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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Stratifizierung
und Therapiesteuerung eines Patienten mittels Protein-Biochips.
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Protein-Biochips
gewinnen eine zunehmende industrielle Bedeutung in der Analytik
und Diagnostik sowie in der Pharmaentwicklung.
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Insbesondere
konnten mit Hilfe von Protein-Biochips bei der Analyse des Genoms
und der Genexpression ein großer Informationsgewinn geleistet
werden. Hierbei wird die schnelle und hochparallele Detektion einer
Vielzahl spezifisch bindender Analysemoleküle in einem
einzigen Experiment ermöglicht. Zur Herstellung von Protein-Biochips
ist es erforderlich, die benötigten Proteine zur Verfügung
zu haben. Hierzu haben sich insbesondere Protein-Expressionsbibliotheken
etabliert. Die Hochdurchsatz-Klonierung von definierten offenen
Leserahmen ist eine Möglichkeit (Heyman, J. A.,
Cornthwaite, J., Foncerrada, L., Gilmore, J. R., Gontang, E., Hartman,
K. J., Hernandez, C. L., Hood, R., Hull, H. M., Lee, W. Y., Marcil,
R., Marsh, E. J., Mudd, K. M., Patino, M. J., Purcell, T. J., Rowland,
J. J., Sindici, M. L. and Hoeffler, J. P. (1999) Genome-scale cloning and
expression of individual open reading frames using topoisomerase
I-mediated ligation. Genome Res, 9, 383–392; Kersten,
B., Feilner, T., Kramer, A., Wehrmeyer, S., Possling, A., Witt,
I., Zanor, M. I., Stracke, R., Lueking, A., Kreutzberger, J., Lehrach,
H. and Cahill, D. J. (2003) Generation of Arabidopsis Protein chip
for antibody and serum screening. Plant Molecular Biology, 52, 999–1010; Reboul,
J., Vaglio, P., Rual, J. F., Lamesch, P., Martinez, M., Armstrong,
C. M., Li, S., Jacotot, L., Bertin, N., Janky, R., Moore, T., Hudson,
J. R., Jr., Hartley, J. L., Brasch, M. A., Vandenhaute, J., Boulton,
S., Endress, G. A., Jenna, S., Chevet, E., Papasotiropoulos, V.,
Tolias, P. P., Ptacek, J., Snyder, M., Huang, R., Chance, M. R.,
Lee, H., Doucette-Stamm, L., Hill, D. E. and Vidal, M. (2003) C.
elegans ORFeome version 1.1: experimental verification of the genome
annotation and resource for proteome-scale Protein expression. Nat
Genet, 34, 35–41; Walhout, A. J., Temple,
G. F., Brasch, M. A., Hartley, J. L., Lorson, M. A., van den Heuvel,
S. and Vidal, M. (2000) GATEWAY recombinational cloning: application
to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes.
Methods Enzymol, 328, 575–592). Allerdings hängt
ein solcher Ansatz stark mit dem Fortschritt der Genom-Sequenzierungsprojekte
und der Annotierung dieser Gensequenzen zusammen. Darüber
hinaus ist die Bestimmung der exprimierten Sequenz aufgrund differenzieller
Spleißvorgänge nicht immer eindeutig. Dieses Problem
kann durch die Anwendung von cDNA-Expressionsbibliotheken umgangen
werden (Büssow, K., Cahill, D., Nietfeld, W., Bancroft,
D., Scherzinger, E., Lehrach, H. and Walter, G. (1998) A method
for global Protein expression and antibody screening an high-density
filters of an arrayed cDNA library. Nucleic Acids Research, 26,
5007–5008; Büssow, K., Nordhoff,
E., Lübbert, C., Lehrach, H. and Walter, G. (2000) A human
cDNA library for high-throughput Protein expression screening. Genomics,
65, 1–8; Holz, C., Lueking, A., Bovekamp,
L., Gutjahr, C., Bolotina, N., Lehrach, H. and Cahill, D. J. (2001)
A human cDNA expression library in yeast enriched for open reading
frames. Genome Res, 11, 1730–1735; Lueking,
A., Holz, C., Gotthold, C., Lehrach, H. and Cahill, D. (2000) A
system for dual Protein expression in Pichia pastoris and Escherichia
coli, Protein Expr. Purif., 20, 372–378). Hierbei
wird die cDNA eines bestimmten Gewebes in einen bakteriellen oder
einen Hefe-Expressionsvektor einkloniert. Die für die Expression
verwendeten Vektoren zeichnen sich im Allgemeinen dadurch aus, dass
sie induzierbare Promotoren tragen, mit denen sich der Zeitpunkt
der Proteinexpression steuern lässt. Darüber hinaus
weisen Expressionsvektoren Sequenzen für sogenannte Affinitätsepitope
oder -proteine auf, die zum einen den spezifischen Nachweis der
rekombinanten Fusions-Proteine mittels eines gegen das Affinitätsepitop
gerichteten Antikörpers erlauben, zum anderen wird die
spezifische Aufreinigung über Affinitätschromatographie
(IMAC) ermöglicht.
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Beispielsweise
wurden die Genprodukte einer cDNA-Expressionsbibliothek aus humanem
fötalem Hirngewebe in dem bakteriellen Expressionssystem
Escherichia coli im Hochdichte-Format auf einer Membran angeordnet
und konnten erfolgreich mit unterschiedlichen Antikörpern
gescreent werden. Es konnte gezeigt werden, dass der Anteil an Volllänge-Proteinen
bei mindestens 66% liegt. Die rekombinanten Proteine dieser Bibliothek
konnten darüber hinaus im Hochdurchsatz exprimiert und
aufgereinigt werden (
Braun P., Hu, Y., Shen, B., Halleck,
A., Koundinya, M., Harlow, E. and LaBaer, J. (2002) Proteomescale
purification of human Proteins from bacteria. Proc Natl Acad Sci
USA, 99, 2654–2659;
Büssow (2000)
supra; Lueking, A., Horn, M., Eickhoff, H., Büssow, K.,
Lehrach, H. and Walter, G. (1999) Protein microarrays for gene expression
and antibody screening. Analytical Biochemistry, 270, 103–111).
Solche Protein-Biochips auf der Basis von cDNA-Expressionsbibliotheken
sind insbesondere Gegenstand der
WO
99/57311 und
WO 99/57312 .
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Ferner
sind als Protein-Biochips Antigen-Antikörper präsentierende
Anordnungen beschrieben (Lal et al (2002) Antibody arrays:
An embryonic but rapidly growing technology, DDT, 7, 143–149; Kusnezow
et al. (2003), Antibody microarrays: An evaluaution of production
Parameters, Proteomics, 3, 254–264).
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Beispielsweise
konnte mittels Proteinbiochips in Einzelmessung die Bindungsspezifität
verschiedener monoklonaler Antikörper wie anti-HSP90β,
anti-GAPDH oder anti-α-Tubulin auf einem Protein-Microarray,
bestehend aus 96 humanen rekombinant exprimierten Proteinen analysiert
werden (Lueking (1999) supra). Zudem konnte die
Kreuzreaktivität zweier monoklonaler Antikörper
gegen ungefähr 2500 unterschiedliche Proteine untersucht
werden (Lueking, A., Possling, A., Huber, O., Beveridge,
A., Horn, M., Eickhoff, H., Schuchardt, J., Lehrach, H. and Cahill,
D. J. (2003) A Nonredundant Human Protein Chip for Antibody Screening
and Serum Profiling. Mol Cell Proteomics, 2, 1342–1349).
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Ferner
sind Protein-Biochips in der Diagnose von Alopecia areata beschrieben
(Lueking et al, MCP 4, 1382–1390 (2005)).
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Es
besteht jedoch ein großes Bedürfnis nach geeigneten
Verfahren zum Stratifizieren oder Therapiesteuerung eines Patienten.
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Daher
betrifft die Erfindung die Aufgabe ein Verfahren zum Stratifizieren
oder zur Therapiesteuerung eines Patienten bereitzustellen.
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Die
Aufgabe wird dadurch gelöst, dass ein Verfahren zum Stratifizieren
oder zur Therapiesteuerung eines Patienten bereit gestellt wird,
wobei eine Anordnung von Proteinbindern auf einem festen Träger
mit Körperflüssigkeit eines Patienten versetzt
wird und der Bindungserfolg nachgewiesen wird.
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Daher
betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Stratifizieren oder zur
Therapiesteuerung eines Patienten, wie in den Patentansprüchen
definiert (nachstehend: erfindungsgemäßes Verfahren).
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„Stratifizieren
(auch: Stratifikation) oder Therapiesteuerung" im Sinne dieser Erfindung
bedeutet, dass das erfindungsgemäße Verfahren
Entscheidungen zur Behandlung und Therapie des Patienten erlaubt,
sei es Hospitalisierung des Patienten, Einsatz und/oder Dosierung
eines oder mehrerer Arzneimittel, eine therapeutische Maßnahme
oder die Überwachung eines Krankheitsverlaufes bzw. Ätiologie
oder Klassifizierung einer Erkrankung, z. B. in einen Subtyp oder
die Differenzierung von Krankheiten.
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In
einer weiteren Ausführungsform umfasst der Begriff „Stratifizierung"
ebenfalls die Risikostratifizierung mit der Prognose eines „outcome"
eines nachteiligen gesundheitlichen Ereignisses.
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Der
Begriff „Proteinbinder" im Sinne dieser Erfindung bedeutet,
dass ein zu bindendes Protein in Gegenwart eines Proteinbinders
diesen kontaktiert oder an diesen bindet oder zumindest in Wechselwirkung
tritt. Im weitesten Sinne ist das zu bindende Protein an den Proteinbinder
adressiert bzw. das zu bindende Protein erkennt den Proteinbinder
bzw. der Protein-Binder hat das Potential mit einem Protein in Wechselwirkung
zu treten (z. B. Antigen (Epitop)/Antikörper (Paratop)
Wechselwirkung).
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Proteinbinder
können Proteine, Peptide, modifizierte Proteine/Peptide,
rekombinante Proteine/Peptide, Antikörper oder Antigene
sein, oder sonstige Proteine die auf einem erfindungsgemäßen
Proteinbiochip repräsentiert werden können.
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Die
Proteinbinder verfügen über ein Erkennungssignal
an der ein zu bindendes Protein adressiert ist. Erfindungsgemäß bevorzugt
ist das Erkennungssignal ein Epitop und/oder Paratop und/oder Hapten.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform ist der Proteinbinder
daher ein (natives) Antigen (Epitop) oder (nativer) Antikörper
(Paratop), insbesondere ebenfalls ein monoklonaler oder polyklonaler
Antikörper.
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In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der Proteinbinder
ein Antigen, insbesondere ein Biomarker, wobei das jeweilige Antigen
oder der Biomarker mit einer Erkrankung (Indikation) korreliert.
Daher sind solche Proteinbinder (oder Biomarker) erfindungsgemäß bevorzugt,
die spezifisch für eine Indikation sind.
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Solche
zu bindende Proteine an einen Proteinbinder sind erfindungsgemäß Bestandteil
einer Körperflüssigkeit, insbesondere Blut, Vollblut,
Blutplasma, Blutserum, Patientenserum – also nicht abschließend:
Proteine, Peptide, modifizierte Proteine/Peptide, Antikörper
oder Antigene oder sonstige Proteine, Proteide.
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In
einer weiteren Ausführungsform kann der jeweilige Proteinbinder
in unterschiedlichen Mengen in einen oder mehreren Bereichen auf
dem festen Träger repräsentiert sein. Dies erlaubt
eine Variation der Sensitivität. Die Bereiche können
jeweils eine Gesamtheit von Proteinbindern aufweisen, d. h. eine
genügende Zahl an verschiedenen Proteinbindern. Bevorzugt
sind mindestens 96 bis 25.000 (numerisch) oder mehr aus verschiedenen
Proteinbindern. Bevorzugt jedoch mehr als 2.500, besonders bevorzugt
10.000 oder mehr Proteinbinder.
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Im
Rahmen dieser Erfindung bedeutet „Anordnung" synonym „Array"
und sofern dieser „Array" zur Identifizierung von zu bindenden
Proteinen an Proteinbindern verwendet wird, ist hierunter ein „Assay"
zu verstehen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist
die Anordnung derart gestaltet, dass die auf der Anordung repräsentierten
Proteinbinder in Form eines Gitters auf einem festen Träger
vorliegen. Ferner sind solche Anordnungen bevorzugt, die eine hochdichte
(high-density) Anordnung von Proteinbindern erlauben. Solche hochdichte
Anordnungen sind beispielsweise in der
WO 99/57311 und
WO 99/57312 offenbart.
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Die
Proteinbinder der Anordnung sind auf einen festen Träger
fixiert, gespottet oder immobilisiert gar aufgedruckt. Ein oder
mehrere Proteinbinder können mehrfach in der Gesamtheit
aller Proteinbinder präsent sein und in unterschiedlichen
Mengen bezogen auf einen Spot vorliegen. Ferner können
die Proteinbinder auf dem festen Träger standardisiert
sein (z. B. mittels serieller Verdünnungsreihen von Humanglobulinen
als interne Kalibratoren zur Datennormalisierung).
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In
einer weiteren Ausführungsform liegen die Proteinbinder
als Clone vor. Solche Clone können beispielsweise mittels
einer erfindungsgemäßen cDNA-Expressionsbibliothek
erhalten werden (Büssow et al. 1998 (supra)).
In einer bevorzugten Ausführungsform werden solche Expressionsbibliotheken
enthaltend Clone mittels Expressionsvektoren aus einer exprimierenden
cDNA Bibliothek erhalten. Diese Expressionsvektoren enthalten vorzugsweise
induzierbare Promotoren. Die Induktion der Expression kann z.B.
mittels eines Induktors, solche wie IPTG, erfolgen. Geeignete Expressionsvektoren
sind beschrieben in Terpe et al. (Terpe T Appl Microbiol
Biotechnol. 2003 Jan; 60(5): 523–33).
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Expressionsbibliotheken
sind dem Fachmann bekannt, diese können nach Standardwerken,
wie Sambrook et al, "Molecular Cloning, A laboratory handbook,
2nd edition (1989), CSH press, Cold Spring Harbor, New York hergestellt
werden. Weiterhin bevorzugt sind solche Expressionsbibliotheken,
die gewebespezifisch sind (z. B. humanes Gewebe, insbesondere humane
Organe). Ferner sind erfindungsgemäß ebenfalls
solche Expressionsbibliotheken mit eingeschlossen, die mittels exontrapping
erhalten werden können. Statt Expressionsbibliothek kann
synonym von einer Expressionsbank gesprochen werden.
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Weiterhin
bevorzugt sind Protein-Biochips oder entsprechende Expressionsbibliotheken,
die keine Redundanz aufweisen (sogenannte: Uniclone
®-Bibliothek)
und nach den Lehren der
WO 99/57311 und
WO 99/57312 beispielsweise
hergestellt werden können. Diese bevorzugten Uniclone-Bibliotheken
weisen einen hohen Anteil an nicht-fehlerhaften vollständig
exprimierten Proteinen einer cDNA-Expressionsbibliothek auf.
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Im
Rahmen dieser Erfindung können die Clone ebenfalls nicht
abschließend solche sein, wie transformierte Bakterien,
rekombinante Phagen oder transformierte Zellen von Säugern,
Insekten, Pilzen, Hefen oder Pflanzen.
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Die
Clone werden auf einen festen Träger fixiert, gespottet
oder immobilisiert.
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Zusätzlich
können die Proteinbinder in der jeweiligen Form in Form
eines Fusionsproteins vorliegen, welches beispielsweise mindestens
ein Affinitätsepiptop oder "Tag" enthält. Der
Tag kann ein solcher sein wie wie c-myc, His-Tag, Arg-tag, FLAG,
alkalische Phosphatase, V5-Tag, T7-Tag oder Strep-Tag, HAT-tag,
NusA, S-tag, SBP-tag, Thioredoxin, DsbA, ein Fusionsprotein, vorzugsweise
eine Cellulose-bindende Domäne, grünfluoreszierendes
Protein, Maltose bindendes Protein, calmodulin-bindendes Protein,
Glutathione S-transferase oder lacZ enthalten.
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In
sämtlichen Ausführungsformen umfasst der Begriff
"fester Träger" Ausführungen wie einen Filter, eine
Membran, ein magnetisches Kügelchen, ein Silizium-Wafer,
Glas, Metall, ein Chip, ein massenspektrometrisches Target oder
eine Matrix. Ein Filter ist jedoch erfindungsgemäß bevorzugt.
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Als
Filter ist weiterhin PVDF, Nitrocellulose oder Nylon bevorzugt (z.
B. Hybond N+ Amersham).
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen
Anordnung entspricht diese einem Gitter, dass die Größenordnung
einer Mikrotiterplatte (96 Wells, 384 Wells oder mehr), eines Silizium-Wafers,
eines Chips, eines massenspektrometrischen Targets oder einer Matrix
besitzt.
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Nachdem
das zu bindende Protein einen Proteinbinder kontaktiert, erfolgt
die Auswertung des Bindungserfolges, die beispielsweise unter Verwendung
mit handelsüblicher Image-Analyse Software (GenePix Pro
(Axon Laboratories), Aida (Ragtest), ScanArray (Packard Bioscience))
erfolgt.
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Die
Visualisierung erfindungsgemäßer Protein-Protein-Wechselwirkungen
(z. B. Protein an Proteinbinder, wie Antigen/Antikörper)
oder entsprechende „Mittel zum Nachweis des Bindungserfolges"
kann beispielsweise mittels Fluoresenzmarkierung, Biotiniylierung
oder Radio-Isotopen-Markierung in üblicher Weise erfolgen.
Ein Nachweis von gebundenen Antikörpern erfolgt mit Hilfe
von sekundären Antikörpern, die mit handelsüblichen
Reportermolekülen markiert sind (z. B. Cy-, Alexa-, Dyomics,
FITC- oder ähnliche Fluoreszenzfarbstoffe), oder mit Reporter-Enzymen
wie alkalischer Phosphatase, Meerrettichperoxidase, usw. und den
entsprechenden colorimetrischen, fluoreszenten oder chemolumineszenten
Substraten. Eine Auslesung erfolgt z. B. mittels eines Microarray-Laserscanners.
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Ferner
betrifft die Erfindung ein Verfahren zum differentiellen Screenen
von Proteinbindern die für das erfindungsgemäße
Verfahren eingesetzt werden können. Hierzu werden mittels
mindestens einer erfindungsgemäßen Anordnung von
potentiellen Proteinbindern auf einem festen Träger mit
Körperflüssigkeiten von gesunden und kranken Probanden
mehrfach, 10-fach, gar 100-fach oder 100-fach vergleichend versetzt
und der differentielle/unterschiedliche Nachweis eines Bindungserfolges
eines Proteins an einen Proteinbinder weist auf die Spezifität
des Proteinbinders hinsichtlich der Krankheit hin (krankheitsspezifischer
Proteinbinder) oder ein solcher Proteinbinder ist zumindest mit
der Krankheit assoziiert (krankheitsassoziierter Proteinbinder).
Entsprechende Proteinbinder werden selektioniert und werden neu
auf einem festen Träger angeordnet.
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Daher
betrifft die Erfindung ebenfalls ein Verfahren zur Stratifizierung
oder Therapiesteuerung eines oder mehreren Patienten gemäß dem
erfindungsgemäßen Verfahren, wobei folgende Schritte
durchgeführt werden:
- a.) Inkubation
einer ersten Anordnung enthaltend Proteinbinder auf einem festen
Träger mit Körperflüssigkeit,
- b.) Selektion geeigneter Proteinbinder und
- c.) Neuanordnen der Proteinbinder aus b.) auf einen zweiten
festen Träger,
- d.) Erneute Inkubation der Anordnung aus c.) mit Körperflüssigkeit.
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Dieses
Verfahren erlaubt vorteilhaft die Identifizierung von geeigneten
krankheitsspezifischen oder krankheits-assoziierten Proteinbindern.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung
enthält die Anordnung Proteinbinder, die zum einen bekannte
Antigene und/oder Biomarker für eine Indikation sind oder
krankheits-assoziiert sind oder mittels des vorstehend genannten
differentiellen Screenen für eine solche Indikation identifiziert
werden.
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Beispielhaft
sind genannt: Tabelle
1: Bekannte krankheits-assoziierte Proteinbinder definierter Indikation:
| NOL8
Protein [Homo sapiens] | Alopecia
areata spezifisch |
| endosulfine
alpha isoform 3 [Homo sapiens] | Alopecia
areata spezifisch |
| A42856
EPF autoantibody-reactive epitope – human (fragment) | Alopecia
areata spezifisch |
| Signal
recognition particle 14 kDa (homologous Alu RNA binding protein)
[Homo sapiens] | Alopecia
areata spezifisch |
| SCG10
protein [Gallus gallus] | Alopecia
areata spezifisch |
| PRG2
Protein [Homo sapiens] frame_3 ak641f21 frame_2 ak644k22 similar
to chromosome | |
| 17
open reading frame 27 [Rattus norvegicus] | DCM
IgG spezifisch |
| Novel
Protein [Homo sapiens] | DCM
IgG spezifisch |
| 613i09
DNA-binding Protein B YBX1 Protein [Homo sapiens] | DCM
IgG spezifisch |
| USP47
Protein [Homo sapiens] | DCM
IgG spezifisch |
| peroxisome
biogenesis factor 13 [Homo sapiens] | DCM
IgG spezifisch |
| nascent-polypeptide-associated
complex alpha polypeptide [Homo sapiens] | DCM
IgG spezifisch |
| hs
neural Proliferation, differentiation and control, 1 (NPDC1) | DCM
IgG spezifisch |
| FK506
binding Protein 3,25 kDa [Homo sapiens] | DCM
IgG spezifisch |
| pre-mRNA
cleavage complex II protein Pcf11 [Homo sapiens]. | DCM
IgG spezifisch |
| frame_1
MPP616L16 frame_1 616116 Kv channel interacting protein 1 [Homo
sapiens] | DCM
IgG spezifisch |
| Chain
B, Complex Of Hsp90 And P50 CDC37 cell division cycle 37 homolog
(S. cerevisiae) | |
| [Homo
sapiens] | DCM
IgG spezifisch |
| hs
low density lipoprotein-related protein associated protein 1 (LRPAP1). | DCM
IgG spezifisch |
| nuclear
mitotic apparatus protein 1 [Homo sapiens] | DCM
IgG3 Spezifisch |
| PREDICTED:
choline/ethanolamine kinase isoform 1 [Pan troglodytes]. | DCM
IgG3 Spezifisch |
| Homo
sapiens NDRG family member 4 (NDRG4) | DCM
IgG3 Spezifisch |
| heterogeneous
nuclear ribonucleoprotein A1 isoform b [Homo sapiens] | RA
spezifisch |
| unnamed
protein product [Homo sapiens] | RA
spezifisch |
| regulator
of G-protein signaling GAIP [Homo sapiens] | RA
spezifisch |
| frame_3
ak627k08 TRAF interacting protein TANK isoform a [Homo sapiens] | RA
spezifisch |
| ROA1_HUMAN
Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1 (Helix-destabilizing
protein) | |
| (Single-strand
binding protein) (hnRNP core protein A1) | RA
spezifisch |
| interleukin-1
receptor-associated kinase 1 isoform 2 [Homo | RA
spezifisch |
| Chromodomain-helicase-DNA-binding
protein 8 (CHD-8) (Helicase with SNF2 domain 1) | RA
spezifisch |
| Hnrpa1
protein [Rattus norvegicus] | RA
spezifisch |
| erythrocyte
membrane protein band 4.9 (dematin) | Alopecia
areata spezifisch |
| fibroblast
growth factor receptor 3 (FGFR3) transcript variant 2 | Alopecia
areata spezifisch |
| Homo
sapiens cDNA clone GLCDAC05 | Alopecia
areata spezifisch |
- * RA = Rheumathoide Arthritis, DCM = Dilatativen
Cardiomyopathie
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Mithilfe
des erfindungsgemäßen differentiellen Screeningverfahrens
konnten beispielsweise für Multiple Sklerose (MS) folgende
Proteinbinder identifiziert werden:
| PRG2
Protein [Homo sapiens] | MS
spezifisch |
| KIAA0120
[Homo sapiens] | MS
spezifisch |
| PREDICTED:
hypothetical Protein | MS
spezifisch |
| PREDICTED:
CREB binding Protein | MS
spezifisch |
| cyclin-D
binding Myb-like Protein [Homo sapiens] | MS
spezifisch |
| A Chain
A, Structural Basis For Recruitment Of Ubc12 By An E2-Binding Domain
In Nedd8's E1 | MS
spezifisch |
| plasticity
related gene 2 [Homo sapiens] | MS
spezifisch |
| PREDICTED:
similar to uridine-cytidine kinase 2 [Bos taurus]. | MS
spezifisch |
| MAP1B
Protein [Homo sapiens] | MS
spezifisch |
| nuclear
mitotic apparatus Protein 1 [Homo sapiens] | MS
spezifisch |
| USP47
Protein [Homo sapiens] | MS
spezifisch |
Tabelle
2: Identifizierte Proteinbinder mithilfe des erfindungsgemäßen
Verfahrens
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In
einer weiteren Ausführungsform können jeweils
verschiedene Proteinbinder, die jeweils eine oder mehrer Indikationen
repräsentieren auf einem festen Träger angeordnet
sein.
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In
einer weiteren Ausführungsform werden die erhaltenen Daten
der Auslesung bioinformatorisch ausgewertet. Beispielsweise kann
die bioinformatorische Auswertung vorzugsweise mittels „Support
Vector Machines" erfolgen. Es handelt sich hierbei um ein rein mathematisches
Verfahren der Mustererkennung, das in ein entsprechendes Computerprogramm
umgesetzt wird (Vapnik und Chervonenkis, Theory of Pattern Recognition,
1979).
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die
Erfindung ein Verfahren zum Stratifizieren von einem oder mehreren
Patienten nach einem der vorstehenden Ausführungsformen,
wobei das Stratifizieren eine Klassifikation von Patienten oder
Patientengruppen erlaubt. Dies ermöglicht besonders vorteilhaft
die Erstellung/Änderung und Durchführung von Studiendesigns
für eine bestimmte Indikation.
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Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft daher die Verwendung
einer Anordnung von Proteinbindern auf einen festen Träger,
nach einem der vorstehenden Ausführungsformen zum Stratifizieren
oder Klassifizieren von einem oder mehreren Patienten für
eine bestimmte Indikation, wie nicht abschließend zur Hospitalisierung
des Patienten, Einsatz und/oder Dosierung eines oder mehrerer Arzneimittel,
eine therapeutische Maßnahme oder die Überwachung
eines Krankheitsverlaufes bzw. Ätiologie oder Klassifizierung
einer Erkrankung oder die Differenzierung von Krankheiten sowie
zur Risikostratifizierung.
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Beispiel und Figuren:
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Die
Beispiele dienen ausschließlich zur Erläuterung
der Erfindung, ohne die Erfindung auf diese Beispiele zu begrenzen
oder zu beschränken.
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Beispiel 1:
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21
ausgesuchte Patientenseren wurden auf einen Makroarray (37200 Proteinbinder
(rekombinante humane Proteine aus Expressionsklonen) auf Nitrozellulose)
inkubiert. Zur Validierung von geeigneten Proteinbindern wurden
solche detektiert, die zumindest aus 25% der Patientenseren einen
Bindungserfolg mit den Proteinbindern auf dem Makroarray aufweisen.
Diese Proteinbinder wurden identifiziert und selektioniert und auf
einen zweiten festen Träger (Nitrozellulose) neu angeordnet.
Anhand eines solch erhaltenen neuen Proteinbiochip konnte die Therapiesteuerung
und Stratifikation eines Patienten erfolgreich durchgeführt
werden.
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Beispiel 2:
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Stratifizierung und Therapiesteuerung
eines Patienten mittels Protein Biochips
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Zur
Patienten-Stratifizierung erfolgt zunächst ein Studiendesign,
in denen abhängig von der Fragestellung Gruppen von Patienten
gebildet werden (z. B. Krankheitsverlauf x, steht unter Therapie
von Arzneimittel x). Ein Studienziel ist die Stratifizierung (Klassifizierung)
der Patienten in verschiedene Krankheitsverlaufsformen. Diese Stratifizierung
erlaubt unterschiedliche Therapien.
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Nach
dem erfindungsgemäßen Verfahren werden die Proben
(Körperflüssigkeit, z. B. Serum, Plasma, Liquor
etc.) dieser festgelegten Gruppen von Patienten auf einem festen
Träger mit zahlreichen Proteinbindern nach einem der vorhin
beschriebenen Ausführungsformen inkubiert.
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Die
bioinformatische Auswertung erfolgt mittels Support Vektor Maschinen
(SVM) zu einem Klassifizierungsergebnis. Dies ist in 2 beispielhaft
für eine Studie der Erkrankung Multiple Sklerose dargestellt. Beispielsweise
kann die Klassifizierung in die Gruppen A, B und C ein Entscheidungskriterium
für die Wahl einer entsprechenden Therapie sein.
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Weiterhin
lassen sich über die bioinformatische Auswertung für
die einzelnen Proteinbinder Signifikanzwerte (z. B. als pValue)
berechnen, die eine Aussage darüber geben, wie signifikant
sie für die Klassifizierung sind (siehe Tabelle 3). Tabelle
3: Ausschnitt einer Liste von Proteinen sortiert nach ihrer Signifikanz
für die Klassifizierung.
| Feature | pValue |
| 1 | 1,49E-07 |
| 2 | 4,33E-07 |
| 3 | 6,81E-07 |
| 4 | 8,48E-07 |
| 5 | 1,02E-06 |
| 6 | 1,89E-06 |
| 7 | 4,36E-06 |
| 8 | 7,41E-06 |
| 9 | 1,08E-05 |
| 10 | 1,13E-05 |
| 11 | 1,54E-05 |
| 12 | 1,73E-05 |
| 13 | 4,46E-05 |
| 14 | 8,03E-05 |
| 15 | 9,78E-05 |
| 16 | 0,000115597 |
| 17 | 0,000119585 |
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Hoch-signifikante
Binder werden in einem nächsten Schritt ausgewählt
und auf einem zweiten festen Träger neu angeordnet.
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Wird
ein solcher Träger basierend auf validierten Biomarkern/Proteinbindern
dann erneut mit Proben von Körperflüssigkeiten
inkubiert, lässt sich eine deutliche Klassifizierung/Stratifizierung
der Patienten erzielen wie in 3 für
die Krankheit Multiple Sklerose beispielhaft gezeigt.
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1 zeigt
eine Ausführungsform einer 16-fachen Anordnung von Proteinbindern
auf einen festen Träger.
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2 zeigt
die bioinformatorische Auswertung von Patientendaten mittels Proteinbiochips
und deren Klassifizierung basierend auf 229 Proben.
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3:
Klassifizierungsergebnis von gesunden Probanden und Multiple Sklerose
Patienten unter Anwendung von hochsignifikanten Proteinbindern.
-
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
-
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keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
-
Zitierte Patentliteratur
-
- - WO 99/57311 [0004, 0021, 0025]
- - WO 99/57312 [0004, 0021, 0025]
-
Zitierte Nicht-Patentliteratur
-
- - Heyman, J.
A., Cornthwaite, J., Foncerrada, L., Gilmore, J. R., Gontang, E.,
Hartman, K. J., Hernandez, C. L., Hood, R., Hull, H. M., Lee, W.
Y., Marcil, R., Marsh, E. J., Mudd, K. M., Patino, M. J., Purcell,
T. J., Rowland, J. J., Sindici, M. L. and Hoeffler, J. P. (1999)
Genome-scale cloning and expression of individual open reading frames
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