WO2000071749A2 - Erkennungssystem zur untersuchung von molekülwechselwirkungen, seine herstellung und verwendung - Google Patents

Erkennungssystem zur untersuchung von molekülwechselwirkungen, seine herstellung und verwendung Download PDF

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WO2000071749A2
WO2000071749A2 PCT/EP2000/004791 EP0004791W WO0071749A2 WO 2000071749 A2 WO2000071749 A2 WO 2000071749A2 EP 0004791 W EP0004791 W EP 0004791W WO 0071749 A2 WO0071749 A2 WO 0071749A2
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region
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protein
nucleotides
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Dirk BÖKENKAMP
Hans-Ulrich Hoppe
Petra Burgstaller
Dirk Konz
Uwe WÖLK
Marc Pignot
Peter Wagner
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Xzillion Gmbh & Co. Kg
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips

Definitions

  • the present invention relates to a detection system (FIG. 1) comprising a carrier (component (a)) and a detection unit component (b) bound to the carrier, which has a constant region (A) and an adjacent variable region (B). contains, and a component (c) comprising a region complementary to region (A) and (B) and one, optionally via a suitable
  • the invention further relates to a method for producing such detection systems and to methods for investigating molecular interactions using the detection systems
  • a human cell there are generally up to about 30,000 genes which characterize the current state of the cell.
  • the state of a cell can represent, for example, an increased cell division in the case of a cancer cell or generally changed metabolic activities in the disease state.
  • the activity of a gene can be, for example, via its mRNA as a transcription product or via the corresponding protein as a translation product can be determined.
  • the mRNA or protein profile of a cell therefore reflects its current state
  • CONFIRMATION COPY To directly characterize the protein profile in a cell, the cellular proteins must be separated from one another.An efficient method is, for example, two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2DE). In the first dimension, the proteins are classified according to their isoelectric point (IP) and in the second dimension The proteins are separated by their molecular weight. The proteins are then visualized by staining in the 2D gel, in which approximately 1,000-2,000 proteins are stained as spots in typical 2D gels. The result is a protein pattern or profile that is significant for each cell , which reflects the respective state of the cell at the protein level.
  • 2DE two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis
  • Each protein in a cell has a protein-specific position on the 2D gel, so that a so-called proteome map can be created for the cell and consequently for the whole organism of line changes eg in disease processes to be confirmed
  • the protein profiles of healthy and diseased cells are compared in order to determine any differences.
  • arrays are arrangements of immobilized recognition species that play an important role especially in analysis and diagnostics in the simultaneous determination of analytes. Examples are nucleic acid arrays (see e.g. B Southern et al Genomics (1992) 13 1008 U.S. Patent No. 5,632,957 WO97 / 27317 or EP-A1-0 543 550) or peptide arrays (Fodor et al, Nature 1993 364 555).
  • WO96 / 01836 describes an array of DNA molecules of different sequence described the for the detection of
  • nucleic acids are hybridized in a sample on a nucleic acid array on a semiconductor chip using an electrical field and subsequently not - or unspecifically-bound nucleic acids removed by a simple reversal of the polarity of the electric field.
  • a mismatching of a single base pair can be recognized by a precise adjustment of the electric field strength
  • the object of the present invention was to provide a recognition system which is built up from a population of pairing system-effector-fusion molecules with the aid of which this population can be identified and characterized. Furthermore, the object of the present invention is a method for the investigation of effector-binding partner interactions
  • the present invention relates to a recognition system (FIG. 1) comprising i) a carrier (component (a)) and n) at least one recognition unit (component (b)) bound to the carrier, preferably a pairing system, said recognition unit being a region ( A) with a constant sequence and a region (B) adjacent to region (A) with a variable sequence and in) associated with this a pairing system effector fusion molecule containing the recognition sequence (component (b)) complementary sequence (component (c))
  • Component (a) an array in which each array position can be assigned to a defined variable region B of component (b). Starting from the different recognition units on the array surface, the respective position-specific recognition systems (components (a) - (c )) being constructed
  • the term recognition unit means nucleic acids or their analogs, in particular containing pentoses, preferably a pentopyranose or pentofurinose.
  • the pentose is selected from a ribose, arabinose, lyxose or xylose
  • suitable nucleic acids or their Analogs are DNA, RNA, in particular mRNA or p-RNA (pyranosyl-RNA, see eg WO99 / 15539), ammocyclohexyl nucleic acids (CNA, see eg WO99 / 15509), peptidic nucleic acids (PNA, see eg WO92 / 20702 or Science (254) 1999, 1497-1500) or non-helical supramolecular nanosystems as described for example in WO98 / 25943
  • the recognition unit (component (b)) hybridizes specifically with the regions of component (c) complementary to its region A and B.
  • component (c) are, in particular, nucleic acid protein acceptor derivatives, preferably nucleic acid puromycin derivatives or Fusagens like nucleic acid
  • Protein fusion molecules in particular nucleic acid-puromycin-protein fusion molecules. Particularly preferred are fusion molecules from the nucleic acids RNA and DNA, preferably in the fusion with puromycin and a protein.
  • protein includes proteins and protein structures derived from post-translational or chemically modified amino acids such as glycosylated te, phosphorylated halogenated lipid-esterified amino acids, etc., can be built up as well as shorter peptidic amino acid sequences
  • constant sequence region A is understood to mean a sequence, preferably a nucleic acid sequence based on RNA, DNA or cDNA, or else sequences of nucleic acid analogs, such as, for example, a p-RNA CNA or PNA sequence that is identical in all recognition units (components (b))
  • variable sequence region B is understood to mean a sequence, preferably a nucleic acid sequence, the sequence of which is different but known in the respective regions B Nucleic acid sequence
  • region (A) and / or region (B) is preferably approximately 5 to approx. 80 nucleotides, preferably approx. 5 to approx. 30 nucleotides and in particular approx. 10 to approx. 30 nucleotides for region (A) and in particular approx 7-8 nucleotides for region (B), the nucleotides in a particularly preferred embodiment deoxy ⁇ bonucleotides (d), ribonucleotides (r) or 2-
  • a protein profile of a protein population can be characterized, for example, by selecting proteins by means of suitable nucleic acid-protein fusions.
  • WO98 / 31700 describes a system in which mRNA is preferably transferred to the nucleic acid a suitable linker is bound to a protein acceptor, for example a puromycin. In this way it is achieved that shortly before the translation of the mRNA into the corresponding protein has ended, the synthesized protein can be covalently bound to its coding mRNA and thus can be closely related.
  • the linker whose sequence is known is particularly advantageously suitable as a binding region to region (A) of the nucleic acid according to the invention.
  • a poly T 15 strain can be used as region (A) in order to connect a linker, for example with the sequence A27CC, of a nucleic acid-protein fusion
  • the linker can contain a protein acceptor, eg a tRNA amino acid analogue such as the particularly suitable puromycin.
  • a protein acceptor eg a tRNA amino acid analogue such as the particularly suitable puromycin.
  • Comparable systems that can be used for the present invention are described, for example, in DE19646372C1 WO98 / 16636 WO91 / 05058 US 5,843,701, WO93 / 03172 or WO94 / 13623
  • variable sequences of the regions (B) of the recognition units (component (b)) must contain all possible permutations
  • the preferred length of the variable sequence (region B) depends on the complexity of the population, which experience has shown to be lower in a prokaryotic cell and higher in a eukaryotic cell. For example, about 30,000 genes are active in a human cell so that in the case of an array containing all pairing system effector fusion molecules Region B - nucleic acid sequences with a length of 7-8 nucleotides in permuted order are sufficient to detect all active genes of a human cell.
  • n-mer oligonucleotide The number of permutation possibilities for an n-mer oligonucleotide is known to be 4 n where n is the number of nucleotides of the oligonucleotide For the ide
  • a nucleic acid with the following formula, which is bound to a carrier is therefore preferred
  • X any nucleotide selected from adenosine guanosine cytosine, t ⁇ ymidine or uraci! means
  • carrier is understood to mean material, in particular chip material made of semiconductors, in solid or gel-like form
  • support materials are, for example, ceramics, metals, in particular semiconductors, noble metals, glasses, plastics, crystalline materials or thin layers of the support, in particular of the materials mentioned, or (b ⁇ o) molecular filaments, such as cellulose, framework proteins.
  • support systems as in EP- A1-0543550 or WO99 / 15893 and in particular as in
  • a particularly preferred embodiment of the The detection system according to the invention is therefore an electronic chip
  • the carrier is generally covalently, quasi-covalently, supramolecularly or physically and magnetically (AR Shepard et al (1997) Nucleic Acids Res, 25, 3183-3185, No. 15) in an electric field or through a molecular sieve, preferably according to a method as in US 5 605 662 WO96 / 01836, US 5,632 957, WO97 / 12030 or W099 / 15893
  • Another object of the invention is a method for producing a pairing system effector fusion molecule array, for example a Fusagen array, comprising the following method steps i) Production of an array by connecting the recognition units (components (b)) containing a region (A) with a constant sequence and a region (B) adjacent to region (A) with a variable sequence to a carrier (component (a) ), where each array position can be assigned to a recognition unit with a specific region B and n) hybridization of the recognition units (components (b)) with pairing system-effector fusion molecules (components (c)) containing one of the recognition unit (Component (b)) complementary sequence
  • components (c) such as the production of a fusagen
  • more than one recognition system comprising component (b) and component (c) is bound spatially separately to the carrier (component (a)), for example in separate cells, for the production of the array.
  • the detection units (components (b)) can be applied directly to the support surface, for example via adsorption or via spacers known to the person skilled in the art. Special production processes are described, for example, in EP-A1- 0543550 or W099 / 15893 and in particular in US Pat.
  • Arrays are preferred which include all possible permutations in region B of the recognition units (components (b))
  • Preferred embodiments of the method according to the invention include detection systems which have already been described in more detail above.
  • the detection systems are built up on an electronic chip, the component of the sample, for example a nucleic acid fusion with the aid of an electric field is advantageously bound to the recognition unit (component (b)) bound to a carrier, for example a nucleic acid region of component (c) with a complementary sequence.
  • a precise description of such an electronic chip and its Application is described, for example, in EP-A1-0543550 or WO99 / 15893 and in particular in US Pat. No. 5,605,662 WO96 / 01836, US Pat. No. 5,632,957 or WO97 / 12030
  • a suitable nucleic acid linker for example an A 27 CC
  • a suitable ligase for example a T4 DNA ligase.
  • the mRNA linkers are Fusions bound to nucleic acids of the recognition unit (component (b)) with the exemplary formula 3 ' - (X) 7 - s - (T 15 ) -5 ' I, preferably with the aid of an electrical field, where X selected any nucleotide from Ade ⁇ osin, Thymidm Uracil, Guanosin or Cytosin means if necessary in a further step, non- or non-specifically bound nucleic acids, preferably with the help of a reversed electric field, lower field strength than in the first step
  • Another object of the invention is a method for the separation and identification of pairing system-effector-fusion molecules, preferably from complex mixtures (FIG. 2), comprising the following procedure i) Production of a pairing system-effector-fusion-molecule library (components (c) - Library), preferably a Fusagen library n) Hybridization of the pairing system-effector fusion molecules (components (c)) on an array consisting of component (a) and components (b), whose region (B) all possible permutation includes where each permutation is specifically assigned to an array position (IM) Identification of array positions at which a complex consisting of component (b) and component (c) has formed iv) Characterization of the complexes identified under in) consisting of component (b) and component (c)
  • components (c)) such as the generation of a Fusage ⁇ library (components (c)) can be based on WO98 / 31700 or Roberts and
  • a particular advantage of this method is that the special design of the recognition units (components (b)), also pairing system-effector-fusion molecules, in particular fusages, can be identified, in which the area complementary to component (b) is unknown one achieved by the length of the pairing system, which enables a permanent hybridization and, on the other hand, by the length of region B via which the specificity of the hybridization (meaning the same as the separation of the components (c)) can be set
  • the complexes formed during the hybridization of the recognition units (component (b)) and the respective components (c) can be detected by marking the components (c). If, for example, an electronic chip (component (a)) is used, the Complexes moreover eg
  • Characterized sequencing The method is preferably used for the analysis of Fusagen libraries. For example, the state of various cells or tissue samples can be analyzed or compared via the nucleic acid and / or protein profile thus determined. In addition, it can be demonstrated whether a specific nucleic acid or a specific protein is present in a population Possible expression states of different lines can also be identified.
  • Another object of the invention is a method for identifying interactions of one or more binding partners (components (d)) which have an affinity for specific effector units of components (c) (FIG. 3)
  • Affinity in the sense of the present invention means that a component of the sample specifically interacts with the effector unit of component (c)
  • Such interactions can be, in particular, specific protein-protein and / or protein-nucleic acid formations, as well as the specific bond between a chemical agent and a protein effector
  • the method comprises the following method steps i) Incubation of a pairing system-effector-fusion-molecular array with a substance mixture to be analyzed containing at least one component (d) n) Identification of array positions at which a complex consisting of component (b) component ( c) and component (d) has formed m) Characterization of the complexes identified under u) consisting of component (b), component (c) and component (d)
  • the complex that is formed is detected using a component (d) marking.
  • a component (d) marking For example, when using an electronic chip (component (a))
  • the complexes can also be identified, for example, by means of redox processes in the environment or at the electrode or by physical parameters such as impedance measurement and direct current measurement, or in the case of a gold chip, for example by surface plasmon resonance measurement
  • labeling methods for nucleic acids, proteins and / or chemical active substances are chemical and / or physicochemical, enzyme, protein, radioactive isotope, non-radioactive isotope, toxin, chemiluminescent and / or fluorescent labeling
  • Examples of chemical substances known to the person skilled in the art which are suitable for a chemical labeling according to the invention are biotin, fluorescein isothiocyanate (FITC) or streptavidin
  • enzymes known to the person skilled in the art which are suitable for an enzyme labeling according to the invention are malathyrogenase staphylococcus nuclease ⁇ -5-steroidal isomerase alcohol dehydrogenase ⁇ -glycerol phosphate dehydrogenase, typhosphate isomerase peroxidase ⁇ -alkalase phosphatasease aspatasease Catalase glucose-6-phosphate dehydrogenase glucoamylase luciferase or acetylcholmesterase
  • proteins or protein fragments known to the person skilled in the art which are suitable for a protein labeling according to the invention are an N- or C-terminal (H ⁇ S) e, a Myc a FLAG E-tag, Strep-tag a Hamaglute ⁇ in glutathione-Tra ⁇ sferase (GST), Intern with a chitin maltose-forming protein
  • isotopes known to the person skilled in the art which are suitable for radioactive isotope labeling according to the invention are 3 H 125 l 131 l 32 P 33 P, 35 S, 1 C, 1 Cr, 57 To, 58 Co, 59 Fe, 75 Se, 152 Eu, 90 Y 67 Cu 217 C ⁇ 211 At 212 Pb 47 Sc or 109 Pb
  • fluorescent substances known to the person skilled in the art which are suitable for a fluorescent label according to the invention are 152 Eu fluorescein, isothiocyanate, Rhodamm phycoerythin phycocyanin allophycocyanin o
  • Bound nucleic acids can also be further identified or characterized via EST (expressed sequence tags) databases Northern Blot on the detection system according to the invention or by sequencing on the detection system or after targeted release, preferably after prior amplification by means of PCR RT-PCR or cloning
  • Array can be identified Furthermore, it is possible to identify the binding partners of a component (d), preferably a protein, using a labeled component (d) antibody in the form of a sandwich test.
  • a particular advantage of this method is that specific interactions of a component (d) from one Pool of interacting substances, for example in a cell extract, can be specifically identified
  • the array contains, for example, Fusagene with the glycogen synthase and / or the phosphorylase kinase as an effector
  • the effect of the effectors as a substrate can be used in an in vitro assay on the array, for example for the protein kinase which plays an important role in glycogen metabolism can be examined with the help of such an in vitro
  • Assays are shown, for example, that the activation of the protein kinase takes place with the addition of cAMP with regard to the phosphorylation of the two effectors.
  • the removal of the corresponding phosphate groups on the individual effectors can be examined, for example, by adding the protein phosphatase 1
  • the components (d) in the conjugates are preferably proteins, peptides, in particular traction factors, receptors, enzymes and / or chemical agents, preferably organic compounds, pharmacologically active compounds, hormones, crop protection agents, toxins, in particular poisons, carcinogenic and / or teratogenic substances, herbicides, fungicides and / or pesticides contain
  • FIG. 1 schematically describes the detection system according to the invention comprising a carrier ((1) component (a)) and a detection unit component (b) (2) which is bound to the carrier and which can be bound to the surface of the carrier via a spacer (3), which furthermore is a contains constant region (A) (4) and an adjacent variable region (B) (5), and a component (c) (6) comprising a region complementary to region (A) (4) and (B) (5), which is formed from parts of a suitable linker, for example a nucleic acid linker (8) containing puromycin (7) and from parts of the nucleic acid bound to the linker, here RNA (9). At the nucleic acid-puromycin linker (7, 8) the effector unit (10) is bound
  • FIG. 2 schematically describes the identification of a complex consisting of components (a) - (c) using a marker (11) contained in component (c)
  • FIG. 3 schematically describes the identification of a complex consisting of components (a) - (d) with the aid of a label, for example contained in component (d) (12), shown here using the example of an effector antibody
  • a standard glass slide is first degreased in Aceto ⁇ in an ultrasonic bath for 5 minutes (auxiliary color trough for microbiology). After drying in air, the glass slide is treated with 0 1 M NaOH solution in an ultrasonic bath for 5 minutes
  • the amino-modified detection units (components b) can now be immobilized on the silanized glass surface
  • the recognition units (components b) immobilized on the chip in this way are synthesized according to standard methods (see below).
  • RNA coding for the FLAG, MYC and STREP epitope is produced in accordance with Roberts and Szostak (Proc NatI Acad Sei USA 1997) as follows PCR reaction is amplified with the aid of ⁇ er Taq polymerase (Promega, Cat No M166F) the DNA template sequence shown below (Seq ID No 1) with the two polymers (Seq ID No 2/3)
  • the resulting double-stranded DNA product is transcribed into the corresponding RNA sequence (Seq ID No 4) using an in / trans transcription (Promega, Cat No P 1300)
  • a linker (Seq ID No 5), which carries a phosphate group at its 5 'terminus and a puromycin residue (PU) at its 3' terminus, 3'-term ⁇ al to the epitope-coding RNA (Seq ID No 4) ligated
  • the ligation is carried out with T4 DNA lig gases (MBI Cat No EL 0333) with the help of two sapwood molecules (Seq ID No 6/7) which are mixed in the reaction in a ratio of 80 20%
  • NF fluorescein derivative
  • RNA (Seq ID No 4) and linker (Seq ID No 5) is now purified from the non-ligated RNA using a denaturing 6% TBE urea gel
  • the Fusage ⁇ thus synthesized is now purified to homogeneity via O go d (T) cellulose (Amersham Pharmacia Biotech Cat No 27-5543-02) and subsequently by means of Strep Tacti ⁇ -Sepharose (IBA, Cat No 2-1202-005)
  • the recognition units used each consist of a constant region with the sequence 5'-T ⁇ s-3 '(region A) and a variable region (region B) composed of eight nucleotides.
  • the following were used for components (b) Sequences selected (Seq ID No 8/9)
  • Component (b) 5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTAGGCGA-3 '(Seq ID No 9)
  • component (b) -1 within variable region B has the nucleotide sequence which is complementary to the molecule consisting of RNA (Seq ID No 4) and linker (Seq ID No 5), whereas component (b) -2 has the variable region B has no specificity for the target sequence of this molecule.
  • Components (b) were prepared by standard solid-phase DNA synthesis. A 3'-amino-modifier C3 CPG carrier (Glen Research, Cat No 20 -2950-10) or for a 5'-terminal connection on the glass surface
  • 5'-amino modifier C6 phosphoramidite (Glen Research, Cat No 10-1906-90) used
  • a 50 ⁇ M (in 0 1 M NaOH) solution of components (b) -1/2 is applied to the siliconized glass surface positions 1 and 2, respectively. After incubation for at least 2 hours, the glass surface is washed with warm water for approx. 5 minutes
  • the fusagen is recorded in 5 X SCC buffer and transferred to the chip with a cover glass covered and incubated for 5 minutes at 4 ° C
  • the chip is washed 3 times with 5 X SSC buffer at room temperature and the fluorescence fluorescence is read out. Finally, it is washed again with 0 5 x SSC buffer and the fluorescence intensity is read out again. It was found that only in the case of perfect hybridization with the Component (b) -1 was able to detect a fluorescence signal and no interactions of the fusagen with the unspecific sequence of component (b) -2 took place
  • Example 2 Generation of an Exemplary FLAG, MYC, STREP-Fusion Glass Chip for Detection of Protein-Protein Interactions (Detection of the FLAG Epitope with a Fluorescently Labeled Specific Anti-FLAG Antibody)
  • a standard glass slide in acetone is degreased in an ultrasonic bath for 5 minutes (color trough for microbiology). After drying in the air, the glass slide is treated with 0 1 M NaOH solution in the ultrasonic bath for 5 minutes
  • the silanized glass objects After washing with 100% ethanol solution in an ultrasonic bath and drying in air, the silanized glass objects are dried for 20 minutes at 80 ° C.
  • the amino-modified recognition units (component b) can now be immobilized on the silanized glass surface
  • the components (b) immobilized on the chip were synthesized by standard methods (see below).
  • the RNA coding for the FLAG MYC and STREP epitope is based on Roberts and Szostak (Proc NatI Acad Sei USA 1997) as follows
  • the DNA template sequence (Seq ID No 1) with the two primers (Seq ID No 2/3) is amplified using a Taq polymerase (Promega, Cat No M166F) using a PCR reaction
  • RNA sequence (Seq ID No 4) using a wtro transption (Promega, Cat No
  • a linker (Seq ID No 10) which carries a phosphate group at its 5-terminus and a puromycin residue (PU) at its 3'-terminus is ligated 3'-term ⁇ nal to the epitope-coding RNA (Seq ID No 4)
  • the ligation is preferably carried out using T4 DNA ligase (MBI Cat No EL 0333) with the aid of two splint molecules
  • RNA The ligation product consisting of RNA (Seq ID No 4) and linker (Seq ID No).
  • RNA (Seq ID No 4) epitope-coding peptide (Seq ID No 4) and linker (Seq ID No 10) is based on Roberts and Szostak (Proc NatI Acad Sei USA 1997) via a wtro-translation (Promega,
  • the Fusagen synthesized in this way is then purified to homogeneity using oligo d (T) cellulose (Amersham Pharmacia Biotech Cat No 27-5543-02) and subsequently using Strep Tactin-Sepharose (IBA Cat No 2-1202-005)
  • the recognition units used each consist of a constant region with the sequence 5'-T ⁇ s-3 '(region A) and a variable region (region B) composed of eight nucleotides.
  • the following were used for components (b) Sequences selected (Seq ID No 8/9) 23
  • Component (b) -1 within variable region B has the nucleotide sequence which is complementary to the molecule consisting of RNA (Seq ID No 4) and linker (Seq ID No 10), whereas component (b) -2 has the variable region B has no specificity for the target sequence of this molecule.
  • Components (b) were prepared by standard solid-phase DNA synthesis. In the case of immobilization via the 3'-terminus, a 3'-amine modifier C3 CPG carrier (Glen Research Cat No 20-2950-10) or a 5'-amino modifier C6 phosphoramidite (Glen Research, Cat No 10- 1906-90) is used for a 5'-terminal connection on the glass surface.
  • the fusion protein is taken up in 5 x SCC buffer and transferred to the individual chip, covered with a cover glass and incubated for 5 minutes at 4 ° C. Then the Chip 3x washed with 5 x SSC buffer at room temperature and a solution of the anti-FLAG antibody (Sigma Immunochemicals, Cat No F 3040) which had previously been fluorescence-labeled (Cy5 Ab Labellmg Kit, Ameramam Pharmacia Biotech Cat No PA 35000) was added and their fluorescence is read out Finally, it is washed again with 0 5 x SSC buffer and the fluorescence intensity is read out again.
  • the anti-FLAG antibody Sigma Immunochemicals, Cat No F 3040
  • fusagens Two fusagens (components (c)) were synthesized, which could be clearly discriminated against and characterized from one another in a hybrid disruption experiment on the addressable electronic chip.
  • fusagings component (c) -1) from example 2
  • another but different fusagen is used (Component (c) -2) using a template DNA (Seq ID No 11), two primers (Seq ID No 12/13) and a splint (Seq ID No 14) synthesized consisting of RNA (Seq ID No 15 ), epitope coding peptide (Seq ID No 15) and linker (Seq ID No 10)
  • the components (b) immobilized on the electronic chip are biotin-labeled components (b) (Seq ID ⁇ o 16-28), which were obtained by standard D ⁇ A synthesis.
  • the immobilization can in each case be 3'-term ⁇ nal or 5'-term ⁇ nal take place
  • the components (b) are connected to the chip surface with a biotin modification on the 3'-
  • a BiotinTEG CPG carrier (Glen Research Cat Go 20-2955-10) is used for the cnemic D ⁇ A synthesis and the following components (b) with the corresponding biotin modification are synthesized, which also consist of a 15 ⁇ ucleotide-Iange ⁇ thymidine region (region A) and a variable range of 8 nucleotides (region B) exist
  • Component (b) -3 and component (b) -4 are respectively their respective variables
  • Component (c) -3) and Seq ID No 15 + 10 (component (c) -4) or the Fusagene (component (c) -1 or component (c) -2) are taken up in 50 mM histidine buffer and the respective hybridization experiments on the corresponding chip positions (row column) carried out at room temperature 1 1 component (c) -1 1 2 component (c) -2, 2 1 component (c) -1 2.2 component (c) -2 3 1 component (c) -1 3.2 component (c) -2 1 3 component (c) -3, 2 3 component (c) -4 3.3 no component (c)
  • an anti-FLAG antibody Sigma Immunochemicals, Cat No F 3040
  • Cy5 Ab Labellmg Kit Amersham Pharmacia Biotech, Cat No PA 35000
  • An E-antibody Amersham Pharmacia Biotech Cat No 27- 9412-01 that recognizes the E-tag epitope is placed on positions 2 1 and 2.2. Cy5 Ab Labellmg Kit Amersham Pharmacia Biotech Cat No PA 35000), applied to the chip positions 3, 1
  • the fluorescent anti-FLAG antibody or anti-E-tag antibody is applied in order to detect possible non-specific binding events of the antibody

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein Erkennungssystem enthaltend: a) einen Träger (Komponente (a) und (b)), mindestens eine an den Träger gebundene Erkennungseinheit (Komponente (b)), vorzugsweise eine Nukleinsäure, wobei die genannte Erkennungseinheit (Komponente (b)), eine Region (A) mit einer konstanten Struktur und eine zu der Region (A) benachbarte Region (B) mit einer variablen Struktur enthält, auf ein Verfahren zur Auftrennung einzelner Bestandteile in einer Probe, bei dem an mindestens eine an einen Träger gebundene Erkennungseinheit (Komponente (b)) unter geeigneten Bedingungen mindestens ein Bestandteil der Probe gebunden wird, und auf die Verwendung des erfindungsgemäßen Erkennungssystems und des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Auffinden und/oder zur Identifizierung bzw. Charakterisierung von Nukleinsäuren und/oder Proteinen einer Probe bzw. zum Auffinden und/oder zur Identifizierung von zellulären oder künstlichen Bindepartnern.

Description

Erkennungssystem zur Untersuchung von Molekuiwechselwirkungen seine Herstellung und Verwendung
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Erkeπnuπgssystem (Figur 1 ) enthaltend einen Trager (Komponente (a)) und eine an den Trager gebundene Erken- πungsemheit Komponente (b), die eine konstante Region (A) und einer benachbarte variablen Region (B) enthalt, und eine Komponente (c) umfassend eine zu Region (A) und (B) komplementäre Region und eine, gegebenenfalls über einen geeigneten
Linker, daran gebundene Effektoreinheit, die Erfindung bezieht sich weiterhin auf ein Verfahren zur Herstellung solcher Erkeπnungssysteme und auf Verfahren zur Untersuchung von Molekuiwechselwirkungen unter Verwendung der Erkennuπgssysteme
In einer menschlichen Zelle sind im allgemeinen bis zu ca 30 000 Gene aktiv, welche den momentanen Zustand der Zelle charakterisieren Der Zustand einer Zelle kann beispielsweise eine erhöhte Zellteilung im Fall einer Krebszelle oder allgemein veränderte Stoffwechselaktivitaten im Kraπkheitszustand darstellen Die Aktivität eines Gens kann beispielsweise über seine mRNA als Transkriptionsprodukt oder über das entsprechende Protein als Translationsprodukt bestimmt werden Das mRNA- bzw Protein-Profil einer Zelle spiegelt daher deren momentanen Zustand wider
Die Charakterisierung einer gesunden oder kranken Zelle anhand ihres Protein- Profils ist für die Erforschung von Krankheiten und das Auffinden von pharmakolo- gisch wirksamen Verbindungen in jüngster Zeit von großer Bedeutung geworden Es wurden bereits verschiedene Methoden entwickelt die eine Charakterisierung des Protein-Profil einer Zelle ermöglichen
BESTÄΠGUNGSKOPIE Zur direkten Charakterisierung des Protein-Profils in einer Zelle müssen die zellularen Proteine voneinander aufgetrennt werden Eine effiziente Methode ist beispielsweise eine zweidimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophorese (2DE) In der ersten Dimension werden hierbei αie Proteine nach ihrem isoelektrischen Punkt (IP) und in der zweiten Dimension nach ihrem Molekulargewicht aufgetrennt Anschließend werden die Proteine durch Färbung im 2D-Gel sichtbar gemacht wobei in typischen 2D-Gelen ca 1 000-2 000 Proteine als Flecke ( ,spots") eingefarbt werden Als Ergebnis erhalt man ein für jede Zelle signifikantes Proteinmuster oder Profil, das den jeweiligen Zustand der Zelle auf Proteinebene widerspiegelt Jedes Protein einer Zelle hat eine für das Protein spezifische Position auf dem 2D-Gel, so daß man für die Zelle und folglich für den ganzen Organismus eine sogenannte Proteom-Karte erstellen kann Um die molekularen Ursachen von Zeilveranderungen z B bei Krankheitsprozessen zu bestimmen werden die Protein-Profile von gesunden und kranken Zellen verglichen, um eventuelle Unterschiede festzustellen Dieser Ver- gleich kann beispielsweise automatisiert mitteis geeigneter Computer durchgeführt werden (siehe z B Wilkins M R et al (eds ) Proteome Research New Froπtiers in Functional Genomics Springer Verlag, Heidelberg (1997) oder Humphrey-Smith, I et al (1997) Electrophoresis 18 1216-1242) Ein wesentlicher Nachteil dieser Methode ist jedoch, daß für eine weitere Analyse der detektierten Proteine diese auf Proteinebene sequenziert werden müssen was derzeit noch zeit- und kosteninteπsiv
Alternative Methoden zur Bestimmung eventueller Unterschiede im Protein-Profil einer Zelle benutzen sogenannte Arrays, d h Matrixsysteme Arrays sind Anordnun- gen immobilisierter Erkennuπgsspezien die speziell in der Analytik und Diagnostik eine wichtige Rolle bei der simultanen Bestimmung von Analyten spielen Beispiele sind Nukleinsaure-Arrays (siehe z B Southern et al Genomics (1992) 13 1008 U S Patent Nr 5,632 957 W097/27317 oder EP-A1 -0 543 550) oder Peptid-Arrays (Fodor et al , Nature 1993 364 555) In WO96/01836 wird beispielsweise ein Array von DNA-Moiekulen unterschiedlicher Sequenz beschrieben der zur Detektion von
Genabschnitten diente und so beispielsweise zur Diagnose pathogeπer Bakterien führte In den Patentpublikationen U S 5 605 662 WO96/01836 U S 5 632 957 und WO97/12030 werden Halbleiter-Chips und Verfahren beschrieben mit deren Hilfe elektroπiscn kontrollierbar spezifische Bindereaktionen von biologischen Verbindungen, wie Nukleinsäuren oder Proteinen, an spezifische, adressierbare Stellen in Form eines Arrays durchgeführt werden können Beispielsweise werden Nukleinsäuren in einer Probe an einem Nukleinsaure-Array auf einem Halbleiter-Chip mit Hilfe eines elektrischen Feldes hybridisiert und anschließend nicht- oder unspezifisch- gebundene Nukleinsäuren durch eine einfache Umkehrung der Polarität des elektrischen Feldes entfernt Hierbei kann durch eine genaue Einstellung der elektrischen Feldstarke eine Fehlpaarung eines einzigen Basenpaares erkannt werden
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es ein Erkennungssystem bereitzustellen, das aus einer Population von Paarungssystem-Effektor-Fusions-Molekuleπ aufgebaut wird mit dessen Hilfe diese Population identifiziert und charakterisiert werden kann Weiterhin ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Untersuchung von Effektor-Bindungspartπer-Interaktionen
Es wurde nun überraschenderweise gefunden daß eine entsprechende Ansammlung von Erkenπuπgseinheiten enthaltend jeweils eine Region (A) mit einer konstanten Sequenz und eine zu der Region (A) benachbarte Region (B) mit einer variablen Sequenz geeignet ist mittels spezifischer Hybridisierung an Paarungssy- stem-Effektor-Fusions-Molekulen das Effektorprofil zu charakterisieren und anschließend Effektor-Bindungspartner-Interaktionen zu identifizieren
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Erkennungssystem (Figur 1 ) enthaltend i) einen Trager (Komponente (a)) und n) mindestens eine an den Trager gebundene Erkennungseiπheit (Komponente (b)), vorzugsweise ein Paarungssystem wobei die genannte Erkennungseinheit eine Region (A) mit einer konstanten Sequenz und eine zu der Region (A) benachbarte Region (B) mit einer variablen Sequenz enthalt und in) damit verknüpft eine der Erkennungsemneit (Komponente (b)) komplementäre Sequenz enthaltendes Paarungssystem-Effektor-Fusioπs-Molekul (Komponente (c))
Bevorzugt bilden mehrere Erkennungseinheiten (Komponenten (b)) auf dem Trager
(Komponente (a)) einen Array, bei dem jede Array-Position einer definierten variablen Region B der Komponente (b) zugeordnet werden kann Ausgehend von den unterschiedlichen Erkennungsemheiten auf der Arrayoberf lache können die jeweiligen positionsspezifischen Erkennuπgssysteme (Komponenten (a)-(c)) aufgebaut werden
Unter dem Begriff Erkennungseinheit (Komponente (b)) versteht man gemäß der vorliegenden Erfindung Nukleinsäuren oder deren Analoga insbesondere enthaltend Pentosen, vorzugsweise eine Pentopyranose oder Peπtofuraπose Im allgemeinen ist die Pentose ausgewählt aus einer Ribose, Arabinose, Lyxose oder Xylose Beispiele von geeigneten Nukleinsäuren bzw deren Analoga sind DNA, RNA, insbesondere mRNA oder p-RNA (Pyranosyl-RNA, siehe z B W099/15539), Ammocyclo- hexyl-Nukleinsauren (CNA, siehe z B WO99/15509), peptidische Nukleinsäuren (PNA, siehe z B WO92/20702 oder Science (254) 1999, 1497-1500) oder nicht- helikale supramolekulare Nanosysteme wie z B in W098/25943 beschrieben
Die Erkennungseinheit (Komponente (b)) hybridisiert dabei spezifisch mit den zu ihrer Region A und B komplementären Bereichen der Komponente (c) Beispiele für die Komponente (c) sind insbesondere Nukleinsaure-Proteinakzeptor-Deπvate, be- vorzugt Nukleinsaure-Puromycin-Deπvate oder Fusagene wie Nukleinsaure-
Protein-Fusions-Molekule insbesondere Nukleinsaure-Puromycin-Protem-Fusions- Molekule Besonders bevorzugt sind Fusionsmolekule aus den Nukleinsäuren RNA und DNA vorzugsweise in der Fusion mit Puromycin und einem Protein Unter den Begriff Protein fallen im Sinne dieser Erfindung Proteine und Proteinstrukturen die aus posttranslational oder chemisch veränderten Aminosäuren wie z B glykosylier- te, phosphorylierte halogenierte lipidveresterte Aminosäuren usw , aufgebaut werden sowie auch kürzere peptidische Aminosauresequeπzen
Unter dem Begriff konstante Sequenz' (Region A) versteht man gemäß der vorliegenden Erfindung eine Sequenz, bevorzugt eine Nukleinsauresequenz auf RNA-, DNA- oder cDNA-Basis, oder auch Sequenzen von Nuklemsaureanaloga, wie z B eine p-RNA- CNA- oder PNA-Sequenz, die in allen Erkennungseinheiten (Komponenten (b)) identisch ist
Unter dem Begriff variable Sequenz (Region B) versteht man gemäß der vorliegenden Erfindung eine Sequenz bevorzugt eine Nukleinsauresequenz, deren Abfolge in den jeweiligen Regionen B unterschiedlich aber bekannt ist Beispielsweise ist die variable Sequenz einer Nukleinsaure ihre durch Zufallsereignisse bzw Permua- tion der einzelnen Nukleotide entstandene Nukleinsauresequenz
Die Lange der Region (A) und/oder der Region (B) ist vorzugsweise unabhängig voneinander ca 5 bis ca 80 Nukleotide, vorzugsweise ca 5 bis ca 30 Nukleotide und insbesondere ca 10 bis ca 30 Nukleotide für die Region (A) und insbesondere ca 7-8 Nukleotide für die Region (B), wobei die Nukleotide in einer besonders be- vorzugten Ausfuhrungsform Desoxyπbonukleotide (d), Ribonukleotide (r) oder 2-
Hydroxymethylπbonukleotide (hmr) sind In den weiteren Ausfuhrungen werden die Nukleinsauresequenzen ohne deren spezielle Ruckgrate angegeben Die angegebenen Nukleinsauresequenzen umfassen daher in jedem Fall die Ausfuhruπgsfor- meπ (d), (r) und (hmr) Zudem können RNAs gemäß der vorliegenden Erfindung nicht nur aus Ribonukleotiden sondern auch aus 2-Hydroxymethylπbonukleotιden aufgebaut sein
Die Charakterisierung eines Protein-Profils einer Protein-Population beispielsweise einer Protein-Population einer Zelle, gelingt z B über die Selektion von Proteinen mittels geeigneter Nukleinsaure-Protein-Fusionen In WO98/31700 ist beispielsweise ein System beschrieben bei dem an die Nukleinsaure vorzugsweise mRNA über einen geeigneten Linker ein Proteinakzeptor, beispielsweise ein Puromycin gebunden ist Hierdurch wird erreicht daß kurz vor dem Ende der Translation der mRNA in das entsprechende Protein das synthetisierte Protein kovalent an ihre kodierende mRNA gebunden und so naher cnarakteπsiert werden kann Der Linker dessen Se- quenz bekannt ist eignet sich in besonders vorteilhafter Weise als Binderegion an die Region (A) der erfinduπgsgemaßen Nukleinsaure Beispielsweise kann ein poly- T15-Straπg als Region (A) verwendet werden, um an einen Linker z B mit der Sequenz A27CC einer Nukleinsaure-Protein-Fusion zu binden Um die Nukleiπsaure- Protein-Fusion zu erzeugen kann der Linker einen Proteiπakzeptor, z B ein tRNA- Amiπosaureanaiogon wie das besonders geeignete Puromycin enthalten Vergleichbare Systeme die für die vorliegende Erfindung verwendet werden können, sind beispielsweise in DE19646372C1 W098/16636 WO91/05058 U S 5,843,701 , WO93/03172 oder WO94/13623 beschrieben
Um alle unterschiedlichen Bestandteile einer Population aus Paarungssystem-
Effektor-Fusions-Molekulen wie z B Nukleinsäuren-Fusionen insbesondere Nu- klemsaure-Puromycin-Protein-Fusioπen (Fusagene), erfassen zu können, müssen die variablen Sequenzen der Regionen (B) der Erkennungseinheiteπ (Komponente (b)) alle möglichen Permutationen enthalten Die bevorzugt eingesetzte Lange der variablen Sequenz (Region B) hangt hierbei von der Komplexität der Population ab die erfahrungsgemäß bei einer prokaryotischen Zelle geringer und bei einer euka- ryotischen Zelle hoher ist Beispielsweise sind in einer menschlichen Zelle ca 30 000 Gene aktiv so daß im Fall eines alle Paarungssystem-Effektor-Fusions- Molekule enthaltenden Arrays Region B - Nukleinsauresequenzen mit einer Lange von 7-8 Nukleotiden in permutierter Reihenfolge ausreichen um alle aktiven Gene einer menschlichen Zelle zu erfassen Die Zahl der Permutatioπsmoglichkeiten für ein n-mer-Oligonukleotid betragt bekannterweise 4n wobei n die Zahl der Nukleotide des Oligonukleotids bedeutet Für die Identifizierung aller aktiven Gene einer menschlichen Zelle ist daher eine an einen Trager gebundene Nukleinsaure mit fol- gender Formel bevorzugt
3'-(X)7-8-Regιon (A)-5' wobei X jedes beliebige Nukleotid ausgewählt aus Adenosin Guaπosin Cytosin, Tπymidin oder Uraci! beαeutet
Unter dem Begriff Trager versteht man im Sinne der vorliegenden Erfindung Mate- πal, insbesondere Chipmateπal aus Halbleiter das in fester oder auch gelartiger
Form vorliegt Als Tragermateπalien eignen sich beispielsweise Keramik, Metall, insbesondere Halbleiter Edelmetall, Glaser, Kunststoffe, kristalline Materialien bzw dünne Schichten des Tragers insbesondere der genannten Materialien, oder (bιo)molekulare Filameπte wie Cellulose, Gerustproteine Bevorzugt sind Tragersy- steme wie in EP-A1 -0543550 oder WO99/15893 und insbesondere wie in
U S 5,605 662 WO96/01836 U S 5 632,957 oαer WO97/12030 beschrieben da hiermit Halbleiter-Chips hergestellt werden können mit deren Hilfe elektronisch kontrollierbar spezifische Biπdereaktionen von Nukleinsäuren an spezifische, adressierbare Stellen in Form eines Arrays durchgeführt werden können Hierdurch kann in besonders vorteilhafter Weise die spezifisch aufzutrennende Nukleinsaure-
Population einer Probe an einem Nukleinsaure-Array mit den erfinduπgsgemaßen Nukleinsäuren auf dem Halbleiter-Chip mit Hilfe eines elektrischen Feldes hybridisiert und anschließend nicht- oder unspezifisch-gebundene Nukleinsäuren durch eine einfache Umkehrung der Polarität des elektrischen Feldes entfernt werden Ei- ne besonders bevorzugte Ausfuhrungsform des erfindungsgemaßen Erkennungssystems ist daher ein elektronischer Chip
Die Tragerung erfolgt im allgemeinen kovaient quasi-kovalent, supramolekular oder physikalisch wie magnetisch (A R Shepard et al (1997) Nucleic Acids Res , 25, 3183-3185, Nr 15) im elektrischen Feld oder durch einen Molekularsieb, vorzugsweise gemäß einem Verfahren wie in U S 5 605 662 WO96/01836, U S 5,632 957, WO97/12030 oder W099/15893 beschrieben
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Paa- rungssystem-Effektor-Fusions-Molekul-Arrays z B eines Fusagen-Array umfassend folgende Verfahrensschritte i) Herstellung eines Arrays durch Anbinduπg der Erkeπnungseinheiten (Komponenten (b)) enthaltend eine Region (A) mit einer konstanten Sequenz und eine zu der Region (A) benachbarte Region (B) mit einer variablen Sequenz an einen Trager (Komponente (a)), wobei jede Array-Position einer Erkennungseinheit mit einer bestimmten Region B zugeordnet werden kann und n) Hybridisierung der Erkeπnungseiπheiten (Komponenten (b)) mit Paaruπgssy- stem-Effektor-Fusions-Molekulen (Komponenten (c)), enthaltend eine der Erkennungseinheit (Komponente (b)) komplementäre Sequenz
Die Herstellung von Komponenten (c)), wie z B die Erzeugung einer Fusagen-
Bibliothek (Komponenten (c)) kann in Anlehnung an WO98/31700 oder Roberts und Szostak (Proc Natl Acad Sei USA, 1997) erfolgen
Bei dem erfindungsgemaßen Verfahren werden zur Herstellung des Arrays mehr als ein Erkennuπgssystem, umfassend Komponente (b) und Komponente (c), räumlich getrennt an den Trager (Komponente (a)) beispielsweise in separaten Zellen gebunden Die Erkeππungseinheiteπ (Komponenten (b)) können dabei direkt z B über Adsorption oder über dem Fachmann bekannte Spacer auf der Trageroberflache aufgebracht sein Spezielle Herstellungsverfahren sind beispielsweise in EP-A1- 0543550 oder W099/15893 und insbesondere in U S 5 605 662 WO96/01836,
U S 5,632 957 bzw EP-B1 -0373203, WO97/12030 oder WO98/31700 naher beschrieben
Bevorzugt sind Arrays, die alle möglichen Permutationen in der Region B der Erken- nungsemheiten (Komponenten (b)) umfassen
Bevorzugte Ausfuhrungsformen des erfindungsgemaßen Verfahrens beinhalten Erkennungssysteme die oben bereits naher beschrieben wurden In einem besonders bevorzugten erfindungsgemaßen Verfahren werden die Erkennungssysteme auf ei- nem elektronischen Chip aufgebaut wobei die Bestandteil der Probe beispielsweise eine Nukleinsaure-Fusion mit Hilfe eines elektrischen Feldes an die an einen Trager gebundene Erkennungseinheit (Komponente (b)), beispielsweise eine Nukleinsaure- region der Komponente (c) mit komplementärer Sequenz in vorteilhafter Weise gebunden wird Eine genaue Beschreibung eines derartigen elektronischen Chips sowie seine Anwendung wird beispielsweise in EP-A1 -0543550 oder W099/15893 und insbesondere in U S 5 605 662 WO96/01836, U S 5 632 957 oder WO97/12030 beschrieben
Beispielsweise wird in einer bevorzugten Ausfuhrungsform in einem ersten Schritt an eine mRNA-Population einer Probe ein geeigneter Nukleinsaure-Linker beispielsweise ein A27CC bevorzugt chemiscn oder mit Hilfe einer geeigneten Ligase beispielsweise einer T4 DNA Ligase fusioniert in einem zweiten Schritt werden die mRNA-Linker-Fusionen an Nukleinsäuren der Erkennungseinheit (Komponente (b)) mit der beispielhaften Formel 3'-(X)7-s-(T15)-5' I vorzugsweise mit Hilfe eines elektπ- sehen Feldes gebunden gebunden Wobei X jedes beliebige Nukleotid ausgewählt aus Adeπosin, Thymidm Uracil, Guanosin oder Cytosin bedeutet Gegebenenfalls werden in einem weiteren Schritt nicht- oder nicht-spezifisch gebundene Nukleinsäuren, vorzugsweise mit Hilfe eines umgepolten elektrischen Feldes geringerer Feld- starke als im ersten Schritt entfernt
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Auftrennung und Identifizierung von Paarungssystem-Effektor-Fusions-Molekulen bevorzugt aus komplexen Gemischen (Figur 2), umfassend folgende Verfahreπsschπtte i) Herstellung einer Paaruπgssystem-Effektor-Fusions-Molekul-Bib othek (Kom- ponenten (c) - Bibliothek), bevorzugt einer Fusagen-Bibliothek n) Hybridisierung der Paarungssystem-Effektor-Fusions-Molekule (Komponenten (c)) auf einem Array bestehend aus Komponente (a) und Komponenten (b), deren Region (B) alle möglichen Permutation beinhaltet wobei jede Per- mutation spezfisch einer Arraypositiσπ zugeordnet ist IM) Identifizierung von Array-Positionen an denen sich ein Komplex bestehend aus Komponente (b) und Komponente (c) gebildet hat iv) Charakterisierung der unter in) identifizierten Komplexe bestehend aus Komponente (b) und Komponente (c)
Die Herstellung von Komponenten (c)) wie z B die Erzeugung einer Fusageπ- Bibliothek (Komponenten (c)) kann in Anlehnung an WO98/31700 oder Roberts und
Szostak (Proc Natl Acad Sei USA 1997) erfolgen
Ein besonderer Vorteil dieses Verfahrens ist daß durch die spezielle Konstruktion der Erkennungseinheiten (Komponenten (b)), auch Paarungssystem-Effektor- Fusions-Molekule insbesondere Fusageπe identifiziert werden können, bei denen der zu Komponente (b) komplementäre Bereich unbekannt ist Dies wird durch zum einen durch die Lange des Paarungsystems erreicht, wodurch eine stπngente Hybπ- disieruπg ermöglicht wird und zum anderen durch die Lange der Region B über die die Spezifitat der Hybridisierung (gleicbedeutend mit der Auftrennung der Kompo- nenten (c)) eingestellt werden kann
Die sich bei der Hybridisierung der Erkeπnungseinheiten (Komponente (b)) und der jeweiligen Komponenten (c) gebildeten Komplexe können über eine Markierung der Komponenten (c) nachgewiesen werden Bei Verwendung z B eines elektronischen Chips (Komponente (a)) kann eine Identifizierung der Komplexe überdies z B über
Redoxprozesse in der Umgebung oder an der Elektrode oder über physikalische Meßgrößen wie über Impedanzmessung sowie Gleichstrommessung oder im Falle eines Goldchips z B über Oberflachen-Plasmonresonaπzmessung erfolgen
Im allgemeinen werden aus den einzelnen identifizierten Komplexen sequentiell die
Paarungssystem-Effektor-Fusions-Molekule (Komponenten (c)) unter Auflösung der Hybridisierung an Komponente (b) durch z B Erhöhung der Temperatur Variation der lokalen Salzkonzentration oder bevorzugt durch Modulation αer elektronischen Biπdungsparameter eluiert Diese Fusagene werden nun über dem Fachmann be- kannte molekularbiologische Methoden wie z B RT-PCR und anschließende DNA-
Sequenzierung charakterisiert Das Verfahren wird bevorzugt zur Analyse von Fusagen-Bibliotheken verwendet Beispielsweise kann über das so ermittelte Nukleinsaure- und/oder Protein-Profil der Zustand verschiedener Zellen oder Gewebeproben analysiert bzw verglichen wer- den Zudem kann nachgewiesen werden, ob eine spezifische Nukleinsaure oder ein spezifisches Protein in einer Population vorhanden ist Auch können mögliche Ex- pressionszustande verschiedener Zeilen identifiziert werden
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Identifizierung von Wechselwirkungen eines oder mehrerer Bindungspartner (Komponenten (d)) die eine Affinitat zu spezifischen Effektoreinheiten der Komponenten (c) besitzten (Figur 3)
.Affinität" im Sinne der vorliegenden Erfindung bedeutet, daß ein Bestandteil der Probe spezifisch mit der Effektoreinheit der Komponente (c) in Wechselwirkung tritt
Solche Wechselwirkungen können insbesondere spezifische Protein-Protein- und /oder Protein-Nukleinsaure-Biπdungen, sowie die spezifische Bindung zwischen einem chemischen Wirkstoff und einem Protein-Effektor sein
Das Verfahren umfaßt folgende Verfahrensschritte i) Inkubation eines Paarungssystem-Effektor-Fusions-Moiekul-Arrays mit einer zu analysierenden Substanzmischung enthaltend mindestens eine Komponente (d) n) Identifizierung von Array-Positionen an denen sich ein Komplex bestehend aus Komponente (b) Komponente (c) und Komponente (d) gebildet hat m) Charakterisierung der unter u) identifizierten Komplexe bestehend aus Komponente (b), Komponente (c) und Komponente (d)
Im allgemeinen wird der sich gebildete Komplex über eine Markierung Komponenten (d) nachgewiesen Bei Verwendung z B eines elektronischen Chips (Komponente (a)) kann eine Identifizierung der Komplexe uDerdies z B über Redoxprozesse in der Umgebung oder an der Elektrode oder über physikalische Meßgrößen wie über Impedaπzmessung sowie Gleichstrommessung oder im Falle eines Goldchips z B über Oberflachen-Plasmoπresonaπzmessung erfolgen
Im allgemeinen werden aus den einzelnen identifizierten Komplexen sequentiell die Subkomplexe bestehend aus Komponente (c) und Komponente (d) unter Auflösung der Hybridisierung an Komponente (b) durch z B Erhöhung der Temperatur, Variation der lokalen Salzkonzentration oder bevorzugt durch Modulation der elektroni- sehen Bindungsparameter eluiert Die Komponenten (d) werden nun über dem
Fachmann bekannte analytische Methoden cnarakteπsiert
Beispiele von Markierungsverfahren von Nukleinsäuren Proteinen und/oder chemischen Wirkstoffen sind chemische und/oder physikochemische, Enzym-, Protein-, radioaktive Isotopen-, nicht-radioaktive Isotopen-, Toxin-, Chemilumineszens und/oder Fluoreszensmarkierung
Beispiele von dem Fachmann bekannten chemischen Substanzen die sich für eine erfindungsgemaße chemische Markierung eignen sind Biotin, Fluoresceiπisothiocy- anat (FITC) oder Streptavidin
Beispiele von dem Fachmann bekannten erfindungsgemaßen chemischen Modifikationen sind die Übertragung von Methyl-, Acetyl-, Phosphat- und/oder Monosacha- πdgruppen
Beispiele von dem Fachmann bekannten Enzymen, die sich für eine erfindungsge- maße Enzymmarkierung beispielsweise in Form eines ELISA eignen, sind Malathy- drogenase Staphylokokkennuklease Δ-5-Steroιdιsomerase Alkoholdehydrogenase α-Glycerolphosphat-dehydrogenase, Tπosephosphatisomerase Peroxidase, alkalische Phosphatase Asparagmase Glucoseoxidase ß-Galactosidase Urease Kata- lase Glucose-6-phosphatdehydrogenase Glucoamylase Luciferase oder Ace- tylcholmesterase Beispiele von dem Fachmann bekannten Proteinen oder Proteinfragmenten, die sich für eine erfindungsgemaße Proteinmarkierung eignen sind ein N- oder C-terminales (HΙS)e, ein Myc ein FLAG E-tag, Strep-tag ein Hamagluteπin Glutathion- Traπsferase (GST), Intern mit einem Chitin Maltosebiπdendes Protein (MBP) oder Antikörper bzw Antigen-bmdende Teile von Antikörper z B Fv-Fragmente
Beispiele von dem Fachmann bekannten Isotopen die sich für eine erfindungsgemaße radioaktive Isotopeπmarkierung eignen sind 3H 125l 131 l 32P 33P, 35S, 1 C, 1Cr, 57To, 58Co, 59Fe, 75Se, 152Eu, 90Y 67Cu 217Cι 211At 212Pb 47Sc oder 109Pb
Beispiele von dem Fachmann bekannten Isotopen die sich für eine erfinduπgsge- maße nicht-radioaktive Isotopenmarkierung eignen sind 2H oder 13C
Beispiele von dem Fachmann bekannten Toxinen, die sich für eine erfindungsgemaße Toxinmarkierung eignen sind Diphtheπetoxin Ricm oder Choleratoxin
Beispiele von dem Fachmann bekannten chemilumineszenten Substanzen, die sich für eine erfindungsgemaße Chemilumineszeπsmarkierung eignen, sind Luminal- Markierung, Isoluminal-Markierung, aromatische Acπdiπester-Markierung, Oxalester-
Markierung, Lucifeπn-Markierung, Acπdinsalz-Markierung, Imidazol-Markierung oder Aequoπn-Markierung
Beispiele von dem Fachmann bekannten fluoreszierenden Substanzen, die sich für eine erfindungsgemaße Fluoreszensmarkierung eignen sind 152Eu Fluorescein, Isothiocyanat, Rhodamm Phycoerythπn Phycocyanin Allophycocyanin o-
Phthaldehyd, Cy3, Cy5 Green Fluorescent Protein (GFP) und dessen Varianten (YFP, RFP) oder Fluorescamin
Gebundene Nukleinsäuren können auch über EST(expressed sequence tags)- Datenbanken Northern Blot auf dem erfinαungsgemaßen Erkennungssystem oder durch Sequenzierung an dem Erkenπuπgssystem oder nach gezielter Freisetzung vorzugsweise nach vorheriger Amplifikation mittels PCR RT-PCR oder Kloπierung weiter identifiziert bzw charakterisiert werden
Dem Fachmann sind weitere hier nicht aufgeführte Markierung bzw Analyseverfahren, wie z B die Massenspektrometπe NMR-Spektroskopie Kaloπmetπe oder Po- tentiometπe bekannt die auch im Sinne dieser Erfindung zur Markierung eingesetzt werden können Mit Hilfe der vorliegenden Erfindung kann in besonders vorteilhafter Weise der physiologische Zustand einer Zelle und biologische Prozesse einer Zelle identifiziert, charakterisiert und überwacht werden
Die vorliegende Erfindung betrifft daher auch die Verwendung eines erfindungsgemaßen Erkennungssystems eines erfindungsgemaßen Verfahrens oder einer erfindungsgemaßen Erkennungseinheit enthaltend eine Region (A) mit einer konstanten Struktur und eine zu der Region (A) benachbarte Region (B) mit einer variablen Struktur zum Auffinden und/oder zur Identifizierung bzw Charakterisierung von mindestens einem Bestandteil (Komponente (d)) einer Probe insbesondere von Nu- kleinsauren und/oder Proteinen einer Probe, bzw zum Auffinden und/oder zur Identifizierung von zellularen oder künstlichen Biπdepartnern, vorzugsweise von Proteinen, Peptiden Nukleinsäuren chemischen Wirkstoffen, vorzugsweise organischen Verbindungen, pharmakologisch wirksamen Verbindungen, Pflaπzenschutzwirkstof- fen, Toxinen, insbesondere Giften carzinogenen und/oder teratogenen Substanzen, Herbiziden, Fungiziden oder Pestiziden
Von großem Interesse ist dabei die Untersuchung von Interaktionen von Transknpti- onsfaktoren Repressoren oder Enhancer oder die Untersuchung der Wechselwirkungen von Enzymen wie z B Kinasen Phosphatasen GTPasen Esterasen, Gly- cosylasen, Lipasen Oxidasen Reduktasen Hydrolasen Isomerasen oder Ligasen mit deren Substraten oder deren Regulatoren wie z B Induktoren second messenger, wie cAMP oder cGMP Weitere Untersuchungsobjekte sind Rezeptoren und de- ren Bindungspartner wie z B Hormone und Cytokine
Ist z B auf dem erfindungsgemaßen Erkennungssystem-Array die Gesamtpopulation der in einem Zelltyp expremierten Gene über αeren Fusagen (als Komponente (c)) repräsentiert können die Bindungspartner von einzelne Proteinen (Komponente (d)) über die direkte Markierung, z B 35S Isotopenmarkierung als Spots auf dem
Array identifiziert werden Weiterhin ist die Identifizierung der Bindungspartner einer Komponente (d), bevorzugt eines Proteins mit Hilfe eines markierten Komponenten (d) - Antikörpers in Form eines Saπdwich-Assays möglich Ein besonderer Vorteil dieser Methode ist, daß darüber spezifische Wechselwirkungen einer Komponente (d) aus einem Pool von iπteragierenden Substanzen z B in einem Zellextrakt, spezifisch identifiziert werden können
Es kann darüber hinaus auch die Wirkung von Cofaktoren Aktivatoren und Inhibito- ren auf die Interaktion von Effektoren und Komponenten (d) durch sukzessive Zugabe der einzelnen Faktoren untersucht werden
Ein weiteres wichtiges Anwendungsgebiet der Erkennungssystem-Arrays ist die Untersuchung von Enzymaktivitatsmustem So können z B die Substrate einer Ki- nase, die als Phosphatspeπder AT32P nutzt mit Hilfe des Arrays einfach identifiziert werden
Enthalt der Array z B Fusagene mit der Glykogen-Synthase und/oder der Phospho- rylase-Kinase als Effektor kann in einem in vitro Assay auf dem Array die Wirkung der Effektoren als Substrat z B für die im Glykogenstoffwechsel eine wichtige Rolle spielende Protein-Kinase untersucht werden Es kann mit Hilfe eines solchen in vitro
Assays z B gezeigt werden daß die Aktivierung der Protein-Kinase unter Zusatz von cAMP bezüglich der Phosphorylierung der beiden Effektoren erfolgt Darüber hinaus kann die Entfernung der entsprechenden Phosphatgruppen an den einzelnen Effektoren z B durch Zusatz der Protem-Phosphatase 1 untersucht werden
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Konjugate enthaltend ein Erkennungssystem umfassend die Komponenten (a) bis (c), mindestens eine Komponente (d) und gegebenenfalls weitere Substanzen wie mit der Komponente (d) interagierende Substanzen bevorzugt Komponente (d) - Antikörper Bevorzugt enthalten solche Konjugate als Komponente (c) Fusagene
Als Komponenten (d) sind in den Konjugaten bevorzugt Proteine Peptide, insbesondere Traπkπptionsfaktoren Rezeptoren Enzyme und/oder chemische Wirkstoffe, vorzugsweise organische Verbindungen, pharmakologisch wirksame Verbindungen, Hormone Pflanzenschutzwirkstoffe Toxine insbesondere Gifte, carzinogene und/oder teratogene Substanzen, Herbizide Fungizide und/oder Pestizide enthalten
Die folgende Figuren sollen die Erfindung naher beschreiben ohne sie zu beschranken
Beschreibung der Figuren
Figur 1 beschreibt schematisch das erfindungsgemaße Erkennungssystem enthaltend einen Trager ((1) Komponente (a)) und eine an den Trager gebundene Erkennungseinheit Komponente (b) (2), die über einen Spacer (3) an der Trageroberflache gebunden sein kann die weiterhin eine konstante Region (A) (4) und eine benachbarten variable Region (B) (5) enthalt, und eine Komponente (c) (6) umfassend eine zu Region (A) (4) und (B) (5) komplementäre Region, die aus Teilen eines geeigneten Linkers, z B einen Puromycin (7) enthaltenden Nukleinsaure-Linker (8) und aus Teilen der an den Linker gebundenen Nukleinsaure, hier RNA (9) gebildet wird An den Nukleinsaure-Puromycin-Linker (7, 8) ist die Effektoreinheit (10) gebunden
Figur 2 beschreibt schematisch die Identifizierung eines Komplexes bestehend aus den Komponenten (a)-(c) mit Hilfe einer in Komponente (c) enthaltenen Markierung (11 ) Figur 3 beschreibt schematisch die Identifizierung eines Komplexes bestehend aus den Komponenten (a)-(d) mit Hilfe einer beispielsweise in Komponente (d) (12) enthaltenen Markierung hier am Beispiel eines Effektor-Antikörpers gezeigt
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung naher beschreiben ohne sie zu beschranken
Beispiel 1 Generierung eines exemplarischen FLAG MYC STREP-Fusioπs-
Glaschips
Für die Silanisierung der Glaschipoberflache wird zunächst ein Standardglasobjekt- trager in Acetoπ im Ultraschallbad für 5 Minuten entfettet (Hilfsmittel Farbetroge für die Mikrobiologie) Nach Trocknen an der Luft werden die Glastrager für 5 Minuten mit 0 1 M NaOH-Losung im Ultraschallbad behandelt
Anschließend erfolgt ein Waschen mit destilliertem Wasser für weitere 5 Minuten im Ultraschallbad Um die letzten verbliebenen Reste an NaOH zu entfernen wird der Waschvorgang mit destilliertem Wasser wiederholt Anschließend erfolgt der Silani- sieruπgsschπtt Dazu wird eine 2-3 %ιge-(3-Glycιdyloxypropyl)tπmethoxysιlan-
Losuπg in 95 %-ιger wassπgem Ethaπol (Ethanol Wasser 95 5 v v) hergestellt Die ethanolische Silan-Losung wird mit koπz Essigsaure auf einen pH von 4 9-5 2 eingestellt Nach Zugabe und Hydrolyse für 10 Minuten werden die Glasoberflachen für 2 Minuten mit dieser vorbereiteten Silanisierungs-Losung im Ultraschallbad behan- delt
Nach Waschen mit 100 %-ιger Ethanol-Losung im Ulltraschallbad und Trocknung an der Luft werden die silanisierten Glasobjektrager für 20 Minuten bei 80 °C getrocknet Auf die silanisierten Glasoberflache können nun die Amino-modifizierten Erken- nuπgseinheiten (Komponenten b) immobilisiert werden Die so auf dem Chip immobilisierten Erkennπungseiπheiten (Komponenten b) werden nach Standardverfahren synthetisiert (s u ) Die für das FLAG, MYC und STREP-Epitop kodierende RNA wird in Anlehnung an Roberts und Szostak (Proc NatI Acad Sei USA 1997) wie folgt produziert Über eine PCR-Reaktion wird mit Hilfe αer Taq-Polymerase (Promega, Cat No M166F) die unten abgebildete DNA- Template-Sequenz (Seq ID No 1 ) mit den beiden Pπmern (Seq ID No 2/3) amplifi- ziert
5'-GATTACAAGGACGACGACGACAAGGAACAGAAGCTGATCTCCGAAGAGGATC- TGGCAATGTGGAGCCACCCGCAGTTTGAGAAA-3' (Seq ID No 1 )
5 -TAATACGACTCACTATAGGGACAATTACTATTTACAATTACAATGGATTACAAG- GACGACGACGACAAGG-3' (Seq ID No 2)
5'-AGCGGATGCTTTCTCAAACTGCGGGTGGCTCCAC-3' (Seq ID No 3)
Das resultierende doppelstrangige DNA-Produkt wird über eine in v/ ro-Transkription in die entsprechende RNA-Sequenz (Seq ID No 4) transkribiert (Promega, Cat No P 1300)
5'-GGACAAUUACUAUUUACAAUUACAAUGGAUUACAAGGACGACGACGACAAG- GAACAGAAGCUGAUCUCCGAAGAGGAUCUGGCAAUGUGGAGCCACCCGCA- GUUUGAGAAAGCAUCCGCU-3' (Seq ID No 4)
Weiterhin wird ein Linker (Seq ID No 5), der an seinem 5 '-Terminus eine Phosphatgruppe und an seinem 3'-Termιnus einen Puromycin-Rest (Pu-) tragt 3'-termιπal an die epitopkodierende RNA (Seq ID No 4) ligiert Die Ligation erfolgt mit T4 DNA Li- gase (MBI Cat No EL 0333) unter zu Hilfenahme zweier Splint-Molekule (Seq ID No 6/7) die im Verhältnis von 80 20 % in die Reaktion gemischt werden
5 -AAAAAAAAAAAAAAAAAANFAAAAAAAACCPU-3' (Seq ID No 5)
5'-GCGCGCTπTT I I I I I AGCGGATGC-3' (Seq ID No 6)
5'-GCGCGCNπTTTTTTTAGCGGATGC-3' (Seq ID No 7)
Darüber hinaus ist innerhalb des Linkers mittels Standard-DNA-Festphasensynthese ein Fluorescein-Derivat (NF, Interactiva) eingebaut welches im Falle der spezifischen Hybridisierung mit den komplementären Komponenten (b) eine Auslesung eines Bmdungsereignissses über die auftretende Fluoreszenz ermöglicht
Das Ligationsprodukt bestehend aus RNA (Seq ID No 4) und Linker (Seq ID No 5) wird nun über ein denaturierendes 6 %ιges TBE-Harnstoffgel von der nicht-ligierten RNA gereinigt
Die Synthese des Fusagens bestehend aus RNA (Seq ID No 4) epitopkodierendem Peptid (Seq ID No 4) und Linker (Seq ID No 5) erfolgt in Anlehnung an Roberts and Szostak (Proc NatI Acad Sei USA 1997) über eine in ro-Translation (Promega
Cat No L 4960) und einer anschließenden Inkubation des Translationsansatzes mit MgCI2 (150 mM) und KCI (530 mM)
MYC MDYKDDDDKEQKLISEEDLAMWSHPQFEKASA (Seq lD No 4)
FLAG STREP Das so synthetisierte Fusageπ wird nun über O go d(T)-Cellulose (Amersham Pharmacia Biotech Cat No 27-5543-02) und nachfolgend mittels Strep Tactiπ- Sepharose (IBA, Cat No 2-1202-005) zur Homogenitat aufgereiπigt
Die verwendeten Erkennungseinheiten ( Komponenten (b)) bestehen jeweils aus einem konstanten Bereich mit der Sequenz 5'-Tιs-3' (Region A) und einem aus acht Nukleotiden aufgebauten variablen Bereich (Region B) Für die Komponenten (b) wurden die folgenden Sequenzen ausgewählt (Seq ID No 8/9)
Komponente (b)-1 5'-TT I I I I I I I I I I I TTAGCGGATG-3' (Seq ID No 8)
Komponente (b)-2 5'-TTTTTTTTTTTTTTTGTAGGCGA-3' (Seq ID No 9)
Hierbei besitzt Komponente (b)-1 innerhalb der variablen Region B die zum Molekül bestehend aus RNA (Seq ID No 4) und Linker (Seq ID No 5) komplemetare Nu- kleotidabfolge, wohingegen die Komponente (b)-2 bzgl der variablen Region B keine Spezifitat zur Zielsequenz dieses Moleküls besitzt Die Komponenten (b) wurden durch Standard-Festphasen-DNA-Synthese hergestellt Für die Immobilisierung über den 3'-Termιnus wurde ein 3'-Amιno-Modιfιer C3 CPG Trager (Glen Research, Cat No 20-2950-10) bzw für eine 5'-termιnale Anknüpfung auf der Glasoberflache ein
5'-Amιno-Modιfιer C6 Phosphoramidit (Glen Research, Cat No 10-1906-90) verwendet Für die Immobilisierung wird eine 50 μM (in 0 1 M NaOH) Losung der Komponenten (b)-1/2 auf die siianisierte Glasoberflache an den Positionen 1 bzw 2 aufgebracht Nach Inkubation für wenigstens 2 Stunden wird die Glasoberflache für ca 5 Minuten mit warmen Wasser gewaschen Im Anschluß daran wird der Chip für 10
Minuten mit 5 X SSC-Puffer gewaschen
Für die Hybridisierung des im polyA-Bereich mit Fluoreseein fluoreszenzmarkierten Fusagens mit der komplementären Zielsequenz von Komponente (b)-1 (an der Position 1 ) wird das Fusagen in 5 X SCC-Puffer aufgenommen und auf den Chip transfe- nert, mit einem Deckglas abgedeckt und für 5 Minuten bei 4 °C inkubiert Anschlie- ßend wird der Chip 3 x mit 5 X SSC-Puffer bei Raumtemperatur gewaschen und die Fluoresceiπ-Fluoreszeπz ausgelesen Zum Abschluß wird nochmals mit 0 5 x SSC- Puffer gewaschen und erneut die Fluoreszenzmtensitat ausgelesen Es zeigte sich daß nur im Fall der perfekten Hybridisierung mit der Komponente (b)-1 ein Fluoreszenzsignal nachzuweisen war und keinerlei Interaktionen des Fusagens mit der un- spezifischen Sequenz von Komponente (b)-2 stattfanden
Beispiel 2 Generierung eines exemplarischen FLAG, MYC, STREP-Fusioπs- Glaschips zur Detektion von Protein-Protein-Interaktionen (Erkennung des FLAG- Epitops mit einem fluoreszenzmarkierten spezifischen anti-FLAG Antikörper)
Für die Silanisierung der Glaschipoberflache wird zunächst ein Standardglasobjekt- trager in Aceton im Ultraschallbad für 5 Minuten entfettet (Hilfsmittel Farbetroge für die Mikrobiologie) Nach Trocknen an der Luft werden die Glastrager für 5 Minuten mit 0 1 M NaOH-Losung im Ultraschalibad behandelt
Anschließend erfolgt ein Waschen mit destilliertem Wasser für weitere 5 Minuten im Ultraschallbad Um die letzten verbliebenen Reste von NaOH zu entfernen, wird der Waschvorgang mit destilliertem Wasser wiederholt Anschließend erfolgt der Silani- sierungsschπtt Dazu wird eine 2-3 %ιge-Glycιdyloxypropyltπmethoxysιlan-Losung in 95 %-ιger wassπger Ethanol (Ethanol Wasser 95 5 v v) hergestellt Die ethanoli- sche Silan-Losung wird mit konz Essigsaure auf einen pH von 4 9-5 2 eingestellt Nach Zugabe und Hydrolyse für 10 Minuten werden die Glasoberflachen für 2 Minuten mit dieser vorbereiteten Silaπisieruπgs-Losung im Ultraschallbad behandelt
Nach Waschen mit 100 %-ιger Ethanol-Losung im Ulltraschallbad und Trocknung an der Luft, werden die silanisierten Glasobjektrager für 20 Minuten oei 80 °C getrocknet Auf die silanisierte Glasooerflache können nun die Amino-modifizierten Erkennungseinheiten (Komponente b) immobilisiert werden
Die auf dem Chip immobilisierten Komponenten (b) wurden nach Staπdardverfahren synthetisiert (s u ) Die für das FLAG MYC und STREP-Epitop kodierende RNA wird in Anlehnung an Roberts und Szostak (Proc NatI Acad Sei USA 1997) wie folgt produziert Über eine PCR-Reaktion wird mit Hilfe der Taq-Polymerase (Promega, Cat No M166F) die DNA-Template-Sequeπz (Seq ID No 1 ) mit den beiden Primern (Seq ID No 2/3) amplifiziert
Das resultierende αoppelstrangige DNA-Produkt wird über eine in wtro-Transkπption in die entsprechende RNA-Sequenz (Seq ID No 4) transkribiert (Promega, Cat No
P 1300)
Weiterhin wird ein Linker (Seq ID No 10), der an seinem 5 -Terminus eine Phosphatgruppe und an seinem 3'-Termιnus einen Puromycin-Rest (Pu-) tragt 3'-termιnal an die epitopkodierende RNA (Seq ID No 4) ligiert Die Ligation erfolgt bevorzugt mit T4 DNA Ligase (MBI Cat No EL 0333) unter zu Hilfenahme zweier Splint-Molekule
(Seq ID No 6/7) die im Verhältnis von 80 20 % in die Reaktion gemischt werden
5'-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACCPu-3' (Seq ID No 10)
Das Ligationsprodukt bestehend aus RNA (Seq ID No 4) und Linker (Seq ID No
10) wird nun über ein denaturierendes 6 %ιges TBE-Harnstoffgel von der nicht- ligierten RNA gereinigt
Die Synthese des Fusagens bestehend aus RNA (Seq ID No 4) epitopkodiereπdem Peptid (Seq ID No 4) und Linker (Seq ID No 10) erfolgt in Anlehnung an Roberts and Szostak (Proc NatI Acad Sei USA 1997) über eine in wtro-Translation (Promega,
Cat No L 4960) und einer anschließenden Inkubation des Translationsansatzes mit MgCI2 (150 mM) und KCI (530 mM)
Das so synthetisierte Fusagen wird nun über Oligo d(T)-Cellulose (Amersham Pharmacia Biotech Cat No 27-5543-02) und nachfolgend mittels Strep Tactin- Sepharose (IBA Cat No 2-1202-005) zur Homogenitat aufgereinigt
Die verwendeten Erkennungseinheiten (Komponenten (b)) bestehen jeweils aus einem konstanten Bereich mit der Sequenz 5'-Tιs-3' (Region A) und einem aus acht Nukleotiden aufgebauten variablen Bereich (Region B) Für die Komponenten (b) wurden die folgenden Sequenzen ausgewählt (Seq ID No 8/9) 23
Komponente (b)-1 5'- l l I I l I N I I AGCGGATG-3' (Seq ID No 8)
Komponente (b)-2 5'- ι i I I I I i i "GTAGGCGA-3 (Seq ID No 9)
Hierbei besitzt Komponente (b)-1 innerhalb der variablen Region B die zum Molekül bestehend aus RNA (Seq ID No 4) und Linker (Seq ID No 10) komplemetare Nu- kleotidabfolge, wohingegen die Komponente (b)-2 bzgl der variablen Region B keine Spezifitat zur Zielsequenz dieses Moleküls besitzt Die Komponenten (b) wurden durch Standard-Festphasen-DNA-Syπthese hergestellt Im Falle einer Immobilisie- rung über den 3'-Termιnus wurde ein 3'-Amιno-Modιfιer C3 CPG Trager (Glen Research Cat No 20-2950-10) bzw für eine 5'-termιnale Anknüpfung auf der Glasoberflaehe ein 5'-Amιno-Modιfιer C6 Phosphoramidit (Glen Research, Cat No 10- 1906-90) verwendet Für die Immobilisierung wird eine 50 μM (in 0 1 M NaOH) Losung der Komponenten (b)-1/2 auf die silanisierte Glasoberflache an den Positionen 1 bzw 2 aufgebracht Nach Inkubation für wenigstens 2 Stunden wird die Glasoberflache für ca 5 Minuten mit warmen Wasser gewaschen Im Anschluß daran wird der Chip für 10 Minuten mit 5 X SSC-Puffer gewaschen
Für die Hybπdisieruπg des Fusagens mit der komplementären Komponente (b)-1 (Position 1 ) wird das Fusionsprotein in 5 x SCC-Puffer aufgenommen und auf den einzelnen Chip transferiert mit einem Deckglas abgedeckt und für 5 Minuten bei 4 °C inkubiert Anschließend wird der Chip 3x mit 5 x SSC-Puffer bei Raumtemperatur gewaschen und eine Losung des anti-FLAG Antikörpers (Sigma Immunochemicals, Cat No F 3040) der zuvor fluoreszenzmarkiert wurde (Cy5 Ab Labellmg Kit, Amer- sham Pharmacia Biotech Cat No PA 35000) aufgegeben und deren Fluoreszenz ausgelesen Zum Abschluß wird nochmals mit 0 5 x SSC-Puffer gewaschen und erneut die Fluoreszenzintensitat ausgelesen Es zeigte sich daß nur im Fall der perfekten Hybridisierung mit der Komponente (b)-1 ein Fluoreszeπzsigπal nachzuweisen war und keinerlei Interaktionen des Fusagens bzw des fluoreszenzmarkierten Antikörpers mit der unspezifischen Sequenz von Komponente (b)-2 stattfanden Beispiel 3 Generierung eines exemplarischen Fusagen-Arrays bestehend aus zwei unterschiedlichen Fusagenen auf einem elektronisch adressierbareπ Chip
Es wurden zwei Fusagene (Komponenten (c)) synthetisiert die in einem Hybπdisie- ruπgsexpeπment auf dem adressierbaren elektronischen Chip eindeutig voneinander diskriminiert und charakterisiert werden konnten Neben dem Fusagen (Komponente (c)-1 ) aus Beispiel 2 wird dazu ein weiteres aber unterschiedliches Fusagen (Komponente (c)-2) mit Hilfe einer Template-DNA (Seq ID No 1 1 ), zweier Primer (Seq ID No 12/13) und eines Splints (Seq ID No 14) synthetisiert bestehend aus RNA (Seq ID No 15), epitopkodierendem Peptid (Seq ID No 15) und Linker (Seq ID No 10)
5'-GGTGCGCCGGTGCCGTATCCGGATCCGCTGGAACCGCGTGAACAGAAGCT- GATCTCCGAAGAGGATCTGGCAATGTACAAGGACGACGACGACAAG-3' (Seq ID No 1 1 )
5'-TAATACGACTCACTATAGGGACAATTACTATTTACAATTACAATGGGTGCGC-
CGGTGCCGTAT-3' (Seq ID No 12)
5'-CTTGTCGTCGTCGTCCTTGTACATTGCCAGATCCT-3' (Seq ID No 13)
5'- l I I I I I I I I I CTTGTCGTC-3' (Seq ID No 14)
5'-GGACAAUUACUAUUUACAAUUACAAUGGGUGCGCCGGUGCCGUAUCCG- GAUCCGCUGGAACCGCGUGAACAGAAGCUGAUCUCCGAAGAGGAUCUGG- CAAUGUACAAGGACGACGACGACAAG-3' (Seq ID No 15) MYC
MGAPVPYPDPLEPREQKLISEEDLAΛINKDDDDKASA (Seq ID Νo 15)
E-TAG FLAG
Bei den auf dem elektronischen Chip immobilisierten Komponenten (b) handelt es sich um Biotin-markierte Komponenten (b) (Seq ID Νo 16-28), die nach Standard- DΝA-Synthese erhalten wurden Die Immobilisierung kann dabei jeweils 3'-termιnal bzw 5'-termιnal erfolgen In dem angeführten Beispiel erfolgt die Anknüpfung der Komponenten (b) auf die Chipoberflache mit einer Biotinmodifizieruπg am 3'-
Terminus Hierfür wird für die cnemische DΝA-Synthese ein BiotinTEG CPG-Trager (Glen Research Cat Νo 20-2955-10) verwendet und die folgenden Komponenten (b) mit der entsprechenden Biotinmodifikation synthetisiert die darüber hinaus aus einem 15 Νukleotid-Iangeπ Thymidinbereich (Region A) und einem variablen Bereich von 8 Nukleotiden (Region B) bestehen
Komponente (b)-3 5'-T I I I I I I I I I I I I I I GGATGCTTBιo-3' (Seq ID No 16) Komponente (b)-4 5'- l I I I I I I I I I I I I I I CTTGTCGTBιo-3' (Seq ID No 17)
Komponente (b)-5 5'- 1 I I I I I I I I I I I I I I GTAGGCGABιo-3' (Seq ID No 18)
Die Komponente (b)-3 bzw Komponente (b)-4 sind bzgi ihrer jeweiligen variablen
Region B komplementär zu der jeweiligen Komponente (c)-1 bzw Komponente (c)- 2 Die Komponente (b)-5 besitzt bezüglich der Region B keinerlei Spezifitat zu den komplementären Zielsequenzen von Komponente (c)-1 bzw Komponente (c)-2
Für die Immobilisierung der Komponenten (b)-3-5 wird eine 1 μM -Losung derjewei- (igen Komponenten (b) in 50 mM-Histidin-Puffer hergestellt und jeweils 50 μi der entsprechenden Komponente (b) auf einem 3 x 3-Posιtιonen enthaltenden Chip aus Halbleitermateπal aufgetragen Die Immobilisierung wurde bei Raumtempertur durchgeführt Die folgende Positionenbelegung (Zeile Spalte) auf dem Chip wurde ausgewählt 1 1 Komponente (b)-3 1 2 Komponente (b)-4 2 1 Komponente (b)-3 2 2 Komponente (b)-4 3 1 Komponente (b)-5 3 2 Komponente (b)-5 1 3 Komponente (b)-3,
2 3 Komponente (b)-4 3 3 Komponente (b)-5
Für die Hybridisierung der ligierten Nukleinsäuren bestehend aus Seq ID No 4+10
(Komponente (c)-3) und Seq ID No 15+10 (Komponente (c)-4) bzw der Fusagene (Komponente (c)-1 bzw Komponente (c)-2) werden diese in 50 mM Histidin-Puffer aufgenommen und die jeweiligen Hybπdisieruπgexpeπmente auf den entsprechenden Chippositioneπ (Zeile Spalte) bei Raumtemperatur durchgeführt 1 1 Komponente (c)-1 1 2 Komponente (c)-2, 2 1 Komponente (c)-1 2,2 Komponente (c)-2 3 1 Komponente (c)-1 3,2 Komponente (c)-2 1 3 Komponente (c)-3, 2 3 Komponente (c)-4 3,3 keine Komponente (c)
Zur Charakterisierung der auf dem Chip stattgefundenen Hybπdisierungsereigπisse wird nun auf die Positionen 1 1 und 1 ,2 ein das FLAG-Epitop spezifisch-erkenπender anti-FLAG Antikörper (Sigma Immunochemicals, Cat No F 3040), der zuvor fluoreszenzmarkiert wurde (Cy5 Ab Labellmg Kit, Amersham Pharmacia Biotech, Cat No PA 35000) aufgetragen Auf die Positionen 2 1 und 2,2 wird ein das E-Tag Epitop erkennender E-Tag-Aπtikorper (Amersham Pharmacia Biotech Cat No 27- 9412-01 ) der zuvor fluoreszenzmarkiert wurde (Cy5 Ab Labellmg Kit Amersham Pharmacia Biotech Cat No PA 35000), aufgetragen Auf den Chippositionen 3, 1
3,2, 1 3 2 3 und 3,3 wird der fluoreszierende Anti-FLAG-Antikorper bzw Anti-E-tag Antikörper aufgetragen um mögliche unspezifische Bindungsereignisse des Antikörpers zu detektieren
In allen Fallen wurde die Fluoreszenzintensitat ausgelesen Es zeigte sich daß im Fall einer perfekten Hybridisierung der Komponenten (b) mit den komplementären
Komponenten (c)-1/2 mit Hilfe des fluoreszenzmarkierten Anti-FLAG-Antikorper als Fluoreszenzsonde auf den Chippositionen 1 1 und 1 2 ein spezifisch positives Bindungsereignis stattfand Im Falle der Interaktionen des Anti-E-Tag Antikörpers (auf den Positionen 2 1 und 2 2) war lediglich auf Position 2 2 die die mit dem E-Tag Epitop beladeπe Komponente (c)-2 tragt ein Anstieg der Fluoreszenzintensitat nachweisbar Diese Experimente zeigen deutlich daß zunächst die Komponenten (c)-1 und -2 spezifisch von den jeweiligen Antikörpern erkannt wurden Durch ein Kontrollexpeπmeπt wurde zunächst die Möglichkeit untersucht, ob die beiden Fusa- geπe uπspezifische Wechselwirkungen mit einer Komponente (b) eingehen können, welche im variablen Bereich (Region B) keinerlei Komplementaπtat zu den Komponenten (c) besitzt (Position 3 1 und 3,2) Nach Zugabe des Anti-FLAG-Antikorpers konnte keine Fluoreszenz nachgewiesen werden so daß davon ausgegangen werden kann daß es zu keiner unspezifischen Hybridisierung der Komponenten (c) kam Durch ein weiteres Kontrollexperiment wurde zudem ausgeschlossen, daß der Anti-FLAG-Antikorper mit doppelstraπgiger Nukleinsaure interagiert Hierzu wurden auf die Positionen 1 ,3 und 2 3 die jeweiligen Komponenten (c)-3/4 ohne Peptidepitop aufgetragen und durch Zugabe der Anti-FLAG-bzw Anti-E-Tag Antikörper gezeigt, daß keine Fluoreszenzanderuπg auftrat Abschließend konnte noch gezeigt werden, daß die fluoreszierenden Aπti-FLAG-bzw Anti-E-Tag Antikörper keinerlei Affinitat zu eiπzelstraπgigem Komponenten (b) besitzt (Experiment auf Position 3,3) Die Ergebnisse sind zur Übersicht in der folgenden Tabelle skizziert
Chipposition Komponente (c)/Komponeπte (b) Antikörper Fluoreszenzsigπal Ϊ ϊ 3 FLAG +
1 ,2 2/4 FLAG +
2.1 1/3 E-Tag
2.2 2/4 E-Tag +
3.1 1/5 FLAG
3.2 2/5 FLAG
1.3 3/3 FLAG 2.3 4/4 E-Tag 3,3 -15 E-Tag

Claims

Patentansprüche
1 Erkennuπgssystem enthaltend i) einen Trager (Komponente (a)) und n) mindestens eine an den Trager gebundene Erkennungseinheit (Komponente (b)) woDei die genannte Erkennungseinheit umfassend ein Paarungssystem mit einer Region (A) mit einer konstanten Sequenz und eine zu der Region (A) oenachbarte Region ( B) mit einer variablen
Sequenz enthalt und in) damit verknüpft eine der Erkeππungseinheit (KomDoneπte (b)) komplementäre Sequenz enthaltendes Paarungssystem-Effektor-Fusioπs- Molekul (Komponente (c))
Erkennungssystem nach Anspruch 1 dadurcn gekennzeichnet, daß die Lange der Region (A) 5 bis ca 80 Nukleotide oder Nukleotidanaloga vorzugsweise 5 bis ca 30 NuKleotide oσer Nukleotidanaloga und insbesondere 10 bis 30 Nukleotide oder Nukleotidanaloga ist
Erkennungssystem nach Ansprucn 1 oder 2 dadurcn geκeππzeιchnet daß die Region (B) 5 bis 30 insbesondere 5 bis 10 bevorzugt ~-8 Nukleotide oder Nukleotidanaloga lang ist
Erkennungssystem nach den AnsDrucnen 1 bis 3 dadurch geκennzeιchnet daß die Nukleotide Desoxyπboπukleotide (d) Ribcπukleotide \r) oder 2- Hydroxymethyiπbonukleotide (hmr) sind
BESTÄΠGÜNGSMOΠE Erkeπnungssystem nach Anspruch 2 dadurcn gekennzeicnnet daß die Nukleotidanaloga p-RNA- CNA- oder PNA-Monomere sind
Erkennuπgssystem nacn einem der Ansprüche 1 bis 4 daourcn gekennzeichnet daß die Region (A) aus einem poly-T-Straπg vorzugsweise einem T7-15- Strang besteht
Erkenπungssystem nach einem der Ansprüche 1 bis 6 dadurch gekennzeichnet daß die Komponente c ausgewählt sind aus Nukleiπsaure- Proteinakzeptor-Fusions-Molekulen und/oder Nukleiπsaure-Protein-Fusions-
Molekulen insDesoπdere aus einem Nukleinsaure-Puromycn-Deπvateπ und/oder Nukleiπsaure-Puromyciπ-Protein-Fusioπs-Molekuleπ
Erkennungssystem nach e>πem der Ansprüche 1 bis 7 dadurcn gekennzeich- net, daß der Trager aus Keramik Metall insbesondere Halbleiter Edelmetall
Glaser Kunststoffe kristalline Materialien bzw dünne Schienten des Tragers insbesondere der genannten Materialien oder (bιo)molekulare Fiiamente wie Cellulose Gerustproteine oder aus einer Kombination der genannten Materialien aufαebaut ist
Erkennungssystem nacn e'nem der Ansprüche 1 bis 8 dadurcn gekennzeichnet daß das Erkennungssvstem auf e'nem elektroniscnen Chip aufgebaut ist
Verfahren zur Herstellung eines Erkennungssystems gemäß e'nem der An- spruche 1 bis 9 umTassend die Herstellung eines Arrays cι-rch Aπbindung der Erkenπungseinneiten (Komponenten (b)) enthaltene eine Region (A) mit einer konstanten Seouenz und eine zu der Region (A) benaenoarte Region ( B) mit einer vaπaüien Seouenz an einen Trager (Komponente ι aj) wobei lede Array-Position eιner ErKennungs- einheit mit einer bestimmten Region B zugeordnet werden Kam und Hybπαisierung der Erkennungseinheiten (KomDoneπteπ (b)) mit Paarungssy- stem-Effektor-Fusions-Molekuien (Komponenten (c)), enthaltend eine der Er- keπnungseinheit (Komoonente (b)) komolemeπtaren Sequenz
Verfahren zur Auftreπnung und Identifizierung einzelner Bestandteile in einer
Paarungssystem-Effektor-Fusions-Molekule enthaltende Losung umfassend i) Hersteilung einer Paaruπgssystem-Effektor-Fusions-Molekul-Bibliothek
(KomDonenten (c) - Bibliothek), bevorzugt einer Fusagen-Bibliothek, n) Hybridisierung der Paarungssystem-Effektor-Fusioπs-Molekule (Kom- poneπten (o) auf einem Array bestehend aus Komponente (a) und
KomDonenten b) deren Region (B) alle möglichen Permutation beinhaltet, wobei jede einzelne Komponente b) spezifisch einer Arrayposi- tion zugeordnet werden kann
I M) Identifizierung von Array-Positioπen an denen sich ein Komplex beste- heπd aus Komoonente (b) und Komponente (c) gebildet hat ivj Charakterisierung der unter in) identifizierten Komplexe bestehend aus Komponente fb) und Komponente (c)
Verfanren nacn Anscrucn 10 oder 1 1 dadurcn geκennzeιcnnet αaß Kompo- nenten (b) mit einer Region (A) der Lange von 5 bis 80 Nukleotiden oder Nukleotidanaloga vorzugsweise 5 DIS 30 Nukleotiden oder NuKleotidanaloga und insbesondere 10 bis 30 Nukleotiden oder Nukleotidanaloga yerweπdet werden
Verfanren nach einem der Ansprüche 10 bis 12 dadurcn geκenπzeιchnet daß
KomDonenten (b) mit einer Region (B) mit einer Lange zwiscnen 5 und 30 bevorzugt 7-8 Nukleotide verwendet werden
Verfanren nacn einem der Aπsorucne 10 bis ' 3 dadurcn gekennzeichnet daß eine Region <A, aus einem ooiy-T-Strang vorzugsweise einem T- ^-Strang oder einem zu der Ribosomenoindestelle komplementären Strang verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10-14 dadurch gekennzeichnet, daß der Trager aus Keramik Metall, insbesondere Halbleiter, Edelmetall, Glaser, Kunststoffe kristalline Materialien bzw. dünne Schichten des Tragers. insbesondere der genannten Materialien oder (bιo)molekuiare Filamente wie Cel- lulose, Gerustproteine, oder aus einer Kombination der genannten Materialien aufgebaut ist
Verfahren nach einem der Ansprüche 10-15 dadurcn gekennzeichnet daß das genannte Verfanren auf einem elektronischen Chip durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10-16 dadurch gekennzeichnet, daß der Bestandteil der Probe mit Hilfe eines elektrischen Feldes an die an einen Trager gebundene Erkennungseinheit als Komponente (b) oder als Komponente (c) gebunden wird
Verfahren nacn einem der AnsDruehe 10-1 7 dadurcn geκennzeιcnnet. oaß als Komponente (c) Paaruπgssystem-EffeKtor-Fusions-Molekule aus einer Nukleinsaure und/oder deren Analoga, vorzugsweise einer DNA RNA insbesondere eine mRNA ein RNA-Puromyciπ-Deπvat und einem Protein verwendet werden
Verfahren nach einem der Ansprüche 10-1 8 dadurch gekennzeichnet daß in einem mindestens ein RNA-Protein-Fusions-Molekul einer Probe an mindestens eine an einen Trager gebundene Nukleinsaure oer Formel 3'-(X)7-8-(T7- i5)-5' wobei X jedes be eDige Nukleotid ausgewählt aus Adenosin Thymidin Uracil, Guanosin oder Cytosiπ bedeutet vorzugsweise mit Hilfe eines elektπ- scnen Feldes geounoeπ wird und gegeoenenfalls in einem weiteren Schritt nicht- oder nicht-spezifiscn geDundeπe Nukleinsäuren vorzugsweise mit Hilfe eines umgepolten elektπscnen Feldes geringerer Feldstarke als im ersten Schritt entfernt werden
20 Verfahren nach einem der Ansprüche 10-19, dadurch gekennzeichnet daß in einem ersten Schritt an eine RNA-Population einer Probe ein geeigneter Nukleinsaure-Linker vorzugsweise ein dA27dCdC-Lιnker chemisch ocer mit Hilfe einer geeigneten Ligase vorzugsweise einer T4 DNA Ligase fusioniert anschließend traπslatiert und nachfolgend die RNA-Linker-Protein- Fusionsbildung induziert wird in einem zweiten Schritt die RNA-Linker-
Protein-Fusions-Molekule an Nukleinsäuren des emπduπgsgemaßen Erkennungssystem mit vorzugsweise der Formel 3'-(X)7
Figure imgf000034_0001
wobei X jedes beliebige Nukleotid ausgewählt aus Adenosin Thymidin Uracil Guanosin oder Cytosiπ bedeutet vorzugsweise mit Hilfe eines elektπscneπ Feldes ge- bunden und gegebenenfalls in einem weiteren Schritt nicht- oder πicht- spezifiscn gebundene Nukleinsäuren, vorzugsweise mit Hilfe eines umgepolten elektrischen Feldes geringerer Feldstarke als im zweiten Schritt entfernt werden
21 Verfanren zur Identifizierung von Wecnselwirkungen eines ocer menrerer
Binoungspartner (KomDonenten (d)), die eine Affinität zu spezifischen Effektoreinheiten der KomDonenten (c) besitzen umfassend i) die Inkubation eines Paaruπgssystem-Effektor-Fusioπs-Molekul-Arrays mit einer zu analysierenden Substanzmischung enthaltene mindestens eine Komponente (d) n) Identifizierung von Array-Positioπeπ an denen sien ein Komplex Desteheπd aus Komoonente ι b) Komoonente (c) und Komponente < dj gebildet hat in) Charakterisierung der unter in identifizierten Komplexe oestenend aus Komponenten (b) KomDonenten (c) und Komponente (d) Verfahren nach Ansprucn 21 zum Auffinden und/oder zur Identifizierung bzw Charakterisierung von mindestens einem Bestandteil einer Probe insbesondere von Nukleinsäuren und/oder Proteinen einer Probe bzw zum Auffinden und/oder zur Identifizierung von zellularen oder kunstlichen Bindepartner, vorzugsweise von Proteinen Peptiden Nukleinsäuren chemiscnen Wirkstoffen vorzugsweise orgaπiscnen Verbindungen pharmakologisch wirksamen Verbindungen Pflanzenschutzwirkstoffen, Toxinen insbesondere Giften, carzinogenen und/oder teratogenen Substanzen Herbiziden Fungiziden ooer Pestiziden
Verfahren nach einem cer AnsDruehe 21 ooer 22 dadurch geκenπzeιchπet daß mindestens eine KcmDonente (d) direkt markiert ist
Verfahren nach einem oer Ansprüche 21 bis 23 dadurch gekennzeichnet daß mindestens eine effektorgebuπde Komponente (d) mit einem markierten spezifischen Bindungspartner wie z B einem Antikörper nachgewiesen wird
Verfahren nach einem der AnsDruehe 21 bis 24 dadurch gekennzeichnet daß die Wechselwirkung zwischen Effektor und Komoonente (d) gemäß Schritt n) durch die Zugabe von we'teren die Wechse Wirkung beeinflussender Substanzen wie z B Cofaktcren Coenzymen Aktivatoren oder InhiDitoren modifiziert wird
Verfanren nach einem oer Ansprüche 21 bis 25 dadurch gekennzeichnet daß ein Enzymaktivitatsmuster Destimmt wird
Koπjugat enthaltend
Figure imgf000035_0001
Erκeπnuπgssystem ' Komponenten ( a) DIS (C)) und Komponente (d)
8. Konjugat nacn Anspruch 27 dadurcn geκennzeιchnet, daß Komponente (d) ein Fusagen ist.
9 Konjugat nach einem der Ansprüche 27 oder 28 dadurch gekennzeichnet, daß Komponente (d) ein Protein, Peptid, insbesondere ein Transkriptionsfaktor, ein Rezeptor oder ein Enzym, wie z. B Kinasen Phosphatasen, GTPa- sen. Esterasen. Glycosylasen. Lipasen. Oxidasen, Reduktasen, Hydrolasen, Isomerasen, Isomerasen oder Ligasen mit deren Substraten oder deren Regulatoren Wie z. B Induktoren, second messanger,, wie cAMP oder cGMP, und/oder ein chemischer Wirkstoff, vorzugsweise eine organische Verbindung, eine Dharmakologisch wirksame Verbindung, ein Hormon, ein Pflan- zenscnutzwirkstoff ein Toxin, insbesondere ein Gift, eine carzinogene und/oder teratogene Substanz, ein Herbizid, Fungizid und/oder Pestizid ist.
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