Verfahren zur qualitativ und quantitativ vergleichenden Detektion chemischer
Substanzen
Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur qualitativ und quantitativ vergleichenden Detektion chemischer Substanzen.
Stand der Technik
Die quantitative Erfassung aller Proteine einer Zelle eines bestimmten Organismus zu einem bestimmten Zeitpunkt, oft als (zelluläre) Proteom-Forschung bzw. (cellular) Proteomics bezeichnet, ist der Schlüssel zu einem funktioneilen Verständnis des physiologischen, im Spezialfall pathologischen Zustande der betreffenden Zelle. Die "proteomische" Information bereichert sowohl die Grundlagen- als auch die angewandte Forschung. Sie liefert die molekulare Basis für den Zustand einer Zelle und bietet die Möglichkeit, die Änderung des Expressions- und Modifikationsmusters der Proteine als Antwort auf eine spezifische Störung (z.B. eine Krankheit oder die Verabreichung eines bestimmten Medikaments) aufzuzeichnen. Damit besitzt die Proteom-Forschung eine fundamentale Bedeutung für die Target-Suche und -Auswahl in der biomedizinischen Forschung, also der Entwicklung neuer Medikamente. Das (zelluläre oder globale) Proteom kann daneben auch zur Diagnose von Krankheiten und zur Therapiekontrolle eingesetzt werden. Somit verfolgt die Proteom-Forschung im Prinzip die gleichen Ziele wie die Genom-Forschung, nämlich die Korrelation des Zustands eines Organismus oder einer Zelle (des Phänotyps) mit grundlegenden molekularen Bausteinen dieses Organismus durch die parallele Analyse möglichst vieler solcher Bausteine (z.B. der mRNA bzw. der Proteine).
Als Genom wird der komplette Satz genetischer Information bezeichnet, über den eine
Zelle verfügt. Die funktionelle Genom-Forschung (functional genomics or phenomics) umfasst im allgemeinen die Expression und das Verhalten der Gen-Produkte. Innerhalb der "functional genomics" werden die Bereiche zelluläre Transkriptom-Forschung,
zelluläre Proteom-Forschung, globale Proteom-Forschung und Metabolom-Forschung unterschieden. Als zelluläre Transkriptom-Forschung (cellular transcriptomics) wird die vergleichende Untersuchung der mRNA Expressionsprofile mit Hilfe von z.B. DNA-Chips bezeichnet. Die quantitative Isolierung und Identifikation aller Proteine einer Zelle ist als zelluläre Proteom-Forschung (cellular proteomics) bekannt. Bei der globalen Proteom- Forschung (global proteomics) werden alle encodierten Proteine des gesamten Genoms analysiert und zwar ohne Festlegung auf einen spezifischen Zelltypus oder spezifische Wachstumsbedingungen (physiologischer Zustand der Zelle). Das Proteom selbst stellt einen Baustein des Metaboloms bzw. der Metabolom-Forschung (metabolomics) dar, also des Verständnisses über den gesamten Metabolismus eines Organismus.
Das Proteom besitzt im Vergleich zum Genom einen wesentlich größeren Informationsgehalt. Während das Genom das Vererbungsmuster und das unmittelbare Transkriptionsmuster der Gene in Form der cDNA und mRNA qualitativ und quantitativ erfasst, wächst die Komplexität der Transkriptionsprodukte, also der Proteine, durch posttranslatorische Modifikationen vieler Proteine (Phosphorylierung, Glycosilierung, proteolytische Prozessierung etc.) weiter. Dasselbe Genom führt also aufgrund dieser posttranslatorischen Variationen und durch Transportmechanismen, die transkribierte Genprodukte über den ganzen Organismus verteilen, zu unterschiedlichen Proteomen und somit verschiedenen physiologischen (bzw. pathologischen) Zuständen.
Das Proteom besitzt zudem im Hinblick auf die Target-Suche und -Auswahl bzw. die Diagnose von Krankheiten gegenüber dem Genom zwei wesentliche Vorteile: Zum einen ist die Korrelation zwischen Proteom und Phänotyp enger, zum anderen kann das Proteom (zumindest teilweise) in den typisch klinischen Proben wie Serum, cerebrospinale Flüssigkeit oder Urin untersucht werden. Diese einfach zugänglichen Proben enthalten keine DNA, aber Proteine, so dass die Proben zwar auf potentielle proteomische Marker einer Krankheit untersucht werden können, nicht aber auf genomische Marker.
Im Vergleich zur Genomforschung ist die Analyse des Proteoms allerdings wesentlich schwieriger durchzuführen, da - im Gegensatz zum Hybridisierungsprinzip der DNA, cDNA bzw. mRNA beim Genom - für Proteine kein einfaches, universell einsetzbares und eindeutiges Detektionsprinzip existiert. Sowohl die Isolierung und Auftrennung als auch die eigentliche Detektion müssen individuell an die biochemischen Eigenschaften (z.B.
Hydrophobizität, Hydrophilie, Acidophilie, Thermophilie) der jeweiligen Proteine bzw. Proteingruppen angepasst werden.
Die Analyse des Proteoms kann in folgende Schritte eingeteilt werden (vgl. F. Lottspeich, "Proteom Analysis: A Pathway to the Functional Analysis of Proteins", Angewandte Chemie, International Edition, 1999, Vol. 38, 2476 - 2492): Bestimmung der Startparameter, Probenvorbereitung, Protein-Separierung, Protein-Quantifizierung und Datenanalyse. Die Startparameter sollen garantieren, dass das Material, das einer Proteom-Analyse unterzogen wird, reproduzierbar hergestellt werden kann. Die Probenvorbereitung umfasst u.a. Zellkultivierung und Zellaufschluss unter denaturierenden oder nicht-denaturierenden Bedingungen. Da Proteine keine einheitlichen physikalischen und chemischen Eigenschaften besitzen, erfordert die Probenvorbereitung ein exaktes Protokoll, um Reproduzierbarkeit zu gewährleisten.
Die zur Zeit gängigste, hochauflösende Methode der Protein-Separierung stellt die 2D- Gelelektrophorese dar, bei der Proteine nach (i) Ladung (mittels isoelektrischer Fokussierung, lEF-Gel) und (ii) Größe (mittels SDS-PAGE Gel-Elektrophorese) aufgetrennt werden. Auch bei dieser Methode liegt das Problem in der Reproduzierbarkeit, in diesem Fall in der Reproduzierbarkeit der zweidimensionalen Muster auf dem Gel. Äußere Parameter wie der Protein-Transfer von der ersten, lEF-Gel- Dimension in die zweite, SDS-PAGE-Gel-Dimension, das Elektrophoresegerät, die Gelkomposition, die Elektrophoresedauer bei lEF-Gelen, Anfärbemethoden, Bedienungspersonal usw. können zu einer deutlichen Variation der Muster führen.
Die Protein-Identifizierung und -Quantifizierung erfolgt in der Regel durch massenspektrometrische Verfahren, die einen Transfer der gel-separierten Proteine vom Gel in andere Umgebungen (z.B. organische Matrizes bei MALDI-Massenspektroskopie, MALDI-MS) voraussetzen. Auch dieser Transfer in eine andere Umgebung kann zu Modifikationen der Proteine und somit zu Fehlinformation oder Informationsverlust führen.
Die abschließend notwendige Datenanalyse wird durch entsprechende Methoden der Bioinformatik bewerkstelligt.
Neben der begrenzten Reproduzierbarkeit stellen vor allen Dingen die sehr personal- und apparateintensive Probenbereitung und -analyse (MALDI-MS-Quantifizierung) wesentliche Nachteile der geschilderten Vorgehensweise zur Proteom-Analyse dar.
Zudem wird nur ein geringer Parallelisierungsgrad erreicht, da von den ca. 20000 bis 30000 expremierten Proteinen einer Zelle auch in den aufwändigen 2D-Gelen nur wenige hundert verschiedene Proteine separiert und dann auch detektiert werden können. Die 2D-Gel Technik ist außerdem nicht automatisierbar und daher personal- und kostenintensiv.
Aus dem Stand der Technik bekannte Alternativen im Bereich der Probenvorbereitung und Separation sind die Immunoprezipitation und die chromatographische Auftrennung. Neben irreversibel gebundenem und damit für die Analyse verlorenem Protein stellt vor allem die geringe Trennkraft der verbreiteten chromatographischen Methoden ein wesentliches Problem dieser Alternativen dar. Im ersten chromatographischen Schritt kann das Proteom in wenige hundert Fraktionen mit unterschiedlichen Proteinzusammensetzungen getrennt werden, die anschließend in erneuten chromatographischen Schritten, also seriell, weiter separiert werden müssen.
Zur Erhöhung des Parallelisierungsgrades wurden verschiedene Strategien zur zumindest partiellen, chip-basierten Proteomanalyse vorgeschlagen (vgl. Alan Dove: "Proteomics: translating genomics into products?", Nature Biotechnology, 1999, Vol. 17, 232 - 236). So könnten z.B. "Separations-Chips", die mit verschiedener Protein-spezifischer Oberflächenchemie oder spezifischen Protein-Bindungspartnern strukturiert sind, zur zweidimensionalen Auftrennung des Proteoms verwendet werden. Die fraktionierten Proteine sollen dann massenspektroskopisch analysiert werden. In einer verwandten Strategie wird vorgeschlagen, die Proteine des isolierten Proteoms zuerst (einheitlich) mit einem Fluoreszenzfarbstoff zu markieren, dann auf einem Antikörper-Chip-(Antibody- Array) zweidimensional aufzutrennen und schließlich anhand der Fluoreszenzintensität (z.B. über CCD-Kameras) zu quantifizieren. Dazu erforderlich ist eine sehr spezifische Antikörper-Bibliothek, wobei die Spezifität/Selektivität der Antikörper extrem hoch sein muss. Zudem weist die Antibody-Chip-Strategie die Nachteile einer unspezifischen Fluoreszenz und einer aufgrund des zweidimensionalen Ausleseverfahrens der Fluoreszenz durch z.B. CCD-Kameras in Kombination mit konfokaler Mikroskop-Optik extrem teuren Detektionsmethode auf. Daneben stellt die Vereinheitlichung der Reaktion zur Anbindung des Fluoreszenzfarbstoffs an die verschiedenen Proteine (qualitativ und quantitativ) ein ungelöstes Problem dar.
Die Proteom-Analyse besitzt somit das Potential, sich zu einer äußerst hilfreichen Technik in der biomedizinischen Forschung und medizinischen Diagnostik zu entwickeln.
Allerdings müssen dazu die oben geschilderten Probleme überwunden werden, nämlich die ungenügende Reproduzierbarkeit, der geringe Grad an Parallelisierung und der enorme Aufwand an präparativer Arbeit, an hochqualifiziertem Personal und teurer technischer Ausstattung.
Bei der Untersuchung von Krankheitsbildern oder bei vergleichenden Studien ist es häufig nicht erforderlich, die Bestandteile eines Proteoms explizit zu bestimmen. In den meisten Fällen reicht es aus, eine Probe mit einer Referenzprobe zu vergleichen, also z.B. das Proteom eines gesunden Menschen mit dem Proteom eines kranken Patienten.
Darstellung der Erfindung
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Verfahren zur qualitativ und quantitativ vergleichenden Detektion chemischer Substanzen bereitzustellen, welches die Nachteile des Standes der Technik nicht aufweist.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch das Verfahren zur qualitativ und quantitativ vergleichenden Detektion chemischer Substanzen gemäß unabhängigem Patentanspruch 1 und das Kit gemäß unabhängigem Patentanspruch 29 gelöst. Weitere vorteilhafte Details, Aspekte und Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen, der Beschreibung und den Beispielen.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren zur qualitativ und quantitativ vergleichenden Detektion chemischer Substanzen wird wenigstens eine Art von chemischen Substanzen und wenigstens eine Art von Markierungs-Rezeptor-Einheiten bereitgestellt, wobei die Markierungs-Rezeptor-Einheiten aus jeweils einer bekannten Markierung und jeweils einer mit der Markierung verbundenen Rezeptor-Einheit bestehen und die Rezeptor- Einheit eine chemische Substanz spezifisch binden kann. Der Markierungsbestandteil der Markierungs-Rezeptor-Einheiten ist ein Desoxyribonukleinsäureoligomer, ein Ribonukleinsäureoligomer, ein Peptidnukleinsäureoligomer oder ein
Nukleinsäureoligomer mit strukturell analogem Rückgrat. Die chemischen Substanzen und die Markierungs-Rezeptor-Einheiten werden miteinander in Kontakt gebracht, wodurch eine Bildung von Komplexen aus wenigstens einer Markierungs-Rezeptor- Einheit und chemischer Substanz erfolgt. Danach werden die Komplexe aus Markierungs-
Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz von den nicht gebundenen Markierungs- Rezeptor-Einheiten abgetrennt und eine oder mehrere chemische Bindungen der Komplexe aus Markierungs-Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz so gespalten, dass der Markierungs-Bestandteil von dem Komplex aus Markierungs-Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz abgetrennt wird. Die abgetrennten Markierungs-Bestandteile werden ausgewaschen und durch ein geeignetes Verfahren detektiert. In dem erfindungsgemäßen Verfahren wird außerdem wenigstens eine Art von chemischen Substanzen bereitgestellt, wobei es sich um die gleichen Arten von chemischen Substanzen wie bei den bereits bereitgestellten Arten von chemischen Substanzen oder um davon verschiedene Arten von chemischen Substanzen handeln kann. Zudem wird die gleiche Art und Menge an Markierungs-Rezeptor-Einheiten, die bereits bereitgestellt wurde, nochmals bereitgestellt. Die zuletzt bereitgestellten chemischen Substanzen und die zuletzt bereitgestellten Markierungs-Rezeptor-Einheiten werden miteinander in Kontakt gebracht, wodurch eine Bildung von Komplexen aus wenigstens einer Markierungs-Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz erfolgt. Die ungebundenen Markierungs-Rezeptor-Einheiten werden abgetrennt. Anschließend werden eine oder mehrere chemische Bindungen der Komplexe aus Markierungs-Rezeptor-Einheit und chemischer Substanz so gespalten, dass der Markierungs-Bestandteil der Markierungs- Rezeptor-Einheit abgetrennt wird. Die abgetrennten Markierungs-Bestandteile werden ausgewaschen und durch ein geeignetes Verfahren detektiert. Abschließend werden die erhaltenen Ergebnisse der beiden Analysen der Markierungs-Bestandteile verglichen.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren werden grundsätzlich spezifische Markierungen verwendet, d.h. an eine bestimmte Art von Rezeptor ist ein Desoxyribonukleinsäureoligomer, ein Ribonukleinsäureoligomer, ein
Peptidnukleinsäureoligomer oder ein Nukleinsäureoligomer mit strukturell analogem Rückgrat mit einer bestimmten Basensequenz gebunden. Dadurch wird eine eindeutige Zuordnung von chemischer Substanz, Rezeptor und Markierung ermöglicht. Für den Fall, dass verschiedene Arten chemischer Substanzen nur summarisch detektiert werden sollen, kann von dem beschriebenen Vorgehen abgewichen werden. Die summarische Detektion verschiedener chemischer Substanzen kann nämlich in einfacher Weise dadurch erfolgen, dass an die verschiedenen Rezeptoren, die die verschiedenen chemischen Substanzen binden, ein Desoxyribonukleinsäureoligomer, ein Ribonukleinsäureoligomer, ein Peptidnukleinsäureoligomer oder ein Nukleinsäureoligomer mit strukturell analogem Rückgrat gleicher Basensequenz gebunden werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird wenigstens eine Art von chemischen Substanzen, wenigstens eine Art von Rezeptor-Einheiten und wenigstens eine Art von Markierungs-Rezeptor-Einheiten bereitgestellt, wobei die Markierungs-Rezeptor-Einheiten aus jeweils einer bekannten Markierung und jeweils einer daran angebundenen Rezeptor-Einheit bestehen und die Rezeptor-Einheit eine chemische Substanz spezifisch binden kann. Die chemischen Substanzen, die Markierungs-Rezeptor-Einheiten und die Rezeptor-Einheiten werden in beliebiger Reihenfolge miteinander in Kontakt gebracht, wodurch eine Bildung von Komplexen aus einer oder mehrerer Markierungs-Rezeptor-Einheit/en, chemischer Substanz und Rezeptor-Einheit erfolgt. Die Rezeptor-Einheiten werden vor oder nach dem Inkontaktbringen von chemischen Substanzen, Markierungs-Rezeptor-Einheiten an ein geeignetes Material gebunden, wodurch die gebildeten Komplexe aus Markierungs- Rezeptor-Einheit, chemischer Substanz und Rezeptor-Einheit an das Material gebunden vorliegen und dadurch eine Trennung von ungebundenen Markierungs-Rezeptor- Einheiten erfolgt. Anschließend werden eine oder mehrere chemische Bindungen der an das Material gebundenen Komplexe aus Markierungs-Rezeptor-Einheit, chemischer Substanz und Rezeptor-Einheit so gespalten, dass der Markierungs-Bestandteil der Markierungs-Rezeptor-Einheit von dem Material getrennt wird. Die von dem Material getrennten Markierungs-Bestandteile werden ausgewaschen und durch ein geeignetes Verfahren detektiert. In dem erfindungsgemäßen Verfahren wird außerdem wenigstens eine Art von chemischen Substanzen bereitgestellt, wobei es sich um die gleichen Arten von chemischen Substanzen wie bei den bereits bereitgestellten Arten von chemischen Substanzen oder um davon verschiedene Arten von chemischen Substanzen handeln kann. Zudem werden die gleiche Art und Menge an Markierungs-Rezeptor-Einheiten, die bereits bereitgestellt wurde, und die gleiche Art und Menge an Rezeptor-Einheiten, die ebenfalls bereits bereitgestellt wurde, nochmals bereitgestellt. Die zuletzt bereitgestellten chemischen Substanzen, die zuletzt bereitgestellten Markierungs-Rezeptor-Einheiten und die zuletzt bereitgestellten Rezeptor-Einheiten werden in beliebiger Reihenfolge miteinander in Kontakt gebracht, wodurch eine Bildung von Komplexen aus Markierungs- Rezeptor-Einheit, chemischer Substanz und Rezeptor-Einheit erfolgt. Die zuletzt bereitgestellten Rezeptor-Einheiten werden vor oder nach dem Inkontaktbringen von zuletzt bereitgestellten chemischen Substanzen, zuletzt bereitgestellten Markierungs- Rezeptor-Einheiten und zuletzt bereitgestellten Rezeptor-Einheiten an ein geeignetes Material gebunden, wodurch die gebildeten Komplexe aus Markierungs-Rezeptor-Einheit, chemischer Substanz und Rezeptor-Einheit an das Material gebunden vorliegen und
dadurch eine Trennung von ungebundenen Markierungs-Rezeptor-Einheiten erfolgt. Anschließend werden eine oder mehrere chemische Bindungen der an das Material gebundenen Komplexe aus Markierungs-Rezeptor-Einheit, chemischer Substanz und Rezeptor-Einheit so gespalten, dass der Markierungs-Bestandteil der Markierungs- Rezeptor-Einheit von dem Material getrennt wird. Die von dem Material getrennten Markierungs-Bestandteile werden ausgewaschen und durch ein geeignetes Verfahren detektiert. Abschließend werden die erhaltenen Ergebnisse der beiden Analysen der Markierungs-Bestandteile verglichen.
Gemäß einer speziellen Ausführungsform des Verfahrens kann die Verwendung der Rezeptor-Einheit entfallen, wenn die chemische Substanz von einer Art ist, dass der Komplex aus chemischer Substanz und Markierungs-Rezeptor-Einheit selbst physikalisch abgetrennt werden kann. Ganze Zellen, größere Zellteile oder Zellkompartimente erfüllen diese Voraussetzung.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine beliebige nicht näher spezifizierte Bibliothek von Rezeptoren, insbesondere protein- bzw. peptid-bindenden Molekülen, Oligomeren oder Polymeren, die auch posttranslationale Modifikationen erkennen, reproduzierbar durch eine entsprechende, dem Fachmann bekannte Chemie an einem Trägermaterial immobilisiert. An diese modifizierte Matrix wird ein Teil eines zellulären Proteoms durch spezifische Wechselwirkung an die Rezeptoren gebunden. Anschließend wird eine zweite nicht näher spezifizierte Bibliothek von Markierungs-Rezeptoren verwendet, um einen Teil des gebundenen zellulären Proteoms zu markieren. In dieser zweiten Rezeptor-Bibliothek trägt jeder einzelne spezifische Rezeptor eine bekannte oder unbekannte, aber eindeutige Markierung. Die Markierung der bindenden Rezeptoren können isoliert bzw. kopiert und im folgenden Schritt qualitativ oder quantitativ bestimmt werden. Diese Analysendaten werden zum Vergleich mit einem identisch durchgeführten Verfahren (identische trägerimmobilisierte Rezeptoren, identische zweite Markierungs-Rezeptor-Bibliothek) an einem anderen zellulären Proteom für Proteomstudien, z.B. vergleichende Proteinexpressionsstudien, verwendet.
Die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung werden ganz besonders bevorzugt zur Detektion von Veränderungen in Zellkomponenten verwendet. Bei den chemischen Substanzen handelt es sich also bevorzugt um Proteine und deren posttranslationalen Modifikationen, insbesondere um ein vollständiges Proteom. Es beinhaltet aber auch biologisch relevante Moleküle anderer Art wie Nukleinsäuren, Glykolipide der
Zellmembranen, Glykoside der extrazellulären Matrix oder der Zellwand von Mikroorganismen, Signalmoleküle anderer Art wie bestimmte Arten von Hormonen, Cytokinen und Inhibitoren oder Metaboliten, die unter speziellen Bedingungen gebildet werden. Desweiteren wird das Verfahren verwendet, um pathogene Veränderungen an den Zellkomponenten zu untersuchen, was auch chemische Veränderungen unterschiedlichster Art hervorgegangen aus einem nicht natürlichen Prozess oder Reaktion beinhaltet.
Der Aufbau des Komplexes aus Rezeptor, Protein aus dem zu untersuchenden Proteom und dem mit einer Markierung versehenen Rezeptor kann in unterschiedlichen Schritten verlaufen. So ist es möglich, den gesamten Komplex in Lösung aufzubauen, um diesen im zweiten Schritt an einem Träger zu immobilisieren. Ebenso kann der Aufbau der zwei Komponenten Rezeptor und Protein in Lösung durchgeführt werden, gefolgt von der Immobilisierung des Dimers auf einer festen Matrix. Im abschließenden Schritt wird auf der festen Phase der gesamte Komplex mit dem Markierungs-Rezeptor gebildet.
Neuartig bei diesem Verfahren ist u.a., dass beim Aufbau einer Struktur aus drei Komponenten nur eine eindeutige Markierungszuordnung in der zweiten Rezeptor- Bibliothek notwendig ist. Die Zusammensetzung der an die Matrix immobilisierten Rezeptoren und der mit einer Markierung versehenen Rezeptor-Bibliothek muss vor dem Experiment nicht bekannt sein. Die einzige Bedingung für die vergleichende qualitative und/oder quantitative Proteomanalyse ist die konstante Zusammensetzung der Markierungs-Rezeptor-Bibliothek und der immobilisierten Rezeptoren.
Als Rezeptor-Einheit der Markierungs-Rezeptor-Einheit können verwendet werden: Antikörper, Zellrezeptorprotein, Hormon- oder Cytokin-Rezeptor, regulatorisches Protein, DNA- oder RNA-bindendes Protein, Enzym, Protein anderer Natur oder Peptid, ein gentechnisch hergestelltes Äquivalent dieser Proteine oder Teilen davon, DNA, RNA oder andere Nukleinsäure-Produkte, ein gentechnisch hergestelltes Äquivalent dieser Nukleinsäureprodukte oder Teilen davon, ein Oligoglykosid oder deren Derivate wie Glykoproteine und Glykolipide und gentechnisch hergestellte Äquivalente dieser Derivate von Oligoglykosiden, ein Lectin, ein Hormon, Cytokin oder ein anderes biologisches Signalmolekül sowie deren Analoga und Antagonisten, ein Inhibitor eines Proteins sowie deren Analoga, gentechnisch hergestellte Äquivalente dieser Moleküle, ein Hapten oder eine andere Modifikation von Proteinen oder Nukleinsäurederivaten, ein Peptid- oder Nukleinsäure-Aptamer.
Rezeptor-Einheiten oder mit einer Markierung versehene Rezeptoren können eine weitreichende Zahl von spezifisch bindenden Molekülen sein wie z.B. Antikörper, Lektine, Rezeptorproteine, Aptamere, Inhibitoren, Peptide, RNA, DNA, Oligonukleotide, PNA, LNA, Capture Proteine, Zucker oder Haptene. Die Rezeptor-Einheiten können durch kovalente Bindungen an den Träger gebunden werden z.B. über eine Amid-Bindung, oder über ein Hapten z.B. Biotin, Digoxigenin.
Die mit einer Markierung versehene Rezeptor-Bibliothek kann z.B. aus gentechnisch hergestellten monoklonalen Antikörpern aufgebaut sein. Die Markierungen können durch kovalente Bindungen an den Antikörper gebunden werden z.B. über eine Amid-Bindung, oder über ein Hapten wie z.B. Biotin, Digoxigenin oder über einen Crosslinker, der eine chemisch oder enzymatisch spaltbare Bindung zwischen Antikörper und Markierung besitzt. Nicht kovalente Bindungen zwischen Antikörper und Markierung können mit chaotropen Salzen oder Detergenzien gelöst werden.
Erfindungsgemäß werden als Markierung Nukleinsäureoligomere, also Desoxyribonukleinsäureoligomere, Ribonukleinsäureoligomere, Peptidnukleinsäure- oligomere oder Nukleinsäureoligomere mit strukturell analogem Rückgrat verwendet. Unter dem Begriff "Nukleinsäureoligomere" wird jede Art von Oligonukleotid, DNA, oder RNA verstanden.
Die Antikörper-Biobliotheken können auch durch Phagendisplay Methoden generiert werden. Als Immobilisierungs-Rezeptoren können auch gentechnisch generierte Antikörper einer Phage Display Bibliothek auf der festen Matrix immobilisiert werden. Dieser erste Antikörper-Pool kann z.B. durch reduktive Spaltung einer chemischen Bindung erhalten werden, wenn die Phagen eine Disulfidbrücke zwischen Antikörper und Virushülle besitzen. Über die dabei entstehende freie Thiolgruppe können die Antikörper auf einem mit Maleinimid voraktivierten festen Trägermaterial angebunden werden. Auf das Affinitätsmaterial wird anschließend das zelluläre Proteom oder ein Teil davon aufgetragen, wobei ein bestimmtes Proteinmuster abhängig vom immobilisierten Antikörper-Set an die Säule gebunden wird. Zur Vervollständigung der Sandwichstruktur wird ein zweites Set von über Phage Display hergestelltem Antikörper-Pool eingesetzt. Dabei können die gesamten Phagen verwendet werden. Nach dem Auswaschen der nicht gebundenen Phagen wird die immobilisierte Phagen-RNA/DNA isoliert und mittels dem Fachmann bekannten Methoden aufgearbeitet, um die gewonnenen Oligonukleotide mit
DNA-Arrays qualitativ und quantitativ auszuwerten. Phagen Display Methoden sind eine ideale Möglichkeit mittels gentechnisch hergestellten Antikörper-Bibliotheken Rezeptoreinheiten zu generieren, deren Bindungsspezifitäten vor dem Verfahren nicht bekannt sind.
Dem Fachmann bekannte Methoden sind u.a. Amplifizierung der Phagen RNA/DNA mittels PCR, Verdau des viralen Genoms mit Restriktionsenzymen und/oder spezifische lineare Amplifizierung eines der Markierung entsprechenden Teil des viralen Genoms/Antikörper-Gens durch RNA-Polymerasen (z.B. T7-RNA-Polymerase) oder DNA-Polymerasen (z.B. Primer Extension mit Kleenow-Fragment, Tli-DNA-Polymerase, Pfu-DNA-Polymerase, Taq-DNA-Polymerase).
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird ein erster Pool von Antikörpern auf einem polymeren Träger immobilisiert. Die Anbindung der Antikörper kann über ein Hapten (z.B. Biotin, Digoxigenin) oder im einfachsten Fall durch einen chemischen Crosslinker erfolgen. Auf das Affinitätsmaterial wird anschließend das zelluläre Proteom oder ein Teil davon aufgetragen, wobei ein bestimmtes Proteinmuster abhängig vom immobilisierten Antikörper-Set an die Säule gebunden wird. Zur Vervollständigung des Immuno-Sandwich wird ein zweiter Pool von Antikörpern, die mit spezifischen Oligonukleotiden markiert sind, auf die Affinitätssäule gegeben. Nach Auswaschen der freien nicht in Immunkomplexen gebundenen Antikörpern werden die Bindungen zwischen den immobilisierten Antikörpern und den Oligonukleotiden chemisch gespalten. Die erhaltenen unmarkierten Oligonukleotide werden mittels DNA-Arrays quantitativ ausgewertet, womit man ein spezifisches Proteinprofil abhängig von der Auswahl der beiden Antikörper-Pools erhält. Dieses Verfahren ermöglicht eine räumliche Trennung von Selektionsprozess und Detektionsprozess, so dass beide unabhängig voneinander durchgeführt werden können.
Alternativ kann der gesamte Sandwich-Immun-Komplex in Lösung aufgebaut und im zweiten Schritt auf einem polymeren Träger immobilisiert werden.
Durch eine vordefinierte Auswahl der Antikörper für die beiden Pools ist es möglich, ein vordefiniertes Proteinprofil und deren zeitliche Veränderung zu verfolgen. In toxikologischen und Drogenwirksamkeits-Studien können z.B. Änderungen in den Signalkaskaden und Regulationsmechanismen oder die Aktivierung von Rezeptorproteinen spezifisch untersucht werden. Bei cytologischen Charakterisierung von
Tumorgewebe ist es möglich, die Tumormarker und die tumorauslösenden Faktoren zu bestimmen.
Folgende Paare von Rezeptoren und chemischen Substanzen weisen u.a. die erforderliche Bindungsaffinität auf und können daher im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden:
Rezeptor zugehörige spezifische chemische Substanz
Antigen (inklusive Hapten) Antikörper
Antikörper (monoklonal oder polyklonal, Antigen (inklusive Hapten) inklusive Fab-Fragment)
Enzym Inhibitor, Antagonist oder Kofaktor eines Enzyms
Inhibitor, Antagonist oder Kofaktor eines Enzym Enzyms ds-DNA (ss-DNA, ss-RNA) mit DNA- (RNA-) bindende Proteine spezifischer Sequenz zur Anbindung DNA- (RNA-) bindender Proteine
DNA- (RNA-) bindende Proteine ds-DNA (ss-DNA, ds-RNA, ss-RNA) mit spezifischer Sequenz zur Anbindung DNA- (RNA-) bindender Proteine ds-DNA (ss-DNA, ds-RNA, ss-RNA) mit Antagonisten DNA- (RNA-) bindender spezifischer Sequenz zur Anbindung Proteine DNA- (RNA-) bindender Proteine
Proteine eines Multi-Proteinkomplexes Multi-Proteinkomplex
Multi-Proteinkomplex Proteine eines Multi-Proteinkomplexes
Protein oder Peptid spezifischer Bindungspartner eines Proteins oder eines Peptids oder dessen Antagonist
Lectin (Oligo-)Glycosid
(Oligo-)Glycosid Rezeptorprotein, Lectin
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt die Anbindung der Rezeptor-Einheiten an ein geeignetes Material vor dem Inkontaktbringen der Rezeptor-Einheiten mit den chemischen Substanzen und den Markierungs-Rezeptor- Einheiten.
Bevorzugt werden zusätzlich ein oder mehrere Waschschritte durchgeführt. Insbesondere werden jeweils Waschschritte nach der Bildung der Komplexe aus Rezeptor-Einheit, chemischer Substanz und Markierungs-Rezeptor-Einheit und der Bindung der Komplexe an das Material durchgeführt. Durch diese Waschschritte wird sämtliches unspezifisch gebundenes Material und sämtliche nicht gebundene Markierungs-Rezeptor-Einheiten entfernt.
Bevorzugt wird als Rezeptor-Einheit ein Antigen, ein Antikörper, ein gentechnisch hergestellter Antikörper, ein Fab-Fragment, insbesondere ein gentechnisch modifiziertes Fab-Fragment, ein Protein, insbesondere ein DNA- oder RNA-bindendes Protein, ein gentechnisch hergestelltes Äquivalent eines Proteins oder Teile davon, ein Peptid, ein Enzym, ein Enzym-Antagonist, ein Hormon, ein Hormonrezeptor, ein Hapten, ein Oligoglycosid oder ein Lectin bereitgestellt.
Bevorzugt ist außerdem die Verwendung von Markierungs-Rezeptor-Einheiten, die als Rezeptor-Einheit ein Antigen, einen Antikörper, einen gentechnisch hergestellten Antikörper, ein Fa -Fragment, insbesondere ein gentechnisch modifiziertes Fab-Fragment, ein Protein, insbesondere ein DNA- oder RNA-bindendes Protein, ein gentechnisch hergestelltes Äquivalent eines Proteins oder Teile davon, ein Peptid, ein Enzym, einen Enzym-Antagonist, ein Hormon, einen Hormonrezeptor, ein Hapten, ein Oligoglycosid oder ein Lectin aufweisen.
Bei dem Markierungs-Bestandteil handelt es sich um ein Nukleinsäureoligomer, also um ein Desoxyribonukleinsäureoligomer, ein Ribonukleinsäureoligomer, ein Peptidnukleinsäureoligomer oder um ein Nukleinsäureoligomer mit strukturell analogem Rückgrat, wobei der Nukleinsäureoligomer-Bestandteil ein anderes Nukleinsäureoligomer mit komplementärer Basensequenz sequenzspezifisch unter Ausbildung von Basenpaaren binden kann. Nachfolgend wird unter dem Begriff "Nukleinsäureoligomer" jede Art von Desoxyribonukleinsäureoligomer, Ribonukleinsäureoligomer, Peptidnukleinsäureoligomer oder Nukleinsäureoligomer mit strukturell analogem Rückgrat verstanden.
Die Rezeptor-Einheit einer Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit ist bevorzugt an eine der Phosphorsäure-Einheiten, an eine der Thiophosphat-Einheiten, an eine der Phosphorsäureamid-Einheiten, an eine der Zucker-Einheiten, insbesondere an eine Zucker-Hydroxy-Gruppe, an eine Carbonyl-, Carboxyl-, Amid- oder Amin-Gruppe, oder an eine der Basen des Nukleinsäureoligomer-Bestandteils angebunden, insbesondere an eine endständige 3'- oder 5'-Einheit.
Besonders bevorzugt ist die Rezeptor-Einheit einer Nukleinsäureoligomer-Rezeptor- Einheit über eine durch Induktion spaltbare Gruppe an den Nukleinsäureoligomer- Bestandteil angebunden, insbesondere über eine -CHOH-CHOH- Gruppe, eine -CO-O- CH2-CH2-O-CO- Gruppe, eine -S-S- Gruppe, eine -N=N- Gruppe oder über Psoralen.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die Rezeptor-Einheit einer Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit und der Nukleinsäureoligomer-Bestandteil einer solchen Einheit jeweils mit einer chemischen Substanz modifiziert, die beiden chemischen Substanzen stellen zueinander spezifische Bindungspartner dar und die Rezeptor-Einheit ist über die zueinander spezifische Bindung der beiden chemischen Substanzen an den Nukleinsäureoligomer-Bestandteil angebunden. Besonders bevorzugt werden als die beiden chemischen Substanzen jeweils zwei spezifische Bindungspartner ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Biotin und monovalentes Avidin, Biotin und monovaltentes Streptavidin, Biotin und Avidin, Biotin und Streptavidin, Chitin und Chitin-bindendes Protein, Antigen und Antikörper, Antigen und Fab-Fragment des Antikörpers verwendet. Wird ein Antigen und ein Antikörper verwendet, so werden ganz besonders bevorzugt jeweils zwei spezifische Bindungspartner ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Biotin und anti-Biotin- Antikörper, FITC und anti-FITC-Antikörper, Digoxigenin und anti-Digoxigenin-Antikörper, DNP und anti-DNP-Antikörper, Rhodamin und anti-Rhodamin-Antikörper, His-Tag und anti-His-Tag-Antikörper, HA-Tag und anti-HA-Tag-Antikörper, Flag-Tag und anti-Flag- Tag-Antikörper, GST-Tag und anti-GST-Tag-Antikörper verwendet.
Die Rezeptor-Einheit einer Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit kann bevorzugt auch an einen verzweigten oder unverzweigten Molekülteil beliebiger Zusammensetzung und Kettenlänge angebunden sein und der verzweigte oder unverzweigte Molekülteil kann alternativ an eine der Phosphorsäure-Einheiten, an eine der Thiophosphat-Einheiten, an eine der Phosphorsäureamid-Einheiten, an eine der Zucker-Einheiten, insbesondere an
eine Zucker-Hydroxy-Gruppe, an eine Carbonyl-, Carboxyl-, Amid- oder Amin-Gruppe, oder an eine der Basen des Nukleinsäureoligomer-Bestandteils gebunden sein, insbesondere an eine endständige 3'- oder 5'-Einheit. Besonders bevorzugt kann die Rezeptor-Einheit an einen verzweigten oder unverzweigten Molekülteil angebunden sein, der wenigstens eine durch Induktion spaltbare Gruppe enthält, die sich in dem die Rezeptor-Einheit und den Nukleinsäureoligomer-Bestandteil verbindenden Molekülteil befindet, wobei die Rezeptor-Einheit insbesondere an einen verzweigten oder unverzweigten Molekülteil angebunden ist, der wenigstens eine -CHOH-CHOH- Gruppe, eine -CO-O-CH2-CH2-O-CO- Gruppe, eine -S-S- Gruppe, eine -N=N- Gruppe oder Psoralen enthält.
Bevorzugt wird auch, dass der verzweigte oder unverzweigte Molekülteil in dem die Rezeptor-Einheit und den Nukleinsäureoligomer-Bestandteil verbindenden Molekülteil eine Bindung zweier chemischer Substanzen enthält, wobei die beiden chemischen Substanzen zueinander spezifische Bindungspartner darstellen und die Bindung der beiden chemischen Substanzen der zueinander spezifischen Bindung der beiden chemischen Substanzen entspricht. Insbesondere werden als die beiden chemischen Substanzen jeweils zwei spezifische Bindungspartner ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Biotin und monovalentes Avidin, Biotin und monovalentes Streptavidin, Biotin und Avidin, Biotin und Streptavidin, Chitin und Chitin-bindendes Protein, Antigen und Antikörper, Antigen und Fab-Fragment des Antikörpers bevorzugt verwendet. Wird ein Antigen und ein Antikörper verwendet, so werden ganz besonders bevorzugt jeweils zwei spezifische Bindungspartner ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Biotin und anti- Biotin-Antikörper, FITC und anti-FITC-Antikörper, Digoxigenin und anti-Digoxigenin- Antikörper, DNP und anti-DNP-Antikörper, Rhodamin und anti-Rhodamin-Antikörper, His- Tag und anti-His-Tag-Antikörper, HA-Tag und anti-HA-Tag-Antikörper, Flag-Tag und anti- Flag-Tag-Antikörper, GST-Tag und anti-GST-Tag-Antikörper verwendet.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird ganz besonders bevorzugt zur Detektion von Proteinen verwendet. Bei den chemischen Substanzen handelt es sich also bevorzugt um Proteine, ganz besonders bevorzugt um ein vollständiges Proteom.
Die Spaltung der einen oder der mehreren chemischen Bindungen zwischen Markierung und Markierungs-Rezeptor-Einheit, erfolgt bevorzugt durch Zugabe eines Oxidationsmittels, durch Zugabe eines Reduktionsmittels, durch Zugabe einer zur
Spaltung einer Amid-Bindung geeigneten Säure oder durch Einstrahlung von Licht,
besonders bevorzugt durch Zugabe eines zur Spaltung einer -S-S- Gruppe, zur Spaltung einer -CHOH-CHOH- Gruppe oder zur Spaltung einer -CO-O-CH2-CH2-O-CO- Gruppe geeigneten Reduktions- oder Oxidationsmittels, insbesondere durch Zugabe von NalO4, durch Zugabe von H2N-OH, durch Zugabe von DTT oder durch Zugabe von ß- Mercaptoethanol. Ebenso können diese Bindungen enzymatisch gespalten werden.
Die Detektion der Nukleinsäureoligomer-Bestandteile erfolgt bevorzugt über die Hybridisierung an dazu komplementäre Nukleinsäureoligomere, wobei die Detektion besonders bevorzugt amperometrisch, cyclovoltam metrisch, impedanzspektroskopisch oder potentiometrisch erfolgt.
Die besonderen Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens liegen insbesondere in der gleichzeitigen Detektion mehrerer Arten von Nukleinsäureoligomer-Bestandteilen. Dadurch kann eine Vielzahl chemischer Substanzen und insbesondere eine Vielzahl an Proteinen parallel detektiert werden. Besonders geeignet sind Detektionsverfahren mit einem hohen Parallelisierungsgrad, also insbesondere die Detektion mit Hilfe der DNA- Chip-Technologie.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch einen Kit zur Durchführung eines der oben beschriebenen Verfahren. Das Kit umfasst eine effektive Menge wenigstens einer Art der oben beschriebenen Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten. Bevorzugt umfasst das Kit zusätzlich eine effektive Menge wenigstens einer Art der oben beschriebenen Rezeptor-Einheiten. Besonders bevorzugt umfasst das Kit zusätzlich eine Chromatographiesäule und ganz besonders bevorzugt umfasst das Kit zusätzlich eine mit geeigneten Sondenoligonukleotid-Arten vorbelegte Dot-Plot-Membran zur Detektion der Nukleinsäureoligomer-Bestandteile der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten.
Wege zur Ausführung der Erfindung
Beispiel 1: Bindung der Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten an auf Material immobilisierte Proteine
Es wird in Dämmerlicht oder bei Rotlicht gearbeitet. Auf die mit PBS oder PBST gewaschenen Säulen oder Membranen werden je 0.1 μg der gewünschten Nukleinsäureoligomer-markierten Fab-Fragmente in PBS in einem möglichst geringen Volumen (bzw. in einem Säulenvolumen verdünnt) auf die Säule oder die Membran gegeben. Man lässt die Nukleinsäureoligomer-markierten Fab-Fragmente für 1 Stunde bei Raumtemperatur und weitere 16 Stunden bei 4°C an die auf dem Material immobilisierten Proteine binden und wäscht mit PBST und Phosphat-Waschpuffer (50 mmol/l Kaliumphosphat pH 7.5, 500 mmol/l NaCI). Durch die Waschschritte werden die verbleibenden nicht gebundenen Nukleinsäureoligomer-markierten Fab-Fragmente entfernt und auf dem Säulenmaterial oder der Membran bleiben nur die Nukleinsäureoligomer-Proteinbinder-Einheiten zurück, die an das Target gebunden wurden. Die Nukleinsäureoligomer-Einheit kann nach einer der in den untenstehenden Beispielen 3 bis 5 beschriebenen Methoden isoliert und weiter analysiert werden.
Beispiel 2: Immobilisierung löslicher Proteine (Targets) an anti-Fluorescein-Antikörper modifiziertes Material
Es wird in Dämmerlicht oder bei Rotlicht gearbeitet. Die Reaktionsgefäße werden vor Verwendung mit PBST und PBS gespült. 5 μl einer löslichen nativen cytoplasmatischen Protein-Fraktionen als Target-Fraktion in PBS (cytoplasmatische Proteine, lösliche Fraktion aus Kern- und Membranfraktionen) werden auf eine Biogel PD6-Säule gegeben, die vorher mit Carbonat-Puffer (50 mmol/l NaHCO3/Na2CO3, pH 9.5, 150 mmol/l NaCI) equilibriert wurde. Es wird mit Carbonatpuffer eluiert und die Proteinfraktionen werden gesammelt (Reinigungsschritt und Pufferwechsel). Zu den gesammelten und vereinigten Proteinfraktionen wird 0.2 mg FITC (20 mg/ml in DMSO) gegeben. Man lässt für 30 min bei Raumtemperatur reagieren. Anschließend wird die Reaktionslösung auf eine Biogel PD6-Säule gegeben, die vorher mit PBS equilibriert wurde, es wird mit PBS eluiert und die Proteinfraktionen gesammelt (Reinigungsschritt). Zu den vereinigten Proteinfraktionen werden je 0.02 μg der gewünschten Nukleinsäureoligomer-markierten Fa -Fragmente gegeben. Danach lässt man die Nukleinsäureoligomer-markierten Fab-Fragmente für 1 Stunde bei Raumtemperatur und weitere 16 Stunden bei 4°C an die Antigene binden. Die gesamte Probe (in ca. einem Säulenvolumen verdünnt) wird auf eine Affinitätschromatographie-Säule gegeben, die mit anti-FITC-Antikörpern belegt ist. Man lässt die FITC-markierten Antigene für ca. 1 Stunde bei Raumtemperatur (und eventuell für weitere 12 Stunden bei 4°C) anbinden, wäscht mit PBST, danach mit Phosphat-
Waschpuffer (50 mmol/l, pH 7.2, 500 mmol/l NaCI) und isoliert nach einer in den folgenden Beispielen 3 bis 5 beschriebenen Methoden die Nukleinsäureoligomer-Einheit. Durch die Waschschritte werden die verbleibenden freien Nukleinsäureoligomer- markierten Fab-Fragmente von der Säule entfernt, und auf der Säule verbleiben nur Komplexe dieser Nukleinsäureoligomer-Fab-Fragmente mit dem Target, so dass die von der Säule isolierten Nukleinsäureoligomer-Einheiten der Menge an Target entsprechen.
Beispiel 3: Abtrennung des Nukleinsäureoligomers von der Rezeptor-Einheit
(i) Denaturierung mit Guanidiniumhydrochlorid: Zu den im Eluat isolierten, im Pellet gebundenen, membrangebundenen oder säulengebundenen Nukleinsäureoligomeren, die an die Rezeptor-Einheit (und gegebenenfalls zudem an das Target oder in den verschiedenen Immunkomplexen) gebunden sind, gibt man 20 mmol/l Natriumphosphatpuffer pH 7.2, 6 mol/l Guanidinium/HCI, 10 mmol/l DTT, 2% TritonX 100 vorgewärmt auf 90°C (ca. ein Säulenvolumen/ ca. 3 faches Volumen bei anderen Isolaten), eluiert im Fall der säulengebundenen Komplexe nach 2-3 min mit weiteren 3 Säulenvolumen des gleichen Puffers und sammelt im Fall der säulengebundenen Immunkomplexe das Eluat. Die Eluate werden kurz bei 15.000 x g zentrifugiert, zum Überstand werden 5 μg Poly-dT(33) zur Unterstützung der Präzipitation gegeben, die Probe wird anschließend mit einem halben Volumen 3 mol/l Kaliumacetat pH 5.0 und dem vierfachen Volumen Ethanol (-20°C) versetzt und die DNA bei 15.000 x g bei 4°C über 40 min präzipitiert. Das Pellet wird abgetrennt, mit 70% Ethanol (-20°C) und 100% Ethanol (- 20°C) gewaschen und an der Luft getrocknet. Alternativ wird nach Zugabe der Carrier- DNA 0.5 Volumen Ethanol und 0.5 Volumen 3 mol/l Kaliumacetat pH 5.0 zugegeben und auf eine 'spin column' mit einer aktivierten Glasfasermembran aufgetragen. Nach Abkühlung der Lösung (ca. 10 min) wird zentrifugiert, dann mit dem gleichen Puffer und anschließend mit Ethanol gewaschen. Die Nukleinsäureoligomere werden schließlich mit 50 μl TE-Puffer von der Glasfasermembran eluiert (Kits von Qiagen, Promega, u.a.). Zur Amplifikation wird das Pellet im PCR-Puffer (vgl. Beispiel 4) und zur direkten Detektion ohne Amplifikation im Hybridisierungspuffer (vgl. Beispiel 5) aufgenommen.
(ii) Spaltung des Linkers nach Reduktion: Zur Spaltung der RS-SR' Einheit gibt man zu den im Eluat isolierten, im Pellet gebundenen, membrangebundenen oder säulengebundenen Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten, die gegebenenfalls an das
Target oder in den verschiedenen Immunkomplexen gebunden sind, 10 mmol/l DTT in
PBS (ein Säulenvolumen oder 1-3 Volumen der Probe), lässt für 15 min einwirken, eluiert mit 1-2 Säulenvolumen des gleichen Puffers und sammelt im Fall der säulengebundenen Komplexe das Eluat. Die Eluate werden kurz bei 15.000 x g zentrifugiert. Zum Überstand werden 5 μg Poly-dT(33) zur Unterstützung der DNA-Präzipitation gegeben, die Probe wird anschließend mit einem halben Volumen 3 mol/l Kaliumacetat pH 5.0, und dem vierfachen Volumen Ethanol (-20°C) versetzt und die DNA bei 15.000 x g bei 4°C über 40 min präzipitiert. Das Pellet wird abgetrennt, mit 70% Ethanol (-20°C) und 100% Ethanol (- 20°C) gewaschen und an der Luft getrocknet. Zur Amplifikation wird das Pellet im PCR- Puffer (vgl. Beispiel 4) und zur direkten Detektion ohne Amplifikation im Hybridisierungspuffer (vgl. Beispiel 5) aufgenommen. Alternativ können die Nukleinsäureoligomere wie unter (i) beschrieben auch über Glasfasermembranen aufgereinigt werden. Diese Methode hat wie die in (iii) und (iv) beschriebenen Methoden den Vorteil, dass die DNA vom Protein getrennt und weniger Proteine im Eluat mit ausgewaschen werden.
(iii) Spaltung des Linkers nach Oxidation: Zur Spaltung der RC(OH)-C(OH)R' Einheit (im Linker zwischen Nukleinsäureoligomer und Rezeptor-Einheit) gibt man zu den isolierten freien oder säulengebundenen Komplexen 10 mmol/l NalO4 in PBS (ein Säulenvolumen oder das gleiche Volumen der Eluationslösung), lässt für 15 min einwirken, eluiert mit 1-2 Säulenvolumen PBS und sammelt im Fall der säulengebundenen Komplexe das Eluat. Zum Eluat werden 5 μg Poly-dT(33) zur Unterstützung der DNA-Präzipitation gegeben und es wird wie unter (i) beschrieben über Ethanol-Präzipitation oder über Glasfasermembran isoliert.
(iv) Photolytische Spaltung des Linkers: Zur Spaltung der RN=NR' Einheit bestrahlt man die isolierten freien oder in einem Becherglas suspendierten säulengebundenen Komplexe in PBS unter Rühren für 10 min mit dem Licht einer 500 W Xenon-Lampe mit aufgesetztem 330 bis 350 nm Interferenzfilter. Das Säulenmaterial wird filtriert, kurz mit PBS-Puffer nachgewaschen und das Filtrat gesammelt. Die vereinigten Filtrate werden mit 5 μg Poly-dT(33) zur Unterstützung der DNA-Präzipitation versetzt und wie unter (i) beschrieben über Ethanol-Präzipitation oder über Glasfasermembran isoliert.
Beispiel 4: Amplifizierung und nachträgliche Markierung des Nukleinsäureoligomers
Handelt es sich bei den an den Rezeptor-Einheiten gebundenen Nukleinsäureoligomeren um DNA bzw. RNA, die Primer-Bindungsregionen besitzen, die für alle verwendeten Rezeptor-gebundenen Nukleinsäureoligomere innerhalb einer qualitativen und/oder quantitativen Targetanalyse (Proteomanalyse etc.) identisch sind, so können die in der Untersuchungslösung vorhandenen Nukleinsäureoligomere, die anhand einer der Methoden (i) bis (v) in Beispiel 3 abgetrennt wurden, durch PCR amplifiziert werden. Bei identischen Primern und identischer bzw. nahezu identischer Länge aller Nukleinsäureoligomere und den Auswahlkriterien für die einzelnen Sequenzen ist eine Amplifikation über PCR möglich, ohne dass sich die Repräsentanz einzelner Nukleinsäureoligomere bzw. die Zusammensetzung der Nukleinsäureoligomer-Mischung verändert.
(i) Exponentielle Amplifikation: Nach Abtrennung der DNA aus den Komplexen aus Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheit, chemischer Substanz und Rezeptor-Einheit (vgl. Beispiel 3) löst man das DNA-enthaltende Pellet in 10 mmol/l Tris/HCI pH 8.0. Ein Aliquot davon (1/20 - 1/100) wird zur Amplifikation eingesetzt. Damit die Amplifizierungsrate exakt ermittelt werden kann wird vor der Amplifikation eine definierte Menge (10 fg, 1 pg, 50 pg, 1 ng) von 4 Kontroll-Nukleinsäureoligomeren (mit eigenen spezifischen Kodierungsregionen und ansonsten identischen Aufbau wie die zur Markierung verwendeten Nukleinsäureoligomere) zum Isolat der Nukleinsäureoligomere zugegeben. Man gibt die beiden universalen Primer P1 und P2 (ein Primer bevorzugt mit einem Detektions-Marker) und die Nukleotid-Bausteine dCTP, dGTP, dATP und dTTP zu und führt z.B. eine Standard-PCR mit 11 bis 18 Zyklen durch, um eine in etwa 1000fache bis 100000fache Amplifikation zu erreichen. Bei Verwendung von unterschiedlichen Primer- Gruppen, die jede für sich universal nur für eine bestimmte Gruppe von Nukleinsäureoligomer-Rezeptor-Einheiten ist, werden für jedes Primer-Paar entsprechend 4 spezifische Kontroll-Nukleinsäureoligomere in definierter Menge vor der PCR zugegeben und die PCR optional in separaten PCR-Reaktionen amplifiziert. Die Lösung wird nach erfolgter PCR-Synthese mit 5 μg Poly-dT(33) zur Unterstützung der Präzipitation und mit 4 Volumen 6 mol/l Guanidiniumchlorid versetzt, um die Polymerase zu zerstören. Zu dieser Lösung wird anschließend ein halbes Volumen 3 mol/l Kaliumacetat pH 5.0, das vierfache Volumen Ethanol (-20°C) gegeben und die DNA bei 15.000 x g bei 4°C über 40 min präzipitiert. Das Pellet wird mit 70% Ethanol (-20°C) und 100% EtOH (-20°C) gewaschen und an der Luft getrocknet. Zur direkten Detektion wird
das Pellet im Hybridisierungspuffer gelöst (vgl. Beispiel 5). Zur nachträglichen Modifikation mit Detektions-Marker führt man anschließend eine lineare Amplifikation mit gleichzeitigem Einbau eines Detektions-Markers (siehe Beispiel 4 ii) oder eine nachträgliche chemische Modifikation mit Detektions-Marker (siehe Beispiel 4 iii) durch. Für die nachträgliche Modifikation mit einem Detektions-Marker wird nach der PCR ein zusätzlicher Chromatographieschritt eingeführt, um die nicht umgesetzten Primer von den amplifizierten Nukleinsäureoligomeren abzutrennen. Dazu wird der gesamte Ansatz auf eine Sephacryl S100-Säule aufgetragen und die erste Fraktion (ca. 25kDa), die die Amplifikationsprodukte enthält, gesammelt. Die zweite Fraktion (ca. 4kDa), die die Primer enthält, wird verworfen.
(ii) Lineare Amplifikation: Unter sonst gleicher Vorgehensweise wie unter Beispiel 4 i) erhält man bei Weglassen des Primers P1 (Zusatz von Primer P2, der einen Detektions- Marker wie z.B. Rhodamin trägt) bei Durchlaufen von 10 bis 40 Synthesezyklen (analog zur PCR) eine 10fache bis 40fache Amplifikation als ss-DNA, wobei die komplementäre Sequenz des Nukleinsäureoligomers als ss-DNA erhalten wird. Setzt man die Amplifikationsprodukte aus Beispiel 4 i) ein, kann wahlweise auch mit Primer 1 (ebenfalls mit Detektions-Marker) spezifisch das Nukleinsäureoligomer als ss-DNA amplifiziert werden. Vorteil dieses Amplifikationsschrittes ist, dass die zu detektierenden Nukleinsäureoligomere bereits als ss-DNA vorliegen.
(iii) Neben der beschriebenen Methode kann auch durch Zugabe von Nukleotiden, die einen Detektions-Marker tragen, über PCR die DNA oder über in-vitro Transskription die RNA mit einem Detektionsmarker versehen werden, daneben kann der Detektions- Marker an das Nukleinsäureoligomer nachträglich angebunden werden.
Beispiel 5: (Parallele) Detektion der Nukleinsäureoligomere über Fluoreszenz
(i) Parallele Detektion mit Dot-Plot-Technik auf modifizierter Nylonmembran (Hybond N+) über Fluoreszenzdetektion: Die Testsites tragen an ein Trägermaterial kovalent angebundene Sonden-Oligonukleotide, die komplementär zu den zu detektierenden Nukleinsäureoligomeren sind. Die Sonden-Oligonukleotide werden in einem beliebigen aber bekannten Muster auf die modifizierte Nylonmembran getropft. Anschließend wird die Membran bei 80°C für 2 Stunden gebacken, wodurch eine feste Anbindung der
Sonden-Oligonukleotide erfolgt. Alternativ dazu kann das Sonden-Oligonukleotid 3' oder 5' terminal einen Linker tragen, der eine reaktive oder aktivierbare Gruppe besitzt, über die das Sonden-Oligonukleotid auf eine geeignete Trägeroberfläche in definierter Weise gebunden wird (z.B. eine NH2-Gruppe am Sonden-Oligonukleotid und eine Isothiocyanat- Gruppe auf dem Träger).
Freie Bindungsstellen der Membran werden durch Inkubation für 30 min bei 45°C mit dem Hybridisierungspuffer 1 (7% SDS, 500 mmol/l Na-Phosphatpuffer pH 7.5, 5 mmol/l EDTA, 0.1 mg/ml ssDNA aus einem Organismus mit möglichst geringer phylogenetischer Verwandtschaft, z.B. pBR322 aus E.coli, 0.5 mg/ml acetyliertes BSA) abgesättigt (Prähybridisierung). Die so gebildeten 'Dots' (Testsites mit Sondenoligonukleotid) werden von der Hybridisierungslösung, die die isolierten Nukleinsäureoligomere bzw. deren Amplifikationsprodukte enthält, überschichtet. Doppelsträng ige DNA-
Nukleinsäureoligomere werden vorher 5 min lang bei 100°C denaturiert und kurz auf Eis gekühlt, bevor sie zur Hybridisierungslösung zugegeben werden. Man lässt die Sonden- Oligonukleotide und Nukleinsäureoligomere der Lösung bei ca. 40°C für ca. 3 bis 16 h hybridisieren. Nach Entfernung der nicht-hybridisierten Bestandteile (nicht-stringentes Waschen mit 2 x SSC, 0.1 % SDS, 1 mmol/l EDTA für 15 - 60 min bei 40°C und anschließend stringentes Waschen mit 0.4 x SSC, 0.1% SDS, 0.1 mmol/l EDTA, für 5 min bei 50°C) werden anhand des Fluoreszenz-Musters die entsprechenden ss- Nukleinsäureoligomere aus der Targetanalyse detektiert (qualitative Analyse) und/oder quantitativ erfasst.
(ii) Parallele Detektion auf DNA-Chips über Fluoreszenzdetektion: Als Chip kann z.B. ein custom made Affymetrix GeneChip® (vgl. Wodicka et al. 1997, Nature Biotechnology, 15, 1359ff) verwendet werden. Die Testsites tragen an ein Trägermaterial kovalent angebundene Sonden-Oligonukleotide, die komplementär zu den zu detektierenden Nukleinsäureoligomeren sind. Die für die Targetanalyse eingesetzten Nukleinsäureoligomere (oder die Amplifikationsprodukte) enthalten entsprechend des Affymetrix-Protokolls ein Biotin als primären Detektions-Marker.
10 μg der Nukleinsäureoligomere werden als ss-Nukleinsäureoligomere in 250 μl (pro verwendeten Chip) Hybridisierungs-Puffer 3 (100 mmol/l MES, 1 mol/l NaCI, 20 mmol/l EDTA, 0.01 % TWEEN 20, pH 6.5 - 6.7) gemeinsam mit 0.1 mg/ml Herings-Spermien ss- DNA und 0.5 mg/ml acetylierter BSA aufgenommen und auf den Chip gebracht. Anschließend lässt man die zueinander komplementären Nukleinsäureoligomere für 16 h
bei 43°C hybridisieren. Nach erfolgter Hybridisierung wird der Chip zur Entfernung der nicht-hybridisierten Bestandteile gewaschen (nicht-stringentes Waschen mit 900 mmol/l NaCI / 60 mmol/l Na-Phosphat pH 7.6, 6 mmol/l EDTA, 0.05% Triton X100 für 1 h bei 40°C und anschließend stringentes Waschen mit 75 mmol/l NaCI / 5 mmol/l Na-Phosphat pH 7.6, 0.5mM EDTA, 0.05% Triton X100 für 15 min bei 40°C). Die Anbindung des Detektionsmarkers Streptavidin-modifiziertes Phycoerithrin wird anhand einer Standardmethode z.B. mit konvokalem Fluoreszenzmikroskop und gekoppelter CCD- Kamera ausgelesen. Anhand des Musters der Fluoreszenz können bestimmte Nukleinsäureoligomere detektiert (qualitative Analyse) oder auch quantitativ erfasst werden (quantitative Analyse).
Beispiel 6: Exemplarische zelluläre Proteomanalyse
(i) Proteinaufschluss: Gewebezellen (> 100 Zellen), z.B. das Zellmaterial einer Biopsie, wird - nach Zugabe von RIPA-Puffer (150 mmol/l NaCI 1% NP-40, 0.5% Desoxycholat, 0.1%) SDS, 50 mmol/l Tris, pH 8.0, 10 μl pro mg Zellgewebe, mindestens jedoch 1 μl) im Mikrotip-Sonifier aufgeschlossen. Ein Großteil des zellulären Proteoms der Zellen wird wie in Beispiel 6 ii) unter partiell denaturierenden Bedingungen in Lösung gebracht (Abtrennen der verbleibenden unlöslichen Protein-Fraktion (ECM/Cytoskelett) bei 800 x g / 4°C / 15 min und Reste des Zelldetritus aus dem abgetrennten Überstand bei 50.000 x g / 4°C / 30 min). Der RIPA-gepufferte Überstand enthält die partiell denaturierten löslichen cytoplasmatischen Proteine und einen Großteil der Membranproteine. Die im Pellet verbliebenen Proteine werden verworfen.
(ii) Konstruktion der Rezeptor-Nukleinsäureoligomer-Komplexe: Als Rezeptor-Einheiten werden z.B. biotinylierte Fab-Fragmente der Antikörper verwendet (i.a. hängt die Auswahl der Rezeptor-Einheiten von der Fragestellung der Proteomanalyse ab und die Rezeptor- Einheiten werden entsprechend ausgewählt). Als Nukleinsäureoligomer wird eine synthetische ss-DNA der Sequenz Rhodomin-5'-TTT-GACGAGACGTCATGG-/«6- CTCACCAGAGCTTCG-TTT-3'-hexyl-NH2 mit der Primer-Bindungsregion P1 (= GACGAGACGTCATGG), der dem Primer P2 komplementären Basenregion P'2 (= CTCACCAGAGCTTCG), der für eine Rezeptor-Einheit (bzw. eine bestimmte Rezeptor- Einheitgruppe) spezifischen 16 Basen langen Kodierungssequenz K16, siehe unten, sowie einer 3'-terminalen TTT-Hexy|-NH2-Einheit und einer δ'-terminalen Rhodamin-TTT- Einheit, die in der Festphasensynthese kovalent gebunden wurden, benutzt.
Nukleinsäureoligomer 1 zur Anbindung von Rezeptor-Einheit 1 besitzt z.B. die Kodierungssequenz 5'-GTTCCAAGCATGGTTC-3', wobei die Positionen 1 , 2, 9 und 10 der Kodierungssequenz unabhängig sind, die Positionen 3, 5 und 7 durch die Permutationsvorschrift G → A → C → T → G von Position 1 abhängig ist, also für ein G an Position 1 folgt, dass Position 3 ein A, Position 5 ein C und Position 7 ein T ist. Analog sind durch die gleiche Permutationsvorschrift die Positionen 4, 6 und 8 von der unabhängigen Besetzung der Position 2 abhängig, sowie die Positionen 11 , 13 und 15 von der unabhängigen Position 9 sowie die Positionen 12, 14 und 16 von der unabhängigen Position 10. Durch diese einfache Permutationsvorschrift ergeben sich aufgrund der 4 frei wählbaren Positionen 44 = 256 verschiedene Kodierungssequenzen, die berücksichtigen, dass (a) der GC-Gehalt der Kodierungssequenz (50%) erhalten bleibt und dass sich (b) die einzelnen Kodierungssequenzen um mindestens 4 Basen unterscheiden. Will man zusätzlich gewährleisten, dass (c) nicht mehr als zwei der Basen eines Basenpaares (T und/oder A bzw. G und/oder C) benachbart sind, ist innerhalb dieser Besetzungsvorschrift einzig Position 8 nicht mehr völlig frei wählbar, also bedingt abhängig, so dass sich für Position 8 nur noch 3 Besetzungsmöglichkeiten ergeben und somit von den ursprünglichen 44 = 256 nur noch 43 x 3 = 192 verschiedene Kodierungssequenzen verbleiben, die definitiv den Bedingungen (a) bis (c) genügen (von den 16 Besetzungsmöglichkeiten für die Basen 7 und 8 gibt es 8 Möglichkeiten, da 2 Basen eines Basenpaares benachbart sind, die dann nur noch 2 Wahlmöglichkeiten für die Position 9 erlauben, während für die anderen 8 Möglichkeiten, die keine 2 Basen eines Basenpaares benachbart aufweisen, weiterhin alle 4 Wahlmöglichkeiten verbleiben, so dass für Base 9 rechnerisch statt 4 nur 3 Wahlmöglichkeiten bleiben; für eine längere Kodierungssequenz aus beliebigen Vielfachen einer 8er Sequenz, also aus n x 8 Basen ergeben sich analog (42(n"1) x 3π"1) Kodierungssequenzen, die den Bedingungen (a) bis (c) bzw. 42n Kodierungssequenzen, die den Bedingungen (a) und (b) genügen).
Zur Anbindung der Fab-Fragmente werden alle für die verschiedenen Antikörper notwendigen Nukleinsäureoligomer-Bestandteile mit unterschiedlicher Kodierungssequenz (beliebige aus den oben generierten maximal 192 Nukleinsäureoligomeren) mit dem Linker Dithio-bis-propionsäure-sulfosuccinimidylester gekoppelt (je ein getrennter Ansatz Nukleinsäureoligomer pro Antikörper: 1 nmol des Nukleinsäureoligomers wird mit 50 nmol Dithio-bis-propionsäure-sulfosuccinimidylester in ca. 100 μl 100 mmol/l NaHCO3/Na2CO3, pH 9 aufgenommen, man lässt über Nacht bei Raumtemperatur im Dunklen stehen, isoliert und trennt die umgesetzte DNA in Carbonat- Puffer ab). Die Nukleinsäureoligomer-Linker-Einheiten einer Reaktion werden
anschließend mit je einer Art Fab-Fragmente umgesetzt und isoliert und die Anzahl der DNA-Einheiten pro Fab-Fragment z.B. über das Verhältnis der Rhodamin-Fluoreszenz bei 575 nm (proportional der DNA) zur Absorption bei 285 nm (proportional den Fab- Frag enten) ermittelt.
(iii) Target-Rezeptor-Einheit-Kopplung: Die in PBS gelösten und mit den Nukleinsäureoligomeren markierten Fab-Fragmente aller Ansätze werden vereinigt (ca. 10 ml) und 10 μl davon zu 10 μl Lösung der partiell denaturierten Proteine in RIPA-Puffer gegeben (entsprechend 1 mg Zellmaterial). Man lässt die Proteine für ca. 3 h bei Raumtemperatur und für ca. 24 h bei 4°C an die Fab-Fragmente koppeln. Man gibt 1 μg eines Cocktails aus polyklonalen Antikörpern in PBS zu, die für dieselben Targets (Proteine) spezifisch sind wie die Fab-Fragmente (und optional weitere anti-lg-Antikörper, die gegen die Fc-Regionen dieser Antikörpern spezifisch sind) und lässt die Antikörper für weitere ca. 3 h bei Raumtemperatur und für ca. 12 h bei 4°C an die Proteine koppeln.
(iv) Abtrennung der Komplexe aus Nukleinsäure-markiertem Rezeptor, Target und Target-spezifischem Antikörper: Eine mit Protein G belegte Agarose-Säule wird mit PBST, pH 7.5 equilibriert, die Lösung mit den Komplexen aus Nukleinsäure-markiertem Rezeptor, Target und Target-spezifischem Antikörper zur Immobilisierung der Immunkomplexe auf die Säule gegeben und 2 h bei Raumtemperatur inkubiert, damit die Immunkomplexe binden können. Danach wird die Säule mit PBS eluiert (das Eluat wird verworfen oder zur späteren Kontrolle aufbewahrt) und gewaschen.
(v) Abtrennung, Amplifizierung und Quantifizierung der DNA aus den Träger- immobilisierten Antikörper-Target-Rezeptor-DNA-Immunkomplexen: Zur Spaltung der -S-
S- Einheit im Linker zwischen DNA und Fab-Fragment wird ein Säulenvolumen 30 mmol/l
DTT in PBS zugegeben. Man lässt die Säule für ca. 15 min stehen, eluiert mit PBS, isoliert und reinigt die DNA im Eluat. Anschließend wird die erhaltene DNA wie unter
Beispiel 4 i) und iii) beschrieben mit PCR unter Verwendung von Primer 2 und Rhodamin-modifizierten Primer P1 exponentiell amplifiziert, die amplifizierte DNA aufgeschmolzen (Erhitzen für 5 min auf 100°C, danach auf Eis abgekühlt), auf eine mit zu den ursprünglichen Kodierungssequenzen komplementären Sonden-Oligonukleotiden versehenen Dot-Plot-Membran gegeben, hybridisiert und gewaschen (wie in Beispiel 5 i beschrieben). Danach wird die Fluoreszenz der Spots quantitativ bestimmt (vgl. Beispiel 5 i).