を含む対応する宿主細胞から同定
できる。
【００５５】 マルチプルオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションを平面キャリアーに固
定された核酸に関して行う場合、相互作用タンパク質をコードする全遺伝的エレ
メントのオリゴフィンガープリントが得られ得る。これらのオリゴフィンガープ
リントは、相互作用の全メンバー又はMaierら（1997）に記載された特定の遺伝 子ファミリーに属するメンバーを同定するのに使用できる。
【００５６】 有利には、相互作用タンパク質をコードする核酸分子は、DNA配列決定などに よる同定の前に、PCRによって又は宿主細胞中、好ましくは大腸菌中の該遺伝的 エレメントで増幅される。該遺伝子配列の増幅は、大腸菌細胞の増殖及び該遺伝
的エレメントの単離によって行われる。DNA配列決定及び分析による相互作用タ ンパク質をコードする核酸を同定する方法は、当業界で周知である。同じクロー
ン由来の相互作用の両者又は全メンバーをコードする核酸を増幅し、配列決定す
ることによって相互作用の両者又は全メンバーの同一性を決定できる。
【００５７】 目的のタンパク質が相互作用ライブラリー内の融合タンパク質として発現され
るか否かを決定するために特異的抗体が使用される場合、平面キャリアー上の相
互作用ライブラリーから発現される全融合タンパク質を固定するのが有利である
。例えば、融合タンパク質を発現する相互作用ライブラリーのクローンは、Lehr
achら（1997）に記載のスポッティングロボットを用いて平面キャリアーに移す ことができる。クローンは、続いて、キャリアー上で溶解され、解放されたタン
パク質は、同じ位置に固定される。例えば、抗HIP1抗体（Wankerら, 1997）を用
いて、HIP1融合タンパク質及び未知の相互作用融合タンパク質を含む相互作用ラ
イブラリー由来のクローンが同定できる。分子の相互作用ペアの未知のメンバー
は、今や上記方法のいずれかによって対応する宿主細胞から同定することができ
る。プローブとして使用される抗体は、直接的に検出可能なように標識され得る
。あるいは、該抗体は、第１抗体に特異的であり得る二次的なプローブ又は抗体
によって検出できる。例えば、三次抗体を用いる種々の別の態様は、当業者であ
れば、その通常の知識に基づいて案出し得る。
【００５８】 最も有利には、相互作用を含むメンバーの前記同定が前記規則的なグリッドの
使用を行う場合、ハイブリダイゼーションまたは抗体反応後に平らな担体のデジ
タル画像を入手し、デジタル画像記憶、処理またはLehrachら(1997)に記載のよ うな自動化または半自動化画像解析システムを用いた解析により解析を行う。
【００５９】 最も好ましくは、宿主細胞中に含まれる遺伝的エレメントにより発現される相
互作用する分子の同一性および宿主細胞の同一性を含む情報を、例えばリレーシ
ョナルデータベース内で、コンピューター上に蓄積する。
【００６０】 本発明によれば、ステップ(a)の前に、リードアウト系を活性化できる単一分 子を発現するクローンの前選択を、対抗選択化合物（例えば、5-フルオロオロチ
ン酸、カナバニン、シクロヘキシミドまたはα-アミノアジピン酸）を含む培養 培地上で行うのが付加的に好ましい。
【００６１】 この態様では、例えば、URA3遺伝子がリードアウト系の成分として組み入れら
れる。該遺伝的エレメントの１つのみを含むクローンは、5-フルオロオロチン酸
（5-FOA）を含む選択培地上に置かれる。リードアウト系を活性化できる単一分 子を発現するクローンの場合、5-FOAは、毒性の5-フルオロウラシルに変換され る。従って、自己活性化分子を含む宿主細胞は、5-FOAを含む選択培地上で死滅 するであろう。
【００６２】 予備選択に用いるマーカーは、同時には選択又は対抗選択マーカーとして使用
できないことに注意することはさらに重要である。
【００６３】 また本発明は、本発明の方法により同定した相互作用分子のペアまたは複合体
の少なくとも1つのメンバーを、医薬上許容される形態に製剤化することを含む 医薬組成物の製造方法に関するものである。
【００６４】 医薬組成物は、本発明の方法により同定され上述の化合物の少なくとも1を単 体または組み合わせた形で含み、任意に医薬上許容されるキャリアーまたは賦形
剤を含む。適当な医薬用キャリアーの例は当分野で周知であり、例えばリン酸緩
衝食塩水、水、油／水エマルジョンのようなエマルジョン、様々な種類の湿潤剤
、滅菌溶液等がある。そのようなキャリアーを含む組成物は慣用の方法によって
製剤化することができる。これらの医薬組成物はそれを必要とする患者に適当な
投与量で投与することができる。適当な組成物の投与は、様々な方法、例えば静
脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、筋内投与、局所的投与、または皮内投与によ
って行うことができる。投与計画は、主治医及び他の臨床的要因によって決定さ
れる。医学分野では周知のように、ある患者への投与量は、例えば患者の体格、
体表面積、年齢、投与する特定の化合物、性別、投与の時間及び経路、全身の健
康状態、及び同時に投与する他の薬剤等の様々な因子によって変化する。投与量
は変化し得るが、DNAの静脈内投与での好ましい投与量は、約106〜1022のコピー
数の核酸分子である。タンパク質またはペプチドは、体重1 kg当たり0.1 ng〜10
mgの範囲で投与することができる。本発明の組成物は、局所的にまたは全身に 投与することができる。投与は、通常非経口的に、例えば静脈内に行われる。ま
たDNAは、例えば内部または外部の標的部位へのバイオリスティックデリバリー(
biolistic delivery)により、またはカテーテルを用いることにより動脈内の部 位へ直接投与することができる。
【００６５】 また本発明は、本発明の方法により同定された相互作用分子のペアまたは複合
体の少なくとも1のメンバーと、好ましくは同様に本発明の方法により同定され た別の分子との相互作用の阻害剤を、医薬上許容される形態に製剤化することを
含む医薬組成物の製造方法に関するものである。
【００６６】 阻害剤は従来のプロトコルに従って同定することができる。さらに、URA3リー
ドアウト系を使用する酵母2H系を用いて、既存のタンパク質−タンパク質相互作
用を阻害する分子を単離することができる。URA3リードアウト系を活性化する、
相互作用するGAL4ad及びLexA融合タンパク質を発現する酵母細胞は5-FOAを含む 選択培地上で増殖することができない。しかしこれらの細胞中に融合タンパク質
の相互作用を妨害する別の分子が存在する場合、URA3リードアウト系は活性化さ
れず、酵母細胞は5-FOAを含む選択培地上で増殖することができる。この方法を 用いて、タンパク質−タンパク質相互作用の潜在的阻害剤をそのような阻害剤を
含むライブラリーから単離することができる。URA3系に対応する系は、本発明の
教示に基づいて当業者が想到することができ、従って本発明に包含される。
【００６７】 また、本発明は、上述の方法の何れかによって同定されたその相互作用分子の
少なくとも1つのメンバーがその一部をなす、相互作用分子のカスケードにおけ る別の分子を同定すること、または別の分子の阻害剤を同定すること含む医薬組
成物の製造方法に関するものである。
【００６８】 相互作用分子の少なくとも1のメンバーが同定されれば、そのメンバーが生物 学的カスケードの一部であると予測することは合理的である。カスケードの別の
メンバーの同定は、本発明の方法を適用するか、または従来の方法を適用するこ
とにより行うことができる。また、前記別のメンバーの阻害剤を同定し、医薬組
成物に製剤化することができる。
【００６９】 本発明はさらに以下の少なくとも1つを含むキットに関する： (f) 先行する請求項のいずれか１項で同定された宿主細胞、ならびに上記で特
定され、対抗選択マーカーを含む前記相互作用する可能性のある分子の少なくと
も１つを特定する遺伝情報を含む少なくとも１つの遺伝的エレメント； (g) 先行する請求項のいずれか１項で同定された宿主細胞、ならびに上記で特
定され、対抗選択マーカーを含む前記相互作用する可能性のある分子の少なくと
も１つを特定する遺伝情報を含まない少なくとも１つの遺伝的エレメント； (h) 上記で特定され、対抗選択マーカーを含む前記相互作用する可能性のある
分子の少なくとも１つを特定する前記遺伝情報を含む少なくとも１つの遺伝的エ
レメント； (i) 上記で特定され、対抗選択マーカーを含む前記相互作用する可能性のある
分子の少なくとも１つを特定する遺伝情報を含まない少なくとも１つの遺伝的エ
レメント； (j) (h)または(i)で特定された遺伝的エレメントの少なくとも１つ、好ましく
は少なくとも２つを含む宿主細胞； (k) 上記で特定された前記遺伝的エレメントの少なくとも１つのメンバーを含
む前記宿主細胞由来の核酸またはタンパク質を保有する少なくとも１つの平面キ
ャリアー（ここで該核酸またはタンパク質は、グリッド形態にて該キャリアーに
付着されている）、ならびに核酸プローブまたはタンパク質の、該グリッドに付
着された分子へのハイブリダイゼーションまたは結合を生じさせるための任意の
溶液； (l) 少なくとも１つの貯蔵コンパートメント、平面キャリアーまたは(f)〜(k)
のいずれか１つで同定された遺伝的エレメント、宿主細胞、貯蔵コンパートメン
トまたはキャリアーを含むおよび／または特性決定するコンピューターディスク
；および／または (m) can1およびcyh2突然変異を含む少なくとも１つの酵母株。
【００７０】 好ましくは、前記キットは、(f)、(g)または(j)の宿主細胞を含む1以上の貯蔵
コンパートメントを含むか、またはさらに含み、および／または、前記遺伝情報
または(f)または(h)において特定された前記遺伝情報によりコードされる相互作
用する可能性のある分子を含む少なくとも１つの貯蔵コンパートメントを含むか
、またはさらに含む。
【００７１】 本発明はまた、相互作用する可能性のある分子のペアの少なくとも１つのメン
バーの同定のための、本明細書および添付の実施例において記載される任意の酵
母菌株の使用に関する。
【００７２】 有利な点として、本発明の方法により多くの異なる分子と相互作用するものと
して同定した分子を記録することができる。2H系内の多くの他の分子と相互作用
することが判った分子を含む相互作用はアーチファクトである疑いがあることか
ら、この情報によって特定の相互作用をさらに特徴づけるために必要な労力を低
減することができる(Bartelら, 1993)。
【００７３】 好ましくは、本発明の方法を用いることによって得られたデータは、ソフトウ
ェアツールまたはグラフィックインタフェースを用いることによってアクセスす
ることができ、これにより確立された相互作用ネットワークに関する生物上の問
題を照会することが容易にできるようになり、またはさらにデータを加えること
により確立されたネットワークを開発できるようになる。
【００７４】 従って、本発明はさらに、生物学的サンプルに由来する核酸によりコードされ
る相互作用分子の少なくとも１つのペアまたは複合体の潜在的メンバーに関する
データを記憶し、解析するためのコンピューター実行方法であって、 (n) 第１のデータテーブルから第１の核酸についての情報を検索すること、た
だし該情報が、 (oa) 核酸を一意的に同定する、第１の文字および／または数字の組合せ、 および (ob) 該核酸を含む遺伝的エレメントのタイプ、および (oc) 該核酸によりコードされる潜在的メンバーが相互作用分子のペアまた は複合体の少なくとも１つの他の潜在的メンバーとの相互作用について試験され
たクローンを一意的に同定する、第２の文字および／または数字の組合せ を含むものであること、 (p) 第２の文字および／または数字の組合せを用いて、第１のデータテーブル
または任意に更なるデータベースから、ステップ(oc)における前記少なくとも１
つの他の潜在的メンバーをコードする追加的な核酸を同定する情報を検索するこ
と を含む、上記方法に関する。
【００７５】 前記方法の好ましい態様は、ステップf3)における第２の文字および／または 数字の組合せを用いて第２のデータテーブルから更なる情報を検索することをさ
らに含み、ここで、該更なる情報は少なくとも前記クローンの相互作用クラスを
含み、かつ任意に追加的な情報は (q) クローンの物理的位置、 (r) (ra)組織、疾病状態または核酸の細胞源、 (rb) クローニングの詳細、および (rc) 他のクローンのライブラリーのメンバー構成 を含む、前記クローンの作製に関連する予め決定された実験詳細、 を含むものである。
【００７６】 さらに好ましくは、前記方法は、第１の核酸についてのステップ(o)の情報お よび／または追加的な核酸についてのステップ(p)の情報を用いて、該第１の核 酸および／または追加的な核酸をさらに特性決定する第３のデータテーブルと関
連付けること、ただし該更なる特性決定は、 (s) ハイブリダイゼーションデータ； (t) オリゴヌクレオチドフィンガープリントデータ； (u) ヌクレオチド配列； (v) 該核酸のインフレーム翻訳； (w) 組織、疾病状態または細胞源の遺伝子発現データ のうちの少なくとも１つを含むものであること、ならびに、 任意に、前記第１の核酸または追加的な核酸によりコードされるタンパク質ド
メインを同定することをさらに含む。
【００７７】 好ましくは、前記方法は、ステップf3)において核酸を前記相互作用について 試験したクローンの相互作用のクラスを考察することにより、前記核酸によって
コードされる潜在的メンバーが相互作用するか否かを同定することを含む。
【００７８】 さらに好ましくは、データは、10〜100個の潜在的メンバー、より好ましくは1
00〜1000個の潜在的メンバー、さらに好ましくは1000〜10000個の潜在的メンバ ー、最も好ましくは10000を越える潜在的メンバーの1または複数に関連するもの
である。
【００７９】 好ましい態様においては、データは、相互作用分子のペアまたは複合体のメン
バーを同定するための上述の方法によって作製されたものである。
【００８０】 さらに好ましい態様においては、相互作用の種類が、陽性、または陰性、また
は偽陽性の1つを含む。
【００８１】 付着性タンパク質が発生回数を考察することによって同定され、陽性の相互作
用の種類の異なるクローンにおける多数の異なるメンバーと相互作用するものと
して所与のメンバーが同定されることがさらに好ましい。
【００８２】 より好ましくは、第1のデータテーブルが第1のデータベースの一部を形成し、
第2の及び第3のデータテーブルが少なくとも第2のデータベースの一部を形成す る。
【００８３】 さらに好ましくは、第2のデータベースが、第1のデータベースを保持するコン
ピュータが読み出し可能なメモリとは別のコンピュータが読み出し可能なメモリ
上に保持され、前記データベースがデータ交換ネットワークを介してアクセス可
能なものである。
【００８４】 第2のデータベースが、核酸またはタンパク質配列の情報、2次構造または3次 構造の情報、生化学的情報、生活史的(biographical)情報、または遺伝子発現に
ついての情報を有することがさらに好ましい。
【００８５】 特定の好ましい態様においては、第1、第2または別のデータテーブルへのデー
タ入力が、他のコンピュータデータ、プログラム、またはコンピュータで制御さ
れたロボットにアクセスすることによって、第1のデータベースから自動的に制 御される。
【００８６】 相互作用分子のペアまたは複合体のメンバーを同定するための上述の方法の進
行を助けるための、少なくとも1のワークフロー管理システム (workflow manage
ment system)を、特定のデータセットを中核として構築するのがより好ましい。
【００８７】 最も好ましくは、作業の流れを管理するシステムは、上述の核酸のハイブリダ
イゼーションの方法を用いて相互作用分子のペアまたは複合体のメンバーを同定
する処理の進行を助けるソフトウェアである。
【００８８】 別の好ましい態様においては、前記データが、調査者に関心のある対象を照会
することにより調査される。
【００８９】 より好ましくは、前記照会は、 (aa) 相互作用ネットワークの第１のメンバーと第２のメンバー間の相互作用 または相互作用経路を同定すること、 (ab) 相互作用ネットワークの第１のメンバーと第２のメンバー間の、少なく とも１つの別のメンバーを介する相互作用経路を同定すること、 (ac) 核酸またはタンパク質配列、２次または３次構造によって特性決定され る少なくとも２つのメンバー間の相互作用または相互作用経路を同定すること、 ならびに (ad) 前記異なる組織、疾病状態または細胞源が異なる相互作用または相互作 用経路を同定すること のうちの少なくとも１つを含む。
【００９０】 さらに好ましくは、データ照会手順を助けるために、前記情報の一部を制御さ
れたフォーマットで記憶させる。
【００９１】 さらに好ましいのは、照会の結果がグラフにより調査者に対して表示される方
法である。
【００９２】 さらに有利な方法は、相互作用分子のペアまたは複合体のメンバーをコードす
るものとして同定した核酸を特徴づけるデータを含むデータのサブセットを別の
データテーブルまたはデータベースに記憶させる方法である。
【００９３】 さらに好ましくは、所与のメンバーが第2のメンバーまたは別のメンバーと相 互作用すると同定される発生回数を考察することを使用して核酸を特徴づけるデ
ータがデータサブセットの一部を形成しているか否かを決定する。
【００９４】 さらに好ましい方法は、追加的な情報または実験データを用いてサブセットの
一部を形成するデータを選択する方法である。
【００９５】 最も好ましくは、一定のデータ照会手順を速めるために、コンピュータ読み出
し可能なメモリ内においてデータが記憶されている構造を改変する。
【００９６】 別の好ましい態様においては、リレーショナルデータベースまたはオブジェク
ト指向データベースにデータを保持させる。
【００９７】 さらに本発明は、相互作用する各メンバーについての情報を保持するデータテ
ーブルを含むデータ記憶スキームに関するものであり、テーブル内の記録が相互
作用する各メンバーを表し、そのメンバーは共通ネームを共有することにより相
互作用を形成するものとして示される。
【００９８】 好ましくは、データ記憶スキームにおいて、共通のネームは、クローン名また
はクローン名を含む文字及び／または数字の一意的な組み合わせである。
【００９９】 収集されたデータを取り扱うためのコンピュータ化された方法は、本発明によ
る方法によって作製される大量のタンパク質−タンパク質相互作用データを取り
扱うための強力で効率的な解決法を提供する。これは、イントラネットまたはイ
ンターネットを介して異なるデータベース及び／または他のデータ記憶システム
と通信すること及び、それを利用することを可能にし、調査者によるデータベー
スへの照会及び照会の結果の視覚的な表示を可能にするインタフェースを提供す
る。前記データベースを支援するデータ分析及び表示プログラムを備えたリレー
ショナルデータベースまたはオブジェクト指向データベースは使用が容易なもの
となる。例として、図2はそのような相互作用データを管理するのに適したデー タテーブルのセットの方式及び特徴を示す。テーブルキー間の1次リンクは、入 力フィールドまたは各テーブル内に保持される要素として示されている。必要な
らば、テーブルの要素は、別のデータを保持する追加のテーブルに拡張すること
ができる。同様に、あるテーブルを、別のデータを保持及び管理するために別の
データベースに拡張することができる。この追加のデータベースは、同一のコン
ピュータまたはリモートコンピュータ(remote computer)に格納することができ る。テーブルの要素は、数字、記述、または固定フォーマットのうち各データに
最も適した何れかの書式で記録することができる。効率的な照会を可能にするた
め、適当な場合には、要素を制御された用語で記録する。図3は、相互作用実験 の間の作業プロセスのどのプロセスにおいて各テーブルが最も関連するか、及び
そのプロセスの部分についての作業の流れを管理するソフトウェアの基本となる
データセットをどこでそれが形成するかを示す。
【０１００】 特定の相互作用、部分的なまたは完全なタンパク質−タンパク質相互作用ネッ
トワークの視覚的な表示を作製するためのその他のコンピュータに基づく方法を
用いて、最も効率的に必要な相互作用を自動的に計算し、表示することができる
。当分野で周知なように、コンピュータデータベースは大規模な生物学及び分子
生物学の研究のための価値ある資源である。
【０１０１】 要約すると、既存の酵母2H系上と比較したときの本発明の大きな利点は、その
ような相互作用及び相互作用のメンバーを同定できるスケールである。好ましく
は、本発明の方法では、アレイにされた相互作用ライブラリーを用いて、ライブ
ラリー−ライブラリー相互作用についてスクリーニングを行う。従って、本発明
の方法により既存の方法より完全で徹底的なタンパク質−タンパク質相互作用ネ
ットワークを効率的に作製することができる。確立された完全なタンパク質−タ
ンパク質相互作用のネットワークは、図1に示すように様々な目的で利用できる 。例えば、それを用いて新しい生物学的な相互作用または経路の存在を予測した
り、生物学的ネットワーク間の結びつきを決定することができる。さらにこの方
法を用いて、これまで未知であったタンパク質の機能及び局在化を、それらが相
互作用する相手を決定することによって予測することができる。また、それを用
いてネットワークの特定のメンバーの発現の変化に対する細胞の応答を予測する
ことができる。さらにこれらのデータを用いて、疾病の治療的処置、診断、また
は治療に適したタンパク質または医学上関連する経路内でのタンパク質間の相互
作用を同定することができる。
【０１０２】実施例1: 改良型ツーハイブリッドシステムのためのベクター、酵母株およびリ ードアウト系の構築 1.1 ベクターの構築 改良型2-ハイブリッドシステムのために構築されたプラスミドpBTM118 a,bお よびc、ならびにpGAD428 a,bおよびcを図４に示す。ベクターセットは両方とも 、ハイブリッド(融合)タンパク質の構築のために用いることができる。該ベクタ
ーは、lexAコード配列またはGAL4ad配列のいずれかについてのオープンリーディ
ングフレームの3'末端にあるマルチクローニングサイト(MCS)領域内に位置する ユニークな制限部位SalIおよびNotIを含む(図4b)。
【０１０３】 酵母宿主細胞において、両方のプラスミドセットを用いて、その構成性ADH1プ
ロモーター(P)から高レベルで融合タンパク質を発現させる。その転写はADH1転 写終結シグナル(T)で終結する。図4aに示された2-ハイブリッドプラスミドは、 大腸菌(E.coli)およびS.セレビシエ(S.cerevisiae)の両方で自律的に複製するシ
ャトルベクターである。
【０１０４】 3種のプラスミドpBTM118 a,bおよびcを用い、MCS内に目的のタンパク質を正し
い向きおよび読み枠でクローニングして、LexAタンパク質(アミノ酸1〜220)と目
的のタンパク質の融合物を産生する。プラスミドpBTM118 a,bおよびcは、pBTM11
7c(Wankerら, 1997)から誘導されたものであって、表1に示すアダプターをその 制限部位SalIおよびNotIに挿入し、3種の異なる読み枠をもつ改良型ベクターを 作製することにより誘導される。
【０１０５】 プラスミドpBTM118 a,bおよびcは、対抗選択のための野生型酵母CAN1遺伝子を
含み、形質転換した酵母細胞はこの遺伝子によりカナバニン感受性になる(Hoffm
ann, 1985)。該プラスミドはまた、trp1-栄養要求性酵母株をトリプトファンを 含まない選択合成培地で増殖できるようにする選択マーカーTRP1、および大腸菌
にアンピシリン耐性を与える選択マーカーblaも含む。
【０１０６】 プラスミドpGAD428 a,bおよびcを用い、機能しうるように目的のタンパク質に
GAL4活性化ドメイン(アミノ酸768〜881)を連結した融合タンパク質を産生する。
プラスミドpGAD428 a,bおよびcは、形質転換した細胞をシクロヘキシミド感受性
にする野生型酵母CYH2遺伝子(Kaeuferら, 1983)、leu2-栄養要求性酵母株をロイ
シンを含まない選択合成培地で増殖できるようにする選択マーカーLEU2、および
大腸菌にカナマイシン耐性を与える細菌性マーカーaphA(Pansegrauら, 1987)を 含む。プラスミドpGAD428 a,bおよびcは、pGAD427から作製されたものであって 、表1に示されたアダプターをそのMCSに連結して、3種の異なる読み枠をもつ改 良型ベクターを構築することにより作製される。
【０１０７】 pGAD427を構築するため、aphA遺伝子を含む1.2kbのDdeI断片をpFG101uから単 離し(Pansegrauら, 1987)、オリゴヌクレオチド [B2]アダプターである5'-GTCGC
GATC-3'および5'-TAAGATCGCGACAT-3'を用いて、pGAD426のPvuI部位にサブクロー
ニングした。プラスミドpGAD426は、pAS2-1(Clonetech)から単離した1.2kbのEco
RV切断CYH2遺伝子断片を、pGAD425(Han and Collicelli, 1995)のPvuII部位に挿
入することによって、作製した。
【０１０８】 1.2 酵母株の構築 改良型酵母2-ハイブリッドシステムに備えて、3種のサッカロミセスセレビシ エ(Saccharomyces cerevisiae)株、L40cc,L40ccu,L40ccuαを作製した。S.セレ ビシエ L40ccは、L40のCYH2およびCAN1遺伝子を部位特異的にノックアウトする ことによって作製し(Hollenbergら, Mol.Cell.Biol. 15: 3813-3822)、L40ccuは
、L40ccのURA3遺伝子を部位特異的にノックアウトすることによって作製した(Cu
rrent Protocols in Molecular Biology, 編者 Ausubelら John Wiley&Sons: 1
992)。L40ccuα株は、標準的な手法により、L40ccu株の接合型切換えを誘導する
ことにより作製された(Ray BL, Write CI, Haber JE(1991))。L40cc株の遺伝子 型は： Mata his3Δ200 trp1-901 leu2-3, 112 ade2 LYS2::(lexAop)4-HIS3 URA
3::(lexAop)8-lacZ GAL4 can1 cyh2である。L40ccu株の遺伝子型は： Mata his3
Δ200 trp1-901 leu2-3, 112 ade2 LYS2::(lexAop)4-HIS3 ura3::(lexAop)8-lac
Z GAL4 can1 cyh2であり、またL40ccuα株の遺伝子型は： Matα his3Δ200 trp
1-901 leu2-3, 112 ade2 LYS2::(lexAop)4-HIS3 ura3::(lexAop)8-lacZ GAL4 ca
n1 cyh2である。
【０１０９】 1.3 リードアウト系 図5はプラスミドpLUAが保持するURA3リードアウト系を示している。細菌性Lex
Aop上流活性化配列(UAS)の制御のもとに、このURA3リードアウト系は、酵母2-ハ
イブリッドシステムにおいて、偽陽性クローンを排除するための陽性選択レポー
ター遺伝子としても、対抗選択レポーター遺伝子としても、用いることができる
。該プラスミドは、UASlexAop-URA3リードアウト系、ade2-栄養要求性酵母株が アデニンを含まない選択培地で増殖できるようにする選択マーカーADE2、および
大腸菌にアンピシリン耐性を与えるbla遺伝子を特徴としてもつ。該プラスミドp
LUAは、大腸菌および酵母において自律的に複製するシャトルベクターである。
【０１１０】 pLUAを構築するため、1.5kbのSacI/ClaI切断UASlexAop-URA3断片をpBS-lexURA
から単離し、2.4kbのSacI/ClaI切断ADE2断片とともに、ClaIで切断したpGAD425 Δに連結した。pBS-lexURAは、URA3断片をURSlexAop断片とともにpBluescript S
K+中に連結して作製した。URA3およびURSlexAop断片は、S.セレビシエ L40c株由
来のゲノムDNAを用いたPCRによって得た。この際、標準的な手法およびアンカー
プライマーを用いて、連続する2つの断片の間に相補的な張り出し(overhang)を 作り、次いでそれらをアニールさせることにより、キメラ配列を生成した(例え ばCurrent Protocolls in Molecular Biology, 編者 Ausubelら John Wiley&So
ns: 1992を参照のこと)。ADE2遺伝子は、SEY6210α由来のゲノムDNAを用いたPCR
により単離した。pGAD425Δは、pGAD425(Han and Colicelli, 1995)から1.2kbの
SphI断片を切除し、該ベクターを再結合させることによって作製した。
【０１１１】 1.4 限定された(defined)相互作用ライブラリーの作製 酵母の改良型2-ハイブリッドシステムにおいて、本発明を用いることができる
かどうかを判定するために、図6または図7に示されるように、第1.1節および第1
.2節に記載のベクターおよび菌株を用いて、目的の、種々のLexAおよびGAL4ad融
合タンパク質を発現するプラスミドの、限定された相互作用ライブラリーを構築
した。挿入断片の向きは制限酵素解析により決定され、読み枠は配列決定により
確認される。前述の、作製した構築物および原プラスミドは、表2に列挙した。p
BTM117c-HD1.6、-HD3.6、および-SIM1の構築については他に記載されている(Wan
kerら, 1997; Probstら, 1997)。pBTM117c-HIP1およびpGAD427-HIP1は、pGAD-HI
P1(Wankerら, 1997)から単離された1.2kbのSalI切断HIP1断片を、pBTM117cおよ びpGAD427へそれぞれ連結することにより得られた。pBTM117c-MJDは、1.1kbのSa
lI/NotI切断MJD1断片(Kawagushiら, 1994)をpBTM117cに挿入することにより作製
し、またpGAD427-14-3-3は、pGAD10-14-3-3の1.0kbのEcoRI/NotI切断断片をpGAD
427に挿入することにより作製した。pGAD427-HIPCTを構築するため、pGAD-HIPCT
(Wankerら, 1997)より単離された0.5kbのEcoRI切断HIP1断片を、pGAD427に連結 した。pGAD427-lexAおよびpGAD427-ARNTは、1.2kbのSalI/NotI切断lexA PCR断片
および1.4kbのSalI/NotI切断ARNT断片を、それぞれpGAD427に挿入することによ って、作製した。
【０１１２】 融合タンパク質LexA-SIM1およびGAL4ad-ARNTは、酵母2-ハイブリットシステム
において、互いに特異的な相互作用をすることが示された(Probstら, 1997)。こ
のことは、2つの統合レポーター構築物である酵母HIS3遺伝子および細菌性lacZ 遺伝子(どちらもプロモーター領域にLexAタンパク質に対する結合部位を含む)を
含有するサッカロミセスセレビシエにおいて、両ハイブリットを共発現させた場
合、これら2つの融合タンパク質間の相互作用によってレポーター遺伝子の転写 が起こったことに基づく。GAL4ad-ARNTはDNA結合ドメインを、LexA-SIM1は活性 化ドメインを欠失しているため、該融合タンパク質は、単独では、転写を活性化
できない(Probstら, 1997)。一方、近年、融合タンパク質LexA-HIP1およびGAL4a
d-LexAは、それぞれ特定のGAL4adまたはLexA融合タンパク質と相互作用すること
なくHIS3およびlacZレポーター遺伝子を活性化できることが示された。したがっ
て、本明細書では偽陽性体とは、GAL4ad融合タンパク質またはLexA融合タンパク
質が、それぞれのパートナーとなるタンパク質無しに単独で、パートナーとなる
タンパク質とのいずれの相互作用も必要とせずに、レポーター遺伝子の転写を活
性化するクローンとして定義されるので、LexA-HIP1タンパク質を発現している 酵母クローンは、偽陽性体と呼ばなくてはならない。
【０１１３】 これらの融合タンパク質の、予測されるタンパク質−タンパク質相互作用を図
8に示す。融合タンパク質LexA-SIM1 & GAL4ad-ARNT、LexA-HD1.6 & GAL4ad-HIP1
およびLexA-HD3.6 & GAL4ad-HIP1は、酵母2-ハイブリッドシステムにおいて、互
いに特異的に相互作用することが示された。そのことは、それらは、1つの細胞 中に両方のタンパク質が存在する場合のみレポーター遺伝子HIS3およびlacZを活
性化することに基づくものである(Probstら, 1997; Wankerら, 1997)。一方、Le
xA-HIP1およびGAL4ad-LexA融合タンパク質は、融合タンパク質とのいずれの相互
作用をも必要とせずに、レポーター遺伝子を活性化できることが明らかになった
。タンパク質LexAおよびGAL4adならびに融合タンパク質LexA-MJDおよびGAL4ad-1
4-3-3は、限定された相互作用ライブラリーにも含まれてはいるが、単独で、ま たは該ライブラリーを構成する他の任意の融合タンパク質と共に同じ細胞中に存
在する場合には、レポーター遺伝子を活性化できない。
【０１１４】実施例2: 改良型2-ハイブリットシステムを用いた、偽陽性体由来の既知の相互 作用するタンパク質を発現するクローンの検出 酵母2-ハイブリッドプラスミドのペアである、pBTM117c-SIM1 & pGAD427-ARNT
、pBTM117c & pGAD427、およびpBTM117c-HIP1 & pGAD427により、酵母株L40ccを
形質転換し、該２種のプラスミドのそれぞれを１つ以上含有するTrp+Leu+形質転
換体をSD-leu-trpプレート上で選択した。各形質転換から得られた形質転換体2 つについて、SD-leu-trp、SD-leu-trp-his、SD-leu+CANおよびSD-trp+CHXプレー
ト上でのその酵母細胞の増殖能力を調べることにより、またβ-ガラクトシダー ゼメンブレンアッセイを用いることにより、タンパク質-タンパク質相互作用の 存在を調べた(Breeden および Nasmyth, 1985)。図9は、pBTM117c-SIM1 & GAD42
7-ARNTまたはpBTM117c-HIP1 & pGAD427の両プラスミドをもつ酵母株の細胞がSD-
leu-trp-hisプレート上で増殖すること、およびX-Gal溶液中でインキュベートす
ると青色に変わったことを示しており、このことは、HIS3およびlacZレポーター
遺伝子がこれらの株で活性化されていることを示している。対照的に、陰性対照
プラスミドpBTM117c & pGAD427を両方有する酵母株は、この培地では増殖できず
、lacZ活性も示さなかった。2-ハイブリッドプラスミドを異なる組み合わせで有
する該酵母株を、SD-leu+CANおよびSD-trp+CHX上で選択した後、その得られた株
もβ-ガラクトシダーゼアッセイにより解析した。SD-trp+CHX培地上で3つの株す
べてを含むメンブレンをインキュベートすると、元はプラスミドpBTM117c-HIP1
& pGAD427の両方を有していたが、対抗選択を通して、プラスミドpGAD427を失っ
た酵母株の子孫だけが、X-Gal溶液中でインキュベートした後に青色に変化した 。この結果は、このクローンが偽陽性体であることを示している。このことは、
LexA-HIP1融合タンパク質は、SD-leu-trp-his培地上で増殖した場合にはlacZ+の
表現型を示すが、融合タンパク質とのいずれの相互作用をも必要とせずにSD-trp
+CAN培地上でHIS3およびlacZ遺伝子を活性化することもできたことに基づく。そ
れに対して、レポーター遺伝子の活性化には、LexAおよびGal4ad融合タンパク質
の両方が必要であるから、プラスミドpBTM117c-SIM1 & pGAD427-ARNTの両方を有
する酵母株は、相互作用するLexAおよびGal4ad融合タンパク質を発現する陽性ク
ローンである。SD-trp+CHXまたはSD-leu+CANそれぞれにおける対抗選択によって
、プラスミドpBTM117c-SIM1またはpGAD427-ARNTのいずれかが該株から失われて しまうと、得られる細胞は、もはやlacZレポーター遺伝子を活性化できず、X-Ga
l溶液中でインキュベートしても青色に変わらない。自己活性化GAL4ad-LexA融合
タンパク質を発現する偽陽性クローンも、SD-leu+CANプレートから得たメンブレ
ンを用いて、β-ガラクトシダーゼアッセイによって検出した。
【０１１５】実施例３： 相互作用する可能性のある融合タンパク質を発現する宿主細胞の規 則的なグリッドパターンの作製 3.1 オートメーションを用いたマイクロタイタープレート内の相互作用ライブ ラリー由来クローンの規則的なグリッドパターンの作製 充分に限定された相互作用ライブラリーを作製するために、図8に示す融合タ ンパク質を発現するための構築物をプールし、3μgの混合物を用いてSchiestel およびGietz (1989)の方法で酵母株L40cc中を同時形質転換した。表2に記載の構
築物で同時形質転換した酵母細胞をトリプトファン、ロイシン、およびヒスチジ
ンの欠乏した最小培地（SD-leu-trp-his)を含む大きな24 x 24 cmの寒天トレー （Genetix, UK)上にプレートした。寒天トレーに寒天オートクレーブおよびポン
プ(Integra, Switzerland)を用いて注ぎ、寒天の色と深さのばらつきがトレー間
で小さくなるようにした。自動化したピッキングの効率を最大化するために、30
℃で4〜７日間のインキュベーションの後で各寒天トレーにつき200から2000の間
のコロニーが得られるように形質転換混合物をプレートした。
【０１１６】 Lehrachら(1997)記載の大腸菌細胞をピッキングするために設計された標準的 なピッキングロボットのハードおよびソフトに適当な変更を施して、酵母細胞に
特異的な必要条件に合うようにした。プレートしたコロニーを含む寒天トレーの
照度を、暗視野サブイルミネーション(sub-illumination)から暗視野トップイル
ミネーション(top-illumination)に変化させ、形質転換していない細胞のローン
(lawn)と酵母コロニーを区別した。コロニーを含む寒天トレーのデジタル画像に
応用する際に連結性アルゴリズムが出したブロッブ特性表からピッキングするた
めに、酵母細胞を選択するときの”ブロッブ(blob)”サイズの許容範囲をより広
くするように既存の視覚制御型モーションシステム (vision guided motion sys
tem)(Krishnaswamy & Agapakis 1997)を改良した。ピッキング手順の間にピッキ
ングピン上で乾燥した細胞材料が、ウェル内でピンを激しく動かす前にマイクロ
タイタープレートのウェルの中に10秒間浸すことによって最初に確実に再水和す
るようにクローン接種の手順を再度プログラムした。このロボット工程では十分
な細胞材料が各ピッキングピンからマイクロタイタープレートの個々のウェルに
確実に植え付けられた。ピッキングピンに0.3％(v/v)の過酸化水素水中でブラシ
をかけ、続いて2番目の洗浄槽で70％エタノールのリンスにかけ、最後にピンか ら残留エタノールを蒸発させるために熱銃で乾燥させるようにロボットをプログ
ラムすることにより、植付のあとピッキングピンを滅菌してピッキングサイクル
を繰り返すことができるようにした。さらに、3つのコーナーにおける寒天の表 面高さのリファレンスをとり、これらの値から自動的に寒天の界面平面(surface
plane)を見積もることにより、寒天における高さのばらつきを自動的に補正す るアルゴリズムを組み込んだ。さらにロボットは、ピンがコロニーの中に延びた
ときにコロニーの表面の最上部の細胞のみを取り、コロニー全体を貫通して増殖
培地に入り込まないように、イメージングの高さとピッキング高さの両方を寒天
の表面高さに従って自動的に調節するようにプログラムした。最後に[B3]、青と
白のコロニーを確実に分類する付加的な選択の基準を組み込んだ。ロボットは、
平均グレースケール（average grey scale）の範囲内で(例えば白いコロニーで は80より大きい）そのような「ブロッブ(blob)」(コロニー）のみを選択する方 法を提供したが、これは信頼できないことが明らかとなった。なぜなら、正確に
区別することが必要とされる平均グレースケールの実際の値は、照明の強度のわ
ずかな違いによって寒天トレー全体にわたって変動するからである。そのため、
フレーム間ベースでカメラで測定されるように寒天トレーの領域の平均照度に基
づいてこの分類値を自動的に修正する新しい方法を実現化した。リードアウト系
を活性化している「青」のコロニーは、しばしばその全体の領域にわたって一様
に青色ではなく、中心のみが青色で周辺の細胞材料は白色であることがあった。
そのような場合、連結性アルゴリズムは二つの「ブロッブ」を検出するであろう
。一方（青い中心）は、もう一方（白い周辺）の上に直接のっている。そして、
前者は青いため無視されるが、後者はその平均のグレースケールが分類値より大
きいため選択される。そのような場合は、その境界内に第２のブロッブを持つブ
ロッブにフラグを立てる画像分析プログラムである「穴の数」機能を用いて、「
穴」のあるコロニーを無視することによって選択に成功した。
【０１１７】 実験用ピッキングロボットへのこれらの改造を用いて、個々の酵母コロニーを
寒天トレ−からピッキングし、滅菌した384-ウェルマイクロタイタープレート(G
enetix, UK)の個々のウェルに自動的に移した。このマイクロタイタープレート のウェルは、ロイシンおよびトリプトファンの欠乏した滅菌した液体の最小培地
（SD-leu-trp)を含み、７％(v/v)のグリセロールを含む。得られたマイクロタイ
タープレートは30℃で36時間インキュベートし、植付けたコロニーは384-ウェル
プラスチック複製ツール(Genetix, UK)を用いて激しくかき混ぜることによって 分散させ、続いてさらに２〜４日間インキュベートした。増殖する酵母培養株を
含む90％以上のウェルのピッキングに成功した。マイクロタイタープレート内で
酵母株を増殖させた後、各プレートを固有の数字およびバーコードで標識した。
また、滅菌した384-ピンプラスチックレプリケーター(Genetix, UK)を用いて、 少量の細胞材料を各ウェルから予め標識し、予めSD-leu-trp-his/7%グリセロー ル液体培地で満たした384-ウェルマイクロタイタープレートに移すことにより、
各プレートを複製してさらに二つのコピーを作製した。複製されたプレートを36
時間後の細胞分散工程を入れて30℃で3日間インキュベートし、続いて凍結させ て最初にピッキングした相互作用ライブラリーのマイクロタイタープレートとと
もに-70℃で保存した。
【０１１８】 この方法で、ロボットおよび自動化ピッキングシステムを用いて、相互作用す
る可能性のある酵母クローンを発現する酵母細胞の規則的なグリッドパターンを
作製した。384-ウェルマイクロタイタープレートは、4.5mmに一個ウェルがあり 、16ｘ24でウェルが並んでいる。従って、それぞれの384-ウェルマイクロタイタ
ープレートについて、１cm2あたりに4クローンより高い密度で規則的なグリッド
パターンが自動的に作製された。
【０１１９】 3.2 密度が増大した規則的なグリッドパターンの作製 密度の高い配列を作製するため、自動のプレートスタッキング、チップ洗浄、
廃液、およびチップが容易にアクセスできるマイクロタイタープレートの正確な
x-y位置合わせ(positioning)の備わったコンピュータ制御96-ウェルピペッティ ングシステム(pipetting system)(Opal-Jena)を採用した。上記の配列された相 互作用ライブラリーのウェルの底に植付けられた酵母２-ハイブリッド細胞を再 懸濁し、これら384-ウェルプレートのスタックをピペッティングシステムのイン
プットスタッカー（input stacker)中に配置した。配列された酵母２-ハイブリ ッドクローンを含む１つの384-ウェルマイクロタイタープレートを採用し、同時
に培地および細胞の10μlを384-ウェルプレートのうちの96-ウェルから96ピペッ
トチップのそれぞれに吸引するようにシステムをプログラムした。96チップのチ
ップ間の間隔は9mmで、384-ウェルマイクロタイタープレートのウェルの間隔は4
.5mmであり、384-ウェルプレートの各列に沿って一つ置きのウェルのみから細胞
を取るようにした。次に、チップに含まれる吸引された96のサンプル８μlを、 滅菌した1536-ウェルマイクロタイタープレート(Greiner, Germany)の1セットの
ウェルに同時にピペットで移した。この1536-ウェルマイクロタイタープレート のウェル間の間隔は2.25mmなので、酵母細胞は1536-ウェルプレートの各列に沿 って4つに１つのウェルの中のみに入れた。残っている2μlの培地および細胞は 各96チップを滅菌する前に、同時に吸引廃棄された。滅菌は、システム上の第1 の補給可能な洗浄槽（wash-bath)に保存される0.3％(v/v)過酸化水素の50μlを 使って吸引と洗浄を２回行い、次に第２の補給可能な洗浄槽に保存された滅菌蒸
留水の50μlを使って吸引および洗浄することにより行った。
【０１２０】 このプレートからプレートへのピペッティングサイクルをさらに3回繰り返し た。それぞれシステムの正確なx-y位置合わせを用い、96チップにあわせてマイ クロタイタープレートを動かすことにより、酵母2-ハイブリッドクローンの384-
ウェル配列から毎回異なったセットの96-クローンを吸引して、1536-ウェルマイ
クロタイタープレートの異なったセットの96-ウェルに入れた。第１の384-ウェ ルマイクロタイタープレートの全てのクローンがサンプリングされ1536-ウェル プレートに配列されると、第１の384-ウェルマイクロタイタープレートは自動的
に次の384-ウェルマイクロタイタープレートに交換され、この第２の384-ウェル
プレートに配列された酵母2-ハイブリッドクローンは同様に1536-ウェルプレー トに配列された。4つの384-ウェルマイクロタイタープレートに含まれる酵母2- ハイブリッドクローンが第１の1536-ウェルプレートに自動的に配列され全ての ウェルが満たされると、1536-ウェルプレートはピペッティングシステムの第２ のスタッキングユニットに保存された第２の滅菌1536-ウェルプレートに自動的 に交換された。相互作用ライブラリーの酵母2-ハイブリッドクローンの全てが38
4-ウェルから1536-ウェルのマイクロタイタープレートに自動的に移されるまで 処理全体を繰り返した。
【０１２１】 この方法で、コンピュータ制御ピペッティングシステムを用いて、相互作用す
る可能性のある酵母クローンを発現する酵母細胞の規則的なグリッドパターンを
作製した。1536-ウェルマイクロタイタープレートは2.25mmに1つのウェルがあり
、32x48でウェルが並んでいる。従って、それぞれの1536-ウェルマイクロタイタ
ープレートに対して我々は1cm2あたり19クローンより高い密度で、規則的なグリ
ッドパターンを自動的に作製した。
【０１２２】 3.3 オートメーションによる多孔性キャリアー上の相互作用ライブラリー由来 クローンの規則的なグリッドパターンの作製 Lehrachら（1997）が記載したような高スループットのスポッティングロボッ トを用いて、384-ウェルマイクロタイタープレート内に含まれる限定された相互
作用ライブラリー由来の酵母クローンの高密度の規則的なグリッドパターンで多
孔性の平らなキャリアーを構築した。ロボットは、予め定義した控えのスポッテ
ィングパターンおよびマイクロタイタープレートのバーコードを用いて、高密度
グリッドパターン内の個々のクローンの位置を記録した。個々に番号を付したサ
イズが222 x 80 mmのメンブレンシート(Hybond N+, Amersham UK)をSD-leu-trp-
his培地中に予め浸し、同じ培地に予め浸した3mmフィルター紙(Whatmann)のシー
トの上に注意深くのせ、それをロボットの苗床(bed)内に置いた。相互作用ライ ブラリーは、ロボットに備え付けの384-ピンスポッティングツールを用いて自動
的に複製コピーとして膜上に配置された。相互作用ライブラリーの第１のコピー
から得られた5種のマイクロタイタープレートは、10個のナイロン膜上に中央の インクガイドスポット(ink guid-spot)周囲に「3ｘ3複製(duplicate)」パターン
でスポットされた複製品であった。これは、１ｃｍ2あたりおよそ40スポットの 密度でスポットされた約1900のクローンに対応する。各複製膜上に３種の対照ク
ローンをスポットした。それぞれ全てのウェルに同じ対照クローンを含むマイク
ロタイタープレート由来のものであった。ある対照クローンは融合タンパク質Le
xA-SIM1およびGal4ad-ARNTを発現した。第２の対照クローンは融合タンパク質Le
xA-HIP1を発現し、一方、第３のものは融合タンパク質Gal4ad-LexAを発現した。
そして、すべてのクローンは、選択、対抗選択およびこの方法のβ-galアッセイ
特性を試験するためにスポットされた。各スポット上の酵母細胞の数が対抗選択
培地プレート上に配置されるそれらの膜に対して確実に十分であるように、マイ
クロタイタープレートのウェル内のわずかに異なった位置から各スポット位置に
5回スポットするようにロボットをプログラムした。ロボットは、作製されたス ポッティングパターンおよび各マイクロタイタープレートから自動的に読み取っ
たバーコードが記録されたデータファイルを作製した。
【０１２３】 各膜を、24ｘ24 cm寒天トレー内の約300mlの固体寒天培地の上に注意深く載せ
た。6つの膜をSD-leu-trp-his培地中に移し、それぞれの残りの膜の内の２つをS
D-trp＋CHXまたはSD-leu＋CAN培地に移した。酵母コロニーを30℃で3日間インキ
ュベーションすることにより膜の表面で増殖させた。
【０１２４】 3.4 オートメーションを用いた非多孔性キャリアー上でのクローンの相互作用 ライブラリーからの、規則的なグリッドパターンの作製 プラスミドpGNG1（MoBiTec, Germany）は緑色蛍光タンパク質変異体をLexAオ ペレーターの制御下に有している。この変異体GFPuvは、クラゲ（Aequora victo
ria）から単離された野生型変異体よりも最大16倍明るいものである（Ausubelら
、1995; Short protocols in molecular biology, 3rd ed. John Wiley & Sons,
New York, NY）。酵母2μｍ複製開始点および栄養要求性マーカーURA3は、ura3
変異酵母株において該プラスミドを維持する。このプラスミドは、単一の融合タ
ンパク質、または、ここに記載される本発明の方法でリードアウト系を活性化で
きる相互作用融合タンパク質を検出するためのリードアウト系として機能するは
ずである。この分野で知られているように、緑色蛍光タンパク質およびその変異
体は、殆どの宿主細胞型において好適なレポーター遺伝子であると考えられてい
る。それ故に、当業者には、この遺伝子を他の宿主細胞型の内部および本発明に
おいて開示されている相互作用系に組み込むことが可能であろう。
【０１２５】 酵母株L40ccuを、プラスミドpGNG1（MoBiTec, Germany）でSchistelおよびGie
tz（1989）の方法を用いて形質転換し、その結果得られた安定な形質転換体クロ
ーンをウラシルを欠損している最小培地で培養し、続いてそれを用いて、それぞ
れ2つの遺伝的エレメントを含む更なる2つの酵母クローンを作製した。第1の株G
NGpは、レポータープラスミドpGNG1を既に担持しているL40ccu中へ共形質転換さ
せたプラスミドpBTM117c-SIM1およびpGAD427-ARNTの混合物の共形質転換によっ て作製した。第2の株GNGnは、レポータープラスミドpGNG1を既に担持しているL4
0ccu中へ共形質転換させたプラスミドpBTM117c-MJDおよびpGAD427-14-3-3の混合
物の共形質転換によって作製した。両方の場合に、形質転換はSchistelおよびGi
etz（1989）の方法を用いて行い、形質転換体はウラシル、トリプトファンおよ びロイシンを欠損している最小培地へのプレーティングにより選択した。
【０１２６】 2つの形質転換に由来する個々のコロニーを、マイクロタイタープレートがウ ラシル、トリプトファンおよびロイシンを欠損している液体最小培地を含んでい
たことを除いては3.1節に記載の通りに、384-ウェルマイクロタイタープレート の個別のウェルにピッキングにより入れた。GNGp酵母株の個々のコロニーを含む
マイクロタイタープレートと、GNGnのコロニーを担持するもう1つのマイクロタ イタープレートとを作製した。4×4パターン中に16本のピンを担持する高精度ス
ポッティングツールを装備したスポッティングロボット（Lehrachら、1997）を 使用して、ポリリシンをコーティングしたガラススライド（Sigma, US）上にク ローンをアレイ化した。クローンは440μｍの間隔で、約300μｍのスポット直径
で点在させ、1ｃｍ2当たり490個を超えるクローンの密度とした。各々のスポッ トに配置した細胞材料の量を増加させるために、ロボットを、マイクロタイター
プレートのウェル内部の僅かに異なった位置から各々のスポット位置に10回スポ
ットするようプログラムした。圧電（piezo）インクジェットマイクロピペッテ ィングシステム（Kietzmannら、1997, Schoberら、1993）によって、さらに高密
度のクローンの規則的なグリッドパターンを作製できることは当分野で周知であ
る。事実、1ｃｍ2あたり1600スポットを超えるグリッド密度が、そのようなシス
テムによって実現されている。
【０１２７】 次いで、細胞の規則的なグリッドパターン中の細胞の、蛍光リードアウト系は
高感度CCDカメラ（LAS1000, Fuji, Japan）を使用して視覚化された。好適な励 起光が提供され、GFPUVの発光スペクトルに好適な発光フィルターをレンズに装 着した。他のイメージングシステムを、クローンの規則的なグリッドパターンの
調査に利用することも可能である。例えば、レーザースキャン共焦点顕微鏡を含
むレーザースキャンシステムは、非常に高密度の規則的なグリッドパターンを、
または各々の位置に置かれた少数の宿主細胞から形成された規則的なグリッドパ
ターンをイメージングする際に好ましいであろう。
【０１２８】 融合タンパク質LexA-SIM1およびGAL4ad-ARNTは相互に作用しあって、LexAオペ
レーターの制御下にリードアウト系を活性化できることが示された。GNGUVレポ ーター遺伝子はLexAオペレーターの制御下にあるので、pGNG1プラスミドを担持 しこれらの融合タンパク質を発現する細胞は、UV光の下では蛍光を発するはずで
ある。これとは対照的に、融合タンパク質LexA-MJDおよびGAL4-14-3-3は、同じ リードアウト系を活性化できないことが示された。酵母細胞の規則的なグリッド
パターンのデジタル画像を画像解析することにより、実際に、GNGp酵母株は蛍光
を発するがGNGnは蛍光を発しないことが示された。
【０１２９】 pGNG1の代替物として、当業者は、Andersonら（1996）に記載された改良型GFP
変異体をサブクローン化することができる。pLUA中のURAコード配列（断片）をG
FPで置き換えることは、好適なアンカープライマーを使用してGFP変異体を増幅 することにより行った。好適な増殖培地を使用して、上記のように解析を実施で
きる。
【０１３０】実施例4： 規則的なグリッドパターン中のリードアウト系の検出 4.1デジタル画像キャプチャー、処理および解析を使用した、平坦なキャリア ー上の相互作用ライブラリー由来のクローンの、規則的なグリッドパターンでの リードアウト系活性化の検出 3.3節に記載した選択培地の各々から得られた2つの膜を、BreedenおよびNasmy
th（1985）に記載されたβ-galアッセイを使用してlacZの発現に関してアッセイ
し、一晩自然乾燥した。各々の膜に関して、β-galアッセイの24ビットデジタル
BMP（ビットマップ）画像を標準A3コンピュータースキャナーを使用してキャプ チャーし、画像をコンピューターに保存した。限定された（defined）相互作用 ライブラリーを作製するために使用した酵母株は、ade2栄養要求性変異体であり
、生育はしてもリードアウト系を活性化はしなかったコロニーは、成熟したとき
にはピンク色をしていた。DNAグリッドの解析に使用した画像解析プログラムは シングルチャンネル（グレースケール）画像を使用するので、このカラー画像を
8ビットのグレースケール画像に変換する必要があった。しかしながら、β-gal レポーター遺伝子を発現しないピンク色のコロニーは、グレースケールに変換す
ると、このリードアウト系の陽性／陰性活性化状態のコントラストを低下させる
であろう。故に、この画像のピンク〜赤色を薄い黄色に再マップしてから、再マ
ップした24ビットカラー画像を、色反転（colour-inverted）8ビットグレースケ
ールTIF（tagged image file format）へソフトウェアPhoto Magic（Micrografi
x, USA）を使用して処理した。3種類の選択培地の各々の上に置かれた膜上で増 殖させ、続いてβ-gal活性に関してアッセイを行った限定された相互作用ライブ
ラリーの、1つの非反転8ビットグレースケール画像を図10に示す。
【０１３１】 相互作用ライブラリーの個々のクローンを同定して、高密度でスポットされた
フィルター上のそれらの位置を、マイクロタイタープレート中の特定のウェルに
、Lehrachら（1997）によって記載された自動化画像解析システムを使用して変 換することができる。ここでは、各クローンの基本的なグリッドおよびノード（
node）位置は、GemanおよびGeman（1984）によって提唱された反復（iterative ）サンプリングスキームにより決定される。一旦ノード位置が決定されると、平
均コロニー直径に対して適切な大きさとした1つのピクセルマスクの平均グレー スケール値が、フィルター上の全てのコロニーの画像から記録される。これらの
強度データから、包括的ブロック特異的バックグラウンドの補正を行い、局所的
ブロック特異的バックグラウンドに、より多くの荷重を与える。次いで、各々の
コロニーは、バックグラウンド補正がなされた強度の、適切な貯蔵値（binning
value）により、4段階のβ-ガラクトシダーゼ活性の1つに分類される。
【０１３２】 相互作用する融合タンパク質を発現する陽性クローンは、多様な選択培地上の
スポットした膜の上で増殖させたクローンのβ-ガラクトシダーゼ活性を考慮す ることにより、偽陽性クローンから判定した。陽性クローンは、SD-leu-trp-his
培地においてlacZレポーター遺伝子を活性化して、X-Gal溶液とのインキュベー ションにより青色に変化するが、2種類の対抗選択培地では、いずれにおいても そのようにならないはずのものである。偽陽性クローンはレポーター遺伝子を活
性化して、SD-leu-trp-his培地のみならず対抗選択培地の少なくとも1つにおい て、X-Gal溶液とのインキュベーションにより青色に変化するはずである。
【０１３３】 図11は、3種類の選択培地に置かれた膜上で増殖させたクローンのβ-galアッ セイの拡大図を示している。図11aに示された膜の拡大領域内では、2つのクロー
ンが、相互作用融合タンパク質を発現する陽性クローンとして判定されたが、そ
れは、それらがlacZレポーター遺伝子をSD-leu-trp-his培地上では活性化したが
、2つの対抗選択培地のいずれにおいても活性化しなかったからであり、それら のスポット位置を円で囲ってある。これらの2つのクローンは、相互作用ライブ ラリー内のそれらのマイクロタイタープレートのアドレスから、06L22および08N
24とそれぞれ同定された。膜のこの領域内にスポットされた他のクローン全ては
偽陽性であると判定されたが、それは、それらがSD-leu-trp-his培地と同様にSD
-trp+CHX培地上でもβ-ガラクトシダーゼを発現するためである。
【０１３４】 同じ膜上にスポットされた3種類の対照クローンについてのLacZレポーター遺 伝子の発現により、これらの結果が確認された。相互作用融合タンパク質LexA-S
IM1およびGAL4ad-ARNTを発現する陽性対照クローンは、SD-leu-trp-his培地で増
殖させた場合にLacZ+表現型を示すが、対抗選択培地のいずれかで増殖させた場 合はLacZ-表現型を示すはずである。この対照クローンを図11bに示した膜領域中
の位置03にスポットし、そのうちの1例を円で囲ってある。この陽性対照クロー ンについての3種類の選択培地上でのβ-gal活性のパターンは予測どおりであっ た。融合タンパク質LexA-HIP1を発現する偽陽性対照クローンおよび融合タンパ ク質GAL4ad-LexAを発現する偽陽性クローンを、位置02および位置01にそれぞれ スポットした。両方の偽陽性対照クローンはSD-leu-trp-his培地で増殖させた場
合はLacZ+表現型を示したが、本発明の方法によって偽陽性クローンと判定され た。なぜなら、それらはSD-leu+CAN培地またはSD-trp+CHX培地それぞれにおいて
もまた、LacZ+表現型を示したからである。位置04にスポットされたクローンは 限定された相互作用ライブラリーに由来するものであり、SD-leu+CAN培地での増
殖時のそれらのLacZ+表現型から偽陽性クローンであると予測される。
【０１３５】 上記の画像解析システムを用いて、各々の高密度の規則的なグリッドパターン
上でLacZリードアウト系を活性化した個々のクローンを自動的に同定した。この
ことは、3種類の選択培地上で増殖させた膜の各々について行い、3種類の培地上
で増殖させた各々のクローンのβ-ガラクトシダーゼ活性の強度を、0〜3までの スケール（無活性、弱い活性、中程度の活性、高い活性）を使用するプログラム
によって自動的に記録した。所与の膜上での全てのクローンに関するこれらのデ
ータをコンピューターファイルに保存し、所与のクローンに関するβ-ガラクト シダーゼ活性を、他の2つの選択培地上で増殖した場合の活性と、コンピュータ プログラムを使用して関連付けた。このプログラムは、SD-leu-trp-his培地で増
殖させた場合はレポーター遺伝子を活性化した（スコアは0より大きい）が対抗 選択培地のいずれでも活性化しなかった（両方の培地でのスコアが0に等しい） 、相互作用ライブラリー由来のクローン全てを照会および同定するために使用し
た。図12aは、このデータ照会手順を使用して同定したこれらのクローンのサブ セットを示し、図12bは、2つのクローン06L22および08N24が、この陽性クローン
の自動同定データセット内に見出されることを示している。
【０１３６】 4.2 デジタル画像キャプチャー、処理および解析を使用した、マイクロタイタ ープレート中の相互作用ライブラリー由来のクローンの、規則的なグリッドパタ ーンでのリードアウト系の検出 ： 3.1節に記載した酵母細胞を含む相互作用ライブラリーを、マイクロタイター プレートフォーマットによりスクリーニングし、相互作用融合タンパク質を発現
する細胞を同定した。最初に、相互作用ライブラリーを含むマイクロタイタープ
レートを凍結貯蔵から取り出し、室温まで融解させた。第二に、各々のプレート
を、3.1節に記載されている通りにレプリカ作製してラベルを付け、スクリーニ ング用の付加的なコピーを3種類の別々の選択培地それぞれの中に作製した。細 胞を、予め40μｌの液体選択培地（SD-leu-trp、SD-leu+CAN またはSD-trp+CHX のいずれか）で満たした384ウェルのマイクロタイタープレート中に移送した。 第三に、30℃、4日間の増殖の後に、Galacton-StarおよびSapphire II（Tropix,
US）を含む10μｌの酵母ワンステップ酵母溶解緩衝液（Yeast One Step Yeast
Lysis Buffer）を添加し、細胞をプラスチック製のレプリカツールを使用して分
散させ、プレートを37℃で40分間インキュベートした。最後に、プレートを2×3
配置に並べて置くことにより、LAS1000 CCDカメラ（Fuji, Japan）を用いて、並
行して6つのプレートのデジタル画像を得た。Sapphire II（Tropix, US）と組み
合わせたβ-ガラクトシダーゼ基質Galacton-Starは、酵母細胞中でのβ-galレポ
ーター遺伝子の活性化において検出可能な発光をもたらし、十分なシグナルを収
集するために露出時間は5分間とした。グレースケールデジタル画像をキャプチ ャーし、コンピュータに保存し、次いで4.1節に記載した画像解析システムを使 用して解析した。しかしながら、この場合は、マイクロタイタープレート中のク
ローンの規則的なグリッドパターンの密度が低いため、各々のクローンの位置を
決定することは遥かに簡単である。第二には、平均ピクセル強度を測定するため
に使用したピクセルマスクのサイズは、マイクロタイタープレートのウェルのサ
イズとほぼ同じ大きさにした。6つのマイクロタイタープレート中の陽性クロー ンを、3つの選択培地で増殖させたクローンに由来するデジタル画像の画像解析 によって同定し、これらのデータを4.1節に記載の通りにコンピュータプログラ ムによって処理した。
【０１３７】実施例５： 相互作用の個々のメンバーの同定 本実施例のために構築した相互作用ライブラリーは、図８に示したように、予
測した相互作用を有する既知の融合タンパク質からなるものであった。従って、
この特定の相互作用ライブラリーから実際に得られた陽性クローンは、相互作用
する融合タンパク質ペア、LexA-SIM1とGAL4ad-ARNT、LexA-HD1.6とGAL4ad-HIP1 またはLexA-HD3.6とGAL4ad-HIP1を発現し、またそれゆえに、プラスミド構築体 の対応するペア、pBTM117c-SIM1とpGAD427-ARNT、pBTM117c-HD1.6とpGAD427-HIP
1またはpBTM117c-HD3.6とpGAD427-HIP1をそれぞれ含むと予想される。単一細胞 内で発現される融合タンパク質間の相互作用を含む個々のメンバーの同定は、図
１、図6および図7に概説する多様な方法により行うことができる。３つの独立の
方法、核酸ハイブリダイゼーション、PCRおよびDNA配列決定を用いて、陽性クロ
ーン06L22および08N24中の相互作用する融合タンパク質を発現した個々のプラス
ミド構築体を同定した。
【０１３８】 5.1 核酸ハイブリダイゼーションによる相互作用の個々のメンバーの同定 LarinおよびLehrach(1990)に記載されている手順に従って、SD‐leu−trp−hi
s培地上に置かれ、β-gal活性のアッセイに用いられなかった４つのメンブレン を処理し、相互作用ライブラリーのクローン中に含まれるDNAをメンブレンの表 面上に付着させた。ハイブリダイゼーションプローブとして使用するために、SI
M1の1.1kb DNA断片およびARNTの1.3kb DNA断片を標準のランダムプライマー法に
より放射性標識した（FeinbergおよびVogelstein、1983）。各プローブを10分間
95℃で熱変性させ、65℃で一晩、15mlの５％ SDS／0.5M リン酸ナトリウム(pH7.
2)／1mM EDTA中で、メンブレンに付着した相互作用ライブラリーからのDNA(上記
のように調製した)を有する高密度にスポットされたメンブレンとハイブリダイ ズさせた。メンブレンを室温で20分間、40ｍMリン酸ナトリウム／0.1％SDS中で 一回、65℃、20分間で1回洗浄し、その後各メンブレンをサランラップ(Saran Wr
ap)で覆い、それをリン光体貯蔵スクリーン(phosphor-storage screen； Molecu
lar Dynamics、USA)に一晩露光した。リン光体画像装置(phosphor-imager；Mole
cular Dynamics、USA)を使用して、リン光体貯蔵スクリーンを走査することによ
り、各ハイブリダイズされたメンブレンのデジタル画像を得た。デジタル画像を
コンピュータ上に記憶させ、Lehrachら(1997)に記載の、スクエアブロック(squa
re block)を有する陽性ハイブリダイゼーションシグナルを選び出すDNAアレイの
分析のために、画像解析システムを使用して分析した。図13は、クローン06L22 および08N24を含み、図11aに示されるものに対応する各ハイブリダイズされたメ
ンブレンの拡大された領域を示し、そのスポット位置は環状である。これらのク
ローンは相互作用する融合タンパク質ペア、LexA-SIM1とGAL4adARNT、LexA-HD1.
6とGAL4ad-HIP1またはLexA-HD3.6とGAL4ad-HIP1のいずれかを発現すると予測さ れ、また特異的なSIM1およびARNTプローブでのハイブリダイゼーションは両クロ
ーンがプラスミド構築体pBTN117c-SIM1およびpGAD427-ARNTを含むことを示して いた。
【０１３９】 5.2 核酸増幅および配列決定による相互作用の個々のメンバーの同定 個体クローン06L22を元の相互作用ライブラリーの凍結プレートから解凍し、S
D−leu−trp−his液体培地に接種した。この培養株を30℃で3日間増殖させ、ク ローンに含まれる対応するプラスミドをQiaPrep(Qiagen, Hilden)手順を用いて 単離した。Duplex PCRを使用して、pBTM117またはpGAD427プラスミドのどちらか
に特異的なプライマーペアを用いてプラスミド構築体に含まれるインサートを同
時に増幅した。クローン06L22についてSIM1およびARNTインサートの存在を、別 々に得たプラスミドpBTM117c-SIM1およびpGAD427-ARNT由来のインサートの対照 増幅物をサイズマーカーとして、そのPCR増幅産物を電気泳動することにより確 認した（図14）。
【０１４０】 必要なプラスミドに対しそれぞれのプライマーペアのみを用いることを除いて
は上記のように、クローン06L22が保持する個々のプラスミド由来の個々のイン サートのPCRを行った。個々のインサートもまた、ホールセル酵母PCRキット(Who
le Cell Yeast PCR Kit; Bio 101、USA)を用いて酵母培養株から直接に増幅され
た。抽出プラスミドDNAからの増幅または酵母クローンの直接的なPCRによってク
ローン06L22から単離されたインサートのペアを、標準プロトコルでDNA配列決定
にかけた。
【０１４１】 プラスミドpBTM117に特異的なプライマーを用いて増幅した1.26Kbのインサー トを、SIM1遺伝子の既知配列と比較することにより、予測されたSIM1遺伝子断片
として確認した（Probstら、1997）。同様に、pGAD427プラスミドに特異的なプ ライマーを用いて増幅した1.37Kbのインサートを、予測されたARNT遺伝子断片と
して確認した。
【０１４２】実施例６： 大規模化かつ自動化された改良型２−ハイブリッドシステムを用い た相互作用タンパク質の検出と同定 図６に、相互作用する融合タンパク質を発現するクローンの同時検出と、該相
互作用を含むメンバーの同定のために、大規模かつ自動化アプローチ中に本発明
の方法を利用するスキームを示す。視覚検査またはデジタル画像処理の使用によ
り、また種々の選択培地上で増殖した後に、βガラクトシダーゼ活性についてア
ッセイし終えた高密度グリッドのメンブレンの分析により、相互作用するタンパ
ク質を発現する「相互作用ライブラリー」由来の酵母クローンを大規模に同定す
る。前出の実施例に記載のような自動化方法を用いて、相互作用ライブラリーお
よび高密度にスポットされたメンブレンの作製、およびβ−galアッセイのデジ タル画像およびハイブリダイゼーション画像の解析を行う。
【０１４３】 6.1 高等真核生物用の相互作用ライブラリーの作製 標準法（Life Technologies、USA）により、pSport1のNot 1/Sal 1部位にクロ
ーン化したウニ類(バフンウニ：Strongylocentrotus purpuratus)胚（受精後40 時間）の、ランダムプライマー法で標識され、サイズ選択(1−1.5Kb)されたcDNA
ライブラリーをA. Poustkaからの贈り物として入手した。このライブラリー（こ
の発生段階において発現されるおよそ6000個の異なる転写産物を示す(Davidson 、1986)）の100ngを標準エレクトロポレーション技術によりエレクトロ−コンピ
テント大腸菌細胞に形質転換した。形質転換混合物を、2ｘYT/100μg/ml アンピ
シリンを含む24ｘ24cm寒天トレイ(Genetix、UK)上で平板培養することによって 、組換え体クローンを選択した。37℃で18時間の増殖後に、５つのトレイからの
生じた組換え体コロニー（1トレイに20,000と算定した）をトレイあたり50mlのL
B液体培地を用いて洗浄した。pSportにクローン化され、増幅されたcDNAライブ ラリーを、QiaPrep(Qiagen、Germany)プラスミド抽出法でこの洗浄混合物から単
離した。その後ライブラリーのインサートのおよそ1μgをNot 1/Sal 1消化によ りプラスミドDNAから単離し、標準法を用いるアガロースゲル精製によりサイズ 選択(1−1.5Kb)した。
【０１４４】 ２つのベクター系pGAD428およびpBTM118の3つのリーディングフレーム全てを 示す２つのプールを、ベクターpGAD428 a, b, cおよびpBTM118 a, b, cの各１μ
gをそれぞれNot 1/Sal 1消化しプールすることによって調製した。上記のように
単離したインサート混合物を２つの等画分に分割し、300ngを各調製ベクター系 プールの50ngとライゲートした。続いてライゲーション後に、各反応を別々にエ
レクトロ−コンピテント大腸菌細胞に形質転換し、各ライブラリーの組換え体ク
ローンを、pGAD428またはpBTM118ライブラリーにそれぞれカナマイシンまたはア
ンピシリンを用いた5つの24ｘ24cmプレート上で選択した。およそ500μgのpBTM1
18および500μgのpGAD428ライブラリーを、上記のように、平板培養された細胞 の洗い流しと、続く洗浄混合物のQiaPrepプラスミド抽出によって、大腸菌形質 転換体の２つのセットから抽出した。
【０１４５】 相互作用ライブラリーを生成するために、DNA結合および活性化ドメインライ ブラリーのモル等価量をプールし、この混合物の20μgをGietzら(1992)の方法で
酵母株L40ccに同時形質転換した。生じた形質転換混合物を単一の24ｘ24cm寒天 トレイ上で平板培養した。寒天トレイは第１．３．１節に記載のように調製され
た。合計20個の形質転換体を調製し、別々の寒天トレイ上で平板培養し、30℃で
７日間インキュベーション後にトレイあたり平均1500個の酵母コロニーを得た。
【０１４６】 6.2 マイクロタイタープレートにおける相互作用ライブラリーの規則的なグリ ッドパターンの作製 相互作用ライブラリーの規則的なグリッドパターンを作製するために、酵母コ
ロニーを含む寒天トレイを改良型実験室用ピッキングロボット(modified labora
tory picking robot)に配置し、個々のクローンを自動的に第３．１節に記載の ようにつまみ取った。合計30個の384ウェルマイクロタイタープレートを作製し 、調査生物用の10,000クローン以上の相互作用ライブラリーを示した。マイクロ
タイタープレートのウェル内における酵母クローンの増殖後、ライブラリーを複
製してさらに３つのコピーを生成し、標識した。また、全コピーを−70℃で保管
し、第３．１節に記載のように後日の分析に供した。
【０１４７】 6.3 平らなキャリアー上における相互作用ライブラリーの規則的なグリッドパ ターンの作製 相互作用ライブラリーの効率的な分析に備えるために、第３．３節に記載の方
法を用いて相互作用ライブラリーを含むクローンを222ｘ222mm多孔質性メンブレ
ン(Hybond N＋、Amersham、UK)上に高密度に配列した。23個の384ウェルマイク ロタイタープレートを用いて、各メンブレンにつき保管の相互作用ライブラリー
のコピーを解凍して得たクローンの「3ｘ3二重の」規則的なグリッドパターンに
配列した合計20のレプリカメンブレンを作製した。それぞれのレプリカメンブレ
ン上に、一つのマイクロタイタープレートを8つの異なる対照クローン（既知の 陽性、陰性および偽陽性クローンを示す）を含む位置24にさらに配列した。この
パターンは1平方センチメートルあたり約40クローンの密度でスポットされた900
0個を超える酵母2−ハイブリッドクローンに対応した。対抗選択培地プレート上
に配置された4つのメンブレンの各スポットにおける酵母細胞数が十分であるこ とを保証するために、ロボットはマイクロタイタープレートのウェル内のわずか
に異なる位置から各スポット位置に5回スポットするようにプログラムされた。 ロボットはスポットパターンを作るデータファイルを作成し、各マイクロタイタ
ープレートから自動的に読み取るバーコードを記録した。
【０１４８】 各メンブレンを注意深く24ｘ24cm寒天トレイ中の約300mlの固体寒天培地上に 置いた。14個のメンブレンをSD−leu−trp−his培地に移し、5回スポットされた
メンブレン３個のそれぞれをSD−trp＋CHXまたはSD−leu＋CAN培地のどちらかに
移した。酵母コロニーをメンブレンの表面上で30℃、3日間のインキュベーショ ンにより増殖させた。
【０１４９】 6.4 陽性クローンを同定するための、規則的なグリッドパターンにおけるリー ドアウト系の検出及びそのデジタル画像解析 相互作用する融合タンパク質を発現した個々のクローンを効率よく同定するた
めに、多孔性担体上で増殖された個々のクローンの活性化状態を、高度平行法に
より試験した。対抗選択培地上に置いた６枚のメンブレン上及び上述のSD-leu-t
rp-his培地上に置いたさらなる３枚のメンブレン上で増殖された相互作用ライブ
ラリーのレプリカアレイについて、lacZ活性を分析した。各々のデジタル画像を
捕捉し、1.4.1.節に記載のごとく画像処理を行った。図１５は、メンブレンフィ
ルター上で規則的なグリッドパターン中に配列され、SD-leu-trp-his培地上で増
殖された相互作用ライブラリーから得た個々のクローンのリードアウト系の活性
化について、グレイスケール画像で示したものである。
【０１５０】 4.1節に記載の画像解析システムを用いて、各々のデジタル画像から、３種の 選択培地上で増殖された規則的なグリッドパターンにおける個々のクローンのリ
ードアウト系の活性化状態を記録した。これらのデータは、SD-leu-trp-his、SD
-leu+CAN、及びSD-trp+CHX選択培地の各々の３種のレプリカメンブレン上で増殖
された相互作用ライブラリーについて集積されたものであり、また、これらのデ
ータは共に、図１２aに示したコンピュータプログラムを用いて各々のクローン に関連づけられた。
【０１５１】 本プログラムを用いて、これらのデータを照会し、３枚のうちの２枚のSD-leu
-trp-hisレプリカメンブレン上で増殖された際にリードアウト系を活性化したが
、SD-leu+CANあるいはSD-trp+CHXの２種の対抗選択培地上に置かれた３枚のレプ
リカメンブレンの２組のうちいずれかの組で増殖された際にはリードアウト系を
活性化しなかったクローンを同定した。本データベースにより、２４番目のマイ
クロタイタープレートの４８ウェル中に各々配列された８個の異なる対照クロー
ンを正確に同定した。２３個の３８４ウェルマイクロタイタープレート中に配列
された相互作用ライブラリーから、陽性クローンとして合計７５３９個のクロー
ンを同定した。それらの陽性クローンは、双方のプラスミド（したがって融合タ
ンパク質）が細胞中に発現された場合にのみリードアウト系を活性化したもので
ある。SD-trp+CHX培地上で増殖した際にもリードアウト系を活性化したため、３
９８３個のクローンを偽陽性クローンとして同定した。SD-trp+CHX培地は、活性
化ドメイン融合タンパク質を発現するプラスミドを排除する。SD-leu+CAN培地上
で増殖した際にリードアウト系を活性化したため、１１３個のクローンを偽陽性
クローンとして同定した。SD-leu+CAN培地は、DNA結合融合タンパク質を発現す るプラスミドを排除する。実施例７に記載のごとく、これらのデータにより、相
互作用ライブラリーの各々のクローンに関する情報を有する関連データベースの
一覧表を自動的に作成することが可能となった。
【０１５２】 SD-trp+CHX選択により同定された比較的多数の偽陽性クローンについては、活
性化ドメインプラスミドが排除されるに際して、DNA結合ドメイン融合タンパク 質が、パートナータンパク質の非存在下でリードアウト系を活性化する能力を試
験することにより説明されうる。ウニ初期胚において発現される転写物の多くは
転写因子であること、及びその転写因子断片が、DNA結合ドメイン融合タンパク 質として発現された際に、一般に酵母ツーハイブリッドシステムにおいて偽陽性
を示す原因となることが知られている。従って、本発明の結果により、上述の方
法が、大規模のライブラリー対ライブラリースクリーン相互作用スクリーンから
大多数の偽陽性クローンを効率よく排除できることが実証される。
【０１５３】 6.5 核酸増幅及び配列決定による相互作用の個々のメンバーの同定 合計９６個の陽性クローンを、データベースから無作為に選択し、３８４ウェ
ルマイクロタイタープレートに保存した相互作用ライブラリークローンの凍結複
製物から回収した。高処理能力水浴熱サイクル装置 (high-throughput water-ba
th thermocycling machine)（Maierら、1994）を用いて９６ウェルマイクロタイ
タープレート中で直接PCR反応を行ったことを除いて、各々のクローンが保有す るpGAD428及びpBTM118ベクター中にクローン化されたDNA配列を、5.2節に記載の
ごとく直接増幅した。
【０１５４】 陽性クローンのDNA結合ドメイン融合タンパク質をコードする核酸を特徴付け るために、上述のpBTM428に特異的な９６ウェルPCRを行った後、標準的な方法に
より配列決定を行った。同様に、pGAD118に特異的なPCRを行った後、活性化ドメ
イン融合タンパク質をコードするインサートの配列を決定した。これらのインサ
ートの配列と、公表されたDNA配列とを標準的な配列比較法（例えばBAST）によ り比較したところ、１つの相互作用が２つの未同定の遺伝子断片に関連すること
が示されたが、その遺伝子断片は、プレート５のK20ウェルに位置する陽性クロ ーンにより発現されたものである。予想されるタンパク質の配列から、これら２
つの遺伝子を、タンパク質A遺伝子及びタンパク質B遺伝子と称することとした。
【０１５５】 6.6 核酸ハイブリダイゼーションによる相互作用の個々のメンバーの同定 相互作用ライブラリーから得た融合タンパク質をコードする核酸の規則的なグ
リッドパターンを構築した。SD-leu-trp-his培地上に置かれた、及びb-gal活性 を測定するために用いられなかったメンブレンを、LarinとLehrach(1990)により
記載された方法に従って処理し、相互作用ライブラリーのクローンに含まれるDN
Aをメンブレン表面に固着させた。上述のように単離されたタンパク質Aをコード
したDNA断片を、FeinbergとVogelstein(1983)の方法により放射性標識した。こ の放射性標識したプローブを、メンブレン表面に固着させた相互作用ライブラリ
ーから得たDNAを有するアレイにハイブリダイズさせ、そのアレイを洗浄し、5.1
.節のごとく検出した。
【０１５６】 ハイブリダイゼーション陽性のクローン数及びその同一性を、Lehrachら (199
7)によって記載された自動画像解析システムを用いて、各々のハイブリダイゼー
ションについて決定した。相互作用ライブラリーから得た７個のクローンを、タ
ンパク質Aをコードするプローブに対してハイブリダイゼーション陽性であると 確定した。図１６は、自動画像解析システムにより同定され、かつ特色付けられ
たハイブリダイゼーション陽性クローンを用いて、タンパク質A をコードする遺
伝子断片にハイブリダイズしたDNAアレイをデジタル画像で示したものである。 図１７は、本解析法により陽性であることがわかったものを図式表示したもので
ある。実施例７に記載したデータベースを用いて、画像解析プログラムにより得
られたクローンの一覧表を参照すること、及び相互作用陽性のクローンであるこ
れらのハイブリダイゼーション陽性クローンを同定することにより、以後の解析
から偽陽性クローンを排除した。期待したとおり、ハイブリダイゼーション陽性
のクローンは、クローン5K20であった。クローン5K20から、タンパク質Aに対応 するプローブが得られた。
【０１５７】 タンパク質Aから相互作用経路を拡張するために、第２のフィルターを、タン パク質Bをコードする断片から作製された放射性標識プローブにハイブリダイズ させた。実施例７に記載のデータベースを用いたハイブリダイゼーションシグナ
ルの解析により、タンパク質Bをコードする遺伝子断片を有する８個の相互作用 陽性のクローンを同定した。図１８は、プローブB（白抜きの丸印）及びプロー ブA（赤い丸印）を用いて同定されたハイブリダイゼーション陽性及び相互作用 陽性のクローンを図式表示したものである。２個のクローン（”A/B”で表した5
K20及び3L11）について、プローブA及びプローブBの双方とのハイブリダイゼー ションシグナルを検出した。このことは、これらの陽性クローンの双方が同一の
相互作用融合タンパク質を発現したことを示している。
【０１５８】 タンパク質A及びタンパク質Bの相互作用経路をさらに拡張するために、プロー
ブBについてのみハイブリダイゼーションシグナルが検出された１個の相互作用 陽性クローン（クローン6D18）から、DNA結合及び活性化ドメインプラスミドを 抽出した。それらの遺伝的エレメントが有するインサートのDNA配列決定により 、DNA結合ドメインプラスミドにおいてタンパク質Bをコードする遺伝子断片の存
在を確認した。配列の解析により、活性化ドメインプラスミドが、タンパク質C をコードする別の未知の遺伝子の断片を有することが示された。この遺伝子断片
を、別のアレイに対するプローブとして用い、そのデータを上述のごとく解析し
た。図１９は、このハイブリダイゼーションの結果（菱形で表示してある）を、
先述の２つのハイブリダイゼーションの結果と共に示したものである。合計６個
の相互作用陽性クローンを、タンパク質Cをコードする遺伝的エレメントを有す るものとして同定した。これらの相互作用陽性クローンのうち３個は、プローブ
Bにハイブリダイズすること（4G19、1D7、及び6D18）、及び２個のクローンはプ
ローブAにハイブリダイズすること（1C22及び3A11）が先に示されている。これ ら３つの簡単なハイブリダイゼーションにより同定された相互作用の図式を、図
１９に示してある。クエスチョンマークは、ネットワークにおいて考え得るさら
なる段階を示す。そのネットワークは、プローブA、B、あるいはCに対しハイブ リダイゼーション陽性である残りのクローンが保有する遺伝的エレメントを同様
に調べることによってさらに検討可能であろう。実際、本発明のハイブリダイゼ
ーション法を行うことにより、合計９つのハイブリダイゼーション及びそれに続
く相互作用するメンバーをコードするインサートのシークエンシングにより、１
４個の異なるタンパク質間相互作用を同定した。それらのデータの全てを、実施
例７に記載のデータベースに入力した。
【０１５９】 6.7 陽性クローンの自動再アレイイング 上述のごとく同定された３４４３個の陽性クローンを、相互作用ライブラリー
の２３枚全てのマイクロタイタープレートに分配した。陽性クローンのさらなる
解析をきわめて容易にするためには、物理的に個々のクローンを単離し、好まし
くは３８４ウェルプレートのさらなる１セット内に、再配列された陽性クローン
の、第二の規則的なグリッドパターンを作製することが好都合であった。
【０１６０】 Stantonら（1996）、Lehrachら（1997）によって記載されたような、もしくは
市販元（Genetix、英国）から発売されているような現存の再アレイイングロボ ットは、もとの相互作用ライブラリーを含有する供給先の３８４ウェルプレート
（“母”）の個々のウェルから、増殖培地を含有する受入先の新しい滅菌３８４
ウェルプレート（“娘”）のウェルに酵母細胞を移入する際に、満足な種菌を提
供できなかった。そのため、現存の移入ピンを、末端の平たい、まっすぐな直径
２mmのピンに代えた。次に、酵母コロニーの自動採集についての3.1節の記載の ごとく、ピン上に運ばれ、娘プレート中の新しいウェルに移入される乾燥細胞の
量を最大化するように、接種法を改良した。3.1.節に記載のごとく、再アレイイ
ングサイクルの間に、0.3%過酸化水素洗浄浴槽、70%エタノール洗浄浴槽、及び 乾熱法により、ピンを滅菌した。
【０１６１】 実施例７に記載のデータベースを用いて、陽性クローン及びそれらのプレート
−ウェルの位置の一覧表を作成し、再アレイイング用ロボットに、コンピュータ
ファイルとして自動的にロードさせた。ロボットは、データファイルを参照して
第１の陽性酵母ツーハイブリッドクローンを含む母プレートを自動的に取り上げ
、プレートのバーコードを読み取り、それを記録した。９６個の再アレイイング
用頭部を有するピンを、個々に及び順次、本第１のプレートから上に移動させ、
対象とするウェル中に下ろした。全ての陽性クローンを試料とした際に、母プレ
ートを自動的に交換した。全ての９６ピンを用いて陽性クローンの種菌を採集し
た際に、ピンの頭部を、SD-leu-trp/7%グリセロールを含む、第１の３８４ウェ ル娘プレートに自動的に移動させ、上述のウェルの第１のセット中に９６ピンの
全てを接種した。その後、再配列したライブラリー中の所与の陽性クローンの新
しいプレート−ウェル位置と、もとの相互作用ライブラリー中の古いプレート−
ウェル位置とを関連付けるデータ出力ファイルを更新した。全てのピンを上述の
ごとく滅菌し、全ての陽性クローンが、相互作用ライブラリーから再配列したラ
イブラリーを含む新しいプレート−ウェル位置に移入されるまで、サイクルを完
了させた。その後、データ出力ファイルを中央コンピュータのデータベースに移
し、再配列した相互作用ライブラリー中の所与の陽性クローンの正確な位置を記
録するための、実施例７に記載のデータベース中に一覧表を添付した。娘プレー
ト中の、得られたクローンを、２つのさらなるコピーに複製し、3.1.節に記載の
ごとく−７０℃で保存した。
【０１６２】実施例７： 相互作用のデータベースの作成 スキーム（図２）の中央には、相互作用の各メンバーについての関連情報を保
有するデータテーブル（cDNAテーブル）がある。このテーブルでは、個々のレコ
ードは相互作用の各々のメンバーを表わしており、これらのメンバーは同じクロ
ーン名を共有することにより相互作用を形成することが示されている。幾つかの
理由のために、このようにコア・データテーブルを構築することは有益である。
第１に、同じコア・テーブルを使用して、単なる相互作用データではなく、種々
のゲノム技術を用いたグローバル分析の間に生成され得る種々の遺伝子ライブラ
リー（例えば標準cDNAもしくはゲノムライブラリー）からのcDNAについてのデー
タを保有することができる。第２に、相互作用のメンバーまたは遺伝的断片の各
々を、異なるデータセットについて種々の方法によりさらに特徴付けることがで
きる。cDNA＿テーブル中の所与の遺伝的断片についてのタンパク質-タンパク質 相互作用に直接関連性があるものは、第１に、遺伝子＿テーブルであり、これは
、該断片のDNA配列、ヌクレオチドの相同性マッチ（例えばBLAST検索によるもの
）および対応する遺伝子名への直接的な関連性を提供する。第２に、ドメイン＿
テーブルは、該断片のインフレーム翻訳、アミノ酸の相同性マッチ（例えばBLAS
TN検索によるもの）および任意の２次元もしくは３次元構造情報（予め分かって
いるかまたは予測できるもの）のデータに直接アクセスするための機能を提供す
る。分子生物学の分野で一般に知られているように、所与の遺伝的断片を特徴付
けることができる多くの方法があり、およびこのデータベース構造は、中央のcD
NA＿テーブルから、適切であると思われる前記特徴付けを記載しているデータを
保有する他のテーブル（例えば、遺伝的、発現、標的の実証（validation）、タ
ンパク質生化学またはライブラリー構築の情報についてのデータを保有するテー
ブル）へと関連付けるための機能を提供する。本発明の方法に特に関連があるの
は、オリゴフィンガープリンティング・データについての情報を保持するテーブ
ルに対する所与のcDNA断片の関係である。前記オリゴフィンガープリンティング
・データは、高い並列様式で相互作用の各メンバーを同定するのに使用すること
ができ、クラスターの数、クラスターメンバーシップのコンフィデンスおよびそ
のクラスターについての予測された遺伝子相同性等のデータフィールドを含む（
Maire et al., 1994）。第３に、このようなデータベース構造により、３次以上
の相互作用を同じデータテーブル内に組み込むことがより簡単にできるようにな
る。これは、相互作用のメンバーではなく相互作用がデータテーブル中の主なオ
ブジェクトまたはレコードであり、各高次相互作用について新しいデータテーブ
ルが必要とされるか既存のデータテーブルを修正する必要があった構造とは対称
的である。
【０１６３】 酵母ツーハイブリッド相互作用のスクリーニングの場合、１つの関連テーブル
はY2H_テーブルであろう。前記テーブルは、クローニングに関する所与のクロー
ンおよびその作製の実験的な詳細、それが由来する組織およびライブラリー、さ
らなる研究のための簡単なアクセスを可能とするその物理的位置、それが所与の
Mata株およびMatα株の接合から得られたかどうか、についての情報を含む。重 要なことは、前記Y2H_テーブルが前記クローンの相互作用クラスに関する情報を
保有することである。ここで、前記相互作用クラスとは、活性化ドメイン（AD）
融合タンパク質または結合ドメイン（BD）融合タンパク質のいずれかに関して、
そのクローンが陽性クローンであるか、陰性クローンであるか、あるいは偽陽性
であるか、として定義される。前記相互作用クラスの評価は、最初の方の実施例
に記載した本発明の方法により、沢山のクローンについて簡単に得られる。
【０１６４】 相互作用を含むメンバーを同定する集中的な方法を支援するために、Hybテー ブルが提供される。このテーブルは、所与のクローンについての、所与の高密度
アレイを用いたハイブリダイゼーション実験において所与のプローブで得られた
ハイブリダイゼーション強度に関係する。前記高密度アレイは、スポッティング
ロボットからのデータ（例えば使用される決まったスポッティングパターン、該
アレイが作製された方法ならびに前記アレイに並べられたライブラリーおよびク
ローンのアイデンティティー等）を保有するテーブルに関連付けられる。ユーザ
ーインターフェースの中にこれらのテーブルを組み込めば、所与のプローブにハ
イブリダイズした所与の陽性酵母ツーハイブリッドクローンの物理的な位置をユ
ーザーに表示することにより、本発明の方法のこの実施形態を簡単に行うことが
できるようになる。次に、前記ツーハイブリッドクローンを回収し、相互作用を
含むメンバーをPCRにより単離して配列決定することができる。つぎに、相互作 用の前記配列決定されたメンバーは、cDNA＿テーブルおよび更なる分析における
他の関連するテーブルに入力するためのデータを提供する。前記メンバーは次に
、同じ手法により相互作用経路における次のステップを同定するためにアレイ上
で第２ハイブリダイゼーションプローブとして使用される。
【０１６５】 cDNA＿テーブルの中の実質的な数の相互作用メンバーを集め、これらのデータ
をマニュアルおよび／またはエキスパートシステムにより補正（curate）し、例
えばパスコード(PathCode)＿テーブル等の定義データテーブル（definitive dat
a table）を更新することができる。前記定義データベースは、cDNA＿テーブル からの相互作用についての最高品質の情報を保有する。ここで相互作用について
の前記最高品質の情報とは、補正者（curator）および／またエキスパートシス テムに明示された「確実性(certainty)」のレベルをパスするcDNA＿テーブルか らの情報である。この識別法（decision-making process）を支援するために、 すべての関連データ、特にcDNAの翻訳されたフレームおよび対応するタンパク質
ドメインのデータは、他のテーブルから関連付けられ、使用可能なフォームで補
正者および／またはエキスパートシステムに提示される。この提示により、該デ
ータの中の基本的なエラー（例えば低品質の配列決定など）または誤ってクロー
ニングされたcDNA断片の認識および排除または修正が簡単になる。これらの断片
には、cDNAライブラリーの起源とは異なる生物から派生したものとして同定され
ることができる汚染断片が含まれる。
【０１６６】 所与のcDNAは、それに対応する相互作用cDNA（または複合多量体のcDNA）につ
いてのレコードとともに、そのcDNAが見られる各相互作用につき一回ずつだけパ
スコード＿テーブルに入力される。しかし、cDNAが異なる相互作用、例えば異な
るタンパク質との相互作用を有する場合、あるいは該cDNAの異なるタンパク質ド
メインが異なるタンパク質と相互作用する場合、各ケースにおいて、該cDNAにつ
いての異なるレコードが作成される。これらの異なるレコードに一般的かつユニ
ークな「相互作用ID」をリンクさせる。こうして所与の相互作用を、一回だけパ
スコード＿テーブルの中に提示し、そして該相互作用を示す宿主細胞クローンお
よびその相互作用の中の各cDNAのIDによりデータベースの中の過去のテーブルに
関連付ける。前記相互作用を示す前記宿主細胞は、全ての宿主細胞ならびにcDNA
＿テーブルに保有された前記相互作用を示す相互作用断片を考慮および補正する
ことにより、選択される。
【０１６７】 判断基準（criteria）の１セットを手段として、前記補正（curation）および
選択を支援し、該相互作用の信頼性(confidence)を測定することができる。例と
して、このような判断基準は、下降情報値を有する場合があり、以下のものを含
む：第１に、所与の相互作用がその実験の両方向で観察される場合。すなわちタ
ンパク質B−BDと相互作用するタンパク質A−AD、およびタンパク質A-DBと相互作
用するタンパク質B-BD；第２に、同じ相互作用の異なる例が観察される場合。こ
こで、同じ相互作用の異なる例とは、長さおよび位置が実質的に異なる（例えば
１０％を超える差）が、同じ根底タンパク質ドメイン（underlying protein dom
ain）に由来しているのものであって、同じく相互作用することが分かっている タンパク質断片として定義される；第３に、同じ相互作用の同じ例が、例えば同
じ断片の多重クローニングにより観察される場合。ここで該同じ断片とは、同じ
根底タンパク質ドメインに由来するものであって、長さおよび位置が実質的に同
じである断片である；第４に、相互作用する前記タンパク質ドメインが生物学的
な関連性を有する場合。つまり公開文献から、類似するドメインまたは遺伝子は
相互作用することが知られている、あるいは両方の遺伝子が同じ細胞位置で発現
されるまたは発現される可能性があることが知られている。またこの判断基準は
、ライブラリークローニング、相互作用実験およびその後の相互作用メンバーの
同定の、内部品質管理（internal quality control）として使用することもでき
る。というのは、全ての相互作用実験は、公開された「ハウス-キーピング相互 作用」のあるセットを同定し、このような相互作用の同定は、全体的な相互作用
実験の品質の指標として使用することができるからである。
【０１６８】 特に重要な判断基準の１つは、二次実験による所与の相互作用の最適な実証（
validation）である。例えば、該相互作用タンパク質を表わすcDNA断片をサブク
ローニングし、さらなる相互作用実験を行うことができる。前記さらなる相互作
用実験は、１セットの非関連タンパク質に対する相互作用について各タンパク質
をテストして、前記相互作用の特異性を調べることを含む。前記テストは、前記
相互作用を同定したのと同じ相互作用法、例えば酵母ツーハイブリッド法を用い
て行ってもよいが、好ましくは独立した方法である。好ましくは、所与の相互作
用は、組織-共ノーザン（tissue co-northern）、細胞-同時局在化、または共沈
殿法を含む方法を用いて、生化学的に実証される。
【０１６９】 これら全ての判断基準は、補正者（curator）および／またはエキスパートシ ステムにより考慮され、どのcDNA断片およびその相互作用をパスコード＿テーブ
ルに入力するかを決めるのに役立てられる。補正処理の間に、既知のまたは科学
文献に公開された他の相互作用を、このデータベースに入力することもできる。
したがって、前記テーブル中のフィールドは、この相互作用のソースが内部また
は外部の参考であることを示す。パスコード＿テーブルは、ヌクレオチドおよび
タンパク質配列、ならびに生化学的、構造的、生物学的もしくは書誌的情報につ
いてのデータを保有する２次もしくは外部データベースへの関連リンクを有する
。全てのテーブルおよびデータベースの間の完全な関係をあらわすこれらのデー
タは、簡単なユーザインターフェース（例えばJavaを用いて設計されたインター
フェース等）を用いることにより、またはより複雑なコマンド（例えばSQLによ り提供されたもの等）により、照会することができる。可能な照会には、所与の
ヌクレオチドもしくはアミノ酸の配列またはモチーフについての、あるいは所与
の３次元構造またはモチーフについての、これらのデータ相互作用、経路または
ネットワークから位置指定するための照会が含まれる。第２に、高度に確立され
たネットワークでは、これらのデータを照会して２つの所与のポイント間の所与
の経路を同定することができる。幾つかの照会は、実質的に異なる設計のパスコ
ード＿テーブルを用いることより、例えば相互作用の所与のメンバーでなく所与
の相互作用を根底のレコードとして表わすことにより、より効率的に行われる。
当業者であれば、標準的なデータ追跡システムを用いて１つのテーブル設計から
他のテーブル設計にデータを転送し、前記照会のより効率的な実施を可能とする
ことができるであろう。
【０１７０】 これらの照会の結果は、検索者がこれらのデータを最も効率的に解釈できるよ
うにするために、グラフィック法を用いて表示される。前記グラフィック法は、
マウスのクリックにより起動される要素（例えばシームレスにこれらのデータを
他のデータソースソースにリンクしたり、またはさらなる相互作用のレベルを照
会および表示するためのホットリンクなど）を含む。特定の相互作用、部分的も
しくは完全なタンパク質・タンパク質相互作用ネットワークのビジュアル表示を
作成するコンピュータ・ベースの方法を使用して、最も効率的に、要求された相
互作用を自動的に計算および表示することができる。ネットワークパスを見つけ
出すこと、および見つけ出したパスの最適な表示の計算は、両方とも、数学的グ
ラフ理論の分野で周知のアルゴリズムに基づくことができる。例えば、他の生物
学的関係（例えば遺伝的系統や系統発生的関係等）を表示するのに使用されてき
たものに似たアルゴリズムがある。
【０１７１】 タンパク質相互作用の確立されたコンピュータデータベースは、多くの有用な
用途を有する。例えば、新しい生物学的相互作用または経路の存在を予測したり
、生物学的ネットワーク間のリンクを決定したりするのに使用することができる
。さらにこの方法を用いて、以前知られていなかったタンパク質の機能および局
在化を、これらの相互作用パートナーを決定することにより予測することができ
る。また、該方法は、分子、細胞または動物実験を行うことなく、前記ネットワ
ークの特定のメンバーの発現の変化に対する細胞の応答を予測するために使用す
ることもできる。最後に、これらのデータを使用して、疾病の治療的介入、診断
または治療に適した、医学的に関連性のある経路の中のタンパク質またはタンパ
ク質間の相互作用を同定することができる。
【０１７２】実施例８： 偽陽性クローンに対する前選択および融合タンパク質を発現する酵 母細胞の規則的なグリッドパターンの自動作製 8.1 偽陽性クローンの遺伝的前選択 Schiestel & Gietz (1989)の方法を用いて、URA3リードアウト系を含むプラス
ミドpLUA、およびpBTM117c、pBTM117c-SIM1またはpBTM117c-HIP1プラスミドのい
ずれかをそれぞれ、L40ccu中に共形質転換（co-transformation）することによ り、３つのaタイプ接合酵母株を構築した。pLUAプラスミドとDNA結合ドメインプ
ラスミドのうちの１つとを両方含む形質転換体をSD-trp-ade培地上で選択した。
pLUA、およびpGAD427、pGAD427-ARNTまたはpGAD427-LexAプラスミドのいずれか をそれぞれ、L40ccuα中に共形質転換することにより、３つのαタイプ接合酵母
株を同様に構築した。pLUAと活性化ドメインプラスミドのうちの１つとを両方含
む形質転換体をSD-leu-ade培地上で選択した。このように得た該酵母株を表３に
挙げる。
【０１７３】 酵母株x1a、x2aおよびx3aを選択培地SD-trp-ade、0.2% 5-FOAを含むSD-trp-ad
eおよびSD-trp-ade-ura上にレプリカ接種し、酵母株y1α、y2αおよびy3αを選 択培地SD-leu-ade、0.2% 5-FOAを含むSD-leu-ade、およびSD-leu-ade-ura上にレ
プリカ接種した。表４は、融合タンパク質LexA-HIP1およびGAL4ad-LexAをそれぞ
れ発現する２つの酵母株x3aおよびy3αは、5-FOAを含むこれら各々の培地上で増
殖することができなかったが、ウラシルを含まないこれら各々の培地上では増殖
することができたことを示している。これに対し、単独ではリードアウト系を活
性化させることができない融合タンパク質を発現するプラスミドを含む他の全て
の酵母株は、5-FOAを含むこれら各々の培地上で増殖することができたが、ウラ シルを含まない選択培地上では増殖することができなかった。これは、5-FOAを 含む培地上での選択により、前記リードアウト系を自己活性化する単一の融合タ
ンパク質を発現する酵母クローンを排除することが可能であることを示す。この
ように、URA3リードアウト系は、相互作用接合の前に自己活性化融合タンパク質
を含むクローンを首尾良く排除した。
【０１７４】 8.2 融合タンパク質を発現する遺伝的に前選択された酵母細胞の規則的なグリ ッドパターンの作製 融合タンパク質を発現するクローンの２つの決まったライブラリーを作製した
。第１に、酵母株L40ccuをプラスミドpLUAで形質転換し、得られた安定な形質転
換体のコロニーを、アデニンを含まない最少培地中で培養した。この培養物から
得た細胞をコンピテントとし、表２に示した６つ全てのpBTM117c構築物のプール
した混合物3μgで形質転換した。第２に、酵母株L40ccuαをプラスミドpLUAで形
質転換し、得られた安定な形質転換体のコロニーを、アデニンを含まない最少培
地中で培養した。この培養物から得た細胞をコンピテントとし、表２に示した６
つ全てのpGAD427構築物のプールした混合物3μgで形質転換した。全てのケース において、コンピテント細胞を調製し、Schiestel & Gietsの方法(1989)を用い て形質転換を行った。
【０１７５】 この２つの形質転換体混合物を、YPD液体培地10ml中で30℃にて２時間インキ ュベートした後、大きな24×24cm寒天トレイ（Genetix, UK）上に接種した。pBT
M117c融合ライブラリーを含むMet a細胞を、トリプトファンおよびアデニンを含
まずに0.2％ 5-FOAを含む最少培地（SD-trp-ade+FOA）上に接種し、pGAD427融合
ライブラリーを含むMatα細胞を、ロイシンおよびアデニンを含まずに0.2% 5-FO
Aを含む最少培地（SD-leu-ade+FOA）上に接種した。寒天トレイには、寒天-高圧
滅菌器およびポンプ（Integra, スイス国）を用いて注ぎ、各トレイ毎の寒天の 色および深さのばらつきを最小限にした。接種後、前記トレイを30℃にて4〜7日
間インキュベートしてこれらのコロニーを増殖させると、各トレイあたり約1500
コロニーとなった。
【０１７６】 プラスミドpBTM117c-HIP1を含むMat aクローンおよびプラスミドpGAD427-LexA
を含むMatα株は、融合タンパク質LexA-HIP1およびGAL4ad-Lexaをそれぞれ発現 した。これらの融合タンパク質は、相互作用する融合タンパク質が無くてもURA3
リードアウト系を活性化することが分かった。それゆえ、これらのプラスミドを
担持する細胞は、5-FOAを含む選択培地上では増殖できない。従って、URA3レポ ーター遺伝子を活性化することができない単一の融合タンパク質を発現するこれ
らの酵母クローンのみがコロニーを形成し、該コロニーを該改変ロボットシステ
ムによりピッキングする。
【０１７７】 この改変した実験室用ピッキングロボットを用いて、第１．３．１節中に記載
されたように、個々の酵母コロニーを寒天トレイから滅菌384ウェル・マイクロ タイタープレートの個々のウェル中に自動的にピッキングした。ただし、Mat a 酵母株は増殖培地SD-trp-adeおよび7% (v/v)グリセロールを含むマイクロタイタ
ープレート中に、Matα酵母株は増殖培地SD-leu-adeおよび7% (v/v)グリセロー ルを含むマイクロタイタープレート中にピッキングした。得られたマイクロタイ
タープレートを、第３．１節の36時間後に細胞分散ステップを行って、30℃にて
４日間インキュベートした。インキュベート後、標識した384ウェル・マイクロ タイタープレート中に各プレートのレプリカとして２つの付加的なコピーを作製
したが、その際プレートを該酵母株に適するように7％グリセロールを含む液体 増殖培地で事前に満たしておいた。このレプリカプレートを、上記のように36時
間後に細胞分散ステップを行って、30℃にて4日間インキュベートしたあと、最 初にピッキングした融合タンパク質を発現する細胞のライブラリーのマイクロタ
イタープレートと共に、-70℃にて冷凍保存した。
【０１７８】 このような相互作用ライブラリーのより高密度の規則的なグリッドパターンは
、当業者により、本発明の第３．２節、第３．３節および３．４節に開示された
方法に従って、二倍体酵母細胞のこれらのマイクロタイタープレートから簡単に
作製できることは、明らかであろう。
【０１７９】 8.3 改良された酵母ツーハイブリッド系のための偽陽性に対する視覚的識別 Schiestel & Gietzの方法(1989)によって表２に記載されたpBTM117cプラスミ ド構築物の各々をL40ccu中に形質転換することにより、６つの酵母株を作製した
。各株を、トリプトファンを含まない、リン酸カリウムでpH7.0に緩衝した、β ガラクトシダーゼ基質X-Gal（２μg/ml）を含む選択増殖培地 (SD-trp/XGAL)上 に接種した。表２に記載したpGAD427プラスミド構築物の各々をL40ccuα中に形 質転換することにより、さらに６株を同様に構築した。これらの株を、ロイシン
を含まない、リン酸カリウムでpH7.0に緩衝した、X-Gal（２μg/ml）を含む選択
増殖培地(SD-leu/XGAL)上に接種した。30℃にて７日間インキュベートした後、 これらの株の増殖および青色について調べた。表５は、全ての酵母株は選択培地
上で増殖することができたが、融合タンパク質LexA-HIP1を発現するL40ccu株お よび融合タンパク質GAL4ad-LexAを発現するL40ccuα株のみが青に変わったこと を示す。これに対し、単独でリードアウト系を活性化することができない融合タ
ンパク質を発現するプラスミドを含む他の全ての酵母株は該選択培地上で増殖で
きたが、青色にはならなかった。本明細書中に記載した融合タンパク質について
、βガラクトシダーゼリードアウト系の自己活性化により生成された青色は、ad
e2突然変異による他のクローンのピンク色よりも早く発色することが分かった。
しかし、幾つかの融合タンパク質の場合、この青色は、ピンク色よりもゆっくり
発色し得るため、グレースケール・ビジョンシステムを用いた自動化システムを
使用した視覚的識別の信頼性に影響を及ぼし得る。そのため、当業者であれば、
カラー認識システムやカラーフィルターを組み入れたり、またはピンク色を発色
しない酵母菌株を構築することができる。例えば、野生型ADE2遺伝子または相補
的変異ade3を保有する株を用いる。
【０１８０】 8.4 偽陽性酵母クローンを視覚的に差別するためのオートメーションの使用、 および細胞の規則的なグリッドパターンの作製 ２つの規定の融合タンパク質ライブラリーを生成した。表２に示した６つのpB
TM117c構築物をプールし、該混合物３μgを酵母株L40ccu中に共形質転換した。 トリプトファンを含まない、リン酸カリウムでpH7.0に緩衝した、X-Gal（2μg/m
l）を含む最小培地(SD-trp/XGAL)を入れた５つの大きな24×24cm寒天トレイ（Ge
netix、UK）に該混合物を接種することにより、この得られた形質転換体を選択 した。第２に、表５に示した６つのpGAD427構築物をプールし、該混合物3μgを 酵母株L40ccuα中に共形質転換した。ロイシンを含まない、リン酸カリウムでpH
7.0に緩衝した、X-Gal（2μg/ml）を含む最小培地(SD-leu/XGAL)を入れた５つの
大きな24×24cm寒天トレイ（Genetix、UK）に該混合物を接種することにより、 この得られた形質転換体を選択した。これらの寒天トレイには、寒天-高圧滅菌 器およびポンプ（Integra、スイス国）を用いて注ぎ、各トレイ毎の寒天の色お よび深さのばらつきを最小にした。この寒天トレイを７日間インキュベートして
該酵母クローンを増殖させ、βガラクトシダーゼレポーター遺伝子を活性化する
ことができるクローンの青色を発色させた。全てのケースにおいて、コンピテン
ト細胞を調製し、Schiestel & Gietzの方法(1989)を用いて形質転換を行った。
【０１８１】 改変した実験室用ピッキングロボットを用いて、第３．１節に記載されたよう
に、個々の酵母コロニーを寒天トレイから滅菌384ウェル・マイクロタイタープ レートの個々のウェル中に自動的にピッキングした。ただし、Mat a酵母株は増 殖培地SD-trpおよび7% (v/v)グリセロールを入れたマイクロタイタープレート中
に、Matα酵母株は増殖培地SD-leuおよび7% (v/v)グリセロールを入れたマイク ロタイタープレート中にピッキングした。
【０１８２】 第３．１節に記載された青/白選別パラメーターを用いて自動化された視覚的 識別を行った。該ロボットは、白いコロニーのみをマイクロタイタープレートに
ピッキングし、βガラクトシダーゼレポーター遺伝子の活性化により青に変わっ
たコロニーは全て無視するように、プログラムした。図20は、上記改変ピッキン
グシステムを用いた偽陽性クローンの自動化された視覚的識別を表わす。得られ
たマイクロタイタープレートを、第３．１節の36時間後に細胞分散ステップを行
って、30℃にて４日間インキュベートした。インキュベーション後、標識した38
4ウェル・マイクロタイタープレート中に各プレートのレプリカとして２つの付 加的なコピーを作製し、該酵母株に適するように7％グリセロールを含む液体増 殖培地で事前に満たしておいた。このレプリカプレートを、上記のように36時間
後に細胞分散ステップを行って、30℃にて4日間インキュベートした後、最初に 取り出した融合タンパク質発現細胞のライブラリーのマイクロタイタープレート
と共に、-70℃にて冷凍保存した。
【０１８３】 当業者であれば、本発明の第３．２節、第３．３節および第３．４節に開示さ
れた方法に従って、このような相互作用ライブラリーのより高密度な規則的なグ
リッドパターンを、二倍体酵母細胞のこれらのマイクロタイタープレートから簡
単に生成することができることは、明らかである。
【０１８４】 融合タンパク質LexA-HIP1またはGAL4ad-LexAを発現したこれらのコロニーのみ
が、LacZ遺伝子を活性化することができ、従って、選択培地上で増殖させたとき
に青に変わるはずである。従って、Mat aライブラリーから得た青いコロニーはp
BTM117c-HIP1構築物を担持しているものと予想され、一方白いコロニーは他方の
pBTM117cプラスミド構築物を担持するものと思われる。同様に、Matαライブラ リーから得られた青いコロニーはpGAD427-LexA構築物を担持し、白いコロニーは
他のpGAD427プラスミド構築物を担持するものを思われる。この仮説を証明する ために、10個の白いコロニーおよび10個の青いコロニーを、ピッキングしたMat
aライブラリーの寒天トレイから無作為に選択し、20個のコロニーを、自動的に ピッキングした384ウェル・マイクロタイタープレートから選択した。40個全て のコロニーを、SD-trp培地の個々の液体培養物1ml中に手で接種し、該培養物を3
0℃にて３日間増殖させた。各クローンが保有する挿入物（inset）を、酵母培養
物からpBTM117c挿入体を直接PCR増幅させ、標準的なプロトコールによりDNAの配
列決定を行うことにより調べた。リードアウト系を活性化させて青に変化した10
個全ての酵母コロニーは、1.2KbのHIP1断片を保有しており、白いコロニーは1.6
KbのHD1.6もしくは1.1Kb SIM挿入体を保有していたか、あるいは非組換えベクタ
ーからの増幅反応は見られなかった。自動的に視覚的識別した384ウェルマイク ロタイタープレートから選択した20個のクローンのうち、1.2KbのHIP1断片を有 するものは１つも無かった。Matαライブラリーから手動で選択したクローンお よび自動的に取り出したクローンの同様の実験により、青いコロニーはpGAD427-
LexA構築物からのLexA挿入体を含んでいたが、自動的に取り出したコロニーはど
れもこの挿入体を保有していなかったことが確認された。LexA-HIP1融合タンパ ク質をコードするpBTM117c-HIP1プラスミドおよびGAL4ad-lexA融合タンパク質を
コードするpGAD427-LexAは、いずれのパートナータンパク質が無くてもそのリー
ドアウト系を自己活性化することが知られていた。従って、自動的な視覚的識別
は、これらの偽陽性クローンに対して前選択され、リードアウト系を活性化させ
ることができない単一の融合タンパク質を発現する酵母クローンの規則的なグリ
ッドパターンを自動的に作製した。
【０１８５】実施例９： 酵母細胞中で遺伝的エレメントを組み合わせるための自動化された 相互作用接合 9.1 規則的なパターンでの固相支持体上の自動化された相互作用接合 第８．１節における自律活性化融合タンパク質を発現しない酵母株を、自動化
されたアプローチを用いて接合させた。酵母株x1a、x2a、y1αおよびy2αの各々
を、Mat a株用のSD-trp-ade培地およびMatα株用のSD-leu-ade培地を含む４つの
マイクロタイタープレートのうち１つの全てのウェルの中で増殖させた。各プレ
ートをユニークなバーコードで標識し、Lehrachら（1997）により記載されたよ うなスポッティングロボットを用いて酵母株x1aおよびx2aを、規定の２×２複製
パターンで、各スポット間のスペースが2mmとなるように、YPD培地に予め浸して
おいたHybond-N+膜（Amersham）に移した。次に、このスポッティングロボット は、酵母株y1αおよびy2αを、すでにx1aおよびx2aクローンを含んでいる各膜上
の同じそれぞれのスポッティング位置に、自動的に移した。該ロボットは、該ス
ポッティングツールを自動的に滅菌し、マイロタイタープレートを、移したクロ
ーンの各セット間で交換し、作製されたスポッティングパターンおよび各マイク
ロタイタープレートから自動的に読み出されたバーコードが記録されたデータフ
ァイルを作成する。スポッティングされた膜をYPDプレートに移し、30℃にて一 晩インキュベートして、接合および増殖を促した。各膜を、Breeden & Nasmyth の方法(1985)を用いてβ-Gal活性について分析した後、一晩自然乾燥した。乾燥
した各フィルターのデジタル画像を、標準的なA3コンピュータスキャナを用いて
捕捉し、第４．１節で記載したように画像処理した。処理した画像をコンピュー
ターに記憶させ、第４．１節で記載した画像分析システムを用いてβ-ガラクト シダーゼを発現するクローンの同定を行った。図21は、x1a株とy1α株間、およ びx2a株とy2α株間の自動化された相互作用接合の結果を示す。得られた二倍体 株は両方ともYPD培地上で増殖したが、相互作用融合タンパク質LexA-SIM1および
GAL4ad-ARNTをそれぞれコードするプラスミドを含むx2aとy2αの相互作用接合に
より生じた二倍体株のみは、LacZ+表現型を示し、X-Galと共にインキュベートす
ると青に変化した。タンパク質LexAおよびGAL4adをコードするプラスミドを含む
x1a株とy1α株の間での相互作用接合により生じた二倍体株では、βガラクトシ ダーゼ活性は観測されなかった。
【０１８６】 9.2 液体培養に基づく自動化された相互作用接合 融合タンパク質を発現する２つの規定のライブラリーを作製した。第１に、酵
母株L40ccuをプラスミドpLUAで形質転換し、得られた安定な形質転換体コロニー
を、アデニンを含まない最小培地で培養した。この培養物から得た細胞をコンピ
テントとし、表２に示した６つ全てのpBTM117c構築物のプールした混合物3μgで
形質転換した。第２に、酵母株L40ccuαをプラスミドpLUAで形質転換し、得られ
た安定な形質転換体のコロニーを、アデニンを含まない最小培地中で培養した。
この培養物から得た細胞をコンピテントとし、表２に示した６つ全てのpGAD427 構築物のプールした混合物3μgで形質転換した。全てのケースにおいて、コンピ
テント細胞を調製し、Schiestel & Gietzの方法(1989)を用いて形質転換を行っ た。
【０１８７】 得られたこの２つの形質転換体混合物中の細胞を、YPD液体培地中で30℃にて ２時間インキュベートして回収した後、大きな24×24cm寒天トレイ（Genetix, U
K）上に接種した。pBTM117c融合ライブラリーを含むMet a細胞を、トリプトファ
ンおよびアデニンを含まずに0.2％ 5-FOAを含む最小培地（SD-trp-ade+FOA）上 に接種し、一方pGAD427融合ライブラリーを含むMatα細胞を、ロイシンおよびア
デニンを含まずに0.2% 5-FOAを含む最小培地（SD-leu-ade+FOA）上に接種した。
【０１８８】 寒天トレイ上のコロニーを、30℃にて4〜7日間インキュベートして増殖した。
休眠細胞（dormant cell）から発生する偽陽性を最小にするために、この２つの
寒天トレイ上のコロニーを、標準的なベルベットレプリカ法を用いて、所与の元
のトレイと同じそれぞれの選択培地を含む新しい寒天トレイ上にレプリカ接種し
た。このレプリカ法は単に、増殖するコロニーの一番上から細胞を移して、それ
により休眠細胞の余剰を減少させることにより、酵母ツーハイブリッド系中の偽
陽性クローンの数を減少させるものであった。これらのレプリカ寒天トレイを、
30℃にて４〜７日間インキュベートして、該酵母細胞を増殖させた。
【０１８９】 液体相互作用接合を行うために、得られたMat aおよびMatαコロニーを、液体
最小培地20mlで洗浄することにより両方のレプリカトレイから別々に収集した。
これらの酵母クローンの２つの混合物を慎重に再懸濁し、ペレットとし、滅菌蒸
留水で洗浄してから、YPD（100ml）中でインキュベートして両混合物中の細胞が
接合コンピテントであることを確実にした。接合コンピテント細胞のこの２つの
集団を、容量10リットルの平底フラスコに入れたYPD液体培地(500ml)中で組み合
わせ、非常に穏やかに振とう（<60rpm）しながら30℃にて一晩インキュベートし
て、相互作用接合を促した。得られた二倍体細胞の混合物を、3000rpmにて５分 間穏やかに遠心分離することによりペレット化し、50mlの滅菌蒸留水で２回洗浄
し、最後にこの得られた細胞県濁液10mlを、ロイシン、トリプトファン、アデニ
ン、ヒスチジンおよびウラシルを含まない最小培地（SD-leu-trp-ade-his-ura）
300mlを入れた５つの24×24cm寒天トレイの各々に接種した。これらの寒天トレ イには、寒天-高圧滅菌器およびポンプ（Integra、スイス国）を用いて注ぎ、各
トレイ毎の寒天の色および深さのばらつきを最小にした。接種後、30℃にて４〜
７日間該トレイをインキュベートすることにより、これらのコロニーを増殖させ
た。
【０１９０】 インキュベーション後、相互作用融合タンパク質を発現するこの得られた二倍
体酵母細胞を、第３．１節に記載したように本発明者らが改変したピッキングシ
ステムを用いて自動的にピッキングした。ただし、ピッキングしたクローンは、
液体選択培地SD-leu-trp-ade/7%グリセロールを含むマイクロタイタープレート の中に接種した。該マイクロタイタープレート中の二倍体酵母細胞を含む相互作
用ライブラリーを、第３．１節で記載したように30℃にてインキュベートするこ
とにより増殖させた。SD-leu-trp-ade/7%グリセロール増殖培地を含む新しいマ イクロタイタープレート中に相互作用ライブラリーのさらに２つのコピーを作製
し、全てのプレートをユニークなバーコードで別々に標識し、第３．１節に記載
したさらなる分析に必要になるまで、-70℃にて保存した。
【０１９１】 当業者であれば、本発明の第３．２節、第３．３節および第３．４節に開示さ
れた方法に従って、二倍体酵母細胞のこれらのマイクロタイタープレートから、
このような相互作用ライブラリーのより高密度の規則的なグリッドパターンが簡
単に作製できることは明らかであろう。二倍体酵母細胞のより高密度の規則的な
グリッドパターンの作製は、最初の方の節に記載した手順を用いて行うことがで
きる。これらのアレイは、レポーター遺伝子活性のアッセイ、またはハイブリダ
イゼーション用の核酸アレイの生成に使用することができる。当業者が認める選
択培地の改変が必要な場合がある。
【０１９２】実施例１０： 改良されたツーハイブリッド系の原核生物ツーハイブリッド系へ の適用 10.1 株、リードアウト系およびベクター placOR2-62プロモーターの制御下でsacB対抗選択マーカーを担持し、また第２
placOR2-62プロモーターの制御下でテトラサイクリン選択遺伝子を担持する、２
つの大腸菌株KS1-OR2HF+およびKS1-OR2HF-を作製した。両株とも、アラビノース
オペロンのノックアウトにより大腸菌染色体中に安定に挿入されたsacB対抗選択
レポーター遺伝子を有し、アラビノースに制御された誘導可能プロモーターが利
用できるようになっている。該選択Tet.レポーター遺伝子は、ラクトースオペロ
ンのノックアウトにより該染色体中に安定に挿入されており、これによってlacY
対抗選択マーカーも利用可能になっている。稔性を供与するF'プラスミドをKS1-
OR2HF-中に形質転換することにより、KS1-OR2HF+株を作製した。sacBレポーター
遺伝子構築物の部位指定ノックアウトおよびKS1-ORTet株のアラビノースオペロ ン中への挿入により、KS1-OR2HF-を作製した。これは、プラスミドpKO3-araOrsa
cBの形質転換およびLinkらの方法（1997）を用いた安定な挿入のための選択によ
り行った。pKO3-araOrsacBは、Stu Iで消化したpKO3-ARA中に1.4KbのOrsacB断片
を平滑末端化ライゲーションすることにより、大腸菌アラビノースオペロンの2.
5Kb bpの3'端および1.0Kbの5'端によりそれぞれフランキングされたOrsacB断片 の挿入物を生成することにより、調製した。pKO3-ARAは、テイル化プライマー（
tailed primer）を用いて、大腸菌のゲノムDNAをPCR増幅し、Sal Iで消化し、標
準的な方法でpKO3のSal I部位にクローニングすることにより作製された完全な アラビノース大腸菌オペロンを担持する。placOR2-62プロモーターのPCR断片とs
acB遺伝子のPCR断片とを連結することにより、OrsacB断片を作製した。該placOR 2-62プロモーターおよびsacBのPCR断片を、標準法およびアンカープライマーを 用いて増幅し、これにより２つの連続的な断片の間に相補的な突出部を生じ、次
にこれらの断片がアニーリングされてプラスミドKJ306-31およびpKO3からキメラ
配列を生成した（例えばCurrent Protocols in Molecular Biology, Eds. Ausub
el et al., John Wiley & Sons: 1992）。プラスミドKJ306-31により担持された
lacプロモーター誘導体placOR2-62は、プラスミドKJ306をHinc IIで切断し、31b
pリンカー配列を挿入することにより、調製した（Doveら、1997）。KS1-ORTet株
は、部位指定ノックアウト、およびplacOR2-62プロモーターの制御下におけるpK
O3系を使用したゲノムノックアウトによるKS1F-株のラクトースオペロンへのテ トラサイクリンレポーター遺伝子の挿入により、作製した。このテトラサイクリ
ン遺伝子は、プラスミドpACYC184のPCRにより得た。キメラテトラサイクリンレ ポーター遺伝子のラクトースオペロンへのノックアウト挿入を可能とするために
適当なpKO3構築物を当業者が作製できるように、上記ノックアウト挿入法の改変
がなされた。大腸菌株KS1F-は、KS1(Doveら）から標準的なプラスミド除去法を 用いてF'プラスミドを除去することにより、構築した。
【０１９３】 ２つのベクターpBAD18-αRNAPおよびpBAD30-cIを構築して、本発明の方法を可
能にするための更なる遺伝的特徴を提供した（図２２）。これらのベクターは、
アラビノースオペロンからのプロモーターを用いたクローニングされた遺伝子の
正確な誘発（tight inducive）制御発現を提供するpBADシリーズのベクターに基
づき（Guzman et al., 1995 J. Bact. 177:4141-4130）、両用性（compatible）
複製起点の特徴により、同じ大腸菌細胞の中で保持されることができる。該プラ
スミドpBAD18-αRNAPは、アラビノースプロモーターの制御下において、RNAポリ
メラーゼのαサブユニットのαアミノ末端ドメイン（NTD）とそのマルチクロー ニング部位にクローニングされたDNA断片との間の融合タンパク質を発現する。 カナマイシン感受性細胞中のこのプラスミドの存在は、カナマイシンを補充した
増殖培地に接種することにより選択することができ、あるいはその不在は、スト
レプトマイシンを補充した培地上に接種することにより対抗選択rpsL対立遺伝子
により、選択することができる（Murphyら、1995）。プラスミドpBAD30-cIは、 アラビノースプロモーターの制御下において、λcIタンパク質とそのマルチクロ
ーニング部位にクローニングされたDNA断片との融合タンパク質を発現する。ア ンプリシリン(amplicllin)感受性細胞中のこのプラスミドの存在は、アンプリシ
リンを補充した増殖培地に接種することにより選択することができ、あるいはそ
の不在は、2-ニトロフェニル-β-D-チオガラクトシダーゼ（tONPG）（Murphyら 、1995）を補充した培地に接種することにより対抗選択lacY遺伝子により、選択
することができる。さらに、288bpのoriT配列により、pBAD30-cIプラスミドおよ
びその誘導体の、F'稔性因子を含む大腸菌細胞から稔性因子を含まないF-株への
一定方向の遺伝的変化が可能となる。
【０１９４】 RNAポリメラーゼのαサブユニットのαアミノ末端ドメイン（NTD）をコードす
る0.7KbのDNA断片（α-NTD）（1〜248番残基）を、Eco RIで消化したpBAD18-CS 中にクローニングすることにより、プラスミドpBAD-αRNAPを構築した。0.7Kbの
αNTD断片を、プラスミドpHTf1αからPCRにより単離した（Tang et al., 1994,
Genes Dev 8: 3058-3067）。このプラスミドpBAD18-CSは、対抗選択および選択 マーカーのポリシストロン性転写を可能とするために、カナマイシン遺伝子の転
写終結シグナルの前に、rpsL対立遺伝子の400bpのコード領域および翻訳開始部 位をPCRクローニングすることにより支援された、pBAD18Kanへの部位指定挿入に
より得た（Guzman et al., 1995）。このrpsL対立遺伝子は、プラスミドpNO1523
のPCR増幅により得た（Murphy et al. 1995）。
【０１９５】 λcIタンパク質をコードする730bpのDNA断片をEco RI消化したpBAD30-TCS中に
クローニングすることにより、プラスミドpBAD30-cIを構築した。λcIタンパク 質をコードするこの730bp断片は、プラスミドpACλcIからPCRにより単離した（D
oveら、1997）。このプラスミドpBAD30-TCSは、対抗選択および選択マーカーの ポリシストロン性転写を可能とするために、アンピシリン遺伝子の転写終結シグ
ナルの前へ、lacY遺伝子の1.3Kbのコード領域および翻訳開始部位をPCRクローニ
ングすることにより支援された、pBAD30-Tへの部位指定挿入により得た。lacY遺
伝子は、プラスミドpCM10のPCR増幅により得た（Murphyら、1995）。プラスミド
pBAD30-Tは、F'プラスミドのPCRにより得た288bp oriT配列を、pBAD30のM13遺伝
子間領域とcat'遺伝子座との間に部位指定挿入することにより、得た（Guzmanら
、 1995）。
【０１９６】 10.2 大規模な自動化された原核生物ツーハイブリッド系を用いた相互作用タン パク質の検出および同定 融合タンパク質を発現する大腸菌細胞のライブラリーの作製 第６．１節に記載したStrongylocentrotus purpuratusの増幅されたcDNAライ ブラリーを含むpSport1プラスミド抽出物を使用した。つぎに、標準法を用いて 、プラスミドDNAからHindIII/Sal1消化およびサイズ選択（1〜1.5Kb）アガロー スゲル精製により約1μgのライブラリー挿入体を単離した。
【０１９７】 この２つのプラスミドpBAD18-αRNAPおよびpBAD30-cIは、HindIII/Sal1による
消化により調製した。上記のように単離した挿入混合物を２つの等しい画分に分
け、300ng[DB4]を、この２つの調製したプラスミドの各々50ngに連結した。連結
後、pBAD18-αRNAP反応物をコンピテントKS1-OR2HF-大腸菌細胞中に形質転換し 、pBAD30-cIをコンピテントKS1-OR2HF+大腸菌細胞中に形質転換した。
【０１９８】 偽陽性クローンに対する遺伝子的前選択および、融合タンパク質を発現する大 腸菌細胞の規則的なグリッドパターンの自動作製 ２つの形質転換混合物を、選択培地を含む大きな24×24cm寒天トレイ（Geneti
x、イギリス国）に接種した。pBAD18-αRNAP融合ライブラリーを含むF-細胞を、
カナマイシン（50μg/ml）、アラビノース（0.2% w/v）およびスクロース（5% w
/v）を補充したLB選択培地に接種した。pBAD30-cI融合ライブラリーを含むF+細 胞を、アンプリシリン（100μg/ml）、アラビノース（0.2%）およびスクロース （5%）を補充したLB選択培地に接種した。寒天トレイには、寒天-高圧滅菌器お よびポンプ（Integra、スイス国）を用いて注ぎ、各トレイ毎の寒天の色および 深さのばらつきを最小にした。接種後、37℃にて18〜24時間該トレイをインキュ
ベートすることにより、これらのコロニーを増殖させた。該大腸菌細胞はアラビ
ノースプロモーターの制御下にて融合タンパク質を発現し、sacBレポーター遺伝
子を自己活性化することができる単一の融合タンパク質を発現するこれらの細胞
は、増殖することができなかった。何故なら、sacB遺伝子の発現は、高濃度で該
増殖培地中に補充されたスクロースに感受性を提供するからである。
【０１９９】 Lehrachら（1997）に記載されたような視覚制御ロボットシステムを用いたDNA
分析のための大腸菌クローンの自動ピッキングは、当分野において周知である。
このようなシステムもまた、相互作用するもしくは潜在的に相互作用する融合タ
ンパク質を発現する大腸菌細胞の分析に適している。従って、実験室用ピッキン
グロボットを使用して、選択寒天トレイから個々の大腸菌コロニーを、滅菌液体
培地の入った滅菌384ウェルマイクロタイタープレート（Genetix、イギリス国）
の個々のウェルに自動的に取り出した。pBAD18-αRNAP融合ライブラリーを発現 する細胞を、カナマイシン（50μg/ml）および10%(v/v)グリセロールを補充した
液体LB選択培地（LB+Kan/10%Gly）に接種し、pBAD30-cI融合ライブラリーを発現
する細胞を、アンプリシリン（100μg/ml）および10%(v/v)グリセロールを補充 したLB選択培地（LB+Amp/10%Gly）に接種した。得られたマイクロタイタープレ ートを37℃にて18〜24時間インキュベートし、該マイクロタイタープレート中の
大腸菌株の増殖後、各プレートを特定の番号およびバーコードで標識した。これ
らのプレートも、滅菌384ピン-プラスチックレプリケーター（Genetix、イギリ ス国）を用いて、各ウェルから少量の細胞材料を予め標識し、該大腸菌株に適す
るように10％グリセロールを含む液体選択培地で予め満たした384ウェルマイク ロタイタープレート中に移し、さらに２つのコピーをレプリカとして作製した。
レプリカプレートを37℃にて18〜24時間インキュベートしたあと標識し、融合タ
ンパク質を発現する大腸菌細胞のライブラリーの最初にピッキングしたマイクロ
タイタープレートと共に-70℃にて冷凍保存した。
【０２００】 このように、我々は、ロボット自動ピッキングシステムを用いて融合タンパク
質を発現する大腸菌細胞の規則的なグリッドパターンを作製した。384ウェルマ イクロタイタープレートのウェルは4.5mmごとに縦横16×24列に並べられる。従 って、各384ウェルマイクロタイタープレートについて、我々は、１平方センチ メートルあたりクローン４個を超える密度で規則的なグリッドパターンを自動的
に作製した。本発明の第3.2節、第3.3節および第3.4節に開示された方法に従っ て、大腸菌細胞のこれらのマイクロタイタープレートからこのような相互作用ラ
イブラリーのより高密度の規則的なグリッドパターンが当業者でによって簡単に
作製できることは明らかであろう。例えば、1536ウェルマイクロタイタープレー
トのウェルにクローンをロボットでピペッティングすることにより、１平方セン
チメートル当たり19クローンを超える密度が得られる。
【０２０１】 偽陽性クローンに対する視覚的識別および融合タンパク質を発現する大腸菌細 胞の規則的なグリッドパターンの自動作製 リードアウト系を自己活性化する単一の融合タンパク質を発現する細胞に対す
る視覚的識別を、原核生物２ハイブリッド系に適用することができることを示す
ために、第10.2.1節に記載された融合タンパク質のライブラリーを使用した。こ
の２つの形質転換体混合物を選択培地を入れた大きな24×24cm寒天トレイ（Gene
tix、イギリス国）に接種した。pBAD18-αRNAP融合ライブラリーを含むF-細胞を
、カナマイシン（50μg/ml）、アラビノース（0.2%）およびX-Gal(2μg/ml)を補
充したLB選択培地（LB+Kan/10%Gly）に接種した。pBAD30-cI融合ライブラリーを
含むF+細胞を、アンプリシリン（100μg/ml）、アラビノース（0.2％）およびX-
Gal(2μg/ml)を補充したLB選択培地に接種した。該寒天トレイには、寒天-高圧 滅菌器およびポンプ（Integra、スイス国）を用いて注ぎ、各トレイ毎の寒天の 色および深さのばらつきを最小にした。接種後、37℃にて18〜24時間該トレイを
インキュベートすることによりこれらのコロニーを増殖させ、コロニーの青色を
発色させた。該大腸菌細胞はアラビノースプロモーターの制御下にて融合タンパ
ク質を発現し、lacZレポーター遺伝子を自己活性化することができる融合タンパ
ク質を発現するこれらの細胞は、当分野で周知のように、X-Gal基質の酵素反応 により青に変化した。
【０２０２】 自動ピッキングシステムを用いてリードアウト系を活性化することができない
単一の融合タンパク質を発現する白い大腸菌細胞は、青色に変化した偽陽性大腸
菌細胞から自動的に視覚的に識別され、白い大腸菌細胞のみを規則的なグリッド
パターンに並べた。標準的な実験室用ピッキングロボット（Lehrachら、1997） を使用したが、白い大腸菌コロニーと青い大腸菌コロニーとを高い依頼性で見分
けるために、第3.1節に記載したしたような青い酵母コロニーからの白いコロニ ーの信頼性の高い選別に関する改良も使用した。上記のように調製した２セット
の寒天トレイから白い大腸菌コロニーを自動的に取り出し、第10.2節に記載した
ように384ウェルマイクロタイタープレート中の適切な選択培地に接種した。当 業者であれば、これらのクローンのより高密度の規則的なグリッドパターンを簡
単に形成することができることが分かるであろう。
【０２０３】 大腸菌細胞中において遺伝子エレメントを組み合わせるための自動相互作用接 合 第9.1節で酵母細胞について記載したような固相支持体上での自動相互作用接 合は、本発明に開示された遺伝子的事前選択または視覚的識別の方法により選択
された異なる接合型の大腸菌細胞にも等しく適していることは、当業者には明ら
かであろう。このような場合、選択培地に適切な改変を行うことが必要となる。
しかし、当業者であれば、本明細書中の開示に従って選択培地に対する前記改変
を認識および実施することが可能であろう。
【０２０４】 液体培地に基づく相互作用接合の自動化された方法を示すために、融合タンパ
ク質を発現するクローンの２つのライブラリーを第10.1節に記載したように調製
した。pBAD18-αRNAP融合ライブラリーを含むF-細胞を、カナマイシン（50μg/m
l）、アラビノース（0.2%）およびスクロース（5%）を補充したLB選択培地に接 種した。pBAD30-cI融合ライブラリーを含むF+細胞を、アンピシリン（100μg/ml
）、アラビノース（0.2%）およびスクロース（5%）を補充したLB選択培地に接種
した。
【０２０５】 液体相互作用接合を行うために、得られたF-およびF+コロニーを、寒天トレイ
から液体LB培地20mlで洗浄することにより別々に収集した。これら２つの大腸菌
クローンの混合物を慎重に再懸濁し、ペレットとし、LBで洗浄した。該２つの細
胞集団をLB液体培地500ml中で合わせ、37℃にて６時間穏やかに振とうしながら インキュベートして、相互作用接合を促した。得られた大腸菌細胞の混合物を、
3000rpmにて５分間穏やかに遠心分離することによりペレット化し、50mlのLB液 体培地で２回洗浄し、最後に、得られた細胞懸濁液10mlを、アンピシリン（100 μg/ml）、カナマイシン（50μg/ml）、アラビノース（0.2％）およびテトラサ イクリン（35μg/ml）を補充した固体LB選択培地（LA+Amp+Kan+Tet+ara）300ml を含む５つの24×24cm寒天トレイの各々に載せた。これらの寒天トレイには、寒
天-高圧滅菌器およびポンプ（Integra、スイス国）を用いて注ぎ、各トレイ毎の
寒天の色および深さのばらつきを最小にした。接種後、37℃にて18〜24時間該ト
レイをインキュベートすることにより、これらのコロニーを増殖させた。
【０２０６】 インキュベーション後、得られた相互作用融合タンパク質を発現する大腸菌細
胞を選択寒天の表面で増殖させ、第10.2節に記載したように実験室用ピッキング
システムを用いて自動的に取り出した。ただし、取り出したクローンは、アンピ
シリン（100μg/ml）、カナマイシン（50μg/ml）および10％（v/v）グリセロー
ルを補充した液体LB培地（LB+Amp+Kan/10%Gly）を入れたマイクロタイタープレ ートに接種した。該マイクロタイタープレート中に含まれる大腸菌細胞を含む相
互作用ライブラリーを、37℃にて18〜24時間インキュベートすることにより増殖
させた。相互作用ライブラリーのさらに２つのコピーを、LB+Amp+Kan/10%Glyc増
殖培地を入れた新しいマイクロタイタープレート中に作製し、全てのプレートを
特定のバーコードで別々に標識し、上記のようにさらなる分析に必要になるまで
、-70℃にて保存した。当業者であれば、これらのクローンのより高密度の規則 的なグリッドパターンが簡単に作製できることは明らかであろう。
【０２０７】 オートメーションを用いた平面キャリアー上での相互作用ライブラリーからク ローンの規則的グリッドパターンの作製 Lehrachら（1997）に記載されたような高効率スポッティングロボットを用い て、上記384ウェルマイクロタイタープレート中に含まれる画定された相互作用 ライブラリーから大腸菌クローンの高密度の規則的なグリッドパターンを有する
多孔性平面キャリアーを構築した。予め画定された複製スポッティングパターン
およびそのマイクロタイタープレートのバーコードを使用して、該ロボットは該
高密度グリッドパターン中の個々のクローンの位置を記録した。個々に番号を付
けた膜シート（サイズ222×222mm、Hybond N+, Amershm UK）をLB培地に予め漬 けておき、LB培地中に予め漬けておいた3MMフィルター紙（Whatmann, UK）のシ ート上に載せ、該ロボットの台に置いた。ロボットに取り付けられた384ピン-ス
ポッティングツールを用いて、該相互作用ライブラリーを、該膜の上に自動的に
レプリカコピーとして並べた。相互作用ライブラリーの第１コピーからのマイク
ロタイタープレートを、10枚のナイロン膜上の中央のインクガイドスポットの周
りに「5×5複製」パターンでレプリカ・スポッティングした。これは１平方セン
チメートルあたり100スポットを超える密度でスポッティングした27,000を超え るクローンの位置に相当する。ロボットは、作製されたスポットパターンおよび
各マイクロタイタープレートから自動的に読み出したバーコードが記録されたデ
ータファイルを作製した。
【０２０８】 各膜を、24×24cmの寒天トレイ中の約300mlの固体寒天培地上に慎重に載せた 。0.2％アラビノースを含むLB+Amp+Kan+Tet寒天に６つの膜を移し、残った膜を ２つずつ、カナマイシン（50μg/ml）、アラビノース（0.2％）およびtONPG（1m
M）を補充したLB寒天（LB+kan+ara+tONPG）、あるいはアンプリシリン（100μg/
ml）、アラビノース（0.2％）およびストレプトマイシン（対抗選択に適した濃 度）を補充したLB寒天（LB+Amp+ara+Sm）に移した。該大腸菌コロニーを、37℃ にて18〜24時間インキュベートすることにより、該膜の表面上で増殖させた。
【０２０９】 規則的なグリッドパターンにおけるリードアウト系の検出 Breeden & Nasmythの方法(1985)を用いて、該選択培地の各々から得た２つの 膜を処理して、βガラクトシダーゼ活性を検出し、第4.1節に記載したようにデ ジタル画像をキャプチャーしてコンピュータに保存した。第4.1節に記載した画 像解析およびコンピュータシステムを使用して、クローンを種々の選択培地上で
増殖させたときのβガラクトシダーゼのリードアウト系の活性化状態を考慮して
、陽性大腸菌クローンを同定した。陽性クローンは、選択培地LB+Amp+Kan+Tet+a
ra上で増殖させたあとのに青に変わったが、対抗選択培地LB+Kan+ara+tONPGまた
はLB+Amp+ara+Smの何れかで増殖したときは青に変わらなかったクローンとして 同定された。
【０２１０】 相互作用の個々のメンバーの同定 上記コンピュータシステムにより測定された相互作用融合タンパク質を発現し
た陽性大腸菌クローン（15F09として同定）を、相互作用ライブラリーの冷凍保 存コピーから回収した。相互作用を含んでいる両メンバーを、プラスミド特異的
プライマーを用いて大腸菌培養物から直接、pBAD18-αRNAPおよびpBAD30-cIプラ
スミドが保有する挿入物の特異的PCR増幅により回収した。相互作用の両方のメ ンバーを標準法により配列決定し、その情報を実施例７に記載したようにデータ
ベースに入力した。
【０２１１】 第4.1節に記載したように、相互作用ライブラリーおよび相互作用ライブラリ ーを含むメンバーを表わすDNAの高密度アレイは、種々の方法により固相支持体 に移すことにより作製することができる。相互作用融合タンパク質をコードする
プラスミドを担持する大腸菌クローンを同定するためのDNAハイブリダイゼーシ ョンの適用性を示すために、LB+Amp+Kan+Tet+ara増殖培地から取り出した１枚の
膜を処理し、Hoheiselらの方法（1991）に従って相互作用ライブラリーを含む大
腸菌細胞が保有するDNAを固定した。Feinberg & Vogelsteinの方法（1983）によ
りクローン15F09のpBAD30-cIプラスミドが保有する挿入体を放射能標識してDNA アレイへのハイブリダイゼーションプローブとして使用し、陽性シグナルを第4.
1節に記載したように同定した。クローン(22C11)が該プローブにハイブリダイズ
すると同定され、第4.1節に記載されたデータベースへの照会により陽性クロー ンであることが示された。このように、タンパク質-タンパク質相互作用経路に おけるさらなるステップは、ハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション
陽性クローンのレポーター遺伝子活性化の考慮、およびこれらの相互作用を含む
メンバーをコードするプラスミドの回収により、同定することができる。該プラ
スミドの回収により、該メンバーを同定するためのDNA配列決定、またはタンパ ク質-タンパク質相互作用経路におけるさらなるステップの同定のための反復ハ イブリダイゼーションなどのさらなる調査が可能となり、したがって、第6.6節 に記載したようなタンパク質-タンパク質相互作用ネットワークを開発すること ができる。
【０２１２】実施例11 改良型ツーハイブリッドシステムの哺乳動物ツーハイブリッドへの応 用 11.1 株、リードアウト系およびベクター ヒト胚性腎繊維芽細胞（human embryonic kidney fibroblast）から誘導した 細胞系HEK-293（または単に293細胞）は、トランスフェクション中にDNAに対す る感受性が高いため、哺乳動物2H研究に特に適している（Graham, F.L.およびVa
n der Eb, A.J. (1973), Virol. 54: 536-539；Graham, F.L., Smiley, J., Rus
sel, W.C.およびNairn, R. (1977), J. Gen. Virol. 36:59-72）。該細胞系はAT
CCから入手可能である。
【０２１３】 pG5E1bEGFPneo、pG5E1bEGFPhygまたはpG5E1bEGFPpurと名付けられた哺乳動物 リードアウト系を保有するプラスミドを使った。これらのプラスミドは、増強し
たグリーン蛍光タンパク質（EGFP; Yang, T.T., Cheng, L.およびKain, S.R. (1
996), Nucl. Acids Res. 24 (22):4592-4593）をコードする配列の直ぐ上流に位
置する、アデノウイルスElb遺伝子のTATAエレメントおよびGAL4応答エレメントU
ASG（5' CGGAGTACTGTCC TGCG 3'）（Sadowski, I., Ma, J., Treizenberg, S.お
よびPtashne, M. (1988), Nature 335: 559-560）の５つのタンデムコピーを含 有する。これらのレポータープラスミドは、G5E1bCATのCATをコードする配列（D
ang, C.V., Barrett, J., Villa-Garcia, M., Resar, L.M.S., Kato, G.J.およ びFearon, E.R. (1991), Mol. Cell. Biol. 11: 954-962）を、EGFPをコードす る配列により置換し、そして、ネオマイシン、ハイグロマイシンまたはピューロ
マイシン耐性マーカー遺伝子（neor、hygrまたはpurr）のいずれかを標準サブク
ローニング手法を使って導入することにより作製する。
【０２１４】 標準のサブクローニング手法を使い、neorまたはhygrマーカー遺伝子のいずれ
かの挿入によって、pM1、2、3から誘導されるプラスミドpMneo1、2、3またはpMh
yg1、2、3（Sadowski, I., Bell, B., Broad, P.およびHollis, M. (1992), Gen
e 118:137-141）は、酵母Gal4タンパク質のDNA結合ドメインを含有する融合タン
パク質の哺乳動物発現のために設計された、pSG424プラスミドから誘導される改
良型Gal4p融合ベクターの系列（1、2、3は３つの可能なリーディングフレームに
対応する）である（Sadowski, I.およびPtashne, M. (1989), Nucl. Acids Res.
17:7539）。このベクターは、Gal4pアミノ酸1-147をコードする配列の後に続く
ポリリンカーを含有する。したがって、Gal4p融合タンパク質をコードするハイ ブリッドリーディングフレームを、cDNA配列をpSG424/pMのポリリンカー領域中 に挿入することにより、作製することができる。ハイブリッドリーディングフレ
ームの転写産物は、SV40初期プロモーターから開始され、それらのプロセシング
はSV40ポリアデニル化シグナルにより促進される。あるいは、ハイブリッドリー
ディングフレームを、pLXSNまたは他の同様なレトロウイルスベクター中にサブ クローニングして、パッケージング細胞系で補助する標的細胞の感染を行わせる
。
【０２１５】 プラスミドpVP-NconeoおよびpVP-Ncohygは、pVP-Ncoベクターから、標準のサ ブクローニング手法を使い、neorまたはhygrマーカー遺伝子のいずれかを挿入し
て導入する（Tsan, J., Wang, Z., Jin, Y., Hwang, L., Bash, R.O., Baer, R.
, The Yeast Two-Hybrid System（酵母ツーハイブリッドシステム）, 第1版. Ba
rtel, P.L., Fileds, S. 編、New York: Oxford University Press (1997): 217
-232）。次に、pVP-Ncoは、単純ヘルペスウイルスタンパク質VP16-融合タンパク
質の哺乳動物細胞内での発現のために構築されたpNLVP16プラスミドの改良版で ある（Dang, C.V., Barrett, J., Villa-Garcia, M., Resar, L.M.S., Kato, G.
J.およびFearon, E.R. (1991), Mol. Cell. Biol. 11: 954-962）。ポリリンカ ー配列は、Gal4pの11個のアミノ末端残基（MKLLSSIEQAC）、SV40ラージT抗原か らの核局在化シグナル（PKKKRKVD）、およびVP16タンパク質の酸性トランス活性
化ドメイン（アミノ酸411-456）を含む人工リーディングフレームの後に続く。 あるいは、Gal4（1-147）およびcDNAライブラリーの個々の配列を含むハイブリ ッドリーディングフレームを、pLXSNまたは任意の他の同様なレトロウイルスベ クターにサブクローニングして、パッケージング細胞系で補助する標的細胞の感
染を行わせる。
【０２１６】 11.2 相互作用タンパク質の検出および同定 pG5E1bEGFPneo-、pG5E1bEGFPhygまたはpG5E1bEGFPpurリードアウト系を安定し
て含有する複数のモノクローナル293細胞系を、リン酸カルシウムトランスフェ クションの方法（Chen, C.およびOkayama, H.(1987), Mol. Cell. Biol. 7:2745
-2752）、リポフェクタミントランスフェクションまたは任意の他の通常のトラ ンスフェクション方法により作製し、続いて、G418、ハイグロマイシンB（HygB ）またはピューロマイシン含有培地中でそれぞれ選択する。続いて、どの特定の
クローンが、本発明の方法に最も適当であるかを試験する（リードアウト系コピ
ー数および宿主染色体中への組み込み部位が発現レベルおよびレポーター遺伝子
の誘導能に影響を与えうる）。
【０２１７】 選択した293-G5E1bEGFPneo、293-G5E1bEGFPhygまたは293-G5E1bEGFPpurレポー
ター細胞系を「改変型宿主細胞株」として使い、本発明の方法を実施する（相互
作用タンパク質の検出および同定）。
【０２１８】 ２つのベクター系列（pMneoまたはpMhygおよびpVP-NconeoまたはpVP-Ncohyg）
の３つのリーディングフレーム全てを表す２つのプールを、Not 1/Sca 1で消化 し、ベクターpMneo / pMhyg 1、2、3およびpVP-Nconeo / pVP-Ncohyg 1、2、3の
各1μgをそれぞれプールして調製した。第6.1節に記載したように単離したcDNA インサート混合物の300ngを２つの等しい画分に分割し、調製した各ベクター系 列のプールの50ngとライゲートさせた。ライゲーションの後、各反応物を別々に
エレクトロコンピテント大腸菌（E.coli）細胞中に形質転換し、各ライブラリー
との組換えクローンを５枚の24 x 24cmプレート上でアンピシリン選択した。上 に記載したように、プレートの細胞の洗浄および続いて洗浄混合物のQiaPrepプ ラスミド抽出により、大腸菌（E.coli）形質転換体から、ほぼ500μgのpVP-Ncon
eo／pVP-Ncohygおよび500μgのpMneo /pMhygのライブラリーを抽出した。10cmプ
レートの293細胞をトランスフェクトするために各ベクターの16μgを使った。
【０２１９】 11.3 視覚的識別による偽陽性に対する前選択 Gal4-DNA結合ドメインに融合したcDNAライブラリーを含有するpMneo 1、2、3 またはpMhyg 1、2、3プラスミドを、選択した293レポーター細胞系中にトランス
フェクトした。レトロウイルスを用いる感染については、定めたパッケージング
細胞系をそれぞれのレトロウイルスベクターでトランスフェクトし、その後、こ
の培養からのウイルス含有上清を使ってレポーター細胞系を感染させた（標準プ
ロトコルによる；例えば、Redemann, N., Holzmann, v.Ruden, T., Wagner, E.F
., Schlessinger, J. およびUllrich, A. (1992), Mol. Cell. Biol. 12:491-49
8）。トランスフェクションおよび感染プロトコルは、平均して細胞当たりただ １つのプラスミドを導入し、感染中、トランスフェクションのプラスミド濃度ま
たはウイルス力価を調節することによって最適化することができる。トランスフ
ェクトまたは感染したレポーター細胞をうまく選択するために、抗生物質G418ま
たはHygBを用いる。
【０２２０】 適当な（相互作用）トランス活性化ドメイン-融合タンパク質が同時発現され ることを要求する代わりに、単にDNA結合ドメイン-融合タンパク質を発現する結
果として、リードアウト系活性化を提示する（この場合、融合タンパク質は「自
己アクチベーター」と呼ばれるであろう）細胞は、この段階で、除去する必要が
ある。したがって、得られた安定にトランスフェクト／感染したレポーター細胞
のポリクローナルプールは、その後、自己活性化融合タンパク質を発現する細胞
を視覚的に識別するリードアウト系を使い、前選択スクリーニングにかけられる
。EGFPに基づくリードアウト系では、自己アクチベーターを発現する細胞は、EG
FPの発現について、すなわち適当な励起波長（488nm）を用いる刺激時にそれぞ れの細胞のグリーン蛍光（507nm）を放つ能力について、スクリーニングをして 同定することができる（Yang, T.T., Cheng, L.およびKain, S.R. (1996), Nucl
. Acids Res. 24 (22):4592-4593）。リードアウト系活性化のモニタリングは、
蛍光顕微鏡を使い目視によるかまたは自動化検出デバイスによって行う。GRPレ ポーター系を活性化した細胞は、蛍光活性化セルソーティングデバイス（FACS:f
luorescent assisted cell sorting device）を使って、レポーター系を活性化 しない他の細胞から視覚的に識別し、ソートした。あるいは、自己アクチベータ
ーを発現する偽陽性細胞の除去は、人手で、または吸引ポンプもしくはマイクロ
マニピュレーターの方法によるかまたはマイクロマニピュレーターもしくはレー
ザー切除デバイスを用いる検出器と連結した自動化システムによる細胞の除去／
死滅により行う。
【０２２１】 自己活性化融合タンパク質を発現する細胞を除去した後、残りのDNA結合融合 タンパク質を発現する293レポーター細胞のポリクローナルプールは、その後、 上記のように、pVP-NconeoもしくはpVP-Ncohygプラスミド、または、VP16トラン
スアクチベーター配列に融合したcDNAライブラリーを含有するそれぞれのレトロ
ウイルス誘導体を使い、第２のトランスフェクション／感染ステップにかけられ
る。うまくトランスフェクション／感染した細胞に対する抗生物質G418またはHy
gBを用いる選択は、ここでは任意である。もし選択が所望であれば、リードアウ
ト系の部分を構成する耐性マーカーが、先にトランスフェクション／感染したベ
クターのマーカー遺伝子と異なることを確かめなければならない。もし続くスク
リーニング／最終選択操作が完了するまでに数日を要すれば、選択的圧力の不在
下でのプラスミドの損失／希釈消失を防止するために、第２のトランスフェクシ
ョン／感染ベクターを選択する抗生物質の添加が必要でありうる。完全な選択は
また、同時トランスフェクトに成功しなかった（すなわちpVP-Ncoプラスミドを 受け入れなかった）細胞を排除するが、これらの細胞は相互作用スクリーニング
により同定されないであろうから（トランスフェクション／感染効率が高ければ
）大きな問題ではないであろう。該細胞が細胞溶解（および相互作用タンパク質
およびそれらの対応するcDNA配列の分子の分析）まで培養中に長く置かれるほど
、多かれ少なかれ毒性融合タンパク質をコードするcDNAを恐らく遊離するであろ
うことも注目すべきである。
【０２２２】 11.4 相互作用タンパク質を発現する細胞の自動化された同定 その後、得られた二重トランスフェクトしたレポーター細胞のポリクローナル
プールを、視覚的前選択について記載したように、相互作用タンパク質に対する
視覚的スクリーニングにかける。２つの相互作用タンパク質の発現を示すグリー
ン蛍光（「陽性」）細胞を、FACSシステムを使って自動的にソートして、細胞を
、マイクロタイタープレートのウエル中の規則的なグリッドパターンに配置する
。続いて、単一細胞PCRおよびDNA配列決定を実施して相互作用を含むメンバーを
同定する。あるいは、陽性細胞を規則的なアレイ／グリッドパターン中の培養シ
ャーレ上にまくことができる。細胞はまた、１つずつマルチウエルシャーレの小
ウエル中に置き、適当な増殖因子補給培地または調製培地を与えて、該細胞を他
の細胞から単離して生存させ増殖させることもできる。
【０２２３】 11.5 二重前選択および細胞融合 以上に記載の同時トランスフェクションプロトコルは、（二重前選択の代わり
に）単一前選択しか含まない。これは、pVP-Nco（トランス活性化ドメイン-cDNA
融合ライブラリー）プラスミドから生じる偽陽性クローンに対する前選択の可能
性を含まない。pVP-Ncoプラスミドからの偽陽性の数は、通常、pM1、2、3（DNA 結合ドメイン-cDNA融合ライブラリー）プラスミドからのものより遥かに低いが 、場合によっては、二重前選択方法を適用する必要があるだろう。
【０２２４】 その目的のためには、pM-またはpVP-Nco-cDNA融合ライブラリーの各々のメン バーを発現する２つの異なる安定細胞系のポリクローナルプールを、293レポー ター細胞系のトランスフェクション／感染により作製し、それぞれの（異なる）
抗生物質（G418およびHygB）を使うことにより、上記のように選択する。細胞系
の両方のプールを、その後、別々に、上に記載したように偽陽性クローンの前選
択および除去にかける。
【０２２５】 融合ベクターとそれらの対応する発現された融合タンパク質とを１細胞中に組
み合わせるために、細胞系の両プールの個々の細胞を、リおよびフイ他（Li, L.
-H.およびHui, S.W. (1994), Biophys. J. 67:2361-2366；Hui, S.W., Stoiche
va, N.およびZhao, Y.-L. (1996), Biophys. J. 71:1123-1130；ならびにStoich
eva, N.およびHui, S.W. (1994), Membrane Biol. 140:177-182）が記載したPEG
促進電気融合（PEG facilitated electrofusion）に関わる最新技術の細胞融合 プロトコルを使って一緒に融合する。両プールの１細胞間の融合が所望である。
この目的のために、各プールの１細胞を上記のようにマルチウエルシャーレの各
ウエル中に配置する。細胞融合後、組み合わせた細胞を、その後、視覚的選択に
かける。細胞を視覚的または自動化されたスクリーニングのために同じシャーレ
上に置くか、またはFACSにより捕集しソートする。
【０２２６】 11.6 誘導発現系を使う二重前選択および細胞融合 上記の二重前選択法の欠点は、両方のcDNA融合ライブラリー-配列に対する安 定細胞系のポリクローナルプールを確立するのに必要な長い選択プロセス中に、
毒性または非増殖効果をもつタンパク質およびそれらの対応するcDNAが失われる
ことである。毒性／非増殖性タンパク質をコードするcDNA配列の消失を防止する
ために、以下の誘導系を用いる二重前選択方法を組み合わせることができる。
【０２２７】 宿主細胞株は、テトラサイクリン（Tet）制御トランスアクチベーター（tTA）
を発現する293細胞系であり、これは、テトラサイクリンリプレッサー（TetR） のアミノ酸1-207と単純ヘルペスウイルスタンパク質VP16のC末端活性化ドメイン
（130アミノ酸）との融合体である。該細胞系は、tTAがTetの不在下でのみTetオ
ペレーター配列（tetO）制御遺伝子からの転写を活性化することができるので、
293 Tet-Offと呼ばれる。リバースtTA（(r)tTA）を安定的に発現する293Tet-On 細胞系では状況が逆になり、tetO調節遺伝子から転写を誘導するにはTetの存在 が必要である。293Tet-Offおよび293Tet-On細胞系は、G418耐性（neor）である 。これらの細胞系は、クローンテック社（Clonetech Inc.）を介して入手可能で
ある。293Tet-Offおよび293Tet-On細胞系を作製するために使われるtTAプラスミ
ドは、ゴッセンおよびブジャール他（Gossen, M.およびBujard, H. (1992), Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551；ならびにGossen M., Freundlieb, S.,
Bender, G., Mueller, G., Hillen, W.およびBujard, H. (1995), Science 268
:1766-1769）が記載している。
【０２２８】 293 Tet-Onまたは-Off細胞系は、その後、リードアウト系（11.1で記載した）
を用いてトランスフェクションし、レポーター細胞系293 Tet-On-または-Off-pG
5E1bEGFPhyg/purを、G418またはHygB中の選択を介して作製する。
【０２２９】 Gal4-DNA結合ドメインのため、およびSV40核局在化シグナル／VP16トランス活
性化ドメインのための配列（詳細および参考文献は11.1に与えられる）は、pMお
よびpVP-Ncoプラスミドから検索し、別々に、レトロウイルスベクターであるpRE
V-TRE（Clonetech Inc.）のポリリンカー中にサブクローニングして、pREV-TRE-
Gal4およびpREV-TRE-VP16を作製する。pREV-TREは、PT67のようなパッケージン グ細胞系と結合して、感染性であるが複製能力のないウイルスの産生を可能にす
るレトロウイルス拡張パッケージングシグナルΨ+、続いて、hygr遺伝子（選択 マーカー）およびポリリンカーの直ぐ5'のサイトメガロウイルス（CMV)最小プロ
モーターに融合したtetOの７コピーを含有する。Ψ+およびポリリンカー配列は 、それぞれ5'および3'LTRがフランキングする。pREV-TREは、クローンテック社 から入手可能である。cDNAライブラリーは、pREV-TREのポリリンカー中にサブク
ローニングする。以上記載したレポーター細胞系は、別々にpREV-TRE-Gal4また はpREV-TRE-VP16誘導レトロウイルス粒子を用いて感染させる。新しい安定細胞 系のポリクローナルプールは、両ケースとも、耐性選択マーカー遺伝子hygrを使
って選択する。pREV-TREプラスミドからの融合タンパク質の一過性発現は、上記
のように、二重前選択および偽陽性の除去を可能にするために、Tetの撤去（Tet
-Off）または追加（Tet-On）により誘導しなければならない。
【０２３０】 11.7 細胞融合および相互作用タンパク質を発現する細胞の選択 残りの細胞系のポリクローナルプールは、その後、上記のように、細胞融合に
かける。培地中のHygB濃度を増加させて、全融合細胞中に存在する融合タンパク
質cDNA配列ペアのどちらか１成分の損失可能性も最小化する。陽性クローン、す
なわち、相互作用タンパク質ペアを発現する細胞（上記のように）の検出につい
ては、融合タンパク質の発現をTetの追加または撤去により誘導しなければなら ない。
【０２３１】 参考文献： Allen, T.B., Walberg, M.W., Edwards, M.C., Elledge, S.J. (1995) ライブラ
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【０２３２】
【表１】 新規の酵母ツーハイブリッドベクターpBTM118a、bおよびc ならびに、pGAD428a、bおよびcの構築のためのオリゴヌクレオチドアダプター
【０２３３】
【表２】 融合タンパク質の発現のために使われたツーハイブリッドベクター
【０２３４】
【表３】 5-FOA対抗選択および自動化された相互作用交配に使われた酵母株
【０２３５】
【表４】 URA3リードアウト系を活性化する融合タンパク質の同定
【０２３６】
【表５】 lacZリードアウト系を活性化する融合タンパク質の同定 A. LexA DNA結合ドメインを含む融合タンパク質を発現するpBTM117cプラスミド
構築物を用いて形質転換したL40ccu酵母細胞を、リン酸カリウムでpH 7.0に緩衝
化しX-Galの2μg/mlを含有するトリプトアファン欠損最少培地（SD-trp/XGAL） 上にプレートした：様々な自己活性化および非自己活性化融合タンパク質に対す
るリードアウト系の状態を示す結果。 B. GAl4ad活性化ドメインを含む融合タンパク質を発現するpGAD427プラスミド 構築物を用いて形質転換したL40ccuα酵母細胞を、リン酸カリウムでpH 7.0に緩
衝化しX-Galの2μg/mlを含有するロイシン欠損最少培地（SD-leu/XGAL）上にプ レートした：様々な自己活性化および非自己活性化融合タンパク質に対するリー
ドアウト系の状態を示す結果。
【図面の簡単な説明】
【図１】 確立されかつ徹底したタンパク質-タンパク質相互作用ネットワークの応用。 全体の相互作用ライブラリーに対する相互作用を含んでなる陽性クローンのアイ
デンティティーおよびメンバーのアイデンティティーはデータベースに記憶され
ている。これらのデータは、様々な目的に、例えば、新しい生物学的相互作用も
しくは経路の存在を予測するためにまたは生物学的ネットワーク間のリンクを決
定するために、使用することができるタンパク質-タンパク質相互作用のネット ワークを確立するために使われる。さらにこの方法を用いて、今まで未知のタン
パク質の機能および局在性を、それらの相互作用パートナーを確認することによ
って予測することができる。これはまた、ネットワークの特定メンバーの発現の
変化に対する細胞の応答を予測するために使うこともできる。最後に、これらの
データを使って、治療、診断処置および疾患の治療に適した医学的に関係のある
経路内のタンパク質を同定することもできる。
【図２】 大規模なタンパク質−タンパク質相互作用スクリーニングからのデータを記憶
、管理および検索するのに適した１セットのデータ-テーブルに対するスキーム および特徴。該スキームは、リレーショナルまたはオブジェクト指向データベー
スのいずれにおいても実行することができる。各テーブル内に納められ示唆され
たフィールドまたはエレメントのテーブル-キー間の主要なリンクを示す。
【図３】 大規模タンパク質−タンパク質相互作用スクリーニング中の実験および情報の
流れを表すプロセスの流れ。図は、上記データベースからの各テーブルが、実験
ステップのどの部分で最も応用されうるのかを表す。各テーブルは、プロセスの
該部分に対する作業の流れ管理ソフトウェアが基づいている、基礎的データセッ
トを形成する。
【図４】 改良２-ハイブリッドシステムのために構築したプラスミド。 pBTM118a、bおよびcのDNA結合ドメインベクター系列ならびにpGAD428a、bおよ
びcの活性化ドメインベクター系列のプラスミドマップ。両プラスミドはSal Iお
よびNot Iに対するユニークな制限酵素切断部位を含有し、これらを使って遺伝 子断片をマルチクローニングサイトにクローニングすることができる。該プラス
ミドは、選択マーカーTRP1およびLEU2によりそれぞれ酵母細胞内に維持される。
該プラスミドの損失は、対抗選択マーカーCAN1およびCYH2によりそれぞれ選択す
ることができる。 ３つのリーディングフレームの１つに遺伝子断片の発現をあたえる、マルチク
ローニングサイト内で使われるポリリンカー。
【図５】 プラスミドpLUAが保有するURA3リードアウト系（readout system）の構造。pL
UAの重要な特徴は、lexAop-GAL1プロモーターの転写制御下にあるURA3遺伝子、 アデニン欠乏選択培地上で酵母ade2-栄養要求株が増殖することを可能にするADE
2選択マーカー、および大腸菌（E.coli）にアンピシリン耐性を与えるβ-ラクタ
マーゼ遺伝子（bla）を含む。pLUAプラスミドは、酵母中では2μ複製起点を使い
、また大腸菌（E.coli）中ではColE1複製起点を使い、自律的に複製する。
【図６】 本発明の方法の１つの実施様態のスキーム概観。本発明の方法を使うタンパク
質−タンパク質相互作用ネットワークの平行分析のために、DNA結合ドメインお よび活性化ドメイン融合タンパク質を発現するプラスミド構築物の１つのライブ
ラリーを提供する。これらのライブラリーは、様々な選択および対抗選択マーカ
ーを含有する本発明の改良された結合ドメインおよび活性化ドメインプラスミド
中にライゲートされた、特定のDNA断片または多数の未知のDNA断片からなり得る
。両ライブラリーを、酵母細胞内で形質転換または相互作用的交配（interactiv
e mating）により結合し、そして相互作用タンパク質を発現する能力のある酵母
株をヒスチジン欠乏選択培地上で選択する。選択マーカーTRP1およびLEU2は、選
択培地上で増殖した酵母株中の該プラスミドを維持するが、CAN1およびCYH2は、
各プラスミドの損失を選択する対抗選択マーカーを規定する。HIS3およびlacZは
、相互作用融合タンパク質による活性化時に発現される酵母ゲノム中の選択マー
カーを表す。本事例におけるリードアウト系は、ヒスチジン欠乏培地上の増殖と
続いてスクリーニングできるβ-ガラクトシダーゼ酵素活性との両方である。コ ロニーピッキングロボット（colony picking robot）を使って、得られた酵母コ
ロニーを384ウエルマイクロタイタープレートの個々のウエル中に拾い、得られ たプレートを30℃でインキュベートして細胞を増殖する。マイクロタイタープレ
ートに保持される相互作用ライブラリーは、場合によっては、複製し貯蔵するこ
とができる。相互作用ライブラリーを試験して、相互作用融合タンパク質を発現
する陽性クローンを検出し、本発明の方法を使ってこれらを偽陽性クローンから
識別する。スポッティングロボットを使って、細胞をレプリカメンブランに移し
、続いて、これらを、選択培地SD-leu-trp-his、SD-leu+CANおよびSD-trp+CHXの
それぞれの１つに置く。選択プレート上でインキュベートした後、メンブラン上
で増殖したクローンを、β-Galアッセイにかけ、各メンブランからのデジタル画
像は、CCDカメラで捕獲され、その後、コンピューターに記憶される。デジタル 画像処理および解析を使い、様々な選択培地で増殖したクローンのβ-Gal活性パ
ターンを考察することによって、相互作用融合タンパク質を発現するクローンを
同定することができる。相互作用物を含んでなる個々のメンブランは、その後、
PCR、配列決定、ハイブリダイゼーション、オリゴフィンガープリンティングま たは抗体反応を含む１以上の技術により同定することができる。
【図７】 本発明の方法の１つの実施様態のスキーム概観。本発明の方法を使うタンパク
質−タンパク質相互作用ネットワークの平行分析のために、DNA結合ドメインま たは活性化ドメイン融合タンパク質を発現するプラスミド構築物の２つのライブ
ラリーを提供する。これらのライブラリーは、選択マーカーTRP1およびLEU2なら
びに場合によっては対抗選択マーカーCAN1およびCYH2をそれぞれ含有する結合ド
メインおよび活性化ドメインプラスミド中にライゲートされた、特定のDNA断片 または多数の未知のDNA断片からなり得る。該ライブラリーは、URA3リードアウ ト系を含有するMatａまたはMatα酵母株中に形質転換され、続いて5-フルオロオ
ロト酸（5-FOA）を含有する選択培地に播種される。5-FOAの存在では、URA3リー
ドアウト系を自己活性化する能力の無い融合タンパク質を発現する酵母細胞のみ
が増殖するであろう。得られた非自己活性化タンパク質のみを発現する酵母株は
、その後、自動化された相互作用交配方法において、直接用い、lacZリードアウ
ト系の活性化をアッセイすることができる配列された二倍体株のアレイを作製す
ることができる。a）URA3リードアウト系を活性化する能力のない単一の融合タ ンパク質を発現する個々の酵母細胞を、改良したピッキングロボットを使い、38
4-ウエルマイクロタイタープレートのウエル中に移す。マイクロタイタープレー
ト中に保持される酵母株は、場合によっては、複製して貯蔵することができる。
該マイクロタイタープレートは、酵母株中の対応するプラスミドを維持するのに
適したアミノ酸欠乏増殖培地を含有する。続いて、レーラッハら（Lehrachら, 1
997）が記載した自動化システムを使い、自動的にMatａおよびMatα酵母株をナ イロンメンブラン上の同じ位置に移すことによって相互作用交配を行う。あるい
は、ピペッティングまたはマイクロピペッティングシステム（Schoberら, 1993 ）を使い、酵母株の個々の小容量の液体培養物を移し、その上に、少なくとも１
つの反対の交配型の酵母クローン由来の酵母細胞のローン（lawn）を噴霧または
アプライすることができる。酵母株は、単独でまたは多くのクローンのプールと
してアプライすることができる。両方法により、配列された酵母クローンのアレ
イを、一夜、30℃でインキュベートして相互交配を起こさせる。得られた二倍体
細胞を、その後、ブリーデンおよびナスミス（Breeden & Nasmyth, 1985）が記 載したβ-Galアッセイで分析する。b）5-FOAを含有する選択培地上で増殖した酵
母株をプールし、YPD液体培地内で、MatａおよびMatα株の間で相互作用交配を 行わせる。相互作用タンパク質を発現するこれらの二倍体酵母株を、ヒスチジン
およびウラシル欠乏選択培地上に播種することにより選択する。選択マーカーTR
P1およびLEU2は,選択培地上で増殖した酵母株のプラスミドを維持する。HIS3、U
RA3およびlacZは、相互作用融合タンパク質による活性化時に発現される酵母細 胞中のレポーター遺伝子を表す。本事例におけるリードアウト系は、ヒスチジン
および／またはウラシル欠乏培地上の増殖および後の時点にスクリーニングでき
るβ-ガラクトシダーゼ酵素活性である。改良したコロニーピッキングロボット を使って、二倍体酵母コロニーを、選択培地を含有する384ウエルマイクロタイ タープレートの個々のウエル中へ拾い、得られたプレートを30℃で細胞増殖させ
る。相互作用ライブラリーは、場合によっては、複製し貯蔵するとよい。スポッ
ティングロボットを使い、二倍体細胞をレプリカメンブランに移し、続いて、増
殖培地上に置く。レプリカメンブランを対抗選択培地SD-trp+CHXまたはSD-leu+C
AN上に置く。得られた二倍体酵母クローンの規則的なアレイを、ブリーデンおよ
びナスミス（Breeden & Nasmyth, 1985）の記載のようにしてβ-Gal活性につい て分析する。a）およびb）いずれの場合でも、乾燥メンブランからのデジタル画
像は、CCDカメラで捕獲し、その後、コンピューターに保存する。デジタル画像 処理および解析を使い、規定のパターンにスポットされて様々な選択培地上に置
かれたメンブランで増殖された、これらのクローンのβ-Gal活性を考察すること
により、相互作用融合タンパク質を発現するクローンを同定することができる。
相互作用物を含んでなる個々のメンバーは、その後、PCR、配列決定、ハイブリ ダイゼーション、オリゴフィンガープリントまたは抗体反応を含む、１以上の技
術により同定することができる。
【図８】 限定された相互作用ライブラリーを作製するために使われた融合タンパク質の
間の予測される相互作用。太線の箱で囲んだ融合タンパク質は、示されたように
相互作用すると考えられる。細線の矩形箱で囲んだLexA-HIP1およびGal4ad-LexA
融合タンパク質は、相互作用融合タンパク質の必要なしに、LacZリードアウト系
を活性化することが示されている。２つのタンパク質LexAおよびGAL4ad、ならび
に３つの融合タンパク質GAL4ad-HIPCT、GAL4ad-14-3-3およびLexA-MJD（いずれ も箱に入ってない）は、お互いまたはこの実施例に使われた他の融合タンパク質
と相互作用しないと考えられる。
【図９】 本発明の方法を使う、偽陽性クローンから相互作用融合タンパク質を含有する
陽性クローンの同定。プラスミド構築物のペア（陽性対照：pBTM117c-SIM1およ びpGAD427-ARNT；陰性対照：pBTM117cおよびpGAD427ならびに偽陽性対照：pBTM1
17c-HIP1およびpGAD427）をそれぞれ含有する３つの異なる酵母クローンを、手 で、異なる選択培地（SD-leu-trp、SD-leu-trp-his、SD-leu+CANおよびSD-trp+C
AN）を含有する４つの寒天プレートに移し、48時間、30℃でインキュベートした
。続いて、酵母コロニーをナイロンメンブランに移し、β-Gal活性について、ブ
リーデンおよびナスミス（Breeden & Nasmyth, 1985）の方法によりアッセイし た。
【図１０】 選択培地(a)SD-leu-trp-his、(b)SD-trp+CHXおよび(c)SD-leu+CANから得た限 定された相互作用ライブラリーを含有するレプリカナイロンメンブランから作っ
たβ-Galアッセイのデジタル画像。各ケースで、各メンブランの左側は、対照ク
ローンおよび限定された相互作用ライブラリーからのクローンを含有し、右側は
、限定された相互作用ライブラリーからのクローンのみを含有する。第１メンブ
ラン上にマークした２領域は、図11の拡大したクローンを表す。各メンブランの
全体サイズは22 x 8 cmで、1.4 mmのスポッティングピッチで6912スポット場所 を有する。
【図１１】 選択培地SD-leu-trp-his、SD-trp+CHXおよびSD-leu+CANから得られた３枚のメ
ンブランの同じ領域からとり、β-Gal活性をアッセイした相互作用ライブラリー
からのクローンの拡大図： 限定された相互作用ライブラリーを含有するメンブランの右側の領域から画像
作成したクローン。相互作用タンパク質を発現する、限定された相互作用ライブ
ラリーからのクローンを丸で囲んだが、マイクロタイタープレートのアドレス06
L22および08N24に対応する。 対象クローンおよび相互作用ライブラリーからのクローンを含有する同じメン
ブランの左側の領域から画像作成したクローン、ここで、各インクガイドスポッ
ト周りのクローンは、示されたように配置され、次のとおり対応する：00 イン
クガイドスポット；01 融合タンパク質GAL4ad-LexAを発現する偽陽性対照クロ ーン；02 融合タンパク質LexA-HIPIを発現する偽陽性対照クローン；03 相互 作用融合タンパク質LexA-SIM1およびGal4ad-ARNTを発現する陽性対照クローン；
04 限定された相互作用ライブラリーからのクローン。陽性対照クローン（スポ
ット03）を丸で囲んだ。
【図１２】 自動画像解析およびβ-ガラクトシダーゼ活性の定量により作製したデータの コンピューター照会（computer query）により同定したクローンのリストのサブ
セット。各レコードは、３つの選択培地上で増殖した所与のクローンに対するβ
-ガラクトシダーゼ活性を表す。このプログラムはデータを照会して、相互作用 ライブラリーから、ロイシン、トリプトファン、およびヒスチジン欠乏最少培地
（SD-leu-trp-his）で増殖したときにはレポーター遺伝子を活性化したが（スコ
ア＞0）、対抗選択培地のいずれでも活性化しなかった（両培地のスコアが0であ
る）全クローンを同定した。 ハイブリダイゼーションにより特性決定した２つの陽性クローン06L22および0
8N24は、コンピューターファイル内に存在する。
【図１３】 クローン06L22および08N24により保持された遺伝子断片のハイブリダイゼーシ
ョンによる特性決定。1.3kbのSTM1および1.4kbのARNT DNA断片を核酸プローブと
して使い、限定された相互作用ライブラリーからのDNAを含有する高密度スポッ トメンブランとハイブリダイゼーションさせた。これらのクローンは、ハイブリ
ダイゼーションにより、SIM1およびARNT遺伝子断片を含有すると特性決定された
。画像は、図11aに示したのと同じメンブラン領域のものである。クローン06L22
および08N24のスポット位置を丸で囲んだ。
【図１４】 二重（duplex）PCRによりクローン06L22により実施した、酵母ツーハイブリッ
ドプラスミドからのSIM1およびARNTのDNA断片の同定。プラスミドDNAをQiaPrep （Heiden）手法によりクローン06L22の液体培養物から単離し、該プラスミド内 に含まれるインサートを、プライマーペアに、プラスミドpBTM117cに対して5'-T
CG TAG ATC TTC GTC AGC AG-3'および5'-GGA ATT AGC TTG GCT GCA GC-3'を、そ
してプラスミドpGAD427に対して5'-CGA TGA TGA AGA TAC CCC AC-3'および5'-GC
A CAG TTG AAG TGA ACT TGC-3'を使い、PCRによって増幅した。レーン１はサイ ズマーカーとしてBstEIIによるλDNA消化物を含有し；レーン２はクローン06L22
から単離したプラスミドからの二重PCR反応物を含有し；レーン３および４はプ ラスミドpBTM117c-SIM1およびpGAD427-ARNTからの対照PCR増幅物をそれぞれ含有
する。
【図１５】 相互作用ライブラリーからの規則的なグリッドパターン（regular gid patter
n）中のクローンに対するリードアウト系活性化。ウニ（sea urchin）相互作用 ライブラリーの23枚の384-ウエルマイクロタイタープレートを、スポッティング
ロボットを使って、222 x 222 mm多孔質メンブラン（Hybond N+, Amersham, UK ）上でインクガイドスポットを囲む「3x3重複」規則的なグリッドパターンにス ポットした。該メンブランをSD-leu-trp-his培地中で３日間インキュベートし、
ブリーデンおよびナスミス（Breeden & Nasmyth, 1985）が記載したβ-Galアッ セイを使ってlacZ発現をアッセイし、一夜、風乾した。デジタル画像を、標準A3
コンピュータースキャナーを使って捕獲した。
【図１６】 タンパク質Aをコードする遺伝子断片（プローブA）の、相互作用ライブラリー
由来のDNAアレイへのハイブリダイゼーション。プローブに標準技術により放射 性標識を付し、相互作用ライブラリー由来のハイブリダイゼーション-陽性クロ ーンを、自動画像解析システムにより同定した。遺伝子断片を単離したクローン
5K20の位置を示した。他のハイブリダイゼーション-陽性クローンもこの遺伝子 断片を保有しており、これらのクローンから相互作用メンバーを回収することに
よって、タンパク質Aに対するタンパク質−タンパク質相互作用経路を明らかに することができた。
【図１７】 プローブAと、相互作用ライブラリーを表すDNAアレイとのハイブリダイゼーシ
ョンにより作製したハイブリダイゼーション陽性クローンの図的表現。
【図１８】 プローブB（薄塗りの箱にマークしたクローンから単離した）との続いてのハ イブリダイゼーションにより作製したハイブリダイゼーション陽性かつ相互作用
陽性クローンの図的表現。プローブAからのハイブリダイゼーション陽性クロー ンの位置も示した。両方の遺伝子断片を保有する相互作用陽性クローンは、両方
のプローブとハイブリダイズすると同定される。
【図１９】 クローン6D18（薄塗りの箱と「B/C」によりマークした）から単離したプロー ブCとのさらなるハイブリダイゼーションにより作製したハイブリダイゼーショ ンおよび相互作用陽性クローンの図的表現。プローブAおよびBに対するハイブリ
ダイゼーションシグナルも示した。相互作用陽性クローンに対する共通のハイブ
リダイゼーションシグナルおよびこれらのクローンが保有するインサートの続い
てのDNA配列決定を考察することにより、タンパク質−タンパク質相互作用を明 らかにすることができる。図はまた、これらのデータに基づいてタンパク質A、B
およびC間で明らかになった相互作用経路も示す。
【図２０】 LacZリードアウト系を活性化する能力のある単一融合タンパク質を発現する酵
母細胞の自動化された視覚的識別。プラスミドpBTM117cにクローニングした様々
な融合タンパク質を発現するL40ccu酵母クローンの定義されたライブラリーを、
リン酸カリウムでpH 7.0にバッファーしX-Galの2μg/mlを含有するトリプトアフ
ァン欠乏最少培地（SD-trp/XGAL）上に播種した。LacZレポーター遺伝子を活性 化しなかった白いコロニーは自動的に認識され赤い水平十字でマークされた。La
cZレポーター遺伝子を活性化する能力がある単一融合タンパク質の発現により青
色に変わったコロニーは、その暗い色および「孔（hole）」の存在によって自動
的に認識される。矢印はこのコロニーを示す。さらなる分析およびピッキングに
不適なコロニー（あまりに小さいかまたは付着したコロニー）は全て自動的に認
識され、青い対角線十字でマークされた。
【図２１】 相互作用融合タンパク質を発現する二倍体酵母株を同定するための、自動化さ
れた相互作用交配の結果。a）酵母株x1aおよびx2aの子孫を、ナイロンメンブラ ン上の位置１および２に、レーラッハら（Lehrachら, 1997）が記載したスポッ ティングロボットを使ってスポットした。反対の交配型の酵母株y1αおよびy2α
を、既に株x1aおよびx2aからの細胞を含有する位置１および２に、続いてスポッ
トした。二重スポットパターンの認識を助けるために、スポットした酵母クロー
ンの直ぐ右側の位置２にインクをスポットした。b）メンブランをYPD寒天プレー
トに移し、30℃で一夜インキュベートして相互作用交配を起こさせた。c）その 後、メンブラン上に増殖した二倍体酵母細胞を、β-ガラクトシダーゼ活性につ いて、ブリーデンおよびナスミス（Breeden & Nasmyth, 1985）の方法を使って 分析した。
【図２２】 原核生物ツーハイブリッドシステム内で本発明の方法にさらなる能力をもたせ
る遺伝的特徴を与えるために構築した２つのベクター。該ベクターは、アラビノ
ースオペロン由来のプロモーターを使い、クローニングした遺伝子発現の厳格な
誘導制御を与えるpBAD系列のベクターに基づき（Guzmanら, 1995 J. Bact. 177:
4141-4130）、適合し得る複製起点により同じ大腸菌（E.coli)細胞中で維持す ることができる。 プラスミドpBAD18-αRNAPは、アラビノースプロモーターの制御のもとで、RNA
ポリメラーゼのαサブユニットのαアミノ末端ドメイン（NTD）とマルチクロー ニングサイト中にクローニングされたDNA断片との間の融合タンパク質を発現す る。カナマイシン感受性細胞中のこのプラスミドの存在は、カナマイシンを補給
した増殖培地上に播種することにより、またはその不在については、対抗選択rp
sL対立遺伝子によりストレプトマイシンを補給した培地上に播種することにより
、選択することができる（Murphyら, 1995）。 プラスミドpBAD30-cIは、アラビノースプロモーターの制御のもとで、λcIタ ンパク質とマルチクローニングサイト中にクローニングされたDNA断片との間の 融合タンパク質を発現する。アンピシリン感受性細胞中のこのプラスミドの存在
は、アンピシリンを補給した増殖培地上に播種することにより、またはその不在
については、対抗選択lacY遺伝子により2-ニトロフェニル-β-D-チオガラクトシ
ダーゼ（tONPG）を補給した培地上に播種することにより、選択することができ る（Murphyら, 1995）。さらにoriT配列は、F'稔性因子を含有する大腸菌（E.co
li)から稔性因子を欠くF-株への、pBAD30-cIプラスミドおよびその誘導体の一方
向の遺伝的交換を可能にする。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (31)優先権主張番号 ９７１２０８８０．６ (32)優先日 平成９年11月27日(1997．11．27) (33)優先権主張国 欧州特許庁（ＥＰ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ， ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，Ｌ Ｕ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ， ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，Ｕ Ｇ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 レーラック、ハンス ドイツ連邦共和国 ディー‐14195 ベル リン、ルトゼルスタイナー ヴェク 50 (72)発明者 ヴェデマイヤー、ニールズ ドイツ連邦共和国 48356 ノートヴァル ド、グルナー グルント 22 Ｆターム(参考） 2G045 DA36 FB02 FB03 JA01 4B024 AA01 AA11 AA19 AA20 CA01 CA07 CA09 CA11 DA01 DA02 DA05 DA06 DA12 EA02 EA04 FA10 FA15 GA01 GA11 GA30 HA12 4B063 QA18 QQ07 QQ13 QQ42 QQ52 QQ79 QR33 QR41 QR43 QR68 QR69 QR75 QR80 QS05 QS25 QS34 QS39 QX01 4C084 AA17 MA02 MA66 ZC781

Claims (61)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 相互作用分子のペアまたは複合体の少なくとも１つのメンバ
    ーを同定する方法であって、 (a) 異なる選択マーカーおよび対抗選択マーカーを有する少なくとも２つの遺
    伝的エレメントを含む宿主細胞を提供すること、ただし、該遺伝的エレメントの
    それぞれは該メンバーの１つを特定する遺伝情報を含み、該宿主細胞は該分子の
    相互作用時に活性化されるリードアウト系をさらに保有するものであること； (b) 少なくとも一つの相互作用を、もし存在するのであれば、生起させること
    ； (c) 該宿主細胞の子孫を、 (ca) 少なくとも２つの異なる選択培地、ここで該選択培地のそれぞれは 該対抗選択マーカーの少なくとも一つの不存在下かつ一つの選択マーカーの存在
    下においてのみ該宿主細胞の増殖を可能にするものであること；および (cb) 該リードアウト系の活性化時にのみ該宿主細胞の同定を可能にする 更なる選択培地 に移すことにより、該相互作用を選択すること； (d) (da) (ca) で特定した選択培地のいずれにおいてもリードアウト系を活性
    化せず、かつ (db) (cb)で特定した選択培地上でリードアウト系を活性化する 相互作用分子を含む宿主細胞を同定すること；ならびに (e) 該相互作用分子のペアまたは複合体の少なくとも１つのメンバーを同定す
    ること、 を含む、上記方法。
  2. 【請求項２】 前記相互作用分子のペアまたは複合体が、RNA-RNA、RNA-DNA
    、RNA-タンパク質、DNA-DNA、DNA-タンパク質、タンパク質-タンパク質、タンパ
    ク質-ペプチド、またはペプチド-ペプチド相互作用からなる群から選択される、
    請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記遺伝的エレメントが、プラスミド、人工染色体、ウイル
    スまたは他の染色体外エレメントである、請求項１または２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記相互作用が、前記リードアウト系の活性化を駆動する応
    答成分を活性化する能力があり、DNA結合ドメインとトランス活性化タンパク質 ドメインを含む機能的転写アクチベータータンパク質の形成へと至らせる、請求
    項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記リードアウト系が検出可能なタンパク質である、請求項
    ４に記載の方法。
  6. 【請求項６】 検出可能なタンパク質が、遺伝子lacZ、HIS3、URA3、LYS2、
    sacB、tetA、gfpまたはHRPTのうちの少なくとも１つからコードされる、請求項 ５に記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記宿主細胞が、酵母細胞、細菌細胞、哺乳動物細胞、昆虫
    細胞または植物細胞である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 【請求項８】 ステップ(a)の前に、前記宿主細胞を前記遺伝的エレメント で形質転換またはトランスフェトすることをさらに含む、請求項１〜７のいずれ
    か１項に記載の方法。
  9. 【請求項９】 ステップ(a)の前に、前記遺伝的エレメントをもつ前記宿主 細胞を作るために、細胞融合、接合または相互作用交配が用いられる、請求項１
    〜８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 ステップ(ca)において対抗して選択される対抗選択マーカ
    ーが、CAN1、CYH2、LYS2、URA3、lacY、rpsL HPRTおよびsacBからなる群から選 択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 前記選択マーカーが栄養要求性または抗生物質マーカーで
    ある、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 前記栄養要求性または抗生物質マーカーが、LEU2、TRP1、
    URA3、ADE2、HIS3、LYS2またはゼオシン(Zeocin)である、請求項１１に記載の方
    法。
  13. 【請求項１３】 ステップ(b)の宿主細胞の子孫が貯蔵コンパートメントに 移送される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 移送が、オートメーションまたはピッキングロボットによ
    り行われるかまたは支援される、請求項１３に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 前記貯蔵コンパートメントが抗凍結剤を含む、請求項１３
    または１４に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 前記貯蔵コンパートメントがマイクロタイタープレートで
    ある、請求項３〜１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 前記マイクロタイタープレートが384個のウェルを含む、 請求項１６に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 ステップ(c)の移送が、オートメーション、スポッティン グロボット、ピペッティングまたはマイクロピペッティング装置によって行われ
    るかまたは支援される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 移送が平面キャリアーに対して行われる、請求項１８に記
    載の方法。
  20. 【請求項２０】 移送が、１cm2当たり１〜1000個のクローン密度の規則的 なグリッドパターンで行われる、請求項１８または１９に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 平面キャリアーがメンブランである、請求項１８〜２０の
    いずれか１項に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 ステップ(d)における宿主細胞の同定が、視覚的手段によ り該リードアウト系の活性化状態の考察から行われる、請求項１〜２１のいずれ
    か１項に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 ステップ(d)における宿主細胞の同定が、デジタル画像の 記憶、解析または処理により行われる、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の
    方法。
  24. 【請求項２４】 相互作用分子のペアの少なくとも１つのメンバーの同定が
    、核酸ハイブリダイゼーション、抗体結合または核酸の配列決定により行われる
    、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 前記抗体反応または前記ハイブリダイゼーションにより行
    われる同定が、前記少なくとも１つのメンバーの、または前記少なくとも１つの
    メンバーをコードする遺伝情報の規則的グリッドを用いて行われる、請求項２４
    に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 前記規則的グリッドの構築が、オートメーションまたはス
    ポッティングロボットにより行われる、請求項２５に記載の方法。
  27. 【請求項２７】 前記同定が、デジタル画像の記憶、処理または解析により
    行われる、請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の方法。
  28. 【請求項２８】 前記同定に先だって、核酸分子をPCRで増幅するか、また は前記遺伝的エレメントの一部として、好ましくは細菌内で、最も好ましくは大
    腸菌内で増幅する、請求項２４〜２７のいずれか１項に記載の方法。
  29. 【請求項２９】 ステップ(a)の前に、対抗選択化合物を含む培地上で、リ ードアウト系を活性化し得る１つの分子を発現するクローンに対抗して予備選択
    が行われる、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
  30. 【請求項３０】 前記対抗選択化合物が、5-フルオロオロチン酸、カナバニ
    ン、シクロヘキシミド、スクロース、tONPG、ストレプトマイシン、またはα-ア
    ミノ-アジペートである、請求項２９に記載の方法。
  31. 【請求項３１】 請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法により同定さ
    れた相互作用分子の少なくとも１つのメンバーを薬剤学的に許容される形態に製
    剤化することを含む、医薬組成物の製造方法。
  32. 【請求項３２】 請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法により同定さ
    れた相互作用分子の相互作用の阻害剤を薬剤学的に許容される形態に製剤化する
    ことを含む、医薬組成物の製造方法。
  33. 【請求項３３】 相互作用分子のカスケード（請求項１〜３０のいずれか１
    項に記載の方法により同定された相互作用分子の少なくとも１つのメンバーがカ
    スケードの一部である）の更なる分子を同定すること、または該更なる分子の阻
    害剤を同定することを含む、医薬組成物の製造方法。
  34. 【請求項３４】 (f) 先行する請求項のいずれか１項で同定された宿主細胞
    、ならびに先行する請求項のいずれか１項で特定され、対抗選択マーカーを含む
    前記相互作用する可能性のある分子の少なくとも１つを特定する遺伝情報を含む
    少なくとも１つの遺伝的エレメント； (g) 先行する請求項のいずれか１項で同定された宿主細胞、ならびに先行する
    請求項のいずれか１項で特定され、対抗選択マーカーを含む前記相互作用する可
    能性のある分子の少なくとも１つを特定する遺伝情報を含まない少なくとも１つ
    の遺伝的エレメント； (h) 先行する請求項のいずれか１項で特定され、対抗選択マーカーを含む前記
    相互作用する可能性のある分子の少なくとも１つを特定する前記遺伝情報を含む
    少なくとも１つの遺伝的エレメント； (i) 先行する請求項のいずれか１項で特定され、対抗選択マーカーを含む前記
    相互作用する可能性のある分子の少なくとも１つを特定する遺伝情報を含まない
    少なくとも１つの遺伝的エレメント； (j) (h)または(i)で特定された遺伝的エレメントの少なくとも１つ、好ましく
    は少なくとも２つを含む宿主細胞； (k) 先行する請求項のいずれか１項で特定された前記遺伝的エレメントの少な
    くとも１つのメンバーを含む前記宿主細胞由来の核酸またはタンパク質を保有す
    る少なくとも１つの平面キャリアー（ここで該核酸またはタンパク質は、グリッ
    ド形態にて該キャリアーに付着されている）、ならびに核酸プローブまたはタン
    パク質の、該グリッドに付着された分子へのハイブリダイゼーションまたは結合
    を生じさせるための任意の溶液； (l) 少なくとも１つの貯蔵コンパートメント、平面キャリアーまたは(f)〜(k)
    のいずれか１つで同定された遺伝的エレメント、宿主細胞、貯蔵コンパートメン
    トまたはキャリアーを含むおよび／または特性決定するコンピューターディスク
    ；および／または (m) can1およびcyh2突然変異を含む少なくとも１つの酵母株 のうちの少なくとも１つを含むキット。
  35. 【請求項３５】 (f)、(g)または(j)の宿主細胞が、少なくとも１つの貯蔵 コンパートメントに含まれている、請求項３４に記載のキット。
  36. 【請求項３６】 (i)または(iii)で特定された、前記遺伝情報または該遺伝
    情報によりコードされる前記相互作用する可能性のある分子が、少なくとも１つ
    の貯蔵コンパートメントに含まれている、請求項３４または３５に記載のキット
    。
  37. 【請求項３７】 生物学的サンプルに由来する核酸によりコードされる相互
    作用分子の少なくとも１つのペアまたは複合体の潜在的メンバーに関するデータ
    を記憶し、解析するためのコンピューター実行方法であって、 (n) 第１のデータテーブルから第１の核酸についての情報を検索すること、た
    だし該情報が、 (oa) 核酸を一意的に同定する、第１の文字および／または数字の組合せ、 および (ob) 該核酸を含む遺伝的エレメントのタイプ、および (oc) 該核酸によりコードされる潜在的メンバーが相互作用分子のペアまた は複合体の少なくとも１つの他の潜在的メンバーとの相互作用について試験され
    たクローンを一意的に同定する、第２の文字および／または数字の組合せ を含むものであること、 (p) 第２の文字および／または数字の組合せを用いて、第１のデータテーブル
    または任意に更なるデータベースから、ステップa3)における前記少なくとも１ つの他の潜在的メンバーをコードする追加的な核酸を同定する情報を検索するこ
    と を含む、上記方法。
  38. 【請求項３８】 ステップ(oc)における第２の文字および／または数字の組
    合せを用いて第２のデータテーブルから更なる情報を検索することをさらに含む
    請求項３７に記載の方法であって、該更なる情報が少なくとも前記クローンの相
    互作用クラスを含み、かつ任意に追加的な情報が (q) クローンの物理的位置、 (r) (ra)組織、疾病状態または核酸の細胞源、 (rb) クローニングの詳細、および (rc) 他のクローンのライブラリーのメンバー構成 を含む、前記クローンの作製に関連する予め決定された実験詳細 を含む、上記方法。
  39. 【請求項３９】 第１の核酸についてのステップ(o)の情報および／または 追加的な核酸についてのステップ(p)の情報を用いて、該第１の核酸および／ま たは追加的な核酸をさらに特性決定する第３のデータテーブルと関連付けること
    、ただし該更なる特性決定が、 (s) ハイブリダイゼーションデータ； (t) オリゴヌクレオチドフィンガープリントデータ； (u) ヌクレオチド配列； (v) 該核酸のインフレーム翻訳； (w) 組織、疾病状態または細胞源の遺伝子発現データ のうちの少なくとも１つを含むものであること、ならびに、 任意に、前記第１の核酸または追加的な核酸によりコードされるタンパク質ド
    メインを同定することをさらに含む、請求項３８に記載の方法。
  40. 【請求項４０】 核酸によりコードされる前記潜在的メンバーが相互作用す
    るか否かを、ステップ(oc)において核酸が前記相互作用について試験された前記
    クローンの相互作用クラスを考察することにより同定することをさらに含む、請
    求項３９に記載の方法。
  41. 【請求項４１】 前記データが、10〜100個の潜在的メンバー、好ましくは1
    00〜1000個の潜在的メンバー、より好ましくは1000〜10000個の潜在的メンバー 、最も好ましくは10,000個以上の潜在的メンバーに関連するものである、請求項
    ３７〜４０のいずれか１項に記載の方法。
  42. 【請求項４２】 前記データが、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の方
    法により作製される、請求項３７〜４１のいずれか１項に記載の方法。
  43. 【請求項４３】 前記相互作用クラスが、 (x) 陽性 (y) 陰性 (z) 偽陽性 のうちの１つを含む、請求項３８〜４２のいずれか１項に記載の方法。
  44. 【請求項４４】 所与のメンバーが、陽性相互作用クラスの異なるクローン
    における多数の異なるメンバーと相互作用すると同定される発生数を考察するこ
    とにより付着性タンパク質が同定される、請求項４０〜４３のいずれか１項に記
    載の方法。
  45. 【請求項４５】 前記第１のデータテーブルが第１のデータベースの一部を
    形成し、前記第２および第３のデータテーブルが少なくとも第２のデータベース
    の一部を形成する、請求項３７〜４４のいずれか１項に記載の方法。
  46. 【請求項４６】 前記第２のデータベースが、前記第１のデータベースを保
    持するコンピューター読取可能メモリーとは別個のコンピューター読取可能メモ
    リーに保持されており、かつ該データベースがデータ交換ネットワークを介して
    アクセスされるものである、請求項４５に記載の方法。
  47. 【請求項４７】 前記第２のデータベースが、核酸もしくはタンパク質の配
    列、２次もしくは３次構造、生化学的、生活史的もしくは遺伝子発現の情報を含
    む、請求項４６に記載の方法。
  48. 【請求項４８】 前記第１、第２または更なるデータテーブルへのデータ入
    力が、他のコンピューターデータ、プログラムまたはコンピューター制御ロボッ
    トへのアクセスにより前記第１のデータベースから自動的に制御される、請求項
    ３７〜４７のいずれか１項に記載の方法。
  49. 【請求項４９】 請求項１〜３６のいずれか１項に記載の方法の進行を支援
    するために、少なくとも１つのワークフロー管理システムが特定のデータのセッ
    トを中核にして構築されている、請求項３７〜４８のいずれか１項に記載の方法
    。
  50. 【請求項５０】 前記ワークフロー管理システムが、請求項２４〜２８のい
    ずれか１項で特定したハイブリダイゼーション方法を用いた相互作用分子のペア
    または複合体のメンバーの同定の進行を支援するためのソフトウエアである、請
    求項４９に記載の方法。
  51. 【請求項５１】 前記データが、調査者に関心のある対象を照会することに
    より調査される、請求項３７〜５０のいずれか１項に記載の方法。
  52. 【請求項５２】 前記照会が、 (aa) 相互作用ネットワークの第１のメンバーと第２のメンバー間の相互作用 または相互作用経路を同定すること、 (ab) 相互作用ネットワークの第１のメンバーと第２のメンバー間の、少なく とも１つの別のメンバーを介する相互作用経路を同定すること、 (ac) 核酸またはタンパク質配列、２次または３次構造によって特性決定され る少なくとも２つのメンバー間の相互作用または相互作用経路を同定すること、 ならびに (ad) 前記異なる組織、疾病状態または細胞源が異なる相互作用または相互作 用経路を同定すること のうちの少なくとも１つを含む、請求項５１に記載の方法。
  53. 【請求項５３】 データ照会手順を支援するために前記情報の一部が制御さ
    れたフォーマットで記憶されている、請求項５１または５２に記載の方法。
  54. 【請求項５４】 前記照会の結果が、調査者に対し、グラフの形で表示され
    る、請求項５１〜５３のいずれか１項に記載の方法。
  55. 【請求項５５】 請求項４０の相互作用分子のペアまたは複合体のコードメ
    ンバーとして同定された核酸を特性決定するデータを含むデータのサブセットが
    、更なるデータテーブルまたはデータベースに記憶されている、請求項５４に記
    載の方法。
  56. 【請求項５６】 所与のメンバーが第２または更なるメンバーと相互作用す
    ると同定される発生回数の考察を用いて、核酸を特性決定するデータが前記デー
    タのサブセットの一部を形成するか否かを決定する、請求項５５に記載の方法。
  57. 【請求項５７】 追加的情報または実験的データが、それらのデータを選択
    して前記サブセットの一部を形成するために用いられる、請求項５５または５６
    に記載の方法。
  58. 【請求項５８】 一定のデータ照会手順を迅速化するために、コンピュータ
    ー読取可能メモリーにおけるデータの記憶の構造が改変される、請求項５５〜５
    ７のいずれか１項に記載の方法。
  59. 【請求項５９】 データが、リレーショナルデータベースまたはオブジェク
    ト指向データベースに保持されている、請求項３７〜５８のいずれか１項に記載
    の方法。
  60. 【請求項６０】 相互作用の各メンバーについての情報を保持するデータテ
    ーブルを含むデータ記憶スキームであって、該テーブル内の記録が相互作用の各
    メンバーを表わし、メンバーが共通ネームの共有により相互作用を形成すること
    が示される、上記スキーム。
  61. 【請求項６１】 前記共通ネームがクローン名であるか、または前記クロー
    ン名を含む文字および／または数字の一意的な組合せである、請求項６０に記載
    のデータ記憶スキーム。
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