KR101280817B1 - 안젤만 증후군 진단용 마이크로어레이 및 키트 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 염색체 이상, 특히 안젤만 증후군 (Angelman syndrome, AS)의 진단에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 안젤만 증후군 진단을 위한 프로브, 상기 프로브를 포함하는 마이크로어레이 및 키트에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 신속하고 정확하게 안젤만 증후군을 검정함으로써 검체의 건강상태 및 질환 여부를 쉽게 진단할 수 있는 염색체 이상 검출방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 염색체 이상, 특히 안젤만 증후군 (Angelman syndrome, AS)의 진단에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 안젤만 증후군 진단을 위한 프로브, 상기 프로브를 포함하는 마이크로어레이 및 키트에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 신속하고 정확하게 안젤만 증후군을 검정함으로써 검체의 건강상태 및 질환 여부를 쉽게 진단할 수 있는 염색체 이상 검출방법에 관한 것이다.
염색체 이상은 유전자 장애 및 퇴행성 질환과 연관되며, 개별 염색체의 결손 또는 중복, 염색체 일부분의 손실 또는 중복, 염색체 끊어짐(break), 역위 및 전좌 등을 나타낸다. 염색체 이상은 생물체의 유전자 균형을 깨뜨려, 태아 사망 또는 심각한 정신적, 육체적 결함을 야기한다. 일 예로 다운 증후군은 염색체 21번이 3 배수로 존재하여 야기된 것으로, 대표적인 염색체 수 이상 질환이다. 그 외에도 에드워드 증후군(18+), 파타우 증후군(13+), 터너 증후군(XO) 및 클라인펠터 증후군(XXY)이 염색체 수 이상 질환에 속한다.
염색체 이상은 주로 핵형 분석(Karyotype) 및 FISH(Fluorescent In Situ Hybridization)으로 진단된다. 상기 방법들은 정확성에 비해 시간과 노동이 많이 소요되며, 특히 핵형 분석은 세포 배양 시간이 요구되는 단점이 있다. 또한 FISH는 분석대상이 기존에 염기서열 및 염색체 내 위치 특성 등이 밝혀진 것에만 한정되는 단점이 있다. 상기한 FISH의 단점을 해결한 방법으로 게놈 혼성화 비교법(comparative genome hybridization; CGH)이 있다. CGH는 전체 게놈을 분석하여 염색체 수 이상을 나타낸 부위를 검출하는 것이나, FISH에 비하여 해상도가 낮은 단점이 있다.
염색체 이상을 진단하는 다른 방법으로, DNA 마이크로어레이 시스템을 사용할 수 있다. DNA 마이크로어레이 시스템은 어레이 상에 집적된 생분자(bio-molecules)에 따라 cDNA 마이크로어레이, 올리고뉴클레오타이드 마이크로어레이 및 게놈 마이크로어레이로 분류된다. cDNA 마이크로어레이 및 올리고뉴클레오타이드 마이크로어레이는 제작이 간편한 장점이 있으나 어레이 상에 고정가능한 프로브의 수적 한계, 과다한 프로브의 제작 비용 및 프로브 이외 부위에서의 염색체 이상을 검사하기 어려운 단점이 있다. 반면에 게놈 DNA 마이크로어레이는 프로브의 준비가 용이하며, 염색체의 광범위한 부분에서의 염색체 이상을 검사할 수 있으며, 염색체 내 인트론 부위에서의 이상을 검사할 수 있다는 장점이 있으나, 기능 및 염색체상의 위치가 확인된 다수의 DNA 절편을 준비하기 어려운 단점이 있다.
한편, 안젤만 증후군 (Angelman syndrome, AS)은 모계로부터 유래한 15번 염색체 장완 근위부 (15q11~q13)의 미세결실이 주원인(75%)이며 20 %정도는 15번 염색체에 존재하는 UBE3A 유전자의 돌연변이가 원인으로 추정되는 질환으로, 발달지연, 언어장애, 잦은 미소, 발작, 소두증 등의 증상을 나타낸다. 안젤만 증후군의 진단은 임상적 관찰과 가족력에 주로 의존하고 있으며, 안젤만 증후군을 세포유전학적 측면에서 특이적으로 진단할 수 있는 방법이 확립되어 있지 않은 실정이다.
이와 관련하여, 일본공개특허 JP2005-124431 는 RNA-FISH (fluorescence in situ hybridization) 법에 의하여 염색체 상의 유전자 발현의 존부를 측정함으로써 안젤만 증후군을 진단하는 방법을 기술하고 있고, 국제공개특허 WO2011/028533 및 미국공개특허 US20110046009 는 유전자 위치(genomic locus)의 메틸화 상태를 검출함으로써 안젤만 증후군을 진단하는 방법을 기술하고 있고, 미국등록특허 US7439346 은 15번 염색체의 15q12 또는 15q13 위치의 게놈 핵산 단편들을 포함하는 핵산 어레이를 이용한 안젤만 증후군의 진단에 관하여 기술하고 있다. 그러나, 상기 문헌들은 안젤만 증후군을 특이적으로 진단할 수 있는 프로브를 제공하고 있지 않으며, 나아가 안젤만 증후군에 특이적인 염색체 이상의 검출을 실험예로 구현하여 실증하지 않고 있다.
이에, 본 발명자들은 안젤만 증후군을 세포유전학적 측면에서 특이적으로 진단할 수 있는 시스템을 구축하기 위하여 노력한 결과, 안젤만 증후군에 해당하는 염색체 이상을 검출할 수 있는 프로브를 개발하였으며, 나아가 상기 프로브를 이용한 안젤만 증후군 진단 시스템을 확립함으로써 본 발명을 완성하였다.
상기 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명의 하나의 목적은 안젤만 증후군을 진단할 수 있는 프로브를 포함하는 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 조성물을 포함하는 안젤만 증후군 진단용 마이크로어레이를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 마이크로어레이의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 마이크로어레이 및 표지물질 검출 제제를 포함하는 안젤만 증후군 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 마이크로어레이를 이용한 안젤만 증후군 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 여러 가지 유형의 특이적인 염색체 이상 중에서, 특히 15q12 결실에 의해 나타나는 안젤만 증후군 (Angelman syndrome, AS)을 진단하는 기술에 관한 것이다.
본 발명자들은 인간 게놈 DNA 단편을 포함하는 BAC 클론을 조사하였으며, 종래의 방법을 통해 진단된 aCGH 데이터의 정량 및 정성 분석을 수행함으로써 안젤만 증후군 유전자의 복제수 변화를 측정하는 기술을 확립하여 본 발명을 완성하였다.
구체적으로, 본 발명은 안젤만 증후군에 해당하는 염색체 이상을 검출할 수 있는 프로브를 슬라이드 위에 균일하게 집적하여, 정상적인 유전자 복제수를 갖는 시료와 안젤만 증후군의 의심 검체를 각각 다른 형광물질로 염색하여 두 시료간의 염색 차이에 의한 비율값을 수치화함으로써 정확한 유전자의 증폭 유무를 알 수 있으며, 면역조직화법 및 FISH법 등의 종래 방법에 비하여 소요 시간이 반 이상으로 단축 가능하고 매우 저렴한 비용으로 그 결과를 도출할 수 있는 장점이 있다.
따라서, 하나의 양태로서, 본 발명은 안젤만 증후군을 진단할 수 있는 프로브를 포함하는 진단용 조성물에 관한 것이다
바람직한 양태로서, 본 발명은
(a) 표 1의 1번 내지 3번으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 게놈 DNA 단편;
(b) 상기 게놈 DNA 단편 내의 연속하여 위치하는 20 내지 100 bp의 올리고뉴클레오타이드;
(c) 상기 게놈 DNA 단편에서 유래하는 100 bp 내지 10 kbp의 cDNA; 및
(d) 상기 게놈 DNA 단편, 올리고뉴크레오타이드 및 cDNA의 상보체
로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 프로브를 포함하고,
상기 프로브는 염기서열 내 반복 서열 함유 비율이 최대 85% 인 것이고,
상기 프로브를 이루는 염기서열은 염색체 내 단일 위치성 (single locus)을 갖는 것인, 안젤만 증후군 진단용 조성물에 관한 것이다.
| 번호 | BAC DNA명 | FISH로 확인한 염색체 위치 | 인간 게놈상에서의 위치 | 크기 (bp) | 참조 염기서열 | 서열번호 | |
| 시작 | 끝 | ||||||
| 1 | #5948_BAC248 | 15q12 | 26,730,055 | 26,832,784 | 102,730 | NCBI Build 37.1 (August, 2009) |
1 |
| 2 | #4049_BAC21 | 15q12 | 26,878,318 | 27,002,755 | 124,438 | NCBI Build 37.1 (August, 2009) |
2 |
| 3 | AS | #5948_ BAC248 및 #4049_ BAC21의 pooled DNA | |||||
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 안젤만 증후군 진단용 마이크로어레이에 관한 것이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 프로브를 마이크로어레이에 고정하는 단계를 포함하는 안젤만 증후군 진단용 마이크로어레이의 제조방법 에 관한 것이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 마이크로어레이 및 표지물질 검출 제제를 포함하는 안젤만 증후군 진단용 키트에 관한 것이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 안젤만 증후군 진단용 키트를 이용한 안젤만 증후군 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
바람직한 양태로서, 상기 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법은,
(a) 상기 마이크로어레이 상에 고정된 프로브에, 검출 가능한 제1 표지물질로 표지한 검체 게놈 DNA 및 검출 가능한 제2 표지물질로 표지한 표준 DNA를 동일비율로 혼합반응시키는 단계, 및
(b) 상기 프로브와 검체 DNA와의 혼성화 정도를 측정하여, 이를 표준 DNA와의 혼성화 정도와 비교하는 단계를 포함한다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
안젤만
증후군
안젤만 증후군 (Angelman syndrome, AS)은 모계로부터 유래한 15번 염색체 장완 근위부 (15q11~q13)의 미세결실이 주원인(75%)이며 20 %정도는 15번 염색체에 존재하는 UBE3A 유전자의 돌연변이가 원인으로 추정되는 질환으로, 발달지연, 언어장애, 잦은 미소, 발작, 소두증 등의 증상을 나타낸다.
본 발명은 염색체 핵형 15q12 에 특이적인 염색체 이상 결실에 의해 나타나는 안젤만 증후군을 진단한다.
본 발명에서는 상기 인간 게놈 염색체 부위 15q12 부위를 최신 버전인 NCBI Build 37.1 (August, 2009)에 따라 표현하였지만, 상기 인간 게놈 염색체 부위 15q12 부위의 구체적 서열은 게놈 서열 연구 결과가 업데이트됨에 따라서 그 표현이 다소 변경될 수 있으며, 이러한 변경에 따라 본 발명의 상기 인간 게놈 염색체 부위 15q12 부위의 표현이 상이해질 수 있다. 따라서, 본 발명의 NCBI Build 37.1 (August, 2009)에 따라 표현된 인간 게놈 염색체 부위 15q12 부위는 본 발명의 출원일 이후 인간 표준 염기서열(human reference sequence)이 업데이트되어 상기 인간 게놈 염색체 부위 15q12 부위의 표현이 지금과 다르게 변경된다고 하여도, 본 발명의 범위가 상기 변경된 인간 게놈 염색체 부위 15q12 위에 미치게 됨은 자명하다고 할 것이다. 이러한 변경 내용은 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자라면 누구라도 용이하게 알 수 있는 사항이다.
안젤만
증후군 진단용
프로브
본 발명에서 용어, "프로브" 란 마이크로어레이 상에 고정되어 시료 내 함유된 상동의 DNA와 혼성화되는 물질로서, DNA, RNA, cDNA 또는 mRNA일 수 있으며, DNA의 경우 올리고머일 수 있다. 프로브는 염기서열 내 반복서열 함유비율이 최대 85%일 수 있으며, 바람직하게는 최대 70%, 더욱 바람직게는 최대 50 %, 가장 바람직하게는 최대 40%일 수 있다. 프로브의 크기는 게놈 DNA인 경우 10 내지 350 kb 일 수 있으며, 올리고머인 경우 20 내지 300 bp, 바람직하게는 20 내지 100 bp이며, cDNA 또는 RNA인 경우 100 bp 내지 10 kb일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 보다 정확한 검출을 위하여, 상기 프로브를 이루는 염기서열은 염색체 내 단일 위치성 (single locus)을 갖는 것이 바람직하다.
본 발명의 프로브는, 인간 게놈 염색체 부위 15q12의 결실에 의해 나타나는 안젤만 증후군을 진단하기 위하여, 인간 게놈 염색체 15q12 부위의 특정 게놈 DNA 단편, 상기 게놈 DNA로부터 유래한 올리고머, cDNA 또는 이들의 상보체임을 특징으로 한다.
바람직한 양태로서, 본 발명의 안젤만 증후군 진단용 프로브는
(a) 표 1의 1번 내지 3번으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 게놈 DNA 단편;
(b) 상기 게놈 DNA 단편 내의 연속하여 위치하는 20 내지 100 bp의 올리고뉴클레오타이드;
(c) 상기 게놈 DNA 단편에서 유래하는 100 bp 내지 10 kbp의 cDNA; 및
(d) 상기 게놈 DNA 단편, 올리고뉴크레오타이드 및 cDNA의 상보체
로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 프로브를 포함하고,
상기 프로브는 염기서열 내 반복 서열 함유 비율이 최대 85% 인 것이고,
상기 프로브를 이루는 염기서열은 염색체 내 단일 위치성 (single locus)을 갖는 것이 바람직하다.
상기 표 1에서, AS 로 명명된 3번 프로브의 경우, 상기 1번 및 2번의 BAC DNA 를 혼합하여 함께 사용하는 것을 의미한다.
본 발명에서 안젤만 증후군 진단용 프로브로 사용하는 표 1의 게놈 DNA 단편은, 생물체의 전체 염색체로부터 목적한 크기 및 목적한 염기서열을 포함하는 형태로 수득하거나, 생물체의 게놈 라이브러리로부터 클로닝하거나 또는 화학적으로 합성하여 수득할 수 있다.
바람직하게, 상기 프로브는, 특별한 제한은 없지만, 상기 게놈 DNA 단편이 BAC(Bacterial Artificial Chromosome), HAC(Human Artificial Chromosome), TAC(Transformation competent Artificial Chromosome), YAC(Yeast ArtificialChromosome), PAC(P1-derived Artificial Chromosome), P1(phage) 및 코스미드(cosmid)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 벡터에 삽입되어 제조된 것일 수 있다. 특히 BAC은 비교적 크기가 큰, 예컨대, 약 100,000 bp 이상의 유전자 단편도 삽입이 가능하여, 본 발명에 따른 프로브 제조에 바람직할 수 있다.
게놈 DNA 단편의 크기는 게놈 DNA 마이크로어레이의 분석 해상도에 따라 조절될 수 있으나, 평균 100 내지 350kb의 크기를 갖는 것이 바람직하다. 전체 염색체 상에서 일어나는 염색체 이상의 최소변화인 Micro-deletion이 1Mb인 것을 감안하면, 평균 100 내지 350 kb 크기의 게놈 DNA로 이루어진 본 발명의 진단 시스템은 염색체 이상 분석시 매우 높은 해상도를 구현시킬 수 있음은 자명한 일이다.
본 발명에 언급된 표 1의 인간 게놈 단편은 공개된 데이터베이스, 예컨대 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST 사이트, 또는 http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway 에서 각각의 염기서열을 확인할 수 있다.
안젤만
증후군 진단용
프로브의
선별과정
본 발명의 안젤만 증후군 진단용 프로브는 다음의 과정에 의하여 선별되었다:
(a) 인간 게놈 라이브러리 및 BAC 클론을 제조하는 단계,
(b) 상기 각 클론에 삽입된 게놈 DNA 단편을 동정하는 단계,
(c) 염색체 이상 여부를 확인하고자 하는 대상 염색체 부위를 선정하는 단계, 및
(d) 상기 (b) 단계의 동정된 게놈 DNA 단편들 중, 상기 대상 염색체 부위를 검출할 수 있고, 염기서열 내 반복서열 함유 비율이 최대 85 %이며, 염색체 내 단일 위치성(single locus)을 포함하는 게놈 DNA 단편을 프로브로 선택하는 단계.
이하, 각 단계를 보다 상세하게 설명한다.
상기 (a) 단계에서, 인간 게놈 라이브러리 및 BAC 클론은 공지의 방법으로 제조 가능하다. 일실시예로, 인종별 사람의 게놈을 분리한 후 제한효소 처리 및/또는 초음파 분쇄 처리하여 절단하고 PFGE(Pulse Field Gel Electrophoresis)를 통해 평균 100 내지 350 Kb 크기의 DNA 조각을 수득할 수 있다. DNA 조각을 동일 제한효소로 처리된 BAC 벡터에 삽입시킨 후 숙주세포, 예컨대 E. Coli에 형질전환시켜 제조된, 각 사람 게놈 DNA 조각을 포함하고 있는 세포주를 BAC 클론이라 한다. 본 발명자는 상기 방법으로 총 96,768개의 클론을 제작하였다.
상기 (b) 단계는 상기 각 클론에 삽입된 게놈 DNA 단편을 동정하는 단계이며, 일실시예로, BAC 클론 내 삽입된 DNA의 일부 서열분석, 상기 서열과 동정된 사람 게놈 서열과의 상동성 분석을 통한 DNA의 위치 및 전체 염기서열 확인, FISH(Fluorescent In Situ Hybridization)를 이용한 DNA의 게놈상 위치 재확인, 및 각 BAC 클론으로부터의 DNA 회수 단계를 통하여, 각 클론에 삽입된 게놈 DNA 단편을 동정할 수 있다.
1) BAC 클론 내 삽입된 게놈 DNA 단편의 위치 및 전체 염기서열 확인
각 클론에 존재하는 게놈 DNA 단편은 바이오인포메틱스를 이용한 상동성 분석으로, 이미 염기서열이 공지된 사람 게놈의 서열과 상동성 분석을 실시할 수 있다. 이 때 사용가능한 상동성 분석 데이터베이스는 NCBI, UC Santa Cruz, 및 Sanger Institute 등이 있다. 상동분석을 위하여, 먼저 클론에 형질도입한 벡터에 특이적인 프라이머로 말단 서열분석(end-sequencing)을 실시하여 삽입된 게놈 DNA 단편의 양 말단 서열의 일부, 예컨대 100 내지 700 bp를 서열 분석할 수 있다. 상기한 과정은 벡터의 염기서열 및 개열지도가 확인된 상태이므로 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자라면 용이하게 실시가능하다. 다음으로, 분석된 게놈 DNA 단편의 양 말단 서열을 사람 게놈 서열이 존재하는 데이터베이스에 입력하여 상동성 검색을 실시하고, 일치되는 부위를 확인함으로써 게놈 DNA 단편의 사람 게놈상의 위치 및 전체염기서열을 확인할 수 있다.
2) FISH를 이용한 게놈 DNA 단편의 게놈상 위치 재확인
생략가능한 단계이나, 게놈 DNA 단편의 게놈상의 위치를 재확인하기 위하여 FISH를 실시할 수 있다. 이를 위하여, 게놈 DNA 단편을 프로브로 사용하고 여기에 형광표지한 후 이를 세포분열 중기단계의 사람 염색체에 반응시킬 수 있다. 형광표지 신호를 인식하여, 게놈 DNA 단편의 염색체상 결합부를 재확인할 수 있다.
3) 클론으로부터 게놈 DNA 단편 회수
공지의 방법 또는 시판되는 게놈 DNA 회수 키트를 이용하여 각 클론으로부터 게놈 DNA 단편을 회수할 수 있다.
이와 같이, (b) 단계에서는 각 클론별 게놈 DNA 단편의 특징, 즉 염색체 내 위치, 염기서열, 이의 기능, 관련 유전자 또는 질환 정보를 정리할 수 있으며, DNA 칩의 용도에 따라 적절한 게놈 DNA 단편을 선택하여 용이하게 준비할 수 있는 장점이 있다. 특히 특정 질환 진단용 칩을 제조하고자 하는 경우, 질환발병 또는 예후에 염색체 이상을 나타내는 것으로 확인 또는 추정되는 게놈 부위에 대응되는 게놈 DNA 단편만을 각각의 클론으로부터 용이하게 회수할 수 있다.
상기 게놈 DNA 단편은 인간 게놈 DNA 단편으로 이루어진 군으로부터 1종 이상이 선택될 수 있으며, 바람직하게는 염색체 이상을 확인 하고자 하는 목적 부위 또는 질환의 종류에 따라 적절한 게놈 DNA 단편을 선별하여 사용할 수 있다.
상기 (c) 단계에서, 상기 염색체 이상은 핵산 서열 변이, 염색체 수 증폭, 염색체 수 결손, 염색체 역위 및 염색체 전좌로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게는 염색체 수 이상이다. 또한, 대상 염색체 부위는 질환 특이적 변이성을 포함하는 부위, 예컨대 질환에 특이적인 염색체수 증폭 또는 결손을 보이는 염색체 부위로, 이는 본 발명이 속하는 기술분야의 해당업자라면 용이하게 채택할 수 있다. 본 발명의 목적상, 상기 염색체 수 이상 질환은 안젤만 증후군을 의미하며, 대상 염색체 부위는 인간 게놈 염색체 부위 15q12 를 의미한다.
상기 (d) 단계에서는, 상기 대상 염색체 부위를 검출할 수 있는 게놈 DNA 단편들을 선별할 수 있다. 이 때 게놈 DNA 단편의 염색체상 위치, 염기서열, 질병관련성 및 기능들을 분석하여, 적절한 게놈 DNA 단편을 선택할 수 있다. 상기 프로브는 염기서열 내 반복서열 함유 비율이 최대 85 %이며, 게놈 DNA 단편을 이루는 염기서열이 염색체 내 단일 위치성(single locus)을 가지는 것을 선택하는 것이 바람직하다. 상기 프로브는 대상 염색체 부위의 전체, 일부 또는 이들의 상보체 서열을 포함할 수 있다.
이와 같이 선별된 본 발명의 프로브는, 염색체 핵형 15q12 에 특이적인 염색체 이상 결실에 의해 나타나는 안젤만 증후군을 진단하는데 사용될 수 있다.
안젤만
증후군 진단용
마이크로어레이
바람직한 양태로서, 본 발명은
(a) 표 1의 1번 내지 3번으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 게놈 DNA 단편;
(b) 상기 게놈 DNA 단편 내의 연속하여 위치하는 20 내지 100 bp의 올리고뉴클레오타이드;
(c) 상기 게놈 DNA 단편에서 유래하는 100 bp 내지 10 kbp의 cDNA; 및
(d) 상기 게놈 DNA 단편, 올리고뉴크레오타이드 및 cDNA의 상보체
로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 프로브가 고정되고,
상기 프로브는 염기서열 내 반복 서열 함유 비율이 최대 85% 인 것이고,
상기 프로브를 이루는 염기서열은 염색체 내 단일 위치성 (single locus)을 갖는 것인, 안젤만 증후군 진단용 마이크로어레이에 관한 것이다.
상기 마이크로어레이는 하나의 스팟당 1종 또는 2종 이상의 프로브를 포함할 수 있으며, 상기 하나의 스팟에 2종 이상의 프로브를 포함할 경우, 염색체 수 이상 질환에서 동일한 유전자 표현형을 나타내는 염색체 부위의 전체, 일부분 및 이들의 상보체로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함할 수 있으며, 상기 유전자 표현형은 유전자 증폭 또는 유전자 결손일 수 있다.
상기 프로브는 게놈 DNA 단편일 수 있으며, 또는 상기 게놈 DNA 단편으로부터 유래한 RNA 단편, cDNA 단편 또는 올리고머일 수 있다. 프로브는 마이크로어레이의 목적에 따라 적절한 종류를 선택하여 사용할 수 있다. 마이크로어레이는 통상의 마이크로어레이 제조방법과 동일한 방법으로 실시될 수 있다. 일실시예로, 프로브는 마이크로어레이용 기판에 물리적 결합 또는 화학적 결합을 통하여 고정시킬 수 있다. 상기 기판은 공지된 모든 종류의 물질일 수 있으며 바람직하게는 통상의 마이크로어레이에서 사용되는 물질일 수 있고, 상기 기판표면에 DNA를 고정시킬 수 있는 반응기나 나이트로셀룰로스 또는 3차 구조형성물이 더욱 포함된 것일 수 있다. 그 예로는 실리콘 웨이퍼, 유리, 폴리카보네이트, 막(membrane), 폴리스티렌 또는 폴리우레탄과 같은 고분자 필름 및 다공성 물질이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 바람직한 일실시예로, 본 발명의 마이크로어레이는 안젤만 증후군의 산전/산후 (constitutional diseases) 진단용으로 제공될 수 있다.
산전/산후 진단용 DNA 마이크로어레이는 통상 산전/산후 진단에 타겟이 되는 질환 또는 전체 염색체 상의 변이 검출을 목적으로 하며, 본 발명의 목적상, 안젤만 증후군에 관련된 염색체 부위를 검출할 수 있는 게놈 DNA 또는 상기 게놈 DNA로부터 유래한 올리고머, cDNA 또는 RNA를 프로브로 포함한다. 이때, 산전/산후 진단용 DNA 마이크로어레이는 하나의 어레이에 각 타켓 질환별 염색체 변이를 검출할 수 있는 프로브가 1종 내지 다수종 고정되어 있을 수 있다.
본 발명의 게놈 DNA 마이크로어레이는 삽입된 게놈 DNA 단편의 염색체 내 위치 및 염기서열이 확인된 클론으로부터 게놈 DNA 칩의 목적에 따라 바람직한 게놈 DNA 단편을 다량으로 용이하게 확보할 수 있는 장점이 있으며, 생물의 게놈상의 염색체 이상을 용이하게 검출할 수 있으며, 염색체 이상이 엑손 부위 외에 인트론 부위에서 발생되는 경우까지 검출가능하며, 검출된 염색체 이상으로부터 특정 질환과의 관련성을 예시할 수 있으며, 내인적 또는 외부적인 요인에 의한 생물의 게놈 변이 양상을 관찰할 수 있고, 각 질환 특이적 진단 칩을 용이하게 제공할 수 있으며, 인종 특이적 또는 사람 특이적 다양성(polymorphism)을 연구하는데 매우 유용하다.
안젤만
증후군 진단용
마이크로어레이의
제조
본 발명에 따른 마이크로어레이는 상기 안젤만 증후군 진단용 조성물에 포함된 게놈 DNA 단편, cDNA 단편, 올리고머 및 이들의 상보체로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로브를 마이크로어레이에 고정하는 단계를 포함하는 방법으로 제조될 수 있다.
상기 프로브의 고정은, 통상의 DNA 마이크로어레이 제조방법에서 취하는 방법을 통하여 실시할 수 있으며, 예컨대 포토리소그래피(photolithography) 방법, 압전 인쇄(piezoelectric printing) 방법, 마이크로 피펫팅 또는 스폿팅(spotting) 등의 방법을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 이러한 방법은 게놈 DNA 마이크로어레이 제조시에 통상적인 방법이므로 본 발명이 속하는 기술분야의 해당업자라면 용이하게 실시할 수 있다.
프로브는 마이크로어레이 상의 하나의 스팟당 2 내지 100 pg으로 고정시킬 수 있으며, 또한 스팟당 동일한 염기서열로 이루어진 1종의 프로브를 고정시키거나 2종 이상의 프로브를 혼합하여 고정시킬 수 있다. 또한 마이크로어레이 상의 스팟은 1배수 이상일 수 있으며, 바람직하게는 2 내지 3배수로 구성될 수 있다. 이 때 스팟은 원형일 수 있으며, 직경 50 내지 500 um, 스팟간 간격은 10 내지 500 um 일 수 있다. 그러나 스팟의 크기 및 조밀도는 마이크로어레이 분석 시스템의 해상도에 따라 적절히 조절하는 것이 바람직하다.
본 발명의 마이크로어레이는 마이크로웰 플레이트, 예컨대 96웰 플레이트의 웰에 위치시켜, 기존의 96웰 플레이트를 이용한 자동장비(예, Biomek, Genetix robo)로 시료 분지, 표지, 혼성화 및 세척과정을 기계적으로 처리할 수 있다.
안젤만
증후군 진단용
키트
바람직한 양태로서, 본 발명은
상기 마이크로어레이 및 표지물질 검출 제제를 포함하고,
상기 마이크로어레이에 고정된 프로브에, 검출 가능한 제1 표지물질로 표지한 검체 게놈 DNA 및 검출 가능한 제2 표지물질로 표지한 표준 DNA를 동일비율로 혼합반응시키고, 상기 검체 DNA 및 표준 DNA 각각의 혼성화 비율을 측정하여 그 결과로부터 검체 DNA의 염색체 이상 여부를 판단하는 것을 특징으로 하는,
안젤만 증후군 진단용 키트에 관한 것이다.
표준 DNA란 그 크기나 서열 등을 이미 알고 있는 DNA로, 정상인의 핵형을 갖는 DNA 로 세포나 태반 조직 등에서 추출한 Genomic DNA 를 의미한다.
상기 혼성화 비율 측정 결과에서, 검체 DNA의 혼성화 비율이 표준 DNA의 혼성화 비율과 동일한 경우 염색체 이상은 없는 것으로 판독하고, 검체 DNA의 혼성화 비율이 표준 DNA의 혼성화 비율보다 높을 경우 염색체 증가가 있는 것으로 판독하고, 검체 DNA의 혼성화 비율이 표준 DNA의 혼성화 비율보다 낮을 경우 염색체 결손이 있는 것으로 판독함으로써 검체 DNA의 염색체 이상을 분석할 수 있다.
상기 검체는 사람 또는 동물로부터 수득한 생체시료, 예컨대 체액 (침, 혈액, 소변, 정액, 양수 등), 조직 또는 세포일 수 있으며, 상기 생체시료로부터 통상의 방법으로 DNA를 추출 및 분리할 수 있다.
상기 제1 표지물질 및 제2 표지물질은 동일하거나 서로 다른 물질일 수 있으며, 예컨대 서로 독립적으로 형광물질, 방사능동위원소, 화학발광체 또는 효소일 수 있다. 그 예로는 Cy3, Cy5, Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 658, 시아닌(Cyanine)-3, 시아닌-5, 플루오레세인(fluorescein), 보디피(bodipy), 텍사스 레드(Texas red), FITC(Fluorescein Isothiocyanate), 로다민(rhodamine), d-NTP (including d-UTP), 아미노-알릴 수정된 dNTPs를 갖는 반응성 염료, 양고추냉이 과산화효소, 바이오틴 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
안젤만
증후군 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법
바람직한 양태로서, 상기 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법은,
(a) 상기 마이크로어레이 상에 고정된 프로브에, 검출 가능한 제1 표지물질로 표지한 검체 게놈 DNA 및 검출 가능한 제2 표지물질로 표지한 표준 DNA를 동일비율로 혼합반응시키는 단계, 및
(b) 상기 프로브와 검체 DNA와의 혼성화 정도를 측정하여, 이를 표준 DNA와의 혼성화 정도와 비교하는 단계를 포함한다.
이를 보다 상세히 설명하면 하기와 같다.
상기 단계 (a)에서, 검체 게놈 DNA 는 검체 시료로부터 통상의 방법 또는 공지된 키트를 이용하여 추출할 수 있으며, 바람직하게 검체 게놈 DNA는 100 ng 내지 1 ug 로 준비할 수 있다.
상기 추출된 검체 DNA 와 표준 게놈 DNA는 랜덤 프라이밍을 통하여 각각 서로 다른 표지물로 표지시켜, 표지된 검체 및 표준 게놈 DNA를 수득할 수 있다. 일예로, 검체 게놈 DNA는 Cy3(푸른색)로 표지하고, 표준 게놈 DNA는 Cy5(붉은색)로 표지가능하다. 상기 표지된 검체 및 표준 게놈 DNA는 1:1 중량비로 혼합한 후 그 혼합물을 마이크로어레이에 처리하여 반응시킨 후 세척할 수 있다.
마이크로어레이에 처리하는 혼합물의 DNA 양은 200 ng 내지 2 ug 일 수 있으며, 처리시 혼합물은 혼성화 완충액에 현탁하여 처리할 수 있다. 혼성화 완충액은 공지의 용액을 포함한다. 또한 BAC 칩은 혼합물 처리 이전 단계로, 비특이적 혼성화를 방지할 수 있는 물질, 예컨대 연어 정자 DNA를 반응시킬 수 있다.
상기 단계 (b) 는, 혼성화 반응이 완료된 마이크로어레이를 표지물질의 검출가능한 스캐너에 넣어 스캔한 후, 마이크로어레이 상에 올려진 프로브 정보 및 스팟 위치가 입력된 프로그램을 이용하여 혼성화 여부를 분석함으로써 수행할 수 있다.
상기 혼성화 비율 측정 결과에서, 검체 DNA의 혼성화 비율이 표준 DNA의 혼성화 비율과 동일한 경우 염색체 이상은 없는 것으로 판독하고, 검체 DNA의 혼성화 비율이 표준 DNA의 혼성화 비율보다 높을 경우 염색체 증가가 있는 것으로 판독하고, 검체 DNA의 혼성화 비율이 표준 DNA의 혼성화 비율보다 낮을 경우 염색체 결손이 있는 것으로 판독함으로써 검체 DNA의 염색체 이상을 검출할 수 있다.
예컨대, 검체의 염색체가 정상인 경우 프로브에 혼성화된 검체 및 표준 게놈 DNA 비율은 1:1이므로, 스팟이 노란색을 나타내게 된다. 또한, 검체의 염색체가 증폭된 변이를 갖는 경우, 프로브에 검체가 표준 게놈 DNA에 비하여 높은 비율로 혼성화되어 스팟은 푸른색을 나타내게 된다. 또한, 검체의 염색체가 결손된 변이를 갖는 경우, 프로브에 표준 게놈 DNA가 검체에 비하여 높은 비율로 혼성화되어 스팟은 붉은색을 나타낸다.
따라서, 마이크로어레이 상의 각 스팟의 형광을 확인하여, 검체의 특정 DNA의 증폭 또는 결손 변이를 검출할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는, BAC 라이브러리에서 1440 개의 클론을 선별하고 상기 클론으로터 수득한 게놈 DNA 단편을 점적한 마이크로어레이를 제작한 후, 검체 시료에 포함된 각 염색체의 log2(T/R) 값을 측정하여 평균값(chromo-mean) 및 평균도표(chromo-mean graph)로부터 각 염색체의 증폭(addition) 또는 결실(deletion)을 여부를 판별해 보았다. 또한, 안젤만 증후군 유전자 중 총 2종의 BAC DNA(마크로젠) 및 2종을 모두 pooling한 DNA, 즉 표 1에 기재된 3종의 BAC DNA를 이용하여 log2(T/R)값을 측정한 결과, 안젤만 증후군의 임상 시료에서 모두 -0.25보다 낮은 값을 나타내었으므로 15q12 상의 유전자가 결실(deletion) 되었음을 확인할 수 있었다.
본 발명의 염색체 이상 검출방법은 신속하고 정확하게 안젤만 증후군 관련 염색체 이상을 검출함으로써 검체의 건강상태 및 질환여부를 쉽게 진단할 수 있도록 한다. 또한 본 발명의 방법에 의하여 염색체 이상이 엑손 부위 외에 인트론 부위에서 발생되는 경우까지 검출가능하며, 내인적 또는 외부적인 요인에 의한 게놈 변이 양상을 관찰할 수 있고, 나아가 인종 특이적 또는 사람 특이적 다양성(polymorphism)을 연구하는데 유용하다.
도 1은 pECBAC1 벡터의 개열지도이다.
도 2는 실시예 2의 BAC 칩의 구성을 나타낸 것이다.
도 3은 실시예 2의 BAC 칩에서 안젤만 증후군에 해당되는 특이적인 프로브 위치를 나타낸 것이다.
도 4는 안젤만 증후군 환자의 BAC 칩 분석결과를 나타낸 것이다.
도 5는 실험예 2의 BAC 칩에서 안젤만 증후군 클론의 구성을 나타낸 것이다.
도 6은 실험예 2의 BAC 칩에서 안젤만 증후군 클론별 분석결과를 나타낸 것이다.
도 2는 실시예 2의 BAC 칩의 구성을 나타낸 것이다.
도 3은 실시예 2의 BAC 칩에서 안젤만 증후군에 해당되는 특이적인 프로브 위치를 나타낸 것이다.
도 4는 안젤만 증후군 환자의 BAC 칩 분석결과를 나타낸 것이다.
도 5는 실험예 2의 BAC 칩에서 안젤만 증후군 클론의 구성을 나타낸 것이다.
도 6은 실험예 2의 BAC 칩에서 안젤만 증후군 클론별 분석결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예
1: 게놈 라이브러리의 제조 및
BAC
클론에 삽입된 게놈
DNA
의 동정
1-1. 게놈 라이브러리 제조
한국인의 게놈을 분리한 후 HindIII 효소(NEB(New Englanf BioLabs)) 처리와 PFGE(Pulsed-Field Gel Electrophoresis)를 통해 약 100Kb 정도의 DNA 조각을 얻었다. 평균 100Kb의 DNA 조각을 BAC 벡터에 결합 (ligation) 한 후 E. Coli 숙주 세포 (Invitrogen, DH10B)에 형질전환 (Transformation) 하였다. 여기서 각각의 DNA 조각을 포함하고 있는 E. Coli 세포주를 클론이라고 하며, 상기 게놈 라이브러리 제작을 통해 총 96,768 클론을 확보하였다.
1-1-1. 게놈 분리
한국인의 정액 20㎖에서 총 게놈 DNA를 추출한 후, 아가로스 젤상에 전기영동하여 추출된 DNA의 질과 양을 분석하였다.
1-1-2. 게놈의 단편화 및 정제
게놈 DNA를 BamHI(NEB(New Englanf BioLabs))으로 절단한 후 이를 PFG 젤에 전기영동한 후 100Kb 위치에 전개된 부분만을 취하여 DNA 조각들을 분리하였다.
1-1-3. 형질전환
DNA 조각들을 BAC 벡터(pECBAC1, Friijter et al, 1997)의 BamHI 절단위치에 삽입한 후, 이를 숙주세포(Competent cell, E.coli DH10B BAC, Invitrogen)에 형질전환시켰다. 이후 고체배지에서 배양하여 각각의 클론을 수득한 후 이를 다시 96웰 포맷 세포 배양 블럿에 1웰당 1클론을 접종하여 37℃ 회전배양기에서 18시간, 300rpm로 배양하였다.
1-1-4. 라이브러리 세포 원액 제조
384 웰 플레이트에 65% 글리세롤 25㎕를 나눠 담고, 96 웰 배양 블럿에서 배양한 세포 25㎕를 넣는다(4개의 96 웰 포맷 세포 배양 블럿에서 배양한 세포는 하나의 384 웰 플레이트에 모아져서 보관된다). 상기 384 웰은 상부를 봉하여 -70℃에 보관하였다.
1-2. 말단부 염기서열분석 (
End
-
sequencing
)
BAC 벡터에 특이적 프라이머(Specific primer)로 100Kb DNA 조각의 양쪽 끝 500bp를 분석하여, 각 클론별 삽입된 게놈 DNA 정보를 확인 및 기록하였다.
1-2-1. BAC DNA의 분리(Mini-prep.)
96 웰 배양 블럿에 1 X LB 1㎖을 넣고 라이브러리 세포 원액 2㎕을 접종한다. 이때, 348 웰 플레이트 하나에 보관되어 있는 세포는 96 웰 배양 블럿 4개에 나눠서 배양하였다. 회전배양기로 37℃, 18시간, 300 rpm으로 배양한 다음 각 웰 당 25㎕씩 5배수로 시료 원액을 제작하였다. 나머지는 원심분리(1000rpm, 15분)하여 세포를 수득하였다. Montage mini-prep. 키트 (Millipore)를 이용하여 DNA를 회수하였다.
1-2-2. 서열분석
T7 및 M13R 프라이머 (T7: 5'-TAA-TAC-GAC-TCA-CTA-TAG-GG-3' (서열번호: 4), M13R: 5'-CAG-GAA-ACA-GCT-ATG-ACC-3'(서열번호: 5))를 사용하여 각 클론에 삽입된 게놈 DNA 조각의 양 말단을 분석하여, ABL 3700 자동 서열분석기 (Applied Biosystems)로 염기서열을 판독하였다.
1-3. 생물정보학(
Bioinformatics
)을 이용한
상동성
분석
분석한 염기서열은 생물정보학 기술을 이용하여 인간 게놈 프로젝트에서 밝혀진 사람 전체 게놈 서열과 상동성을 비교하였다. 상기 과정을 통해 각 클론이 포함하고 있는 BAC DNA의 게놈상 위치와 전체 염기서열을 밝혔다.
1-3-1. Blast 검색
분석한 말단 서열을 이용하여 Blast 검색하였고, 상동성 분석으로 각 클론의 게놈 상의 위치를 확인하였다.
1-3-2. 유전자/마커 선별
게놈 라이브러리로부터 수득한 각 클론별 게놈 DNA 조각들 중, 암 관련 유전자/STS (Sequence-Tagged Site) 마커를 포함하는 클론을 선별하였다.
1-4.
BAC
클론의 지도제작(
BAC
Clone
mapping
by
FISH
)
각 BAC 클론의 게놈상의 위치를 보다 정확하게 확인하기 위해, 각 BAC 클론 내 포함된 게놈 DNA 조각을 프로브로 사용하여 FISH를 실시하였다. FISH 기법은 DNA의 상보적 결합의 원리를 이용한 것으로, 염색체의 특정 부위에만 특이적으로 결합하는 프로브를 유리 슬라이드 상에 고정되어 있는 염색체에 직접 결합시킴으로써 염색체 내 프로브의 위치를 확인한다. 확인된 BAC 클론별 게놈 DNA 단편들의 염색체 위치는 표 1에 나타낸 바와 같다.
실시예
2:
BAC
칩의 제조
2-1.
BAC
칩의 제작에 사용될 클론의 선별
사람의 염색체의 수적이상과 안젤만 증후군 등과 같은 특정 유전질환의 진단을 목적으로 BAC 라이브러리에서 각 염색체 번호 별로 1440 개의 클론을 선별하였다. 1440개의 클론은 표 2에 나타내었다.
상기 선별한 총 1440개의 게놈 DNA 단편 각각의 염색체 위치 및 총 크기는 하기 표 3에 나타내었다.
2-2. 클론으로부터 게놈
DNA
단편 분리
클로람페니콜 용액(100% 알코올 100 ㎖ + 클로람페니콜 340 mg) 400㎕가 함유된 1X LB(DIFCO, Cat. No 244620) 85 ㎖에 각 BAC 클론 원액 2 ㎕를 접종하였다. 37 ℃에서 15 시간동안 250 rpm으로 회전배양한 후, 6,000rpm, 4 ℃, 5분 원심분리하여 펠렛을 수득한 후, QUIAGEN-tip 100 (QIAGEN plasmid midi kit)을 사용하여 DNA를 추출하였다.
BAC DNA 1㎖중 850㎕는 초음파 분쇄하여 슬라이드 점적 DNA로 이용하고, 3㎕는 아가로스 젤상에 전기영동용으로 이용하였다. 또한 무작위로 선별된 일부 BAC DNA 20㎕는 PFG 전기영동(Pulse field gel electrophoresis) 검사용으로 이용하였다.
2-2-1. 아가로즈 젤 전기영동
분리한 BAC DNA를 확인하기 위하여, 증류수에 녹인 BAC DNA 3 ㎕를 취하여 Not I 제한효소(NEB(New Englanf BioLabs))로 처리하여 반응시키고, 0.85% 아가로스 젤에 전개시켰다. 전개양상을 확인하여 게놈 DNA 단편이 포함된 BAC DNA를 선별하였다.
2-2-2. PFG 전기영동(CHEFF 162-00133, BIO-RAD)
일회 BAC DNA 추출 단위인 48개의 BAC 클론중, 6개를 무작위로 선별하여 PFG 전기영동을 실시하였고, 6개 클론중 하나라도 불량이 나오면 일회 추출 분량인 48개의 BAC 클론을 다시 추출하였다.
2-3. 점적(
Spotting
)
1440개의 클론으로부터 수득한 게놈 DNA 단편을 마이크로어레이에 점적하였다. 본 실험에서는 도 3의 12개의 서브어레이를 이용하였으며, 각 서브어레이에는 360(30 x 12)개의 스팟이 있으며, 동일한 게놈 DNA 단편은 가로 방향으로 3회 점적하였다. 즉, 하나의 서브어레이에는 120가지(360/3)의 서로 다른 게놈 DNA 단편이 점적되어 있으며, 12개의 서브어레이에는 1440개의 게놈 DNA 단편이 존재한다. 각 서브어레이별 점적된 게놈 DNA 단편수 및 표적 염색체 번호는 하기 표 4에 나타내었다.
2-3-1. 시료 준비
BAC DNA 용액을 원심분리(12,000 rpm, 10 min) 한 후 상층액 850 ㎕를 회수하고, 하기 조건에서 초음파 분해를 실시하였다.
-초음파 분해 조건-
시간: 5초, 온도: 25℃, 펄스: 0.1/0.1
초음파 분해가 끝난 1440개의 BAC DNA 모두를 1% 아가로스 젤에 전기영동하여 초음파 분해가 제대로 이루어졌는지를 확인하였다. 초음파 분해된 DNA는 0.5Kb 내지 10Kb 위치에 분포하여야 한다. BAC DNA 용액은 SpeedVAC(SAVANT, AES2010-220)에서 농축/건조시킨 후, 증류수 45 ㎕에 용해시킨 후 혼합하여 점성을 확인하였다. 점성이 높은 시료는 초음파 분해를 반복실시하였다. 이후 점적 용액(100% DMSO, 1.2 ug/㎕ nitrocellulose) 45 ㎕을 첨가하고 384 플레이트(well당 30㎕)에 이동시킨다. 빈 칸에는 50% DMSO 30㎕로 채운다.
상기 준비한 시료는 1개월 이상 보관 시 -70℃에서, 그 이하 기간으로 보관하는 경우 -20℃로 보관한다. 사용전 해동하여 2000 rpm에서 1 분간 스핀 다운하여 사용한다.
2-3-2. 기판 준비
25 ㎜ x 75 ㎜ x 1 ㎜ 규격의 유리 기판을 준비하였다. 유리 기판은 아미노-실란 처리된 것이다.
2-3-3. 점적
GeneMachine MicroGrid100 (GeneAmchine) 혹은 Aushon 2470 Arrayer (Aushon biosystems)를 이용하여 기판(Corning, UltraGaps)의 스팟당 5 - 10 pg으로 점적하였다. 이때, 질소 실린더 수치는 103.4kPa 내지 137.9 kPa로 하고, 진공 펌프를 작동시켜 74.5kPa 내지 101.6kPa을 유지시켰다.
실험예
1: 유전자의
증폭 과
결손 이상 분석
안젤만 증후군 환자로부터 검체 세포를 수득하였으며, 이를 실시예 2의 BAC 칩에 반응시켰다.
1. 게놈 DNA 의 추출
혈액으로부터 시판되는 Gentra Puregene cell Kit (Qiagen, Cat. No 158745)를 이용하여 500 ng의 검체 DNA를 수득하였다. 또한 표준(reference) 세포 (GM10851, GM15510은 Coriell Institute, 그 외 나머지는 ATCC(미국세포은행))를 대상으로 동일한 방법으로 실시하여 표준 시료를 수득하였다.
2. 프로브 표지
검체와 표준 시료 각각은 무작위적 프라이밍 (Random priming)으로 Cy3 (Cy3-dCTP) 및 Cy5 (Cy5-dCTP) 각각으로 표지한 후, 바이오알앤디 사의 purification Kit로 정제하였다.
1) 표지
(1) 튜브에 DNA(검체 또는 표준 시료) 23ul (250ng) 을 취하여 넣고 2.5 X random reaction buffer 20ul을 첨가하였다.
(2) 튜브를 100 ℃의 열판 (heating block) 에서 5분간 끓인 후, 즉시 얼음 위에 5분간 방치하였다.
(3) 스핀다운 (spindown) 후 2mM dNTP 용액을 5ul씩 튜브에 첨가하였다 (2mM dNTP 용액 제조: 100mMdATP, dGTP, dTTP는 각각 20ul씩, dCTP 는 10씩 따고 여기에 TE 30ul를 넣어 서로 잘 섞어준다).
(4) 검체는 Cy3, 표준 시료는 Cy5를 각각 1.5ul씩 첨가하였다.
(5) 클레노우 단편(klenow fragment)을 0.5ul씩 첨가하였다.
(6) 피펫팅하여 고루 혼합한 후 스핀다운하여 37 ℃ 인큐베이터에서 반응시켰다.
2) 스핀컬럼을 이용한 정제 (바이오알앤디, DNA purification kit)
(1) 위의 반응액 50ul에 TE buffer 50ul 와 500ul의 PB (결합완충액)를 넣어주고 준비된 스핀컬럼 (spin column) 으로 점적하였다.
(2) 스핀컬럼을 11,000 rcf에서 1분간 원심분리하였다.
(3) 스핀컬럼에 안에 600ul의 PE (세척완충액) 를 넣어주었다.
(4) 스핀컬럼을 11,000 rcf에서 1분간 원심분리하였다.
(5) 2ml 튜브 안에 모인 용액을 버렸다.
(6) 스핀컬럼에 안에 200ul의 PE (세척완충액) 를 넣어주었다.
(7) 스핀컬럼을 11,000 rcf에서 1분간 원심분리하였다.
(8) 2ml 튜브 안에 모인 용액을 버렸다.
(9) 스핀컬럼에 EB (유출완충액) 50ul을 컬럼 안에 떨어뜨리고 3분간 상온에 방치하였다.
(10) 스핀컬럼을 11,000 rcf에서 1분간 원심분리하였다.
(11) EB 30ul을 컬럼안에 떨어뜨리고 3분간 상온에 방치하였다.
(12) 스핀컬럼을 11,000 rcf에서 1분간 원심분리하였다.
3) 에탄올 침전
(1) 검체 DNA (Cy3 labeling) 80ul, 대조 DNA (Cy5 labeling) 80ul, Cot I DNA 35ul, 3M 구연산나트륨 25ul, 차게한 100% 에탄올 500ul를 혼합하였다.
(2) -20 ℃에서 60 분간 방치하였다.
(3) 13,000rpm, 4 ℃에서 20분간 원심분리하였다.
(4) 원심분리 후 보라색 침전물이 생기며, 상층액을 제거하였다.
(5) 차가운 70% 에탄올 500ul를 섞어 준 후, 13,000rpm, 4 ℃에서 10분간 원심분리하였다.
(6) 상층액을 제거하고, 스핀다운 (spin down) 후 피펫으로 남은 에탄올을 제거하였다.
(7) 암실에서 10분간 방치하였다.
(8) 침전물에 어레이 혼성화 용액 33.3ul와 이스트 tRNA 용액 3.7ul를 첨가하였다. 30분 이상 암실 방치하면 침전물이 녹아서 보라색을 띄며 이를 프로브 검액으로 사용하였다.
3. 혼성화 반응
- BAC 칩 전처리 -
(1) 다이아몬드펜으로 BAC 칩의 위 아래를 표시하였다.
(2) 하이브리드 용액 30 uL에 연어 정자 DNA 10 uL를 첨가하였다.
(3) 혼합물을 70 ℃ 열판 (Heat Block) 에서 10분간 변성 (denaturation) 시킨 후 얼음에 5분간 박아놓았다.
(4) BAC 칩에 혼합물 40 uL을 로딩 (loading) 하고 습기가 있는 슬라이드 박스에 넣어 30분간 방치하였다.
(5) BAC 칩은 3차 증류수에 10초 동안 침지시켜서 2회 반복 세척하였다.
(6) BAC 칩은 이소프로판올로 세척한 후 550rpm에서 5분간 원심분리하여 슬라이드를 건조시켰다.
- 혼성화 -
(1) 보라색의 프로브 검액 37 ul를 70℃ 열판 (Heat Block) 에서 15분간 변성 (denaturation) 시킨 후, BAC 칩에 반응시켰다.
(2) 37 ℃ 인큐베이터에서 1시간 방치하였다.
(3) 하이브리드화 용액을 로딩하였다.
(4) 커버글라스를 20 X 40㎜로 덮었다.
(5) 슬라이드 박스에 넣고 약 5rpm의 진탕기 (shaker) 위에 놓았다. 온도 37℃, 습도 100%로 유지된 인큐베이터에서 48~72시간 동안 하이브리드화 시켰다.
-세척-
(1) 50% 포름아마이드 및 2X SSC을 포함하는 용액(pH7.3)을 46℃로 가하여 BAC 칩을 15분간 세척하였다.
(2) 2X SSC 및 0.1% SDS를 포함하는 46℃의 용액으로 30분간 세척하였다.
(3) PN 완충액(0.2M Na2HPO4(pH 9.0) 및 0.2M NaH2PO4(pH 4.3)를 포함하는 혼합액(pH 8.0) 100 mL, 증류수 100 mL 및 NP40 200 μL)을 실온에서 가하여 15분간 세척하였다.
(4) 2X SSC로 실온에서 5분간 세척하였다.
(5) 70%(v/v), 85%(v/v) 및 100%(v/v) 에탄올로 순차적으로 실온에서 1분간 세척하였다.
(6) 550rpm에서 5분간 원심분리하여 슬라이드를 건조시켰다.
4. 스캐닝과 분석
BAC 칩을 마이크로어레이 칩 분석장치(MAC VIEWER, 2등급, A661200)에 삽입하여 스캐닝하고, Cy3와 Cy5 필터를 통해 각각의 스캔 이미지를 얻었다. BAC 칩에 점적된 게놈 DNA 단편에 대한 정보가 입력된 BAC 칩 분석 프로그램(Macrogen)을 이용하여, 상기 스캔 이미지 결과를 분석하였다.
1) 스캐닝
가. 마이크로어레이칩분석장치의 사용 전 준비사항
마이크로어레이 칩 분석장치를 PCI가 내장된 PC에 연결한다.
PC의 권장사양은 다음과 같다:
- IBM 팬티움 III 이상
- Windows NT 4.0 또는 Windows 2000
- 768 MB RAM 이상
- 하드디스크 30 GB 이상
- 저장/재저장성 CD-ROM
- 1280 x 1024 디스플레이 시스템(16M colors)
스캔시, 채널을 cy3 및 cy5로 선택하고, 노출 시간은 1 sec을 사용하였다. 초점을 맞춘 후 스캔하고, 파일명을 명명하여 저장하였다.
2) 분석
스캔 파일을, BAC 칩에 대한 정보가 입력된 분석 소프트웨어인 BAC Chip Analysis Program (Macrogen)에서 실행시켜, Log Ratio Chart를 구하였다.
BAC 칩의 최종 실험 결과는 전체 상염색체(1번-22번)와 X, Y 성염색체를 고르게 포함하고 있는 1440개의 BAC 클론에 대한 log2 base T/R 값을 염색체의 순서대로 나타낸다.
상기 식 중, *은 시험 샘플에서의 DNA 복제수를 탐지할 수 있도록 사용된 형광 물질의 신호 정도로서, 상기 사용된 형광 물질은 DNA 검출에 사용 가능한 모든 형광물질일 수 있으며 (예컨대, Cy3 등), 신호 정도는 사용된 형광 물질의 신호 탐지에 통상적으로 사용되는 방법으로 측정된 값이고;
**는 정상 샘플에서의 DNA 복제수를 탐지할 수 있도록 사용된 형광 물질의 신호 정도로서, 상기 사용된 형광 물질은 DNA 검출에 사용 가능한 모든 형광물질 중에서 상기 시험 샘플에 사용된 것과 상이한 것일 수 있으며 (예컨대, Cy5 등), 신호 정도는 사용된 형광 물질의 신호 탐지에 통상적으로 사용되는 방법으로 측정된 값이다.
두 형광염료의 강도가 동일하면 0의 값, 검체의 형광강도가 강하면 0>0.2, 그리고 대조군의 형광강도가 강하면 0<0.2이 된다. 각 염색체의 log2 base T/R 값의 평균값(chromo-mean) 및 평균도표(chromo-mean graph)로부터 각 염색체의 증폭(addition) 또는 결실(deletion)을 여부에 따라 각 염색체의 수적인 변화를 판별하였다. 상염색체의 경우 검체와 대조군의 염색체수가 2개로 모두 동일하며 같은 형광강도를 가지기 때문에 염색체별 평균값(chromo-mean)이 0에 수렴하게 되며, 특정 염색체의 증폭이 있는 경우 해당 염색체의 평균값이 0.2 이상 증가하게 된다. 성염색체의 경우 염색체 수에 따라 상염색체와 동일한 양상을 보이나 검체의 성별을 고려하여 판단하였다. 대조군은 남성의 DNA를 사용하므로, 검체가 남성의 DNA인 경우 상염색체와 동일한 방법으로 판정하나, 검체가 여성의 DNA인 경우에는 Y 염색체의 평균값이 -0.4 미만으로 나타나고, X 염색체는 약 0.2이상 증가한다. 각 염색체의 수적이상 판정은 아래의 판정기준 표 5에 의한다.
또한 상기 질환 관련 클론의 log2 값이 약 0.2 보다 높은 경우 (T/R>0.2), 관련 질환 유전자의 증폭(addition)을 진단할 수 있고, 관련 clone의 log2 값이 약 0.2 보다 낮은 경우 (T/R<0.2), 관련 질환 유전자의 결실(deletion)을 판별 하였다. 상기 기준 수치는 다양한 유전자 복제수에 따른 DNA log2 값에 대한 실험에 의하여 얻어진 것이다
실험예
2: 유전자의
복제수
변화에 따른 증폭(
addition
) 또는 손실(
deletion
) 진단
안젤만 증후군 유전자 중 총 2종의 BAC DNA(마크로젠) 및 2종을 모두 pooling한 DNA, 즉 표 1에 기재된 3종의 BAC DNA를 이용하여 상기 실험예 1 과 동일한 방법으로 log2(T/R)값을 측정하였다.
상기 임상 시료 3가지는 모두 -0.25 보다 낮은 값으로, 안젤만 증후군에 해당되는 경우인데, 본 발명에서는 앞의 각각의 2 클론을 모두 합친 3 번째 DNA값이 가장 낮을 것을 확인하여 정확도의 효율을 높이는 측면에서도 각각의 클론을 pooling 하여 사용하였다.
실험결과
표 6 및 표 7, 그리고 도 4 내지 도 6은 안젤만 증후군에 대한 유전자의 증폭(addition) 또는 손실(deletion)의 이상 진단결과를 나타낸 것이다. 특히, X 염색체의 log2 T/R 값은 -0.021, Y 염색체의 log2 T/R 값은 -0.045 로 확인되어, 검체의 성별이 남성임을 확인할 수 있으며, 상염색체의 log2 T/R 값이 -0.2 내지 0.2 사이에 속하여 정상임을 알 수 있으나, 안젤만 증후군의 유전자는 모두 -0.25보다 낮은 값을 나타내고 있으므로 안젤만 증후군 유전자가 결실(deletion) 되었음을 알 수 있다.
| 번호 | BAC DNA명 | FISH로 확인한 염색체 위치 | 인간 게놈상에서의 위치 | 크기 (bp) | 참조 염기서열 | log2 (T/R) | ||
| 시작 | 끝 | |||||||
| 1 | #5948_BAC248 | 15q12 | 26,730,055 | 26,832,784 | 102,730 | NCBI Build 37.1 (August, 2009) |
-0.345 | |
| 2 | #4049_BAC21 | 15q12 | 26,878,318 | 27,002,755 | 124,438 | NCBI Build 37.1 (August, 2009) |
-0.442 | |
| 3 | AS | #5948_ BAC248 및 #4049_ BAC21의 pooled DNA | -0.515 | |||||
| BAC DNA명 | 플레이트_No. | Version | log2 (T/R) |
| AS 1) | R19-1 | Ver.37.1 | -0.6611 |
| AS | R19-2 | Ver.37.1 | -0.7857 |
| AS | R19-3 | Ver.37.1 | -0.3491 |
| AS | R19-4 | Ver.37.1 | -0.6067 |
| AS | R19-5 | Ver.37.1 | -0.6067 |
1) #5948_ BAC248 및 #4049_ BAC21의 pooled DNA
서열목록 전자파일 첨부
Claims (12)
- 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 군에서 선택된 염기서열로 구성된 게놈 DNA 단편; 및
상기 게놈 DNA 단편의 상보체
로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 프로브를 포함하는,
안젤만 증후군 (Angelman syndrome, AS) 진단용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 프로브는 상기 게놈 DNA 단편이 BAC(Bacterial Artificial Chromosome), HAC(Human Artificial Chromosome), TAC(Transformation competent Artificial Chromosome), YAC(Yeast ArtificialChromosome), PAC(P1-derived Artificial Chromosome), P1(phage) 및 코스미드(cosmid)로 이루어진 군으로부터 선택되는 벡터에 삽입되어 제조된 것인,
안젤만 증후군 진단용 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 프로브는 상기 게놈 DNA 단편이 BAC(Bacterial Artificial Chromosome)에 삽입되어 제조된 것인,
안젤만 증후군 진단용 조성물.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 안젤만 증후군 진단용 마이크로어레이.
- 제4항에 있어서, 상기 프로브는 스팟당 2 내지 100 pg 농도로 고정된 것인,
안젤만 증후군 진단용 마이크로어레이.
- 제4항에 있어서, 하나의 스팟에 1종 또는 2종 이상의 프로브가 고정된 것인,
안젤만 증후군 진단용 마이크로어레이.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 프로브를 마이크로어레이에 고정하는 단계를 포함하는,
안젤만 증후군 진단용 마이크로어레이의 제조방법.
- 제4항의 마이크로어레이를 포함하고,
상기 마이크로어레이 상에 고정된 프로브에, 검출 가능한 제1 표지물질로 표지한 검체 게놈 DNA 및 검출 가능한 제2 표지물질로 표지한 표준 DNA를 동일비율로 혼합시킨 혼합물을 반응시키고, 상기 검체 DNA 및 표준 DNA 각각의 혼성화 비율을 측정하여 그 결과로부터 검체 DNA의 염색체 이상 여부를 판단하는 것을 특징으로 하는,
안젤만 증후군 진단용 키트.
- 제8항에 있어서, 상기 제1 표지물질 및 제2 표지물질은 방사선 동위원소, 형광물질, 화학발광체 및 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 서로 다른 물질이거나 동일한 물질인,
안젤만 증후군 진단용 키트.
- 제8항에 있어서,
상기 검체는 침, 혈액, 소변, 정액 및 양수로 이루어진 군으로부터 선택되는 체액, 조직 또는 세포인,
안젤만 증후군 진단용 키트.
- (a) 제4항의 마이크로어레이에 고정된 프로브에, 검출 가능한 제1 표지물질로 표지한 검체 게놈 DNA 및 검출 가능한 제2 표지물질로 표지한 표준 DNA를 동일비율로 혼합시킨 혼합물을 반응시키는 단계, 및
(b) 상기 프로브와 검체 DNA와의 혼성화 정도를 측정하여, 이를 표준 DNA와의 혼성화 정도와 비교하는 단계를 포함하는,
안젤만 증후군 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
- 제11항에 있어서,
검체 DNA의 혼성화 비율이 표준 DNA의 혼성화 비율과 동일한 경우 염색체 이상은 없는 것으로 판독하고
검체 DNA의 혼성화 비율이 표준 DNA의 혼성화 비율보다 높을 경우 염색체 증가가 있는 것으로 판독하고,
검체 DNA의 혼성화 비율이 표준 DNA의 혼성화 비율보다 낮을 경우 염색체 결손이 있는 것으로 판독하여 검체 DNA의 염색체 이상을 검출하는 것을 특징으로 하는,
안젤만 증후군 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020110087387A KR101280817B1 (ko) | 2011-08-30 | 2011-08-30 | 안젤만 증후군 진단용 마이크로어레이 및 키트 |
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| KR20130024136A KR20130024136A (ko) | 2013-03-08 |
| KR101280817B1 true KR101280817B1 (ko) | 2013-07-02 |
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Citations (3)
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| US20110046009A1 (en) | 2009-08-24 | 2011-02-24 | Perkinelmer Health Sciences, Inc. | Methods for detecting dna methylation using encoded particles |
| KR20110060337A (ko) * | 2009-11-30 | 2011-06-08 | (주)멜파스 | 접촉 감지 패널의 제조 방법 |
-
2011
- 2011-08-30 KR KR1020110087387A patent/KR101280817B1/ko active IP Right Grant
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