KR100804423B1 - 울프-허쉬호른 증후군 진단용 마이크로어레이 및 키트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 염색체 이상, 특히 울프-허쉬호른(Wolf-hirschhorn) 증후군의 검정방법 및 마이크로어레이 칩에 관한 것이다. 본 발명의 염색체 이상 검출방법은 신속, 정확하게 염색체 이상을 검정함으로써 검체의 건강상태 및 질환 여부를 쉽게 진단할 수 있으며, 질환 특이적 염색체 이상을 확인할 수 있는 질환 진단용 표시자를 제공할 수 있다.

마이크로어레이, 칩, 게놈, 염색체 이상

Description

울프-허쉬호른 증후군 진단용 마이크로어레이 및 키트{MICROARRAY AND KIT FOR DIAGNOSING WOLF-HIRSCHHORN SYNDROME}

도 1은 pECBAC1 벡터의 개열지도이다.

도 2a 내지 2h는 실시예 2의 BAC 칩에 사용된 프로브의 염색체내 위치를 나타낸 것이다.

도 3은 실시예 2의 BAC 칩의 구성을 나타낸 것이다.

도 4a 내지 4f는 실시예 2의 BAC 칩에서 각 염색체에 특이적인 프로브 위치를 나타낸 것이다.

도 5는 파타우 증후군 여성 질환자의 BAC 칩 분석결과를 나타낸 것이다.

도 6은 파타우 증후군 남성 질환자의 BAC 칩 분석결과를 나타낸 것이다.

도 7은 에드워드 증후군 남성 질환자의 BAC 칩 분석결과를 나타낸 것이다.

도 8은 에드워드 증후군 여성 질환자의 BAC 칩 분석결과를 나타낸 것이다.

도 9는 다운 증후군 여성 질환자의 BAC 칩 분석결과를 나타낸 것이다.

도 10은 21번 염색체가 증폭되어 있으며, X 염색체가 하나 더 증폭된 핵형 XXY을 갖는 여성의 BAC 칩 분석결과를 나타낸 것이다.

도 11은 터너 증후군 질환자의 BAC 칩 분석결과를 나타낸 것이다.

도 12는 클라인펠터 증후군 질환자의 BAC 칩 분석결과를 나타낸 것이다.

도 13은 정상 여성의 BAC 칩 분석결과를 나타낸 것이다.

도 14는 정상 남성의 BAC 칩 분석결과를 나타낸 것이다.

도 15는 다운증후군 여성 질환자의 BAC　칩 분석결과를 나타낸 것이다.

[발명이 속하는 기술분야]

본 발명은 염색체 이상, 특히 울프-허쉬호른(Wolf-hirschhorn) 증후군의 검정방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 신속, 정확하게 염색체 이상을 검정함으로써 검체의 건강상태 및 질환 여부를 쉽게 진단할 수 있으며, 질환 특이적 염색체 이상을 확인하여 질환 진단용 표시자를 제공할 수 있는 염색체 이상 검출방법에 관한 것이다.

[종래기술]

염색체 이상은 유전자 장애 및 퇴행성 질환과 연관되며, 개별 염색체의 결손 또는 중복, 염색체 일부분의 손실 또는 중복, 염색체 끊어짐(break), 역위 및 전좌 등을 나타낸다. 염색체 이상은 생물체의 유전자 균형을 흩트려, 태아 사망 또는 심각한 정신적, 육체적 결합을 야기한다. 일예로 다운 증후군은 염색체 21번이 3 배수로 존재하여 야기된 것으로, 대표적인 염색체 수 이상 질환이다. 그 외에도 에드워드 증후군(18+), 파타우 증후군(13+), 터너 증후군(XO) 및 클라인펠터 증후군(XXY)가 염색체 수 이상 질환에 속한다.

염색체 이상은 핵형분석(Karyotype) 및 FISH(Fluorescent In Situ Hybridization)으로 진단된다. 상기 방법들은 정확성에 비해, 시간과 노동이 많이 소요되며, 특히 핵형분석은 세포 배양 시간이 요구되는 단점이 있다. 또한 FISH는 분석대상이 기존에 염기서열 및 염색체내 위치 특성 등이 밝혀진 것에만 한정되는 단점이 있다. 상기한 FISH의 단점을 해결한 방법으로 게놈 혼성화 비교법(comparative genome hybridization; CGH)이 있다. CGH는 전체 게놈을 분석하여 염색체 수 이상을 나타낸 부위를 검출한다. 그러나 CGH는 FISH에 비하여 해상도가 낮은 단점이 있다.

다른 방법으로, DNA 마이크로어레이 시스템을 사용할 수 있다. DNA 마이크로어레이 시스템은 어레이상에 집적된 생분자(bio-molecules)에 따라 cDNA 마이크로어레이, 올리고뉴클레오타이드 마이크로어레이 및 게놈 마이크로어레이로 분류된다. cDNA 마이크로어레이 및 올리고뉴클레오타이드 마이트로어레이는 제작이 간편한 장점이 있으나 어레이 상에 고정가능한 프로브의 수적 한계, 과다한 프로브의 제작 비용 및 프로브 이외 부위에서의 염색체 이상을 검사하기 어려운 단점이 있다. 특히, 반면에 게놈 DNA 마이크로어레이는 프로브의 준비가 용이하며, 염색체의 광범위한 부분에서의 염색체 이상을 검사할 수 있으며, 염색체내 인트론 부위에서의 이상을 검사할 수 있다는 장점이 있으나, 기능 및 염색체상의 위치가 확인된 다수의 DNA 절편을 준비하기 어려운 단점이 있다.

한편, 게놈 DNA를 BAC (Bacterial Artificial Chromosome) 클론은 사람의 전체 게놈이 일정 크기로 삽입된 BAC 벡터를 포함하는 균주로, 각 균주는 하나의 사 람 DNA 절편을 포함하고 있어 삽입된 DNA의 염기서열 및 염색체상의 위치를 분석하므로써, 특정 염색체 부위의 DNA 절편에 대응되는 BAC 클론을 나열할 수 있다. 따라서, 특정 DNA 절편을 각 BAC 클론으로부터 용이하게 수득할 수 있는 장점이 있다.

상기 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명은 염색체 이상 검정용 게놈 DNA 마이크로어레이 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 하나의 스팟에 2종이상의 프로브가 고정된 마이크로어레이 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 사람 게놈 전체에 대한 염색체 이상 검정용 DNA 칩을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은, 다운 증후군, 파타우 증후군, 에드워드 증후군, 터너 증후군, 클라인펠터 증후군, ATR-16(alpha-thalassemia retardation) 증후군, CAT1A(Charcot-Marie-Tooth neuropathy 1A), 고양이울음 증후군, 디조지 증후군, HNPP(Hereditary Neuropathy with liability to presure palsies) 질환, 칼만 증후군, 밀러-디커 증후군, 프라더-윌리 증후군, 루빈스테인테이비 증후군, 스미스-마게네스 증후군, 스테로이드 설파타제 유전자 증후군, 윌리암스 증후군, 울프-허쉬호른 증후군 및 산전-산후 염색체 이상으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환에 대한 검정용 DNA 칩을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 염색체 이상 검출용 마이크로어레이를 이용한 염색체 이상 검출방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 염색체 이상 검출용 마이크로어레이를 이용한 염색체 수 질환의 진단방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 염색체 이상 검출용 마이크로어레이를 이용한 질환에 특이적인 염색체 이상을 검출하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은

(a) 생물체의 게놈 라이브러리로부터 수득한 클론들로부터, 각 클론에 삽입된 게놈 DNA 단편을 동정하는 단계,

(b) 염색체 이상 여부를 확인하고자 하는 대상 염색체 부위를 선정하는 단계,

(c) 상기 (a) 단계의 동정된 게놈 DNA 단편들 중, 상기 대상 염색체 부위를 검출할 수 있는 게놈 DNA 단편들을 프로브로 선택하는 단계로서,

상기 프로브는 염기서열내 반복서열 함유 비율이 최대 85 %이며 상기 프로브를 이루는 염기서열은 염색체내 단일 위치성(single locus)을 포함하며 상기 프로브는 상기 대상 염색체 부위의 전체, 일부 또는 이들의 상보체 서열을 포함하며 및

(d) 상기 프로브를 마이크로어레이에 고정하는 단계를 포함하는 염색체 이상 검출용 게놈 DNA 마이크로어레이 제조방법을 제공한다.

또한 본 발명은 RNA 단편, cDNA 단편, 올리고머 및 게놈 DNA 단편으로 이루 어진 군으로부터 선택되는 프로브를 마이크로어레이에 고정하는 단계를 포함하는 마이크로어레이 제조방법으로서, 상기 마이크로어레이는 하나의 스팟당 2종 이상의 프로브를 포함하며, 상기 하나의 스팟에 고정되는 2종이상의 프로브들은, 염색체 수 이상 질환에서 동일한 유전자 표현형을 나타내는 염색체 부위의 전체, 일부분 및 이들의 상보체로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하며 상기 유전자 표현형은 유전자 증폭 또는 유전자 결손인 마이크로어레이 제조방법을 제공한다.

또한 본 발명은 인간 게놈 유전자로부터 선택된 1종이상의 게놈 DNA 단편, 상기 단편내 연속된 20 내지 100 bp의 1종이상의 올리고머, 또는 상기 단편으로부터 유래된 100 bp 내지 10 kbp의 1종이상의 cDNA가 고정된 마이크로어레이를 포함하는 사람 게놈 전체에 대한 염색체 이상 검정용 DNA 칩을 제공한다.

또한 본 발명은, 다운 증후군, 파타우 증후군, 에드워드 증후군, 터너 증후군, 클라인펠터 증후군, ATR-16(alpha-thalassemia retardation) 증후군, CAT1A(Charcot-Marie-Tooth neuropathy 1A), 고양이울음 증후군, 디조지 증후군, HNPP(Hereditary Neuropathy with liability to presure palsies) 질환, 칼만 증후군, 밀러-디커 증후군, 프라더-윌리 증후군, 루빈스테인테이비 증후군, 스미스-마게네스 증후군, 스테로이드 설파타제 유전자 증후군, 윌리암스 증후군, 울프-허쉬호른 증후군 및 산전-산후 염색체 이상으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환에 대한 검정용 DNA 칩을 제공한다.

또한 본 발명은 (a) 염색체 이상 검출용 마이크로어레이를 제조하는 단계, (b) 상기 마이크로어레이상에 고정된 프로브에, 표지한 검체 게놈 DNA 및 표지한 표준 DNA를 동일비율로 혼합반응시키고, 상기 마이크로어레이상에 검체 DNA 및 표준 DNA 각각의 혼성화 비율을 측정하는 단계 및 (c) 상기 혼성화 비율의 측정 결과로부터 검체 DNA의 염색체 이상 여부를 판단하는 단계를 포함하는 염색체 이상 검출방법을 제공한다.

또한 본 발명은 (a) 게놈 DNA단편내 연속된 20 내지 100 bp를 포함하는 프로브를 선택하여 이를 마이크로어레이상에 고정하는 단계로서,

상기 게놈 DNA 단편은 하기 표 1에 기재된 DNA 들로부터 선택되며

상기 프로브는 염기서열내 반복서열 함유 비율이 최대 85%이며

상기 프로브를 이루는 염기서열은 염색체내 단일 위치성(single locus)을 포함하며

(b) 상기 마이크로어레이상의 DNA 층에, 검출가능한 제일 표지물질로 표지된 검체 게놈 DNA 및 검출가능한 제이 표지물질로 표지된 표준 DNA를 동일비율로 혼합반응시키고, 상기 마이크로어레이상에 검체 DNA 및 표준 DNA 의 혼성화 비율을 측정하는 단계 및

(c) 상기 혼성화 비율의 측정 결과로부터, 검체 DNA의 혼성화 비율이 표준 DNA의 혼성화 비율과 동일한 경우 염색체 이상은 없는 것으로 판독하고, 전자가 후자에 비하여 높을 경우 염색체 증가가 있는 것으로 판독하고, 전자가 후자에 비하여 낮을 경우 염색체 결손이 있는 것으로 분석하는 단계를 포함하는 염색체 이상 검출방법을 제공한다.

또한 본 발명은 (a) RNA 단편, cDNA 단편, 올리고머 및 게놈 DNA 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로브를 마이크로어레이에 고정하는 단계로서,

상기 마이크로어레이는 하나의 스팟당 2종 이상의 프로브를 포함하며,

상기 하나의 스팟에 고정되는 서로 다른 서열을 같는 프로브들은 염색체 수 이상 질환에서 동일한 유전자 표현형을 나타내는 염색체 부위의 전체, 일부분 및 이들의 상보체로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하며

상기 유전자 표현형은 증폭 또는 결손이며

(b) 상기 제조한 마이크로어레이에, 검출가능한 제일 표지물질로 표지된 검체 시료 및 검출가능한 제이 표지물질로 표지된 표준 시료를 동일비율로 혼합반응시키고, 상기 마이크로어레이상의 검체 시료 및 표준 시료의 혼성화 비율을 측정하는 단계 및

(c) 상기 측정 결과, 검체 시료 및 표준 시료의 혼성화 비율이 동일할 경우 염색체 이상은 없는 것으로 판독하고, 전자가 후자에 비하여 높을 경우 염색체 증폭이 있는 것으로 판독하고, 전자가 후자에 비하여 낮을 경우 염색체 결손이 있는 것으로 분석하여 검체 시료의 염색체 이상을 판단하는 단계 를 포함하는 염색체 수 이상 질환의 진단방법을 제공한다.

또한 본 발명은 (a) 생물체의 게놈 라이브러리로부터 수득한 각 클론으로부터, 상기 클론에 삽입된 게놈 DNA 단편을 동정하는 단계, (b) 상기 (a) 단계에서 동정한 게놈 DNA 단편들 전체 또는 일부를 마이크로어레이에 고정시키는 단계, (c) 상기 마이크로어레이에 고정된 프로브에, 질환성 환자의 검출가능한 제일 표지물질로 표지된 검체 게놈 DNA 및 검출가능한 제이 표지물질로 표지된 표준 DNA를 동일 비율로 혼합반응시키고, 검체 DNA 및 표준 DNA의 혼성화 비율을 측정하는 단계 및 (d) 상기 혼성화 비율을 분석하여, 질환성 환자의 염색체 이상을 나타내는 부위 및 염색체 이상 형태를 확인하는 단계를 포함하는 질환에 특이적인 염색체 이상을 검출하는 방법을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서 언급하는 "생물체"는 식물, 곤충, 동물 또는 사람을 의미한다.

본 발명에서 언급하는 "게놈 DNA 마이크로어레이"는 생물체의 게놈 DNA 절편이 고정된 마이크로어레이다. 게놈 DNA 마이크로어레이는, 게놈 라이브러리를 구성하는 각각의 클론으로부터 각각 분리 또는 증폭시켜 수득한 생물의 게놈 DNA 단편을 프로브로 사용할 수 있다.

본 발명에서 언급하는 "클론"은 생물의 전체 게놈의 단편을 포함하는 벡터로 형질전환된 세포주를 의미한다. 상기 벡터 및 세포주는 통상의 게놈 DNA 라이브러리 제조시 사용되는 벡터 및 세포주이며, 대표적인 벡터로는 BAC(Bacterial Artificial Chromosome), HAC(Human Artificial Chromosome), TAC(Transformation competent Artificial Chromosome), YAC(Yeast Artificial Chromosome), Pac(P1-derived Artificial chromosome), P1(Phage) 및 코스미드(cosmid)가 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. BAC 벡터의 예로는 pECBAC1와 pBeloBACII가 있으며 PAC 벡터의 예로는 pCYPAC1가 있으며, YAC 벡터의 예로는 pYAC4가 있으며, 코스미드의 예로는 SuperCos-1가 있으며, P1 벡터의 예로는 pAd10sacBII가 있다. 상기 벡터의 숙주로는 각 벡터에 따라 적절히 선택하여 사용할 수 있으며, 일예로 E.coli, 효 모, 바이러스가 있다. 상기 게놈 라이브러리 및 클론은 통상의 방법에 따라 제조될 수 있다.

본 발명에서 언급하는 "프로브"는 마이크로어레이상에 고정되어, 시료내 함유된 상동의 DNA와 혼성화되는 것으로, DNA, RNA, cDNA 또는 mRNA일 수 있으며, DNA의 경우 올리고머일 수도 있다. 프로브는 염기서열내 반복서열 함유비율이 최대 85%일 수 있으며, 바람직하기로는 최대 70%, 더욱 바람직하기로는 최대 50 %, 가장 바람직하기로는 최대 40%일 수 있다. 프로브의 크기는 게놈 DNA인 경우 10 내지 350 kb 일 수 있으며, 올리고머인 경우 20 내지 300 bp, 바람직하기로는 20 내지 100 bp이며, cDNA 또는 RNA인 경우 100 bp 내지 10 kb일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 프로브는 염기서열이 생물체의 전체 염색체에서 단일 위치성(single locus)을 포함하는 것이 바람직하다.

마이크로어레이

본 발명에 따른, 마이크로어레이는 RNA 단편, cDNA 단편, 올리고머 및 게놈 DNA 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로브를 마이크로어레이에 고정하는 단계를 포함하는 방법으로 제조될 것일 수 있다. 상기 마이크로어레이는 하나의 스팟당 1종 또는 2종 이상의 프로브를 포함하며, 상기 하나의 스팟에 고정되는 2종이상의 프로브들은, 염색체 수 이상 질환에서 동일한 유전자 표현형을 나타내는 염색체 부위의 전체, 일부분 및 이들의 상보체로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함할 수 있으며, 상기 유전자 표현형은 유전자 증폭 또는 유전자 결손일 수 있다.

상기 프로브는 게놈 DNA 단편일 수 있으며, 상기 게놈 DNA 단편으로부터 유래한 RNA 단편, cDNA 단편 또는 올리고머일 수 있다. 프로브는 마이크로어레이의 목적에 따라 적절한 종류를 선택하여 사용한다. 마이크로어레이는 통상의 마이크로어레이 제조방법과 동일한 방법으로 실시될 수 있다. 일실시예로, 프로브는 마이크로어레이용 기판에 물리적 결합 또는 화학적 결합을 통하여 고정시킨다. 상기 기판은 공지된 모든 종류의 물질일 수 있으며 바람직하기로는 통상의 마이크로어레이에서 사용되는 물질일 수 있으며, 상기 기판표면에 DNA를 고정시킬 수 있는 반응기나 나이트로셀룰로스 또는 3차 구조형성물이 더욱 포함된 것일 수 있다. 그 예로는 실리콘 웨이퍼, 유리, 폴리카보네이트, 막(membrane), 폴리스티렌 또는 폴리우레탄과 같은 고분자 필름 및 다공성 물질이 있다.

프로브의 고정은, 통상의 DNA 마이크로어레이 제조방법에서 취하는 방법을 통하여 실시할 수 있으며, 예컨대 포토리소그래피(photolithography) 방법, 압전 인쇄(piezoelectric printing) 방법, 마이크로 피펫팅 또는 스폿팅(spotting) 등의 방법을 사용할 수 있다.

프로브는 마이크로어레이상의 하나의 스팟당 2 내지 100 pg으로 고정될 수 있으며, 스팟당 동일한 염기서열로 이루어진 1종의 프로브를 고정시키거나 2종이상의 프로브를 혼합하여 고정시킬 수 있다. 또한 마이크로어레이 상의 스팟은 1배수 이상일 수 있으며, 바람직하기로는 2 내지 3배수로 구성될 수 있다. 이때 스팟은 원형일 수 있으며, 직경 50 내지 500 um, 스팟간 간격은 10 내지 500 um 일 수 있다. 그러나 스팟의 크기 및 조밀도는 마이크로어레이 분석 시스템의 해상도에 따 라 적절히 조절하는 것이 좋다.

본 발명의 마이크로어레이는 마이크로웰 플레이트, 예컨대 96웰 플레이트의 웰에 위치시켜, 기존의 96웰 플레이트를 이용한 자동장비(예, Biomek, Genetix robo)로 시료 분지, 표지, 혼성화 및 세척과정을 기계적으로 처리할 수 있다.

게놈 DNA 단편

게놈 DNA 단편은, 생물체의 전체 염색체로부터 목적한 크기 및 목적한 염기서열을 포함하는 형태로 수득하거나, 생물체의 게놈 라이브러리로부터 클로닝하거나 또는 화학적으로 합성할 수 있다.

게놈 DNA 단편의 크기는 게놈 DNA 마이크로어레이의 분석 해상도에 따라 조절될 수 있으나, 평균 100 내지 350 kb의 크기를 갖는다. 전체 염색체 상에서 일어나는 염색체 이상의 최소변화인 Micro-deletion이 1Mb인 것을 감안하면, 평균 100 내지 350 kb 크기의 게놈 DNA로 이루어진 본 발명의 BAC 칩은 염색체 이상 분석시 매우 높은 해상도를 구현시킬 수 있음은 자명한 일이다.

본 발명에 언급된 인간 게놈 유전자는 공개된 데이터베이스, 예컨대 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST 사이트, 특히 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi?CMD=Web&LAYOUT=TwoWindows&AUTO_FORMAT=Semiauto&ALIGNMENTS=50&ALIGNMENT_VIEW=Pairwise&CLIENT=web&DATABASE=nr&DESCRIPTIONS=100&ENTREZ_QUERY=%28none%29&EXPECT=10&FILTER=L&FORMAT_OBJECT=Alignment&FORMAT_TYPE=HTML&NCBI_GI=on&PAGE=Nucleotides&PROGRAM=blastn&SERVICE=plain&SET_DEFAULTS.x=34&SET_DEFAULTS.y=8&SHOW_OVERVIEW=on&END_OF_HTTPGET=Yes&SHOW _LINKOUT=yes&GET_SEQUENCE=yes 에서 각각의 게놈 DNA 염기서열을 확인할 수 있다.

상기 공지된 인간 게놈 라이브러리로부터 수득한 게놈 DNA 단편은 본 발명의 게놈 DNA 마이크로어레이에 프로브로 제공될 수 있다. 상기 게놈 DNA 마이크로어레이는, 염색체 이상 진단의 대상이 되는 생물의 전체 게놈에 모두 대응될 수 있는 개수의 게놈 DNA 단편을 포함하거나, 염색체 이상을 검정하고자 하는 부위 또는 목적 유전자에 대응되는 게놈 DNA 단편을 포함한다. 생물의 전체 게놈에 대한 염색체 이상을 진단하고자 하는 경우, 게놈 DNA 단편 수는 생물 게놈의 크기를 게놈 DNA 단편 크기로 나누어 산출할 수 있다. 예컨대, 사람을 대상으로 한 염색체 이상 게놈 DNA 마이크로어레이의 경우, 사람 게놈 크기 3 x 10⁹bp를 평균 100 내지 350 kb의 게놈 DNA 단편으로 나누어 보면, 약 30,000 내지 8571개의 게놈 DNA 단편 또는 클론이 요구된다. 게놈 DNA 단편의 크기가 클수록 요구되는 게놈 DNA 단편 수 또는 클론의 수는 감소된다. 상기 게놈 DNA 단편은 사람의 전체 게놈을 모두 포함한다.

게놈 라이브러리

게놈 라이브러리는 공지의 방법으로 용이하게 제조가능하다. 일실시예로, 사람 BAC DNA의 경우, BAC 라이브러리 제작, BAC 클론내 삽입된 BAC DNA의 일부 서열분석, 상기 서열과 동정된 사람 게놈 서열과의 상동성 분석을 통한 BAC DNA의 위치 및 전체 염기서열 확인, FISH((Fluorescent In Situ Hybridization)를 이용한 BAC DNA의 지놈상 위치 재확인 및 각 BAC 클론으로부터 BAC DNA 회수의 단계를 통 하여 BAC DNA를 수득할 수 있다. 각 단계를 더욱 상세히 설명하면 하기와 같다.

(1) 게놈 라이브러리 제작

인종별 사람의 게놈을 분리한 후 제한효소(Restriction enzyme), 예컨대 HindIII, BamHI 및/또는 초음파분쇄(sonication)를 처리하여 절단하고 PFGE(Pulse Field Gel Electrophoresis)를 통해 평균 100 내지 350 Kb 크기의 DNA 조각을 수득한다. 이는 동일 제한효소로 처리된 BAC , PAC, P1, YAC 또는 코스미드 벡터에 삽입시킨 후 숙주세포, 예컨대 E. Coli에 형질전환시킨다. 상기 방법으로 제조된 각 사람 게놈 DNA 조각을 포함하고 있는 세포주를 클론이라 한다. 본 발명자는 상기 방법으로 총 96,768 클론을 제작하였다.

(2) 삽입된 게놈 DNA 단편의 위치 및 전체 염기서열 확인

각 클론에 존재하는 게놈 DNA 단편은 바이오인포메틱스를 이용한 상동성 분석으로, 이미 염기서열이 공지된 사람 게놈의 서열과 상동성 분석을 실시한다. 이때 사용가능한 상동성 분석 데이터베이스는 NCBI, UC Santa Cruz, 및 Sanger Institute 가 있다.

상동분석을 위하여, 먼저 클론에 형질도입한 벡터에 특이적인 프라이머로 말단 서열분석(end-sequencing)하여 삽입된 게놈 DNA 단편의 양 말단 서열을 일부, 예컨대 100 내지 700 bp를 서열분석한다. 상기한 과정은 벡터의 염기서열 및 개열지도가 확인된 상태이므로 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자라면 용이하게 실시가능하다. 분석된 게놈 DNA 단편의 양 말단 서열을 사람 게놈 서열이 존재하는 데이터베이스에 입력하여 상동성 검색을 실시하고, 일치되는 부위를 확인하므로써 게놈 DNA 단편의 사람 게놈상의 위치 및 전체염기서열을 확인한다.

(3) FISH를 이용한 게놈 DNA 단편의 게놈상 위치 재확인

생략가능한 단계이나, 게놈 DNA 단편의 게놈상의 위치를 재확인하기 위하여 실시될 수 있다.

게놈 DNA 단편을 프로브로 사용하고, 여기에 형광표지한 후 이를 세포분열 중기단계의 사람 염색체에 반응시킨다. 형광표지 신호를 인식하여, 게놈 DNA 단편의 염색체상 결합부를 재확인한다.

(4) 클론으로부터 게놈 DNA 단편 회수

공지의 방법 또는 시판되는 게놈 DNA 회수키트를 이용하여 각 클론으로부터 게놈 DNA 단편을 회수한다.

상기의 단계를 통하여 각 클론별 삽입된 게놈 DNA 단편을 동정한다. 이에 각 클론별 게놈 DNA 단편의 특징, 즉 염색체내 위치, 염기서열, 이의 기능, 관련 유전자 또는 질환 정보를 정리하며, DNA 칩의 용도에 따라 적절한 게놈 DNA 단편을 선택하여 용이하게 준비할 수 있는 장점이 있다. 특히 특정 질환 진단용 칩을 제조하고자 하는 경우, 질환발병 또는 예후에 염색체 이상을 나타내는 것으로 확인 또는 추정되는 게놈 부위에 대응되는 게놈 DNA 단편만을 각각의 클론으로부터 용이하게 회수할 수 있다.

본 발명의 일실시예로, 한국인 게놈에 대한 BAC 라이브러리로부터 수득한 게놈 DNA 절편은 하기 표 1과 같다.

염색체 이상 검출용 게놈 DNA 마이크로어레이 제조

본 발명은 염색체 이상 검출용 DNA 마이크로어레이에 관한 것으로, 이의 제조방법은 (a) 생물체의 게놈 라이브러리로부터 수득한 클론들로부터, 각 클론에 삽입된 게놈 DNA 단편을 동정하는 단계, (b) 염색체 이상 여부를 확인하고자 하는 대상 염색체 부위를 선정하는 단계, (c) 상기 (a) 단계의 동정된 게놈 DNA 단편들 중, 상기 대상 염색체 부위를 검출할 수 있는 게놈 DNA 단편들을 프로브로 선택하는 단계, (d) 상기 프로브를 마이크로어레이에 고정하는 단계를 포함한다.

상기 (a) 단계에서, 상기 게놈 DNA 단편은 인간 게놈 DNA 단편으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택될 수 있으며, 바람직하기로는 염색체 이상을 확인하고자하는 목적 부위 또는 질환의 종류에 따라 적절한 게놈 DNA 단편을 선별하여 사용할 수 있다.

상기 (b) 단계에서, 상기 염색체 이상은 핵산 서열 변이, 염색체 수 증폭, 염색체 수 결손, 염색체 역위 및 염색체 전좌로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 바람직하기로는 염색체 수 이상이다. 염색체 수 이상 질환의 예로는 다운 증후군, 파타우 증후군, 에드워드 증후군, 터너 증후군, 클라인펠터 증후군, ATR-16(alpha-thalassemia retardation-16) 증후군, CMT1A(Charcot-Marie-Tooth neuropathy 1A) 증후군, 고양이울음(Cri-du-chat) 증후군, 디조지(Digeorge) 증후군, HNPP(Hereditary Neuropathy with Liability to Pressure palsies) 질환, 칼만(Kallmann) 증후군, 밀러-디커(Miller-Dieker) 증후군, 프라더-윌리(Prader-willi) 증후군, 루빈스테인-테이비(Rubinstein-taybi) 증후군, 스미스-마게네스(Smith-magenes) 증후군, 스테로이드 설파타제(Steroid-sulfatase) 유전자 증후 군, 윌리암스(Williams) 증후군 및 울프-허쉬호른(Wolf-hirschhorn) 증후군이 있다.

상기 (b) 단계에서, 대상 염색체 부위는 질환 특이적 변이성을 포함하는 부위, 예컨대 질환에 특이적인 염색체 수 증폭 또는 결손을 보이는 염색체 부위로, 이는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자라면 용이하게 채택할 수 있다.

상기 (c) 단계에서, 상기 대상 염색체 부위를 검출할 수 있는 게놈 DNA 단편들을 선별한다. 이때 게놈 DNA 단편의 염색체상 위치, 염기서열, 질병관련성 및 기능들을 분석하여, 적절한 게놈 DNA 단편을 선택한다. 바람직하기로는 염기서열내 반복서열 함유 비율이 최대 85 %이며, 게놈 DNA 단편을 이루는 염기서열이 염색체내 단일 위치성(single locus)을 가지는 것을 프로브로 선택하는 것이 좋다. 프로브는 상기 대상 염색체 부위의 전체, 일부 또는 이들의 상보체 서열을 포함할 수 있다.

상기 (d) 단계는, 선별한 프로브를 마이크로어레이용 기판에 고정하는 단계로, 이는 통상의 방법일 수 있다. 일예로, 프로브로 게놈 DNA 단편이 삽입된 게놈 DNA 라이브러리 벡터의 DNA 를 모두 사용할 수 있으며, 상기 게놈 DNA 단편이 삽입된 벡터 DNA 를 초음파 분쇄들의 방법으로 부분적으로 절단시킨 DNA 절편들을 상기 기판에 고정할 수 있다. 이러한 방법은 게놈 DNA 마이크로어레이 제조시에 통상적인 방법이므로 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자라면 용이하게 실시할 수 있다.

본 발명은 이하 일실시예로, 염색체 이상 질환별 마이크로어레이 또는 DNA 칩 구성을 예시한다.

울프 - 허쉬호른 (Wolf- hirschhorn ) 증후군

울프-허쉬호른 증후군은 핵형 deletion 4p16.3를 진단한다.

울프-허쉬호른 증후군 진단용DNA 칩은, 표 1의 1 내지 72 번으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종이상의 게놈 DNA 단편 또는 상기 단편내 연속된 20 내지 100 bp의 1종이상의 올리고머, 또는 상기 단편으로부터 유래된 100 bp 내지 10 kbp의 1종이상의 cDNA가 고정된 마이크로어레이를 포함한다. 2종 이상의 프로브를 혼합하여 사용하는 경우, 각 종류별 프로브를 동일비율로 혼합하여 하나의 스팟으로 고정시킬 수 있다.

[표 1]

또한, 본 발명은 일실시예로, 산전/산후 (constitutional diseases) 진단용 DNA 마이크로어레이를 제공한다. 산전/산후 진단용 DNA 마이크로어레이는 통상의 산전/산후 진단에 타겟이 되는 질환 또는 전체 염색체상의 변이 검출을 목적으로 하며, 각 질환에 관련된 염색체 부위를 검출할 수 있는 게놈 DNA 또는 상기 게놈 DNA로부터 유래한 올리고머, cDNA 또는 RNA를 프로브로 포함한다. 이때, 산전/산후 진단용 DNA 마이크로어레이는 하나의 어레이에 각 타켓 질환별 염색체 변이를 검출할 수 있는 프로브가 1종 내지 다수종 고정되어 있을 수 있다. 산전/산후 진단에 타겟이 되는 염색체 부위는 주로, 13, 18, 21, X 및 Y 로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 구체적인 질환으로는 파타우, 에드워드, 다운, 터너 및 클라인펠터가 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 게놈 DNA 마이크로어레이는 염색체 이상을 최소 250bp 단위로 검출할 수 있어 해상도가 매우 높으며, 기존의 핵형 분석 및 FISH 방법에 비하여 간편하다.

본 발명의 게놈 DNA 마이크로어레이는 삽입된 게놈 DNA 단편의 염색체내 위치 및 염기서열이 확인된 클론으로부터 게놈 DNA 칩의 목적에 따라 바람직한 게놈 DNA 단편을 다량으로 용이하게 확보할 수 있는 장점이 있으며, 생물의 게놈상의 염색체 이상을 용이하게 검출할 수 있으며, 염색체 이상이 엑손 부위이외 인트론 부위에서 발생되는 경우까지 검출가능하며, 검출된 염색체 이상으로부터 특정 질환과의 관련성을 예시할 수 있으며, 내인적 또는 외부적인 요인에 의한 생물의 게놈 변이 양상을 관찰할 수 있으며, 각 질환 특이적 진단 칩을 용이하게 제공할 수 있으며, 인종 특이적 또는 사람 특이적 다양성(polymorphism)을 연구하는데 매우 유용하다.

본 발명의 게놈 DNA 마이크로어레이는 염색체 변이에 의한 질환을 진단할 수 있으며, 특히 염색체 수 이상에 의한 질환 및 암을 진단하는데 매우 유용하다.

하나의 스팟당 2종이상의 프로브가 고정된 마이크로어레이

본 발명은 1 스팟당 2종이상의 프로브가 혼합고정된 마이크로어레이에 관한 것이다. 1 스팟에 혼용되는 프로브의 비율은 각 종류별 동일비율일 수 있으며, 그 대상은 RNA 단편, cDNA 단편, 올리고머 및 게놈 DNA 단편으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 하나의 스팟에 고정되는 2종이상의 프로브들은, 염색체 수 이상 질환에서 동일한 유전자 표현형을 나타내는 염색체 부위의 전체, 일부분 및 이들의 상보체로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하며, 상기 유전자 표현형은 유전자 증폭 또는 유전자 결손일 수 있다. 상기 게놈 DNA는 인간 게놈 유전자 단편으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, RNA 단편, cDNA 단편 또는 올리고머 역시 상기 게놈 DNA로부터 유래된 것일 수 있다.

마이크로어레이를 이용한 염색체 이상 검출방법

본 발명의 염색체 이상 검출방법은 염색체 이상 검출용 마이크로어레이를 제조하고, 상기 마이크로어레이상에 고정된 프로브에, 검출가능한 제일 표지물질로 표지된 검체 게놈 DNA 및 검출가능한 제이 표지물질로 표지된 표준 DNA를 동일비율로 혼합반응시키고, 상기 마이크로어레이상에 검체 DNA 및 표준 DNA 각각의 혼성화 비율을 측정한 다음, 상기 혼성화 비율의 측정 결과로부터 검체 DNA의 염색체 이상 여부를 판단하는 것을 포함한다. 상기 혼성화 비율에서, 검체 DNA의 혼성화 비율이 표준 DNA의 혼성화 비율과 동일한 경우 염색체 이상은 없는 것으로 판독하고, 전자가 후자에 비하여 높을 경우 염색체 증가가 있는 것으로 판독하고 또는 전자가 후자에 비하여 낮을 경우 염색체 결손이 있는 것으로 분석할 수 있다.

상기 프로브는 게놈 DNA 단편, 올리고머, cDNA 또는 RNA 일 수 있으며, 게놈 DNA의 예로는 표 1의 기재된 게놈 DNA 단편이 있다.

상기 검체는 사람 또는 동물로부터 수득한 생체시료, 예컨대 체액 (예 침, 혈액, 소변, 정액, 양수 등), 조직 또는 세포일 수 있으며, 상기 생체시료로부터 통상의 방법으로 DNA를 추출 및 분리할 수 있다.

상기 제일 표지물질 및 제이 표지물질은 동일하거나 서로다른 물질일 수 있으며, 예컨대 서로 독립적으로 형광물질, 방사능동위원소, 화학발광체 또는 효소일 수 있다. 그 예로는 Cy3, Cy5, Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 658, 시아닌(Cyanine)-3, 시아닌-5, 플루오레세인(fluorescein), 보디피(bodipy), 텍사스 레드(Texas red), FITC(Fluorescein Isothiocyanate), 로다민(rhodamine), d-NTP (including d-UTP), 아미노-알릴 수정된 dNTPs를 갖는 반응성 염료, 양고추냉이 과산화효소, 바이오틴 등이 있다.

이를 보다 상세히 설명하면 하기와 같다.

단계 1: 검체 시료(게놈 DNA) 추출

시료로부터 통상의 방법 또는 공지된 키트를 이용하여 게놈 DNA를 추출한다. 검체 게놈 DNA는 100 ng 내지 1 ug 로 준비한다.

단계 2: 표지

검체와 표준 게놈 DNA는 랜덤 프라이밍을 통하여 각각 서로다른 표지물로 표 지시킨 후, 표지된 검체 및 표준 게놈 DNA를 수득한다.

일예로, 검체는 Cy3(푸른색)로 표지하고, 표준 게놈 DNA는 Cy5(붉은색)로 표지가능하다.

단계 3: 마이크로어레이 칩에 반응

표지된 검체 및 표준 게놈 DNA를 1:1 중량비로 혼합하고, 혼합물은 마이크로어레이에 처리하여 반응시킨 후, 세척한다.

마이크로어레이에 처리하는 혼합물의 DNA 양은 200 내지 2 ug 일 수 있으며, 처리시 혼합물은 혼성화 완충액에 현탁하여 처리될 수 있다. 혼성화 완충액은 공지의 용액을 포함한다. 또한 BAC 칩은 혼합물 처리 이전 단계로, 비특이적 혼성화를 방지할 수 있는 물질, 예컨대 연어 정자 DNA를 반응시킬 수 있다.

단계 4: 분석

반응이 완료된 마이크로어레이는 표지물질의 검출가능한 스캐너에 넣어 스캔한 후, 마이크로어레이 상에 올려진 프로브 정보 및 스팟 위치가 입력된 프로그램을 이용하여 혼성화 여부를 분석한다.

검체의 염색체가 정상인 경우, 프로브에 혼성화된 검체 및 표준 게놈 DNA 비율은 1:1이므로, 스팟이 노란색을 나타낸다.

검체의 염색체가 증폭된 변이를 갖는 경우, 프로브에 검체가 표준 게놈 DNA에 비하여 높은 비율로 혼성화되어, 스팟은 푸른색을 나타낸다.

검체의 염색체가 결손된 변이를 갖는 경우, 프로브에 표준 게놈 DNA가 검체에 비하여 높은 비율로 혼성화되어, 스팟은 붉은색을 나타낸다.

따라서, 마이크로어레이 상의 각 스팟의 형광을 확인하여, 검체의 특정 DNA의 증폭 또는 결손 변이를 검출할 수 있다.

질환에 특이적인 염색체 이상 검출방법

또한 본 발명은 질환에 특이적인 염색체 이상을 검출하는 방법에 관한 것으로, (a) 생물체의 게놈 라이브러리로부터 수득한 각 클론으로부터, 상기 클론에 삽입된 게놈 DNA 단편을 동정하는 단계, (b) 상기 (a) 단계에서 동정한 게놈 DNA 단편들 전체 또는 일부를 마이크로어레이에 고정시키는 단계, (c) 상기 마이크로어레이에 고정된 프로브에, 질환성 환자의 검출가능한 제일 표지물질로 표지된 검체 게놈 DNA 및 검출가능한 제이 표지물질로 표지된 표준 DNA를 동일비율로 혼합반응시키고, 검체 DNA 및 표준 DNA의 혼성화 비율을 측정하는 단계 및 (d) 상기 혼성화 비율을 분석하여, 질환성 환자의 염색체 이상을 나타내는 부위 및 염색체 이상 형태를 확인하는 단계 단계를 포함한다.

상기 방법으로, 각 질환별 염색체 이상여부 및 이상부위가 미확인된 경우, 질환특이적 염색체 이상을 용이하게 확인할 수 있다.

일실시예로, 사람 게놈의 BAC 라이브러리로부터 획득한 BAC 클론을 이용하여 BAC 칩을 제조한다. 이때 BAC 칩상을 구성하는 BAC DNA는 사람 게놈 전체에 대응되거나, 또는 특정 염색체 또는 유전자에 대한 것일 수 있다.

사람 게놈 전체에 대응되는 BAC DNA로 구성된 BAC 칩은 하기의 목적으로 사용가능하다.

(1) 검체의 게놈 전체에서 염색체 이상을 검출하여 검체의 건강 상태 및 검 출된 염색체 이상이 특정 질환과의 연과성이 밝혀진 경우 질환 진단에 사용된다.

(2) 특정 질환성 환자의 DNA를 검체로 사용하여 분석하므로써, 특정 질환과 연관성 있는 염색체 이상을 동정하고, 이를 추후 동일 질환 진단에 유용한 표시자로 사용한다.

(3) 특정 물질, 예컨대 약물 또는 화합물에 의해 야기되는 염색체 이상을 분석한다.

(4) 개체 또는 인종별 게놈 다양성을 확인한다.

특정 염색체 또는 유전자에 대한 BAC 칩은 타겟이 되는 부위에 대한 염색체 이상을 보다 세밀하게 검출하는데 사용될 수 있다.

이하 본 발명의 실시예를 기재한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: BAC 클론의 제조

1-1. 게놈 라이브러리 제조

한국인의 게놈을 분리한 후 HindIII 효소처리와 PFGE를 통해 약 100Kb 정도의 DNA 조각을 얻었다. 평균 100Kb의 DNA 조각을 BAC 벡터에 결합 (ligation) 한 후 E. Coli. 숙주 세포에 형질전환 (Transformation) 하였다. 여기서 각각의 DNA 조각을 포함하고 있는 E. Coli. 세포주를 클론이라고 하며, 상기 게놈 라이브러리 제작을 통해 총 96,768 클론을 확보하였다(도 1).

1-1-1. 게놈 분리

한국인의 정액 20㎖에서 총 게놈 DNA를 추출한 후, 아가로스 젤상에 전기영 동하여 추출된 DNA의 질과 양을 분석하였다.

1-1-2. 게놈의 단편화 및 정제

게놈 DNA를 BamHI으로 절단한 후 이를 PFG 젤에 전기영동한 후 100Kb 위치에 전개된 부분만을 취하여 DNA 조각들을 분리하였다.

1-1-3. 형질전환

DNA 조각들을 BAC 벡터(pECBAC1)의 BamHI에 삽입한 후, 이를 숙주세포(Competent cell, E.coli DH10B BAC)에 형질전환시켰다. 이후 고체배지에서 배양하여 각각의 클론을 수득한 후 이를 다시 96웰 포맷 세포 배양 블럿에 접종하여 37℃ 회전배양기에서 18시간, 300rpm로 배양하였다.

1-1-4. 라이브러리 세포 원액 제조

384 웰 플레이트에 65% 글리세롤 25㎕를 나눠 담고, 96 웰 배양 블럿에서 배양한 세포 25㎕를 넣는다(4개의 96 웰 포맷 세포 배양 블럿에서 배양한 세포는 하나의 384 웰 플레이트에 모아져서 보관된다). 상기 384 웰은 상부를 봉하여 -70℃에 보관하였다.

1-2. 말단부 염기서열분석 (End-sequencing)

BAC 벡터에 특이적 프라이머(Specific primer)로 100Kb DNA 조각의 양쪽 끝 500bp를 분석하여, 각 클론별 삽입된 게놈 DNA 정보를 확인 및 기록하였다.

1-2-1. BAC DNA의 분리(Mini-prep.)

96 웰 배양 블럿에 1 X LB 1㎖을 넣고 라이브러리 세포 원액 2㎕을 접종한다. 이때, 348 웰 플레이트 하나에 보관되어 있는 세포는 96 웰 배양 블럿 4개에 나눠서 배양하였다. 회전배양기로 37℃, 18시간, 300 rpm으로 배양한 다음 각 웰 당 25㎕씩 5배수로 시료 원액을 제작하였다. 나머지는 원심분리(1000rpm, 15분)하여 세포를 수득하였다. Montage mini-prep. 키트를 이용하여 DNA를 회수하였다.

1-2-2. 서열분석

T7 및 M13R 프라이머를 사용하여 각 클론에 삽입된 게놈 DNA 조각의 양 말단을 분석하여, ABL 3700 자동 서열분석기로 염기서열을 판독하였다.

1-3. 생물정보학(Bioinformatics)

분석한 염기서열은 생물정보학 기술을 이용하여 인간 게놈 프로젝트에서 밝혀진 사람 전체 게놈 서열과 상동성을 비교하였다. 상기 과정을 통해 각 클론이 포함하고 있는 BAC DNA의 게놈상 위치와 전체 염기서열을 밝혔다.

1-3-1. Blast 검색

분석한 말단 서열을 이용하여 Blast 검색하였고, 상동성 분석으로 각 클론의 게놈 상의 위치를 확인하였다.

1-3-2. 유전자/마커 선별

게놈 라이브러리로부터 수득한 각 클론별 게놈 DNA 조각들중, 암 관련 유전자/STS 마커를 포함하는 클론을 선별하였다.

1-4. BAC 클론의 지도제작(BAC Clone mapping by FISH)

각 BAC 클론의 게놈상의 위치를 보다 정확하게 확인하기 위해, 각 BAC 클론내 포함된 게놈 DNA 조각을 프로브로 사용하여 FISH를 실시하였다. FISH 기법은 DNA의 상보적 결합의 원리를 이용한 것으로, 염색체의 특정 부위에만 특이적으로 결합하는 프로브를 유리 슬라이드 상에 고정되어 있는 염색체에 직접 결합시킴으로써 염색체내 프로브의 위치를 확인한다.

확인된 BAC 클론별 게놈 DNA 단편들의 염색체 위치는 표 1에 나타내었다.

실시예 2: BAC 칩의 제조

2-1. BAC 칩의 제작에 사용될 클론의 선별

사람의 염색체의 수적이상과 관련된 특정 유전질환의 진단을 목적으로 BAC 라이브러리에서 각 염색체 번호 별로 1440 개의 클론을 선별하였다. 1440개의 클론은 표 2에 나타내었다.

(표 2)

상기 선별한 총 1440개의 게놈 DNA 단편 각각의 염색체 위치 및 총 크기는 하기 표 3 및 도 2a-h 에 나타낸다.

(표 3)

염색체 번호	크기 (Mbp)	BAC 칩에 사용된 게놈 DNA 단편 번호	게놈 NA 단편 크기(Mbp)	염색체 대응 부위(%)
1	246	103	0.1	4.2
2	243	110	0.1	4.5
3	199	92	0.1	4.6
4	191	64	0.1	3.4
5	181	73	0.1	4.0
6	170	81	0.1	4.8
7	158	83	0.1	5.3
8	146	52	0.1	3.6
9	136	66	0.1	4.9
10	135	68	0.1	5.0
11	134	73	0.1	5.4
12	132	56	0.1	4.1
13	113	42	0.1	3.7
14	105	43	0.1	4.1
15	100	39	0.1	3.9
16	90	36	0.1	4.0
17	81	57	0.1	7.0
18	76	33	0.1	4.3
19	63	38	0.1	6.0
20	63	39	0.1	6.2
21	46	40	0.1	8.7
22	49	50	0.1	10.2
X	153	92	0.1	6.0
Y	50	17	0.1	3.4
total	3060	1440	0.1(mean)	4.7(mean)

2-2. 클론으로부터 게놈 DNA 단편 분리

클로람페니콜 용액(100% 알코올 100 ㎖ + 클로람페니콜 340 mg) 400㎕가 함유된 1X LB(DIFCO, Cat. No 244620) 85 ㎖에 각 BAC 클론 원액 2 ㎕를 접종하였다. 37 ℃에서 15 시간동안 250 rpm으로 회전배양한 후, 6,000rpm, 4 ℃, 5분 원심분리하여 펠렛을 수득한 후, QUIAGEN-tip 100 (QIAGEN plasmid midi kit)을 사용하여 DNA를 추출하였다.

BAC DNA 1㎖중 850㎕는 초음파분쇄하여 슬라이드 점적 DNA로 이용하고, 3㎕는 아가로스 젤상에 전기영동용으로 이용하였다. 또한 무작위로 선별된 일부 BAC DNA 20㎕는 PFG(Pulse field gel electrophoresis) 전기영동 검사용으로 이용하였다.

2-2-1. 아가로즈 젤 전기영동

분리한 BAC DNA를 확인하기 위하여, 증류수에 녹인 BAC DNA 3 ㎕를 취하여 Not I 제한효소 처리하여 반응시키고, 0.85% 아가로스 젤에 전개시켰다. 전개양상을 확인하여 게놈 DNA 단편이 포함된 BAC DNA를 선별하였다.

2-2-2. PFG 전기영동(CHEFF 162-00133, BIO-RAD)

일회 BAC DNA 추출 단위인 48개의 BAC 클론중, 6개를 무작위로 선별하여 PFG 전기영동을 실시하였고, 6개 클론 중 하나라도 불량이 나오면 일회 추출 분량인 48개의 BAC 클론을 다시 추출하였다.

6-3. 점적(Spotting)

1440개의 클론으로부터 수득한 게놈 DNA 단편을 마이크로어레이에 점적하였다. 본 실험에서는 도 3의 12개의 서브어레이를 이용하였으며, 각 서브어레이에는 360(30 x 12)개의 스팟이 있으며, 동일한 게놈 DNA 단편은 가로방향으로 3회 점적하였다. 즉, 하나의 서브어레이에는 120가지(360/3)의 서로 다른 게놈 DNA 단편이 점적되어 있으며, 12개의 서브어레이에는 1440개의 게놈 DNA 단편이 존재한다. 각 서브어레이별 점적된 게놈 DNA 단편 수 및 표적 염색체 번호는 하기 표 4 및 도 4a-f에 나타내었다.

(표 4)

염색체 번호	서브어레이 번호
	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	sum
1	9	6	11	11	5	5	10	13	9	7	9	8	103
2	9	11	9	8	4	5	13	5	11	9	13	12	109
3	5	6	5	10	10	12	11	8	7	7	8	3	92
4	4	7	3	3	3	4	6	6	6	8	8	5	63
5	2	4	7	10	7	5	7	3	7	10	8	3	73
6	7	5	12	6	5	7	5	5	8	9	7	5	81
7	9	8	5	7	5	8	8	7	5	10	5	6	84
8	6	3	5	2	3	4	5	7	4	5	6	3	53
9	4	0	6	5	1	3	8	8	8	5	6	2	56
10	6	8	4	2	7	8	3	5	7	10	5	3	68
11	7	4	9	5	8	11	4	5	4	3	6	7	72
12	6	1	4	4	5	5	7	8	3	6	4	4	57
13	2	1	2	5	2	2	2	6	7	3	6	4	42
14	5	3	2	2	1	7	4	3	6	3	3	5	44
15	4	1	2	2	4	5	3	4	6	3	4	2	40
16	0	2	1	4	2	2	1	5	5	3	2	9	36
17	5	9	5	4	5	2	1	5	2	3	5	11	57
18	1	3	4	2	3	3	5	3	4	1	2	2	33
19	1	5	1	6	4	7	1	1	1	2	1	8	38
20	4	9	3	3	4	2	1	1	4	2	1	5	39
21	5	6	5	4	7	1	1	0	3	0	4	4	40
22	7	5	5	7	13	6	2	0	2	2	0	1	50
X	7	8	4	3	7	3	6	6	0	5	5	4	58
Y	1	2	0	4	2	0	3	2	1	0	0	2	17
sum	120	120	120	120	120	120	120	120	120	120	120	120	1440

2-3-1. 시료 준비

BAC DNA 용액을 원심분리(12,000 rpm, 10 min) 한 후 상층액 850 ㎕를 회수하고, 하기 조건에서 초음파 분해를 실시하였다.

-초음파 분해 조건-

시간: 5초, 온도: 25℃, 펄스: 0.1/0.1

초음파 분해가 끝난 1440개의 BAC DNA 모두를 1% 아가로스 젤에 전기영동하여 초음파 분해가 제대로 이루어졌는지를 확인하였다. 초음파 분해된 DNA는 0.5Kb 내지 10Kb 위치에 분포하여야 한다. BAC DNA 용액은 SpeedVAC(SAVANT, AES2010-220)에서 농축/건조시킨 후, 증류수 45 ㎕에 용해시킨 후 혼합하여 점성을 확인하였다. 점성이 높은 시료는 초음파 분해를 반복실시하였다. 이후 점적 용액(100% DMSO, 1.2 ug/㎕ nitrocellulose) 45 ㎕을 첨가하고 384 플레이트(well당 30㎕)에 이동시킨다. 빈 칸에는 50% DMSO 30㎕로 채운다.

상기 준비한 시료는 1개월 이상 보관 시 -70℃에서, 그 이하 기간으로 보관하는 경우 -20℃로 보관한다. 사용전 해동하여 2000 rpm에서 1 분간 스핀 다운하여 사용한다.

2-3-2. 기판 준비

25 ㎜ x 75 ㎜ x 1 ㎜ 규격의 유리 기판을 준비하였다. 유리 기판은 아미노-실란 처리된 것이다.

2-3-3. 점적

GeneMachine MicroGrid100를 이용하여 기판의 스팟당 5 - 10 pg으로 점적하였다. 이때, 질소 실린더 수치는 103.4kPa 내지 137.9 kPa로 하고, 진공 펌프를 작동시켜 74.5kPa 내지 101.6kPa을 유지시켰다.

실험예 1: 염색체 수 이상 분석

다운 증후군, 에드워드 증후군, 파타우 증후군, 터너 증후군 및 클라인펠터 증후군 환자로부터 각각의 검체 세포를 수득하였으며, 이를 실시예 2의 BAC 칩에 반응시켰다.

(실험방법)

1. 게놈 DNA 의 추출

혈액으로부터 시판되는 Puregene DNA isolation Kit (Gentra, Cat. No D5500A)를 이용하여 500 ng의 검체 DNA를 수득하였다. 또한 표준(reference) 세포 를 대상으로 동일한 방법으로 실시하여 표준 시료를 수득하였다.

2. 프로브 표지

검체와 표준 시료 각각은 무작위적 프라이밍 (Random priming)으로 Cy3 (Cy3-dCTP) 및 Cy5 (Cy5-dCTP)각각으로 표지한 후, QIAGEN사의 purification Kit로 정제하였다.

1) 표지

(1) 튜브에 DNA(검체 또는 표준 시료) 21ul (500ng) 을 취하여 넣고 2.5 X random reaction buffer 20ul을 더한다.

(2) 튜브를 100 ℃의 열판 (heating block) 에서 5분간 끓인 후, 즉시 얼음 위에 5분간 방치한다.

(3) 스핀다운 (spindown) 후 2mM dNTP 용액을 5ul씩 튜브에 넣는다. (2mM dNTP 용액 제조 : 100mMdATP, dGTP, dTTP는 각각 20ul씩, dCTP 는 10씩 따고 여기에 TE 30ul를 넣어 서로 잘 섞어 준다)

(4) 검체는 Cy3, 표준 시료는 Cy5를 각각 3ul 씩 넣어준다.

(5) 클레노우조각 (klenow fragment) 을 1.2ul씩 넣어준다.

(6) 피펫팅하여 고루 혼합한 후 스핀다운하여 37 ℃ 인큐베이터에서 반응시킨다.

2) 스핀컬럼을 이용한 정제 (Qiagen, Qiaquick PCR purification kit)

(1) 위의 반응액 50ul에 250ul의 PB (결합완충액) 를 넣어주고 준비된 스핀컬럼 (spin column) 으로 떨어뜨린다.

(2) 스핀컬럼을 13,200 rpm에서 1분 30초간 원심분리한다.

(3) 스핀컬럼에 안에 750ul의 PE (세척완충액) 를 넣어준다.

(4) 스핀컬럼을 13,200 rpm에서 1분 30초간 원심분리한다.

(5) 2ml 튜브 안에 모인 용액을 버린다.

(6) 원심분리한다.

(7) 스핀컬럼에 EB (유출완충액) 50ul을 컬럼 안에 떨어뜨리고 3분간 상온에 방치한다.

(8) 스핀컬럼을 13,200 rpm에서 1분 30초간 원심분리한다.

(9) EB 30ul을 컬럼안에 떨어뜨리고 3분간 상온에 방치한다.

(10) 스핀컬럼을 13,200 rpm에서 1분 30초간 원심분리한다

3) 에탄올 침전

(1) 검체 DNA (Cy3 labeling) 80ul, 대조 DNA (Cy5 labeling) 80ul, Cot I DNA 30ul, 3M 구연산나트륨 20ul, 차게한 100% 에탄올 500ul를 혼합한다.

(2) -20 ℃에서 60 분간 방치한다.

(3) 13,000rpm, 4 ℃에서 20분간 원심분리한다.

(4) 원심분리 후 보라색 침전물이 생긴다. 상층액을 버린다.

(5) 차가운 70% 에탄올 500ul를 섞어 준 후, 13,000rpm, 4 ℃에서 10분간 원심분리한다.

(6) 상층액을 버리고 스핀다운 (spin down) 후 피펫으로 남은 에탄올을 제거한다.

(7) 암실에서 10분간 방치한다.

(8) 침전물에 어레이 혼성화 용액 44ul와 이스트 tRNA 용액 4ul를 넣어준다. 30분 이상 암실 방치하면 침전물이 녹아서 보라색을 띄며 이를 프로브 검액으로 사용한다.

4. 혼성화 반응

- BAC 칩 전처리 -

(1) 다이아몬드펜으로 BAC 칩의 위 아래를 표시한다.

(2) 하이브리드 용액 30 uL에 연어 정자 DNA 10 uL를 첨가한다.

(3) 혼합물을 70 ℃ 열판 (Heat Block) 에서 10분간 변성 (denaturation) 시킨 후 얼음에 5분간 박아놓는다.

(4) BAC 칩에 혼합물 40 uL을 로딩 (loading) 하고 습기가 있는 슬라이드 박스에 넣어 30분간 방치한다.

(5) BAC 칩은 3차 증류수에 10초 동안 담궈서 2회 반복 세척한다.

(6) BAC 칩은 이소프로판올로 세척한 후 550rpm에서 5분간 원심분리하여 슬라이드를 건조시킨다.

- 혼성화 -

(1) 보라색의 프로브 검액 44 ul를 70℃ 열판 (Heat Block) 에서 15분간 변성 (denaturation) 시킨 후, BAC 칩에 반응시킨다.

(2) 37 ℃ 인큐베이터에서 1시간 방치한다.

(3) 하이브리드화 용액을 로딩한다.

(4) 커버글라스를 20 X 40㎜로 덮는다.

(5) 슬라이드 박스에 넣고 약 5rpm의 진탕기 (shaker) 위에 놓는다. 온도37℃, 습도 100%로 유지된 인큐베이터에서 48~72시간 동안 하이브리드화 시킨다.

-세척-

(1) 50% 포름아마이드 및 2X SSC을 포함하는 용액(pH7.3)을 46℃로 가하여 BAC 칩을 15분간 세척한다.

(2) 2X SSC 및 0.1% SDS를 포함하는 46℃의 용액으로 30분간 세척한다.

(3) PN 완충액(0.2M Na2HPO4(pH 9.0) 및 0.2M NaH2PO4(pH 4.3)를 포함하는 혼합액(pH 8.0) 100 mL, 증류수 100 mL 및 NP40 200 μL)을 실온에서 가하여 15분간 세척한다.

(4) 2X SSC로 실온에서 5분간 세척한다.

(5) 70%, 85% 및 100% 에탄올로 순차적으로 실온에서 1분간 세척한다.

(6) 550rpm에서 5분간 원심분리하여 슬라이드를 건조시킨다.

4. 스캐닝과 분석

BAC 칩을 마이크로어레이 칩 분석장치(MAC VIEWER, 2등급, A661200)에 삽입하여 스캐닝하고, Cy3와 Cy5 필터를 통해 각각의 스캔 이미지를 얻었다. BAC 칩에 점적된 게놈 DNA 단편에 대한 정보가 입력된 BAC 칩 분석 프로그램(Macrogen)을 이용하여, 상기 스캔 이미지 결과를 분석하였다.

1) 스캐닝

가. 마이크로어레이칩분석장치의 사용 전 준비사항

마이크로어레이 칩 분석장치를 PCI가 내장된 PC에 연결한다. PC의 권장사양은 다음과 같다:

- IBM 팬티움 III 이상

- Windows NT 4.0 또는 Windows 2000

- 768 MB RAM 이상

- 하드디스크 30 GB 이상

- 저장/재저장성 CD-ROM

- 1280 x 1024 디스플레이 시스템(16M colors)

스캔시, 채널을 cy3 및 cy5로 선택하고, 노출 시간은 1 sec을 사용하였다. 초점을 맞춘 후 스캔하고, 파일명을 명명하여 저장하였다.

2) 분석

스캔 파일을, BAC 칩에 대한 정보가 입력된 분석 소프트웨어인 BAC Chip Analysis Program (Macrogen)에서 실행시켜, Log Ratio Chart를 구하였다.

BAC 칩의 최종 실험 결과는 전체 상염색체(1번-22번)와 X, Y 성염색체를 고르게 포함하고 있는 1440개의 BAC 클론에 대한 log2 base T/R 값을 염색체의 순서대로 나타낸다. T/R 값은 검체(test)의 형광강도(CY3)를 대조(reference)의 형광강도(CY5)로 나눈 값으로, 두 형광염료의 강도가 동일하면 0의 값, 검체의 형광강도가 강하면 0>0.2, 그리고 대조군의 형광강도가 강하면 0 < 0.2이 된다. 각 염색체의 log2 base T/R 값의 평균값(chromo-mean) 및 평균도표(chromo-mean graph)로부터 각 염색체의 증폭(addition) 또는 손실(deletion)을 여부에 따라 각 염색체의 수적인 변화를 판별하였다. 상염색체의 경우 검체와 대조군의 염색체수가 2개로 모두 동일하며 같은 형광강도를 가지기 때문에 염색체별 평균값(chromo-mean)이 0에 수렴하게 되며, 특정 염색체의 증폭이 있는 경우 해당 염색체의 평균값이 0.2 이상 증가하게 된다. 성염색체의 경우 염색체 수에 따라 상염색체와 동일한 양상을 보이나 검체의 성별을 고려하여 판단하였다. 대조군은 남성의 DNA를 사용하므로, 검체가 남성의 DNA인 경우 상염색체와 동일한 방법으로 판정하나, 검체가 여성의 DNA인 경우에는 Y 염색체의 평균값이 -0.4 미만으로 나타나고, X 염색체는 약 0.2이상 증가한다. 각 염색체의 수적이상 판정은 아래의 판정기준 표 5에 의한다.

(표 5)

염색체	핵형(kayotype)	염색체 log2T/R 평균 (M)
염색체 번호 1 내지 22	Diploid	-0.2 < M < 0.2
	deletion (Monosomy)	M < - 0.2
	Amplification (Trisomy)	M > 0.2
X 염색체	Male　 (XY)	-0.2 < M < 0.2
	Male, Duploid　 (XXY)	M > 0.2
	Female (XX)	M > 0.2
	Female, Deletion(Monosomy, XO)	-0.2 < M < 0.2
Y 염색체	Male (XY)	-0.4 < M < 0.4
	Male, Duploid (XXY)	M > 0.4
	Female　 (XX)	M < -0.4

(결과)

도 5 내지 14는 검체 DNA에 대한 염색체 수 이상 진단결과를 나타낸 것이다. 도 5는 X 염색체의 log2 T/R 값은 0.2 보다 큰 0.421로 확인되어, 검체의 성별이 여성임을 확인할 수 있으며, 13번 염색체를 제외한 상염색체의 log2 T/R 값이 -0.2 내지 0.2 사이에 속하여 정상임을 알 수 있으나, 13번 염색체는 0.273이므로 13번째 염색체가 증폭되었음을 알 수 있다. 즉 도 5의 결과는 파타우 증후군의 여성환 자임을 나타낸다.

도 6에서는, 13번 염색체의 log2 T/R 값이 0.32이고, X 염색체의 log2 T/R 값이 0.011, Y 염색체의 log2 T/R 값이 -0.076이므로, 파타우 증후군의 남성으로 진단된다.

도 7은, 18번 염색체의 log2 T/R 값이 0.390이고, X 염색체의 log2 T/R 값이 -0.004, Y 염색체의 log2 T/R 값이 -0.118이므로, 에드워드 증후군의 남성으로 진단된다.

도 8은, 18번 염색체의 log2 T/R 값이 0.367이고, X 염색체의 log2 T/R 값이 0.380, Y 염색체의 log2 T/R 값이 -1.227이므로, 에드워드 증후군의 여성으로 진단된다.

도 9는, 21번 염색체의 log2 T/R 값이 0.263이고, X 염색체의 log2 T/R 값이 0.428, Y 염색체의 log2 T/R 값이 -1.186이므로, 다운 증후군의 여성으로 진단된다.

도 10은, 21번 염색체의 log2 T/R 값이 0.260이고, X 염색체의 log2 T/R 값이 0.344, Y 염색체의 log2 T/R 값이 -0.149이므로, 검체 DNA는 21번 염색체가 증폭되어 있으며, X 염색체가 하나 더 증폭된 핵형 XXY을 갖는 것으로 진단된다.

도 11은, X 염색체의 log2 T/R 값이 -0.071이고, Y 염색체의 log2 T/R 값이 -1.987이므로, 핵형 XO를 갖는 터너 증후군으로 진단된다.

도 12는, X 염색체의 log2 T/R 값이 0.446이고, Y 염색체의 log2 T/R 값이 -0.0091이므로, 핵형 XXY를 갖는 클라인펠터 증후군으로 진단된다.

도 13은, X 염색체의 log2 T/R 값이 0.395 이고, Y 염색체의 log2 T/R 값이 -1.131이므로, 정상 여성으로 진단된다.

도 14는, X 염색체의 log2 T/R 값이 -0.010이고, Y 염색체의 log2 T/R 값이 -0.108이므로, 정상 남성으로 진단된다.

실험예 2

실험예 1과 동일한 방법으로 실시하였으며, 단지 검체 및 대조군 DNA의 표지는 모두 Cye3으로 하였다. 스캔 후 분석시, 스팟 신호의 log2 T/R 값을 사용하였고, 표 5의 기준에 따라 분석하였다. 도 15는 다운증후군 검체 DNA의 BAC　칩 분석결과를 나타낸 것으로, 21번 염색체가 증폭된 신호가 관찰되었다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 염색체 이상 검출방법은 신속, 정확하게 염색체 이상을 검정함으로써 검체의 건강상태 및 질환여부를 쉽게 진단할 수 있도록 한다. 또한 본 발명의 방법은 질환 특이적 염색체 이상을 확인하여 질환 진단용 표시자를 제공할 수 있다.

Claims (10)

1. (a) 표 1의 1번 내지 72번으로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 게놈 DNA 단편;

   (b) 상기 게놈 DNA 단편 내의 연속하여 위치하는 20 내지 100 bp의 올리고뉴클레오타이드;

   (c) 상기 게놈 DNA 단편에서 유래하는 100 bp 내지 10 kbp의 cDNA; 및

   (d) 상기 게놈 DNA 단편, 올리고뉴크레오타이드 및 cDNA의 상보체

   로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 프로브가 고정되고,

   상기 프로브는 염기서열 내 반복 서열 함유 비율이 최대 85%인 것이고,

   상기 프로브를 이루는 염기서열은 염색체내 단일 위치성 (single locus)을 갖는 것인,

   울프-허쉬호른(Wolf-hirschhorn) 증후군 진단용 마이크로어레이:

   [표 1]

   

   
2. 제1항에 있어서, 상기 프로브는 상기 게놈 DNA 단편이 BAC(Bacterial Artificial Chromosome), HAC(Human Artificial Chromosome), TAC(Transformation competent Artificial Chromosome), YAC(Yeast ArtificialChromosome), PAC(P1-derived Artificial Chromosome), P1(phage) 및 코스미드(cosmid)로 이루어진 군으로부터 선택되는 벡터에 삽입되어 제조된 것인 마이크로어레이.
3. 제2항에 있어서, 상기 프로브는 상기 게놈 DNA 단편이 BAC(Bacterial Artificial Chromosome)에 삽입되어 제조된 것인 마이크로어레이.
4. 제1항에 있어서, 상기 프로브는 스팟당 2 내지 100 pg 농도로 고정된 것인 마이크로어레이.
5. 제1항에 있어서, 하나의 스팟에 1종 이상의 프로브가 고정된 것을 특징으로 하는 마이크로어레이.
6. 제1항에 있어서, 하나의 스팟당 2종 이상의 프로브가 고정된 것을 특징으로 하는 마이크로어레이.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 마이크로어레이 및 표지물질 검출 수단을 포함하고,

   상기 마이크로어레이에 고정된 프로브에 검출 가능한 제1 표지물질로 표지한 검체 게놈 DNA 및 검출 가능한 제2 표지물질로 표지한 표준 DNA를 동일비율로 혼합 반응시키고, 상기 검체 DNA 및 표준 DNA 각각의 혼성화 비율을 측정하여 그 결과로부터 검체 DNA의 염색체 이상 여부를 판단하는 것을 특징으로 하는

   울프-허쉬호른(Wolf-hirschhorn) 증후군 진단용 키트.
8. 제7항에 있어서, 상기 제1 표지물질 및 제2 표지물질은 방사선 동위원소, 형광물질, 화학발광체 및 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 서로 다른 물질이거나 동일한 물질인 키트.
9. 제7항에 있어서,

   상기 검체는 침, 혈액, 소변, 정액 및 양수로 이루어진 군으로부터 선택되는 체액; 또는 조직; 또는 세포인,

   키트.
10. 제7항에 있어서,

    검체 DNA의 혼성화 비율이 표준 DNA의 혼성화 비율과 동일한 경우 염색체 이상은 없는 것으로 판독하고

    검체 DNA의 혼성화 비율이 표준 DNA의 혼성화 비율보다 높을 경우 염색체 증가가 있는 것으로 판독하고,

    검체 DNA의 혼성화 비율이 표준 DNA의 혼성화 비율보다 낮을 경우 염색체 결손이 있는 것으로 판독하여 검체 DNA의 염색체 이상을 판단하는 것을 특징으로 하 는, 키트.

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