JP2002513588A - 所望の生物学的特性を与えるクローンを発現ライブラリーから同定する新規方法 - Google Patents
所望の生物学的特性を与えるクローンを発現ライブラリーから同定する新規方法Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、所望の生物学的特性を与えるクローンを発現ライブラリーから同定及び／又は特徴づけするための新規な方法に関する。本発明の方法は、そのクローンがアレイ形態で配置されている前記発現ライブラリーのクローンの組換えインサートとともに融合タンパク質として発現されるタグのような、少なくとも１つの（ポリ）ペプチドの発現について分析する工程を含む。前記（ポリ）ペプチドは、前記インサートにＮ末端か又はＣ末端で融合し得る。本発明の方法は、前記所望の生物学的特性を与えるクローンのインサートによって発現される（ポリ）ペプチドと特異的に相互作用するリガンドをアレイ形態のクローンの前記ライブラリーの第一レプリカと接触させること、及び前記クローンのライブラリーを相互作用の発生について分析すること、及び／又は所望の生物学的特性を与えるクローンのインサートに特異的な核酸プローブを用いて、アレイ形態に配置された前記クローンのライブラリーの第二レプリカとのハイブリダイゼーション又はオリゴヌクレオチド・フィンガープリントを実施すること、及び前記クローンのライブラリーを特異的なハイブリダイゼーションの発生について分析することを含む。最後に、本発明の方法は、工程（ａ）における少なくとも１つの（ポリ）ペプチド発現、及び／又は工程（ｂ）における相互作用、及び／又は工程（ｃ）におけるハイブリダイゼーション又はオリゴヌクレオチド・フィンガープリントが検出され得るクローンを同定することを必要とする。本発明はまた本発明の方法を実施するのに有用なキットにも関する。
Description
【０００１】 発明の背景 タンパク質は、機能ユニットへ翻訳されるゲノム配列情報であり、生物学的プ
ロセスを可能にする。大きくて複雑なヒトゲノムの配列を決定しようとする初期
の試みは、ｃＤＮＡレパートリーに代表されるように、発現領域に意図的に注力
されてきた（Adams et al., Nature 377 (1995), 3S-174S）。同時に、ほとんど
のヒト遺伝子についての発現配列タグ（ＥＳＴ）がヌクレオチドデータベースに
集められてきた（Wolfsberg et al., Nucl. Acids Res. 25 (1997), 1626-1632
）。しかしながら、機能がこれまでに特定されたのは、これらの配列のごく一部
でしかない（Strachan et al., Nature Genet. 16 (1997), 126-132）。この構
造−機能の不一致への最も直接的な解決法は、ある組織の機能状態とある遺伝子
セットの発現とを直接関連づけることであると考えられる。現在、遺伝子発現の
様々なレベルで、この目標に迫る技術がある。転写レベルでは、複雑なプローブ
（DeRisi et al., Science 278 (1997), 680-686; Schena et al., Science 270
81995), 467-470; Bernard et al., Nucl. Acids Res. 24 (1997), 1435-1442;
Mallo et al., Int. J. Cancer 74 (1997), 35-44）又は短オリゴヌクレオチド
のセット（Velculescu et al., Science 270 (1995), 484-487）とｃＤＮＡアレ
イとのハイブリダイゼーション、ＳＡＧＥ配列決定アプローチ（Wodicka et al.
, Nature Biotechnol. 15 (1997), 1359-1367）又はオリゴヌクレオチドアレイ
へのハイブリダイゼーション（Maier et al., Drug Discovery Today 2 (1997),
315-324）によって遺伝子発現パターンが分析されてきた。
ロセスを可能にする。大きくて複雑なヒトゲノムの配列を決定しようとする初期
の試みは、ｃＤＮＡレパートリーに代表されるように、発現領域に意図的に注力
されてきた（Adams et al., Nature 377 (1995), 3S-174S）。同時に、ほとんど
のヒト遺伝子についての発現配列タグ（ＥＳＴ）がヌクレオチドデータベースに
集められてきた（Wolfsberg et al., Nucl. Acids Res. 25 (1997), 1626-1632
）。しかしながら、機能がこれまでに特定されたのは、これらの配列のごく一部
でしかない（Strachan et al., Nature Genet. 16 (1997), 126-132）。この構
造−機能の不一致への最も直接的な解決法は、ある組織の機能状態とある遺伝子
セットの発現とを直接関連づけることであると考えられる。現在、遺伝子発現の
様々なレベルで、この目標に迫る技術がある。転写レベルでは、複雑なプローブ
（DeRisi et al., Science 278 (1997), 680-686; Schena et al., Science 270
81995), 467-470; Bernard et al., Nucl. Acids Res. 24 (1997), 1435-1442;
Mallo et al., Int. J. Cancer 74 (1997), 35-44）又は短オリゴヌクレオチド
のセット（Velculescu et al., Science 270 (1995), 484-487）とｃＤＮＡアレ
イとのハイブリダイゼーション、ＳＡＧＥ配列決定アプローチ（Wodicka et al.
, Nature Biotechnol. 15 (1997), 1359-1367）又はオリゴヌクレオチドアレイ
へのハイブリダイゼーション（Maier et al., Drug Discovery Today 2 (1997),
315-324）によって遺伝子発現パターンが分析されてきた。
【０００２】 翻訳レベルでは、タンパク質抽出物が２次元ゲル上に高解像度でマップされた
（Klose et al., Electrophoresis 16 (1995), 1034-1059）。配列情報を得るの
にタンパク質スポットの質量分析法も使用された（Clauser et al., Proc. Natl
. Acad. Sci. USA 92 (1995), 5072-5076）。哺乳類細胞でクローンｃＤＮＡを
発現させ、そのタンパク質産物を細胞タンパク質の２次元電気泳動パターンに適
合させる方法がLeffers et al.（Leffers et al., Electrophoresis 17 (1996),
1713-1719）に記載された。整理されたｃＤＮＡライブラリーからプールしたク
ローンがin vitroの転写／翻訳により発現され、２次元電気泳動によって分析さ
れた（Lefkovits et al., Appl. Theor. Electrophor. 5 (1995), 35-42; Behar
et al., Appl. Theor. Electrophor. 5 (1995), 99-105; Lefkovits et al., A
ppl. Theor. Electrophor. 5 (1995), 43-47）。
（Klose et al., Electrophoresis 16 (1995), 1034-1059）。配列情報を得るの
にタンパク質スポットの質量分析法も使用された（Clauser et al., Proc. Natl
. Acad. Sci. USA 92 (1995), 5072-5076）。哺乳類細胞でクローンｃＤＮＡを
発現させ、そのタンパク質産物を細胞タンパク質の２次元電気泳動パターンに適
合させる方法がLeffers et al.（Leffers et al., Electrophoresis 17 (1996),
1713-1719）に記載された。整理されたｃＤＮＡライブラリーからプールしたク
ローンがin vitroの転写／翻訳により発現され、２次元電気泳動によって分析さ
れた（Lefkovits et al., Appl. Theor. Electrophor. 5 (1995), 35-42; Behar
et al., Appl. Theor. Electrophor. 5 (1995), 99-105; Lefkovits et al., A
ppl. Theor. Electrophor. 5 (1995), 43-47）。
【０００３】 これまで、個々のクローンについてのＤＮＡ配列情報から直接タンパク質産物
を導き、再び全ゲノムレベルへ戻すための技術はない。そのような方法は、特に
生物学的材料の大規模分析に重要であろう。
を導き、再び全ゲノムレベルへ戻すための技術はない。そのような方法は、特に
生物学的材料の大規模分析に重要であろう。
【０００４】 どちらかと言えば、そのような材料の大規模分析用に設計された先行技術の方
法は、労力と時間がひどくかかり、さらに、不適切に多数の偽陽性クローンを原
理的に与えるものである。従って、本発明の根底にある技術課題は、上記の課題
を克服して、特に哺乳類ゲノムのレベルでのライブラリースクリーンにおける偽
陽性クローンの数を有意に減らす方法を提供することであった。前記技術課題の
解決は、本発明の特許請求で特徴づけられる態様を提供することにより達成され
る。
法は、労力と時間がひどくかかり、さらに、不適切に多数の偽陽性クローンを原
理的に与えるものである。従って、本発明の根底にある技術課題は、上記の課題
を克服して、特に哺乳類ゲノムのレベルでのライブラリースクリーンにおける偽
陽性クローンの数を有意に減らす方法を提供することであった。前記技術課題の
解決は、本発明の特許請求で特徴づけられる態様を提供することにより達成され
る。
【０００５】 発明の要約 本発明は、所望の生物学的特性を与えるクローンを発現ライブラリーから同定
及び／又は特徴づけするための新規な方法に関する。本発明の方法は、そのクロ
ーンがアレイ形態で配置されている前記発現ライブラリーのクローンの組換えイ
ンサートとともに融合タンパク質として発現されるタグのような、少なくとも１
つの（ポリ）ペプチドの発現について分析する工程を含む。前記（ポリ）ペプチ
ドは、前記インサートにＮ末端か又はＣ末端で融合し得る。本発明の方法は、前
記所望の生物学的特性を与えるクローンのインサートによって発現される（ポリ
）ペプチドと特異的に相互作用するリガンドをアレイ形態のクローンの前記ライ
ブラリーの第一レプリカと接触させること、及び前記クローンのライブラリーを
相互作用の発生について分析すること、及び／又は所望の生物学的特性を与える
クローンのインサートに特異的な核酸プローブを用いて、アレイ形態に配置され
た前記クローンのライブラリーの第二レプリカのハイブリダイゼーション又はオ
リゴヌクレオチド・フィンガープリントを実施すること、及び前記クローンのラ
イブラリーを特異的なハイブリダイゼーションの発生について分析することを含
む。最後に、本発明の方法は、工程（ａ）における少なくとも１つの（ポリ）ペ
プチド発現、及び／又は工程（ｂ）における相互作用、及び／又は工程（ｃ）に
おけるハイブリダイゼーション又はオリゴヌクレオチド・フィンガープリントが
検出され得るクローンを同定することを必要とする。本発明はまた本発明の方法
を実施するのに有用なキットにも関する。
及び／又は特徴づけするための新規な方法に関する。本発明の方法は、そのクロ
ーンがアレイ形態で配置されている前記発現ライブラリーのクローンの組換えイ
ンサートとともに融合タンパク質として発現されるタグのような、少なくとも１
つの（ポリ）ペプチドの発現について分析する工程を含む。前記（ポリ）ペプチ
ドは、前記インサートにＮ末端か又はＣ末端で融合し得る。本発明の方法は、前
記所望の生物学的特性を与えるクローンのインサートによって発現される（ポリ
）ペプチドと特異的に相互作用するリガンドをアレイ形態のクローンの前記ライ
ブラリーの第一レプリカと接触させること、及び前記クローンのライブラリーを
相互作用の発生について分析すること、及び／又は所望の生物学的特性を与える
クローンのインサートに特異的な核酸プローブを用いて、アレイ形態に配置され
た前記クローンのライブラリーの第二レプリカのハイブリダイゼーション又はオ
リゴヌクレオチド・フィンガープリントを実施すること、及び前記クローンのラ
イブラリーを特異的なハイブリダイゼーションの発生について分析することを含
む。最後に、本発明の方法は、工程（ａ）における少なくとも１つの（ポリ）ペ
プチド発現、及び／又は工程（ｂ）における相互作用、及び／又は工程（ｃ）に
おけるハイブリダイゼーション又はオリゴヌクレオチド・フィンガープリントが
検出され得るクローンを同定することを必要とする。本発明はまた本発明の方法
を実施するのに有用なキットにも関する。
【０００６】 発明の詳細な説明 本発明は、以下の工程を含んでなる、所望の生物学的特性を与える発現ライブ
ラリーのクローンを同定及び／又は特徴づけする方法に関する： （ａ）アレイ形態で配置されている前記発現ライブラリーのクローンの組換え
インサートの発現産物とともに融合タンパク質として発現される少なくとも１つ
の（ポリ）ペプチドの発現について分析すること、 （ｂ）前記所望の生物学的特性を与えるクローンのインサートによって発現さ
れる（ポリ）ペプチドと特異的に相互作用するリガンドを、アレイ形態のクロー
ンの前記ライブラリー又は前記ライブラリーの第一レプリカと接触させること、
及び前記クローンのライブラリーを相互作用の発生について分析すること；及び
／又は、 （ｃ）所望の生物学的特性を与えるクローンのインサートに特異的な核酸プロ
ーブを用いて、アレイ形態に配置されたクローンの前記ライブラリー又は前記第
一レプリカ又は前記ライブラリーの第二レプリカとのハイブリダイゼーション又
はオリゴヌクレオチド・フィンガープリントを実施すること、及び前記クローン
のライブラリーをハイブリダイゼーションの発生について分析すること；及び （ｄ）工程（ａ）における少なくとも１つの（ポリ）ペプチドの発現、及び／
又は工程（ｂ）における相互作用、及び／又は工程（ｃ）における特異的なハイ
ブリダイゼーション又はオリゴヌクレオチド・フィンガープリントが検出され得
るクローンを同定すること及び／又は特徴づけること。
ラリーのクローンを同定及び／又は特徴づけする方法に関する： （ａ）アレイ形態で配置されている前記発現ライブラリーのクローンの組換え
インサートの発現産物とともに融合タンパク質として発現される少なくとも１つ
の（ポリ）ペプチドの発現について分析すること、 （ｂ）前記所望の生物学的特性を与えるクローンのインサートによって発現さ
れる（ポリ）ペプチドと特異的に相互作用するリガンドを、アレイ形態のクロー
ンの前記ライブラリー又は前記ライブラリーの第一レプリカと接触させること、
及び前記クローンのライブラリーを相互作用の発生について分析すること；及び
／又は、 （ｃ）所望の生物学的特性を与えるクローンのインサートに特異的な核酸プロ
ーブを用いて、アレイ形態に配置されたクローンの前記ライブラリー又は前記第
一レプリカ又は前記ライブラリーの第二レプリカとのハイブリダイゼーション又
はオリゴヌクレオチド・フィンガープリントを実施すること、及び前記クローン
のライブラリーをハイブリダイゼーションの発生について分析すること；及び （ｄ）工程（ａ）における少なくとも１つの（ポリ）ペプチドの発現、及び／
又は工程（ｂ）における相互作用、及び／又は工程（ｃ）における特異的なハイ
ブリダイゼーション又はオリゴヌクレオチド・フィンガープリントが検出され得
るクローンを同定すること及び／又は特徴づけること。
【０００７】 本明細書で使用される「組換えインサート」という用語は、前記少なくとも１
つの（ポリ）ペプチドをコードする核酸フラグメントとともにオープンリーディ
ングフレームを産生するような、前記発現ライブラリーの製造に使用される発現
ベクターのなかに存在する核酸フラグメントを意味するが、前記オープンリーデ
ィングフレームが発現すると、前記融合タンパク質を生じる。
つの（ポリ）ペプチドをコードする核酸フラグメントとともにオープンリーディ
ングフレームを産生するような、前記発現ライブラリーの製造に使用される発現
ベクターのなかに存在する核酸フラグメントを意味するが、前記オープンリーデ
ィングフレームが発現すると、前記融合タンパク質を生じる。
【０００８】 本明細書で使用される「発現ライブラリーのクローン」という用語は、組換え
遺伝物質を含有して発現ライブラリーの一部となる、増殖可能で、本質的にクロ
ーン性の生物学的材料を意味する。典型的には、この用語は細菌性の形質転換細
胞に言及するが、他の形質転換細胞や組換えウイルス性の物質やバクテリオファ
ージに関することもある。「発現ライブラリー」という用語は、当技術分野でよ
く理解されている；例えば、Sambrook et al., "Molecular Cloning, a Laborat
ory Handbook", 2nd edition (1989), CSH Press, Cold Spring Harbor, N. Y.
を参照のこと。好ましくは、発現ライブラリーはインデューサーによって誘導さ
れ得る。インデューサーは当技術分野で知られていて、例えば、ＩＰＴＧを包含
する。様々なタイプの発現ライブラリーが当技術分野で知られている。これらの
タイプのすべてが本発明に含まれる。好ましいタイプのライブラリーは、エクソ
ントラッピングから生じるライブラリー（即ち、エクソンが捕捉されたライブラ
リー）、又はシャトルベクター（例えば、原核生物及び真核生物のシステム、多
重原核生物及び／又は多重真核生物システムにおいて使用され得るベクター）で
つくられるライブラリーである。さらに、発現ライブラリーは多種多様な供給源
から構築されることがよく知られている。また、本発明は上記の方法におけるす
べての前記供給源の使用を想定する。そのような供給源は、例えば、哺乳動物又
は他の真核生物の細胞、組織、細菌、他の微生物、植物、酵母、血液、又は細胞
系であり得る。
遺伝物質を含有して発現ライブラリーの一部となる、増殖可能で、本質的にクロ
ーン性の生物学的材料を意味する。典型的には、この用語は細菌性の形質転換細
胞に言及するが、他の形質転換細胞や組換えウイルス性の物質やバクテリオファ
ージに関することもある。「発現ライブラリー」という用語は、当技術分野でよ
く理解されている；例えば、Sambrook et al., "Molecular Cloning, a Laborat
ory Handbook", 2nd edition (1989), CSH Press, Cold Spring Harbor, N. Y.
を参照のこと。好ましくは、発現ライブラリーはインデューサーによって誘導さ
れ得る。インデューサーは当技術分野で知られていて、例えば、ＩＰＴＧを包含
する。様々なタイプの発現ライブラリーが当技術分野で知られている。これらの
タイプのすべてが本発明に含まれる。好ましいタイプのライブラリーは、エクソ
ントラッピングから生じるライブラリー（即ち、エクソンが捕捉されたライブラ
リー）、又はシャトルベクター（例えば、原核生物及び真核生物のシステム、多
重原核生物及び／又は多重真核生物システムにおいて使用され得るベクター）で
つくられるライブラリーである。さらに、発現ライブラリーは多種多様な供給源
から構築されることがよく知られている。また、本発明は上記の方法におけるす
べての前記供給源の使用を想定する。そのような供給源は、例えば、哺乳動物又
は他の真核生物の細胞、組織、細菌、他の微生物、植物、酵母、血液、又は細胞
系であり得る。
【０００９】 「所望の生物学的特性」という用語は、機能的な特性だけでなく構造的な特性
のような非機能的な特性も含むように考えられている。機能的な特性は、例えば
、抗体やフラグメント、又はそれらの誘導体によって与えられるような結合特性
であり得る。別の選択肢では、前記機能的な特性は、酵素活性により提供される
ような、標的分子の代謝回転に関する場合がある。一方、非機能的な特性は、例
えば核酸ハイブリダイゼーションによって検出され得る核酸の一次構造に関する
場合がある。
のような非機能的な特性も含むように考えられている。機能的な特性は、例えば
、抗体やフラグメント、又はそれらの誘導体によって与えられるような結合特性
であり得る。別の選択肢では、前記機能的な特性は、酵素活性により提供される
ような、標的分子の代謝回転に関する場合がある。一方、非機能的な特性は、例
えば核酸ハイブリダイゼーションによって検出され得る核酸の一次構造に関する
場合がある。
【００１０】 「（ポリ）ペプチド」という用語は、天然に存在するか又は組換え的、化学的
又は他の手段によって産生又は修飾されたペプチドとポリペプチドの両方に言及
し、所望によりネーティブなタンパク質とほとんど同じようなやり方で、タンパ
ク質の３次元構造をとって、翻訳後にプロセシングを受ける場合もある。
又は他の手段によって産生又は修飾されたペプチドとポリペプチドの両方に言及
し、所望によりネーティブなタンパク質とほとんど同じようなやり方で、タンパ
ク質の３次元構造をとって、翻訳後にプロセシングを受ける場合もある。
【００１１】 「融合タンパク質」という用語は、天然ではそのような（ポリ）ペプチドを形
成しない少なくとも２つの（ポリ）ペプチドからなるか又はそれらを含む（ポリ
）ペプチドを意味する。ＤＮＡレベルでは、２種又はそれ以上のコード配列が正
しいフレームで融合している。
成しない少なくとも２つの（ポリ）ペプチドからなるか又はそれらを含む（ポリ
）ペプチドを意味する。ＤＮＡレベルでは、２種又はそれ以上のコード配列が正
しいフレームで融合している。
【００１２】 本明細書で使用される「アレイ形態」という用語は、複製し得る規則的又は不
規則な形態に言及する。好ましいのは規則的な形態、特に、例えば Lehrach et
al., Interdisciplinary Science Reviews 22 (1997), 37-44 に記載されるよう
な高密度グリッドである。
規則な形態に言及する。好ましいのは規則的な形態、特に、例えば Lehrach et
al., Interdisciplinary Science Reviews 22 (1997), 37-44 に記載されるよう
な高密度グリッドである。
【００１３】 本明細書で使用される「リガンド」という用語は、その３次元構造により所望
の（ポリ）ペプチドと特異的に相互作用し得る任意のタイプの分子を含む。その
３次元構造に依存して、前記リガンドはまた、組換えインサートにより発現され
る（ポリ）ペプチドと非特異的に相互作用する。典型的なリガンドの例は、抗体
又はホルモン受容体のような他の受容体である。抗体に関して言えば、非特異的
な相互作用の典型的な例は交叉反応である。
の（ポリ）ペプチドと特異的に相互作用し得る任意のタイプの分子を含む。その
３次元構造に依存して、前記リガンドはまた、組換えインサートにより発現され
る（ポリ）ペプチドと非特異的に相互作用する。典型的なリガンドの例は、抗体
又はホルモン受容体のような他の受容体である。抗体に関して言えば、非特異的
な相互作用の典型的な例は交叉反応である。
【００１４】 核酸プローブとの「ハイブリダイゼーション」という用語は、特異的又は非特
異的なハイブリダイゼーションに言及する。ハイブリダイゼーションが特異的か
非特異的であるかは、当技術分野で知られているストリンジェンシー条件次第で
ある。「特異的なハイブリダイゼーション」という用語は、ストリンジェントな
条件に関する。前記ハイブリダイゼーション条件は、例えば Sambrook et al.,
"Molecular Cloning, a Laboratory Handbook", 2nd edition (1989), CSH Pres
s, Cold Spring Harbor, N. Y.; Ausbel, "Current Protocols in Molecular Bi
ology", Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N. Y. (1989)
;又は Higgins and Hames (eds) "Nucleic acid hybridization, a practical a
pproach" IRL Press Oxford, Washington DC (1985) に記載されている従来のプ
ロトコールにより決定し得る。特異的なハイブリダイゼーション条件の例は、「
４ｘＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ、６５℃でハイブリダイゼーション、次いで０．
１ｘＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ、６５℃で洗浄」である。他のやり方では、スト
リンジェントなハイブリダイゼーション条件は、例えば「５０％ホルムアミド、
４ｘＳＳＣ、４２℃」である。非特異的な条件は、例えば「４ｘＳＳＣ及び１％
ＳＤＳ、５０℃でハイブリダイゼーション、次いで同一条件で洗浄」である。
異的なハイブリダイゼーションに言及する。ハイブリダイゼーションが特異的か
非特異的であるかは、当技術分野で知られているストリンジェンシー条件次第で
ある。「特異的なハイブリダイゼーション」という用語は、ストリンジェントな
条件に関する。前記ハイブリダイゼーション条件は、例えば Sambrook et al.,
"Molecular Cloning, a Laboratory Handbook", 2nd edition (1989), CSH Pres
s, Cold Spring Harbor, N. Y.; Ausbel, "Current Protocols in Molecular Bi
ology", Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N. Y. (1989)
;又は Higgins and Hames (eds) "Nucleic acid hybridization, a practical a
pproach" IRL Press Oxford, Washington DC (1985) に記載されている従来のプ
ロトコールにより決定し得る。特異的なハイブリダイゼーション条件の例は、「
４ｘＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ、６５℃でハイブリダイゼーション、次いで０．
１ｘＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ、６５℃で洗浄」である。他のやり方では、スト
リンジェントなハイブリダイゼーション条件は、例えば「５０％ホルムアミド、
４ｘＳＳＣ、４２℃」である。非特異的な条件は、例えば「４ｘＳＳＣ及び１％
ＳＤＳ、５０℃でハイブリダイゼーション、次いで同一条件で洗浄」である。
【００１５】 本発明によれば、工程（ｂ）及び／又は（ｃ）は、前記ライブラリー及び／又
は前記ライブラリーの第一レプリカ及び／又は第二レプリカ及び／又はそれ以上
のレプリカについて実施し得る。前記ライブラリー又は前記第一又は第二又はそ
れ以上のレプリカが２種の異なる工程で使用される場合、工程（ａ）及び／又は
（ｂ）の間に加えられる、以後の工程に干渉し得る物質は、好ましくは従来のプ
ロトコールにより、以後の工程の実施に先立って、所望により除去し得る。
は前記ライブラリーの第一レプリカ及び／又は第二レプリカ及び／又はそれ以上
のレプリカについて実施し得る。前記ライブラリー又は前記第一又は第二又はそ
れ以上のレプリカが２種の異なる工程で使用される場合、工程（ａ）及び／又は
（ｂ）の間に加えられる、以後の工程に干渉し得る物質は、好ましくは従来のプ
ロトコールにより、以後の工程の実施に先立って、所望により除去し得る。
【００１６】 「クローンを同定する」という用語は、関心対象のクローンを同定するのに適
したあらゆるタイプの同定工程を含む。例えば、組換えインサートとともに融合
タンパク質として発現される（ポリ）ペプチドがグリーン蛍光タンパク質であり
、視覚的に検出可能なラベルで（例、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペル
オキシダーゼ、又はＦＩＴＣ）リガンド又はプローブが標識されていれば、視覚
的な手段によりクローンを同定し得る。さらに、ポジティブ・クローンは、当技
術分野でよく知られているブルー／ホワイト選別法によっを同定し得る。他のや
り方では、核酸プローブが放射活性ラベルで標識されていれば、Ｘ腺フィルムへ
の露出は所望のクローンを同定することに役立ち得る。クローンはまた質量分析
法によっても同定され得る。
したあらゆるタイプの同定工程を含む。例えば、組換えインサートとともに融合
タンパク質として発現される（ポリ）ペプチドがグリーン蛍光タンパク質であり
、視覚的に検出可能なラベルで（例、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペル
オキシダーゼ、又はＦＩＴＣ）リガンド又はプローブが標識されていれば、視覚
的な手段によりクローンを同定し得る。さらに、ポジティブ・クローンは、当技
術分野でよく知られているブルー／ホワイト選別法によっを同定し得る。他のや
り方では、核酸プローブが放射活性ラベルで標識されていれば、Ｘ腺フィルムへ
の露出は所望のクローンを同定することに役立ち得る。クローンはまた質量分析
法によっても同定され得る。
【００１７】 「オリゴヌクレオチド・フィンガープリント」という用語は、核酸、好ましく
はＤＮＡの上に数多くのオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせるときに得ら
れるハイブリダイゼーション・パターン（ハイブリダイゼーション／非ハイブリ
ダイゼーション）を分析して得られる配列の、配列依存的で再現可能な、統計的
に有意なパターン又はフィンガープリントを産生することを説明する。
はＤＮＡの上に数多くのオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせるときに得ら
れるハイブリダイゼーション・パターン（ハイブリダイゼーション／非ハイブリ
ダイゼーション）を分析して得られる配列の、配列依存的で再現可能な、統計的
に有意なパターン又はフィンガープリントを産生することを説明する。
【００１８】 本発明の方法は従来技術の方法に優る意義深い利点を示し、哺乳類及び／又は
植物及び／又は他の真核生物のゲノムを効率的に分析することに特に適している
が、勿論、他の発現ライブラリー、例えば原核生物や他の微生物由来のゲノムＤ
ＮＡ発現ライブラリーの分析にも適用し得る。この新しい方法は発現ライブラリ
ーのスクリーニングにおける偽陽性クローンのバックグラウンドを顕著に減少さ
せる。特に１つ又はそれ以上のライブラリーのなかにある多数のクローンがスク
リーニングされるときは、結局は所望の生物学的特性を有さないことが判明する
クローンを同定するという時間のかかる作業を回避することが可能になる。当然
ながら、これにより、ゲノム及び／又はタンパク質分析におけるコスト要因も有
意に減少されるだろう。本発明のさらに特別な利点は、所望のクローンについて
ライブラリーをスクリーニングするための核酸プローブとリガンドを研究者が選
択できることである。工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を組み合わせることにより
、本当に所望されるクローンを同定する本発明の方法の信頼性が増すことだろう
。驚くべきことに、形質転換細胞のアレイにおける最初のスポッティングに次い
でコロニーが増殖すると、前記検出可能な（ポリ）ペプチドがアレイ構造に妨害
されずに検出され得ることが、本発明により示し得るのである。このことは、コ
ロニーが約１８時間培養されたとしても有効である。
植物及び／又は他の真核生物のゲノムを効率的に分析することに特に適している
が、勿論、他の発現ライブラリー、例えば原核生物や他の微生物由来のゲノムＤ
ＮＡ発現ライブラリーの分析にも適用し得る。この新しい方法は発現ライブラリ
ーのスクリーニングにおける偽陽性クローンのバックグラウンドを顕著に減少さ
せる。特に１つ又はそれ以上のライブラリーのなかにある多数のクローンがスク
リーニングされるときは、結局は所望の生物学的特性を有さないことが判明する
クローンを同定するという時間のかかる作業を回避することが可能になる。当然
ながら、これにより、ゲノム及び／又はタンパク質分析におけるコスト要因も有
意に減少されるだろう。本発明のさらに特別な利点は、所望のクローンについて
ライブラリーをスクリーニングするための核酸プローブとリガンドを研究者が選
択できることである。工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を組み合わせることにより
、本当に所望されるクローンを同定する本発明の方法の信頼性が増すことだろう
。驚くべきことに、形質転換細胞のアレイにおける最初のスポッティングに次い
でコロニーが増殖すると、前記検出可能な（ポリ）ペプチドがアレイ構造に妨害
されずに検出され得ることが、本発明により示し得るのである。このことは、コ
ロニーが約１８時間培養されたとしても有効である。
【００１９】 前記発現ライブラリーのクローンの組換えインサートとともに融合タンパク質
として発現される（ポリ）ペプチドについて言えば、留意すべきは、前記融合タ
ンパク質へ組込まれた１つ又はそれ以上の前記（ポリ）ペプチドの使用を本発明
が想定していることである。付帯の実施例から明らかなように、（ポリ）ペプチ
ドをＮ末端に融合させれば、原則として、Ｎ末端（ポリ）ペプチドと正しいフレ
ーム状態にないインサートは速やかに細胞質内で分解されるので、正しいフレー
ムで発現されるインサートを検出することが可能になる。一方、前記（ポリ）ペ
プチドをＣ末端に融合させ、前記（ポリ）ペプチドを検出すれば、完全長のイン
サートを選別することが可能になる。また、本発明は、インサートのＮ末端及び
Ｃ末端に融合した１つ又はそれ以上の（ポリ）ペプチドの複合物を想定する。
として発現される（ポリ）ペプチドについて言えば、留意すべきは、前記融合タ
ンパク質へ組込まれた１つ又はそれ以上の前記（ポリ）ペプチドの使用を本発明
が想定していることである。付帯の実施例から明らかなように、（ポリ）ペプチ
ドをＮ末端に融合させれば、原則として、Ｎ末端（ポリ）ペプチドと正しいフレ
ーム状態にないインサートは速やかに細胞質内で分解されるので、正しいフレー
ムで発現されるインサートを検出することが可能になる。一方、前記（ポリ）ペ
プチドをＣ末端に融合させ、前記（ポリ）ペプチドを検出すれば、完全長のイン
サートを選別することが可能になる。また、本発明は、インサートのＮ末端及び
Ｃ末端に融合した１つ又はそれ以上の（ポリ）ペプチドの複合物を想定する。
【００２０】 留意すべきは、工程（ａ）〜（ｄ）を実行するに先立って、試験される生物学
的材料へ接近し得る形態でクローンを提示すべきことである。クローンが、例え
ば細菌の形質転換細胞であれば、前記形質転換細胞は、好ましくは溶解されるべ
きであろう。そのような溶菌法は当技術分野でよく知られている。
的材料へ接近し得る形態でクローンを提示すべきことである。クローンが、例え
ば細菌の形質転換細胞であれば、前記形質転換細胞は、好ましくは溶解されるべ
きであろう。そのような溶菌法は当技術分野でよく知られている。
【００２１】 本発明の方法にコンピュータ関連技術を適用することにより、１つのライブラ
リーにつきスクリーニングを１回だけすればよいことが可能になる。これは、後
の分析、例えば配列決定により個々のクローンについて産生されたデータをこの
スクリーニングに戻して関連づけられるからである。従って、ｃＤＮＡライブラ
リーのような発現ライブラリーからタンパク質ライブラリーへの速やかな移行が
可能になった。これにより、遺伝子カタログと機能的タンパク質／（ポリ）ペプ
チドカタログとの直接的な連関が創出される。上記に加え、反応を繰り返しスク
リーニングすること又は延長してスクリーニングすることにより、偽陽性クロー
ンを排除する可能性をさらに高めることが可能である。
リーにつきスクリーニングを１回だけすればよいことが可能になる。これは、後
の分析、例えば配列決定により個々のクローンについて産生されたデータをこの
スクリーニングに戻して関連づけられるからである。従って、ｃＤＮＡライブラ
リーのような発現ライブラリーからタンパク質ライブラリーへの速やかな移行が
可能になった。これにより、遺伝子カタログと機能的タンパク質／（ポリ）ペプ
チドカタログとの直接的な連関が創出される。上記に加え、反応を繰り返しスク
リーニングすること又は延長してスクリーニングすることにより、偽陽性クロー
ンを排除する可能性をさらに高めることが可能である。
【００２２】 本発明によれば、本方法はまた既知の核酸分子を特徴づけるために使用され得
る。 本発明の方法の好ましい態様では、前記組換えインサートの前記発現産物とと
もに融合タンパク質の一部として発現される前記（ポリ）ペプチドは、抗体又は
フラグメント又はそれらの誘導体、タグ、酵素、ファージタンパク質又はそのフ
ラグメント、又は融合タンパク質である。
る。 本発明の方法の好ましい態様では、前記組換えインサートの前記発現産物とと
もに融合タンパク質の一部として発現される前記（ポリ）ペプチドは、抗体又は
フラグメント又はそれらの誘導体、タグ、酵素、ファージタンパク質又はそのフ
ラグメント、又は融合タンパク質である。
【００２３】 上記に特定された（ポリ）ペプチドの任意の態様を検出する方法は当技術分野
でよく知られているか、又は当業者によって容易に設計し得る。例えば、抗体は
、検出可能なように標識されている抗−抗体によって検出され得る。抗体フラグ
メント又はその誘導体に関して言えば、これはＦ（ａｂ’）2、Ｆａｂ、Ｆｖ又
はｓｃＦｖフラグメントを包含し得る。例えば、Harlow and Lane, "Antibodies
, A Laboratory Manual", CHS Press (1988), Cold Spring Harbor, N. Y. を参
照のこと。さらに、従来法によりタグが検出され得る。同じことは、例えば特定
の基質と反応させ、例えば発色反応を検出すること、又は前記酵素に特異的な検
出可能に標識された抗体を使用することによって検出され得る酵素にも有効であ
る。抗体はファージ又はそのフラグメントを検出するためにも使用され得る。抗
体のラベルはまた当技術分野でよく知られていて、アルカリホスファターゼ（Ａ
ＴＴＰＰＨＯＳ）、ＣＳＰＤ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ＦＩＴＣ及び放射
活性を包含する。また、上記に特定される（ポリ）ペプチドの任意の態様を検出
するのに質量分析法も使用され得る。
でよく知られているか、又は当業者によって容易に設計し得る。例えば、抗体は
、検出可能なように標識されている抗−抗体によって検出され得る。抗体フラグ
メント又はその誘導体に関して言えば、これはＦ（ａｂ’）2、Ｆａｂ、Ｆｖ又
はｓｃＦｖフラグメントを包含し得る。例えば、Harlow and Lane, "Antibodies
, A Laboratory Manual", CHS Press (1988), Cold Spring Harbor, N. Y. を参
照のこと。さらに、従来法によりタグが検出され得る。同じことは、例えば特定
の基質と反応させ、例えば発色反応を検出すること、又は前記酵素に特異的な検
出可能に標識された抗体を使用することによって検出され得る酵素にも有効であ
る。抗体はファージ又はそのフラグメントを検出するためにも使用され得る。抗
体のラベルはまた当技術分野でよく知られていて、アルカリホスファターゼ（Ａ
ＴＴＰＰＨＯＳ）、ＣＳＰＤ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ＦＩＴＣ及び放射
活性を包含する。また、上記に特定される（ポリ）ペプチドの任意の態様を検出
するのに質量分析法も使用され得る。
【００２４】 本発明の方法のさらに好ましい態様では、工程（ａ）における（ポリ）ペプチ
ドの発現についての前記分析は、特異的に相互作用する工程（ｂ）のリガンドと
は異なるリガンドを前記（ポリ）ペプチドと接触させ、前記クローンのライブラ
リーを特定の相互作用の出現について分析することによって達成される。工程（
ａ）で使用されるリガンドは工程（ｂ）で使用されるリガンドと同じクラスであ
ってよいが、リガンドの実際の分子構造は、この２つのリガンドを差別化し得る
ためには、２つの工程で異なるべきである。
ドの発現についての前記分析は、特異的に相互作用する工程（ｂ）のリガンドと
は異なるリガンドを前記（ポリ）ペプチドと接触させ、前記クローンのライブラ
リーを特定の相互作用の出現について分析することによって達成される。工程（
ａ）で使用されるリガンドは工程（ｂ）で使用されるリガンドと同じクラスであ
ってよいが、リガンドの実際の分子構造は、この２つのリガンドを差別化し得る
ためには、２つの工程で異なるべきである。
【００２５】 本発明の方法の別の好ましい態様では、工程（ａ）の（ポリ）ペプチド発現に
ついての前記分析が視覚的な手段によって達成される。有利にも、前記（ポリ）
ペプチドの発現は、蛍光、生物発光又は燐光のような視覚的手段によって検出さ
れ得る。対応するシグナルは、コンピュータ・ユニットに付属し得る写真撮影の
手段により保管され得る。対応するシグナルは、高解像ＣＣＤ検出システムを用
いて画像化され、イメージファイルとしてコンピュータにセーブされて保管され
、ポジティブ・クローンを記録するカスタムソフトウェアを用いて解析される。
ついての前記分析が視覚的な手段によって達成される。有利にも、前記（ポリ）
ペプチドの発現は、蛍光、生物発光又は燐光のような視覚的手段によって検出さ
れ得る。対応するシグナルは、コンピュータ・ユニットに付属し得る写真撮影の
手段により保管され得る。対応するシグナルは、高解像ＣＣＤ検出システムを用
いて画像化され、イメージファイルとしてコンピュータにセーブされて保管され
、ポジティブ・クローンを記録するカスタムソフトウェアを用いて解析される。
【００２６】 前記視覚手段は質量分析法を利用することが最も好ましい。例えば、アレイ状
タンパク質の質量分析では、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ及び／又は複雑なハイブリダイゼ
ーションの成果を２−Ｄ−ＰＡＧＥの成果へつなげる架け橋として、タンパク質
アレイが使用される。このことは、アレイ・タンパク質（例えば、チップ、質量
分析ターゲット又はマトリックス）の質量スペクトルをとり、この質量スペクト
ルを２−Ｄゲル上のスポットから得た質量スペクトルと比較することによってな
される。このアプローチを用いると、細胞の（ｃＤＮＡライブラリーを介した）
ｍＲＮＡレパートリーを（遺伝子の活性を最も直接的に反映する）遺伝子発現の
第一レベルとして研究し、細胞、組織、植物、微生物及び／又は生物のタンパク
質全体の分析であるプロテオーム分析に関連づけることができる。
タンパク質の質量分析では、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ及び／又は複雑なハイブリダイゼ
ーションの成果を２−Ｄ−ＰＡＧＥの成果へつなげる架け橋として、タンパク質
アレイが使用される。このことは、アレイ・タンパク質（例えば、チップ、質量
分析ターゲット又はマトリックス）の質量スペクトルをとり、この質量スペクト
ルを２−Ｄゲル上のスポットから得た質量スペクトルと比較することによってな
される。このアプローチを用いると、細胞の（ｃＤＮＡライブラリーを介した）
ｍＲＮＡレパートリーを（遺伝子の活性を最も直接的に反映する）遺伝子発現の
第一レベルとして研究し、細胞、組織、植物、微生物及び／又は生物のタンパク
質全体の分析であるプロテオーム分析に関連づけることができる。
【００２７】 現在では、１−Ｄ及び２−Ｄゲルからの単離タンパク質は、質量分析法を用い
て配列データベースにおいて同定される。しかしながら、わずかな数の既知タン
パク質にこれが限定されていることは明らかである。有利にも、発現ライブラリ
ーのクローンによって発現される各タンパク質が「最小タンパク質識別子」（Ｍ
ＰＩ）と命名される構造情報の最小セットにより特定されるという本発明のコン
セプトにより、この制限は克服される。ＭＰＩの内容、ペプチドマップ、及び追
加の構造データは、明白なタンパク質の同定及び質量分析によるハイスループッ
ト定量という２通りのやり方で最適化し得る。
て配列データベースにおいて同定される。しかしながら、わずかな数の既知タン
パク質にこれが限定されていることは明らかである。有利にも、発現ライブラリ
ーのクローンによって発現される各タンパク質が「最小タンパク質識別子」（Ｍ
ＰＩ）と命名される構造情報の最小セットにより特定されるという本発明のコン
セプトにより、この制限は克服される。ＭＰＩの内容、ペプチドマップ、及び追
加の構造データは、明白なタンパク質の同定及び質量分析によるハイスループッ
ト定量という２通りのやり方で最適化し得る。
【００２８】 一度記録されれば、ＭＰＩにより、単に測定データを比較することによって、
生物学的サンプルにおいて遺伝子産物を跡付けることが促進される。このように
すれば、タンパク質の認識は、タンパク質が「知られている」（即ち、現在のデ
ータベースに存在している）か又は「知られていない」（即ち、現在のデータベ
ースに存在していない）かによらない。これらのスペクトルは、例えば、１−Ｄ
及び２−Ｄ電気泳動ゲルから分離したタンパク質のような、他の供給源に由来す
るタンパク質の分析から次いで得られるスペクトルを同定するために使用され得
る。
生物学的サンプルにおいて遺伝子産物を跡付けることが促進される。このように
すれば、タンパク質の認識は、タンパク質が「知られている」（即ち、現在のデ
ータベースに存在している）か又は「知られていない」（即ち、現在のデータベ
ースに存在していない）かによらない。これらのスペクトルは、例えば、１−Ｄ
及び２−Ｄ電気泳動ゲルから分離したタンパク質のような、他の供給源に由来す
るタンパク質の分析から次いで得られるスペクトルを同定するために使用され得
る。
【００２９】 このことにより、２−Ｄ電気泳動により特徴づけられるタンパク質を、対応す
るｍＲＮＡ及び遺伝子（ｃＤＮＡ）と結びつける架け橋が提供される。２−Ｄゲ
ルから採取されるすべてのＭＰＩは、コンピュータをベースとする方法（in sil
ico）によって、組換えタンパク質ライブラリーから得られるＭＰＩと比較され
、逆も真なりである。それにより、何千もの生物学的に活性な遺伝子産物がその
遺伝子に関連づけられる。この関連性は配列情報と無関係であり、従って、他の
生物の機能性プロテオーム分析にも魅力的である。
るｍＲＮＡ及び遺伝子（ｃＤＮＡ）と結びつける架け橋が提供される。２−Ｄゲ
ルから採取されるすべてのＭＰＩは、コンピュータをベースとする方法（in sil
ico）によって、組換えタンパク質ライブラリーから得られるＭＰＩと比較され
、逆も真なりである。それにより、何千もの生物学的に活性な遺伝子産物がその
遺伝子に関連づけられる。この関連性は配列情報と無関係であり、従って、他の
生物の機能性プロテオーム分析にも魅力的である。
【００３０】 既存の戦略に比較した場合、本発明の戦略にあるもう１つの利点は、質量分析
データを、ＤＮＡ又はタンパク質の配列から予測されるデータとではなく、質量
分析データと比較するので、タンパク質の同定に信頼性が増すことにある。前者
のアプローチの主な欠点は、基質依存性プロテアーゼの性能、ペプチドの溶解度
、質量分析における最終的なシグナル抑制が考慮されていないことである。
データを、ＤＮＡ又はタンパク質の配列から予測されるデータとではなく、質量
分析データと比較するので、タンパク質の同定に信頼性が増すことにある。前者
のアプローチの主な欠点は、基質依存性プロテアーゼの性能、ペプチドの溶解度
、質量分析における最終的なシグナル抑制が考慮されていないことである。
【００３１】 さらに、本発明のタンパク質アレイにより、安定同位体で標識した組換え相同
体を用いることによって、２−Ｄゲルからとった数千もの異なるタンパク質の質
量分析データを研究することが可能になる。さらに、複雑なハイブリダイゼーシ
ョンによってｍＲＮＡレベルをプロファイルするために用いられるｃＤＮＡマイ
クロアレイを産生する無尽蔵の供給源が提供される。
体を用いることによって、２−Ｄゲルからとった数千もの異なるタンパク質の質
量分析データを研究することが可能になる。さらに、複雑なハイブリダイゼーシ
ョンによってｍＲＮＡレベルをプロファイルするために用いられるｃＤＮＡマイ
クロアレイを産生する無尽蔵の供給源が提供される。
【００３２】 本発明の方法の別の好ましい態様では、前記生物学的特性は、細胞、組織又は
発生段階の細胞又は組織、微生物、好ましくは細菌、植物又は生物への特異性で
ある。
発生段階の細胞又は組織、微生物、好ましくは細菌、植物又は生物への特異性で
ある。
【００３３】 本発明のこの好ましい態様では、例えば細胞、組織又は生物の発生状況や、細
胞又は組織の、例えばその起源に関する特異性に関する情報を研究者に提供する
特別の比較をなし得る。このことは、あるマーカータンパク質の存在について、
起源の異なる２種の組織を比較することによってなし得る。例えば、ある生物の
発生状況に関し、６日齢のマウス胚のアレイｃＤＮＡ発現ライブラリーと９日齢
のマウス胚のアレイｃＤＮＡ発現ライブラリーとの発現プロフィールを比較して
、分化により発現される遺伝子を同定して特徴づけることにより、異なる発生段
階で発現されるタンパク質を解明することが可能である。
胞又は組織の、例えばその起源に関する特異性に関する情報を研究者に提供する
特別の比較をなし得る。このことは、あるマーカータンパク質の存在について、
起源の異なる２種の組織を比較することによってなし得る。例えば、ある生物の
発生状況に関し、６日齢のマウス胚のアレイｃＤＮＡ発現ライブラリーと９日齢
のマウス胚のアレイｃＤＮＡ発現ライブラリーとの発現プロフィールを比較して
、分化により発現される遺伝子を同定して特徴づけることにより、異なる発生段
階で発現されるタンパク質を解明することが可能である。
【００３４】 本発明の方法のさらに好ましい態様では、前記細胞又は組織は、正常な細胞又
は組織、病的な細胞又は組織、又は前処理された細胞又は組織である。 細胞又は組織に組み合わせて使用される「前処理された」という用語は、前記
細胞又は組織が薬物、アクチベータ、又はリガンドなどにさらされたことを意味
する。前記前処理は、原則として、細胞の経路に影響を及ぼし、所望により、前
処理されてない細胞に比較して少なくとも１つの表現型の変化をもたらすもので
ある。前記少なくとも１つの表現型の変化は、本発明の方法を用いて検出される
ことが想定されている。また、病的な組織又は細胞は、健全な組織又は細胞に比
較して表現型の違いを示し、本発明の方法で検出され得ると期待される。
は組織、病的な細胞又は組織、又は前処理された細胞又は組織である。 細胞又は組織に組み合わせて使用される「前処理された」という用語は、前記
細胞又は組織が薬物、アクチベータ、又はリガンドなどにさらされたことを意味
する。前記前処理は、原則として、細胞の経路に影響を及ぼし、所望により、前
処理されてない細胞に比較して少なくとも１つの表現型の変化をもたらすもので
ある。前記少なくとも１つの表現型の変化は、本発明の方法を用いて検出される
ことが想定されている。また、病的な組織又は細胞は、健全な組織又は細胞に比
較して表現型の違いを示し、本発明の方法で検出され得ると期待される。
【００３５】 本発明の方法のもう１つの好ましい態様では、前記クローンは細菌の形質転換
細胞、組換えファージ、形質転換された哺乳類、昆虫、真菌、酵母又は植物の細
胞である。
細胞、組換えファージ、形質転換された哺乳類、昆虫、真菌、酵母又は植物の細
胞である。
【００３６】 細菌の形質転換細胞は、好ましくは形質転換された E．coli 細胞であり、組
換えファージは、好ましくはＭ１３又はｆｄファージに由来し、形質転換された
か又はトランスフェクトされた哺乳類細胞はヒーラ細胞か又はＣＯＳ細胞であり
得る。昆虫細胞に関しては、Spodoptera frugiperda 又は Drosophila melanoga
ster の細胞が好ましい。好ましい真菌細胞が Aspergillus 細胞を含むのに対し
、前記酵母細胞は、好ましくは Pichia pastoris 又は Saccharomyces cerevisi
ae に由来する。留意すべきは、本発明では「形質転換された」と「トランスフ
ェクトされた」という用語が、交換可能なように使用されていることである。
換えファージは、好ましくはＭ１３又はｆｄファージに由来し、形質転換された
か又はトランスフェクトされた哺乳類細胞はヒーラ細胞か又はＣＯＳ細胞であり
得る。昆虫細胞に関しては、Spodoptera frugiperda 又は Drosophila melanoga
ster の細胞が好ましい。好ましい真菌細胞が Aspergillus 細胞を含むのに対し
、前記酵母細胞は、好ましくは Pichia pastoris 又は Saccharomyces cerevisi
ae に由来する。留意すべきは、本発明では「形質転換された」と「トランスフ
ェクトされた」という用語が、交換可能なように使用されていることである。
【００３７】 前記細菌の形質転換細胞が形質転換された E．coli細胞である場合、以下の実
施例で説明されるようなE．coli ＳＣＳ１細胞が使用されることが最も好ましい
。もう１つの最も好ましい態様では、E．coli細胞は、誘導される発現を可能に
する、好ましくはまた前記融合タンパク質の一部としてタグを発現するベクター
、好ましくは以下の実施例で説明されるようなｐＱＥ−３０ＮＳＴベクターへク
ローン化されたライブラリーで形質転換される。しかしながら、当業者は、実施
例で説明されるようなE. coli細胞及び／又はベクターの構造上及び／又は機能
上の特徴についてよく知っているので、本質的に同一の構造上及び／又は機能上
の特徴を示す任意のE. coli細胞及び／又はベクターは本発明に含まれる。
施例で説明されるようなE．coli ＳＣＳ１細胞が使用されることが最も好ましい
。もう１つの最も好ましい態様では、E．coli細胞は、誘導される発現を可能に
する、好ましくはまた前記融合タンパク質の一部としてタグを発現するベクター
、好ましくは以下の実施例で説明されるようなｐＱＥ−３０ＮＳＴベクターへク
ローン化されたライブラリーで形質転換される。しかしながら、当業者は、実施
例で説明されるようなE. coli細胞及び／又はベクターの構造上及び／又は機能
上の特徴についてよく知っているので、本質的に同一の構造上及び／又は機能上
の特徴を示す任意のE. coli細胞及び／又はベクターは本発明に含まれる。
【００３８】 本発明のもう１つの好ましい態様は、前記アレイ形態が工程（ａ）〜（ｃ）に
おいて実質的に同一のフォーマットを有する方法に関する。 本発明のこの態様が特に有用であるのは、１つのマスタープレートからレプリ
カを産生し、１：１のスケールで結果を比較することができるからである。一方
、あまり好ましくないが、アレイ形態は、様々なレプリカ上のクローンを明白に
関連づけることが可能である限りにおいて、工程（ａ）〜（ｃ）の少なくとも２
つにおいてスケールが異なるような、異なるフォーマットをとってもよい。
おいて実質的に同一のフォーマットを有する方法に関する。 本発明のこの態様が特に有用であるのは、１つのマスタープレートからレプリ
カを産生し、１：１のスケールで結果を比較することができるからである。一方
、あまり好ましくないが、アレイ形態は、様々なレプリカ上のクローンを明白に
関連づけることが可能である限りにおいて、工程（ａ）〜（ｃ）の少なくとも２
つにおいてスケールが異なるような、異なるフォーマットをとってもよい。
【００３９】 本発明の方法のさらに好ましい態様では、前記アレイ形態はグリッド形態であ
る。 グリッドは、本明細書の上記考察によれば、発現ライブラリーのクローンの高
密度アレイを可能にすべきである。それはさらに、好ましくは、上記Lehrachに
記載されたグリッドのフォーマットを有すべきである。
る。 グリッドは、本明細書の上記考察によれば、発現ライブラリーのクローンの高
密度アレイを可能にすべきである。それはさらに、好ましくは、上記Lehrachに
記載されたグリッドのフォーマットを有すべきである。
【００４０】 本発明の方法の最も好ましい態様では、前記グリッドは、マイクロタイタープ
レート、シリカウェーハー、チップ、質量分析ターゲット、又はマトリックスの
ディメンジョンを有する。
レート、シリカウェーハー、チップ、質量分析ターゲット、又はマトリックスの
ディメンジョンを有する。
【００４１】 上記のディメンジョンを使用すれば、従来の実験材料を本発明の方法に利用す
ることが可能である。さらに、上記のディメンジョンは、多数のクローンを小ス
ケール装置で簡便に分析することを可能にする。
ることが可能である。さらに、上記のディメンジョンは、多数のクローンを小ス
ケール装置で簡便に分析することを可能にする。
【００４２】 本発明の方法のもう１つの好ましい態様では、前記クローンは固形支持体に固
定されている。 固形支持体は、可撓性か不撓性であり得る。この態様は、発現ライブラリーの
アレイ状クローンの簡便な保管と輸送を特に考慮する。特に好ましい態様は、前
記固形支持体に固定されている凍結乾燥クローンに関する。
定されている。 固形支持体は、可撓性か不撓性であり得る。この態様は、発現ライブラリーの
アレイ状クローンの簡便な保管と輸送を特に考慮する。特に好ましい態様は、前
記固形支持体に固定されている凍結乾燥クローンに関する。
【００４３】 本発明の方法のさらに好ましい態様は、前記固形支持体がフィルター、膜、磁
気ビーズ、シリカウェーハー、ガラス、金属、チップ、質量分析ターゲット又は
マトリックスである方法に関する。
気ビーズ、シリカウェーハー、ガラス、金属、チップ、質量分析ターゲット又は
マトリックスである方法に関する。
【００４４】 フィルター又は膜に関しては、ＰＶＤＦ又はナイロンから生産されるものが特
に好ましい。フィルター又は膜に関しては、高いＤＮＡ結合能力を有するナイロ
ン膜フィルター（例えば、Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ＋、アマシャム）の上でＤＮＡ又は
ＤＮＡ含有クローンがスポット／グリッドされ、増殖すること、及び高いタンパ
ク質結合能力を有するポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜フィルター（
例えば、Ｈｙｂｏｎｄ ＰＶＤＦ、アマシャム）の上でタンパク質又はタンパク
質発現クローンがスポット／グリッドされ、増殖することが特に好ましい。
に好ましい。フィルター又は膜に関しては、高いＤＮＡ結合能力を有するナイロ
ン膜フィルター（例えば、Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ＋、アマシャム）の上でＤＮＡ又は
ＤＮＡ含有クローンがスポット／グリッドされ、増殖すること、及び高いタンパ
ク質結合能力を有するポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜フィルター（
例えば、Ｈｙｂｏｎｄ ＰＶＤＦ、アマシャム）の上でタンパク質又はタンパク
質発現クローンがスポット／グリッドされ、増殖することが特に好ましい。
【００４５】 本発明の方法のさらに好ましい態様では、前記リガンドの少なくとも１つは、
（ポリ）ペプチド、ファージ又はそのフラグメント、血液、血清、毒素、阻害剤
、医薬品又は医薬品候補物質、非タンパク質又は部分的にタンパク質である受容
体、触媒ポリマー、酵素、核酸、ＰＮＡ、ウイルス又はその部分、細胞又はその
部分、無機化合物、結合体、色素、組織又は前記リガンドを含む結合体である。
（ポリ）ペプチド、ファージ又はそのフラグメント、血液、血清、毒素、阻害剤
、医薬品又は医薬品候補物質、非タンパク質又は部分的にタンパク質である受容
体、触媒ポリマー、酵素、核酸、ＰＮＡ、ウイルス又はその部分、細胞又はその
部分、無機化合物、結合体、色素、組織又は前記リガンドを含む結合体である。
【００４６】 従って、リガンドは多種多様な性質のものであり得る。重要にも、様々なタイ
プのリガンドが直接的又は間接的に検出され得るので、所望されるクローンの同
定が可能になる。
プのリガンドが直接的又は間接的に検出され得るので、所望されるクローンの同
定が可能になる。
【００４７】 本発明の方法のもう１つの好ましい態様では、前記（ポリ）ペプチドは抗体又
はフラグメント又はその誘導体、ホルモン又はそのフラグメント、又は酵素又は
フラグメント又はその誘導体である。
はフラグメント又はその誘導体、ホルモン又はそのフラグメント、又は酵素又は
フラグメント又はその誘導体である。
【００４８】 上記に使用されるような、「フラグメント又はその誘導体」という用語は、抗
体、ホルモン又は酵素が、そのある部分を欠損するように修飾されてもリガンド
として機能するその能力を本質的に維持し得ることを意味するものである。
体、ホルモン又は酵素が、そのある部分を欠損するように修飾されてもリガンド
として機能するその能力を本質的に維持し得ることを意味するものである。
【００４９】 上記の好ましい（ポリ）ペプチドは、特に用途が広く、扱いやすく、多くの異
なる数で提供され得る。 本発明の方法のさらに好ましい態様では、工程（ｂ）での前記相互作用は特異
的な相互作用である。
なる数で提供され得る。 本発明の方法のさらに好ましい態様では、工程（ｂ）での前記相互作用は特異
的な相互作用である。
【００５０】 この状態の例は、抗体が１つのエピトープ又は（ポリ）ペプチド配列と特異的
に結合する場合であり、例えば抗ヒスチジン抗体は、６ｘ−ヒスチジンタグ、５
ｘ−ヒスチジンタグ、ＲＧＳ−６ｘ−ヒスチジンタグ、又は１つのタンパク質に
のみ見出されるエピトープと特異的に結合する。
に結合する場合であり、例えば抗ヒスチジン抗体は、６ｘ−ヒスチジンタグ、５
ｘ−ヒスチジンタグ、ＲＧＳ−６ｘ−ヒスチジンタグ、又は１つのタンパク質に
のみ見出されるエピトープと特異的に結合する。
【００５１】 本発明の方法の追加的な好ましい態様では、工程（ｂ）の前記相互作用は非特
異的な相互作用である。 この状態の例は、同一のＤＮＡ配列からはコードされないが、類似の３次元構
造、電荷などを共有し、別のタンパク質上に存在し得るエピトープに抗体が非特
異的に結合する場合である。本発明によって示し得るように、本発明の応用は、
抗体のようなリガンドの選択性又は交叉反応性を決定することであり得る。抗体
が必ずしもタンパク質のライブラリー全体に対して試験されるわけではないので
、タンパク質のマイクロアレイ上で抗体の交叉反応性を検出することは驚くにあ
たらない。潜在可能な抗原のアレイに対して抗体をスクリーニングして共通のエ
ピトープを検出する本発明の方法は、様々な構造バッテリーに直面する、細胞全
体や組織の免疫組織化学や生理学的研究に使用される試薬にとって、特に重要で
あり得る。他のやり方、又は追加的なやり方では、抗原特異性が知られていない
抗体（例えば、リンパ腫のタンパク質）を、タンパク質分子のごく多様なレパー
トリーに対する結合についてスクリーニングし得る。これらタンパク質はいずれ
もアレイ状ｃＤＮＡライブラリーの単離クローンから発現されるので、対応する
インサートを容易に配列決定して、抗原コード遺伝子を同定することが可能であ
る。本発明によれば、抗体、血清などの結合性及び／又は非特異性を特徴づける
方法を、タンパク質ファミリーに関する相同性の研究、及び／又は結合ドメイン
やエピトープを決定することのために使用することが想定されている。さらに、
この技術は抗原−抗体スクリーニングに限定されず、任意のリガンド−受容体シ
ステムへ適用し得る。
異的な相互作用である。 この状態の例は、同一のＤＮＡ配列からはコードされないが、類似の３次元構
造、電荷などを共有し、別のタンパク質上に存在し得るエピトープに抗体が非特
異的に結合する場合である。本発明によって示し得るように、本発明の応用は、
抗体のようなリガンドの選択性又は交叉反応性を決定することであり得る。抗体
が必ずしもタンパク質のライブラリー全体に対して試験されるわけではないので
、タンパク質のマイクロアレイ上で抗体の交叉反応性を検出することは驚くにあ
たらない。潜在可能な抗原のアレイに対して抗体をスクリーニングして共通のエ
ピトープを検出する本発明の方法は、様々な構造バッテリーに直面する、細胞全
体や組織の免疫組織化学や生理学的研究に使用される試薬にとって、特に重要で
あり得る。他のやり方、又は追加的なやり方では、抗原特異性が知られていない
抗体（例えば、リンパ腫のタンパク質）を、タンパク質分子のごく多様なレパー
トリーに対する結合についてスクリーニングし得る。これらタンパク質はいずれ
もアレイ状ｃＤＮＡライブラリーの単離クローンから発現されるので、対応する
インサートを容易に配列決定して、抗原コード遺伝子を同定することが可能であ
る。本発明によれば、抗体、血清などの結合性及び／又は非特異性を特徴づける
方法を、タンパク質ファミリーに関する相同性の研究、及び／又は結合ドメイン
やエピトープを決定することのために使用することが想定されている。さらに、
この技術は抗原−抗体スクリーニングに限定されず、任意のリガンド−受容体シ
ステムへ適用し得る。
【００５２】 本発明の方法のもう１つの好ましい態様では、工程（ｃ）での前記ハイブリダ
イゼーションはストリンジェントな条件で起こる。他のやり方では、工程（ｃ）
の前記ハイブリダイゼーションは非ストリンジェントな条件で起こることが好ま
しい。
イゼーションはストリンジェントな条件で起こる。他のやり方では、工程（ｃ）
の前記ハイブリダイゼーションは非ストリンジェントな条件で起こることが好ま
しい。
【００５３】 ストリンジェント／非ストリンジェントなハイブリダイゼーションの意義や適
用に関して言えば、特異的／非特異的な相互作用の考察に関連して説明したこと
とほとんど同じことが当てはまる。
用に関して言えば、特異的／非特異的な相互作用の考察に関連して説明したこと
とほとんど同じことが当てはまる。
【００５４】 本発明の方法の特に好ましい態様では、前記タグは、ｃ−ｍｙｃ、Ｈｉｓ−タ
グ、ＦＬＡＧ、アルカリホスファターゼ、ＥｐｉＴａｇTM、Ｖ５タグ、Ｔ７タグ
、ＸｐｒｅｓｓTMタグ又はＳｔｒｅｐ−タグ、融合タンパク質、好ましくはＧＳ
Ｔ、セルロース結合ドメイン、グリーン蛍光タンパク質、マルトース結合タンパ
ク質又はｌａｃＺである。本発明によれば、２種又はそれ以上のタグが融合タン
パク質に含まれ得る。
グ、ＦＬＡＧ、アルカリホスファターゼ、ＥｐｉＴａｇTM、Ｖ５タグ、Ｔ７タグ
、ＸｐｒｅｓｓTMタグ又はＳｔｒｅｐ−タグ、融合タンパク質、好ましくはＧＳ
Ｔ、セルロース結合ドメイン、グリーン蛍光タンパク質、マルトース結合タンパ
ク質又はｌａｃＺである。本発明によれば、２種又はそれ以上のタグが融合タン
パク質に含まれ得る。
【００５５】 本発明の方法に利用される発現ライブラリーは、様々な供給源から構築され得
る。例えば、それはゲノムライブラリーか抗体ライブラリーであり得る。好まし
くは、前記クローンのライブラリーはｃＤＮＡライブラリーを含む。
る。例えば、それはゲノムライブラリーか抗体ライブラリーであり得る。好まし
くは、前記クローンのライブラリーはｃＤＮＡライブラリーを含む。
【００５６】 アレイ形態は、好ましくは自動化装置を用いて産生される。 本発明の方法の特に好ましい態様では、前記ライブラリーの前記アレイ形態及
び／又は前記レプリカは、ピッキングロボット及び／又はスポッティングロボッ
ト及び／又はグリッディングロボットによって産生される。
び／又は前記レプリカは、ピッキングロボット及び／又はスポッティングロボッ
ト及び／又はグリッディングロボットによって産生される。
【００５７】 本発明のもう１つの好ましい態様は、前記所望されるクローンの核酸インサー
トを配列決定することをさらに含んでなる方法に関する。前記クローンの配列決
定により、多くの場合、本発明の方法で得られる最終的に所望される情報が提供
される。ＤＮＡ又はＲＮＡの配列決定プロトコールは当技術分野でよく知られて
いて、例えば Sambrook、上記に記載されている。
トを配列決定することをさらに含んでなる方法に関する。前記クローンの配列決
定により、多くの場合、本発明の方法で得られる最終的に所望される情報が提供
される。ＤＮＡ又はＲＮＡの配列決定プロトコールは当技術分野でよく知られて
いて、例えば Sambrook、上記に記載されている。
【００５８】 本発明の方法の最後の好ましい態様では、本方法は所望されるクローンのイン
サートによってコードされる（ポリ）ペプチドを同定することを含む。所望され
るクローンから発現される前記（ポリ）ペプチドの同定は、多種多様な方法によ
り達成され得る。そのような方法は、アフィニティークロマトグラフィー、ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ等のような標準的な生化学の方法として、特
に知られている。（ポリ）ペプチドを十分特徴づければ、医薬応用（例えばペプ
チド模擬体）のために、対応する化学成分を設計し得る。
サートによってコードされる（ポリ）ペプチドを同定することを含む。所望され
るクローンから発現される前記（ポリ）ペプチドの同定は、多種多様な方法によ
り達成され得る。そのような方法は、アフィニティークロマトグラフィー、ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ等のような標準的な生化学の方法として、特
に知られている。（ポリ）ペプチドを十分特徴づければ、医薬応用（例えばペプ
チド模擬体）のために、対応する化学成分を設計し得る。
【００５９】 本発明はまた、所望によりベクターに含まれるインサート又は所望の生物学的
特性を与えるクローンのインサートの発現産物を製剤化することを含んでなる、
医薬組成物を製造する方法に関する。ここで、前記インサート又は発現産物は上
記に開示した本発明の方法によって同定及び／又は特徴づけされる。
特性を与えるクローンのインサートの発現産物を製剤化することを含んでなる、
医薬組成物を製造する方法に関する。ここで、前記インサート又は発現産物は上
記に開示した本発明の方法によって同定及び／又は特徴づけされる。
【００６０】 さらに、本発明は、本発明の方法により製造される医薬組成物に関する。 本発明の医薬組成物は、製剤的に許容される担体をさらに含み得る。好適な製
剤用担体の例は当技術分野でよく知られていて、リン酸緩衝化生理食塩水、水、
水中油型エマルジョンのようなエマルジョン、様々なタイプの湿潤剤、無菌溶液
などが含まれる。そのような担体を含んでなる組成物は、よく知られた従来法に
よって製剤化され得る。これら医薬組成物は、好適な用量で被検者へ投与され得
る。好適な組成物の投与は、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所又は皮内投与
といった様々な方法により達成し得る。投与方式は、担当医や種々の臨床要因に
よって決定される。医学上の技術でよく知られているように、ある患者への投与
量は、患者のサイズ、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性、投与の時
間と経路、一般健康状態、同時投与される他の薬剤を包含する多くの要因に依存
する。概して言えば、医薬組成物を定期的に投与する場合の治療方式は、１日に
つき１μｇ〜１０ｍｇ単位の範囲にあるべきである。治療方式が連続注入であれ
ば、１分につき体重キログラムあたり、それぞれ１μｇ〜１０ｍｇ単位の範囲に
あるべきである。進捗度合いは定期評価によってモニターし得る。用量は変わり
得るが、ＤＮＡを静脈内投与するときの好ましい投与量は、ＤＮＡ分子の約１０ 6 〜１０12コピーである。本発明の組成物は、局所的又は全身的に投与し得る。
投与は概して腸管外、例えば静脈内であろうが、ＤＮＡは、例えば内部／外部標
的部位への生物的（biolistic）デリバリー又は動脈内部位へのカテーテルによ
って標的部位へ直接投与してもよい。腸管外投与用の調製物には、無菌の水性又
は非水性溶液、懸濁液及びエマルジョンが含まれる。非水性溶媒の例は、プロピ
レングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、及びオ
レイン酸エチルのような注射し得る有機エステルである。水性の担体には、水、
アルコール／水溶液、生理食塩水や緩衝化媒質を含むエマルジョン又は懸濁液が
含まれる。腸管外投与の担体には塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース
、デキストロース／塩化ナトリウム、乳酸リンゲル、又は固定油が含まれる。静
脈内投与の担体には、体液や栄養補充物、電解質補充物（リンゲルデキストロー
スに基づいたもの）、等が含まれる。例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、及
び不活性ガスといった保存剤や他の添加剤もあってよい。
剤用担体の例は当技術分野でよく知られていて、リン酸緩衝化生理食塩水、水、
水中油型エマルジョンのようなエマルジョン、様々なタイプの湿潤剤、無菌溶液
などが含まれる。そのような担体を含んでなる組成物は、よく知られた従来法に
よって製剤化され得る。これら医薬組成物は、好適な用量で被検者へ投与され得
る。好適な組成物の投与は、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所又は皮内投与
といった様々な方法により達成し得る。投与方式は、担当医や種々の臨床要因に
よって決定される。医学上の技術でよく知られているように、ある患者への投与
量は、患者のサイズ、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性、投与の時
間と経路、一般健康状態、同時投与される他の薬剤を包含する多くの要因に依存
する。概して言えば、医薬組成物を定期的に投与する場合の治療方式は、１日に
つき１μｇ〜１０ｍｇ単位の範囲にあるべきである。治療方式が連続注入であれ
ば、１分につき体重キログラムあたり、それぞれ１μｇ〜１０ｍｇ単位の範囲に
あるべきである。進捗度合いは定期評価によってモニターし得る。用量は変わり
得るが、ＤＮＡを静脈内投与するときの好ましい投与量は、ＤＮＡ分子の約１０ 6 〜１０12コピーである。本発明の組成物は、局所的又は全身的に投与し得る。
投与は概して腸管外、例えば静脈内であろうが、ＤＮＡは、例えば内部／外部標
的部位への生物的（biolistic）デリバリー又は動脈内部位へのカテーテルによ
って標的部位へ直接投与してもよい。腸管外投与用の調製物には、無菌の水性又
は非水性溶液、懸濁液及びエマルジョンが含まれる。非水性溶媒の例は、プロピ
レングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、及びオ
レイン酸エチルのような注射し得る有機エステルである。水性の担体には、水、
アルコール／水溶液、生理食塩水や緩衝化媒質を含むエマルジョン又は懸濁液が
含まれる。腸管外投与の担体には塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース
、デキストロース／塩化ナトリウム、乳酸リンゲル、又は固定油が含まれる。静
脈内投与の担体には、体液や栄養補充物、電解質補充物（リンゲルデキストロー
スに基づいたもの）、等が含まれる。例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、及
び不活性ガスといった保存剤や他の添加剤もあってよい。
【００６１】 本発明には、所望によりベクターに含まれる様々なインサートが、単独か又は
標準ベクター及び／又は遺伝子デリバリーシステムを用いる組合せのいずれかで
、及び所望により製剤的に許容される担体又は賦形剤とともに投与されることが
想定されている。投与に続き、前記ポリヌクレオチド又はベクターは、被検者の
ゲノムへ安定的に組み込まれ得る。また、ある種の細胞又は組織に特異的であり
、前記細胞に存続するウイルスベクターが使用される場合がある。好適な医薬担
体や賦形剤は当技術分野でよく知られている。本発明により製造される医薬組成
物は様々な種類の疾患（例えばＢ細胞及び／又はＴ細胞に関連した免疫欠損や悪
性腫瘍に関連した疾患、悪性／非悪性の細胞／組織の疾患、及び／又は病原微生
物と非病原微生物、疾患抵抗性及び／又はウイルス抵抗性の植物と非抵抗性の植
物といった様々な系統の生物の間にある疾患、及び／又は細胞、組織、生物、微
生物、植物、ウイルス、ファージ、細菌、酵母などの任意の２系統の間にある疾
患）を予防又は治療、又は遅延させるために使用され得る。
標準ベクター及び／又は遺伝子デリバリーシステムを用いる組合せのいずれかで
、及び所望により製剤的に許容される担体又は賦形剤とともに投与されることが
想定されている。投与に続き、前記ポリヌクレオチド又はベクターは、被検者の
ゲノムへ安定的に組み込まれ得る。また、ある種の細胞又は組織に特異的であり
、前記細胞に存続するウイルスベクターが使用される場合がある。好適な医薬担
体や賦形剤は当技術分野でよく知られている。本発明により製造される医薬組成
物は様々な種類の疾患（例えばＢ細胞及び／又はＴ細胞に関連した免疫欠損や悪
性腫瘍に関連した疾患、悪性／非悪性の細胞／組織の疾患、及び／又は病原微生
物と非病原微生物、疾患抵抗性及び／又はウイルス抵抗性の植物と非抵抗性の植
物といった様々な系統の生物の間にある疾患、及び／又は細胞、組織、生物、微
生物、植物、ウイルス、ファージ、細菌、酵母などの任意の２系統の間にある疾
患）を予防又は治療、又は遅延させるために使用され得る。
【００６２】 さらに、本発明のポリヌクレオチド又はベクターを含む本発明の医薬組成物を
遺伝子治療に使用することが可能である。好適な遺伝子デリバリーシステムは、
リポソーム、受容体介在性のデリバリーシステム、裸のＤＮＡ、ヘルペスウイル
ス、レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ関連ウイルスといったウイルス
ベクターをとりわけ包含し得る。遺伝子治療のために核酸を体内の特定部位へデ
リバリーすることは、Williams (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991), 2726
-2729)により記載されるような生物的デリバリーシステムを用いても達成され得
る。
遺伝子治療に使用することが可能である。好適な遺伝子デリバリーシステムは、
リポソーム、受容体介在性のデリバリーシステム、裸のＤＮＡ、ヘルペスウイル
ス、レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ関連ウイルスといったウイルス
ベクターをとりわけ包含し得る。遺伝子治療のために核酸を体内の特定部位へデ
リバリーすることは、Williams (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991), 2726
-2729)により記載されるような生物的デリバリーシステムを用いても達成され得
る。
【００６３】 導入されたインサートやベクターが前記細胞への導入後に遺伝子産物を発現し
、好ましくは前記細胞の生存中にそのままの状態で残存することが理解されるべ
きである。例えば、適切な調節配列の制御下でポリヌクレオチドを安定的に発現
する細胞系は、当技術分野の当業者によく知られている方法によって工学処理さ
れ得る。宿主細胞は、ウイルスの複製起点を含有する発現ベクターを使用するよ
りは、同一のプラスミドか別個のプラスミドのいずれかにある本発明のポリヌク
レオチドと選択マーカーを用いて形質転換され得る。異種ＤＮＡの導入後、工学
処理した細胞を栄養豊富な培地で１〜２日間増殖させた後、選択培地へ移される
。組換えプラスミド内の選択マーカーが選択抵抗性をもたらすので、その染色体
にプラスミドが安定的に組込まれ、クローン化されて細胞系へ拡張し得るフォー
カスを形成するまで増殖する細胞を選択することが可能になる。そのような工学
処理された細胞系はまた、例えばＢ細胞／Ｔ細胞相互作用に関わる化合物を検出
するスクリーニング方法においても特に有用である。
、好ましくは前記細胞の生存中にそのままの状態で残存することが理解されるべ
きである。例えば、適切な調節配列の制御下でポリヌクレオチドを安定的に発現
する細胞系は、当技術分野の当業者によく知られている方法によって工学処理さ
れ得る。宿主細胞は、ウイルスの複製起点を含有する発現ベクターを使用するよ
りは、同一のプラスミドか別個のプラスミドのいずれかにある本発明のポリヌク
レオチドと選択マーカーを用いて形質転換され得る。異種ＤＮＡの導入後、工学
処理した細胞を栄養豊富な培地で１〜２日間増殖させた後、選択培地へ移される
。組換えプラスミド内の選択マーカーが選択抵抗性をもたらすので、その染色体
にプラスミドが安定的に組込まれ、クローン化されて細胞系へ拡張し得るフォー
カスを形成するまで増殖する細胞を選択することが可能になる。そのような工学
処理された細胞系はまた、例えばＢ細胞／Ｔ細胞相互作用に関わる化合物を検出
するスクリーニング方法においても特に有用である。
【００６４】 限定しないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wigler, Cell 11 (1
977), 233）、ヒポキサンチンーグアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（S
zybalska, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48 (1962), 2026）、及びアデ
ニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowy, Cell 22 (1980), 817）（それ
ぞれ、ｔｋ-、ｈｇｐｒｔ-又はａｐｒｔ-細胞の系）を包含する、数多くの選択
システムが使用され得る。また、代謝拮抗剤への抵抗性は、メトトレキセート抵
抗性をもたらすｄｈｆｒ（Wigler, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980), 35
67; O'Hare, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 1527）；マイコフェノー
ル酸抵抗性をもたらすｇｐｔ（Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (198
1), 2072）；アミノグリコシドＧ−４１８抵抗性をもたらすｎｅｏ（Colberre-G
arapin, J. Mol. Biol. 150 (1981), 1）；ヒグロマイシン（Santerre, Gene 30
(1984), 147）又はピューロマイシン（ｐａｔ、ピューロマイシンＮ−アセチル
トランスフェラーゼ）抵抗性をもたらすｈｙｇｒｏを選択する基礎として使用さ
れ得る。これまでに記載されている追加の選択遺伝子には、例えば、細胞がトリ
プトファンの代わりにインドールを利用することを可能にするｔｒｐＢ；細胞が
ヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用することを可能にするｈｉｓＤ（Hart
man, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 8047）；オルニチンデカルボキ
シラーゼ阻害剤の２−（ジフルオロメチル）−ＤＬ−オルニチン、ＤＦＭＯへの
抵抗性をもたらすＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼ）（McConlogue, 1987
, In: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor La
boratory ed.）がある。
977), 233）、ヒポキサンチンーグアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（S
zybalska, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48 (1962), 2026）、及びアデ
ニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowy, Cell 22 (1980), 817）（それ
ぞれ、ｔｋ-、ｈｇｐｒｔ-又はａｐｒｔ-細胞の系）を包含する、数多くの選択
システムが使用され得る。また、代謝拮抗剤への抵抗性は、メトトレキセート抵
抗性をもたらすｄｈｆｒ（Wigler, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980), 35
67; O'Hare, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 1527）；マイコフェノー
ル酸抵抗性をもたらすｇｐｔ（Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (198
1), 2072）；アミノグリコシドＧ−４１８抵抗性をもたらすｎｅｏ（Colberre-G
arapin, J. Mol. Biol. 150 (1981), 1）；ヒグロマイシン（Santerre, Gene 30
(1984), 147）又はピューロマイシン（ｐａｔ、ピューロマイシンＮ−アセチル
トランスフェラーゼ）抵抗性をもたらすｈｙｇｒｏを選択する基礎として使用さ
れ得る。これまでに記載されている追加の選択遺伝子には、例えば、細胞がトリ
プトファンの代わりにインドールを利用することを可能にするｔｒｐＢ；細胞が
ヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用することを可能にするｈｉｓＤ（Hart
man, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 8047）；オルニチンデカルボキ
シラーゼ阻害剤の２−（ジフルオロメチル）−ＤＬ−オルニチン、ＤＦＭＯへの
抵抗性をもたらすＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼ）（McConlogue, 1987
, In: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor La
boratory ed.）がある。
【００６５】 本発明はまた、固形支持体に固定していると上記に言及されるような発現ライ
ブラリーの少なくとも２つのレプリカを含んでなるキットにも関する。本発明の
キットは、本発明の方法を実行するのに特に適している。本明細書では、様々な
タイプの可能で好ましい固形支持体を上記に規定した。好ましくは、本発明のキ
ットは、上記に規定したようにさらに少なくとも１種のリガンドを含む。
ブラリーの少なくとも２つのレプリカを含んでなるキットにも関する。本発明の
キットは、本発明の方法を実行するのに特に適している。本明細書では、様々な
タイプの可能で好ましい固形支持体を上記に規定した。好ましくは、本発明のキ
ットは、上記に規定したようにさらに少なくとも１種のリガンドを含む。
【００６６】 本発明のキットの成分は、所望により緩衝液及び／又は溶液に溶けた状態で、
バイアルのような容器にパッケージされ得る。１つ又はそれ以上の前記成分は、
１つの同一容器に適宜パッケージされ得る。
バイアルのような容器にパッケージされ得る。１つ又はそれ以上の前記成分は、
１つの同一容器に適宜パッケージされ得る。
【００６７】 本明細書に引用した文献は参照により本明細書に組込まれている。 以下の実施例は説明のためであって、本発明を限定しない。これらは使用され
得る典型的なものであるが、当技術分野の当業者に知られている他の方法も代替
的に使用され得る。
得る典型的なものであるが、当技術分野の当業者に知られている他の方法も代替
的に使用され得る。
【００６８】
実施例１：アレイ状ヒトｃＤＮＡ発現ライブラリーの構築 指向性にクローン化したヒト胎児脳のｃＤＮＡライブラリー（ｈＥｘ１）を、
Ｈｉｓ６−タグ付き融合タンパク質のＩＰＴＧ誘導発現ベクターであるｐＱＥ−
３０ＮＳＴにおいて構築した。ｐＱＥ−３０ＮＳＴは、ファージＴ５プロモータ
ー及びＩＰＴＧ誘導組換えタンパク質を発現させる２つのｌａｃオペレーターを
担う、ｐＢＲ３２２をベースとする発現ベクターであるｐＱＥ−３０（Ｑｉａｇ
ｅｎ）より、以下のようにして構築した；第一工程では、ｐＱＥ−３０の唯一の
ＰｓｔＩ部位へ、ＢＧｌＩＩ及びＮｏｔｌ部位を担う合成オリゴヌクレオチドを
挿入することによりｐＱＥ−３０Ｎを産生した。次の工程では、ＳＰ６プロモー
ターを担うＳＰ６プロモーターオリゴヌクレオチドを、ｐＱＥ−３０ＮのＢａｍ
ＨＩとＳａｌＩ部位の間に挿入した後、Ｔ７プロモーターを担う第二のオリゴヌ
クレオチドを、ＨｉｎｄＩＩＩとＮｏｔＩ部位の間に挿入した。得られたベクタ
ー、ｐＱＥ−３０ＮＳＴは、ＳａｌＩとＮｏｔＩの突出を有するｃＤＮＡのクロ
ーニングに使用し得る。このインサートは、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを用い
てセンス方向に、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いてアンチセンス方向に、in v
itroで転写され得る。
Ｈｉｓ６−タグ付き融合タンパク質のＩＰＴＧ誘導発現ベクターであるｐＱＥ−
３０ＮＳＴにおいて構築した。ｐＱＥ−３０ＮＳＴは、ファージＴ５プロモータ
ー及びＩＰＴＧ誘導組換えタンパク質を発現させる２つのｌａｃオペレーターを
担う、ｐＢＲ３２２をベースとする発現ベクターであるｐＱＥ−３０（Ｑｉａｇ
ｅｎ）より、以下のようにして構築した；第一工程では、ｐＱＥ−３０の唯一の
ＰｓｔＩ部位へ、ＢＧｌＩＩ及びＮｏｔｌ部位を担う合成オリゴヌクレオチドを
挿入することによりｐＱＥ−３０Ｎを産生した。次の工程では、ＳＰ６プロモー
ターを担うＳＰ６プロモーターオリゴヌクレオチドを、ｐＱＥ−３０ＮのＢａｍ
ＨＩとＳａｌＩ部位の間に挿入した後、Ｔ７プロモーターを担う第二のオリゴヌ
クレオチドを、ＨｉｎｄＩＩＩとＮｏｔＩ部位の間に挿入した。得られたベクタ
ー、ｐＱＥ−３０ＮＳＴは、ＳａｌＩとＮｏｔＩの突出を有するｃＤＮＡのクロ
ーニングに使用し得る。このインサートは、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを用い
てセンス方向に、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いてアンチセンス方向に、in v
itroで転写され得る。
【００６９】 １４種のクローンのＰＣＲ分析により、約１．４ｋｂの平均インサートサイズ
が得られた。 ｐＳＥ１１１を担っているE. coli ＳＣＳ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を宿主株
として使用し、この発現ライブラリーを構築した。ｐＳＥ１１１は、ｐＳＢＥＴ
ｃから構築した（Schenk et al., BioTechniques 19(2)(1995), 196-198）。ｐ
ＳＢＥＴｃはｐＡＣＹＣ１７７をベースとする発現ベクターであり、カナマイシ
ン抵抗遺伝子のａｒｇＵ遺伝子、及び組換えタンパク質を発現させるＴ７ ＲＮ
Ａポリメラーゼのプロモーター部位を担う（Schenk et al., BioTechniques 19
(1995), 196ff）。ヘルパープラスミドのｐＳＥ１１１は、ｌａｃリプレッサー
遺伝子、及びＡＧＡとＡＧＧのアルギニンコドンを認識する稀なｔＲＮＡをコー
ドするａｒｇＵ（ｄｎａＹ）遺伝子を担うが（Brinkmann et al., Gene 85 (198
9), 109-114）、ｐＳＢＥＴから２つの工程で構築した。
が得られた。 ｐＳＥ１１１を担っているE. coli ＳＣＳ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を宿主株
として使用し、この発現ライブラリーを構築した。ｐＳＥ１１１は、ｐＳＢＥＴ
ｃから構築した（Schenk et al., BioTechniques 19(2)(1995), 196-198）。ｐ
ＳＢＥＴｃはｐＡＣＹＣ１７７をベースとする発現ベクターであり、カナマイシ
ン抵抗遺伝子のａｒｇＵ遺伝子、及び組換えタンパク質を発現させるＴ７ ＲＮ
Ａポリメラーゼのプロモーター部位を担う（Schenk et al., BioTechniques 19
(1995), 196ff）。ヘルパープラスミドのｐＳＥ１１１は、ｌａｃリプレッサー
遺伝子、及びＡＧＡとＡＧＧのアルギニンコドンを認識する稀なｔＲＮＡをコー
ドするａｒｇＵ（ｄｎａＹ）遺伝子を担うが（Brinkmann et al., Gene 85 (198
9), 109-114）、ｐＳＢＥＴから２つの工程で構築した。
【００７０】 Ｘｍｎｌ−ＥｃｏＲＶフラグメント、ヌクレオチドの２０４１−２５２１位を
ｐＳＢＥＴｃから切出して、Ｔ７プロモーター領域を除去した。 ｌａｃＩＱ遺伝子を含有する１．２ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントをプラスミ
ドｐＶＨ１（Haring et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985), 6090-60
94）から切出し、工程（ｉ）から得られるプラスミドの唯一のＥｃｏＲＩ部位へ
挿入した。ｌａｃＩＱインサートを２つの可能な配向で有する５．１ｋｂのプラ
スミドが得られたが、ｌａｃＩＱ遺伝子のｐＳＥ１１１転写は、公表されたｐＳ
ＢＥＴｃのマップ（Schenk et al., BioTechniques 19 (1995), 196ff）では時
計方向であった。このプラスミドは、ｃＤＮＡ発現ライブラリーの宿主株として
使用されるE. coli ＳＣＳ１株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に存在していた。
ｐＳＢＥＴｃから切出して、Ｔ７プロモーター領域を除去した。 ｌａｃＩＱ遺伝子を含有する１．２ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントをプラスミ
ドｐＶＨ１（Haring et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985), 6090-60
94）から切出し、工程（ｉ）から得られるプラスミドの唯一のＥｃｏＲＩ部位へ
挿入した。ｌａｃＩＱインサートを２つの可能な配向で有する５．１ｋｂのプラ
スミドが得られたが、ｌａｃＩＱ遺伝子のｐＳＥ１１１転写は、公表されたｐＳ
ＢＥＴｃのマップ（Schenk et al., BioTechniques 19 (1995), 196ff）では時
計方向であった。このプラスミドは、ｃＤＮＡ発現ライブラリーの宿主株として
使用されるE. coli ＳＣＳ１株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に存在していた。
【００７１】 ピッキング／グリッディングロボットを用いて、８０，６４０個のクローンを
３８４穴マイクロタイタープレートへ刺し入れ、ナイロン／ポリビニリデンジフ
ルオリド（ＰＶＤＦ）フィルターの上に高密度でグリッドした。ナイロンフィル
ターをＤＮＡハイブリダイゼーション用に処理し（ＤＮＡフィルター）、ＰＶＤ
Ｆフィルターは、タンパク質発現を誘導するＩＰＴＧを含有する寒天プレート上
に移し、タンパク質検出用に処理した（タンパク質フィルター）。
３８４穴マイクロタイタープレートへ刺し入れ、ナイロン／ポリビニリデンジフ
ルオリド（ＰＶＤＦ）フィルターの上に高密度でグリッドした。ナイロンフィル
ターをＤＮＡハイブリダイゼーション用に処理し（ＤＮＡフィルター）、ＰＶＤ
Ｆフィルターは、タンパク質発現を誘導するＩＰＴＧを含有する寒天プレート上
に移し、タンパク質検出用に処理した（タンパク質フィルター）。
【００７２】 実施例２：高密度フィルター上でのタンパク質発現スクリーニング ｐＱＥ−３０ＮＳＴベクターから過剰発現される組換え融合タンパク質のＮ末
端配列、ＲＧＳＨ６を認識するモノクローナルＲＧＳ・Ｈｉｓ抗体を用いて、ｈ
Ｅｘ１ライブラリーの高密度タンパク質フィルターをスクリーニングした（図１
）。約２０％のポジティブ・クローン（シグナル強度１、２又は３）を１〜３へ
分類した。これらのクローンは推定タンパク質発現クローンと考えられた（図１
）。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍキット（ライフテ
クノロジーズ）を使用するオリゴ（ｄＴ）プライミング（Gubler et al., Gene
25 (1983), 263）によって、ヒト胎児脳の組織からｈＥｘ１ライブラリーを調製
した。ゲル濾過によりｃＤＮＡをサイズで分画し、発現ベクターｐＱＥ−３０Ｎ
ＴのＳａｌＩとＮｏｔＩ部位の間で各分画を連結した。ヘルパープラスミドのｐ
ＳＥ１１１を担うE. coli ＳＣＳ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を宿主株として使
用した。エレクトロポレーションによる形質転換の後で、四角い寒天プレート（
Ｎｕｎｃ Ｂｉｏ Ａｓｓａｙ Ｄｉｓｈ）上にこのライブラリーをまき、３７
℃で一晩増殖させた。自動ロボットシステム（Lehrach et al., Interdisciplin
ary Science Reviews 22 (1997), 37-44）を使用して、アンピシリン１００μｇ
／ｍｌ、カナマイシン１５μｇ／ｍｌ、２％グルコース及び凍結ミックス（０．
４ｍＭ ＭｇＳＯ4、１．５ｍＭＮａ3−クエン酸、６．８ｍＭ （ＮＨ4）2ＳＯ 4 、３．６％グリセロール、１３ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、２７ｍＭ Ｋ2ＨＰＯ4，［
ｐＨ７．０］）を含有する２ｘＹＴ培地を満たした３８４穴マイクロタイタープ
レート（Ｇｅｎｅｔｉｘ）へクローンを刺し入れた。３７℃で一晩、マイクロタ
イター穴で細菌を増殖させ、３８４ピン複製ツール（Ｇｅｎｅｔｉｘ）を使用し
て新しいマイクロプレートへ複製した。すべてのコピーを−８０℃で冷凍保存し
た。
端配列、ＲＧＳＨ６を認識するモノクローナルＲＧＳ・Ｈｉｓ抗体を用いて、ｈ
Ｅｘ１ライブラリーの高密度タンパク質フィルターをスクリーニングした（図１
）。約２０％のポジティブ・クローン（シグナル強度１、２又は３）を１〜３へ
分類した。これらのクローンは推定タンパク質発現クローンと考えられた（図１
）。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍキット（ライフテ
クノロジーズ）を使用するオリゴ（ｄＴ）プライミング（Gubler et al., Gene
25 (1983), 263）によって、ヒト胎児脳の組織からｈＥｘ１ライブラリーを調製
した。ゲル濾過によりｃＤＮＡをサイズで分画し、発現ベクターｐＱＥ−３０Ｎ
ＴのＳａｌＩとＮｏｔＩ部位の間で各分画を連結した。ヘルパープラスミドのｐ
ＳＥ１１１を担うE. coli ＳＣＳ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を宿主株として使
用した。エレクトロポレーションによる形質転換の後で、四角い寒天プレート（
Ｎｕｎｃ Ｂｉｏ Ａｓｓａｙ Ｄｉｓｈ）上にこのライブラリーをまき、３７
℃で一晩増殖させた。自動ロボットシステム（Lehrach et al., Interdisciplin
ary Science Reviews 22 (1997), 37-44）を使用して、アンピシリン１００μｇ
／ｍｌ、カナマイシン１５μｇ／ｍｌ、２％グルコース及び凍結ミックス（０．
４ｍＭ ＭｇＳＯ4、１．５ｍＭＮａ3−クエン酸、６．８ｍＭ （ＮＨ4）2ＳＯ 4 、３．６％グリセロール、１３ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、２７ｍＭ Ｋ2ＨＰＯ4，［
ｐＨ７．０］）を含有する２ｘＹＴ培地を満たした３８４穴マイクロタイタープ
レート（Ｇｅｎｅｔｉｘ）へクローンを刺し入れた。３７℃で一晩、マイクロタ
イター穴で細菌を増殖させ、３８４ピン複製ツール（Ｇｅｎｅｔｉｘ）を使用し
て新しいマイクロプレートへ複製した。すべてのコピーを−８０℃で冷凍保存し
た。
【００７３】 実施例３：対応するフィルターセット上での遺伝子とタンパク質の同定 実施例のタンパク質としてＧＡＰＤＨとＨＳＰ９０αを選択した。ＧＡＰＤＨ
（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ｐ０４４０６）のオープンリーディングフレームは１
，００８ｂｐ、３５，９２２ダルトンであり、ＨＳＰ９０α（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒ
ｏｔ Ｐ０７９００）のそれは２，１９９ｂｐ、８４，５４２ダルトンである。
（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ｐ０４４０６）のオープンリーディングフレームは１
，００８ｂｐ、３５，９２２ダルトンであり、ＨＳＰ９０α（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒ
ｏｔ Ｐ０７９００）のそれは２，１９９ｂｐ、８４，５４２ダルトンである。
【００７４】 ｈＥｘ１ライブラリーの３種の高密度ＤＮＡフィルター（８０，６４０クロー
ン）セットを、遺伝子特異的ｃＤＮＡプローブでスクリーニングした。高密度フ
ィルターは、文献のように、ロボットスポッティングにより調製した（Maier et
al., Drug Discovery Today 2 (1997), 315-324; Lehrach et al., Interdisci
plinary Science Reviews 22 (1997), 37-44）。細菌コロニーを、ＤＮＡ分析用
にはナイロン膜フィルター（Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ＋、アマーシャム）上に、タンパ
ク質分析用にはポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜フィルター（Ｈｙｂ
ｏｎｄ ＰＶＤＦ、アマーシャム）上にグリッドした（フィルターフォーマット
：２２２ｍｍｘ２２２ｍｍ）。クローンは、フィルターあたり２７，６４８個の
密度で、インクガイドドットを囲むように、同一２検体（デュプリケート）パタ
ーンでスポットした。アンピシリン１００μｇ／ｍｌ、カナマイシン１５μｇ／
ｍｌ、２％グルコースを含有する四角い２ｘＹＴ寒天プレート（Ｎｕｎｃ Ｂｉ
ｏ Ａｓｓａｙ Ｄｉｓｈ）上に、高密度フィルターを置いた。
ン）セットを、遺伝子特異的ｃＤＮＡプローブでスクリーニングした。高密度フ
ィルターは、文献のように、ロボットスポッティングにより調製した（Maier et
al., Drug Discovery Today 2 (1997), 315-324; Lehrach et al., Interdisci
plinary Science Reviews 22 (1997), 37-44）。細菌コロニーを、ＤＮＡ分析用
にはナイロン膜フィルター（Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ＋、アマーシャム）上に、タンパ
ク質分析用にはポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜フィルター（Ｈｙｂ
ｏｎｄ ＰＶＤＦ、アマーシャム）上にグリッドした（フィルターフォーマット
：２２２ｍｍｘ２２２ｍｍ）。クローンは、フィルターあたり２７，６４８個の
密度で、インクガイドドットを囲むように、同一２検体（デュプリケート）パタ
ーンでスポットした。アンピシリン１００μｇ／ｍｌ、カナマイシン１５μｇ／
ｍｌ、２％グルコースを含有する四角い２ｘＹＴ寒天プレート（Ｎｕｎｃ Ｂｉ
ｏ Ａｓｓａｙ Ｄｉｓｈ）上に、高密度フィルターを置いた。
【００７５】 ＤＮＡ分析に使用するフィルターを３７℃で一晩増殖させ、次いで既報のよう
に処理した（Hoheisel et al., J. Mol. Biol. 220 (1991), 903-914）。タンパ
ク質分析に使用するフィルターを３０℃で一晩増殖させ、次いで、１ｍＭ ＩＰ
ＴＧを補充した寒天プレートへ移し、３７℃で３時間の誘導で、タンパク質発現
を誘導した。０．５Ｍ ＮａＯＨ、１．５Ｍ ＮａＣｌに浸したブロッティング
ペーパーの上に１０分間（５分間ｘ２）、１Ｍトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１
．５Ｍ ＮａＣｌに５分間、最後に２ｘＳＳＣに１５分間、このフィルターを置
くことにより、発現されたタンパク質をフィルター上に固定した。フィルターを
空気乾燥し、室温保存した。
に処理した（Hoheisel et al., J. Mol. Biol. 220 (1991), 903-914）。タンパ
ク質分析に使用するフィルターを３０℃で一晩増殖させ、次いで、１ｍＭ ＩＰ
ＴＧを補充した寒天プレートへ移し、３７℃で３時間の誘導で、タンパク質発現
を誘導した。０．５Ｍ ＮａＯＨ、１．５Ｍ ＮａＣｌに浸したブロッティング
ペーパーの上に１０分間（５分間ｘ２）、１Ｍトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１
．５Ｍ ＮａＣｌに５分間、最後に２ｘＳＳＣに１５分間、このフィルターを置
くことにより、発現されたタンパク質をフィルター上に固定した。フィルターを
空気乾燥し、室温保存した。
【００７６】 ジゴキシゲニン標識ＰＣＲプローブとＡｔｔｏｐｈｏｓアルカリホスファター
ゼ基質（ＪＢＬサイエンティフィック、サンルイ、オビスポ）を用いるＤＮＡハ
イブリダイゼーションを既報のように実施した（Maier et al., J. Biotechnol.
35 (1994), 191-203）。ジゴキシゲニン標識ハイブリダイゼーションのプロー
ブは、ヒトＧＡＰＤＨの完全なオープンリーディングフレームを含有するクロー
ンとＨＳＰ９０αのＣ末端部分を含有するＩＭＡＧＥクローン３４３７２２号（
ＧｅｎＢａｎｋ：Ｗ６９３６１）のＰＣＲ増幅により製造した。
ゼ基質（ＪＢＬサイエンティフィック、サンルイ、オビスポ）を用いるＤＮＡハ
イブリダイゼーションを既報のように実施した（Maier et al., J. Biotechnol.
35 (1994), 191-203）。ジゴキシゲニン標識ハイブリダイゼーションのプロー
ブは、ヒトＧＡＰＤＨの完全なオープンリーディングフレームを含有するクロー
ンとＨＳＰ９０αのＣ末端部分を含有するＩＭＡＧＥクローン３４３７２２号（
ＧｅｎＢａｎｋ：Ｗ６９３６１）のＰＣＲ増幅により製造した。
【００７７】 ヒトＧＡＰＤＨプローブ（図２ａ）については、２０６個（０．２６％）のク
ローンがポジティブであった（表１）（図２ａ）。２回目のハイブリダイゼーシ
ョンで２０２個を確認するとともに、さらに３５個の追加クローンを検出した（
全体で２３７個へ増加、表１）。ヒトＨＳＰ９０αプローブでは５６個（０．０
７％）のクローンが同定された。対応するタンパク質フィルターでは、ＧＡＰＤ
ＨとＨＳＰ９０αでそれぞれ５６個（２７％）と１４個（２５％）のポジティブ
・クローンがＲＧＳ・Ｈｉｓ抗体により認識された。
ローンがポジティブであった（表１）（図２ａ）。２回目のハイブリダイゼーシ
ョンで２０２個を確認するとともに、さらに３５個の追加クローンを検出した（
全体で２３７個へ増加、表１）。ヒトＨＳＰ９０αプローブでは５６個（０．０
７％）のクローンが同定された。対応するタンパク質フィルターでは、ＧＡＰＤ
ＨとＨＳＰ９０αでそれぞれ５６個（２７％）と１４個（２５％）のポジティブ
・クローンがＲＧＳ・Ｈｉｓ抗体により認識された。
【００７８】 高密度フィルター上での抗体スクリーニングを以下のように実施した：ウサギ
抗ＧＡＰＤＨ血清を既報のようにアフィニティー精製した（Gu et al., BioTech
niques 17 (1994), 257-262）。抗ＨＳＰ９０（トランスダクション・ラボラト
リーズ、レキシントン）は、ＨＳＰ９０αのアミノ酸５８６〜７３２に向けられ
ている。乾燥したタンパク質フィルターをエタノールに浸し、ＴＢＳ−Ｔ（２０
ｍＭ トリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５、０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅ
ｅｎ ２０、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）に浸したペーパータオルで
細菌の残滓を拭き取った。このフィルターをブロッキング緩衝液（非脂肪の乾燥
乳粉末３％／ＴＢＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７
．５）中で１時間ブロックし、５０００倍希釈した抗ＨＳＰ抗体又は抗ＧＡＰＤ
Ｈ抗体５０ｎｇ／ｍｌとともに一晩インキュベートした。ＴＢＳ−Ｔでの洗浄を
１０分２回、ＴＢＳでの洗浄を１０分１回した後、アルカリホスファターゼ（Ａ
Ｐ）が接合した二次抗体とともにフィルターを１時間インキュベートした。ＴＢ
ＳＴ−Ｔで１０分３回、ＴＢＳで１０分１回、ＡＰ緩衝液（１ｍＭ ＭｇＣｌ2
、０．１Ｍトリス−ＨＣｌ，ｐＨ９．５）で１０分１回洗浄した後、フィルター
を０．５ｍＭ Ａｔｔｏｐｈｏｓ（ＪＢＬサイエンティフィック、サンルイ、オ
ビスポ）／ＡＰ緩衝液で１０分間インキュベートした。長波長ＵＶ光でフィルタ
ーを発光させ、高解像ＣＣＤ検出システムを用いて画像化した（Maier et al.,
Drug Discovery Today 2 (1997), 315-324）。カスタム画像分析ソフトウェアを
用いてポジティブ・クローンを計数した。ポリクローナル抗ＧＡＰＤＨ抗体（図
２ｂ）では、３９個のクローンがポジティブだった（表２）。これらはいずれも
ＲＧＳ・Ｈｉｓ抗体で検出されたが、ＧＡＰＤＨ特異的ＤＮＡプローブでポジテ
ィブと計数されたのは３２個のクローンだけである。しかしながら、２回目のＤ
ＮＡハイブリダイゼーションでは、計数されなかった７個のクローンのうち５個
が検出された。モノクローナル抗ＨＳＰ９０抗体でスクリーニングすると３２個
のポジティブ・クローンが得られ、そのうち２８個はＨＳＰ９０αのＤＮＡプロ
ーブにより検出され、１０個はＨＳＰ９０αのＤＮＡプローブとＲＧＳ・Ｈｉｓ
抗体のいずれでもポジティブであった。２回目の抗ＨＳＰ９０スクリーニングで
は、３０個のクローンが確認され、新たに１２個のクローンが検出されたが、こ
れらはいずれもＨＳＰ９０αのＤＮＡプローブでポジティブであった。
抗ＧＡＰＤＨ血清を既報のようにアフィニティー精製した（Gu et al., BioTech
niques 17 (1994), 257-262）。抗ＨＳＰ９０（トランスダクション・ラボラト
リーズ、レキシントン）は、ＨＳＰ９０αのアミノ酸５８６〜７３２に向けられ
ている。乾燥したタンパク質フィルターをエタノールに浸し、ＴＢＳ−Ｔ（２０
ｍＭ トリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５、０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅ
ｅｎ ２０、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）に浸したペーパータオルで
細菌の残滓を拭き取った。このフィルターをブロッキング緩衝液（非脂肪の乾燥
乳粉末３％／ＴＢＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７
．５）中で１時間ブロックし、５０００倍希釈した抗ＨＳＰ抗体又は抗ＧＡＰＤ
Ｈ抗体５０ｎｇ／ｍｌとともに一晩インキュベートした。ＴＢＳ−Ｔでの洗浄を
１０分２回、ＴＢＳでの洗浄を１０分１回した後、アルカリホスファターゼ（Ａ
Ｐ）が接合した二次抗体とともにフィルターを１時間インキュベートした。ＴＢ
ＳＴ−Ｔで１０分３回、ＴＢＳで１０分１回、ＡＰ緩衝液（１ｍＭ ＭｇＣｌ2
、０．１Ｍトリス−ＨＣｌ，ｐＨ９．５）で１０分１回洗浄した後、フィルター
を０．５ｍＭ Ａｔｔｏｐｈｏｓ（ＪＢＬサイエンティフィック、サンルイ、オ
ビスポ）／ＡＰ緩衝液で１０分間インキュベートした。長波長ＵＶ光でフィルタ
ーを発光させ、高解像ＣＣＤ検出システムを用いて画像化した（Maier et al.,
Drug Discovery Today 2 (1997), 315-324）。カスタム画像分析ソフトウェアを
用いてポジティブ・クローンを計数した。ポリクローナル抗ＧＡＰＤＨ抗体（図
２ｂ）では、３９個のクローンがポジティブだった（表２）。これらはいずれも
ＲＧＳ・Ｈｉｓ抗体で検出されたが、ＧＡＰＤＨ特異的ＤＮＡプローブでポジテ
ィブと計数されたのは３２個のクローンだけである。しかしながら、２回目のＤ
ＮＡハイブリダイゼーションでは、計数されなかった７個のクローンのうち５個
が検出された。モノクローナル抗ＨＳＰ９０抗体でスクリーニングすると３２個
のポジティブ・クローンが得られ、そのうち２８個はＨＳＰ９０αのＤＮＡプロ
ーブにより検出され、１０個はＨＳＰ９０αのＤＮＡプローブとＲＧＳ・Ｈｉｓ
抗体のいずれでもポジティブであった。２回目の抗ＨＳＰ９０スクリーニングで
は、３０個のクローンが確認され、新たに１２個のクローンが検出されたが、こ
れらはいずれもＨＳＰ９０αのＤＮＡプローブでポジティブであった。
【００７９】 実施例４：検出されたクローンの配列とウェスタンブロット分析 図３は、ＧＡＰＤＨとＨＳＰ９０αについて得られたフィルターデータを要約
する。カテゴリーＡ〜Ｅのクローンを、そのｃＤＮＡインサートの５’末端の配
列決定（図４）、及びウェスタンブロット（図５）により分析した。以下の実験
プロトコールを実行した。 （Ａ）全般的ポジティブ・クローン ＤＮＡプローブ、抗ＧＡＰＤＨ及びＲＧＳ・Ｈｉｓ抗体で同定された１０個の
ＧＡＰＤＨクローンの配列を決定し、正しい読み枠にＧＡＰＤＨ配列を含有する
ことを見出した。９個のクローンが、５’−ＵＴＲのついた完全なＧＡＰＤＨ配
列とベクターアミノ酸（ｍＲＮＡの５’−ＵＴＲとベクターによりコードされる
アミノ酸）に広がる組換えＨｉｓ６−タグ付きタンパク質を発現した。
する。カテゴリーＡ〜Ｅのクローンを、そのｃＤＮＡインサートの５’末端の配
列決定（図４）、及びウェスタンブロット（図５）により分析した。以下の実験
プロトコールを実行した。 （Ａ）全般的ポジティブ・クローン ＤＮＡプローブ、抗ＧＡＰＤＨ及びＲＧＳ・Ｈｉｓ抗体で同定された１０個の
ＧＡＰＤＨクローンの配列を決定し、正しい読み枠にＧＡＰＤＨ配列を含有する
ことを見出した。９個のクローンが、５’−ＵＴＲのついた完全なＧＡＰＤＨ配
列とベクターアミノ酸（ｍＲＮＡの５’−ＵＴＲとベクターによりコードされる
アミノ酸）に広がる組換えＨｉｓ６−タグ付きタンパク質を発現した。
【００８０】 ＨＳＰ９０αのＤＮＡプローブ、ＲＧＳ・Ｈｉｓ及び抗ＨＳＰ抗体でポジティ
ブな１０個のクローンは、いずれもＨＳＰ９０αの配列を正しい読み枠で有して
いた。しかしながら、完全なコーディング領域を供するものは１つもなく、ＨＳ
Ｐ９０α配列の様々なサイズのＣ末端部分から翻訳されるＨｉｓ６−タグ付き融
合タンパク質を発現することが示されたのは５個のクローンである。 （Ｂ）特異抗体ネガティブ・クローン フィルター上のＧＡＰＤＨ特異抗体にネガティブな７個のＧＡＰＤＨクローン
の配列が、ＧＡＰＤＨのＧｅｎＢａｎｋ配列と重なることが示された。上記クロ
ーンの２つは正しい読み枠でインサートを有し、ウェスタンブロットで抗ＧＡＰ
ＤＨ抗体によって染色されるＧＡＰＤＨフラグメント（２４ｋＤ）を発現した（
図５ａ、Ｂ、レーン１１、１２）。ＧＡＰＤＨインサートは他の５種のクローン
では正しくない読み枠にあり、６．５〜１６．７ｋＤのポリペプチド範囲にあっ
て、発現が推定されるペプチドの発現を示唆した（図５ａ、Ｂ、レーン１３−１
７）。これらクローンのシグナル強度は、高密度フィルターにＲＧＳ・Ｈｉｓ抗
体でプローブした場合、概して低かった。４種のＨＳＰ９０αクローンのうち３
つは正しくない読み枠にインサートを有し、抗ＨＳＰ９０抗体と反応しない短ペ
プチドを発現した（図５ｂ、レーン６、８に２つのクローンを示す）。残りのク
ローンは正しい読み枠にインサートを有し、ウェスタンブロット上で計算される
サイズ（５６．０ｋＤ）のバンドを示し、二回目の高密度フィルタースクリーニ
ングで抗ＨＳＰ９０抗体により検出された。 （Ｃ）ＤＮＡプローブだけポジティブなクローン １２個の無作為に選択したＧＡＰＤＨクローンのうち１１個は正しくない読み
枠でＧＡＰＤＨインサートを含有し、恐らくは３．４〜９．１ｋＤの範囲のペプ
チドを発現していることが示された。クローンＭＰＭＧｐ８００Ａ１７５５は、
正しい読み枠でインサートを有したが、５’−ＵＴＲの−８位に点突然変異があ
り、停止コドンと推定４．７ｋＤのペプチドをもたらした。ＤＮＡ配列分析は、
１２個のＨＳＰ９０αクローンのうち１１個が正しくない読み枠にインサートを
含み、分子量２．８〜５．４ｋＤと計算されるペプチドを恐らく発現しているこ
とを示した。正しい読み枠にインサートを有し、７８．７ｋＤサイズのタンパク
質を発現し、二回目の抗ＨＳＰ９０抗体スクリーニングでポジティブだったのは
、クローンＭＰＭＧｐ８００Ｉ１３１１５だけである。
ブな１０個のクローンは、いずれもＨＳＰ９０αの配列を正しい読み枠で有して
いた。しかしながら、完全なコーディング領域を供するものは１つもなく、ＨＳ
Ｐ９０α配列の様々なサイズのＣ末端部分から翻訳されるＨｉｓ６−タグ付き融
合タンパク質を発現することが示されたのは５個のクローンである。 （Ｂ）特異抗体ネガティブ・クローン フィルター上のＧＡＰＤＨ特異抗体にネガティブな７個のＧＡＰＤＨクローン
の配列が、ＧＡＰＤＨのＧｅｎＢａｎｋ配列と重なることが示された。上記クロ
ーンの２つは正しい読み枠でインサートを有し、ウェスタンブロットで抗ＧＡＰ
ＤＨ抗体によって染色されるＧＡＰＤＨフラグメント（２４ｋＤ）を発現した（
図５ａ、Ｂ、レーン１１、１２）。ＧＡＰＤＨインサートは他の５種のクローン
では正しくない読み枠にあり、６．５〜１６．７ｋＤのポリペプチド範囲にあっ
て、発現が推定されるペプチドの発現を示唆した（図５ａ、Ｂ、レーン１３−１
７）。これらクローンのシグナル強度は、高密度フィルターにＲＧＳ・Ｈｉｓ抗
体でプローブした場合、概して低かった。４種のＨＳＰ９０αクローンのうち３
つは正しくない読み枠にインサートを有し、抗ＨＳＰ９０抗体と反応しない短ペ
プチドを発現した（図５ｂ、レーン６、８に２つのクローンを示す）。残りのク
ローンは正しい読み枠にインサートを有し、ウェスタンブロット上で計算される
サイズ（５６．０ｋＤ）のバンドを示し、二回目の高密度フィルタースクリーニ
ングで抗ＨＳＰ９０抗体により検出された。 （Ｃ）ＤＮＡプローブだけポジティブなクローン １２個の無作為に選択したＧＡＰＤＨクローンのうち１１個は正しくない読み
枠でＧＡＰＤＨインサートを含有し、恐らくは３．４〜９．１ｋＤの範囲のペプ
チドを発現していることが示された。クローンＭＰＭＧｐ８００Ａ１７５５は、
正しい読み枠でインサートを有したが、５’−ＵＴＲの−８位に点突然変異があ
り、停止コドンと推定４．７ｋＤのペプチドをもたらした。ＤＮＡ配列分析は、
１２個のＨＳＰ９０αクローンのうち１１個が正しくない読み枠にインサートを
含み、分子量２．８〜５．４ｋＤと計算されるペプチドを恐らく発現しているこ
とを示した。正しい読み枠にインサートを有し、７８．７ｋＤサイズのタンパク
質を発現し、二回目の抗ＨＳＰ９０抗体スクリーニングでポジティブだったのは
、クローンＭＰＭＧｐ８００Ｉ１３１１５だけである。
【００８１】 ＧＡＰＤＨ又はＨＳＰ９０αのＤＮＡプローブについては偽陽性クローンは見
出されなかった。 （Ｄ）ＤＮＡプローブネガティブ・クローン ４個のＧＡＰＤＨクローンが、ＤＮＡプローブの偽陰性を表す正しいインサー
トを有することが示されたが、２回目のＤＮＡハイブリダイゼーション実験で検
出された。２個のクローンは、ヒトポリユビキチン（ＧｅｎＢａｎｋ Ｄ６３７
９１）とヒトＨＺＦ１０（ＰＩＲ Ｓ４７０７２）の配列を含有していた。
出されなかった。 （Ｄ）ＤＮＡプローブネガティブ・クローン ４個のＧＡＰＤＨクローンが、ＤＮＡプローブの偽陰性を表す正しいインサー
トを有することが示されたが、２回目のＤＮＡハイブリダイゼーション実験で検
出された。２個のクローンは、ヒトポリユビキチン（ＧｅｎＢａｎｋ Ｄ６３７
９１）とヒトＨＺＦ１０（ＰＩＲ Ｓ４７０７２）の配列を含有していた。
【００８２】 ４個のＨＳＰ９０αクローンはすべてウェスタンブロットで検出されるポリペ
プチドを発現した（図５ｂ、Ｄ）。クローンＭＰＭＧｐ８００Ｇ０６２０７（レ
ーン１２）は４６ｂｐ欠損部分を担うＨＳＰ９０αインサートを含有し、明らか
にＨＳＰ９０α・ＤＮＡプローブの偽陰性であった。残り３つのクローンでは、
マウス子宮特異的プロリンリッチ酸性タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ Ｕ２８４８
６；レーン９、１０）との配列相同性、又は機能不明のＥＳＴ配列（レーン１１
）に対する同一性がインサートに認められた。 （Ｅ）ＤＮＡプローブ及び特異抗体ポジティブ（ＲＧＳ・Ｈｉｓネガティブ）・
クローン ＨＳＰ９０αのＤＮＡプローブと抗ＨＳＰ９０抗体によって認識されるが、Ｒ
ＧＳ・Ｈｉｓ抗体では認識されない１０種のクローンの配列を決定し、正しくな
い読み枠で挿入されたＨＳＰ９０α配列を含有することを見出した。これらのク
ローンから発現されるＨｉｓ６−タグ付きポリペプチドは、３．２〜６．１ｋＤ
の計算量を有するはずであり、ウェスタンブロットでは見出されなかった（図５
ｂ、Ｅ）。対照的に、抗ＨＳＰ９０抗体についてはバンドの適合パターンが観察
された。
プチドを発現した（図５ｂ、Ｄ）。クローンＭＰＭＧｐ８００Ｇ０６２０７（レ
ーン１２）は４６ｂｐ欠損部分を担うＨＳＰ９０αインサートを含有し、明らか
にＨＳＰ９０α・ＤＮＡプローブの偽陰性であった。残り３つのクローンでは、
マウス子宮特異的プロリンリッチ酸性タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ Ｕ２８４８
６；レーン９、１０）との配列相同性、又は機能不明のＥＳＴ配列（レーン１１
）に対する同一性がインサートに認められた。 （Ｅ）ＤＮＡプローブ及び特異抗体ポジティブ（ＲＧＳ・Ｈｉｓネガティブ）・
クローン ＨＳＰ９０αのＤＮＡプローブと抗ＨＳＰ９０抗体によって認識されるが、Ｒ
ＧＳ・Ｈｉｓ抗体では認識されない１０種のクローンの配列を決定し、正しくな
い読み枠で挿入されたＨＳＰ９０α配列を含有することを見出した。これらのク
ローンから発現されるＨｉｓ６−タグ付きポリペプチドは、３．２〜６．１ｋＤ
の計算量を有するはずであり、ウェスタンブロットでは見出されなかった（図５
ｂ、Ｅ）。対照的に、抗ＨＳＰ９０抗体についてはバンドの適合パターンが観察
された。
【００８３】 ｃＤＮＡクローンを含有する細菌を、アンピシリン１００μｇ／ｍｌ、カナマ
イシン１５μｇ／ｍｌ及び２％グルコースを含有する２ｘＹＴ培地２ｍｌにおい
て振盪して増殖させた。Ｏ．Ｄ．６００＝０．４のときにＩＰＴＧを最終濃度が
１ｍＭになるように加え、３７℃で３時間、インキュベーションを続けた。細胞
全体のタンパク質抽出液を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた後、Laemmli（Laemm
li, Nature 227 (1970), 680-685)により、クーマシーブルー染色した。
イシン１５μｇ／ｍｌ及び２％グルコースを含有する２ｘＹＴ培地２ｍｌにおい
て振盪して増殖させた。Ｏ．Ｄ．６００＝０．４のときにＩＰＴＧを最終濃度が
１ｍＭになるように加え、３７℃で３時間、インキュベーションを続けた。細胞
全体のタンパク質抽出液を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた後、Laemmli（Laemm
li, Nature 227 (1970), 680-685)により、クーマシーブルー染色した。
【００８４】 ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後で、製造業者の推奨により、半乾燥電気輸送装置（Ｈｏ
ｅｆａｒファルマシアバイオテク、サンフランシスコ）を用いて、２０ｍＭトリ
ス、１５０ｍＭグリシン、０．１％ ＳＤＳ、１０％メタノールにおいて、タン
パク質をＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｐ、ミリポア）へ移した。
ｅｆａｒファルマシアバイオテク、サンフランシスコ）を用いて、２０ｍＭトリ
ス、１５０ｍＭグリシン、０．１％ ＳＤＳ、１０％メタノールにおいて、タン
パク質をＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｐ、ミリポア）へ移した。
【００８５】 プライマーｐＱＥ６５（ＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧ
）及びｐＱＥ２７６（ＧＧＣＡＡＣＣＧＡＧＣＧＴＴＣＴＧＡＡＣ）を使用し、
アニーリング温度６５℃で、ＰＣＲによりｃＤＮＡインサートを増幅した。我々
の研究所のサービス部門により、ｐＱＥプライマーとＡＢＩシークエンサー（パ
ーキンエルマー）を用いるダイターミネーターサイクルシークエンス法によりＰ
ＣＲ産物の配列が決定された。
）及びｐＱＥ２７６（ＧＧＣＡＡＣＣＧＡＧＣＧＴＴＣＴＧＡＡＣ）を使用し、
アニーリング温度６５℃で、ＰＣＲによりｃＤＮＡインサートを増幅した。我々
の研究所のサービス部門により、ｐＱＥプライマーとＡＢＩシークエンサー（パ
ーキンエルマー）を用いるダイターミネーターサイクルシークエンス法によりＰ
ＣＲ産物の配列が決定された。
【００８６】 実施例５：ベクター構築体 ｐＱＥ−３０ＮＳＴ（ＧｅｎＢａｎｋ 受入番号ＡＦ０７４３７６）について
は記載されている（Bussow et al., Nucleic Acids Res. 26 (1998), 5007-5008
）。ＭＲＧＳとｐＱＥ−３０（Ｑｉａｇｅｎ）のＨｉｓ６との間にタンパク質配
列ＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷをコードするオリゴヌクレオチドを挿入するために
、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてｐＱＥ−ＢＨ６を構築して、ＲＧＳ
−Ｈｉｓ6エピトープの２つの部分を分離した。
は記載されている（Bussow et al., Nucleic Acids Res. 26 (1998), 5007-5008
）。ＭＲＧＳとｐＱＥ−３０（Ｑｉａｇｅｎ）のＨｉｓ６との間にタンパク質配
列ＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷをコードするオリゴヌクレオチドを挿入するために
、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてｐＱＥ−ＢＨ６を構築して、ＲＧＳ
−Ｈｉｓ6エピトープの２つの部分を分離した。
【００８７】 実施例６：抗体 以下の製造業者のモノクローナル抗体を指定の通りに希釈して使用した：マウ
ス抗ＲＧＳ−Ｈｉｓ（Ｑｉａｇｅｎ、１：２，０００）、マウス抗ウサギＧＡＰ
ＤＨ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社、クローン６Ｃ５、１：５
，０００）、マウス抗ＨＳＰ９０（トランスダクション・ラボラトリーズ、クロ
ーン６８、１：２，０００）、ラット抗αチューブリン（セロテック社、クロー
ンＹＬ１／２、１：２，０００）。
ス抗ＲＧＳ−Ｈｉｓ（Ｑｉａｇｅｎ、１：２，０００）、マウス抗ウサギＧＡＰ
ＤＨ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社、クローン６Ｃ５、１：５
，０００）、マウス抗ＨＳＰ９０（トランスダクション・ラボラトリーズ、クロ
ーン６８、１：２，０００）、ラット抗αチューブリン（セロテック社、クロー
ンＹＬ１／２、１：２，０００）。
【００８８】 二次抗体は、マウスとラットのモノクローナルをそれぞれ検出する、５，００
０倍希釈したＦ（ａｂ’）2ウサギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（シグマ）とＦ（ａ
ｂ’）2ウサギ抗ラットＩｇＧ−ＨＲＰ（セロテック社）であった。
０倍希釈したＦ（ａｂ’）2ウサギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（シグマ）とＦ（ａ
ｂ’）2ウサギ抗ラットＩｇＧ−ＨＲＰ（セロテック社）であった。
【００８９】 実施例７：大規模なタンパク質発現と精製 タンパク質は、E．coli（ＳＣＳ１株）の液体培養で発現させた。アンピシリ
ン１００μｇ／ｍｌ及びカナマイシン１５μｇ／ｍｌを含有するＳＢ培地（バク
ト−トリプトン１２ｇ／ｌ、酵母抽出物２４ｇ／ｌ、１７ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、７
２ｍＭ Ｋ2ＨＰＯ4、０．４％（ｖ／ｖ）グリセロール）９００ｍｌへ一晩培養
物１０ｍｌを接種し、ＯＤ600が０．８に達するまで３７℃で振盪した。イソプ
ロピル−ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度が１ｍＭとな
るように加えた。この培養液を３７℃で３．５ｈ振盪し、氷上で４℃に冷却した
。２，１００ｇ、１０分間の遠心分離により細胞を採取し、リン酸緩衝液（５０
ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、０．３Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ８．０）１００ｍｌに再懸濁し
、再び遠心分離した。湿重量１ｇにつき３ｍｌのリゾチーム（０．２５ｍｇ／ｍ
ｌ）含有溶解緩衝液（５０ｍＭ トリス、３００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ
ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）において、氷上、３０分で細胞を溶解した。超音波ホモ
ジェナイザー（Ｓｏｎｉｆｉｅｒ ２５０、ブランソン・ウルトラソニックス、
ダンベリー、ＵＳＡ）を用いて、氷上、３ｘ１分間、５０％のパワーでＤＮＡを
剪断した。１０，０００ｇ、３０分間の遠心分離により、溶解液を澄明にした。
Ｎｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ）を加え、４℃、１時間振盪して混合し
た。この混合液をカラムに注ぎ込み、次いで、１０倍ベッド量の２０ｍＭイミダ
ゾール含有溶解緩衝液で洗浄した。２５０ｍＭイミダゾール含有溶解緩衝液でタ
ンパク質を溶出し、４℃で一晩、ＴＢＳ（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１５０ｍＭ
ＮａＣｌ，ｐＨ７．４）に対して透析した。
ン１００μｇ／ｍｌ及びカナマイシン１５μｇ／ｍｌを含有するＳＢ培地（バク
ト−トリプトン１２ｇ／ｌ、酵母抽出物２４ｇ／ｌ、１７ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、７
２ｍＭ Ｋ2ＨＰＯ4、０．４％（ｖ／ｖ）グリセロール）９００ｍｌへ一晩培養
物１０ｍｌを接種し、ＯＤ600が０．８に達するまで３７℃で振盪した。イソプ
ロピル−ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度が１ｍＭとな
るように加えた。この培養液を３７℃で３．５ｈ振盪し、氷上で４℃に冷却した
。２，１００ｇ、１０分間の遠心分離により細胞を採取し、リン酸緩衝液（５０
ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、０．３Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ８．０）１００ｍｌに再懸濁し
、再び遠心分離した。湿重量１ｇにつき３ｍｌのリゾチーム（０．２５ｍｇ／ｍ
ｌ）含有溶解緩衝液（５０ｍＭ トリス、３００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ
ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）において、氷上、３０分で細胞を溶解した。超音波ホモ
ジェナイザー（Ｓｏｎｉｆｉｅｒ ２５０、ブランソン・ウルトラソニックス、
ダンベリー、ＵＳＡ）を用いて、氷上、３ｘ１分間、５０％のパワーでＤＮＡを
剪断した。１０，０００ｇ、３０分間の遠心分離により、溶解液を澄明にした。
Ｎｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ）を加え、４℃、１時間振盪して混合し
た。この混合液をカラムに注ぎ込み、次いで、１０倍ベッド量の２０ｍＭイミダ
ゾール含有溶解緩衝液で洗浄した。２５０ｍＭイミダゾール含有溶解緩衝液でタ
ンパク質を溶出し、４℃で一晩、ＴＢＳ（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１５０ｍＭ
ＮａＣｌ，ｐＨ７．４）に対して透析した。
【００９０】 実施例８：ハイスループット小規模タンパク質発現 アレイ状のヒト胎児脳ｃＤＮＡ発現ライブラリーｈＥｘ１の選択クローンから
タンパク質を発現させた（Bussow et al., Nucleic Acids Res. 26 (1998), 500
7-5008）。ＩＰＴＧ誘導によりＨｉｓ6−タグ付き融合タンパク質を発現させる
ために、ｐＱＥ−３０ＮＳＴ中にこのライブラリーを指向性にクローン化した。
２ｍｌの中空部分を有する９６穴マイクロタイタープレート（ＳｔｏｒｅＢｌｏ
ｃｈ，Ｚｉｎｓｓｅｒ）を、アンピシリン１００μｇ／ｍｌ及びカナマイシン１
５μｇ／ｍｌを補充したＳＢ培地１００μｌで満たした。−８０℃に保存した３
８４穴ライブラリープレート（Ｇｅｎｅｔｉｘ，Ｃｈｒｉｓｔｃｈｕｒｃｈ、Ｕ
．Ｋ．）由来のE．coli ＳＣＳ１細胞を培養液に接種した。接種には、９６個の
鋼製ピン（長さ６ｃｍ）が付いた複製装置を用いた。激しく振盪しながら３７℃
で一晩増殖させた後、前もって加温した培地９００μｌをこの培養液へ加え、イ
ンキュベーションを１時間続けた。タンパク質発現を誘導するために、最終濃度
が１ｍＭになるようにＩＰＴＧを加えた。遠心分離も含め、以下のあらゆる工程
は、９６穴フォーマットにおいてもなされた。１，９００ｇ（３，４００ｒｐｍ
）、１０分間の遠心分離により細胞を採取し、リン酸緩衝液の再懸濁により洗浄
し、５分間遠心分離して緩衝液Ａ（６Ｍグアニジウム−ＨＣｌ、０．１Ｍ Ｎａ
Ｈ2ＰＯ4、０．０１Ｍトリス−ＨＣｌ，ｐＨ８．０）１５０μｌに再懸濁して溶
菌させた。４，０００ｒｐｍ、１５分間の遠心分離によって細菌の残滓をペレッ
ト化した。真空濾過マニホルド（Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ、ミリポア）上に、空
孔サイズ０．６５μｍの非タンパク質結合性ＰＶＤＦ膜（Ｄｕｒａｐｏｒｅ Ｍ
ＡＤＶ Ｎ６５、ミリポア）を含有する９６穴フィルタープレートを通して、上
澄液を濾過した。
タンパク質を発現させた（Bussow et al., Nucleic Acids Res. 26 (1998), 500
7-5008）。ＩＰＴＧ誘導によりＨｉｓ6−タグ付き融合タンパク質を発現させる
ために、ｐＱＥ−３０ＮＳＴ中にこのライブラリーを指向性にクローン化した。
２ｍｌの中空部分を有する９６穴マイクロタイタープレート（ＳｔｏｒｅＢｌｏ
ｃｈ，Ｚｉｎｓｓｅｒ）を、アンピシリン１００μｇ／ｍｌ及びカナマイシン１
５μｇ／ｍｌを補充したＳＢ培地１００μｌで満たした。−８０℃に保存した３
８４穴ライブラリープレート（Ｇｅｎｅｔｉｘ，Ｃｈｒｉｓｔｃｈｕｒｃｈ、Ｕ
．Ｋ．）由来のE．coli ＳＣＳ１細胞を培養液に接種した。接種には、９６個の
鋼製ピン（長さ６ｃｍ）が付いた複製装置を用いた。激しく振盪しながら３７℃
で一晩増殖させた後、前もって加温した培地９００μｌをこの培養液へ加え、イ
ンキュベーションを１時間続けた。タンパク質発現を誘導するために、最終濃度
が１ｍＭになるようにＩＰＴＧを加えた。遠心分離も含め、以下のあらゆる工程
は、９６穴フォーマットにおいてもなされた。１，９００ｇ（３，４００ｒｐｍ
）、１０分間の遠心分離により細胞を採取し、リン酸緩衝液の再懸濁により洗浄
し、５分間遠心分離して緩衝液Ａ（６Ｍグアニジウム−ＨＣｌ、０．１Ｍ Ｎａ
Ｈ2ＰＯ4、０．０１Ｍトリス−ＨＣｌ，ｐＨ８．０）１５０μｌに再懸濁して溶
菌させた。４，０００ｒｐｍ、１５分間の遠心分離によって細菌の残滓をペレッ
ト化した。真空濾過マニホルド（Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ、ミリポア）上に、空
孔サイズ０．６５μｍの非タンパク質結合性ＰＶＤＦ膜（Ｄｕｒａｐｏｒｅ Ｍ
ＡＤＶ Ｎ６５、ミリポア）を含有する９６穴フィルタープレートを通して、上
澄液を濾過した。
【００９１】 実施例９：自動化フィルタースポッティング 前もって切断した（２５ｘ７５ｍｍ）ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ
）フィルター片（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｐ、ミリポア）を９６％エタノールに浸
し、蒸留水で１分間濯いだ。湿ったフィルター片５枚をテープで２３０ｘ２３０
ｍｍプラスチックトレイ上に固定した。ｘ−ｙ−ｚの方向に５μｍ刻みで定位し
得るモーター付きのトランスファースタンプ（Ｌｉｎｅａｒ Ｄｒｉｖｅｓ，Ｂ
ａｓｉｌｄｏｎ，ＵＫ）（図６）によりスポッティングをした。これにより、約
３００サンプル／ｃｍ2の密度の同一２検体パターンでスポットすることが可能
になる。このトランスファースタンプには、４．５ｍｍ間隔のバネ上げピンがそ
れぞれ４ｘ４で１６個、本体に取り付けられている。この間隔が３８４穴プレー
トの間隔に適合しているので、このツールにより３８４穴マイクロタイタープレ
ートからの高密度スポッティングが可能になる。ステンレス鋼製ピンの平滑末端
のチップサイズは２５０μｍである。各トランスファーに先立って、スポッティ
ング装置を３０％エタノール浴で洗浄し、次いでファン乾燥して相互汚染を防い
だ。ここで示す実験については、各ピンで４ｘ４のパターンをスポットした。各
パターンには、４個のインクガイドスポットと、それを囲んで同一２検体でスポ
ットされる６個のサンプルが含まれる（全部で１２サンプルのスポット、図７Ａ
）。各スポットは、同一のタンパク質サンプルを５回（各５ｎｌ）ロードした。
前もってスポッティングの高さを調整したが、この９６サンプルのスポッティン
グで５つの同一タンパク質マイクロアレイを産生するのに約２０分を要した。
）フィルター片（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｐ、ミリポア）を９６％エタノールに浸
し、蒸留水で１分間濯いだ。湿ったフィルター片５枚をテープで２３０ｘ２３０
ｍｍプラスチックトレイ上に固定した。ｘ−ｙ−ｚの方向に５μｍ刻みで定位し
得るモーター付きのトランスファースタンプ（Ｌｉｎｅａｒ Ｄｒｉｖｅｓ，Ｂ
ａｓｉｌｄｏｎ，ＵＫ）（図６）によりスポッティングをした。これにより、約
３００サンプル／ｃｍ2の密度の同一２検体パターンでスポットすることが可能
になる。このトランスファースタンプには、４．５ｍｍ間隔のバネ上げピンがそ
れぞれ４ｘ４で１６個、本体に取り付けられている。この間隔が３８４穴プレー
トの間隔に適合しているので、このツールにより３８４穴マイクロタイタープレ
ートからの高密度スポッティングが可能になる。ステンレス鋼製ピンの平滑末端
のチップサイズは２５０μｍである。各トランスファーに先立って、スポッティ
ング装置を３０％エタノール浴で洗浄し、次いでファン乾燥して相互汚染を防い
だ。ここで示す実験については、各ピンで４ｘ４のパターンをスポットした。各
パターンには、４個のインクガイドスポットと、それを囲んで同一２検体でスポ
ットされる６個のサンプルが含まれる（全部で１２サンプルのスポット、図７Ａ
）。各スポットは、同一のタンパク質サンプルを５回（各５ｎｌ）ロードした。
前もってスポッティングの高さを調整したが、この９６サンプルのスポッティン
グで５つの同一タンパク質マイクロアレイを産生するのに約２０分を要した。
【００９２】 実施例１０：抗体検出と画像分析 スポッティングの後、フィルターをエタノールに１分間浸し、蒸留水で濯ぎ、
ＴＢＳＴ（ＴＢＳ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０）で１分間洗浄し、２％ウシ血
清アルブミン（ＢＳＡ）／ＴＢＳＴに６０分間ブロックし、２％ＢＳＡ／ＴＢＳ
Ｔにおいてモノクローナル抗体とともに室温で１時間インキュベートした後、Ｔ
ＢＳＴで１０分２回洗浄し、２％ＢＳＡ／ＴＢＳＴにおいて二次抗体とともに１
時間インキュベートした。次いで、ＴＢＳＴ２０ｍｌにおいてフィルターを一晩
洗浄し、ＣＮ／ＤＡＢ溶液（Ｐｉｅｒｃｅ）２ｍｌにおいて１〜１０分間インキ
ュベートして、ポジティブな反応を黒いスポットとして検出した。画像化には冷
却したＣＣＤカメラ（Ｆｕｊｉ ＬＨＳ、Ｒａｙｔｅｓｔ、ドイツ）を用いた。
Ｆｕｊｉｎｏｎ対物レンズ（ｆ：０．８，５０ｍｍ）を用いて２０ｍｓの積算時
間で写真を撮った。スポット認識と定量化のために、ＡＩＤＡパッケージ（Ｒａ
ｙｔｅｓｔ、ドイツ）を用いて画像を分析した。得られたスポット値をＥｘｃｅ
ｌのスプレッドシート（マイクロソフト，ＵＳＡ）へ移し、図７、８、９の図表
を作成した。
ＴＢＳＴ（ＴＢＳ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０）で１分間洗浄し、２％ウシ血
清アルブミン（ＢＳＡ）／ＴＢＳＴに６０分間ブロックし、２％ＢＳＡ／ＴＢＳ
Ｔにおいてモノクローナル抗体とともに室温で１時間インキュベートした後、Ｔ
ＢＳＴで１０分２回洗浄し、２％ＢＳＡ／ＴＢＳＴにおいて二次抗体とともに１
時間インキュベートした。次いで、ＴＢＳＴ２０ｍｌにおいてフィルターを一晩
洗浄し、ＣＮ／ＤＡＢ溶液（Ｐｉｅｒｃｅ）２ｍｌにおいて１〜１０分間インキ
ュベートして、ポジティブな反応を黒いスポットとして検出した。画像化には冷
却したＣＣＤカメラ（Ｆｕｊｉ ＬＨＳ、Ｒａｙｔｅｓｔ、ドイツ）を用いた。
Ｆｕｊｉｎｏｎ対物レンズ（ｆ：０．８，５０ｍｍ）を用いて２０ｍｓの積算時
間で写真を撮った。スポット認識と定量化のために、ＡＩＤＡパッケージ（Ｒａ
ｙｔｅｓｔ、ドイツ）を用いて画像を分析した。得られたスポット値をＥｘｃｅ
ｌのスプレッドシート（マイクロソフト，ＵＳＡ）へ移し、図７、８、９の図表
を作成した。
【００９３】 実施例１１：タンパク質マイクロアレイの製造 液体の細菌培養物においてタンパク質を発現させ、粗溶解液としてか又はＮｉ
−ＮＴＡ固定化金属アフィニティー・クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）により精
製した後で、ＰＤＶＦフィルター上に溶液をスポットした（Hochuli et al., J.
Chromatography, 411 (1987), 177-184）。ＰＶＤＦフィルター膜を使用したの
は、その優れたタンパク質結合能と機械強度（ニトロセルロースに比較して）、
及びこれまでの満足な実績のためである（Bussow et al., Nucleic Acids Res.
26 (1998), 5007-5008）。新しいトランスファースタンプ（図６）はチップサイ
ズ２５０μｍのピンを含むが、これはin situタンパク質発現フィルターの産生
にこれまで用いられてきた４５０μｍピンのほぼ半分のサイズである（Bussow e
t al., Nucleic Acids Res. 26 (1998), 5007-5008）。我々の最初の試験結果と
しての図７、８及び９は、我々のin situフィルターとほとんど同じスポッティ
ング密度を示すが、ピン先端の径が小さくなるほど高密度のスポッティングが可
能になる。２２２ｘ２２２ｍｍのin situフィルターは２７，６４８個のクロー
ン（１つのガイドスポットにつき５x５の同一２検体スポッティングパターン）
を供するが、この新しいトランスファースタンプを用いれば、同一の領域に１０
０，０００個以上のサンプルを置くことが可能である。このことにより、アレイ
サイズ全体を簡便な微視的スライドフォーマット（２，４００個の同一２検体に
相当する４，８００個のサンプル／２５ｘ７５ｍｍ）へ実質的に減らせる。この
ミニチュア化した組立てにより、フィルターをカバーするのにずっと少ない緩衝
液量で済むので、溶液をインキュベートするときに試薬をごく経済的かつ高濃度
で使用することが可能になる。in situフィルターとは対照的に、マイクロアレ
イ上で得られるシグナルは、鋭い上に十分局在化している。タンパク質チップ製
造への次の工程として、我々は、修飾したガラス表面上への高速ピコリットルス
ポッティング（インクジェッティング）を用いることによりさらに密度を高める
ことを想定している。タンパク質マイクロアレイに代わるアプローチについては
、シラン単層の写真製版（Mooney et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93 (1
996), 12287-12291）か、ポリスチレンフィルムへのインクジェッティング（Eki
ns, Clin. Chem. 44 (1998), 2015-2030; Silzel et al., Clin. Chem. 44 (199
8), 2036-2043）のいずれかを用いることが報告されている。我々のライブラリ
ースポッティング技術とは対照的に、これらの最新技術は、単一タンパク質（例
えば、ＢＳＡ、アビジン、又は抗ＩｇＧモノクローナル抗体）のパターニングに
よりミニチュア化したイムノアッセイフォーマットを製造することに注目してい
る。
−ＮＴＡ固定化金属アフィニティー・クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）により精
製した後で、ＰＤＶＦフィルター上に溶液をスポットした（Hochuli et al., J.
Chromatography, 411 (1987), 177-184）。ＰＶＤＦフィルター膜を使用したの
は、その優れたタンパク質結合能と機械強度（ニトロセルロースに比較して）、
及びこれまでの満足な実績のためである（Bussow et al., Nucleic Acids Res.
26 (1998), 5007-5008）。新しいトランスファースタンプ（図６）はチップサイ
ズ２５０μｍのピンを含むが、これはin situタンパク質発現フィルターの産生
にこれまで用いられてきた４５０μｍピンのほぼ半分のサイズである（Bussow e
t al., Nucleic Acids Res. 26 (1998), 5007-5008）。我々の最初の試験結果と
しての図７、８及び９は、我々のin situフィルターとほとんど同じスポッティ
ング密度を示すが、ピン先端の径が小さくなるほど高密度のスポッティングが可
能になる。２２２ｘ２２２ｍｍのin situフィルターは２７，６４８個のクロー
ン（１つのガイドスポットにつき５x５の同一２検体スポッティングパターン）
を供するが、この新しいトランスファースタンプを用いれば、同一の領域に１０
０，０００個以上のサンプルを置くことが可能である。このことにより、アレイ
サイズ全体を簡便な微視的スライドフォーマット（２，４００個の同一２検体に
相当する４，８００個のサンプル／２５ｘ７５ｍｍ）へ実質的に減らせる。この
ミニチュア化した組立てにより、フィルターをカバーするのにずっと少ない緩衝
液量で済むので、溶液をインキュベートするときに試薬をごく経済的かつ高濃度
で使用することが可能になる。in situフィルターとは対照的に、マイクロアレ
イ上で得られるシグナルは、鋭い上に十分局在化している。タンパク質チップ製
造への次の工程として、我々は、修飾したガラス表面上への高速ピコリットルス
ポッティング（インクジェッティング）を用いることによりさらに密度を高める
ことを想定している。タンパク質マイクロアレイに代わるアプローチについては
、シラン単層の写真製版（Mooney et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93 (1
996), 12287-12291）か、ポリスチレンフィルムへのインクジェッティング（Eki
ns, Clin. Chem. 44 (1998), 2015-2030; Silzel et al., Clin. Chem. 44 (199
8), 2036-2043）のいずれかを用いることが報告されている。我々のライブラリ
ースポッティング技術とは対照的に、これらの最新技術は、単一タンパク質（例
えば、ＢＳＡ、アビジン、又は抗ＩｇＧモノクローナル抗体）のパターニングに
よりミニチュア化したイムノアッセイフォーマットを製造することに注目してい
る。
【００９４】 実施例１２：特定タンパク質の検出感度 マイクロアレイ上での特定タンパク質の検出感度を、３種の精製タンパク質、
ヒトグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ、Ｓｗｉｓ
ｓ−Ｐｒｏｔ Ｐ０４４０６）、ヒト熱ショックタンパク質９０α（ＨＳＰ９０
α、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ｐ０７９００）のＣ末端フラグメント（４０．３ｋ
ｄ）及びラット免疫グロブリンＨ鎖結合タンパク質（ＢＩＰ、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒ
ｏｔ Ｐ０６７６１）を様々な濃度でスポットすることにより評価した。次いで
、マイクロアレイをモノクローナル抗ＧＡＰＤＨ抗体、ウサギ抗マウスＩｇＧ−
ＨＲＰ及びＨＲＰ基質ＣＮ／ＤＡＢとともにインキュベートした（図７Ａ）。バ
ックグラウンド以上の明らかに目視できる特定スポットをもたらす最低濃度（検
出閾値）としての検出感度は、１０フェムトモル／μｌと算定されたが、これは
５ｘ５ｎｌにスポットしたＧＡＰＤＨの２５０アトモル又は１０ｐｇに相当する
（図７Ｂ）。
ヒトグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ、Ｓｗｉｓ
ｓ−Ｐｒｏｔ Ｐ０４４０６）、ヒト熱ショックタンパク質９０α（ＨＳＰ９０
α、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ｐ０７９００）のＣ末端フラグメント（４０．３ｋ
ｄ）及びラット免疫グロブリンＨ鎖結合タンパク質（ＢＩＰ、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒ
ｏｔ Ｐ０６７６１）を様々な濃度でスポットすることにより評価した。次いで
、マイクロアレイをモノクローナル抗ＧＡＰＤＨ抗体、ウサギ抗マウスＩｇＧ−
ＨＲＰ及びＨＲＰ基質ＣＮ／ＤＡＢとともにインキュベートした（図７Ａ）。バ
ックグラウンド以上の明らかに目視できる特定スポットをもたらす最低濃度（検
出閾値）としての検出感度は、１０フェムトモル／μｌと算定されたが、これは
５ｘ５ｎｌにスポットしたＧＡＰＤＨの２５０アトモル又は１０ｐｇに相当する
（図７Ｂ）。
【００９５】 実施例１３：タンパク質発現のハイスループットスクリーニング すでにin situフィルター上でモノクローナル抗体ＲＧＳ−Ｈｉｓ（Ｑｕｉａ
ｇｅｎ）によりタンパク質エクスプレッサーとして同定された、アレイ状ヒト胎
児脳ｃＤＮＡライブラリーｈＥｘ１（Bussow et al., Nucleic Acids Res. 26 (
1998), 5007-5008）の９２クローンの粗溶解液を４つの対照サンプル及びインク
ガイドスポットと並んで同一２検体でスポットした。同一の抗体を使用して、Ｒ
ＧＳ−Ｈｉｓ6−タグ付き融合タンパク質の発現についてマイクロアレイをスク
リーニングした（図８Ａ、挿入部分）。同一２検体の相対強度（図７Ａ参照）を
互いにプロットすると、得られた斜線は、この検出法の良好な再現性を示す（図
８Ａ）。従って、同一２検体の平均を全９６サンプルについてプロットし、ポジ
ティブ同定の特異性閾値を相対強度７，５００に任意設定した（図８Ｂ）。以上
の条件では、陰性対照（Ｈ１、インサートのないベクターｐＱＥ−３０ＮＳＴ）
は明らかにネガティブ（相対強度１，５００）であり、分割されたＲＧＳ−Ｈｉ
ｓ6エピトープを特徴とするＨＳＰ９０αクローン（Ｈ２、ベクターｐＱＥ−Ｂ
Ｈ６；相対強度０）でもそれは同様であった。ＲＧＳ−Ｈｉｓ6−タグ付きＧＡ
ＰＤＨクローン（Ｈ３、ベクターｐＱＥ−３０ＮＳＴ）の溶解液を陽性対照とし
て使用したが、これは相対強度２１，０００のシグナルをもたらした。ラットＢ
ＩＰクローン（Ｈ４、ベクターｐＱＥ−ＢＨ６）で得られた明らかにポジティブ
な結果（相対強度１５，０００）が驚くべきなのは、このクローンが分割された
ＲＧＳ−Ｈｉｓ6エピトープも特徴とするからである。この反応性は、ＢＩＰの
コンフォメーション特性によるＲＧＳ−Ｈｉｓ6エピトープの部分的な再構成に
より説明できるかもしれない。
ｇｅｎ）によりタンパク質エクスプレッサーとして同定された、アレイ状ヒト胎
児脳ｃＤＮＡライブラリーｈＥｘ１（Bussow et al., Nucleic Acids Res. 26 (
1998), 5007-5008）の９２クローンの粗溶解液を４つの対照サンプル及びインク
ガイドスポットと並んで同一２検体でスポットした。同一の抗体を使用して、Ｒ
ＧＳ−Ｈｉｓ6−タグ付き融合タンパク質の発現についてマイクロアレイをスク
リーニングした（図８Ａ、挿入部分）。同一２検体の相対強度（図７Ａ参照）を
互いにプロットすると、得られた斜線は、この検出法の良好な再現性を示す（図
８Ａ）。従って、同一２検体の平均を全９６サンプルについてプロットし、ポジ
ティブ同定の特異性閾値を相対強度７，５００に任意設定した（図８Ｂ）。以上
の条件では、陰性対照（Ｈ１、インサートのないベクターｐＱＥ−３０ＮＳＴ）
は明らかにネガティブ（相対強度１，５００）であり、分割されたＲＧＳ−Ｈｉ
ｓ6エピトープを特徴とするＨＳＰ９０αクローン（Ｈ２、ベクターｐＱＥ−Ｂ
Ｈ６；相対強度０）でもそれは同様であった。ＲＧＳ−Ｈｉｓ6−タグ付きＧＡ
ＰＤＨクローン（Ｈ３、ベクターｐＱＥ−３０ＮＳＴ）の溶解液を陽性対照とし
て使用したが、これは相対強度２１，０００のシグナルをもたらした。ラットＢ
ＩＰクローン（Ｈ４、ベクターｐＱＥ−ＢＨ６）で得られた明らかにポジティブ
な結果（相対強度１５，０００）が驚くべきなのは、このクローンが分割された
ＲＧＳ−Ｈｉｓ6エピトープも特徴とするからである。この反応性は、ＢＩＰの
コンフォメーション特性によるＲＧＳ−Ｈｉｓ6エピトープの部分的な再構成に
より説明できるかもしれない。
【００９６】 推定ｈＥｘ１発現クローン９２個のうち５４クローンのｃＤＮＡインサートは
ヒト遺伝子のＧｅｎＢａｎｋエントリーとの相同性を示す（Bussow，学位論文、
化学部、ベルリン自由大学（１９９８））。これらインサートの読み枠（ＲＦ）
を、ベクターにコードされるＲＧＳ−Ｈｉｓ6タグ配列に関連して調べた。正し
い読み枠（ＲＦ＋）でクローン化されていたのが３４インサート（６３％）であ
るのに対し、正しくない読み枠（ＲＦ−）のものは２０個（３７％）であり、こ
れらのクローンでは予測されるタンパク質の発現は期待し得なかった。しかしな
がら、全９２個のクローンは、モノクローナル抗体ＲＧＳ−Ｈｉｓとの明らかに
ポジティブなシグナルによりin situフィルター上のタンパク質エクスプレッサ
ーとして元々選択されたものである［強度レベル２及び３、（Bussow，学位論文
、化学部、ベルリン自由大学（１９９８））］。マイクロアレイ上では、タンパ
ク質エクスプレッサーとして同定される読み枠が正しくないクローンの数は７０
％減少し、依然ポジティブとして確定されたＲＦ（−）クローンは６個だけであ
る（図８Ｂ）。このことは、この新しいマイクロアレイ技術が、正しくない読み
枠のクローンを排除する優れた能力によりin situフィルター法より進歩してい
ることを示す。一方、明らかに特異性の閾値以下でこのスクリーニングでは見落
とされることになるＲＦ（＋）クローンが１つだけあったが、これはマイクロタ
イターの穴において発現したタンパク質の量が不十分であったためだろう。この
ことにより、配列決定及び／又はタンパク質の特徴づけにより確定される「ポジ
ティブ」にのみ基づいている我々のアプローチの本質が再び強調される。
ヒト遺伝子のＧｅｎＢａｎｋエントリーとの相同性を示す（Bussow，学位論文、
化学部、ベルリン自由大学（１９９８））。これらインサートの読み枠（ＲＦ）
を、ベクターにコードされるＲＧＳ−Ｈｉｓ6タグ配列に関連して調べた。正し
い読み枠（ＲＦ＋）でクローン化されていたのが３４インサート（６３％）であ
るのに対し、正しくない読み枠（ＲＦ−）のものは２０個（３７％）であり、こ
れらのクローンでは予測されるタンパク質の発現は期待し得なかった。しかしな
がら、全９２個のクローンは、モノクローナル抗体ＲＧＳ−Ｈｉｓとの明らかに
ポジティブなシグナルによりin situフィルター上のタンパク質エクスプレッサ
ーとして元々選択されたものである［強度レベル２及び３、（Bussow，学位論文
、化学部、ベルリン自由大学（１９９８））］。マイクロアレイ上では、タンパ
ク質エクスプレッサーとして同定される読み枠が正しくないクローンの数は７０
％減少し、依然ポジティブとして確定されたＲＦ（−）クローンは６個だけであ
る（図８Ｂ）。このことは、この新しいマイクロアレイ技術が、正しくない読み
枠のクローンを排除する優れた能力によりin situフィルター法より進歩してい
ることを示す。一方、明らかに特異性の閾値以下でこのスクリーニングでは見落
とされることになるＲＦ（＋）クローンが１つだけあったが、これはマイクロタ
イターの穴において発現したタンパク質の量が不十分であったためだろう。この
ことにより、配列決定及び／又はタンパク質の特徴づけにより確定される「ポジ
ティブ」にのみ基づいている我々のアプローチの本質が再び強調される。
【００９７】 まとめると、マイクロアレイ上でのハイスループットタンパク質発現スクリー
ニングの偽陰性率は２％以下である（全５４クローンにつき１個の非検出ＲＦ（
＋）クローン）。正しくない読み枠でタンパク質を発現している偽陽性クローン
の率は、in situフィルター法の３７％に比較して１１％まで減少した（Bussow
，学位論文、化学部、ベルリン自由大学（１９９８））。これにより、タンパク
質マイクロアレイは、ごく高感度のタンパク質発現スクリーニングにとって経済
的なツールとなる。
ニングの偽陰性率は２％以下である（全５４クローンにつき１個の非検出ＲＦ（
＋）クローン）。正しくない読み枠でタンパク質を発現している偽陽性クローン
の率は、in situフィルター法の３７％に比較して１１％まで減少した（Bussow
，学位論文、化学部、ベルリン自由大学（１９９８））。これにより、タンパク
質マイクロアレイは、ごく高感度のタンパク質発現スクリーニングにとって経済
的なツールとなる。
【００９８】 実施例１４：抗体特異性のスクリーニング ９２個のｈＥｘ１発現クローンと４個の対照（上記参照）の同一試験セットを
特徴づけるタンパク質マイクロアレイを、ヒトのタンパク質であるＧＡＰＤＨ、
ＨＳＰ９０α及びαチューブリンについて、モノクローナル抗体を用いてスクリ
ーニングした。抗ＧＡＰＤＨ抗体がその標的抗原のみを検出した（Ｈ３、図９Ａ
）のに対し、抗ＨＳＰ９０αは選択的にその標的抗原を認識した（Ｈ２、図９Ｂ
）ものの、少なくとも２個の他のクローン（Ｈ１０、６０Ｓリボソームタンパク
質Ｌ１８ＡとＨ３、ＧＡＰＤＨ）とやや交叉反応性を示した。抗体の交叉反応性
は、抗αチューブリンのスクリーニングでずっと顕著であった（図９Ｃ）。試験
セット内の２個のＲＦ（＋）αチューブリンクローン（Ｆ９とＡ４）が特異的に
認識され、ＲＦ（−）クローン（Ｃ７）だけが検出されないままだったのに対し
、他の９個のクローンは任意の特異性閾値より高い抗αチューブリン反応性を示
した。これらクローンのうち２つ（Ｂ１及びＢ１２）は未知の遺伝子を表し、Ｇ
１はＲＦ（−）βチューブリンのクローンである。Ｈ３は図８のＧＡＰＤＨ陽性
対照クローンであり（上記参照）、おそらくはタンパク質発現のレベルが例外的
に高いために、ある程度は非特異的に交叉反応するようである（図９Ｂ及び９Ｃ
）。驚くべきことに、閾値以上の他のクローン（５個）はいずれも正しい読み枠
でリボソームタンパク質を発現する（Ｅ５、ＲＰＬ３；Ｈ１０、ＲＰＬ１８Ａ；
Ｅ６及びＤ８、ＲＰＳ２；Ｆ７、ＲＰＳ３Ａ）。抗αチューブリン反応性を示さ
なかったのは試験セットの唯一の追加リボソームタンパク質（Ｅ３、ＲＰＳ２５
）だけである。抗αチューブリン抗体（ＹＬ１／２、（Kilmartin et al., J. C
ell Biol. 93 (1982), 576-582））により認識されるエピトープは、チロシン化
αチューブリンのカルボキシ末端残基を含む直線状の配列として同定された（We
hland et al., EMBO J. 3 (1984), 1295-1300）。この著者らによれば、ジペプ
チド研究により決定されるような最少配列条件は、終端から２番目の位置に陰電
荷の側鎖があり、フリーのカルボン酸基を必ず有する芳香族の残基がこれに続く
ことである。我々のマイクロアレイ上で交差反応するリボソームタンパク質で上
記の要件を満たすものはないので、他の（例えば構造上の）エピトープがこの抗
原特異性を模倣しているのかもしれない。
特徴づけるタンパク質マイクロアレイを、ヒトのタンパク質であるＧＡＰＤＨ、
ＨＳＰ９０α及びαチューブリンについて、モノクローナル抗体を用いてスクリ
ーニングした。抗ＧＡＰＤＨ抗体がその標的抗原のみを検出した（Ｈ３、図９Ａ
）のに対し、抗ＨＳＰ９０αは選択的にその標的抗原を認識した（Ｈ２、図９Ｂ
）ものの、少なくとも２個の他のクローン（Ｈ１０、６０Ｓリボソームタンパク
質Ｌ１８ＡとＨ３、ＧＡＰＤＨ）とやや交叉反応性を示した。抗体の交叉反応性
は、抗αチューブリンのスクリーニングでずっと顕著であった（図９Ｃ）。試験
セット内の２個のＲＦ（＋）αチューブリンクローン（Ｆ９とＡ４）が特異的に
認識され、ＲＦ（−）クローン（Ｃ７）だけが検出されないままだったのに対し
、他の９個のクローンは任意の特異性閾値より高い抗αチューブリン反応性を示
した。これらクローンのうち２つ（Ｂ１及びＢ１２）は未知の遺伝子を表し、Ｇ
１はＲＦ（−）βチューブリンのクローンである。Ｈ３は図８のＧＡＰＤＨ陽性
対照クローンであり（上記参照）、おそらくはタンパク質発現のレベルが例外的
に高いために、ある程度は非特異的に交叉反応するようである（図９Ｂ及び９Ｃ
）。驚くべきことに、閾値以上の他のクローン（５個）はいずれも正しい読み枠
でリボソームタンパク質を発現する（Ｅ５、ＲＰＬ３；Ｈ１０、ＲＰＬ１８Ａ；
Ｅ６及びＤ８、ＲＰＳ２；Ｆ７、ＲＰＳ３Ａ）。抗αチューブリン反応性を示さ
なかったのは試験セットの唯一の追加リボソームタンパク質（Ｅ３、ＲＰＳ２５
）だけである。抗αチューブリン抗体（ＹＬ１／２、（Kilmartin et al., J. C
ell Biol. 93 (1982), 576-582））により認識されるエピトープは、チロシン化
αチューブリンのカルボキシ末端残基を含む直線状の配列として同定された（We
hland et al., EMBO J. 3 (1984), 1295-1300）。この著者らによれば、ジペプ
チド研究により決定されるような最少配列条件は、終端から２番目の位置に陰電
荷の側鎖があり、フリーのカルボン酸基を必ず有する芳香族の残基がこれに続く
ことである。我々のマイクロアレイ上で交差反応するリボソームタンパク質で上
記の要件を満たすものはないので、他の（例えば構造上の）エピトープがこの抗
原特異性を模倣しているのかもしれない。
【００９９】 表１は、ｈＥｘ１・ｃＤＮＡ発現ライブラリーについての様々なスクリーニン
グオプションの評価を示す。クローンカテゴリーは図３に同じ。括弧内の数は第
二スクリーニングでの数を表す。
グオプションの評価を示す。クローンカテゴリーは図３に同じ。括弧内の数は第
二スクリーニングでの数を表す。
【０１００】 表２は、ｈＥｘ１・ｃＤＮＡ発現ライブラリーについての様々なスクリーニン
グオプションの評価を示す。クローンカテゴリーは図２に同じ。括弧内の数は第
二スクリーニングでの数を表す。
グオプションの評価を示す。クローンカテゴリーは図２に同じ。括弧内の数は第
二スクリーニングでの数を表す。
【０１０１】
【表１】
【０１０２】
【表２】
【図１】 図１は、高密度フィルター上でＲＧＳ・Ｈｉｓ抗体を用いた、タン
パク質発現クローンのＲＧＳ−Ｈｉｓの検出を示す。同一２検体（デュプリケー
ト）でアレイ状態にある２７，６４８個のクローンを示すフィルターをＲＧＳ・
Ｈｉｓ抗体でスクリーニングし、Ｈｉｓ−６タグのついた組換えタンパク質を発
現するクローンを検出した。
パク質発現クローンのＲＧＳ−Ｈｉｓの検出を示す。同一２検体（デュプリケー
ト）でアレイ状態にある２７，６４８個のクローンを示すフィルターをＲＧＳ・
Ｈｉｓ抗体でスクリーニングし、Ｈｉｓ−６タグのついた組換えタンパク質を発
現するクローンを検出した。
【図２】 図２は、ＧＡＰＤＨ発現クローンの同定を示す。（ａ）同一２検体
でアレイ状態にある２７，６４８個のｃＤＮＡクローンを表すＤＮＡフィルター
をＧＡＰＤＨ特異的ＤＮＡプローブでスクリーニングしたもの。（ｂ）（ａ）と
同一のクローンを表す同一のタンパク質フィルターを抗ＧＡＰＤＨ抗体でスクリ
ーニングしたもの。対応するフィルター部分が示されている。
でアレイ状態にある２７，６４８個のｃＤＮＡクローンを表すＤＮＡフィルター
をＧＡＰＤＨ特異的ＤＮＡプローブでスクリーニングしたもの。（ｂ）（ａ）と
同一のクローンを表す同一のタンパク質フィルターを抗ＧＡＰＤＨ抗体でスクリ
ーニングしたもの。対応するフィルター部分が示されている。
【図３】 図３は、異なるプローブと抗体によって同定されたクローンのカテ
ゴリーを示すベン図である。各円は、個々のプローブにより同定されたクローン
の組合せを表す。共通部分のクローンは複数のプローブによって検出された。
ゴリーを示すベン図である。各円は、個々のプローブにより同定されたクローン
の組合せを表す。共通部分のクローンは複数のプローブによって検出された。
【図４】 図４は、ＧＡＰＤＨ（ａ）及びＨＳＰ９０α（ｂ）クローンの配列
の配列並置を示す。ＧＡＰＤＨとＨＳＰ９０αのオープンリーディングフレーム
を空白のボックスとして示す。各ラインは、それぞれのクローンに存在すると予
測される配列の長さを示し、より太い部分は、実際に配列を決定して完全長のｍ
ＲＮＡに並置されたフラグメントを示す。文字Ａ〜Ｅは図３のカテゴリーを示す
。
の配列並置を示す。ＧＡＰＤＨとＨＳＰ９０αのオープンリーディングフレーム
を空白のボックスとして示す。各ラインは、それぞれのクローンに存在すると予
測される配列の長さを示し、より太い部分は、実際に配列を決定して完全長のｍ
ＲＮＡに並置されたフラグメントを示す。文字Ａ〜Ｅは図３のカテゴリーを示す
。
【図５】 図５は、ＲＧＳ・Ｈｉｓ及び／又はＧＡＰＤＨ（ａ）又はＨＳＰ９
０α（ｂ）に対する特異抗体によって検出されたクローンのタンパク質産物を示
す。上部のボックスのシェードと数字は、高密度フィルター上のシグナル強度を
示す。細胞のタンパク質全体をクーマシーブルーで染色した。クローンのカテゴ
リーは図３と同じである。
０α（ｂ）に対する特異抗体によって検出されたクローンのタンパク質産物を示
す。上部のボックスのシェードと数字は、高密度フィルター上のシグナル強度を
示す。細胞のタンパク質全体をクーマシーブルーで染色した。クローンのカテゴ
リーは図３と同じである。
【図６】 図６は、３８４穴マイクロタイタープレートからＰＶＤＦ膜へのタ
ンパク質溶液トランスファーのトランスファースタンプを示す。各１６個のバネ
上げステンレス鋼のピンがＰＯＭ（ポリオキシメチレン、ポリホルムアルデヒド
、ポリアセテート）本体に取り付けられている。ピン間距離は４．５ｍｍである
。付着末端のチップサイズは２５０μｍと測定された。
ンパク質溶液トランスファーのトランスファースタンプを示す。各１６個のバネ
上げステンレス鋼のピンがＰＯＭ（ポリオキシメチレン、ポリホルムアルデヒド
、ポリアセテート）本体に取り付けられている。ピン間距離は４．５ｍｍである
。付着末端のチップサイズは２５０μｍと測定された。
【図７】 図７は、マイクロアレイでの特定タンパク質の検出感度を示す。等
モル濃度（１００ピコモル／μｌ〜１フェムトモル／μｌ）の精製ヒトＧＡＰＤ
Ｈ（同一２検体：１９−２４及び４３−４８）、ヒトｂＨＳＰ９０α（同一２検
体：７−１２及び３１−３６）及びラットｂＢＩＰ（同一２検体：１３−１８及
び３７−４２）を２つの同一系列の同一２検体としてスポットし（５ｘ５ｎｌ）
、モノクローナル抗ＧＡＰＤＨ抗体を用いて検出した。Ａ：ＰＶＤＦフィルター
膜上のスポットアレイ（１２８検体／１．９ｘ１．９ｃｍ、４ｘ４垂直式の同一
２検体スポッティングパターン、黒い同一２検体はガイドスポット、指定通りに
同一２検体を計数）；Ｂ：Ａ（ガイドスポットを除く）の同一２検体の相対平均
強度。同一２検体の番号（Ａと同じ）、スポットタンパク質の名称と量、及び検
出閾値を示す。
モル濃度（１００ピコモル／μｌ〜１フェムトモル／μｌ）の精製ヒトＧＡＰＤ
Ｈ（同一２検体：１９−２４及び４３−４８）、ヒトｂＨＳＰ９０α（同一２検
体：７−１２及び３１−３６）及びラットｂＢＩＰ（同一２検体：１３−１８及
び３７−４２）を２つの同一系列の同一２検体としてスポットし（５ｘ５ｎｌ）
、モノクローナル抗ＧＡＰＤＨ抗体を用いて検出した。Ａ：ＰＶＤＦフィルター
膜上のスポットアレイ（１２８検体／１．９ｘ１．９ｃｍ、４ｘ４垂直式の同一
２検体スポッティングパターン、黒い同一２検体はガイドスポット、指定通りに
同一２検体を計数）；Ｂ：Ａ（ガイドスポットを除く）の同一２検体の相対平均
強度。同一２検体の番号（Ａと同じ）、スポットタンパク質の名称と量、及び検
出閾値を示す。
【図８】 図８は、モノクローナル抗体ＲＧＳ−Ｈｉｓ（Ｑｉａｇｅｎ）を用
いてマイクロアレイ上に検出された、アレイ状ｈＥｘ１ライブラリーのクローン
に由来するＲＧＳ−Ｈｉｓ6−タグ付き融合タンパク質のハイスループット発現
を示す。９２クローンの粗濾過溶解液を９６穴マイクロタイタープレートからス
ポットしたが、このうち４穴に対照タンパク質が含まれる（Ｈ１、インサートの
ないベクターｐＱＥ−３０ＮＳＴ；Ｈ２、ｂＨＳＰ９０α、クローンＮ１５１７
０、ベクターｐＱＥ−ＢＨ６；Ｈ３、ＧＡＰＤＨ、クローンＤ２１５、ベクター
ｐＱＥ−３０ＮＳＴ；Ｈ４、ｂＢＩＰ、ベクターｐＱＥ−ＢＨ６）。Ａ：同一２
検体の相対強度を斜線で示す、検出の再現性；挿入部分：ＰＶＤＦフィルター膜
上のスポットアレイ（図７と同様に、下の二重ガイドスポットは方向付けのもの
）；Ｂ：図７と同様の図。インサートのリーディングフレームが知られている場
合の（＋）か（−）を示す（特異性の閾値は相対強度７，５００に任意設定した
）。
いてマイクロアレイ上に検出された、アレイ状ｈＥｘ１ライブラリーのクローン
に由来するＲＧＳ−Ｈｉｓ6−タグ付き融合タンパク質のハイスループット発現
を示す。９２クローンの粗濾過溶解液を９６穴マイクロタイタープレートからス
ポットしたが、このうち４穴に対照タンパク質が含まれる（Ｈ１、インサートの
ないベクターｐＱＥ−３０ＮＳＴ；Ｈ２、ｂＨＳＰ９０α、クローンＮ１５１７
０、ベクターｐＱＥ−ＢＨ６；Ｈ３、ＧＡＰＤＨ、クローンＤ２１５、ベクター
ｐＱＥ−３０ＮＳＴ；Ｈ４、ｂＢＩＰ、ベクターｐＱＥ−ＢＨ６）。Ａ：同一２
検体の相対強度を斜線で示す、検出の再現性；挿入部分：ＰＶＤＦフィルター膜
上のスポットアレイ（図７と同様に、下の二重ガイドスポットは方向付けのもの
）；Ｂ：図７と同様の図。インサートのリーディングフレームが知られている場
合の（＋）か（−）を示す（特異性の閾値は相対強度７，５００に任意設定した
）。
【図９】 図９は、図８Ａのように、アレイ状ｈＥｘ１ライブラリーのクロー
ンから発現されるＲＧＳ−Ｈｉｓ6−タグ付き融合タンパク質の同一マイクロア
レイに対する３種のモノクローナル抗体の特異性試験を示す。Ａ：モノクローナ
ル抗ＧＡＰＤＨ（Ｈ３、ＧＡＰＤＨ、クローンＤ２１５、ベクターｐＱＥ−３０
ＮＳＴ）；Ｂ：モノクローナル抗ＨＳＰ９０α（Ｈ２、ｂＨＳＰ９０α、クロー
ンＮ１５１７０、ベクターｐＱＥ−ＢＨ６；Ｈ１０、６０Ｓリボソームタンパク
質、Ｌ１８Ａ；Ｈ３、ＧＡＰＤＨ、クローンＤ２１５、ベクターｐＱＥ−３０Ｎ
ＳＴ）；Ｃ：モノクローナル抗αチューブリン（Ｆ９及びＡ４、ＲＦ（＋）αチ
ューブリンクローン；Ｃ７、ＲＦ（−）αチューブリンクローン；Ｂ１及びＢ１
２、未知の遺伝子；Ｈ３、ＧＡＰＤＨ、クローンＤ２１５、ベクターｐＱＥ−３
０ＮＳＴ；Ｇ１、ＲＦ（−）βチューブリンクローン；Ｅ５、ＲＰＬ３リボソー
ムタンパク質、Ｌ３；Ｈ１０、ＲＰＬ１８Ａリボソームタンパク質、Ｌ１８Ａ；
Ｅ６及びＤ８、ＲＰＳ２リボソームタンパク質、Ｓ２；Ｆ７、ＲＰＳ３Ａリボソ
ームタンパク質、Ｓ３Ａ；Ｅ３、ＲＰＳ２５リボソームタンパク質、Ｓ２５）；
特異性の閾値は相対強度２５，０００に任意設定した。
ンから発現されるＲＧＳ−Ｈｉｓ6−タグ付き融合タンパク質の同一マイクロア
レイに対する３種のモノクローナル抗体の特異性試験を示す。Ａ：モノクローナ
ル抗ＧＡＰＤＨ（Ｈ３、ＧＡＰＤＨ、クローンＤ２１５、ベクターｐＱＥ−３０
ＮＳＴ）；Ｂ：モノクローナル抗ＨＳＰ９０α（Ｈ２、ｂＨＳＰ９０α、クロー
ンＮ１５１７０、ベクターｐＱＥ−ＢＨ６；Ｈ１０、６０Ｓリボソームタンパク
質、Ｌ１８Ａ；Ｈ３、ＧＡＰＤＨ、クローンＤ２１５、ベクターｐＱＥ−３０Ｎ
ＳＴ）；Ｃ：モノクローナル抗αチューブリン（Ｆ９及びＡ４、ＲＦ（＋）αチ
ューブリンクローン；Ｃ７、ＲＦ（−）αチューブリンクローン；Ｂ１及びＢ１
２、未知の遺伝子；Ｈ３、ＧＡＰＤＨ、クローンＤ２１５、ベクターｐＱＥ−３
０ＮＳＴ；Ｇ１、ＲＦ（−）βチューブリンクローン；Ｅ５、ＲＰＬ３リボソー
ムタンパク質、Ｌ３；Ｈ１０、ＲＰＬ１８Ａリボソームタンパク質、Ｌ１８Ａ；
Ｅ６及びＤ８、ＲＰＳ２リボソームタンパク質、Ｓ２；Ｆ７、ＲＰＳ３Ａリボソ
ームタンパク質、Ｓ３Ａ；Ｅ３、ＲＰＳ２５リボソームタンパク質、Ｓ２５）；
特異性の閾値は相対強度２５，０００に任意設定した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 Ｂｅｒｌｉｎ，ＢＲＤ (72)発明者 ヴァルター，ゲラルト ドイツ連邦共和国デー−12203 ベルリン， マルゲレテンシュトラーセ 13アー (72)発明者 レーラフ，ハンス ドイツ連邦共和国デー−14195 ベルリン， リューツェルシュタイナー・ヴェーク 50 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 DA36 FB02 FB03 4B024 AA01 AA11 CA01 CA09 DA01 DA02 DA03 DA05 DA06 DA11 DA12 HA11 HA14 4B063 QA05 QA18 QQ02 QQ03 QQ04 QQ05 QQ06 QQ07 QQ08 QQ09 QQ10 QQ13 QQ21 QQ42 QQ79 QQ94 QQ96 QR32 QR55 QR75 QR82 QR83 QR84 QS25 QS34 QX01
Claims (27)
- 【請求項１】 以下の工程を含んでなる、所望の生物学的特性を与える発現
ライブラリーのクローンを同定及び／又は特徴づけする方法： （ａ）アレイ形態で配置されている前記発現ライブラリーのクローンの組換え
インサートの発現産物とともに融合タンパク質として発現される少なくとも１つ
の（ポリ）ペプチドの発現について分析すること；及び （ｂ）前記所望の生物学的特性を与えるクローンのインサートによって発現さ
れる（ポリ）ペプチドと特異的に相互作用するリガンドを、アレイ形態のクロー
ンの前記ライブラリー又は前記ライブラリーの第一レプリカと接触させること、
及び前記クローンのライブラリーを相互作用の発生について分析すること；及び
／又は、 （ｃ）所望の生物学的特性を与えるクローンのインサートに特異的な核酸プロ
ーブを用いて、アレイ形態に配置されたクローンの前記ライブラリー又は前記第
一レプリカ又は前記ライブラリーの第二レプリカとのハイブリダイゼーション又
はオリゴヌクレオチド・フィンガープリントを実施すること、及び前記クローン
のライブラリーをハイブリダイゼーションの発生について分析すること；及び （ｄ）工程（ａ）における少なくとも１つの（ポリ）ペプチドの発現、及び／
又は工程（ｂ）における相互作用、及び／又は工程（ｃ）における特異的なハイ
ブリダイゼーション又はオリゴヌクレオチド・フィンガープリントが検出され得
るクローンを同定すること及び／又は特徴づけること。 - 【請求項２】 前記組換えインサートの前記発現産物とともに融合タンパク
質の一部として発現される前記（ポリ）ペプチドが、抗体又はフラグメント又は
それらの誘導体、タグ、酵素、ファージタンパク質又はそのフラグメント、又は
融合タンパク質である、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 工程（ａ）における（ポリ）ペプチドの発現についての前記
分析が、特異的に相互作用する工程（ｂ）のリガンドとは異なるリガンドを前記
（ポリ）ペプチドと接触させること、及び前記クローンのライブラリーを特定の
相互作用の出現について分析することによって達成される、請求項１又は２に記
載の方法。 - 【請求項４】 工程（ａ）の（ポリ）ペプチドの発現についての前記分析が
視覚的な手段、好ましくは質量分析法によって達成される、請求項１〜３のいず
れか１項に記載の方法。 - 【請求項５】 前記所望の生物学的特性が、細胞、組織又は発生段階の細胞
又は組織、微生物、好ましくは細菌、植物又は生物への特異性である、請求項１
〜４のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項６】 前記細胞又は組織が、正常な細胞又は組織、病的な細胞又は
組織、又は前処理された細胞又は組織である、請求項５に記載の方法。 - 【請求項７】 前記クローンが細菌の形質転換細胞、組換えファージ、形質
転換された哺乳類、昆虫、真菌、酵母又は植物の細胞である、請求項１〜６のい
ずれか１項に記載の方法。 - 【請求項８】 前記アレイ形態が工程（ａ）〜（ｃ）において実質的に同一
のフォーマットを有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項９】 前記アレイ形態がグリッド形態である、請求項１〜８のいず
れか１項に記載の方法。 - 【請求項１０】 前記グリッドが、マイクロタイタープレート、シリカウェ
ーハー、チップ、質量分析ターゲット、又はマトリックスのディメンジョンを有
する、請求項９に記載の方法。 - 【請求項１１】 前記クローンが固形支持体に固定されている、請求項１〜
１０のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１２】 前記固形支持体がフィルター、膜、磁気ビーズ、シリカウ
ェーハー、ガラス、金属、チップ、質量分析ターゲット又はマトリックスである
、請求項１１に記載の方法。 - 【請求項１３】 前記リガンドの少なくとも１つが、（ポリ）ペプチド、フ
ァージ又はそのフラグメント、血液、血清、毒素、阻害剤、医薬品又は医薬品候
補物質、非タンパク質又は一部タンパク質である受容体、触媒ポリマー、酵素、
核酸、ＰＮＡ、ウイルス又はその部分、細胞又はその部分、無機化合物、結合体
、色素、組織又は前記リガンドの結合体である、請求項１〜１２のいずれか１項
に記載の方法。 - 【請求項１４】 前記（ポリ）ペプチドが抗体又はフラグメント又はその誘
導体、ホルモン又はそのフラグメント、又は酵素又はフラグメント又はその誘導
体である、請求項１３に記載の方法。 - 【請求項１５】 工程（ｂ）での前記相互作用が特異的な相互作用である、
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１６】 工程（ｂ）での前記相互作用が非特異的な相互作用である
、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１７】 工程（ｃ）での前記ハイブリダイゼーションがストリンジ
ェントな条件で起こる、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１８】 工程（ｃ）での前記ハイブリダイゼーションが非ストリン
ジェントな条件で起こる、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１９】 前記タグが、ｃ−ｍｙｃ、Ｈｉｓ−タグ、ＦＬＡＧ、アル
カリホスファターゼ、ＥｐｉＴａｇTM、Ｖ５タグ、Ｔ７タグ、ＸｐｒｅｓｓTMタ
グ又はＳｔｒｅｐ−タグ、融合タンパク質、好ましくはＧＳＴ、セルロース結合
ドメイン、グリーン蛍光タンパク質、マルトース結合タンパク質又はｌａｃＺで
ある、請求項２〜１８のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項２０】 前記クローンのライブラリーがｃＤＮＡライブラリーを含
む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項２１】 前記ライブラリー及び／又は前記レプリカの前記アレイ形
態が自動化装置によって産生される、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方
法。 - 【請求項２２】 前記自動化装置がピッキングロボット及び／又はスポッテ
ィングロボット及び／又はグリッディングロボットである、請求項２１に記載の
方法。 - 【請求項２３】 前記所望されるクローンの核酸インサートを配列決定する
ことをさらに含んでなる、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項２４】 所望されるクローンのインサートによってコードされる（
ポリ）ペプチドを同定すること及び／又は特徴づけることをさらに含んでなる、
請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項２５】 所望によりベクターに含まれるインサート、又は所望の生
物学的特性を与える所望されるクローンのインサートの発現産物を製剤化するこ
とを含んでなる、医薬組成物を製造する方法であって、前記インサート又は発現
産物が請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法により同定される及び／又は
特徴づけられる前記方法。 - 【請求項２６】 請求項２５に記載の方法によって製造される医薬組成物。
- 【請求項２７】 固形支持体に固定している請求項１〜２２のいずれか１項
に記載されるような発現ライブラリーの少なくとも２つのレプリカを含んでなる
キット。
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|---|---|---|---|
| US7059098A | 1998-04-30 | 1998-04-30 | |
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| PCT/EP1999/002963 WO1999057311A2 (en) | 1998-04-30 | 1999-04-30 | Novel method for the identification of clones conferring a desired biological property from an expression library |
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|---|---|
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
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