DE19923966C2 - Erkennungssystem zur Auftrennung von Probenbestandteilen, seine Herstellung und Verwendung - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Erkennungssystem enthaltend (a) einen Träger (Komponente (a)) und (b) mindestens eine an den Träger gebundene Erkennungseinheit (Komponente (b)), vorzugsweise eine Nukleinsäure, wobei die genannte Erkennungseinheit (Komponente (b)) eine Region (A) mit einer definierten Struktur und eine zu der Region (A) benachbarte Region (B) mit einer randomisierten Struktur enthält, auf ein Verfahren zur Auf­ trennung einzelner Bestandteile in einer Probe, bei dem an mindestens eine an einen Träger gebundene Erkennungseinheit (Komponente (b)) unter geeigneten Bedingungen mindestens ein Bestandteil der Probe gebunden wird, und auf die Verwendung des erfindungsgemäßen Erkennungssystems und des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Auffinden und/oder zur Identifizierung bzw. Charakterisierung von Nukleinsäuren und/oder Proteinen einer Probe bzw. zum Auffinden und/oder zur Identifizierung von zellulären oder künstlichen Bindepart­ nern.

In einer menschlichen Zelle sind im allgemeinen bis zu ca. 30.000 Gene aktiv, welche den momentanen Zustand der Zelle charakterisieren. Der Zustand einer Zelle kann beispielsweise eine erhöhte Zellteilung im Fall einer Krebszelle oder allgemein veränderte Stoffwechselakti­ vitäten im Krankheitszustand darstellen. Die Aktivität eines Gens kann beispielsweise über seine mRNA als Transkriptionsprodukt oder über das entsprechende Protein als Translations­ produkt bestimmt werden. Das mRNA- bzw. Protein-Profil einer Zelle spiegelt daher deren momentanen Zustand wider.

Die Charakterisierung einer gesunden oder kranken Zelle anhand ihres mRNA- bzw. Protein- Profils ist für die Erforschung von Krankheiten und das Auffinden von pharmakologisch wirksamen Verbindungen in jüngster Zeit von großer Bedeutung geworden. Es wurden bereits verschiedene Methoden entwickelt, die das mRNA-Profil einer Zelle charakterisieren sollen.

Bei der sogenannten "Differential Display"-Methode werden die RNA-Profile mehrerer Zell­ populationen mittels Gelelektrophorese miteinander verglichen. Die mRNA-Population einer Zelle ist jedoch zu komplex, um die verschiedenen RNA-Transkripte im Gel einzeln aufzu­ trennen. Außerdem liegen die einzelnen RNA-Transkripte in sehr unterschiedlichen Mengen vor, so daß die unterrepräsentierten Transkripte nur schwer nachzuweisen sind. Deshalb wer­ den cDNAs von den einzelnen RNA-Transkripten hergestellt und bestimmte Abschnitte da­ von mittels bestimmter Primer-Kombinationen in einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifiziert. Die PCR-Produkte werden anschließend auf Gelen aufgetrennt, die Menge der einzelnen PCR-Produkte bestimmt und vorhandene Unterschiede auf dem Gel analysiert (sie­ he z. B. Liang, P. & Pardee, A. B. (1992) Science 257, 967-972 oder Zhang, H. et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24, 2454-2455). Ein wesentlicher Nachteil dieser Methode ist, daß nur kurze Bereiche der cDNA amplifiziert werden und eine hohe Fehlerrate an falsch-positiven Signalen erreicht wird.

Eine Weiterentwicklung der "Differential Display"-Methode ist die Subtraktionshybridisie­ rung, um schwach exprimierte Transkripte besser nachweisen zu können. Dazu wird von einer ersten Zellpopulation einzelsträngige cDNA hergestellt und diese mit der mRNA-Population einer zweiten Zellpopulation hybridisiert. Es bleiben nur solche cDNA-Moleküle der ersten Zellpopulation einzelsträngig zurück, von denen keine korrespondierenden mRNAs in der zweiten Zellpopulation vorhanden sind. Man kann auch mehrere solcher Hybiridisierungen nacheinander durchführen, so daß die Transkripte, die nur in der ersten Population enthalten sind, angereichert werden. Die einzelsträngig zurückgebliebene cDNA wird anschließend über Hydroxyapatit-Chromatographie, an die nur doppelsträngige DNA aber nicht einzel­ strängige DNA binden kann, abgetrennt und anschießend analysiert (siehe z. B. Konietzko, U. & Kuhl, D. (1998) Nucleic Acids Res. 26, 1359-1361, Perret, X. et al. (1994) Nucleic Acids Res. 25, 1335-1341 oder Herblot, S. et al. (1997) FEBS Lett. 414, 146-152). Ein wesentlicher Nachteil dieser Methode ist, daß immer nur zwei Populationen miteinander verglichen werden können, was zu einem hohen Arbeits- und Zeitaufwand führt.

Zur direkten Charakterisierung des Protein-Profils in einer Zelle müssen die zellulären Protei­ ne voneinander aufgetrennt werden. Eine effiziente Methode ist beispielsweise eine zweidi­ mensionale Polyacrylamid-Gelelektrophorese (2DE). In der ersten Dimension werden hierbei die Proteine nach ihrem isoelektrischen Punkt (IP) und in der zweiten Dimension nach ihrem Molekulargewicht aufgetrennt. Anschließend werden die Proteine durch Färbung im 2D-Gel sichtbar gemacht, wobei in typischen 2D-Gelen ca. 1.000-2.000 Proteine als Flecke ("spots") eingefärbt werden. Als Ergebnis erhält man ein für jede Zelle signifikantes Proteinmuster oder Profil, das den jeweiligen Zustand der Zelle auf Proteinebene widerspiegelt. Jedes Protein einer Zelle hat eine für das Protein spezifische Position auf dem 2D-Gel, so daß man für die Zelle und folglich für den ganzen Organismus eine sogenannte Proteom-Karte erstellen kann. Um die molekularen Ursachen von Zellveränderungen z. B. bei Krankheitsprozessen zu be­ stimmen, werden die Protein-Profile von gesunden und kranken Zellen verglichen, um even­ tuelle Unterschiede festzustellen. Dieser Vergleich kann beispielsweise automatisiert mittels geeigneter Computer durchgeführt werden (siehe z. B. Wilkins, M. R. et al. (eds.) Proteome Research: New Frontiers in Functional Genomics. Springer Verlag, Heidelberg (1997) oder Humphrey-Smith, I. et al. (1997) Electrophoresis 18, 1216-1242). Ein wesentlicher Nachteil dieser Methode ist jedoch, daß für eine weitere Analyse der detektierten Proteine diese auf Proteinebene sequenziert werden müssen, was derzeit noch Zeit- und kostenintensiv ist.

Alternative Methoden zur Bestimmung eventueller Unterschiede im mRNA- oder Protein- Profil einer Zelle benutzen sogenannte Arrays, d. h. Matrixsysteme. Arrays sind Anordnungen immobilisierter Erkennungsspezien, die speziell in der Analytik und Diagnostik eine wichtige Rolle bei der simultanen Bestimmung von Analyten spielen. Beispiele sind Nukleinsäure- Arrays (siehe z. B. Southern et al. Genomics (1992) 13, 1008; U.S. Patent Nr. 5,632,957, WO 97/27317 oder EP-A1-0 543 550) oder Peptid-Arrays (Fodor et al., Nature 1993, 364, 555). In WO 96/01836 wird beispielsweise ein Array von DNA-Molekülen unterschiedlicher Sequenz beschrieben, der zur Detektion von Genabschnitten diente und so beispielsweise zur Diagnose pathogener Bakterien führte. In den Patentpublikationen U.S. 5,605,662, WO 96/01836, U.S. 5,632,957 und WO 97/12030 werden Halbleiter-Chips und Verfahren be­ schrieben, mit deren Hilfe elektronisch kontrollierbar spezifische Bindereaktionen von biolo­ gischen Verbindungen, wie Nukleinsäuren oder Proteinen, an spezifische, adressierbare Stel­ len in Form eines Arrays durchgeführt werden können. Beispielsweise werden Nukleinsäuren in einer Probe an einem Nukleinsäure-Array auf einem Halbleiter-Chip mit Hilfe eines elek­ trischen Feldes hybridisiert und anschließend nicht- oder unspezifisch-gebundene Nukleinsäu­ ren durch eine einfache Umkehrung der Polarität des elektrischen Feldes entfernt. Hierbei kann durch eine genaue Einstellung der elektrischen Feldstärke eine Fehlpaarung eines einzi­ gen Basenpaares erkannt werden.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war ein System bereitzustellen, mit dessen Hilfe eine Population an Nukleinsäuren bzw. Proteinen spezifisch aufgetrennt und anschließend analy­ siert werden kann.

Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß eine entsprechende Ansammlung von Nu­ kleinsäuren enthaltend jeweils eine Region (A) mit einer definierten Nukleinsäuresequenz und eine zu der Region (A) benachbarte Region (B) mit einer jeweils unterschiedlichen, üblicher­ weise randomisierten Nukleinsäuresequenz geeignet ist, mittels spezifischer Hybridisierung an Nukleinsäuren einer Population das Nukleinsäure- und/oder Proteinprofil dieser Population zu charakterisieren.

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Erkennungssystem enthaltend (a) einen Träger (Komponente (a)) und (b) mindestens eine an den Träger gebundene Erken­ nungseinheit (Komponente (b)), wobei die genannte Erkennungseinheit (Komponente (b)) eine Region (A) mit einer definierten Struktur und eine zu der Region (A) benachbarte Region (B) mit einer randomisierten Struktur enthält.

Unter dem Begriff Erkennungseinheit versteht man gemäß der vorliegenden Erfindung Nu­ kleinsäuren und deren Analoga bzw. Fusionen, insbesondere in Form einer Pentose, vorzugs­ weise eine Pentopyranose oder Pentofuranose. Im allgemeinen ist die Pentose ausgewählt aus einer Ribose, Arabinose, Lyxose oder Xylose. Beispiele von geeigneten Nukleinsäuren bzw. deren Analoga sind DNA, RNA, insbesondere mRNA oder p-RNA (Pyranosyl-RNA, siehe z. B. WO 99/15539), Aminocyclohexyl-Nukleinsäuren (CNA, siehe z. B. WO 99/15509), pep­ tidische Nukleinsäuren (PNA, siehe z. B. WO 92/20702 oder Science (254), 1999, 1497-1500) oder nicht-helikale supramolekulare Nanosysteme wie z. B. in WO 98/25943 beschrieben. Beispiele von Nukleinsäurefusionen sind Nukleinsäure-Proteinakzeptor-Derivate, insbesonde­ re Nukleinsäure-Puromycin-Derivate, oder Nukleinsäure-Protein-Fusionen, insbesondere Nu­ kleinsäure-Puromycin-Protein-Fusionen. Besonders bevorzugte Nukleinsäuren sind DNAs und mRNAs einschließlich deren Fusionen vorzugsweise mit Puromycin und/oder mit Prote­ in.

Unter dem Begriff "definierte Struktur" versteht man gemäß der vorliegenden Erfindung eine Struktur, deren Aufbau bekannt ist. Beispielsweise ist die definierte Struktur einer Nuklein­ säure ihre bekannte Nukleinsäuresequenz.

Unter dem Begriff "randomisierte Struktur" versteht man gemäß der vorliegenden Erfindung eine Struktur, deren genauer Aufbau nicht bekannt ist. Beispielsweise ist die randomisierte Struktur einer Nukleinsäure ihre durch Zufallsereignisse bzw. Permuation der einzelnen Nu­ kleotide entstandene Nukleinsäuresequenz.

Die Länge der Region (A) und/oder der Region (B) ist vorzugsweise unabhängig voneinander ca. 5 bis ca. 80 Nukleotide, vorzugsweise ca. 5 bis ca. 30 Nukleotide und insbesondere ca. 10 bis ca. 30 Nukleotide für die Region (A) und insbesondere ca. 7-8 Nukleotide für die Region (B), wobei die Nukleotide in einer besonders bevorzugten Ausführungsform Desoxyribonu­ kleotide (d), Ribonukleotide (r) oder 2-Hydroxymethylribonukleotide (hmr) sind. In den wei­ teren Ausführungen werden die Nukleinsäuresequenzen ohne deren spezielle Rückgrade an­ gegeben. Die angegebenen Nukleinsäuresequenzen umfassen daher in jedem Fall die Ausfüh­ rungsformen (d), (r) und (hmr). Zudem können RNAs gemäß der vorliegenden Erfindung nicht nur aus Ribonukleotiden, sondern auch aus 2-Hydroxymethylribonukleotiden aufgebaut sein.

In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform besteht die Region (A) aus einem poly-T-Strang mit beispielsweise 7-15 Thymidin-Nukleotiden (T_7-15), einem Nukleinsäure- Linker bekannter Sequenz, beispielsweise einem poly-T₂₇GG-Strang, oder einem zu der Ribo­ somenbindestelle komplementären Strang des entsprechenden Organismus, wie z. B. eines prokaryotischen Organismus wie Bakterien oder insbesondere eines eukaryotischen Organis­ mus wie Pflanzen, Tiere, vorzugsweise Säuger, insbesondere Mensch. Mit Hilfe der Region (A) gelingt es, alle unterschiedlichen Nukleinsäuren einer Nukleinsäure-Population, die z. B. aus der entsprechenden Zelle isoliert wurde, zu isolieren bzw. an den Träger des Erkennungs­ systems zu binden. Beispielsweise enthält jede mRNA einer Zelle einen poly-A-Schwanz, an den der poly-T-Strang der an den Träger gebundenen Nukleinsäure unter geeigneten Bedin­ gungen hybridisiert.

Die Nukleinsäurepopulation ist jedoch gemäß der vorliegenden Erfindung nicht auf natürlich vorkommende Nukleinsäurepopulationen beschränkt, sondern umfaßt auch künstlich herge­ stellte Populationen, wie z. B. Nukleinsäurepopulationen kombinatorischer Systeme. Derarti­ ge Populationen bzw. Substanzbibliotheken sind beispielsweise in WO 93/20242, WO 97/43232, WO 98/25943 oder WO 99/15541 beschrieben.

Die Charakterisierung eines Protein-Profils einer Protein-Population, beispielsweise einer Protein-Population einer Zelle, gelingt z. B. über die Selektion von Proteinen mittels geeig­ neter Nukleinsäure-Protein-Fusionen. In WO 98/31700 ist beispielsweise ein System beschrie­ ben, bei dem an die Nukleinsäure, vorzugsweise mRNA, über einen geeigneten Linker ein Proteinakzeptor, beispielsweise ein Puromycin gebunden ist. Hierdurch wird erreicht, daß kurz vor dem Ende der Translation der mRNA in das entsprechende Protein, das synthetisierte Protein kovalent an ihre kodierende mRNA gebunden und so näher charakterisiert werden kann. Der Linker, dessen Sequenz bekannt ist, eignet sich in besonders vorteilhafter Weise als Binderegion an die Region (A) der erfindungsgemäßen Nukleinsäure. Beispielsweise kann ein poly-T₂₇GG-Strang als Region (A) verwendet werden, um an einen Linker mit der Sequenz A₂₇CC einer Nukleinsäure-Protein-Fusion zu binden. Vergleichbare Systeme, die für die vor­ liegende Erfindung verwendet werden können, sind beispielsweise in DE 196 46 372 C1, WO 98/16636, WO 91/05058, U.S. 5,843,701, WO 93/03172 oder WO 94/13623 beschrieben.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich daher auch auf ein Erkennungssystem, bei dem das oben beschriebene Erkennungssystem mindestens eine weitere Erkennungseinheit (Kompo­ nente (c)) enthält, die an die Erkennungseinheit gemäß Komponente (b) spezifisch gebunden ist. Vorzugsweise ist die Komponente (c) ausgewählt ist aus einer Nukleinsäure und/oder de­ ren Analoga oder Fusionen, wie z. B. einer Nukleinsäure mit einem Proteinakzeptor und/oder einer Nukleinsäure-Protein-Fusion, insbesondere aus einem Nukleinsäure-Puromycin-Derivat und/oder einer Nukleinsäure-Puromycin-Protein-Fusion, wie z. B. oben bereits näher be­ schrieben.

Die Region (B) stellt eine Region mit einer randomisierten Struktur dar, um alle unterschied­ lichen Bestandteile einer Population, wie z. B. Nukleinsäuren, erfassen zu können. Die Länge der randomisierten Struktur hängt hierbei von der Komplexität der Population ab, die erfahrungsgemäß bei einer prokaryotischen Zelle geringer und bei einer eukaryotischen Zelle höher ist. Beispielsweise sind in einer menschlichen Zelle ca. 30.000 Gene aktiv, so daß Im Fall einer Nukleinsäure eine Länge von 7-8 Nukleotiden in permutierter bzw. randomisierter Rei­ henfolge ausreicht, um alle aktiven Gene einer menschlichen Zelle zu erfassen. Die Zahl der Permutationsmöglichkeiten für ein n-mer-Oligonukleotid beträgt bekannterweise 4ⁿ, wobei n die Zahl der Nukleotide des Oligonukleotids bedeutet. Für die Auftrennung aller aktiven Gene einer menschlichen Zelle ist daher eine an einen Träger gebundene Nukleinsäure mit folgen­ der Formel bevorzugt:

3'-(X)₈-Region (A)-5',

wobei X jedes beliebige Nukleotid ausgewählt aus Adenosin, Thymidin, Guanosin oder Cyto­ sin bedeutet.

Unter dem Begriff "Träger" versteht man im Sinne der vorliegenden Erfindung Material, ins­ besondere Chipmaterial aus Halbleiter, das in fester oder auch gelartiger Form vorliegt. Als Trägermaterialien eignen sich beispielsweise Keramik, Metall, insbesondere Halbleiter, Edelmetall, Gläser, Kunststoffe, kristalline Materialien bzw. dünne Schichten des Trägers, insbesondere der genannten Materialien, oder (bio)molekulare Filamente wie Cellulose, Ge­ rüstproteine. Bevorzugt sind Trägersysteme wie in EP-A1-0543550 oder WO 99/15893 und insbesondere wie in U.S. 5,605,662, WO 96/01836, U.S. 5,632,957 oder WO 97/12030 be­ schrieben, da hiermit Halbleiter-Chips hergestellt werden können, mit deren Hilfe elektro­ nisch kontrollierbar spezifische Bindereaktionen von Nukleinsäuren an spezifische, adressier­ bare Stellen in Form eines Arrays durchgeführt werden können. Hierdurch kann in besonders vorteilhafter Weise die spezifisch aufzutrennende Nukleinsäure-Population einer Probe an einem Nukleinsäure-Array mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren auf dem Halbleiter- Chip mit Hilfe eines elektrischen Feldes hybridisiert und anschließend nicht- oder unspezi­ fisch-gebundene Nukleinsäuren durch eine einfache Umkehrung der Polarität des elektrischen Feldes entfernt werden. Eine besonders bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Erkennungssystems ist daher ein elektronischer Chip.

Die Trägerung erfolgt im allgemeinen kovalent, quasi-kovalent, supramolekular oder physi­ kalisch wie magnetisch (A. R. Shepard et al. (1997) Nucleic Acids Res., 25, 3183-3185, Nr. 15), im elektrischen Feld oder durch einen Molekularsieb, vorzugsweise gemäß einem Verfahren wie in U.S. 5,605,662, WO 96/01836, U.S. 5,632,957, WO 97/12030 oder WO 99/15893 beschrieben.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zur Herstellung eines erfin­ dungsgemäßen Erkennungssystems, bei dem eine Erkennungseinheit (Komponente (b)) ent­ haltend eine Region (A) mit einer definierten Struktur und eine zu der Region (A) benach­ barte Region (B) mit einer randomisierten Struktur an einen Träger nach allgemein bekannten Verfahren gebunden wird.

Des weiteren bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung eines Erkennungssystems, bei dem zum einen eine Erkennungseinheit (Komponente (b)) enthaltend eine Region (A) mit einer definierten Struktur und eine zu der Region (A) benachbarte Region (B) mit einer randomisierten Struktur an einen Träger (Komponente (a)) gebunden wird und zum anderen mindestens eine weitere Erkennungseinheit als Komponente (c) an die Erken­ nungseinheit gemäß Komponente (b) spezifisch gebunden wird.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden vorzugsweise mehr als eine Erkennungsein­ heit als Komponente (b) bzw. als Komponente (c) räumlich getrennt an den Träger (Kompo­ nente (c)) bzw. an die Erkennungseinheit gemäß Komponente (b) beispielsweise in separaten Zellen gebunden. Spezielle Herstellungsverfahren sind beispielsweise in EP-A1-0543550 oder WO 99/15893 und insbesondere in U.S. 5,605,662, WO 96/01836, U.S. 5,632,957 bzw. EP-B1- 0373203, WO 97/12030 oder WO 98/31700 näher beschrieben.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Auftrennung ein­ zelner Bestandteile in einer Probe, bei dem an mindestens eine an einen Träger (Komponente (a)) gebundene Erkennungseinheit (Komponente (b)), die eine Region (A) mit einer definier­ ten Struktur und eine zu der Region (A) benachbarte Region (B) mit einer randomisierten Struktur enthält, unter geeigneten Bedingungen mindestens ein Bestandteil der Probe gebun­ den wird, der zu der Komponente (b) bzw. zu der Komponente (c) komplementär ist.

"Komplementär" im Sinne der vorliegenden Erfindung bedeutet, daß der Bestandteil der Pro­ be spezifisch an die Komponente (b) oder an die Komponente (c) bindet. Beispielsweise bin­ det eine Nukleinsäure spezifisch an eine andere Nukleinsäure, sofern die beiden Nukleinsäu­ ren komplementäre Sequenzen besitzen, um beispielsweise A-T bzw. G-C Basenpaare im Fall von Desoxyribonukleinsäuren zu bilden. Unter dem Begriff "komplementär" versteht man jedoch auch spezifische Nukleinsäure-Protein- oder Protein-Protein-Bindungen, beispielswei­ se eine spezifische Antigen-Antikörper-Bindung, oder die spezifische Bindung zwischen ei­ nem chemischen Wirkstoff und einer Nukleinsäure oder einem Protein.

Bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens beinhalten ein Erken­ nungssystem, das oben bereits näher beschrieben wurde. In einem besonders bevorzugten erfindungsgemäßen Verfahren wird ein elektronischer Chip verwendet, da der Bestandteil der Probe, beispielsweise eine Nukleinsäure und/oder deren Analoga oder Fusionen, mit Hilfe eines elektrischen Feldes an die an einen Träger gebundene Erkennungseinheit, beispielsweise eine komplementäre Nukleinsäure, in vorteilhafter Weise gebunden wird. Eine genaue Be­ schreibung eines derartigen elektronischen Chips sowie seine Anwendung wird beispielsweise in EP-A1-0543550 oder WO 99/15893 und insbesondere in U.S. 5,605,662, WO 96/01836, U.S. 5,632,957 oder WO 97/12030 beschrieben.

Der Bestandteil der Probe ist beispielsweise eine Nukleinsäure und/oder deren Analoga bzw. Fusionen, wie bereits oben näher beschrieben, und vorzugsweise eine DNA, RNA, insbeson­ dere eine mRNA, ein RNA-Puromycin-Derivat oder eine Nukleinsäure-Protein-Fusion, insbe­ sondere eine RNA-Protein-Fusion, vorzugsweise eine mRNA-Puromycin-Protein-Fusion, wie beispielsweise in WO 98/31700 näher beschrieben, oder ein oder mehrere chemische Wirk­ stoffe.

Beispielsweise wird in einer bevorzugten Ausführungsform in einem ersten Schritt eine mRNA-Population einer Probe an Nukleinsäuren des erfindungsgemäßen Erkennungssystems mit beispielsweise der Formel 3'-(X)_7-8-(T_7-15)-5', wobei X jedes beliebige Nukleotid ausge­ wählt aus Adenosin, Thymidin, Guanosin oder Cytosin bedeutet, vorzugsweise mit Hilfe ei­ nes elektrischen Feldes gebunden, und gegebenenfalls in einem weiteren Schritt nicht- oder nicht-spezifisch gebundene Nukleinsäuren, vorzugsweise mit Hilfe eines umgepolten elektri­ schen Feldes geringerer Feldstärke als im ersten Schritt, entfernt.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird in einem ersten Schritt an eine mRNA- Population einer Probe ein geeigneter Nukleinsäure-Linker, beispielsweise ein A₂₇CC, bei­ spielsweise chemisch oder mit Hilfe einer geeigneten Ligase, beispielsweise einer T4 DNA Ligase, fusioniert, in einem zweiten Schritt werden die mRNA-Linker-Fusionen an Nuklein­ säuren des erfindungsgemäßen Erkennungssystem mit beispielsweise der Formel 3'-(X)_7-8- (T₂₇GG)-5', wobei X jedes beliebige Nukleotid ausgewählt aus Adenosin, Thymidin, Guano­ sin oder Cytosin bedeutet, vorzugsweise mit Hilfe eines elektrischen Feldes gebunden, und gegebenenfalls werden in einem weiteren Schritt nicht- oder nicht-spezifisch gebundene Nu­ kleinsäuren, vorzugsweise mit Hilfe eines umgepolten elektrischen Feldes geringerer Feld­ stärke als im ersten Schritt, entfernt.

Enthält der Linker zusätzlich einen Proteinakzeptor, wie z. B. Puromycin, und wird in einem Zwischenschritt vor oder nach der Bindung der mRNA-Linker-Fusionen an das erfindungs­ gemäße Erkennungssystem eine Translationsreaktion durchgeführt, die zu mRNA-Linker- Protein-Fusionen führt, so wird nach der Bindung der mRNA-Linker-Protein-Fusionen an das erfindungsgemäße Erkennungssystem ein Protein-Profil der entsprechenden Population er­ halten, das weiter analysiert werden kann. Einzelheiten zur Herstellung geeigneter Nuklein­ säure-Linker-Protein-Fusionen sind beispielsweise in WO 98/31700 offenbart.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann zur Analyse der an das Erkennungssystem gebunde­ nen Nukleinsäure der Probe verwendet werden. Beispielsweise kann über das Nukleinsäure- und/oder Protein-Profil der Zustand verschiedener Zellen oder Gewebeproben analysiert bzw. verglichen werden. Zudem kann nachgewiesen werden, ob eine spezifische Nukleinsäure oder ein spezifisches Protein in einer Population vorhanden ist. Auch können mögliche Expressi­ onszustände verschiedener Zellen identifiziert werden. Des weiteren können die gebundenen Nukleinsäuren oder Proteine mittels geeigneter Markierungsmethoden direkt oder indirekt nachgewiesen werden.

Beispiele von Markierungsverfahren von Nukleinsäuren und/oder Proteinen sind chemische, Enzym-, Protein-, radioaktive Isotopen-, nicht-radioaktive Isotopen-, Toxin-, Chemilumines­ zens und/oder Fluoreszensmarkierung.

Beispiele von dem Fachmann bekannten chemischen Substanzen, die sich für eine erfin­ dungsgemäße chemische Markierung eignen, sind: Biotin, Fluoresceinisothiocyanat (FITC) oder Streptavidin.

Beispiele von dem Fachmann bekannten Enzymen, die sich für eine erfindungsgemäße En­ zymmarkierung beispielsweise in Form eines ELISA eignen, sind: Malathydrogenase, Sta­ phylokokkennuklease, A-5-Steroidisomerase, Alkoholdehydrogenase, α-Glycerolphosphat­ dehydrogenase, Triosephosphatisomerase, Peroxidase, alkalische Phosphatase, Asparaginase, Glucoseoxidase, β-Galactosidase, Urease, Katalase, Glucose-6-phosphatdehydrogenase, Glu­ coamylase, Luciferase oder Acetylcholinesterase.

Beispiele von dem Fachmann bekannten Proteinen oder Proteinfragmenten, die sich für eine erfindungsgemäße Proteinmarkierung eignen, sind ein N- oder C-terminales (HIS)₆, ein Myc, ein FLAG, ein Hämaglutenin, Glutathion-Transferase (GST), Intein mit einem Chitin, Malto­ sebindendes Protein (MBP) oder Antikörper bzw. Antigen-bindende Teile von Antikörper, z. B. Fv-Fragmente.

Beispiele von dem Fachmann bekannten Isotopen, die sich für eine erfindungsgemäße radio­ aktive Isotopenmarkierung eignen, sind: ³H, ¹²⁵I ¹³¹I, ³²P, ³³P, ¹⁴C, ⁵¹Cr, ⁵⁷To, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe, ⁷⁵Se, ¹⁵²Eu, ⁹⁰Y, ⁶⁷Cu, ²¹⁷Ci, ²¹¹At, ²¹²Pb, ⁴⁷Sc oder ¹⁰⁹Pb.

Beispiele von dem Fachmann bekannten Isotopen, die sich für eine erfindungsgemäße nicht- radioaktive Isotopenmarkierung eignen, sind: ²H oder ¹³C.

Beispiele von dem Fachmann bekannten Toxinen, die sich für eine erfindungsgemäße Toxin­ markierung eignen, sind: Diphtherietoxin, Ricin oder Choleratoxin.

Beispiele von dem Fachmann bekannten chemilumineszenten Substanzen, die sich für eine erfindungsgemäße Chemilumineszensmarkierung eignen, sind: Luminal-Markierung, Isolu­ minal-Markierung, aromatische Acridinester-Markierung, Oxalester-Markierung, Luciferin- Markierung, Acridinsalz-Markierung, Imidazol-Markierung oder Aequorin-Markierung.

Beispiele von dem Fachmann bekannten fluoreszierenden Substanzen, die sich für eine erfin­ dungsgemäße Fluoreszensmarkierung eignen, sind: ¹⁵²Eu, Fluorescein, Isothiocyanat, Rhoda­ min, Phycoerythrin, Phycocyanin, Allophycocyanin, o-Phthaldehyd, Green Fluorescent Pro­ tein (GFP) oder Fluorescamin.

Dem Fachmann sind weitere hier nicht aufgeführte Markierung bzw. Analyseverfahren, wie z. B. die Massenspektroskopie, bekannt, die auch im Sinne dieser Erfindung zur Markierung eingesetzt werden können.

Beispiele von dem Fachmann bekannten erfindungsgemäßen chemischen Modifikationen sind die Übertragung von Acetyl-, Phosphat-, und/oder Monosacharidgruppen

Gebundene Nukleinsäuren können auch über EST(expressed sequence tags)-Datenbanken, Northern Blot auf dem erfindungsgemäßen Erkennungssystem oder durch Sequenzierung an dem Erkennungssystem oder nach gezielter Freisetzung vorzugsweise nach vorheriger Ampli­ fikation mittels PCR, RT-PCR oder Klonierung weiter identifiziert bzw. charakterisiert wer­ den.

Zur Herstellung eines Protein-Profils einer Population kann die an das erfindungsgemäße Er­ kennungssystem gebundene Nukleinsäure entweder vor oder nach dem Ablösen vom Erken­ nungssystem translatiert und die Translationsprodukte anschließend entweder an demselben Erkennungssystem oder an einem anderen Erkennungssystem erneut an äquivalenten Positio­ nen gebunden werden. Das Protein-Profil kann vorzugsweise auch wie oben bereits näher beschrieben über RNA-Protein-Fusionen hergestellt werden.

Mit Hilfe der vorliegenden Erfindung kann somit in besonders vorteilhafter Weise der phy­ siologische Zustand einer Zelle und biologische Prozesse einer Zelle identifiziert, charakteri­ siert und überwacht werden.

Protein-Profile von Populationen eignen sich insbesondere zum Auffinden und/oder zur Iden­ tifizierung von zellulären oder künstlichen Bindepartner, wie z. B. Proteinen, Peptiden, Nu­ kleinsäuren, chemischen Wirkstoffen, vorzugsweise organischen Verbindungen, pharmakolo­ gisch wirksamen Verbindungen, Pflanzenschutzwirkstoffen, Toxinen, wie z. B. Giften, carzi­ nogenen und/oder teratogenen Substanzen, Herbiziden, Fungiziden oder Pestiziden. Einzelne Proteine können auch anhand ihrer Funktion, z. B. ihrer enzymatischen Aktivität, direkt am Erkennungssystem identifiziert und charakterisiert werden. Desweiteren können gebundene Proteine in Form ihrer mRNA-Protein-Fusionen über die Sequenzierung der mRNA, wie bei­ spielsweise in WO 98/31700 näher beschrieben, charakterisiert werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft daher auch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Er­ kennungssystems, eines erfindungsgemäßen Verfahrens oder einer erfindungsgemäßen Er­ kennungseinheit enthaltend eine Region (A) mit einer definierten Struktur und eine zu der Region (A) benachbarte Region (B) mit einer randomisierten Struktur zum Auffinden und/oder zur Identifizierung bzw. Charakterisierung von mindestens einem Bestandteil einer Probe, insbesondere von Nukleinsäuren und/oder Proteinen einer Probe, bzw. zum Auffinden und/oder zur Identifizierung von zellulären oder künstlichen Bindepartnern, vorzugsweise von Proteinen, Peptiden, Nukleinsäuren, chemischen Wirkstoffen, vorzugsweise organischen Ver­ bindungen, pharmakologisch wirksamen Verbindungen, Pflanzenschutzwirkstoffen, Toxinen, insbesondere Giften, carzinogenen und/oder teratogenen Substanzen, Herbiziden, Fungiziden oder Pestiziden.

Die Figur und das Beispiel sollen die Erfindung näher beschreiben ohne sie zu beschränken:

Beschreibung der Figur

Fig. 1 zeigt die Nukleinsäuresequenzen von an einen Träger gebundenen DNA- Oligonukleotiden, die vom β-Actin-Gen oder von S-9 RNA abgeleitet wurden und die beiden Fluoreszenzfarbstoff-markierten Proben.

Beispiel

Es wurden zwei Sätze von jeweils acht Biotin-markierten Oligonukleotiden hergestellt, die einen 13 Nukleotide-langen Thymidinschwanz (Region A) und einen jeweils unterschiedli­ chen Bereich von 7 Oligonukleotiden (Region B) gemäß Fig. 1 enthielten. Die Region B wur­ de entweder vom 3'-UTR-Bereich des β-Actin-Gens oder von der S-9 RNA abgeleitet und enthielt entweder keine Mutation oder die an den entsprechenden Stellen fett gekennzeichne­ ten Mutationen (siehe Fig. 1). Zusätzlich wurden zwei Oligonukleotide synthetisiert, die vom β-Actin-Gen oder von der S-9 RNA abgeleitet wurden. Diese Oligonukleotide enthalten kom­ plementäre Bereiche zu den Biotin-markierten Oligonukleotiden und wurden entweder mit einem grünen (Cy3) oder mit einem roten (CY5) Fluoreszenzfarbstoff markiert.

Zur Auftrennung der beiden Fluoreszenzfarbstoff-markierten Proben wurde ein 2 × 8- Positionen enthaltender Chip aus Halbleitermaterial verwendet, auf dem die Biotin-markierten Oligonukleotide fixiert wurden. Nach erfolgter Hybridisierung der beiden Fluoreszenzfarb­ stoff-markierten Proben konnte nachgewiesen werden, daß die Bindung an den Chip in beiden Fällen am besten an der Position erfolgte, an der jeweils das Oligonukleotid fixiert war, das eine perfekte Hybridisierung erlaubte.

Claims (23)

1. Erkennungssystem enthaltend

• a) einen Träger (Komponente (a)) und
• b) mindestens eine an den Träger gebundene Erkennungseinheit (Komponente (b)), dadurch gekennzeichnet, daß die genannte Erkennungseinheit (Komponente (b)) eine Region (A) mit einer Länge von 5 bis 80 Nukleotiden und eine zu der Region (A) benachbarte Region (B) mit einer randomisierten Struktur mit einer Länge von 5 bis 30 Nukleotiden enthält und
• c) eine weitere Erkennungseinheit (Komponente (c)) aus einer Nukleinsäure mit einem Proteinakzeptor oder einer Nukleinsäure-Protein-Fusion, die an die Erkennungseinheit gemäß Komponente (b) spezifisch gebunden ist.

2. Erkennungssystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Länge der Region (A) und/oder der Region (B) 10 bis 30 Nukleotide für die Region (A) und 7-8 Nukleotide für die Region (B) ist.

3. Erkennungssystem nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Region (A) aus einem poly-T-Strang, besteht.

4. Erkennungssystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Komponente (c) ein Nukleinsäure-Puromycin-Derivat und/oder eine Nukleinsäure-Puromycin-Protein-Fusion ist.

5. Erkennungssystem nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger aus Keramik, Metall, insbesondere Halbleiter, Edelmetall, Gläser, Kunststoffe, kristalline Materialien oder dünne Schichten des Trägers, der genannten Materialien, oder (bio)molekulare Filamente wie Cellulose, Gerüstproteine, oder aus einer Kombination der genannten Materialien aufgebaut ist.

6. Erkennungssystem nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß das Erkennungssystem ein elektronischer Chip ist.

7. Verfahren zur Herstellung eines Erkennungssystems gemäß einem der Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß eine Erkennungseinheit (Komponente (b)) enthaltend eine Region (A) mit einer definierten Struktur aus 5 bis 80 Nukleotiden und eine zu der Region (A) benachbarte Region (B) mit einer randomisierten Struktur aus 5 bis 30 Nukleotiden an einen Träger (Komponente (a)) gebunden wird und eine weitere Erkennungseinheit Komponente (c) aus einer Nukleinsäure mit einem Proteinakzeptor oder einer Nukleinsäure-Protein-Fusion an die Erkennungseinheit gemäß Komponente (b) spezifisch gebunden wird.

8. Verfahren zur Herstellung eines Erkennungssystems nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß mehr als eine Erkennungseinheit als Komponente (b) räumlich getrennt an den Träger (Komponente (a)) gebunden sind und Komponente (c) an die Erkennungseinheit gemäß Komponente (b) gebunden werden.

9. Verfahren zur Auftrennung einzelner Bestandteile in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, daß an mindestens eine an einen Träger (Komponente (a)) gebundene Erkennungseinheit (Komponente (b)), die eine Region (A) mit einer definierten Struktur aus 5 bis 80 Nukleotiden und eine zu der Region (A) benachbarte Region (B) mit einer randomisierten Struktur aus 5 bis 30 Nukleotiden enthält, mindestens eine Erkennungseinheit (Komponente (c)) spezifisch gebunden ist, die unter geeigneten Bedingungen mindestens ein Bestandteil der Probe bindet.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Länge der Region (A) und/oder der Region (B) 10 bis ca. 30 Nukleotide für die Region (A) und 7-8 Nukleotide für die Region (B) ist.

11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Region (A) aus einem poly-T-Strang besteht.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 9-11, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger aus Keramik, Metall, insbesondere Halbleitern, Edelmetallen, Gläsern, Kunststoffen, kristallinen Materialien oder dünne Schichten der genannten Materialien, oder aus (bio)molekularen Filamenten, wie Cellulose, aus Gerüstproteinen, oder aus einer Kombination der genannten Materialien aufgebaut ist.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 9-12, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte Verfahren an einem elektronischen Chip durchgeführt wird.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 9-13, dadurch gekennzeichnet, daß der Bestandteil der Probe mit Hilfe eines elektrischen Feldes an die an einen Träger gebundene Erkennungseinheit als Komponente (b) oder als Komponente (c) gebunden wird.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 9-14, dadurch gekennzeichnet, daß als Bestandteil der Probe ein chemischer Wirkstoff verwendet wird.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 9-15, dadurch gekennzeichnet, daß in einem ersten Schritt mindestens eine mRNA einer mRNA-Population einer Probe an mindestens eine an einen Träger gebundene Nukleinsäure der Formel 3'-(X)_7-8-(T_7-15)-5', wobei X jedes beliebige Nukleotid ausgewählt aus Adenosin, Thymidin, Guanosin oder Cytosin bedeutet, gebunden wird.

17. Verfahren nach Anspruch 16 dadurch gekennzeichnet, daß nicht spezifisch gebundene Nukleinsäuren entfernt werden.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 und 17 dadurch gekennzeichnet, daß die Anbindung der Komponente (b) und/oder Entfernung nicht spezifisch gebundener Nukleinsäuren mit Hilfe eine elektrischen Feldes erfolgt.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 11-17, dadurch gekennzeichnet, daß in einem ersten Schritt an eine mRNA-Population einer Probe ein dA₂₇dCdC-Linker, chemisch oder mit Hilfe einer geeigneten Ligase, fusioniert wird und in einem zweiten Schritt die mRNA-Linker- Fusionen an Nukleinsäuren des Erkennungssystem mit der Formel 3'-(X)_7-8-(T₂₇GG)-5', wobei X jedes beliebige Nukleotid ausgewählt aus Adenosin, Thymidin, Guanosin oder Cytosin bedeutet, gebunden werden.

20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß in einem Zwischenschritt vor oder nach der Bindung der mRNA-Linker-Fusionen an die an einen Träger gebundenen Nukleinsäuren eine Translationsreaktion durchgeführt wird, die zu mRNA-Linker-Protein- Fusionen führt.

21. Verfahren nach einem der Ansprüche 11-20, dadurch gekennzeichnet, daß in einem weiteren Schritt der chemische Wirkstoff analysiert wird.

22. Verwendung eines Erkennungssystems gemäß einem der Ansprüche 1-6, eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 9-21 zum Auffinden und/oder zur Identifizierung oder Charakterisierung von mindestens einem spezifisch bindenden Bestandteil einer Probe.

23. Verwendung eines Erkennungssystems gemäß einem der Ansprüche 1-6 und eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 9-21, zum Auffinden und/oder zur Identifizierung von zellulären oder künstlichen Bindepartner aus der Gruppe der Proteine, Peptide, Nukleinsäuren, chemischen Wirkstoffen, organischen Verbindungen, pharmakologisch wirksamen Verbindungen, Pflanzenschutzwirkstoffen, Toxinen, Giften, carzinogenen und/oder teratogenen Substanzen, Herbiziden, Fungiziden oder Pestiziden.