-
Proteine
sind in Funktionseinheiten translatierte Genomsequenzinformationen,
die biologische Prozesse ermöglichen.
Anfängliche
Versuche, das große
und komplexe menschliche Genom zu sequenzieren, zielten absichtlich
auf exprimierte Regionen, wie sie die cDNA-Repertoires darstellen
(Adams et al., Nature 377 (1995), 35–174S). In der Zwischenzeit
wurden für
die meisten menschlichen Gene exprimierte Sequenz-Tags (ESTs) in
die Nukleotiddatenbanken eingespeist (Wolfsberg et al., Nucl. Acids
Res. 25 (1997), 1626–1632). Bislang
wurde jedoch nur einer Minderheit dieser Sequenzen eine Funktion
zugeordnet (Strachan et al., Nature Genet. 16 (1997), 126–132). Die
direkteste Lösung
dieser Diskrepanz zwischen Struktur und Funktion scheint die direkte
Korrelation zwischen dem Funktionsstatus eines Gewebes und der Expression
bestimmter Gensets zu sein. Die Technologie zur Erreichung dieses
Ziels auf verschiedenen Ebenen der Genexpression ist heute verfügbar. Auf
der Transkriptionsebene wurden Genexpressionsmuster durch Hybridisierung
komplexer Sonden (DeRisi et al., Science 278 (1997), 680–686; Schena
et al., Science 270 (1995), 467–470;
Bernard et al., Nucl. Acids Res. 24 (1997), 1435–1442; Mallo et al., Int. J.
Cancer 74 (1997), 35–44)
oder Sets kurzer Oligonukleotide (Velculescu et al., Science 270
(1995), 484–487)
in cDNA-Anordnungen, den SAGE-Sequenzierungsansatz (Wodicka et al.,
Nature Biotechnol. 15 (1997), 1359–1367) oder Hybridisierung
in Oligonukleotidanordnungen (Maier et al., Drug Discovery Today
2 (1997), 315–324)
analysiert.
-
Auf
der Translationsebene erfolgte eine hochauflösende Kartierung von Proteinextrakten
auf zweidimensionalen Gelen (Klose et al., Electrophoresis 16 (1995),
1034–1059).
Anschließend
wurde die massenspektrometrische Analyse von Proteinspots angewendet,
um Sequenzinformationen zu erhalten. (Clauser et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 92 (1995), 5072–5076).
Leffers et al. beschrieben die klonale cDNA-Expression in Säugetierzellen
und den Abgleich der Proteinprodukte mit zweidimensionalen Elektrophoresemustern
von Zellproteinen (Leffers et al., Electrophoresis 17 (1996), 1713–1719).
Gepoolte Klone einer geordneten cDNA-Bibliothek wurden durch in
vitro-Transkription/Translation exprimiert und mittels zweidimensionaler
Elektrophorese analysiert (Lefkovits et al., Appl. Theor. Electrophor.
5 (1995), 35–42;
Behar et al., Appl. Theor. Electrophor. 5 (1995), 99–105; Lefkovits
et al., Appl. Theor. Electrophor. 5 (1995), 43–47. Lehrach et al. (Nucl. Acids
Res. 38 (1998), 8) beschrieben Anordnungen von Klonen von cDNA-Bibliotheken
auf Hochdichtefiltergittern. Lehrach et al. lehren jedoch nicht
die Verwendung von Bibliotheken von Fusionsproteinen, wie sie in der
vorliegenden Erfindung erforderlich sind, bzw. weisen nicht darauf
hin. Herstellung und Screening von Fusionsproteinbibliotheken wurden
von Ikeda et al. (Gene 181, (1996) 167–171) beschrieben. Ikeda et
al. beschreiben jedoch keine in Gitterform angeordneten Klone oder
Proteine bzw. weisen nicht darauf hin.
-
Bislang
ist keine Technik verfügbar,
mit der man auf der Ebene des gesamten Genoms direkt von der DNA-Sequenzinformation
auf einzelnen Klonen zu Proteinprodukten und wieder zurück gelangen
kann. Ein solches Verfahren wäre
insbesondere für
die Analyse biologischen Materials im großtechnischen Maßstab wichtig.
-
Die
für die
Analyse eines solchen Materials im großtechnischen Maßstab erwogenen
Verfahren aus dem Stand der Technik sind recht umständlich und
zeitaufwendig und liefern außerdem
grundsätzlich
eine unangemessen große
Anzahl an falschpositiven Klonen. Dementsprechend war das der vorliegenden
Erfindung zugrunde liegende technische Problem die Bereitstellung
eines Verfahrens, das die zuvor genannten Probleme überwindet
und insbesondere die Anzahl der falschpositiven Klone in Bibliotheken-Screenings
vor allem auf der Ebene der Säugetiergenome
signifikant reduziert. Die Lösung
des technischen Problems wird durch Bereitstellung der in den Ansprüchen charakterisierten
Ausführungsformen
erreicht.
-
Zusammenfassung
der Erfindung
-
Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein neuartiges Verfahren
zur Identifizierung und/oder Charakterisierung von Klonen, die eine
gewünschte
biologische Eigenschaft von einer Expressionsbibliothek verleihen.
Das erfindungsgemäße Verfahren
umfasst den Schritt des Analysierens auf die Expression mindestens eines
(Poly)peptids, z.B. eines als Fusionsprotein exprimierten Tags,
zusammen mit einem rekombinanten Insert eines Klons der Expressionsbibliothek,
wobei die Klone der Expressionsbibliothek in einer Anordnung arrangiert
sind. Das (Poly)peptid kann an seinem N- oder C-Ende mit dem Insert fusioniert sein.
Das erfindungsgemäße Verfahren
umfasst weiterhin die Schritte des Inkontaktbringens eines Liganden,
der mit einem (Poly)peptid spezifisch interagiert, das durch das
Insert eines Klons exprimiert wird, der die gewünschte biologische Eigenschaft
verleiht, mit einer ersten Kopie der in einer Anordnung arrangierten
Bibliothek von Klonen und der Analyse der Bibliothek von Klonen
auf das Vorliegen einer Interaktion, und/oder der Durchführung einer
Hybridisierung oder eines Oligonukleotid-Fingerprints mittels einer
für das
Insert eines Klons, der die gewünschte
biologische Eigenschaft verleiht, spezifischen Nukleinsäuresonde,
mit einer zweiten Kopie der in einer Anordnung arrangierten Bibliothek
von Klonen sowie der Analyse der Bibliothek von Klonen auf das Vorliegen
einer spezifischen Hybridisierung. Schließlich erfordert das erfindungsgemäße Verfahren
die Identifizierung von Klonen, wobei eine Expression des mindestens
einen (Poly)peptids in Schritt (a) und/oder eine Interaktion in
Schritt (b) und/oder eine Hybridisierung oder ein Oligonukleotid-Fingerprint
in Schritt (c) nachgewiesen werden kann. Die vorliegende Erfindung
bezieht sich außerdem
auf ein für
die Durchführung
des erfindungsgemäßen Verfahrens
nützliches
Kit.
-
Detaillierte
Beschreibung der Erfindung
-
Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Identifizierung
und/oder Charakterisierung von Klonen einer Expressionsbibliothek,
wobei die Klone eine gewünschte
biologische Eigenschaft verleihen, umfassend die folgenden Schritte:
- (a)Analysieren auf die Expression von mindestens
einem als Fusionsprotein mit einem Expressionsprodukt eines rekombinanten
Inserts eines Klons der Expressionsbibliothek exprimierten (Poly)peptids,
wobei die Klone der Expressionsbibliothek in einer Anordnung arrangiert
sind; und
- (b)Inkontaktbringen eines Liganden, der mit einem (Poly)peptid
spezifisch interagiert, das durch das Insert eines Klons exprimiert
wird, der die gewünschte
biologische Eigenschaft verleiht, mit der Bibliothek oder einer
ersten Kopie der Bibliothek von Klonen in einer Anordnung und Analysieren
der Bibliothek von Klonen auf das Vorliegen einer Interaktion; und/oder
- (c)Durchführen
einer Hybridisierung oder eines Oligonukleotid-Fingerprints mit einer für das Insert
eines Klons, der die gewünschte
biologische Eigenschaft verleiht, spezifischen Nukleinsäuresonde
mit der Bibliothek oder einer ersten Kopie oder einer zweiten Kopie
der in einer Anordnung arrangierten Bibliothek von Klonen und Analysieren
der Bibliothek von Klonen auf das Vorliegen einer Hybridisierung;
und
- (d)Identifizieren und/oder Charakterisieren von Klonen, wobei
eine Expression des mindestens einen (Poly)peptids in Schritt (a)
und/oder eine Interaktion in Schritt (b) und/oder eine Hybridisierung
oder ein Oligonukleotid-Fingerprint
in Schritt (c) nachgewiesen werden kann.
-
Der
Begriff „rekombinantes
Insert", wie er
erfindungsgemäß verwendet
wird, bezeichnet ein Nukleinsäurefragment,
das in dem zur Herstellung der Expressionsbibliothek erzeugten Expressionsvektor
vorliegt, so dass es zusammen mit dem mindestens ein (Poly)peptid
codierenden Nukleinsäurefragment
einen offenen Leserahmen liefert, wobei die Expression des offenen
Leserahmens zu dem Fusionsprotein führt.
-
Der
Begriff „Klon
einer Expressionsbibliothek",
wie er im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet
wird, bezeichnet alle vermehrbaren, im Wesentlichen klonalen biologischen
Materialien, die rekombinantes genetisches Material enthalten und
Teil einer Expressionsbibliothek sind. Typischerweise bezieht sich
dieser Begriff auf transformierte Bakterien, kann sich jedoch auch
auf andere Transformanten oder rekombinantes Virenmaterial oder
Bakteriophagen beziehen. Der Begriff „Expressionsbibliothek" ist im Stand der
Technik geläufig
(siehe z.B. Sambrook et al., „Molecular
Cloning, A Laboratory Handbook",
2. Ausgabe (1989), CSH Press, Cold Spring Harbor, N.Y.). Vorzugsweise
kann die Expressionsbibliothek durch einen Induktor induziert werden.
Induktoren sind im Stand der Technik bekannt und schließen z.B.
IPTG ein. Im Stand der Technik sind verschiedene Arten von Expressionsbibliotheken
bekannt, die die vorliegende Erfindung allesamt umfasst. Ein bevorzugter
Bibliothekstyp ist eine durch Exon-Trapping entstandene Bibliothek
oder eine in einem Shuttle-Vektor entstandene Bibliothek, z.B. einem
Vektor, der in prokaryontischen und eukaryontischen Systemen oder
in multiplen prokaryontischen und/oder in multiplen eukaryontischen
Systemen eingesetzt werden kann. Weiterhin ist bekannt, dass Expressionsbibliotheken
aus einer großen
Vielfalt an Quellen erstellt werden können. Die vorliegende Erfindung
sieht die Verwendung aller Quellen für das zuvor genannte Verfahren
vor. Solche Quellen können
z.B. Säugetier- oder andere eukaryontische
Zellen, Gewebe, Bakterien, andere Mikroorganismen, Pflanzen, Hefe,
Blut oder Zelllinien sein.
-
Der
Begriff „gewünschte biologische
Eigenschaft" soll
funktionelle sowie nicht-funktionelle biologische Eigenschaften
wie z.B. Struktureigenschaften umfassen. Funktionelle Eigenschaften
können
z.B. Bindungseigenschaften sein, wie sie Antikörper oder Fragmente oder Derivate
davon verleihen. Alternativ können
sich funktionelle Eigenschaften auf den Umsatz von Targetmolekülen beziehen,
wie er z.B. durch Enzymaktivitäten bereitgestellt
wird. Andererseits können
sich nicht-funktionelle Eigenschaften auf die Primärstruktur
einer Nukleinsäure
beziehen, die beispielsweise durch Nukleinsäurehybridisierung nachgewiesen
werden kann.
-
Der
Begriff „(Poly)peptid" bezieht sich sowohl
auf Peptide als auch auf Polypeptide, die natürlich vorkommen oder rekombinant
sind, chemisch oder anderweitig hergestellt oder modifiziert werden,
die dreidimensionale Struktur von Proteinen annehmen und posttranslational
verarbeitet werden können,
wahlweise auf im Wesentlichen dieselbe Weise wie native Proteine.
-
Der
Begriff „Fusionsprotein" bezeichnet alle
Polypeptide, die aus mindestens zwei (Poly)peptiden bestehen oder
diese umfassen, die auf natürliche
Weise kein solches Polypeptid bilden. Auf der DNA-Ebene werden zwei
oder mehr Codiersequenzen im Rahmen fusioniert.
-
Der
Begriff „Anordnung", wie er hierin verwendet
wird, bezieht sich auf alle regelmäßigen oder unregelmäßigen replizierbaren
Formen. Regelmäßige Formen,
insbesondere Hochdichtegitter, wie sie z.B. in Lehrach et al., Interdisciplinary
Science Reviews 22 (1997), 37–44
beschrieben sind, werden bevorzugt.
-
Der
Begriff „Ligand", wie er hierin verwendet
wird, umfasst alle Arten von Molekülen, die aufgrund ihrer dreidimensionalen
Struktur mit einem gewünschten
(Poly)peptid spezifisch interagieren können. Je nach der dreidimensionalen
Struktur kann der Ligand auch nicht-spezifisch mit durch die rekombinanten
Inserts exprimierten (Poly)peptiden interagieren. Ein typisches
Beispiel für
einen Liganden ist ein Antikörper
oder ein anderer Rezeptor wie z.B. ein Hormonrezeptor. Ein typisches
Beispiel für
eine nichtspezifische Interaktion eines Antikörpers ist eine Kreuzreaktion.
-
Der
Begriff „Hybridisierung" mit einer Nukleinsäuresonde
bezieht sich auf eine spezifische oder nicht-spezifische Hybridisierung.
Ob eine Hybridisierung spezifisch oder nichtspezifisch ist, hängt von
den Stringenzbedingungen ab, wie im Stand der Technik bekannt. Der
Begriff „spezifische
Hybridisierung" bezieht sich
auf stringente Bedingungen. Solche Hybridisierungsbedingungen können gemäß den in
Sambrook, „Molecular
Cloning, A Laboratory Handbook",
2. Ausgabe (1989), CSH Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Ausubel, „Current
Protocols in Molecular Biology",
Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989); oder
Higgins und Hames (Hrsg.) „Nucleic
acid hybridization, a practical approach" IRL Press Oxford, Washington DC (1985)
beschriebenen herkömmlichen
Protokollen hergestellt werden. Ein Beispiel für spezifische Hybridisierungsbedingungen
ist die Hybridisierung in 4 × SSC
und 0,1% SDS bei 65° C
mit anschließendem
Waschen in 0,1 × SSC,
0,1% SDS bei 65° C.
Alternativ sind stringente Hybridisierungsbedingungen z.B. 50% Formamid,
4 × SSC
bei 42° C.
Nicht-spezifische Bedingungen beziehen sich z.B. auf eine Hybridisierung
in 4 × SSC,
1% SDS bei 50° C
und Waschen unter denselben Bedingungen.
-
Erfindungsgemäß können Schritt
(b) und/oder Schritt (c) mit der Bibliothek und/oder einer ersten
Kopie und/oder einer zweiten und/oder einer weiteren Kopie der Bibliothek
durchgeführt
werden. Wird die Bibliothek oder die erste, zweite oder weitere
Kopie in zwei verschiedenen Schritten verwendet, können alle
in Schritt (a) und/oder (b) zugegebenen Materialien, die die nachfolgenden
Schritte stören
könnten,
vor Durchführung
des nachfolgenden Schrittes wahlweise entfernt werden, vorzugsweise
gemäß herkömmlicher
Protokolle.
-
Der
Begriff „Klonidentifizierung" umfasst alle Arten
von Identifizierungsschritten, die sich für die Identifizierung des Klons
von Interesse eignen. Klone können
z.B. mittels optischer Mittel identifiziert werden, wenn z.B. das
als Fusionsprotein mit dem rekombinanten Insert exprimierte (Poly)peptid
grünfluoreszierendes
Protein ist und der Ligand oder die Sonde mit einer optisch erkennbaren
Markierung markiert ist, z.B. alkalischer Phosphatase, Meerrettich-Peroxidase oder FITC.
Weiterhin können
positive Klone durch die im Stand der Technik bekannte Blau/Weiß-Selektion
identifiziert werden. Alternativ kann die Einwirkung eines Röntgenfilms bei
der Identifizierung des gewünschten
Klons helfen, wenn die Nukleinsäuresonde
radioaktiv markiert ist. Die Klone können auch mittels Massenspektrometrie
identifiziert werden.
-
Der
Begriff „Oligonukleotid-Fingerprint" beschreibt die Erzeugung
eines durch Analyse des Hybridisierungsmusters (Hybridisierung/keine
Hybridisierung) – erhalten
durch Hybridisierung einer Reihe von Oligonukleotiden mit der Nukleinsäure, vorzugsweise
DNA – gewonnenen
sequenzabhängigen, reproduzierbaren,
statistisch signifikanten Sequenzmusters oder -fingerprints.
-
Das
erfindungsgemäße Verfahren
weist signifikante Vorteile gegenüber Verfahren aus dem Stand
der Technik auf und eignet sich besonders für die effiziente Analyse von
Säugetier- und/oder Pflanzen-
und/oder anderen eukaryontischen Genomen, kann jedoch natürlich auch
auf die Analyse anderer Expressionsbibliotheken angewandt werden,
z.B. genomischer DNA-Expressionsbibliotheken von prokaryontischen
oder anderen Mikroorganismen. Dieses neue Verfahren reduziert das
Hintergrundrauschen falsch-positiver Klone beim Durchsuchen der
Expressionsbibliotheken signifikant. Insbesondere beim Durchsuchen
einer oder mehrerer Bibliotheken nach einer großen Anzahl von Klonen kann
die zeitaufwendige Arbeit der Identifizierung von Klonen, die sich
schließlich
als die gewünschten
biologischen Eigenschaften nicht besitzend erweisen, vermieden werden.
Dies führt
natürlich
auch zu einer signifikanten Reduktion des Kostenfaktors bei der
Genom- und/oder Proteomanalyse.
Ein weiterer besonderer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist,
dass der Wissenschaftler beim Durchsuchen seiner Bibliothek nach
den gewünschten
Klonen die Wahl hat, zwischen einer Nukleinsäuresonde und einem Liganden
zu wählen.
Die Kombination der Schritte (a), (b) und (c) verbessert die Zuverlässigkeit
des erfindungsgemäßen Verfahrens
bei der Identifizierung der tatsächlich
gewünschten
Klone weiter. Überraschenderweise
konnte erfindungsgemäß gezeigt
werden, dass das nachweisbare (Poly)peptid selbst nach dem ursprünglichen
Spotten der Transformanten in einer Anordnung und dem nachfolgenden
Koloniewachstum ohne Störung
der Anordnungsstruktur noch nachgewiesen werden kann. Dies gilt
auch, wenn die Kolonien etwa 18 Stunden lang kultiviert wurden.
-
Bezüglich des
als Fusionsprotein mit einem rekombinanten Insert eines Klons der
Expressionsbibliothek exprimierten (Poly)peptids ist anzumerken,
dass die vorliegende Erfindung die Verwendung eines oder mehrerer
in das Fusionsprotein eingebauter (Poly)peptide vorsieht. Wie aus
den beigefügten
Beispielen ersichtlich, erlaubt die Fusion des (Poly)peptids mit
dem N-Ende den Nachweis im Rahmen exprimierter Inserts, da Inserts,
die sich nicht im Rahmen mit dem N-terminalen (Poly)peptid befinden,
grundsätzlich
rasch im Zytoplasma abgebaut werden. Andererseits erlauben die Fusion
des (Poly)peptids mit dem C-Ende und der Nachweis des (Poly)peptids
die Auswahl von Inserts voller Länge.
Die vorliegende Erfindung sieht außerdem die Kombination von
einem oder mehreren mit dem N-Ende und C-Ende des Inserts fusionierten
(Poly)peptiden vor.
-
Es
ist anzumerken, dass die Klone vor Durchführung der Schritte (a) bis
(d) in dem zu testenden biologischen Material in zugänglicher
Form vorliegen sollten. Handelt es sich bei den Klonen z.B. um transformierte
Bakterien, müssten
diese vorzugsweise lysiert werden. Solche Lyseverfahren sind im
Stand der Technik bekannt.
-
Aufgrund
der Anwendung computergestützter
Technologie bei dem erfindungsgemäßen Verfahren muss die Durchsuchung
einer Bibliothek nur einmal erfolgen, da die für die einzelnen Klone erzeugten
Daten in einer späteren
Analyse, z.B. einer Sequenzierung auf dieses Screening zurückgeführt werden
können. Dementsprechend
ist ein rascher Übergang
von einer Expressionsbibliothek wie z.B. einer cDNA-Bibliothek auf
eine Proteinbibliothek möglich.
Dadurch entsteht eine direkte Verbindung zwischen einem Genkatalog
und einem funktionellen Protein/(Poly)peptid-Katalog. Darüber hinaus
kann wiederholtes Durchsuchen oder eine verlängerte Durchsuchungsreaktion
die Wahrscheinlichkeit des Ausschlusses falsch-positiver Klone weiter
erhöhen.
-
Erfindungsgemäß kann das
Verfahren auch zur Charakterisierung bereits bekannte Nukleinsäuremoleküle eingesetzt
werden.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
ist das als Teil eines Fusionsproteins mit dem Expressionsprodukt
des rekombinanten Inserts exprimierte (Poly)peptid ein Antikörper oder
ein Fragment oder Derivat davon, wobei das Fragment ein F(ab')2-,
Fab-, Fv- oder scFv-Fragment
ist, oder ein Antikörper,
der z.B. durch Deletion bestimmter Teile modifiziert ist, im Wesentlichen
jedoch seine Fähigkeit,
als Ligand zu funktionieren, beibehält, ein Tag, ein Enzym oder
ein Phagenprotein oder ein Fusionsprotein.
-
Verfahren
zum Nachweis einer Ausführungsform
des zuvor näher
beschriebenen (Poly)peptids sind im Stand der Technik bekannt bzw.
können
vom Fachmann ohne Weiteres entwickelt werden. Antikörper können beispielsweise
mit Hilfe nachweisbar markierter Anti-Antikörper nachgewiesen werden. Die
Antikörperfragmente
oder -derivate können
F(ab')2-,
Fab-, Fv- oder scFv-Fragmente
sein (siehe z.B. Harlow und Lane, „Antibodies, A Laboratory
Manual", CHS Press
(1988), Cold Spring Harbor, N.Y.). Weiterhin können Tags nach herkömmlichen
Verfahren nachgewiesen werden. Dasselbe gilt für Enzyme, die beispielsweise
durch Umsetzen mit einem spezifischen Substrat und Nachweis z.B.
einer Farbreaktion oder durch Verwendung eines für das Enzym spezifischen, nachweisbar
markierten Antikörpers
nachgewiesen werden können.
Antikörper
können
auch dem Nachweis von Phagen oder Fragmenten davon dienen. Antikörper-Markierungen
sind im Stand der Technik ebenfalls bekannt; dazu gehören alkalische
Phosphatase (ATTPPHOS), CSPD, Meerrettich-Peroxidase, FITC und Radioaktivität. Der Nachweis
einer Ausführungsform
des zuvor näher
beschriebenen (Poly)peptids kann auch massenspektrometrisch erfolgen.
-
In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
erfolgt die Analyse auf die Expression eines (Poly)peptids in Schritt
(a) durch Kontaktaufnahme mit einem Liganden, der sich von dem Liganden
von Schritt (b), der mit dem (Poly)peptid spezifisch interagiert,
unterscheidet, und Analyse der Bibliothek von Klonen auf das Vorliegen
einer spezifischen Interaktion. Der in Schritt (a) eingesetzte Ligand kann
aus derselben Klasse von Liganden stammen wie der in Schritt (b)
eingesetzte. Die tatsächliche
Molekülstruktur
des Liganden sollte jedoch in beiden Schritten unterschiedlich sein,
um zwischen den beiden Liganden unterscheiden zu können.
-
In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
erfolgt die Analyse auf die Expression eines (Poly)peptids in Schritt
(a) mit Hilfe optischer Mittel. Vorteilhafterweise kann die Expression
des (Poly)peptids mit Hilfe optischer Mittel wie Fluoreszenz, Biolumineszenz
oder Phosphoreszenz nachgewiesen werden. Die entsprechenden Signale
können
mittels an die Computereinheit angeschlossener photographischer
Mittel gespeichert werden. Die entsprechenden Signale können bei
Verwendung eines hochauflösenden
CCD-Detektionssystems in Bilder umgewandelt, als Bilddateien auf
dem Computer gespeichert und mittels anwenderspezifischer Software
analysiert werden, um die positiven Klone zu zählen.
-
Die
optischen Mittel sind am bevorzugtesten Massenspektrometrie. Die
massenspektrometrische Analyse der angeordneten Proteine erlaubt
z.B. hier die Verwendung der Proteinanordnungen als Brücke zur Verbindung
von DNA-, mRNA- und/oder
komplexen Hybridisierungsergebnissen mit 2-D-PAGE-Ergebnissen. Dies
erfolgt durch Erzeugung von Massenspektren der angeordneten Proteine
(z.B. auf einem Chip, einem massenspektrometrischen Target oder
einer Matrix) sowie durch Vergleich dieser Massenspektren mit den
von den Spots auf 2-D-Gelen
erzeugten Massenspektren. Mittels dieses Ansatzes kann das mRNA-Repertoire
einer Zelle (über
die cDNA-Bibliothek) als erste Ebene der Genexpression, die die
Genaktivität
am direktesten widerspiegelt, untersucht und mit der Proteomanalyse,
d.h. der Analyse des Proteinkomplements einer Zelle, eines Gewebes,
einer Pflanze, eines Mikroorganismus und/oder eines Organismus in
Verbindung gebracht werden.
-
Derzeit
werden die isolierten Proteine von 1-D- und 2-D-Gelen in Sequenzdatenbanken
mittels Massenspektrometrie identifiziert. Dies ist jedoch eindeutig
auf die wenigen bekannten Proteine beschränkt. Vorteilhafterweise wird
diese Beschränkung
durch das Konzept der vorliegenden Erfindung überwunden, dass nämlich alle
durch die Klone der Expressionsbibliotheken exprimierten Proteine
durch ein Minimum an Strukturdaten, die als MPI (minimal protein
identifier) bezeichnet werden, spezifiziert sind. Der Gehalt an
MPIs – Peptidkarten
kombiniert mit weiteren Strukturdaten – kann für eine eindeutige Proteinidentifizierung
und Hochdurchsatzbestimmung mittels Massenspektrometrie auf zweierlei
Weise optimiert werden.
-
Nach
der Registrierung erleichtern MPIs das Aufspüren von Genprodukten in biologischen
Proben durch einfaches Vergleichen der Messdaten. Auf diese Weise
ist die Proteinerkennung unabhängig
davon, ob das Protein „bekannt" ist (d.h. in den
aktuellen Datenbanken vorliegt) oder „unbekannt" (d.h. in den aktuellen Datenbanken
nicht vorliegt). Diese Spektren können zur Identifizierung von
Spektren verwendet werden, die anschließend bei der Analyse von Proteinen
aus anderen Quellen, z.B. von getrennten Proteinen von 1-D- und 2-D-Elektrophoresegelen
erzeugt werden.
-
Dadurch
entsteht eine Brücke,
die die durch 2-D-Elektrophorese charakterisierten Proteine mit
ihren entsprechenden mRNAs und Genen (cDNAs) verbindet. Alle von
2-D-Gelen gesammelten MPIs werden nach computergestützten Verfahren
(in silico) mit den aus der rekombinanten Proteinbibliothek erhaltenen
MPIs verglichen und umgekehrt. Dadurch kann zwischen Tausenden biologisch
aktiver Genprodukte und ihren Genen eine Verbindung hergestellt
werden. Diese Verbindung ist unabhängig von den Sequenzdaten und
daher auch für
die funktionelle Proteomanalyse anderer Organismen attraktiv.
-
Ein
weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Strategie im Vergleich
zu aktuellen Strategien ist, dass die Proteinidentifizierung zuverlässiger wird,
da massenspektrometrische Daten mit massenspektrometrischen Daten
verglichen werden und nicht mit aus DNA- oder Proteinsequenzen vorhergesagten
Daten. Der Hauptnachteil letzteren Ansatzes ist, dass die substratabhängige Proteaseleistung,
Peptidlöslichkeit
und endgültige Signalsuppression
in der massenspektrometrischen Analyse nicht berücksichtigt werden.
-
Darüber hinaus
erlauben die erfindungsgemäßen Proteinanordnungen
die Untersuchung massenspektrometrischer Daten von Tausenden unterschiedlicher
Proteine von 2-D-Gelen durch Einsatz ihrer mit stabilen Isotopen
markierten rekombinanten Homologe. Außerdem wird eine unsterbliche
Quelle zur Erzeugung von cDNA-Mikroarrays bereitgestellt, mit deren
Hilfe durch komplexe Hybridisierung ein Profil der mRNA-Ebenen erstellt werden
kann.
-
In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
ist die biologische Eigenschaft die Spezifität für eine Zelle, ein Gewebe oder
das Entwicklungsstadium einer Zelle oder eines Gewebes, eines Mikroorganismus,
vorzugsweise eines Bakteriums, einer Pflanze oder eines Organismus.
-
In
dieser bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung können
spezifische Vergleiche gezogen werden, die dem Wissenschaftler z.B.
Informationen über
den Entwicklungsstatus einer Zelle, eines Gewebes oder eines Organismus
oder über
die Spezifität
einer Zelle oder eines Gewebes z.B. bezüglich seines Ursprungs liefern.
Dies kann durch Vergleich von zwei Geweben unterschiedlichen Ursprungs
auf das Vorliegen bestimmter Markerproteine erfolgen. Bezüglich des
Entwicklungsstatus eines Organismus können z.B. Expressionsprofile
einer Expressionsbibliothek von angeordneter cDNA eines 6 Tage alten
Mäuseembryos
und einer Expressionsbibliothek von angeordneter cDNA eines 9 Tage
alten Mäuseembryos
verglichen werden, um unterschiedlich exprimierte Gene zu identifizieren
und zu charakterisieren und so in verschiedenen Entwicklungsstadien
exprimierte Gene zu ermitteln.
-
In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
ist die Zelle oder das Gewebe eine normale Zelle oder ein normales
Gewebe, eine kranke Zelle oder ein krankes Gewebe oder eine vorbehandelte
Zelle oder ein vorbehandeltes Gewebe.
-
Der
Begriff „vorbehandelt", wie er in Verbindung
mit Zellen oder Geweben verwendet wird, soll bedeuten, dass die
Zelle oder das Gewebe einem Medikament, einem Aktivator oder einem
Liganden, usw. ausgesetzt wurde. Die Vorbehandlung beeinflusst grundsätzlich die
Zellwege und führt
wahlweise zu mindestens einer phänotypischen
Veränderung
im Vergleich zu einer nicht behandelten Zelle. Es ist vorgesehen,
dass das erfindungsgemäße Verfahren
die mindestens eine phänotypische
Veränderung
nachweist. Es wird außerdem erwartet,
dass kranke Gewebe oder Zellen phänotypische Unterschiede im
Vergleich zu gesunden Geweben oder Zellen aufweisen, die mit Hilfe
des erfindungsgemäßen Verfahrens
nachgewiesen werden können.
-
In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
sind die Klone transformierte Bakterien, rekombinante Phagen, transformierte
Säugetier-,
Insekten-, Pilz-, Hefe- oder Pflanzenzellen.
-
Transformierte
Bakterien sind vorzugsweise transformierte E. coli-Zellen; rekombinante
Phagen stammen vorzugsweise von M13- oder fd-Phagen; transformierte oder
transfizierte Säugetierzellen
können
Hela- oder COS-Zellen sein. Bei den Insektenzellen werden Spodoptera
frugiperda- oder Drosophila melanogaster-Zellen bevorzugt. Bevorzugte
Pilzzellen umfassen Aspergillus-Zellen, während Hefezellen vorzugsweise von
Pichia pastoris oder Saccharomyces cerevisiae stammen. Es ist anzumerken,
dass die Begriffe „transformiert" und „transfiziert" erfindungsgemäß austauschbar
verwendet werden.
-
Handelt
es sich bei den transformierten Bakterien um transformierte E. coli-Zellen,
werden am bevorzugtesten die in den nachfolgenden Beispielen beschriebenen
E. coli-SCS1-Zellen verwendet. In einer anderen besonders bevorzugten
Ausführungsform
werden die E. coli-Zellen mit einer Bibliothek transformiert, die in
einen Vektor kloniert ist, der eine induzierbare Expression erlaubt
und vorzugsweise auch ein Tag als Teil des Fusionsproteins exprimiert,
vorzugsweise in den in den nachfolgenden Beispielen beschriebenen
Vektor pQE-30NST.
Der Fachmann kennt jedoch die strukturellen und/oder funktionellen
Merkmale von E. coli-Zellen und/oder Vektoren, wie sie in den Beispielen
beschrieben sind, so dass alle E. coli-Zellen und/oder Vektoren, die
im Wesentlichen dieselben strukturellen und/oder funktionellen Merkmale
aufweisen, von der vorliegenden Erfindung eingeschlossen werden.
-
Eine
weitere bevorzugte Ausführungsform
der Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren, bei dem die Anordnung
in den Schritten (a) bis (c) im Wesentlichen dasselbe Format hat.
-
Diese
Ausführungsform
der Erfindung ist besonders nützlich,
da sie die Erzeugung von Kopien von einer Masterplatte sowie den
Ergebnisvergleich auf einer 1:1-Skala erlaubt. Andererseits und
weniger bevorzugt kann die Anordnung in mindestens zwei der Schritte
(a) bis (c) ein anderes Format haben, z.B. eine andere Skala, solange
die eindeutige Verbindung der Klone auf den verschiedenen Kopien
noch möglich
ist.
-
In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
ist die Anordnung eine Gitterform.
-
Das
Gitter sollte gemäß der obigen
Diskussion vorzugsweise eine hochdichte Anordnung von Klonen der
Expressionsbibliothek erlauben. Es sollte außerdem vorzugsweise das Format
der in Lehrach, loc. cit. beschriebenen Gitter haben.
-
In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
der erfindungsgemäßen Verfahrens
hat das Gitter die Abmessungen einer Mikrotiterplatte, eines Silikawafers,
eines Chips, eines massenspektrometrischen Targets oder einer Matrix.
-
Bei
Verwendung dieser Abmessungen kann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren
herkömmliches Labormaterial
eingesetzt werden. Außerdem
erlauben diese Abmessungen die zweckmäßige Analyse einer großen Anzahl
von Klonen auf Geräten
im Labormaßstab.
-
In
einer anderen bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
sind die Klone an einem festen Träger fixiert.
-
Der
feste Träger
kann biegsam oder nicht biegsam sein. Diese Ausführungsform erlaubt insbesondere die
zweckmäßige Lagerung
und den Transport der angeordneten Klone der Expressionsbibliothek.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform
bezieht sich auf gefriergetrocknete Klone, die an dem festen Träger fixiert
sind.
-
Eine
weitere bevorzugte Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
bezieht sich auf ein Verfahren, bei dem der feste Träger ein
Filter, eine Membran, ein Magnetkügelchen, ein Silikawafer, Glas,
Metall, ein Chip, ein massenspektrometrisches Target oder eine Matrix
ist.
-
Die
Filter bzw. Membranen werden besonders bevorzugt aus PVDF oder Nylon
hergestellt. Bei den Filtern bzw. Membranen werden DNA oder DNA-haltige
Klone besonders bevorzugt auf Nylonmembranfilter (z.B. Hybond N+,
Amersham) gespottet/gerastert/gezüchtet, da diese eine hohe DNA-Bindungsfähigkeit
haben, und Proteine oder proteinexprimierende Klone auf Polyvinylidendifluorid
(PVDF)-Membranfilter
(z.B. Hybond PVDF, Amersham), da diese eine hohe Proteinbindungsfähigkeit
haben.
-
In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
ist mindestens einer der Liganden ein (Poly)peptid, ein Phage, Blut,
Serum, ein Toxin, ein Inhibitor, ein Medikament oder ein Medikamentenkandidat,
ein nicht-proteinhaltiger oder teilweise proteinhaltiger Rezeptor,
ein katalytisches Polymer, ein Enzym, eine Nukleinsäure, eine
PNA, ein Virus, eine Zelle, eine anorganische Verbindung, ein Konjugat,
ein Farbstoff, ein Gewebe oder ein Konjugat des Liganden.
-
Dementsprechend
kann der Ligand von verschiedener Natur sein. Wichtig ist, dass
die verschiedenen Ligandentypen direkt oder indirekt nachgewiesen
werden können
und so die Identifizierung der gewünschten Klone ermöglichen.
-
In
einer anderen bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
ist das (Poly)peptid ein Antikörper
oder ein F(ab')2-, Fab-, Fv- oder scFv-Fragment, ein Hormon
oder ein Enzym oder ein Antikörper,
Hormon oder Enzym, das durch Deletion bestimmter Teile modifiziert
ist, jedoch im Wesentlichen seine Kapazität, als Ligand zu funktionieren,
beibehält.
-
Die
obigen bevorzugten (Poly)peptide sind besonders vielseitig, leicht
zu handhaben und können
in großer
unterschiedlicher Anzahl bereitgestellt werden.
-
In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
ist die Interaktion in Schritt (b) eine spezifische Interaktion.
-
Ein
Beispiel für
diese Situation ist der Fall, bei dem sich ein Antikörper spezifisch
an ein Epitop oder eine (Poly)peptidsequenz bindet, sich z.B. der
Antihistidin-Antikörper spezifisch
an das 6x-Histidin-Tag, das 5x-Histidin-Tag, das RGS-6x-Histidin-Tag oder ein
nur auf einem Protein befindliches Epitop bindet.
-
In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
ist die Interaktion in Schritt (b) eine unspezifische Interaktion.
-
Ein
Beispiel für
diese Situation ist der Fall, bei dem sich ein Antikörper nicht-spezifisch
an Epitope bindet, die nicht von identischen DNA-Sequenzen codiert
werden, jedoch eine ähnliche
dreidimensionale Struktur, Ladung, usw. aufweisen und auf verschiedenen
Proteinen vorliegen können.
Wie erfindungsgemäß gezeigt werden
konnte, kann die Spezifität
oder Kreuzreaktivität
von Liganden wie z.B. Antikörpern
durch Anwendung der vorliegenden Erfindung bestimmt werden. Der
Nachweis von Antikörperkreuzreaktivitäten auf
Proteinmikroarrays ist nicht überraschend,
da Antikörper
für gewöhnlich nicht
gegen ganze Proteinbibliotheken getestet werden. Das erfindungsgemäße Verfahren
zum Screening von Antikörpern
gegen Anordnungen potentieller Antigene zum Nachweis gemeinsamer
Epitope kann für
Reagenzien, die für
immunhistochemische oder physiologische Studien über ganze Zellen oder Gewebe
verwendet werden sollen, wo sie Reihen unterschiedlicher Strukturen
gegenüber
stehen, besonders wichtig sein. Alternativ oder zusätzlich können Antikörper ohne bekannte
Antigenspezifität
(z.B. Lymphomproteine) bezüglich
der Bindung an ein sehr verschiedenartiges Repertoire von Proteinmolekülen durchsucht
werden. Da all diese Proteine von isolierten Klonen angeordneter cDNA-Bibliotheken exprimiert
werden, können
die entsprechenden Inserts leicht sequenziert werden, um antigen-codierende
Gene zu identifizieren. Erfindungsgemäß ist die Anwendung des Verfahrens
zur Charakterisierung der Bindung und/oder Nicht-Spezifität von Antikörpern, Serum, usw. für Homologiestudien über Proteinfamilien
und/oder zur Definition von Bindungsdomänen und Epitopen vorgesehen.
Weiterhin ist die Technik nicht auf das Antigen/Antikörper-Screening
beschränkt,
sondern kann auch auf ein Ligand/Rezeptor-System angewandt werden.
-
In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
erfolgt die Hybridisierung in Schritt (c) unter stringenten Bedingungen.
Alternativ erfolgt die Hybridisierung in Schritt (c) bevorzugt unter
nichtstringenten Bedingungen.
-
Bezüglich der
Bedeutung und Anwendung der stringenten/nichtstringenten Hybridisierungen
gilt im Wesentlichen dasselbe wie das, was in Verbindung mit der
Diskussion der spezifischen/unspezifischen Interaktionen aufgeführt wurde.
-
In
einer besonders bevorzugten Ausführung
des erfindungsgemäßen Verfahrens
ist das Tag c-myc, His-Tag, FLAG, alkalische Phosphatase, V5-Tag,
T7-Tag oder Strep-Tag, ein Fusionsprotein, vorzugsweise GST, cellulose-bindende
Domäne,
grünfluoreszierendes
Protein, maltose-bindendes Protein oder lacZ. Erfindungsgemäß kann das
Fusionsprotein zwei oder mehr Tags umfassen.
-
Die
bei dem erfindungsgemäßen Verfahren
eingesetzte Expressionsbibliothek kann aus einer Vielzahl von Quellen
erstellt werden. Sie kann z.B. eine Genombibliothek oder eine Antikörperbibliothek
sein. Vorzugsweise umfasst die Bibliothek von Klonen eine cDNA-Bibliothek.
-
Die
Anordnung wird vorzugsweise mit Hilfe einer automatischen Vorrichtung
erzeugt.
-
In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
wird/werden die Anordnung der Bibliothek und/oder die Kopien durch
einen Sortierautomat und/oder einen Tropfenautomat und/oder einen
Rasterautomat erzeugt.
-
Eine
weitere bevorzugte Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren, das weiterhin
die Sequenzierung des Nukleinsäureinserts
des gewünschten
Klons umfasst. Die Sequenzierung des Klons liefert in vielen Fällen die
durch das erfindungsgemäße Verfahren
erhältlichen
ultimativ gewünschten
Informationen. Protokolle zur Sequenzierung von DNA oder RNA sind
im Stand der Technik bekannt und z.B. in Sambrook, loc. cit. beschrieben.
-
In
einer letzten bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
umfasst das Verfahren die Identifizierung des von dem Insert des
gewünschten
Klons codierten (Poly)peptids.
-
Die
Identifizierung des von dem gewünschten
Klon exprimierten (Poly)peptids kann nach einer Vielzahl von Verfahren
erfolgen. Solche Verfahren sind unter anderem als biochemische Standardverfahren
wie z.B. Affinitätschromatographie,
SDS-PAGE, ELISA,
RIA, usw. bekannt. Sobald das (Poly)peptid ausreichend charakterisiert
worden ist, kann eine entsprechende chemische Komponente für pharmakologische
Anwendungszwecke, z.B. Peptidomimetika entwickelt werden.
-
Es
ist davon auszugehen, dass die eingeführten Inserts und Vektoren
das Genprodukt nach Einbau in die Zelle exprimieren und vorzugsweise
während
der Lebensdauer der Zelle in diesem Status verbleiben. Zelllinien
beispielsweise, die das Polynukleotid unter der Steuerung geeigneter
Regulationssequenzen stabil exprimieren, können nach dem Fachmann bekannten
Verfahren gentechnisch hergestellt werden. Eher als mit Expressionsvektoren,
die virale Replikationsstartpunkte enthalten, können Wirtszellen mit dem erfindungsgemäßen Polynukleotid
und einem selektierbaren Marker entweder auf ein- und demselben
oder separaten Plasmiden transformiert werden. Nach dem Einbau von
Fremd-DNA kann man gentechnisch hergestellte Zellen 1–2 Tage
lang in einem angereicherten Medium wachsen lassen und sie dann
in ein selektives Medium transferieren. Der selektierbare Marker
in dem rekombinanten Plasmid verleiht Auswahlresistenz und ermöglicht die Auswahl
von Zellen, in deren Chromosomen das Plasmid stabil eingebaut ist
und die wachsen, so dass sich Herde bilden, die wiederum kloniert
und in Zelllinien verlängert
werden können.
Solche gentechnisch hergestellten Zelllinien sind auch für Screeningverfahren
zum Nachweis von Verbindungen im Zusammenhang mit z.B. B-Zell-/T-Zellinteraktion besonders
nützlich.
-
Es
kann eine Reihe von Auswahlsystemen eingesetzt werden, z.B., jedoch
nicht ausschließlich
die Thymidinkinase des Herpes simplex-Virus (Wigler, Cell 11 (1977),
223), Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (Szybalska, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 48 (1962), 2026) und Adeninphosphoribosyltransferase (Lowy,
Cell 22 (1980) 817) in tk–-, hgprt–-
bzw. aprt–-Zellen.
Als Basis für
die Auswahl kann die Antimetabolitenresistenz eingesetzt werden:
dhfr, das eine Methotrexatresistenz verleiht (Wigler, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 77 (1980), 3567; O'Hare, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78
(1981), 1527), gpt, das eine Mycophenolsäureresistenz verleiht (Mulligan,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981) 2072), Neo, das eine Aminoglycosid
G-418-Resistenz verleiht (Colberre-Garapin, J. Mol. Biol. 150 (1981), 1),
Hygro, das eine Hygromycinresistenz verleiht (Santerre, Gene 30
(1984), 147) oder Puromycin (pat, Puromycin-N-Acetyltransferase).
Es wurden zusätzliche
selektierbare Gene beschrieben, z.B. trpB, das Zellen die Nutzung
von Indol anstelle von Tryptophan erlaubt, hisD, das Zellen die
Nutzung von Histinol anstelle von Histidin erlaubt (Hartmann, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 8047) und ODC (Ornithindecarboxylase),
das eine Resistenz gegenüber
Ornithindecarboxylaseinhibitor, 2-(Difluormethyl)-DL-Ornithin, DFMO verleiht
(McConlogue, 1987, in: Current Communications in Molecular Biology,
Cold Spring Harbor Laboratory, Hrsg.).
-
Die
Erfindung bezieht sich außerdem
auf ein Kit, das mindestens zwei Kopien der an einem festen Träger fixierten
zuvor genannten Expressionsbibliotheken umfasst, wobei die Klone
solcher Expressionsbibliotheken in Gitterform angeordnet sind. Das
erfindungsgemäße Kit eignet
sich besonders zur Durchführung
des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Die verschiedenen Typen möglicher
und bevorzugter fester Träger
wurden zuvor definiert. Vorzugsweise umfasst das erfindungsgemäße Kit weiterhin
mindestens einen Liganden gemäß der obigen
Definition.
-
Die
Komponenten des erfindungsgemäßen Kits
können
in Behältern
wie z.B. Fläschchen,
wahlweise in Puffern und/oder Lösungen
verpackt werden. Ggf. können
eine oder mehrere Komponenten in ein- und denselben Behälter verpackt
werden.
-
Die
Figuren zeigen Folgendes:
-
1
-
RGS-His-Nachweis
von Proteinexpressionsklonen mit dem RGS-His-Antikörper auf einem Hochdichtefilter.
Ein Filter mit 27.648 doppelt angeordneten Klonen wurde mit dem
RGS-His-Antikörper
durchsucht, um Klone nachzuweisen, die rekombinante Proteine mit
His6-Tag exprimieren.
-
2
-
Identifizierung
von GAPDH-Expressionsklonen. (a) Durchsuchen eines DNA-Filters mit
27.648 doppelt angeordneten cDNA-Klonen mit einer GAPDH-spezifischen
DNA-Sonde. (b) Durchsuchen eines identischen Proteinfilters mit
denselben Klonen wie in (a) mit einem Anti-GAPDH-Antikörper. Es
sind entsprechende Filterabschnitte dargestellt.
-
3
-
Venn-Diagramme,
die die mittels verschiedener Sonden und Antikörper identifizierten Klonkategorien darstellen.
Die Kreise stellen durch Einzelsonden identifizierte Klonsets dar.
Klone in Schnittmengen wurden mit Mehrfachsonden nachgewiesen.
-
4
-
Sequenzalignment
von Sequenzen von GAPDH (a)- und HSP90a (b)-Klonen. Die offenen Leserahmen von GAPDH
und HSP90a sind als offene Kästchen
dargestellt. Die Linien bezeichnen jeweils die Länge der in dem jeweiligen Klon
erwarteten Sequenz, wobei die dickeren Abschnitte das tatsächlich sequenzierte und
mit der mRNA-Sequenz voller Länge
abgeglichene Fragment darstellen. Die Buchstaben A-E beziehen sich
auf die Kategorien von 3.
-
5
-
Proteinprodukte
von mittels RGS-His- und/oder spezifischen Antikörpern gegen GAPDH (a) oder HSP90a
(b) nachgewiesenen Klonen. Die Schattierungen und Ziffern in den
Kästchen
im oberen Teil bezeichnen die Signalintensitäten auf Hochdichtefiltern.
Ganze Zellproteine wurden mit Coomassie-Blau gefärbt. Die Klonkategorien waren
dieselben wie in 3.
-
6
-
Übertragsstempel
für den
Proteinlösungstransfer
von Mikrotiterplatten mit 384 Vertiefungen auf PVDF-Membranen. 16
einzelne, gefederte Nadeln aus rostfreiem Stahl sind auf einem POM-Corpus
angebracht (POM = Polyoxymethylen, Polyformaldehyd, Polyacetal).
Der Abstand zwischen den Nadeln beträgt 4,5 mm. Die Größe der Spitze
am stumpfen Ende beträgt
laut Messung 250 μm.
-
7
-
Empfindlichkeit
des spezifischen Proteinnachweises auf Mikroarrays. In zwei identischen
Duplikatreihen wurden äquimolare
Konzentrationen (100 pmol/μl – 1 fmol/μl) von gereinigtem
menschlichem GAPDH (Duplikate 19–24 und 43–48), menschlichem bHSP90alpha
(Duplikate 7–12
und 31–36)
und Ratten-bBIP (Duplikate 13–18
und 37–42)
(5 × 5
nl) gespottet und mittels eines monoklonalen Anti-GAPDH-Antikörpers nachgewiesen.
A: Spotanordnung auf PVDF-Filtermembran (1,9 × 1,9 cm mit 128 Proben, 4 × 4 vertikales
Duplikat-Spotting-Muster,
schwarze Duplikat-Guide-Spots, Anzahl der Duplikate wie angegeben);
B: Relative Intensitäten
der Duplikatmittel von A (Guide-Spots ausgeschlossen) mit Nummerierung
der Duplikate (wie in A), Name und Menge des gespotteten Proteins
und Nachweisschwelle.
-
8
-
Hochdurchsatzexpression
von Fusionsproteinen mit RGS-His6-Tag von
Klonen der angeordneten hEx1-Bibliothek, nachgewiesen auf einem
Mikroarray mittels des monoklonalen Antikörpers RGS-His (Qiagen). Rohe,
filtrierte Lysate von 92 Klonen wurden von einer Mikrotiterplatte
mit 96 Vertiefungen inklusive 4 Vertiefungen mit Kontrollproteinen
(H1, Vektor pQE-30NST ohne Insert; H2, bHSP90alpha, Klon N15170,
Vektor pQE-BH6; H3, GAPDH, Klon D215, Vektor pQE-30NST; H4, bBIP,
Vektor pQE-BH6) gespottet. A: Reproduzierbarkeit des Nachweises
als Diagonale der relativen Duplikatintensitäten; Insert: Spotanordnung
auf PVDF-Filtermembran (wie in 7,
untere Guide-Spots zur Orientierung verdoppelt); B: Diagramm wie
in 7 mit Angabe von (+)- oder (–)-Leserahmen
der Inserts, soweit bekannt (Spezifitätsschwelle willkürlich auf eine
relative Intensität
von 7500 eingestellt).
-
9
-
Spezifitätstest von
drei monoklonalen Antikörpern
auf identischen Mikroarrays von Klonen der angeordneten hEX1-Bibliothek wie in 8 exprimierter Fusionsproteine mit RGS-His6-Tag.
A: Monoklonales Anti-GAPDH (H3, GAPDH, Klon D215, Vektor pQE-30NST);
B: Monoklonales Anti-HSP90alpha (H2, bHSP90alpha, Klon N15170, Vektor
pQE-BH6; H10, 60S ribosomales Protein L18A; H3, GAPDH, Klon D215, Vektor
pQE-30NST); C:
Monoklonales Anti-Alphatubulin (F9 und A4, RF(+)-Alphatubulinklone;
C7, RF(–)-Alphatubulinklon;
B1 und B12, unbekannte Gene; H3, GAPDH, Klon D215, Vektor pQE-30NST;
G1, RF(–)-Betatubulinklon;
E5, RPL3 ribosomales Protein L3; H10, RPL18A ribosomales Protein
L18A; E6 und D8, RPS2 ribosomales Protein S2; F7, RPS3A ribosomales
Protein S3A; E3, RPS25 ribosomales Protein S25); Spezifitätsschwelle
willkürlich
auf eine relative Intensität
von 25.000 eingestellt).
-
Tabellenlegenden:
-
Tabelle 1
-
Bewertung
verschiedener Screeningoptionen für die hEx1-cDNA-Expressionsbibliothek.
Die Klonkategorien entsprechen denen von 3. Die in
Klammern gesetzten Ziffern stellen zweite Screenings dar.
-
Tabelle 2
-
Bewertung
verschiedener Screeningoptionen für die hEx1-cDNA-Expressionsbibliothek.
Die Klonkategorien entsprechen denen von 2. Die in
Klammern gesetzten Ziffern stellen zweite Screenings dar.
-
Beispiel 1: Erstellung
einer angeordneten Expressionsbibliothek menschlicher cDNA
-
Es
wurde eine Bibliothek von direktional klonierter cDNA von menschlichem
fötalem
Gehirn (hEx1) in pQE-30NST, einem Vektor für die IPTG-induzierbare Expression
von Fusionsproteinen mit His6-Tag erstellt. pQE30-NST wurde aus
pQE-30 (Qiagen), einem pBR322-basierten Expressionsvektor, der einen
Phagen-T5-Promotor
und zwei lac-Operatoren für
die nachfolgende Expression von IPTG-induzierbarem, rekombinantem
Protein trägt,
hergestellt. Im ersten Schritt wurde pQE-30N durch Einfügen eines
synthetischen Oligonukleotids mit einer BgIII- und einer Notl-Schnittstelle in die
einmalige Pstl-Schnittstelle
von pQE-30 erzeugt. In nachfolgenden Schritten wurde ein einen SP6-Promotor
tragendes SP6-Promotor-Oligonukleotid
zwischen die BamHI- und die Sall-Schnittstelle von pQE-30N eingefügt und anschließend ein
zweites, einen T7-Promotor
tragendes Oligonukleotid zwischen die HindIII- und die Notl-Schnittstelle.
Der entstandene Vektor pQE-30NST kann zum Klonen von cDNA mit Sall-
und Notl-Overhangs verwendet werden. Das Insert kann in vitro mittels
SP6-RNA-Polymerase im Uhrzeigersinn und mittels T7-RNA-Polymerase
gegen den Uhrzeigersinn transkribiert werden.
-
Durch
PCR-Analyse von 14 Klonen wurde eine mittlere Insert-Größe von etwa
1,4 kb erhalten.
-
Als
Wirtsstamm für
die Erstellung dieser Expressionsbibliothek wurde pSE111 tragendes
E. coli-SCS (Stratagene) verwendet. pSE111 wurde aus pSBETc hergestellt
(Schenk et al., BioTechniques 19(2) (1995), 196–198).
-
pSBETc
ist ein pACYC177-basierter Expressionsvektor, der das argU-Gen,
ein Kanamycinresistenzgen und eine T7-RNA-Polymerasepromotorschnittstelle für die rekombinante
Proteinexpression trägt
(Schenk et al., BioTechniques 19 (1995), 196 ff.). Das Helferplasmid
pSE111 trägt
das lac-Repressor-Gen
und das argU (dnaY)-Gen, das eine seltene tRNA codiert, die AGA-
und AGG-Arginin-Kodone erkennt (Brinkmann et al., Gene 85 (1989),
109–114),
und wurde in zwei Schritten aus pSBETc hergestellt.
-
Zur
Entfernung der T7-Promotor-Region wurde ein Xmnl-EcoRV-Fragment an der Nukleotidposition 2041–2521 aus
pSBETc ausgeschnitten.
-
Aus
dem Plasmid pVH1 wurde ein 1,2 kb schweres, das laclQ-Gen enthaltendes
Fragment ausgeschnitten (Haring et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
82 (1985), 6090–6094)
und in die einmalige EcoRI-Schnittstelle des in Schritt (i) entstandenen
Plasmids eingefügt.
Man erhielt Plasmide von 5,1 kb mit laclQ-Inserts in beiden möglichen Ausrichtungen; die
lin pSE111-Transkription
des laclQ-Gens erfolgte im Uhrzeigersinn in der veröffentlichten
pSBETc-Karte (Schenk et al., BioTechniques 19 (1995), 196 ff.).
Dieses Plasmid lag in dem als Wirtsstamm für die cDNA-Expressionsbibliothek
verwendeten E. coli-Stamm SCS1 (Stratagene) vor.
-
Mittels
eines Sortier-/Rasterautomaten wurden 80.640 Klone in Mikrotiterplatten
mit 384 Vertiefungen sortiert und bei hoher Dichte auf Nylon- und
Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Filter gerastert. Nylonfilter wurden für DNA-Hybridisierungen
behandelt (DNA-Filter), wohingegen PVDF-Filter zur Auslösung der
Proteinexpression auf IPTG enthaltende Agarplatten transferiert
und für
den Proteinnachweise behandelt wurden (Proteinfilter).
-
Beispiel 2: Proteinexpressionsscreening
auf Hochdichtefiltern
-
Hochdichte
Proteinfilter der hEx1-Bibliothek wurden mit dem monoklonalen RGS-His-Antikörper durchsucht,
der die N-terminale
Sequenz RGSH6 von dem pQE-30NST-Vektor überexprimierter rekombinanter
Fusionsproteine erkennt ( 1). Etwa
20% der Klone waren positiv (Signale der Intensität 1, 2 oder
3, Klassifikation 1 bis 3). Diese Klone galten als mutmaßliche Proteinexpressionsklone
(1). Die hEx1-cDNA-Bibliothek wurde durch Oligo (dT)-Priming
mittels eines Kit von Life Technologies (Superscript Plasmid System)
aus menschlichen fötalen
Hirngeweben hergestellt (Gubler et al., Gene 25 (1983), 263). Die
cDNA wurde mittels Gelfiltration nach Größe fraktioniert und die einzelnen
Fraktionen wurden zwischen der Sall- und der Notl-Schnittstelle
des Expressionsvektors pQE-30NST ligiert. Als Wirtsstamm wurde das
Helferplasmid pSE111 tragendes E. coli-SCS1 (Stratagene) verwendet.
Nach der Transformation durch Elektroporation wurde die Bibliothek
auf quadratische Agarplatten (Nunc Bio Assay Dish) aufgetragen und
bei 37° C über Nacht wachsen
gelassen. Mittels eines automatischen Robotersystems (Lehrach et
al., Interdisciplinary Science Reviews 22 (1997), 37–44) wurden
Kolonien in Mikrotiterplatten mit 384 Vertiefungen (Genetix) sortiert,
die mit 100 μg/ml
Ampicillin, 15 μg/ml
Kanamycin, 2% Glucose und Gefriermischung (0,4 mM MgSO4,
1,5 mM Na3-Citrat, 6, 8 mM (NH4)2SO4, 3, 6% Glycerin,
13 mM KH2PO4, 27
mM K2HPO4, pH 7,0)
enthaltendem 2xYT-Medium gefüllt
waren. In den Mikrotiter-Vertiefungen wurden bei 37° C über Nacht
Bakterien gezüchtet
und mit Hilfe von Replikationswerkzeugen mit 384 Nadeln (Genetix)
in neue Mikrotiterplatten repliziert. Alle Kopien wurden bei 80° C gefriergelagert.
-
Beispiel 3: Identifizierung
von Genen und Proteinen auf entsprechenden Filtersets
-
Als
Beispielproteine wurden GAPDH und HSP90a gewählt, mit offenen Leserahmen
von 1008 bp und 35.922 Dalton bei GAPDH (Swiss-Prot P04406) bzw.
2199 by und 84.542 Dalton bei HSP90a (Swiss-Prot P07900).
-
Ein
Set mit drei DNA-Hochdichtefiltern (80.640 Klone) der hEx1-Bibliothek
wurde mit genspezifischen cDNA-Sonden durchsucht. Wie beschrieben,
wurden mittels Roboter-Spotting Hochdichtefilter hergestellt (Maier
et al., Drug Discovery Today 2 (1994), 315–324; Lehrach et al., Interdisciplinary Science
Reviews 22 (1997), 37–44).
Die Bakterienkolonien wurden zur DNA-Analyse auf Nylonmembranfilter
(Hybond N+, Amersham) und zur Proteinanalyse auf Polyvinylidendifluorid
(PVDF)-Membranfilter (Filterformat 222 mm × 222 mm) (Hybond-PVDF, Amersham) gerastert.
Die Klone wurden bei einer Dichte von 27.648 Klonen pro Filter in
einem Duplikatmuster um Tinten-Guide-Punkte herum gespottet. Hochdichtefilter
wurden auf quadratische, 100 μg/ml
Ampicillin, 15 μg/ml
Kanamycin und 2% Glucose enthaltende 2xYT-Agarplatten (Nunc Bio
Assay Dish) gelegt.
-
Die
für die
DNA-Analyse zu verwendenden Filter wurden über Nacht bei 37° C wachsen
gelassen und anschließend
wie zuvor beschrieben behandelt (Hoheisel et al., J. Mol. Bio. 220
(1991), 903–914).
Die Filter für
die Proteinanalyse wurden über
Nacht bei 30° C
wachsen gelassen und anschließend
zur Auslösung
der Proteinexpression, ausgelöst über 3 Stunden
bei 37° C,
auf mit 1 mM IPTG ergänzte
Agarplatten transferiert. Die exprimierten Proteine wurden auf den
Filtern fixiert, indem die Filter auf Fließpapier gelegt wurden, das
10 Minuten lang in 0, 5 M NaOH, 1, 5 M NaCl, zweimal 5 Minuten lang
in 1 M Tris-HCl, pH 7,5, 5 Minuten lang in 1,5 M NaCl und schließlich 15
Minuten lang in 2 × SSC
eingeweicht wurde. Die Filter wurden an der Luft getrocknet und
bei Raumtemperatur gelagert.
-
Wie
beschrieben, erfolgten DNA-Hybridisierungen mittels digoxigenin-markierter
PCR-Sonden und alkalischem Phosphatase-Substrat Attophos (JBL Scientific, San
Luis Obispo) (Maier et al., J. Biotechnol. 35 (1994), 191–203). Die
digoxigeninmarkierten Hybridisierungssonden wurden mittels PCR-Amplifikation eines den
kompletten offenen Leserahmen des menschlichen GAPDH enthaltenden
Klons und des einen C- terminalen
Teil von H5P90a enthaltenden IMAGE-Klons Nr. 343722 hergestellt
(GenBank W69361).
-
Bei
einer menschlichen GAPDH-Sonde (2a)
waren 206 (0,26) Klone positiv (Tabelle 1) (2a). Eine
zweite Hybridisierung bestätigte
202 und wies 35 weitere Klone nach (Gesamtzahl damit 237, Tabelle
1). 56 (0,07) Klone wurden mit einer menschlichen HSP90a-Sonde identifiziert.
Auf den entsprechenden Proteinfiltern wurden mittels RGS-His-Antikörper 56
(27%) bzw. 14 (25%) GAPDH- bzw. HSP90a-positive Klone erkannt.
-
Das
Antikörperscreening
auf Hochdichtefiltern wurde wie folgt durchgeführt: Ein Kaninchen-Anti-GAPDH-Serum
wurde wie beschrieben affinitätsgereinigt
(Gu et al., BioTechniques 17 (1994), 257–262). Anti-HSP90 (Transduction
Laboratories, Lexington) richtet sich gegen die Aminosäuren 586
bis 732 von HSP90a. Trockene Proteinfilter wurden in Ethanol eingeweicht
und Bakterientrümmer
wurden mit Papierhandtüchern
in TBST-T (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,5 M NaCl, 0,05% Tween 20, 0,5%
Triton X–100)
abgewischt. Die Filter wurden 1 Stunde lang in Blockierpuffer (3%
fettloses Trockenmilchpulver in TBS, 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH
7,5) blockiert und über
Nacht mit 50 ng/ml Anti-HSP90-Antikörper oder Anti-GAPDH-Antikörper (Verdünnung 1:5000)
inkubiert. Nach zweimaligem 10-minütigem Waschen in TBST-T und
einmaligem Waschen in TBS wurden die Filter 1 Stunde lang mit sekundärem Antikörper, konjugiert
mit alkalischer Phosphatase (AP), inkubiert. Nach dreimaligem 10-minütigem Waschen
in TBST-T, einmaligem Waschen in TBS und einmaligem Waschen in AP-Puffer
(1 mM MgCl2, 0,1 M Tris-HCl, pH 9,5) wurden
die Filter 10 Minuten lang in 0,5 mM Attophos (JBL Scientific, San
Luis Obispo) in AP-Puffer inkubiert. Die Filter wurden mit langwelligem
UV-Licht beleuchtet; für
die Bilderzeugung wurde ein hochauflösendes CCD-Detektionssystem
verwendet (Maier et al., Drug Discovery Today 2 (1997), 315–324). Die
positiven Klone wurden mittels einer anwenderspezifischen Bildanalysesoftware
gezählt.
Bei einem polyklonalen Anti-GAPDH-Antikörper (2b)
waren 39 Klone positiv (Tabelle 2). Diese wurden alle mittels des
RGS-His-Antikörpers nachgewiesen,
doch bei der GAPDH-spezifischen DNA-Sonde wurden nur 32 positive Klone gezählt. 5 der
7 nicht erfassten Klone wurden jedoch in der zweiten DNA-Hybridisierung nachgewiesen.
Das Screening mit einem monoklonalen Anti-HSP90-Antikörper lieferte
32 positive Klone, von denen 28 durch die HSP90a-DNA-Sonde nachgewiesen
wurden; 10 waren sowohl bei der HSP90a-DNA-Sonde als auch bei dem
RGS-His-Antikörper positiv.
In einem zweiten Anti-HSP90-Screening wurden 30 Klone bestätigt und
12 neue Klone nachgewiesen, die alle bei der HSP90a-DNA-Sonde positiv
waren.
-
Beispiel 4: Sequenz- und
Western Blotting-Analyse der nachgewiesenen Klone
-
3 fasst
die für
GAPDH und HSP90a erhaltenen Filterdaten zusammen. Klone der Kategorien
A-E wurden durch Sequenzierung der 5'-Enden ihrer cDNA-Inserts (4) und durch Western Blotting (5) analysiert. Die folgenden experimentellen
Protokolle wurden durchgeführt.
-
(A) Positive Klone – insgesamt
-
10
mittels der DNA-Sonde identifizierte GAPDH-Klone; das Anti-GAPDH und der RGS-His-Antikörper wurden
sequenziert und enthielten GAPDH-Sequenzen im richtigen Leserahmen.
9 Klone exprimierten die gesamte GAPDH-Sequenz und die 5'-UTR umfassende rekombinante
Proteine mit His6-Tag, und Vektoraminosäuren codierten Aminosäuren durch
die 5'-UTR der mRNA
und des Vektors.
-
Alle
10 positiven Klone bei der HSP90a-DNA-Sonde, dem RGS-His und dem
Anti-HSP90-Antikörper hatten
HSP90a-Sequenzen im richtigen Leserahmen. Keiner davon umfasste
jedoch die gesamte Codierregion, und 5 Klone exprimierten nachweislich
Fusionsproteine mit His6-Tag, die von unterschiedlich großen C-terminalen
Teilen der HSP90a-Sequenz translatiert worden waren.
-
(B) Negative Klone – spezifischer
Antikörper
-
Es
wurde gezeigt, dass sich die Sequenzen von 7 bei dem spezifischen
GAPDH-Antikörper
negativen GAPDH-Klonen auf Filtern mit der GAPDH-GenBank-Sequenz überschneiden.
2 dieser Klone besaßen
Inserts im richtigen Leserahmen und exprimierten GAPDH-Fragmente
(24 kD), die beim Western Blotting durch den Anti-GAPDH-Antikörper gefärbt wurden
(5a, B, Bahnen 11, 12). Bei den anderen 5 Klonen
waren die GAPDH-Inserts in falschen Leserahmen, was darauf deutet,
dass bei ihrer Expression wahrscheinlich Peptide im Bereich von
6,5 bis 16,7 kD Polypeptiden exprimiert wurden (5a,
B, Bahnen 13–17).
Die Signalintensitäten
dieser Klone waren im Allgemeinen bei Sondierung mit dem RGS-His-Antikörper auf
Hochdichtefiltern gering. 3 von 4 HSP90a-Klonen besaßen Inserts
in einem falschen Leserahmen und exprimierten kurze Peptide, die
nicht mit dem Anti-HSP90-Antikörper
reagierten (2 Klone dargestellt in 5b, Bahnen
6, 8). Der verbleibende Klon mit einem Insert im richtigen Leserahmen
ergab beim Western Blotting eine Bande der berechneten Größe (56,
0 kD) und wurde in einem zweiten Screening des Hochdichtefilters
durch den Anti-HSP90-Antikörper nachgewiesen.
-
(C) Positive Klone – nur DNA-Sonde
-
11
von 12 zufällig
ausgewählten
GAPDH-Klonen enthielten erwiesenermaßen ein GAPDH-Insert in einem
falschen Leserahmen und exprimierten vermutlich Peptide im Bereich
von 3,4 bis 9,1 kD. Der Klon MPMGp800A1755 besaß ein Insert im richtigen Leserahmen,
trug jedoch eine Punktmutation in Position –8 in der 5'-UTR, was zu einem Stop-Kodon und einem
Peptid einer berechneten Größe von 4,7
kD führte.
Die DNA-Sequenzanalyse deutete darauf hin, dass 11 von 12 HSP90a-Klonen
Inserts in einem falschen Leserahmen enthielten und möglicherweise
Peptide einer berechneten Molekülmasse
von 2,8 bis 5,4 kD exprimierten. Nur der Klon MPMGp800113115 besaß ein Insert
im richtigen Leserahmen, exprimierte ein Protein einer Größe von 78,7
kD und war in einem zweiten Screening mit Anti-HSP90-Antikörper positiv.
-
Bei
der GAPDH- bzw. HSP90a-DNA-Sonde wurden keine falschpositiven Klone
gefunden.
-
(D) Negative Klone – DNA-Sonde
-
Es
wurde gezeigt, dass 4 GAPDH-Klone richtige Inserts hatten und falsch-negative
Klone der DNA-Sonde darstellten, jedoch in einem zweiten DNA-Hybridisierungsexperiment
nachgewiesen wurden. 2 Klone enthielten Sequenzen von menschlichem
Polyubiquitin (GenBank D63791) und menschlichem HZF10 (PIR S47072).
-
Alle
4 HSP90a-Klone exprimierten Polypeptide, die beim Western Blotting
nachgewiesen wurden (5b, D). Der Klon MPMGp800G06207
(Bahn 12) enthielt ein HSP90a-Insert mit einer 46 bp-Deletion und war
offensichtlich ein falsch-negatives Klon der HSP90a-DNA-Sonde. Die
verbleibenden 3 Klone besaßen
Inserts mit einer Sequenzhomologie zu uterusspezifischem, prolinreichem
Säureprotein
von Mäusen
(GenBank U28486; Bahnen 9, 10) bzw. waren mit einer EST-Sequenz
unbekannter Funktion identisch (Bahn 11).
-
(E) Positive Klone – DNA-Sonde
und spezifischer Antikörper
(RGS-His)
-
10
von der HSP90a-DNA-Sonde und dem Anti-HSP90-Antikörper, nicht
aber dem RGS-His-Antikörper erkannte
Klone wurden sequenziert und enthielten HSP90a-Sequenzen in einem
falschen Leserahmen. Von diesen Klonen exprimierte Polypeptide mit
His6-Tag hätten
berechnete Massen von 3,2 bis 6,1 kD und würden im Western Blotting nicht
gefunden (5b, E).
Im Gegensatz dazu wurden passende Bandenmuster beim Anti-HSP90-Antikörper beobachtet.
-
cDNA-Klone
enthaltende Bakterien wurden durch Schütteln in 2 ml 100 μg/ml Ampicillin,
15 μg/ml
Kanamycin und 2% Glucose enthaltendem 2xYT-Medium gezüchtet. Bei
einer OD600 von 0,4 wurde der 1 mM Endkonzentration
IPTG zugesetzt und die Inkubation über 3 Stunden bei 37° C fortgesetzt.
Gemäß Laemmli wurden
Ganzzellproteinextrakte einer 15% SDS-PAGE unterzogen und mit Coomassie-Blau
gefärbt
(Laemmli, Nature 227 (1970), 680–685).
-
Nach
der SDS-PAGE wurden die Proteine mittels einer halbtrockenen Elektrotransfervorrichtung (Hoefer
Pharmacia Biotech, San Francisco) entsprechend den Empfehlungen
des Herstellers auf PVDF-Membranen (Immobilon P, Millipore) in 20
mM Tris, 150 mM Glycin, 0,1% SDS, 10% Methanol transferiert.
-
Die
cDNA-Inserts wurde mittels PCR unter Verwendung der Primer pQE65
(TGA GCG GAT AAC AAT TTC ACA CAG) und pQE276 (GGC AAC CGA GCG TTC
TGA AC) bei einer Glühtemperatur
von 65° C
amplifiziert. Die PCR-Produkte wurden mittels Dye-Terminator-Zyklus-Sequenzierung
mit dem Primer pQE65 und ABI-Sequenzanalysatoren
(Perkin Elmer) von der Serviceabteilung unseres Institutes sequenziert.
-
Beispiel 5: Vektorkonstrukte
-
pQE-30NST
(GenBank-Zugriffsnummer AF074376) wurde beschrieben (Büssow et
al., Nucleic Acids Res. 26 (1998), 5007–5008). pQE-BH6 wurde mittels Polymerasekettenreaktion
(PCR) zum Einfügen
eines die Proteinsequenz LNDIFEAQKIEW codierenden Oligonukleotids
zwischen MRGS und His6 von pQE-30 (Qiagen)
und zur Trennung der beiden Teile des RGS-His6-Epitops
hergestellt.
-
Beispiel 6: Antikörper
-
Es
wurden monoklonale Antikörper
der folgenden Hersteller in den angegebenen Verdünnungen verwendet: Mäuse-Anti-RSG-His
(QIAGEN, 1:2000), Mäuse-Anti-Kaninchen-GAPDH
(Research Diagnostics, Inc., Klon 6C5, 1:5000), Mäuse-Anti-HSP90
(Transduction Laboratories, Klon 68, 1:2000), Ratten-Anti-Alphatubulin (Serotec
Ltd., Klon YL1/2, 1:2000).
-
Sekundäre Antikörper waren
F(ab')2-Kaninchen-Anti-Mäuse-IgG-HRP
(Sigma) und F(ab')2-Kaninchen-Anti-Ratten-IgG-HRP (Serotec
Ltd.) (Verdünnung
1:5000) zum Nachweis monoklonaler Mäuse- bzw. Rattenantikörper.
-
Beispiel 7: Proteinexpression
und -reinigung im großtechnischen
Maßstab
-
Die
Proteine wurden in E. coli-Flüssigkulturen
(Stamm SCS1) exprimiert. 900 ml 100 μg/ml Ampicillin und 15 μg/ml Kanamycin
enthaltendes SB-Medium (12 g/l Bactotrypton, 24 g/l Hefeextrakt,
17 mM KH2PO9, 72 mM
K2HPO4, 0, 4% (v/v)
Glycerin) wurden mit 10 ml einer Übernacht-Kultur geimpft und
bei 37° C
geschüttelt, bis
eine OD600 von 0,8 erreicht war. Einer Endkonzentration
von 1 mM wurde Isopropyl-b-D-Thiogalactopyranosid
(IPTG) zugesetzt. Die Kultur wurde 3,5 Stunden lang bei 37° C geschüttelt und
mit Eis auf 4° C
abgekühlt. Die
Zellen wurden mittels 10-minütigem
Zentrifugieren mit 2100 g geerntet, in 100 ml Phosphatpuffer (50
mM NaH2PO4, 0,4
M NaCl, pH 8,0) erneut suspendiert und erneut zentrifugiert. Die
Zellen wurden in 3 ml pro Gramm Nassgewicht des Lysepuffers (50
mM Tris, 300 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0), der 0,25 mg/ml Lysozym
enthielt, 30 Minuten lang auf Eis lysiert. Die DNA wurde mit einem
Ultraschallhomogenisator (Sonifier 250, Branson Ultrasonics, Danbury,
USA) 3 × 1
Minute lang mit 50% Kraft auf Eis scherzerkleinert. Das Lysat wurde
mittels 30-minütigem
Zentrifugieren mit 10.000 g gereinigt. Ni-NTA-Agarose (Qiagen) wurde
zugesetzt und mittels 1-stündigem
Schütteln
bei 4° C
gemischt. Das Gemisch wurde in eine Säule gegossen, die anschließend mit
10 Bettvolumina 20 mM Imidazol enthaltendem Lysepuffer gewaschen
wurde. Das Protein wurde in 250 mM Imidazol enthaltendem Lysepuffer
eluiert und bei 4° C über Nacht
gegen TBS (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7,4) dialysiert.
-
Beispiel 8: Hochdurchsatzproteinexpression
im Labormaßstab
-
Die
Proteine wurden von ausgewählten
Klonen der angeordneten Expressionsbibliothek menschlicher fötaler Gehirn-cDNA
(hEx1) exprimiert (Büssow
et al., Nucleic Acids Res. 26 (1998), 5007–5008). Diese Bibliothek wurde
zur IPTG-induzierbaren Expression der Fusionsproteine mit His6-Tag direktional in pQE-30NST kloniert. Mikrotiterplatten mit
96 2 ml fassenden Vertiefungen (StoreBlock, Zinsser) wurden mit
100 μl durch 100 μg/ml Ampicillin
und 15 μg/ml
Kanamycin ergänztem
SB-Medium gefüllt.
Die Kulturen wurden mit E. coli-SCS1-Zellen von Bibliotheksplatten
mit 384 Vertiefungen (Genetix, Christchurch, UK) geimpft, die bei –80° C gelagert
worden waren. Zum Impfen wurden Replikationsvorrichtungen mit 96
Stahlnadeln (Länge
6 cm) verwendet. Nach Kultivieren über Nacht bei 37° C unter
starkem Schütteln
wurden 900 μl
des vorgewärmten
Mediums den Kulturen zugesetzt und die Inkubation über 1 Stunde
fortgesetzt. Zur Auslösung
der Proteinexpression wurde einer Endkonzentration von 1 mM IPTG
zugesetzt. Sämtliche
nachfolgenden Schritte inklusive Zentrifugieren erfolgten ebenfalls
im 96-Vertiefungen-Format. Die Zellen wurden mittels 10-minütigem Zentrifugieren
mit 1900 g (3400 UpM) geerntet, durch erneute Suspension in Phosphatpuffer
gewaschen, 5 Minuten lang zentrifugiert und durch erneute Suspension
in 150 μl
Puffer A (6 M Guanidinium-HCl, 0,1 M NaH2PO9, 0, 01 M Tris-HCl, pH 8, 0) lysiert. Die
Bakterientrümmer
wurden durch 15-minütiges
Zentrifugieren mit 4000 UpM pelletiert. Die Überstände wurde durch eine eine nichtproteinbindende
PVDF-Membran einer Porengröße von 0,65 μm (Durapore
MADV N 65, Millipore) enthaltende Filterplatte mit 96 Vertiefungen
auf einem Vakuumfilterhalter filtriert.
-
Beispiel 9: Automatisches
Filter-Spotting
-
Zuvor
zugeschnittene (25 × 75
cm) Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Filterstreifen (Immobilon P, Millipore) wurden
in 96% Ethanol eingeweicht und 1 Minute lang mit destilliertem Wasser
gespült.
5 nasse Filterstreifen wurden mittels Klebeband an einer 230 × 230 mm
großen
Kunststoffwanne befestigt. Das Spotting erfolgte mit Hilfe eines
motorbetriebenen Übertragsstempels
(6), der mit einer Auflösung von 5 μm in x-y-z-Richtung positioniert
werden kann (Linear Drives, Basildon, UK). Dies erlaubt eine Dichte
von etwa 300 Proben/cm2, gespottet in einem
Duplikatmuster. Der Übertragsstempel
besitzt 4 × 4
= 16 einzeln befestigte, gefederte Nadeln im Abstand von 4, 5 mm.
Da der Abstand zu dem Abstand der Platten mit 384 Vertiefungen kompatibel
ist, ermöglicht
diese Vorrichtung das hochdichte Spotting von Miktrotiterplatten
mit 384 Vertiefungen. Die Größe der Spitze
des stumpfen Endes der Nadeln aus rostfreiem Stahl beträgt 250 μm. Vor dem
Transfer wurde die Spotting-Vorrichtung in einem 30% Ethanol-Bad
gewaschen und anschließend
mit einem Ventilator getrocknet, um eine Kreuzkontaminierung zu
verhindern. Für
die hier dargestellten Experimente wurden mit jeder Nadel 4 × 4 Muster
gespottet. Jedes Muster enthält
3 Tinten-Guide-Spots, die von 6 doppelt gespotteten Proben umgeben
sind (12 Probenspots insgesamt, 7A). Jeder
Spot wurde fünfmal
mit derselben Proteinprobe (jeweils 5 nl) beladen. Nach Anpassung
der Spotting-Höhe
im voraus dauerte das Spotting der 96 Proben zur Erzeugung von 5
identischen Proteinmikroarrays etwa 20 Minuten.
-
Beispiel 10: Antikörpernachweis
und Bildanalyse
-
Nach
dem Spotting wurden die Filter 1 Minute lang in Ethanol eingeweicht,
mit destilliertem Wasser gespült,
1 Minute lang in TBST (TBS, 0,1% Tween 20) gewaschen, 60 Minuten
lang in 2% Rinderserumalbumin (BSA)/TBST blockiert, 1 Stunde lang
bei Raumtemperatur mit monoklonalen Antikörpern in 2% BSA/TBST inkubiert,
zweimal 10 Minuten in TBST gewaschen und 1 Stunde lang mit sekundären Antikörpern in
2% BSA/TBST inkubiert. Anschließend
wurden die Filter über
Nacht in 20 ml TBST gewaschen und 1 bis 10 Minuten lang in 2 ml
CN/DAB-Lösung
(Pierce) inkubiert; die positiven Reaktionen wurden als schwarze
Spots nachgewiesen. Die Bilder wurden mittels einer gekühlten CCD-Kamera
(Fuji LHS, Raytest, Deutschland) erhalten. Die Bilder wurden durch
ein Fujinon-Objektiv (f: 0,8, 50 mm) mit einer Integrationszeit
von 20 ms aufgenommen. Die Bildanalyse erfolgte mit dem AIDA-Paket
(Raytest, Deutschland) zur Spoterkennung und -quantifizierung. Die
resultierenden Spotwerte wurden auf ein Excel-Spreadsheet (Microsoft,
USA) transferiert, um die Diagramme der 7, 8 und 9 darzustellen.
-
Beispiel 11: Herstellung
von Proteinmikroarrays
-
Die
Proteine wurden in flüssigen
Bakterienkulturen exprimiert und die Lösungen wurden entweder als Rohlysate
oder nach Reinigung mittels Ni-NTA-immobilisierter Metallaffinitätschromatographie
(IMAC) auf PVDF-Filter gespottet (Hochuli et al., J. Chromatography
411 (1987), 177–184).
Wegen ihrer überlegenen
Proteinbindungsfähigkeit
und mechanischen Festigkeit (im Vergleich zu Nitrocellulose) sowie
zufriedenstellender früherer
Leistung wurden PVDF-Filtermembranen
verwendet (Büssow
et al., Nucleic Acids Res. 26 (1998), 5007–5008). Der neue Übertragsstempel
(6) besteht aus Nadeln, deren Spitze 250 μm groß ist, was
fast der Hälfte
der Größe der 450 μm-Nadeln
entspricht, die bislang für
die Erzeugung von in situ-Proteinexpressionsfiltern verwendet wurden
(Büssow
et al., Nucleic Acids Res. 26 (1998), 5007–5008). Zwar zeigen die 7, 8 und 9 als unsere ersten Testergebnisse etwa
dieselbe Spotting-Dichte wie unsere in situ-Filter, doch der kleinere
Nadelspitzendurchmesser ermöglicht
höhere
Spotting-Dichten. Während
ein in situ-Filter von 222 × 222 mm
27.648 Klone aufnimmt (5 × 5
Duplitat-Spotting-Muster
mit einem Guide-Spot), konnten mit dem neuen Übertragsstempel mehr als 100.0000
Proben auf dieselbe Fläche
gesetzt werden. Dies ermöglicht
eine erhebliche Reduktion der Gesamtanordnungsgröße auf ein zweckmäßigeres
Mikroskop-Objektträger-Format
(25 × 75
mm mit 4800 Proben, entspricht 2400 Duplikaten). Das miniaturisierte
Set-up erlaubt eine sehr ökonomische
Verwendung und hohe Reagenzienkonzentrationen in Inkubationslösungen,
da ein wesentlich kleineres Puffervolumen ausreicht, um die Filter
zu bedecken. Im Gegensatz zu in situ-Filtern sind die erhaltenen Signale auf
Mikroarrays scharf und gut lokalisiert. Als nächsten Schritt bei der Herstellung
von Proteinchips sehen wir eine weitere Steigerung der Dichte mittels
Hochgeschwindigkeits-Picoliter-Spotting (Tintenstrahldrucken) auf modifizierte
Glasoberflächen
vor. Es wurden alternative Ansätze
für Proteinmikroarrays
berichtet: Photolithographie von Silanmonoschichten (Mooney et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1996), 12287–12291) oder Tintenstrahldrucken
auf Polystyrolfilme (Ekins, Clin. Chem. 44 (1998), 2015–2030; Silzel
et al., Clin. Chem. 44 (1998), 2036–2043). Im Gegensatz zu unserer
Bibliotheks-Spotting-Technologie
konzentrieren sich diese Fortschritte auf die Herstellung miniaturisierter
Immunoassay-Formate durch musterförmige Anordnung einzelner Proteine
(z.B. BSA, Avidin oder monoklonale Anti-IgG-Antikörper).
-
Beispiel 12: Empfindlichkeit
des spezifischen Proteinnachweises
-
Die
Empfindlichkeit des spezifischen Proteinnachweises auf Mikroarrays
wurde durch Spotting verschiedener Konzentrationen dreier gereinigter
Proteine – menschlicher
Glyceraldehyd-3-Phosphatdehydrogenase
(GAPDH, Swiss-Prot P04406), eines C-terminalen Fragments (40,3 kD) eines
menschlichen Hitzeschockproteins 90 alpha (HSP90alpha, Swiss-Prot
P07900) und des schwere Ketten bindenden Rattenimmunglobulinproteins
(BIP, Swiss-Prot P06761) – bewertet.
Die Mikroarrays wurden anschließend
mit einem monoklonalen Anti-GAPDH-Antikörper, Kaninchen-Anti-Mäuse-IgG-HRP
und dem HRP-Substrat CD/DAB inkubiert (7A). Die
Nachweisempfindlichkeit – als
niedrigste Konzentration, die klar sichtbare, spezifische Spots über dem
Hintergrundrauschen lieferte (Nachweisschwelle) – betrug laut Berechnung 10
fmol/μl,
was 250 Attomol bzw. 10 pg GAPDH in 5 × 5 nl (gespottet) entspricht
(7B).
-
Beispiel 13: Hochdurchsatzscreening
auf Proteinexpression
-
Rohlysate
von 92 Klonen der angeordneten Bibliothek menschlicher fötaler Gehirn-cDNA
(hEx1) (Büssow
et al., Nucleic Acids Res. 26 (1998), 5007–5008), die zuvor durch den
monoklonalen Antikörper
RGS-His (Qiagen) auf in situ-Filtern als Proteinexpressoren identifiziert
worden waren, wurden an 4 Kontrollproben und Tinten-Guide-Spots
entlang doppelt gespottet. Die Mikroarrays wurden mittels desselben
Antikörpers
auf die Expression von Fusionsproteinen mit RGS-His6-Tag durchsucht
(8A, Insert). Werden die relativen Intensitäten der
Duplikate (siehe 7A) gegeneinander aufgetragen,
deutet die entstandene Diagonale auf eine gute Reproduzierbarkeit
des Nachweisverfahrens (8A). Daher
wurden die Duplikatmittel bei allen 96 Proben aufgetragen und eine
willkürliche
Spezifitätsschwelle
zur Identifizierung von positiven Klonen auf eine relative Intensität von 7500
eingestellt (8B). Unter diesen Bedingungen
war eine Negativkontrolle (H1, Vektor pQE-30NST ohne Insert) ebenso
klar negativ (relative Intensität
1500) wie ein HSP90alpha-Klon
mit einem geteilten RGS-His6-Epitop (H2,
Vektor pQE-BH6, relative Intensität 0). Das Lysat eines GAPDH-Klons
mit RGS-His6-Tag (H3, Vektor pQE-30NST) wurde als Positivkontrolle
eingesetzt und lieferte ein Signal einer relativen Intensität von 21.000.
Das bei einem Ratten-BIP-Klon (H4, Vektor pQE-BH6) erhaltene eindeutig
positive Ergebnis (relative Intensität 15.000) ist überraschend,
da dieser Klon ebenfalls über
ein geteiltes RGS-His6-Epitop verfügt. Die
Reaktivität
könnte
durch die teilweise Rekonstitution des RGS-His6-Epitops
aufgrund der Konformationseigenschaften von BIP erklärt werden.
-
Die
cDNA-Inserts von 54 der 92 mutmaßlichen hEx1-Expressionsklone
zeigen eine Homologie zu den GenBank-Einträgen menschlicher Gene (Büssow, Doktorarbeit,
Chemische Fakultät,
Freie Universität
Berlin (1998)). Diese Inserts wurden auf ihre Leserahmen (RF) in
Relation zu der vektorcodierten RGS-His6-Tag-Sequenz überprüft. Es stellte
sich heraus, dass 34 Inserts (63%) im richtigen Leserahmen (RF+)
kloniert waren, 20 (37%) jedoch in einem falschen Leserahmen (RF–), so dass
man erwartete, dass diese Klone das vorhergesagte Protein nicht
exprimieren konnten. Alle 92 Klone wurden jedoch ursprünglich aufgrund
der eindeutig positiven Signale bei dem monoklonalen Antikörper RGS-His
als Proteinexpressoren auf in situ-Filtern ausgewählt (Intensitätsebenen
2 und 3) (Büssow,
Doktorarbeit, Chemische Fakultät,
Freie Universität
Berlin (1998)). Auf Mikroarrays wurde die Anzahl der als Proteinexpressoren
identifizierten falschen Leserahmen-Klone um 70% reduziert, da nur
6 RF(–)-Klone als positiv
bestätigt
wurden (8B). Dies deutet darauf hin,
dass die neue Mikroarray-Technologie aufgrund ihrer überlegenen
Fähigkeit
zum Ausschluss falscher Leserahmen-Klone einen großen Fortschritt
gegenüber
in situ-Filtern
darstellt. Andererseits war nur ein RF(+)-Klon eindeutig unter der
Spezifitätsschwelle
und wäre
bei diesem Screening wahrscheinlich aufgrund einer unzureichenden in
die Mikrotitervertiefung exprimierten Proteinmenge übersehen
worden. Auch dies betont die Bedeutung unseres Ansatzes, der ausschließlich auf
der „Positiv"-Bestätigung durch
Sequenzierung und/oder Proteincharakterisierung beruht (Büssow et
al., Nucleic Acids Res. 26 (1998), 5007–5008).
-
Zusammengefasst
führte
das Screening der Hochdurchsatzproteinexpression auf Mikroarrays
zu einer Falsch-Negativ-Rate von weniger als 2% (1 nicht nachgewiesener
RF(+)-Klon von insgesamt 54 Klonen). Die Rate der falschpositiven
Klone, die Proteine in falschen Leserahmen exprimieren, betrug nur
11% im Vergleich zu 37% bei in situ-Filtern (Büssow, Doktorarbeit, Chemische
Fakultät,
Freie Universität
Berlin (1998)). Dies macht Protein-Mikroarrays zu einem ökonomischen
Werkzeug für
ein sehr empfindliches Proteinexpressionsscreening.
-
Beispiel 14: Antikörperspezifitätsscreening
-
Protein-Mikroarrays
mit demselben Testset von 92 hEx1-Expressionsklonen und 4 Kontrollen (siehe oben)
wurden mittels monoklonaler Antikörper auf die menschlichen Proteine
GAPDH, HSP90alpha und Alphatubulin durchsucht. Während der Anti-GAPDH-Antikörper ausschließlich sein
Zielantigen nachwies (H3, 9A), erkannte
Anti-HSP90alpha zwar vorzugsweise sein Zielantigen (H2, 9B),
zeigte jedoch eine gewisse Kreuzreaktivität mit mindestens 2 anderen
Klonen (H10, 60S ribosomales Protein L18A und H3, GAPDH). Die Antikörper-Kreuzreaktivität war bei
dem Anti-Alphatubulin-Screening sogar noch ausgeprägter (9C).
Während
die beiden RF(+)-Alphatubulin-Klone
in dem Testset (F9 und A4) spezifisch erkannt wurden und das einzige
RF(–)-Klon
(C7) unentdeckt blieb, zeigten 9 andere Klone eine Anti-Alphatubulin-Reaktivität über der
willkürlichen
Spezifitätsschwelle.
2 dieser Klone (B1 und B12) stellen unbekannte Gene dar, G1 ist
ein RF(–)-Betatubulin-Klon.
H3 ist das GAPDH-positive Kontrollklon von 8 (siehe
oben), das bis zu einem gewissen Grad unspezifische Kreuzreaktionen
aufweist ( 9B und 9C), möglicherweise
aufgrund einer außergewöhnlich hohen
Proteinexpressionsebene. Überraschenderweise
exprimieren alle anderen (5) Klone über der Schwelle ribosomale
Proteine in einem richtigen Leserahmen (E5, RPL3; H10, RPL18A; E6 und
D8, RPS2; F7, RPS3A). Nur ein zusätzliches ribosomales Protein
in dem Testset (E3, RPS25) zeigte keine Anti-Alphatubulin-Reaktivität. Das von
dem Anti-Alphatubulin-Antikörper
erkannte Epitop (YL1/2) (Kilmartin et al., J. Cell Biol. 93 (1982),
576–582)
wurde als die die carboxy-terminalen Reste von tyrosiniertem Alphatubulin umfassende
lineare Sequenz identifiziert (Wehland et al., EMBO J. 3 (1984),
1295–1300).
Gemäß den Autoren sind
die Mindestsequenzerfordernisse gemäß Definition in Dipeptidstudien
eine negativ geladene Seitenkette in der penultimativen Position
und ein aromatischer Rest, der die freie Carboxylatgruppe tragen
muss. Da keines der eine Kreuzreaktion aufweisenden ribosomalen
Proteine auf unseren Mikroarrays diese Erfordernisse erfüllt, können andere
(z.B. strukturelle) Epitope die Antigenspezifität nachahmen.
-
-