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FACHGEBIET DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Verfahren, die für das Ermitteln von Protein-Protein-Interaktionen nützlich sind,
welche die Assoziation von zwei oder von mehreren Proteinen durch
die Erzeugung von nicht kovalenten Bindungen ermöglichen, wenn sich die zwei
Proteinoberflächen
präzise
entsprechen. Diese Bindungen begründen die Spezifität der Erkennung.
Protein-Protein-Interaktionen sind zum Beispiel bei dem Aufbau von
Enzym-Untereinheiten; bei Antigen-Antikörper-Reaktionen; bei der Erzeugung
von supramolekularen Strukturen von Ribosomen, Filamenten und Viren;
beim Transport und bei der Interaktion von Rezeptoren auf einer
Zelle mit Wachstumsfaktoren und Hormonen beteiligt. Die Produkte
von Oncogenen können
eine neoplastische Transformation durch Protein-Protein-Interaktionen verursachen.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Der
Hefe-Zwei-Hybrid (Y2H)-Test ist ein Verfahren zum Ermitteln von
Protein-Protein-Interaktionen, wobei
ein genetisches System verwendet wird. Die Technik kann für das Auswerten
von Protein-Interaktionen verwendet werden und daher zum Identifizieren
von möglichen
Partnern in genetischen Signalwegen. Der Test ist sensitiv und ergibt
die DNA-Sequenzen, welche die Proteine codieren, die interagieren.
In einem typischen Zwei-Hybrid-Test wird ein bekanntes Protein,
das einen Teil des Hybrids einer DNA-bindenden Domäne erzeugt,
gegen eine Bibliothek von allen möglichen Proteinen, die als
Hybride einer Transkriptions-Aktivierungsdomäne vorliegen,
getestet. Einige Zwei-Hybrid-Ansätze
beruhen auf eine Interaktionspaarung. In diesem Verfahren werden
das Protein, das an die DNA-bindenden
Domäne
fusioniert ist, und das Protein, das an die Aktivierungsdomäne fusioniert
ist, in zwei verschiedenen haploiden Hefestämmen eines entgegengesetzten
Paarungstyps exprimiert und die Stämme werden gepaart, um zu bestimmen,
ob die zwei Proteine interagieren. Wenn haploide Hefestämme des
entgegengesetzten Paarungstyps in Kontakt kommen, erfolgt eine Paarung und
dies führt
zu der Fusion der zwei Haploide, um einen diploiden Hefestamm zu
erzeugen. Eine Interaktion kann daher durch die Messung der Aktivierung
eines Zwei-Hybrid-Reporter-Gens
in dem diploiden Stamm bestimmt werden.
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Finley
RL et al. (1997) beschreiben Verfahren zur Durchführung von
Interaktionspaarungsanalysen von kleinen oder großen Gruppen
von Proteinen, wobei die Interaktionsfalle verwendet wird, in der
eine Platte mit Köderstämmen und
eine Platte mit Beutestämmen
in die gleiche Samt-Kopie gedrückt
werden und der Abdruck wird mit einer Platte, die YPD-Medium enthält, abgehoben
("Two-Hybrid Analysis
of Genetic Regulatory Networks",
Advances in Molecular Biology (1997), Seiten 197–214). Finley RL et al. (1994)
beschreiben Interaktionen zwischen Zellzyklus regulierenden Proteinen
von Drosophila melanogaster durch eine Hefe-Interaktionspaarungstechnik, welche
die Interaktionsfalle (ein Hefe-Zwei-Hybrid-Verfahren) ausdehnt und das Zeigen der
Muster von Interaktionen in den Interaktionsmatrizen, zweidimensionalen
Arrays von diploiden Stämmen von
geeigneten Indikator-Platten involviert (Proceedings of the National
Academy of Science of USA, National Academy of Science, Washington,
91: 12980–12984).
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WO
94/10300 und das US-Patent Nr.: 5,283,173 beschreiben Verfahren
zum Ermitteln der Interaktion zwischen Proteinen, wobei die Rekonstitution
der Aktivität
eines transkriptionellen Aktivators verwendet wird. Diese Rekonstitution
verwendet chimäre
Gene, die Hybrid-Proteine exprimieren. Das erste Hybrid enthält die DNA-bindende Domäne eines
transkriptionellen Aktivators, der an ein bekanntes Protein (der "Köder") fusioniert ist, wobei die DNA-bindende
Domäne
das DNA-bindende Element stromaufwärts von einem Reporter-Gen
gelegen ist. "Beute"-Proteine werden
entweder als Zufallssequenzen oder cDNAs cloniert und werden an
das Amino- oder das Carboxyende einer Transkriptions-Aktivierungsdomäne fusioniert.
Wenn die Köder- und
die Beute-Proteine in der Lage sind, miteinander zu interagieren,
bringen sie die beiden Domänen
des transkriptionellen Aktivators in eine enge Nähe. Diese Nähe ist ausreichend, um eine
Transkription zu verursachen, die durch die Aktivität eines
Reporter-Gens nachgewiesen werden kann, das eine Bindungsstelle
für die
DNA-bindende Domäne
enthält.
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Die
Nachteile dieser Techniken sind, dass irrelevante Interaktionen
mit Hefe-Proteinen
erzeugt werden. Diese schließen
falsch positive Interaktionen ein, bei denen es unwahrscheinlich
ist, dass sie in lebenden Zellen gefunden werden, und falsch negative
Interaktionen, das heißt
solche Interaktionen, die sonst nachgewiesen würden, aber nicht nachgewiesen
werden. Die Techniken, wie sie in WO 94/10300 und dem US-Patent Nr.
5,283,173 offenbart wurden, benötigen
die Verwendung einer Paarung in einem festen Medium, das beschwerlich
und arbeitsintensiv ist und das keine diploiden Zellen für eine weitere
Analyse bewahrt.
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Wir
haben eine Paarungsstrategie des Hefe-Zwei-Hybrid-Tests in einem
automatisiertem Format entwickelt, das die Verarbeitung von vielen
Köder-Proteinen
ermöglicht.
Das Format verwendet eine Array-Vorrichtung, zum Beispiel Mikrotiterplatten
und die Paarung in einer flüssigen
Masse von einer Untergruppe einer großen, komplexen Bibliothek.
Durch das Verfolgen der positiven Interaktionen in der Bibliothek
haben wir ein Verfahren entwickelt, um eine funktionell verkleinerte
Bibliothek zu erzeugen, das heißt,
eine Bibliothek, die ohne einen auswertbaren Phänotyp hergestellt werden kann.
Unser Verfahren ermöglicht
zum Beispiel die Bestimmung des Nachweises von Hybriden, die promiskuitiv
mit vielen Zielen wie z.B. mit Hitzeschock-Proteinen reagieren,
und deren Eliminierung von jeder weiteren Überlegung.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird ein Verfahren zum Ermitteln von Protein-Protein-Interaktionen zur
Verfügung
gestellt, das die Paarung in einer flüssigen Masse von Untergruppen
einer großen,
komplexen Bibliothek umfasst. Das Verfahren stellt ein Mittel für das Entfernen
von nicht relevanten Protein-Protein-Interaktionen zur Verfügung, um
einen funktionell verkleinerten Test zu erhalten.
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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Gemäß einem
Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Ermitteln
einer Interaktion zwischen einem ersten Test-Protein und einem zweiten
Test-Protein zur Verfügung
gestellt, das umfasst:
- (a) das Bereitstellen
einer Wirtszelle, die ein Reporter-Gen enthält, wobei das Reporter-Gen
ein nachweisbares Protein exprimiert, wenn das Reporter-Gen von
einer Aminosäuresequenz,
die eine Transkriptions-Aktivierungsdomäne einschließt, aktiviert
wird, wenn die Transkriptions-Aktivierungsdomäne in ausreichender Nähe zu dem
Reporter-Gen ist;
- (b) das Bereitstellen eines ersten chimären Gens, das in der Lage ist,
in der Wirtszelle exprimiert zu werden, wobei das erste chimäre Gen eine
DNA-Sequenz umfasst, die ein erstes Hybrid-Protein codiert, wobei
das erste Hybrid-Protein umfasst:
- (i) eine DNA-bindende Domäne,
die eine Bindestelle auf dem Reporter-Gen in der Wirtszelle erkennt; und
- (ii) ein erstes Test-Protein oder ein Fragment davon, das auf
Interaktion mit mindestens einem zweiten Test-Protein oder Fragment
davon getestet werden soll;
- (c) das Bereitstellen eines zweiten chimären Gens, das in der Lage ist,
in der Wirtszelle exprimiert zu werden, wobei das zweite chimäre Gen eine
DNA-Sequenz umfasst, die ein zweites Hybrid-Protein codiert, wobei
das zweite Hybrid-Protein umfasst:
- (i) die Transkriptions-Aktivierungsdomäne; und
- (ii) ein zweites Test-Protein oder ein Fragment davon, das auf
Interaktion mit dem ersten Test-Protein oder Fragment davon getestet
werden soll; wobei die Interaktion zwischen dem ersten Test-Protein
und dem zweiten Test-Protein in der Wirtszelle, die Transkriptions-Aktivierungsdomäne veranlasst,
die Transkription des Reporter-Gens zu aktivieren;
- (d) das Einführen
des zweiten chimären
Gens in die Wirtszelle und das anschließende Einführen der Zellen in eine Array-Vorrichtung,
wobei eine Master-Bibliotheksplatte
erstellt wird;
- (e) das Einführen
von Zellen von der Master-Bibliotheksplatte in eine zweite Array-Vorrichtung,
die eine Array-Vorrichtung für
flüssiges
Medium ist, wobei ein Paarungssatz erstellt wird;
- (f) das Einführen
des ersten chimären
Gens in die Wirtszelle und das anschließende Einführen der Zelle in den Paarungssatz,
wodurch es ermöglicht
wird, das die Paarung in flüssigem
Medium erfolgt;
- (g) das Selektieren nach Auswuchs der Interaktion der ersten
und zweiten Gene;
- (h) das Entfernen eines Teils des Paarungssatzes zu einer dritten
Array-Vorrichtung,
wobei ein Rettungssatz erstellt wird;
- (i) das Ermitteln, ob das Reporter-Gen in dem Paarungssatz exprimiert
wurde; und
- (j) das Analysieren der Zellen von der Rettungsplatte.
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Der
Ausdruck "Reporter-Gen" oder "Markierungs-Gen", wie er hierin verwendet
wird, bedeutet jedes Gen, dessen Expression getestet werden kann.
Mehr als ein Reporter-Gen kann durch die Wirtszelle in Schritt (a),
vorstehend, codiert werden.
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Der
Ausdruck "Array-Vorrichtung", wie er hierin verwendet
wird, bedeutet jedes Verfahren zur Haltung von Clonen in flüssigem Medium,
in Suspension oder in festem Medium, zum Beispiel Mikrotiterplatten
oder Teströhrchen.
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Der
Ausdruck "Selektieren
nach Auswuchs",
wie er hierin verwendet wird, bedeutet jedes Verfahren, das ein
selektierbares Mittel verwendet, um eine Gruppe von interagierenden
Proteinen entweder zu amplifizieren oder zu isolieren. Dieses selektierbare
Mittel kann das Auswachsen in einem nährstoffdefizienten Wachstumsmedium
einschließen,
worin die interagierenden Proteine die Transkription eines biosynthetischen Gens
oder Signalwegs hervorrufen. Beispiele von anderen nützlichen
selektierbaren Mitteln schließen
biosynthetische Gene von Aminosäuren,
Metaboliten, Kataboliten und Nucleinsäuren wie z.B. Hefe-HIS3, URA3
und LYS2, GAL1, E. coli-galK und CAT, GUS, Resistenz gegen Antibiotika
und jedes Gen ein, das ein Zelloberflächen-Antigen codiert, für das Antikörper erhältlich sind.
Man kann das Auswachsen für
5–10 Tage
fortschreiten lassen, bevor das Selektieren nach Auswuchs durchgeführt wird.
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Der
Ausdruck "Analysieren", wie er hierin verwendet
wird, bedeutet jedes Verfahren zur Ermittlung von Informationen,
welche die Protein-Protein-Interaktion betreffen, zum Beispiel das
Selektieren positiver Clone, das Durchführen von PCR, DNA-Sequenz-Analyse
und der Vergleich mit Datenbanken wie z.B. LifeSeq® (Incyte
Pharmaceuticals) oder Genbank.
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Der
Ausdruck "funktionell
verkleinert" bedeutet
das Fehlen eines nachweisbaren Phänotyps, der eine nicht relevante
Protein-Protein-Interaktion repräsentiert.
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In
einem weiteren Aspekt der Erfindung kann die Bestimmung der Expression
des Reporter-Gens und die Analyse der Zellen in einem Schritt erreicht
werden, das heißt
die vorstehenden Schritte (i) und (j) können kombiniert werden. In
einer anderen Ausführungsform
können
die Schritte (h), (i) und (j) eliminiert werden.
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Eine
Hefe-Wirtsstamm kann so konstruiert werden, dass das Protein (der "Köder") des therapeutischen oder diagnostischen
Interesses als ein Fusionsprotein kovalent an eine bekannte DNA-bindende
Domäne
eines transkriptionellen Aktivators gebunden wird. Der Hefe-Wirtsstamm
enthält
ebenfalls ein oder mehrere "Reporter-Gene", das heißt Gene,
deren Transkription als Antwort auf eine Köder-Beute-Interaktion nachgewiesen wird. Die Köder-Proteine
binden über
ihre DNA-bindende Domäne
an ihre spezifische DNA-Stelle, die stromaufwärts von einem Reporter-Gen gelegen
ist, die Transkription des Reporter-Gens wird jedoch nicht stimuliert,
weil dem Köder-Protein
eine eigene Aktivierungsdomäne
fehlt.
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Um
Gene zu isolieren, die neue interagierende Proteine codieren, werden
Zellen dieses Stamms, die ein Reporter-Gen enthalten und ein Köder-Protein
exprimieren, mit individuellen Mitgliedern einer DNA (zum Beispiel
eine cDNA)-Expressions-Bibliothek
transformiert. Jedes Mitglied der Bibliothek leitet die Synthese
eines zur Auswahl stehenden interagierenden Proteins, das an eine
schwache und unveränderliche
Gen-Aktivierungsdomänen-Markierung
fusioniert ist. Die durch die Bibliothek codierten Proteine ("Beute"-Proteine), die physikalisch
mit dem Promotor-gebundenen
Köder-Protein
interagieren, aktivieren nachweisbar die Transkription des stromabwärts gelegenen
Reporter-Gens und stellen einen einfachen Test zur Identifizierung
von bestimmten Zellen zur Verfügung,
die einen DNA-Clon enthalten, der ein interagierendes Protein von
Interesse codiert.
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In
einer Ausführungsform
wird eine cDNA-Bibliothek, die in E. coli erzeugt wurde und die
eine cDNA umfasst, die an die DNA-Sequenz fusioniert ist, welche
die Aktivierungsdomäne
des transkriptionellen Aktivators, das GAL4-Protein, codiert, auf
960-LB-Agarplatten mit einer Dichte von 1000 Clonen pro Platte ausplattiert.
Die E. coli-Kolonien von jeder Platte werden vereinigt, die Plasmid-DNAs
werden isoliert und die DNAs werden verwendet, um Hefezellen zu
transformieren. Die transformierten Hefezellen werden auf festes
Medium ausplattiert und die Kolonien von jeder Platte werden vereinigt
und in Aliquots aufgeteilt, die in unterschiedliche Vertiefungen
von einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen gegeben werden, um
eine angeordnete Gruppe von 10 "Master-Bibliotheksplatten" zu erzeugen. Fünf Mikroliter
von jeder Vertiefung der Master-Bibliotheksgruppe wird erneut in
Aliquots aufgeteilt, um einen "Paarungssatz" zu erzeugen, und
5 μl von
Köder enthaltenden
Hefezellen werden anschließend
getrennt in je eine Vertiefung gegeben. Der "Köder" umfasst ein chimäres Gen,
das ein Hybridprotein exprimiert, das die DNA-bindende Domäne von GAL4
enthält,
die an ein bekanntes Protein fusioniert ist. Der Wirtshefestamm
enthält
das GAL1-lac-Z-Gen, das die GAL4-DNA-bindende Domäne binden
kann. Das GAL1-lacZ-Gen enthält
das lacZ-Gen von E. coli, das die β-Galactosidase codiert. Die
Aktivität
von β-Galactosidase
ist ein Maß für die GAL4-Funktion.
Das Wachstum von Hefe auf Galactose benötigt die Transkription von
Genen, die durch GAL4 reguliert werden, und ist ebenfalls ein Maß für die GAL4-Funktion.
Man lässt
die Paarung in der flüssigen
Masse für
einen Zeitraum ablaufen und das Paarungsgemisch wird 100fach mit
Leucin-Drop-out-Medium verdünnt.
Nach dem Auswachsen von positiv interagierenden, gepaarten Hefe-Diploiden
in dem Drop-out-Medium
wird ein Teil entfernt und auf eine getrennte Gruppe von "Rettungsplatten" gegeben und eine βGal-Analyse
wird bei dem Paarungssatz durchgeführt. Die transkriptionelle Aktivierung
kann durch das Messen der β-Galactosidaseaktivität auf Galactose
enthaltende Medien bestimmt werden. Vertiefungen, die eine βGal-Aktivität enthalten,
werden identifiziert und Clone von der entsprechenden Gruppe von
Vertiefungen aus den Rettungsplatten werden durch PCR-Sequenzierung
analysiert.
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Nicht-relevante
Protein-Protein-Interaktionen können
durch das Kombinieren ausschließlich
produktiver Clone mit der Master-Bibliothek eliminiert werden, wodurch
Clone eliminiert werden, die Proteine wie zum Beispiel Hitzeschock-Proteine herstellen,
von denen bekannt ist, dass sie mit vielen anderen Proteinen interagieren.
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Es
wird ebenfalls ein Verfahren für
eine Strategie zur Clonierung eines offenen Leserahmens zur Verfügung gestellt,
welche die dynamische Umcodierung der Enden von DNA-Molekülen involviert.
Diese Strategie zur Clonierung erhöht die Effizienz des Tests
durch die Eliminierung aller Clone, die Proteine codieren, die außerhalb
des Leserahmens mit Bezug auf die Aktivierungsdomäne liegen,
aus dem Test.
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Bei
der dynamischen Umcodierung einer Aktivierungsdomäne kann
das 3'-Ende des
Gens der Aktivierungsdomäne
umcodiert werden, um ein Aminosäure-Hybrid-Peptid einzubauen,
das ebenfalls die DNA kontrollierenden Elemente codiert, die für die Expression
von E. coli-Genen notwendig sind. In einem Aspekt umfassen diese
Kontrollelemente hintereinander i) eine Sequenz, zum Beispiel eine
-35- und eine -10-Sequenz, die als ein E. coli-Promotor wirkt, um
die Transkription von mRNA zu initiieren, ii) eine Ribosomen-Bindestelle
und ein ATG fMet-Codon, das notwendig ist, um die Translation von
Protein zu initiieren, iii) einen Polylinker (multiple Clonierungsschnittstelle),
der aus einer oder aus mehreren Restriktionsstellen aufgebaut ist, die
vorzugsweise einzigartig für
den Clonierungsvektor sind, in den die Füllfragmente (Stufferfragmente)
der DNA, welche die Proteinfusionen zu der Aktivierungsdomäne codieren
können,
cloniert werden sollen, und iv) ein Reporter-Gen, zum Beispiel das lacZ-Gen, das
außerhalb
des Leserahmens mit Bezug auf das ATG-Codon cloniert wurde. In dem
System zur Clonierung des offenen Leserahmens kann das ATG innerhalb
des Leserahmens mit Bezug auf die Aktivierungsdomäne liegen,
das ATG kann außerhalb
des Leserahmens mit Bezug auf das lacZ-Gen liegen, es liegt eine
vernachlässigbare
Menge von βGal-Protein
vor, das von der Wirtszelle in der Abwesenheit eines Füllfragments
hergestellt wird, das den lacZ-Leserahmen wiederherstellt, und es
liegt ein Fehlen eines Terminations-Codons am Ende des Aktivierungsdomäne-Gens
und des ATG-Codons vor.
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Der
Ausdruck "Füllfragmente" bedeutet jedes DNA-Fragment,
das synthetisch oder durch die Verwendung eines Verfahrens hergestellt
wird, das im Allgemeinen verwendet wird, um Zufalls-cDNA-Moleküle oder am
3'-Ende vorbehandelte
cDNA-Moleküle, die
in den Polylinker des vorstehend beschriebenen Systems zur Clonierung
eines offenen Leserahmens geclont werden können.
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In
einem Aspekt kann durch Random priming hergestellte cDNA, die als
Füllfragmente
verwendet wird, durch Agarose- oder Polyacrylamid-Gelelektrophorese
nach Größe ausgewählt werden.
Eine individuelle cDNA, die durch Gelelektrophorese oder durch andere
Mittel nach Größe ausgewählt wurde,
kann Fragmente enthalten, die, wenn sie in das Vektorsystem, das
beschrieben wurde, cloniert werden, in einem der sechs Leserahmen
(3 Leserahmen sowohl in Vorwärts-
als auch in Rückwärts-Orientierung)
liegen können.
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Die
umcodierte Aktivierungsdomäne
kann in Zusammenhang mit dem außerhalb
des Leserahmens gelegenen Reporter-Gen verwendet werden, um Clone
auszuwählen,
die den Leserahmen des Reporter-Gens wiederherstellen. Wenn zum
Beispiel das lacZ-Gen zunächst
außerhalb
des Leserahmens mit Bezug auf den ATG-Anfang des umcodierten Teils
der Aktivierungsdomäne
liegt, dann werden Clone, die den Leserahmen zwischen dem ATG und
dem lacZ-Gen wiederherstellen, Proteinfusionen dieses Clons mit
dem lacZ-Genprodukt erzeugen. Fusionen, welche die βgal-Aktivität wiederherstellen,
können
danach ausgewählt
werden, ob sie chromogen sind, wobei gut bekannte Farbstoffe (z.B.
Xgal) verwendet werden, oder auch selektive Wachstumsmedien, die
Lactose als die einzige Kohlenstoffquelle enthalten.
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In
dem System zur Clonierung des offenen Leserahmens kann ein Suppressor-Terminations-Codon von
E. coli (zum Beispiel ein TAG-Amber-Terminations-Codon) zwischen
dem Füllfragment
und dem Reporter-Gen codiert werden, sodass durch die phänotypische
Unterdrückung
der E. coli-Wirtsstämme
das Stopp-Codon durch ein Suppressor-tRNA-Molekül unterdrückt wird, das eine spezifische
Aminosäure
einführt. In
nicht unterdrückenden
Wirtszellen, in denen der Interaktionstest durchgeführt wird,
würde die
Terminierung der Proteintranslation am Terminations-Codon stattfinden.
Der Vorteil, dieses unterdrückbare
System zu besitzen, liegt darin, dass das Reporter-Protein des offenen
Leserahmens nicht an das Carboxyl-Ende des codierten Hybridproteins
aus Füllfragment-Aktivierungsdomäne fusioniert
sein wird.
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Die
Wirtszelle ist eine Hefezelle, vorzugsweise Saccharomyces cerevisiae.
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Das
Köder-Protein
kann von einem Bakterienprotein, einem Virusprotein, einem durch
ein Oncogen codierten Protein, einen Wachstumsfaktor oder einem
Enzym abgeleitet sein. Köder-Proteine
können
von jedem Protein gewählt
werden, von dem eine diagnostische oder therapeutische Bedeutung
bekannt ist oder vermutet wird. Bevorzugte Köder-Proteine schließen Oncoproteine
ein (wie z.B. myc, ras, src, fos) oder jedes andere Protein, das
in der Regulierung des Zellzyklus involviert ist (wie z.B. Kinasen,
Phosphatasen).
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Beute-Proteine
können
in einer Bibliothek von Plasmiden codiert werden, die DNA-Insertionen
enthalten, die von einer genomischen DNA, cDNA oder von synthetisch
erzeugten DNA-Sequenzen abgeleitet sind und die an die DNA-Sequenz fusioniert
sind, welche die zweite Aminosäure-Domäne codiert.
Die cDNAs können
von jeder mRNA-Population konstruiert werden und sie können in
einen entsprechenden Expressionsvektor eingeführt werden. Eine solche Bibliothek
der Wahl kann de novo aufgebaut werden, wobei im Handel erhältliche
Kits (zum Beispiel von Stratagene, La Jolla, CA) verwendet werden
oder gut etablierte präparative Verfahren
(zum Beispiel Current Protocols in Molecular Biology, New York,
John Wiley & Söhne, 1987)
verwendet werden. In einer anderen Ausführungsform kann eine im Handel
erhältliche
cDNA-Bibliothek verwendet werden. Ein Beute-Protein kann durch eine
synthetische Sequenz codiert werden oder es kann das Produkt eines
zufällig
erzeugten offenen Leserahmens oder eines Teils davon sein.
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Jedes
geeignete Reporter-Gen wie zum Beispiel das LEU2-Gen oder das lacZ-Gen kann verwendet werden.
Beispiele von anderen nützlichen
Genen, deren Transkription nachgewiesen werden kann, schließen biosynthetische
Gene von Aminosäuren
und Nucleinsäuren
wie z.B. Hefe-HIS3, URA3 und LYS2, GLA1, E. coli-galK, GFP, CUP1
und CAT, GUS, Resistenz gegen Antibiotika und jedes Gen ein, das
ein Zelloberflächen-Antigen
codiert, für
das Antikörper
erhältlich
sind.
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Der
Fachmann wird ebenfalls erkennen, dass die Komponenten des Reporter-Gens, der DNA-bindenden
Domäne
und der Gen-Aktivierungsdomäne
von jedem geeigneten eukaryontischen oder prokaryontischen Zellgenom
oder von cDNAs sowie von künstlichen
Sequenzen abgeleitet sein kann.
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Plasmid-Konstrukte,
Transformation, Transfektion, Zellkultur und der Nachweis der Transkription
kann durch jedes Verfahren, das auf dem Fachgebiet bekannt ist,
wie zum Beispiel das US-Patent Nr. 5,283,173 und WO 94/10300, durchgeführt werden.
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Jedes
Mittel zur Einführung
von Genen in die Wirtszellen kann verwendet werden, wie zum Beispiel die
Elektroporation, Transfektion, Transformation oder Paarung.
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Die
Vorteile der beschriebenen Erfindung schließen eine erhöhte Effizienz
durch die Eliminierung einer weiteren Analyse von promiskuitiven
Proteinen in den Array-Bibliotheken,
die Erzeugung eines Mittels, um funktionell Klassen von Proteinen
von den Bibliotheken zu entfernen, die Eliminierung einer weiteren
Analyse von Clonen, die nicht in einem spezifischen Leserahmen liegen,
die verminderte Arbeit im Vergleich zu den derzeitig verwendeten
Verfahren, die Wiederverwendung der Primär-Bibliotheken der angeordneten
Master-Bibliothekssätze
und das angesammelte Wissen über
den Zeitverlauf des Aufbaus der angeordneten Clone ein.
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Die
Erfindung kann durch die nachfolgenden Beispiele, die nicht einschränkend sein
sollen, dargestellt werden.
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Beispiel 1
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Paarung in flüssiger Masse, funktionell verkleinerte
Hefe-Zwei-Hybrid-Test
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Enzyme
der Restriktion und der DNA-Modifikation wurden von verschiedenen
Herstellern erworben und wurden gemäß deren Empfehlungen verwendet.
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Erzeugung
von angeordneten cDNA-Bibliotheken (1). E. coli-cDNA-Bibliotheken wurden
von Invitrogen erworben und wurden mit einer niedrigen Dichte (etwa
1000 Clone pro Platte) auf LB + Amp-Platten ausplattiert und für 1–2 Tage
bei 37°C
inkubiert. Anschließend
wurden 3–4
ml LB-Medium (das 15% Glycerin enthielt) zu jeder Platte zugegeben,
die Platte wurde auf einem Plattform-Schüttler bei einer niedrigen Geschwindigkeit
geschüttelt
und das LB-Medium wurde geerntet, nachdem die Resuspendierung der
Kolonien in das LB-Medium offensichtlich war. Ein 200 μl großer Anteil
der resuspendierten Zellen wurde für eine Isolierung der Plasmid-DNA
entfernt und die übrigen
Zellen wurden als Archiv für
eine langfristige Lagerung bei –80°C eingefroren.
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Die
Plasmid-DNA wurde durch ein Kit, das von Qiagen erhalten wurde,
isoliert. Zweihundertfünfzig (250) μl P2-Lösung (Qiagen)
wurden zu dem 200 μl
großen
Anteil der Zellen in ein 2 ml-Eppendorf-Zentrifugenröhrchen zugegeben.
Die beiden Lösungen
wurden vorsichtig gemischt und anschließend wurden 250 μl P3-Lösung (Qiagen)
zugegeben und das Röhrchen
wurde geschüttelt.
Das Gemisch wurde anschließend
mit einer hohen Geschwindigkeit (14.000 UpM) in einer Eppendorf-Zentrifuge zentrifugiert.
Der geklärte Überstand (500 μl) wurde
in ein neues Eppendorf-Zentrifugenröhrchen mit einer Pipette gegeben
und 1 ml Ethanol wurde zugegeben, um die DNA zu präzipitieren.
Die präzipitierte
DNA wurde bei hoher Geschwindigkeit (14.000 UpM) für 15 Minuten
pelletiert, die Ethanol-Lösung
wurde abgegossen und das Pellet wurde im Vakuum getrocknet. Das
Pellet wurde in 50 μl
destilliertem H2O resuspendiert und direkt
verwendet, um die Hefe zu transformieren.
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Die
Hefe wurde transformiert, wobei das EZ-Hefe-Transformations-Kit
(Zymo Research) gemäß der Anweisungen
des Herstellers verwendet wurde, wobei 2,5 μl DNA, 25 μl kompetenter Hefestamm EGY48
und 250 ml EZ3 verwendet wurden. Die transformierten Hefezellen
wurden für
1 h bei 30°C
inkubiert und die gesamte Menge wurde auf SD – trp-Agarplatten ausplattiert.
Die Platten wurden für
weitere 3–4
Tage bei 30°C inkubiert
und die Zellen wurden wie für
E. coli geerntet, wobei 3–4
ml SD – trp
+ 15% Glycerin verwendet wurden. Die geernteten Hefezellen von jeder
Platte wurden getrennt in Aliquots in verschiedenen Vertiefungen
von Platten mit 96 tiefen Vertiefungen aufgeteilt (die "Master-Bibliotheksplatten") und bei –80°C für eine langfristige Lagerung
eingefroren.
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Flüssigpaarung
von Hefezellen (2). 100 μl SD – trp oder SGal-trp wurden
mit fünf μl von jeder
Vertiefung der Hefe-Master-Bibliothek in einer Platte mit 96 Vertiefungen
beimpft und man ließ sie übernacht
bei 30°C
wachsen. Fünf μl von jeder
Vertiefung wurden in eine neue "Paarungsplatte" mit 96 Vertiefungen übertragen.
Ein 5 μl-Aliquot
einer Köder-Kultur
(OD600 = 1,0) wurde gemeinsam mit 10 μl YPD-Medium
zu jeder Vertiefung zugegeben. Die Paarungsplatten wurden in eine
wiederverschließbare
Plastiktüte
gegeben und für 12–36 h bei
30°C inkubiert.
Jede Vertiefung wurde anschließend
zweimal nacheinander 10fach verdünnt
(Endverdünnung
100fach), wobei S-min (–leu, –his, –trp, –ura, +gal,
+raff) bis zu einem Endvolumen von 110 μl verwendet wurde. In einer
anderen Ausführungsform
wurde jede Vertiefung anschließend
1:10 in S-min verdünnt, bei
30°C für zwei Tage
inkubiert und anschließend
1:40 in S-min verdünnt
(Endverdünnung
400fach). Die verdünnten
Paare wurden anschließend
für zusätzliche
5–10 Tage
bei 30°C
inkubiert. Zehn μl
der gepaarten Vertiefungen wurden anschließend auf einen zweiten Satz
von Platten übertragen,
bevor die βGal-Analyse
durchgeführt
wurde (diese gepaarten und ausgewachsenen 10 μl-Vorratslösungen ("Rettungsplatten") wurden später zur Rettung der positiven
Clone verwendet).
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βGal-Analyse.
Die Zellen wurden durch die Zugabe von 100 μl einer Lösung des Z-Puffers [Na2HPO4 (16,1 g l–1),
NaH2PO4 (5,5 g l–1),
KCl (0,75 g l–1)
und MgSO4 (0,25 g l–1),
auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt und steril autoklaviert],
der Oxalyticase (100 E ml–1), SDS (0,1%) und CPRG-Substrat
(2 mg ml–1)
enthielt, lysiert. Die Platten wurden bei Raumtemperatur inkubiert,
bis sich das rote chromogene βGal-Substrat
entwickelt hatte (im Allgemeinen 10 min bis 2 h). Für eine quantitative
Messung der Vertiefungen war es notwendig, dass die Zelltrümmer entweder
durch Zentrifugation oder Filtrierung entfernt wurden. Das CPRG-Substrat
kann bei einem Absorptionsvermögen
von 575 Angstrom gemessen werden. In einer anderen Ausführungsform
wurde die β-Gal-Aktivität unter
Verwendung eines chemilumineszierenden Substrats gemessen. Das Tropix
Galacton Plus-Kit wurde für
diesen Zweck verwendet. Fünfundzwanzig
Mikroliter von jeder Analysen-Vertiefung wurden in die entsprechenden
Vertiefungen von Lumineszenz-Platten mit 96-Vertiefungen überführt. Fünfundzwanzig Mikroliter CL
Reaction-Puffer (Z-Puffer, der 0,2% Igepal CA-630, 100 E/ml Oxalyticase
und 1% Galacton Plus enthielt) wurden zu jeder Vertiefung zugegeben
und die Platten wurden übernacht
bei Raumtemperatur inkubiert. Fünfzig
Mikroliter Accelerator II (1:1 mit 0,1 M Na2CO3/NaHCO3, pH 10,5,
verdünnt)
wurden zu jeder Vertiefung zugegeben und die Platten wurden für 5 Minuten
inkubiert. Die Chemilumineszenz wurde anschließend in einem Luminometer mit
96 Vertiefungen gemessen.
-
Test
der Sensitivität
der Vereinigung. Ein Test der Paarungsstrategie in einer vereinten
Flüssigkeit
wurde durchgeführt,
wobei die bekannten starken Y2H-Interactor
RPB4 (Hefe-PolII-Untereinheit) und RPB7 (Hefe-PolII-Untereinheit)
als Kontrollen verwendet wurden. Die RPB4-Untereinheit wurde in
den Aktivierungsdomäne-Vektor
pJG4.5 subcloniert. Die rekombinante RPB4-Fusion wurde in den DNA-bindende
Domänen-Vektor
pEG202 subcloniert, in den Beute- Stamm
transformiert und mit verschiedenen prozentualen Anteilen (von 0
bis 100%) mit dem gleichen Beute-Stamm, der den pJG4.5-Eltern-Vektor
enthält,
gemischt.
-
Die
Ergebnisse (gezeigt in 3) zeigen,
dass wir in der Lage waren, den Beute-Stamm für diese Interaktion wiederzugewinnen,
auch wenn die Beute ursprünglich
etwa 0,1% des Beute-"Paarungsgemisches" darstellte. Die
Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine etwa 100fache Verdünnung des
komplexen YPD-Mediums
benötigt
werden kann, um das differenzierte Wachstum der positiv interagierenden
Paare zu beobachten. Die Verdünnung
der Proben, um die Konzentration des YPG-Komplexes zu vermindern,
kann gegenüber anderen
Verfahren wie z.B. der Zentrifugation oder Filtration bevorzugt
werden. Der Grund hierfür
ist, dass eine Verdünnung
kostengünstiger,
schneller und einfacher für
eine Automatisierung ist. Die βGal-Analyse
des Tests der Aktivierung des Reporters im Format einer vereinten
Mikrotiterplatte zeigte keinen deutlichen Unterschied zwischen einer
0,1 und 100% rekombinanten Fusion bei einer 100fachen Verdünnung. Bei
höheren
Verdünnungen
erfolgte eine Streuung der βGal-Aktivität. Es kann
sein, dass bei höheren
Verdünnungen
(von Vereinigungen mit einem niedrigen prozentualen Anteil) die
Probeentnahme der positiven Interaktoren verloren geht.
-
Test
der vereinten, angeordneten cDNA-Bibliotheken. In dem ersten Test
des angeordneten cDNA-Bibliotheken-Experiments wurden die nucleären Rezeptoren
RXR und LXRa gegen ca. 6 × 105 cDNAs in 6 Mikrotiterplatten getestet.
Die meisten der cDNAs stammten von im Handel erhältlichen cDNA-Bibliotheken,
die von der menschlichen fötalen
Leber (Invitrogen A202-01) und dem menschlichen fötalen Gehirn
(Invitrogen A212-01) abgeleitet wurden.
-
Die
cDNA enthaltenden Clone wurden mit etwa 1 × 103 Clone
pro Vertiefung ausgesät.
Kurz zusammengefasst, der Köder-Stamm
(der das Zielprotein enthält,
in diesem Fall entweder RXR oder LXRa) wurde zu den Clonen der cDNA-Bibliothek
in die Vertiefungen zugegeben und man ließ die Paarung in einem Komplex-Medium
fortfahren. Die Paarungsgemische wurden mit Minimal-Medium (–Leucin)
verdünnt
und man ließ das
Wachstum der Interaktoren über
einen Zeitraum von 5 oder mehr Tagen stattfinden (wobei das Wachstum eine
erfolgreiche Interaktion anzeigte). Die βGal-Tests wurden anschließend in
den Vertiefungen durchgeführt (vergl.
Beispiel, 2) und die Clone von 10 Vertiefungen,
die eine deutliche βGal-Aktivität zeigten,
wurden durch das Ausstreichen eines Aliquots der Vertiefung der
Bibliothek auf ein festes Minimal-Medium (–Leucin) erneut isoliert. Die
Plasmide wurden von solchen Clonen isoliert und der Analyse der
DNA-Sequenz und der Bioinformatik unterzogen. Die Ergebnisse werden
nachfolgend in Tabelle 1 gezeigt.
-
Einige
der sequenzierten Clone wurden durch die traditionelle Y2H-Analyse
gefunden. Diese schließen
TRIP6 (Thyroid-Rezeptor interagierendes Protein 6) ein, das zuvor
in der Literatur von anderen "Standard"-Interaktionsfallen-Experimenten
gegen andere nucleäre
Rezeptoren (es wurde noch nicht gegen LXRa getestet) und TIF1 beschrieben
wurde. Wir glauben, dass diese wahre Positive darstellen. Die anderen
Clone, beide codieren ein GCN5-Homolog, wurden zweimal isoliert
(in zwei verschiedenen Vertiefungen). Wir wissen noch nicht, ob
das GCN5-Homolog richtig positiv oder falsch positiv ist.
-
Man
hat herausgefunden, dass ungefähr
ein Drittel der interagierenden Clone eine Homologie zu cDNAs in
den Datenbanken Incyte oder GenBank besitzen, aber keine zugeschriebene
Funktion besitzen.
-
Von
mehreren Clonen scheint bekannt zu sein, dass sie promiskuitiv Positive
in den Interaktionsfallen-Experimenten sind (nämlich Cofilin und die Hitzeschock-Proteine). Da nun
bekannt ist, in welchen Vertiefungen sie liegen, bedeutet dies,
dass sie von der weiteren Analyse ausgeschlossen werden können. Es
sollte jedoch beachtet werden, dass, wenn diese Vertiefungen ausgeschlossen
werden, ebenfalls Informationen von anderen Clonen in dieser Vertiefung
verloren gehen. Wenn zum Beispiel RXR als ein Köder verwendet wird, haben wir
eine Interaktion mit dem Thymopoietin verwandten Protein in der
Vertiefung 1D9 beobachtet. Wenn mit LXRa abgesucht wurde, wurde
jedoch in der gleichen Vertiefung eine positive Interaktion mit
dem promiskuitiv positiven HSP90 beobachtet. Man kann hoffen, dass
eventuell eine Bibliothek von cDNAs, die groß genug ist, verwendet wird,
um eine Redundanz bei der Analyse der Bibliothek zu erhalten. Tabelle
1 Ergebnisse der Y2H-Analyse
- a Allgemein bekannt
positiv in anderen Y2H-Absuchungen (E. Golemis).
- b Kein Kommentar zu Genbank-Datenbank
spezifischer Sequenz gefunden.
- c Von diesem Protein ist bekannt, dass
es mit mehreren anderen nucleären
Rezeptoren interagiert.
- d GCN5 besitzt eine Histon-Acetyltransferase
(HAT)-Aktivität.
- e Das Protein wurde ebenfalls unter
Verwendung eines traditionellen Zwei-Hybrid-Verfahrens isoliert.
-
Beispiel 2
-
Strategie zur Clonierung des
offenen Leserahmens
-
Clonierung des offenen Leserahmens und
Verwendung der Unterdrückung
zur Kontrolle der 3'-Genfusion
-
Eine
zufällig
gescherte cDNA mit einer Länge
von etwa 600 Basenpaaren wurde isoliert und in ein βgal-Gen mit
Leserahmenverschiebung cloniert (5a). Transformierte
E. coli-Zellen, die βgal+ wurden, enthielten einen offenen Leserahmen.
In einem Vektor mit einem Amber-Suppressor-Terminations-Codon zwischen
dem 3'-Ende der
cDNA und dem 5'-Ende
von βgal
wurde die Fusion der cDNA mit dem βgal durch den Sup-Phänotyp des
E. coli-Stamms kontrolliert (5b). Der
gleiche Typ des Clonierungsschemas kann adaptiert werden, um das
5'-Ende des M13-Phagen-Display-Proteins
mit der cDNA zu fusionieren, in diesem Fall werden lebende Phagen
eine erfolgreiche Clonierung des offenen Leserahmes anzeigen (5c).
-
Dynamische Umcodierung des 3'-Endes der Hefe-Aktivierungsdomäne.
-
Das
3'-Ende der Hefe-Aktivierungsdomäne wurde
umcodiert, um die Kontrollelemente der E. coli-Genexpression aufzunehmen. 6 ist
ein Beispiel der Umkodierung der Kontrollelemente, die für die Expression
des Bakteriophagen-T7-Proteins
benötigt
werden. Die umcodierte Hefe-Aktivierungsdomäne wurde anschließend in
Verbindung mit dem System zur Clonierung des offenen Leserahmens
verwendet, um den korrekten Leserahmen mit der Aktivierungsdomäne und gleichzeitig
mit einem getrennten 3'-Fusionsprotein
zu fusionieren (zum Beispiel βgal
oder M13gp3).
-
Die
Auswahl der cDNA-ORFs nach Phänotyp
in E. coli und deren gleichzeitige Fusion an das 3'-Ende der Hefe-Aktivierungsdomäne und dem
5'-Ende von M13gpIII
kann gemäß 7 durchgeführt werden: A. Clonierung von
zufälligen,
500 bp großen
cDNA-Fragmenten; Transformation von T7RNAP+,
Sup+ E. coli; Absuchen der Plaques; B. Phagen-Display
in E. coli; C. Hefe-Zwei-Hybrid in Hefe: Transformation von T7RNAP–, Sup+ E. coli; Transformation von M13 in Sup–-Hefe.
-
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
-
1.
Erzeugung der angeordneten cDNA-Bibliotheken. E. coli-cDNA-Bibliotheken wurden
mit einer niedrigen Dichte (etwa 1000 Kolonien pro Platte) auf LB
+ Amp ausplattiert. Anschließend
wurden 3–4
ml LB-Medium (das 15% Glycerin enthielt) zu jeder Platte zugegeben
und das LB-Medium wurde geerntet, nachdem die Resuspendierung der
Kolonien im LB-Medium offensichtlich war. Die Plasmid-DNA wurde durch ein Kit,
das von Qiagen (Valencia, CA) erhalten wurde, isoliert und direkt
verwendet, um Hefezellen zu transformieren. Die transformierten
Hefezellen wurden auf SD – trp-Agarplatten
ausplattiert. Die Platten wurden inkubiert und die Zellen wurden
wie für
E. coli geerntet, wobei 3–4
ml SD – trp
+ 15% Glycerin verwendet wurden. Die geernteten Hefezellen von jeder
Platte wurden getrennt in Aliquots in verschiedenen Vertiefungen
von Platten mit 96 tiefen Vertiefungen aufgeteilt (die "Master-Bibliotheksplatten") und bei –80°C für eine langfristige
Lagerung eingefroren.
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2.
Automatisierbares Y2H-Format. Die nachfolgenden Schritte wurden
verwendet, um eine Y2H-Analyse in einer Mikrotiterplatte durchzuführen: i)
Zugabe des Köder-Stamms
zu dem cDNA-Bibliothek-Stamm in einer Vertiefung, ii) Stattfinden
der Paarung in Komplex-Medium, iii) Verdünnung des Paarungsgemisches
in Minimal-Drop-out-Medium (–leu),
iv) Wachstum der positiv interagierenden Proteine (Wachstum als
Anzeige), v) Durchführung
der βGal-Tests
(quantitative Anzeige), vi) Sequenz (+)-Clone, Abfrage der Datenbank(en).
Legende: 1 = Master-Bibliothek; 2 = Tochter; 3 =
Zugabe des Köders
(Paarung für
24–36
h); 4 = selektives Auswachsen (Inkubation > 5 Tage); 5 =
Lagerung; 6 = βGal.
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3a und 3b.
Untersuchung der Reporter-Aktivierung in einer vereinten Vertiefung
einer Mikrotiterplatte. Ergebnisse werden als % Interaktor im Pool
von Nicht-Interaktoren ausgedrückt.
Bekannte Interaktoren werden in einem bekannten Verhältnis gemischt
und in dem flüssigen
Paarungs-Format gegen eine Köder-Fusion
getestet. X-Achse: Paarungsverdünnung;
Y-Achse: A600 oder A574. 3A:
Selektives Auswachsen nach Verdünnung
der gepaarten Hefe im Leucin-Drop-out- Medium. Fusion der Aktivierungsdomäne: pJG-scRPB4
(Hefe-PolII-Untereinheit); Fusion der DNA-bindenden Domäne: pEG-scRPB7
(Hefe-PolII-Untereinheit); 3B: βgal-Test
der Vertiefungen. Fusion der Aktivierungsdomäne: pJG-scRPB4 (Hefe-PolII-Untereinheit);
Fusion der DNA-bindenden Domäne:
pEG-scRPB7 (Hefe-PolII-Untereinheit).
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4.
Y2H-Analyse des menschlichen nucleären Rezeptors RXR, der gegen
(etwa) 88 × 104 cDNA-Clone abgesucht wurde. Jede Vertiefung
der drei gezeigten Platten mit 96 Vertiefungen stellt einen βgal-Test
dar, die mit einem pEG202-RXR-Köder-Plasmid
enthaltenen Hefestamm, der mit etwa 1000 Hefe-Clone einer pJG4.5
AD-Bibliothek gepaart wurde, durchgeführt wurde. Die acht Vertiefungen
am linken Rand jeder Platte sind positive und negative Kontrollen
(von oben nach unten auf der Platte); a) pEG202 × pjGRXR, b) pEG202, c) pEGKREV1 × pjGRAF,
d) pEGKREV1 × pJGKRIT1,
e) pEGRAS × pJGKRIT1,
f) pEGRAS × pJGRAF,
g) pEGRXR × pJGGOR4
und h) pEGGOR4 × pJGRXR.
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5. Strategie zur Clonierung des offenen
Leserahmens. Clonierung des offenen Leserahmens. A. Fusion der Leserahmenverschiebung
mit βgal+. Eine zufällig gescherte cDNA mit einer
Größe von etwa
600 Basenpaaren wurde isoliert und in ein βgal-Gen mit Leserahmenverschiebung
cloniert. Transformierte E. coli-Zellen,
die βgal+ wurden, enthielten einen offenen Leserahmen.
B. Fusion der Leserahmenverschiebung mit βgal+ in
einem Sup+-Wirt. In einem Vektor mit einem
Amber-Suppressor-Terminations-Codon zwischen dem 3'-Ende der cDNA und
dem 5'-Ende von βgal wurde
die Fusion der cDNA mit dem βgal
durch den Sup-Phänotyp
des E. coli-Stamms kontrolliert. C. Die Fusion der Leserahmenverschiebung
mit M13gpIII in einem Sup+-Wirt. Der gleiche
Typ des Clonierungsschemas kann adaptiert werden, um das 5'-Ende des M13-Phagen-Display-Proteins
mit der cDNA zu fusionieren, in diesem Fall werden lebende Phagen
die erfolgreiche Clonierung des offenen Leserahmens anzeigen.
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6.
Dynamische Umcodierung der 3'-Hefe-Aktivierungsdomäne. Translation
der T7-Kontrollelemente (T7CE). Das 3'-Ende der Hefe-Aktivierungsdomäne (AD)
wurde umcodiert, um die Kontrollelemente für die Genexpression in E. coli aufzunehmen.
Gezeigt wird ein Beispiel der Umcodierung der Kontrollelemente, die
für die
Expression des Bakteriophagen-T7-Proteins benötigt wird. Die umcodierte Hefe-Aktivierungsdomäne wurde
anschließend
in Verbindung mit dem System zur Clonierung des offenen Leserahmens
verwendet, um den korrekten Leserahmen mit der Aktivierungsdomäne und gleichzeitig
mit einem getrennten 3'-Fusionsprotein
(zum Beispiel βgal
oder M13gp3) zu fusionieren. Legende: 1 = Hefe; 2 =
cDNA-Insertion; 3 =
Leserahmenverschiebung.
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7. Phänotypische
Auswahl der offene Leserahmen-cDNA in E. coli und deren gleichzeitige
Fusion an das 3'-Ende
der Hefe-Aktivierungsdomäne
(AD) und dem 5'-Ende
von M13gpIII. A. Clonierung von zufälligen, 500 bp großen cDNA-Fragmenten; Transformation
von T7RNAP+, Sup+ E.
coli; Absuchen der Plaques; B. Phagen-Display in E. coli; C. Hefe-Zwei-Hybrid
in Hefe: Transformation von T7RNAP-Sup+ E. coli;
Transformation von M13 in Sup–-Hefe. Legende: 1 =
Hefe; 2 = Insertionsstelle; 3 = Leserahmenverschiebung.
