EP1397688A2 - Verfahren zur identifizierung von wechselwirkungen zwischen proteinen und dna-fragmenten eines genoms - Google Patents

Verfahren zur identifizierung von wechselwirkungen zwischen proteinen und dna-fragmenten eines genoms

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Publication number
EP1397688A2
EP1397688A2 EP02754655A EP02754655A EP1397688A2 EP 1397688 A2 EP1397688 A2 EP 1397688A2 EP 02754655 A EP02754655 A EP 02754655A EP 02754655 A EP02754655 A EP 02754655A EP 1397688 A2 EP1397688 A2 EP 1397688A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
dna
protein
dna fragments
library
proteins
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP02754655A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Stefan Beyer
Ursula Bilitewski
Joop Van Den Heuvel
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Helmholtz Zentrum fuer Infektionsforschung HZI GmbH
Original Assignee
Helmholtz Zentrum fuer Infektionsforschung HZI GmbH
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Filing date
Publication date
Application filed by Helmholtz Zentrum fuer Infektionsforschung HZI GmbH filed Critical Helmholtz Zentrum fuer Infektionsforschung HZI GmbH
Publication of EP1397688A2 publication Critical patent/EP1397688A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B30/00—Methods of screening libraries
    • C40B30/04—Methods of screening libraries by measuring the ability to specifically bind a target molecule, e.g. antibody-antigen binding, receptor-ligand binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6845—Methods of identifying protein-protein interactions in protein mixtures

Definitions

  • the present invention relates to a novel method for the parallel zn-vitro identification of DNA-protein changes effects, ie potential DNA binding sites for proteins of unknown function can be found in the genome of organisms.
  • the proteins to be examined are incubated with DNA fragments that map the entire genome and then the sequences to which a specific binding takes place are identified.
  • the DNA fragments are preferably used in immobilized form and the binding of the protein to be examined is detected.
  • Upstream regulatory elements in front of genes and operons that are bound by DNA-binding proteins such.
  • B. transcription factors can be identified, can be identified.
  • the clarification of regulatory networks in complex biological systems is simplified and accelerated.
  • this invention can be used in order to describe the function and networking of regulons and modulons in bacterial systems.
  • DNA-protein interactions can be detected either in vivo, in vitro or by a combination of both experimental systems. As a rule, the investigations must be limited to one or only a few interacting and previously identified DNA-protein binding partners. By linking a so-called in vivo footprint with in vitro DNA microarray analyzes, even complex DNA mixtures can be checked for interactions based on a known or suspected DNA binding protein.
  • In vivo analyzes determine the effect of a DNA binding protein in connection with a possible DNA binding site on the transcription rate of a gene located in ice downstream.
  • the mRNA formed is detected and possibly quantified by z.
  • the mRNA is radioactively marked during the in vivo transcription or the mRNA is subsequently hybridized with radioactive or fluorescence-labeled probes.
  • the transcription rate can be indirectly correlated with the amount of the protein translated by this mRNA or with the enzyme activity derived therefrom.
  • the DNA partner is usually radioactively marked.
  • Protein and DNA are incubated in solution under various conditions and then either paired with a nitrocellulose membrane (filter binding) or immunoprecipitated with an antibody (McCay assay).
  • McCay assay Another go The common method is the gel retardation assay, in which the electrophoretic running behavior of protein-bound DNA is compared with that of unbound DNA. Different incubation conditions such as salt concentration, pH value, competitor DNA etc. allow conclusions to be drawn about the specificity and binding constants between the protein and the DNA fragment.
  • Chromatin immunoprecipitation with subsequent DNA microarray hybridization is based on the covalent linkage of DNA with cellular proteins catalyzed by formaldehyde or glutaraldehyde in an intact cell system. Because of their proximity, DNA binding proteins are preferentially bound to the DNA.
  • the DNA from the cells treated in this way is extracted, fragmented (eg by scissors) and then immunoprecipitated using an antibody directed against the DNA binding protein to be examined.
  • the DNA After separation of the DNA binding protein, the DNA can be amplified, labeled and hybridized against DNA spotted on microarrays. Compared to a control, e.g. B. a deletion mutant relating to the protein to be examined, specifically bound DNA fragments can be identified in parallel.
  • the detection limit of this method is directly dependent on the presence or the amount of the regulatory protein to be examined, the intracellular concentration of which is generally very low.
  • Nucleic acids are polymers and therefore bind to suitable carrier materials such as e.g. Membranes.
  • Nucleic acids are always negatively charged due to the phosphate residues of the nucleotides. Accordingly, they can be transferred to positive carrier surfaces using purely electrostatic forces. tie surfaces. This is exploited when using supports that are functionalized with amino groups (eg polylysine-coated supports or supports modified with aminopropyltriethoxysilane (APTS)), or membranes with positively charged side groups. Both methods (pure adsorption or adsorption supported by electrostatic forces) are characterized by the fact that they are easy to carry out, since the simple incubation of the support with the nucleic acid is sufficient for coupling, and that they largely retain the functionality of the bound molecules , since they do not need any further manipulation of the biomolecules.
  • APTS aminopropyltriethoxysilane
  • nucleic acids have a phosphate group at their 5 'end. This can be activated (eg by carbodiimides and succinimides) so that chemical coupling to amino groups can take place.
  • modified nucleic acids in particular nucleic acids which have an amino group or a biotin residue at one end.
  • nucleic acids oligonucleotides
  • Such nucleic acids are commercially available and can be incorporated into the nucleic acid to be investigated via polymerase reactions.
  • Amino-functionalized nucleic acids bind quickly to aldehyde-modified supports (formation of Schiff bases), which are also commercially available as glass supports.
  • they can be coupled to epoxy-functionalized carriers (modification, for example by means of suitable silanizing reagents) or else to carriers with carboxyl groups (after activation with carbodiimide and succinimd).
  • the use of biotinylated nucleic acid allows stable coupling to avidin or streptavidin modified carriers.
  • the coupling via reactions of the amino groups with aldehyde groups or via biotin (strept) avidin takes place so quickly that they are also suitable for the production of arrays with spotters.
  • nucleic acids or proteins, for example avidin or streptavidin
  • suitable functional groups for example amino, aldehyde, epoxy, carboxyl groups.
  • such carriers are commercially available, in others these modifications must be carried out by yourself, which is usually done by reaction of the carrier with suitable silanizing reagents. No further requirements are placed on the carrier, so that planar glass carriers can be silanized just like glass beads or metallic carriers.
  • carrier surfaces are often described in order to suppress non-specific interactions of later added molecules with the carrier.
  • Such further modifications include the saturation of carrier surfaces with inert proteins, such as bovine serum albumin, but also the coating with polymers, such as dextrans, or polyacrylamide gel, which can also serve as the basis for the immobilization and thus increase the loading capacity of the surface.
  • the immobilization principles described above can also be used for proteins, since proteins have sufficient functional groups, in particular for covalent couplings, due to the side groups of the amino acids. Since the charge of proteins is not as uniform as that of nucleic acids, immobilization due to electrostatic interactions is not as important, but pure adsorption reactions, which also include hydrophobic interactions, often lead to stable protein layers.
  • the marking the binding properties of the protein are not changed.
  • the coupling of the fluorescent dye in the region of the binding site of the protein could prevent the binding, or the coupling of highly hydrophobic dyes can lead to additional non-specific hydrophobic interactions with a carrier surface.
  • markers radioisotopes, fluorescent dyes
  • detection via subsequent reactions of the markers is also known.
  • Enzymes whose reaction products are detected principle of enzyme immunoassays) or labels for which binding partners exist (eg biotin with streptavidin peroxidase and enzymatic reaction; digoxigenin with enzyme-labeled antibody and subsequent enzymatic reaction; His.) are also used as markers 6 with appropriate antibody).
  • markers are suitable for the detection of bound nucleic acids as well as for the detection of bound proteins.
  • the most elegant detection methods are based on the direct, label-free detection of an affinity reaction. They not only allow the detection of the binding of an unmodified binding partner, but also the quantification of this binding and the monitoring of the binding reaction in real time and thus the determination of kinetic constants, ie the association and dissociation constants. These methods are essentially based on the fact that the binding reaction to a partner immobilized on a support changes the mass coverage of this support or / and the thickness of the layers on this support. The change in the layer thickness can be tracked using interferometric, ie optical methods (RIFs principle).
  • arrays have mainly been used for the detection of DNA-DNA interactions (expression analysis or sequencing with gene chips). Due to the need to elucidate the functions of the proteins encoded by the genes, the development of protein arrays is becoming more important. This is primarily about the detection of proteins by specific antibodies or similar binding proteins (protein A / G; receptors), or of enzyme activities. DNA-protein interactions with DNA fragments immobilized in array format have not yet been described. However, there are publications on the detection of DNA-protein interactions.
  • the present invention enables a function assignment of proteins or genes whose biological function is hitherto unknown or only partially known.
  • this invention enables a comprehensive, parallel in vitro identification of DNA-protein interactions and is independent of the expression of the regulatory protein to be examined in the actual host. This makes it possible, unaffected by environmental conditions, to clarify global regulatory networks in organisms in order to test them for their suitability for use in modulating metabolic pathways. Subsequent "genetic engineering” allows the optimization of, for example, fermentation processes for the production of enzymes, chemicals and pharmaceutically usable substances.
  • the regulatory networks discovered on the basis of this invention can be used to identify new "drug targets" for the treatment of diseases in humans, animals and plants.
  • the object on which the invention is based is thus achieved by a method for identifying interactions between proteins and DNA fragments of a genome, in which at least one protein is incubated with at least one DNA fragment of a genome in vitro and then the protein and / or DNA - Identified sequences that have interacted.
  • the DNA fragments can map the genome of a procaryte or eukaryote, in particular a bacterium, a yeast or a fungus.
  • a procaryte or eukaryote in particular a bacterium, a yeast or a fungus.
  • DNA fragments which are present as a DNA vector library in particular as a DNA plasmid library.
  • the DNA vector library with Escherichia coli clones can be provided.
  • the DNA fragments can be arranged as a DNA library or as a DNA vector library in microtiter plates.
  • the DNA fragments can be arranged multiple times in duplicate.
  • the vector DNA of the library can be double-stranded and immobilized on a solid matrix.
  • the vector DNA can be provided in an orderly or systematic manner.
  • a solid, optionally functionalized support which is a glass support, a membrane or a gel, can be provided as the solid matrix.
  • a functionalization of the support can be provided for the method according to the invention, which can couple the immobilized DNA fragments, in particular can bind covalently or electrostatically.
  • the optionally functionalized support can be provided on a planar support element, in a column or in or on a capillary.
  • a protein which is derived from the genome shown can also be used in the method according to the invention.
  • the derived protein may have been heterologously expressed in a prokaryotic, in particular a bacterial, or in a eukaryoiitic expression system.
  • a prokaryotic in particular a bacterial
  • a eukaryoiitic expression system in particular a prokaryotic, in particular a bacterial, or in a eukaryoiitic expression system.
  • the derived protein may have been expressed with an artificial epitope tag, in particular a histidine hexapeptide as an epitope tag.
  • the incubation can be carried out simultaneously on all immobilized DNA fragments batchwise or in the flow.
  • the incubation can also be carried out sequentially, in particular when immobilized in a column or in or on a capillary.
  • the interacting partners, DNA fragment and protein can be covalently linked to one another, in particular using an aldehyde, preferably formaldehyde or glutaraldehyde.
  • the interacting protein can be detected by looking at the protein
  • the DNA fragments can have a size of 1.5 to 2.5 kB, 1.0 to 2.0 kB, 0.5 to 1.5 kB, 0.3 to 0.8 kB or 0.03 to 0.5 kB ,
  • the method according to the invention can be carried out to identify DNA-protein interactions in complex DNA fragment mixtures, in particular to identify DNA binding sites for proteins of known or unknown function.
  • the method according to the invention for identifying cis-arranged regulatory elements for the transcription of eukaryotic or prokaryotic genes can be carried out.
  • the method according to the invention can be carried out for the function assignment of genes and / or proteins which are related to gene regulation, in particular for the identification of transcription factors or of genes which are regulated by transcription factors.
  • the method according to the invention for elucidating regulatory networks in complex biological systems can be carried out, in particular for optimizing the cultivation of prokaryotes or eukaryotes on the basis of regulatory networks.
  • the method according to the invention for optimizing fermentation processes can be carried out with the help of prokaryotes or eukaryotes on the basis of regulatory networks.
  • the method according to the invention for identifying targets for the development of active substances or of methods for the treatment of diseases can be carried out.
  • Another embodiment of the invention relates to a microtiter plate with a DNA library or DNA vector library arranged therein for carrying out the method according to the invention.
  • Another embodiment of the invention relates to a solid matrix according to the invention with DNA fragments immobilized on the matrix.
  • Another embodiment of the invention relates to a planar support element according to the invention with a solid matrix according to the invention applied thereon.
  • the plasmid DNA of the library is immobilized in an orderly manner as a double strand 'on a solid matrix.
  • a treated / coated glass surface, a membrane or a gel of different materials can be used as the matrix.
  • the treatment or coating of the glass surface can be carried out in order to permit the coupling of the DNA (covalent or electrostatic), to suppress unspecific bonds (see 5.), or to enable detection (coating with, for example, a gold layer for detection via surface plasmon resonance).
  • Other supports than glass supports can also be used if other detection methods than optical are selected.
  • only the “insert DNA” of the recombinant plasmids can be immobilized in a directional manner. B. done using the PCR.
  • the matrix can be on a planar support, but also in a column or on the wall of a capillary.
  • the protein to be examined is selected by computer-aided analysis of DNA and protein sequences that are already available, e.g. B. from fully or partially sequenced genomes.
  • a comparison of the derived amino acid sequences of ORFs with protein databases can provide first indications of DNA binding proteins.
  • the assignment of the derived proteins to so-called COGs (clusters of orthologous groups) or the presence of special structural motifs (eg “helix-turn-helix” motifs) can make it possible to predict a potential DNA-binding activity.
  • the gene / gene product selected under 3) is heterologously expressed in a bacterial or eukaryotic expression system with or without an artificial “epitope tag (eg histidine hexapeptide) and then purified in its native state.
  • an artificial “epitope tag eg histidine hexapeptide
  • the protein present in buffer solution is incubated with the double-stranded DNA immobilized on a matrix. Non-specific interactions of the protein with the matrix or the DNA are suppressed by suitable surface treatments or washing steps, or made visible by competition experiments.
  • the incubation can be carried out simultaneously on all immobilized DNA samples in batch or in flow, or sequentially (preferably when the DNA is immobilized in columns or capillaries and corresponding flow systems).
  • the interacting partners are covalently linked to one another using crosslinkers (for example formaldehyde or glutaraldehyde).
  • crosslinkers for example formaldehyde or glutaraldehyde.
  • the detection of the regulator protein is then carried out by means of immunological methods using (enzyme, fluorescence or radioactive) labeled antibodies which are directed against the regulator protein or the "epitope tag" present on the regulator protein. Detection methods are used which allow a label-free measurement (eg surface plasmon resonance; "resonant mirror”;interferometer; piezocrystals), the attachment of the protein can be followed directly without the need for antibodies.
  • the method described above identifies protein-DNA binding partners with the aid of a heterologously expressed protein and a DNA library.
  • the ordered plasmid library allows the clear assignment to genomic DNA regions of the organism to be examined.
  • the sequencing of the "inserts" of the plasmids filtered out makes it possible to identify the genes which are in the immediate vicinity of the protein binding region. In the case of fully sequenced genomes, DNA sequences which influence the regulation of genes and operons can be identified in this way.
  • the biochemical and biological characterization of the DNA-protein interactions can then be carried out using various "state-of-the-art" methods (for example, by sequence comparison, marker gene analysis in combination with deletion studies, DNAse protection analysis, reporter gene analysis, etc.).
  • LexA modulates the expression of many regulons of the SOS system.
  • TyrA controls 8 operons bifunctionally as a repressor and activator.
  • FnrR is involved in the regulation of more than 30 transcription units.
  • LrpR affects the transcription of 8 operons.
  • PhoPQ is involved in the regulation of at least 7 operons.
  • DNA chips a) Nature Genet. 21 (1999) Suppl. B) K. Niikura, K. Nagata, Y. Okahata, Quantitative detection of protein binding onto DNA by using a quartz-crystal microbalance, Chem. Lett. 1996, 863-4 c) D. Guschin, G. Yershov, A. Zaslavsky, A. Gemmell, V. Shick, D. Proudnikov, P. Arenkov, A. Mirzabekov, Manual Manufacturing of oligonucleotides, DNA, and protein microchips, Anal. Biochem. 250, 1997, 203-11

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung von Wechselwirkungen zwischen Proteinen und DNA-Fragmenten eines Genoms, bei dem man mindestens ein Protein mit mindestens einem DNA-Fragment eines Genoms in vitro inkubiert und danach die Protein- und/oder DNA-Sequenzen, identifiziert, die in Wechselwirkung getreten sind.

Description

Verfahren zur Identifizierung von Wechselwirkungen zwischen Proteinen und DNA-Fragmenten eines Genoms
Gegenstand der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neuartiges Verfahren zur parallelen zn-vitro-Identifizie- rung von DNA-Protein- echsel Wirkungen, d.h. für Proteine unbekannter Funktion können im Genom von Organismen potentielle DNA-Bindestellen gefunden werden. Dazu werden die zu untersuchenden Proteine mit DNA-Fragmenten, die das gesamte Genom abbilden, inkubiert und anschließend die Sequenzen identifiziert, an denen eine spezifische Bindung stattfindet. Die DNA-Fragmente werden bevorzugt in immobilisierter Form eingesetzt und die Bindung des zu untersuchenden Proteins detektiert. Stromaufwärtsgelegene Regulatorelemente vor Genen und Operonen, die durch DNA-bindende Proteine wie z. B. Transkriptionsfaktoren erkannt werden, können dadurch identifiziert werden. Die Aufklärung von Regulationsnetzwerken in komplexen biologischen Systemen wird vereinfacht und beschleunigt. Z. B. kann diese Erfindung genutzt werden, um in bakteriellen Systemen die Funktion und Vernetzung von Regulons und Modulons zu beschreiben.
Stand der Technik
a) Nachweis von DNA-bindenden Proteinen
Der Nachweis von DNA-Protein- Wechselwirkungen kann entweder in vivo, in vitro oder durch eine Kombination beider experimenteller Systeme erfolgen. Die Untersuchungen müssen sich dabei im Regelfall auf eines oder nur wenige miteinander wechselwirkende und schon zuvor identifizierte DNA-Protein-Bindungspartner beschränken. Durch die Verknüpfung eines sog. in vivo-Footprints mit in vitro-DNA-Microarray- Analysen können ausgehend von einem bekannten oder vermuteten DNA-Bindeprotein auch komplexe DNA-Gemische auf Wechselwirkungen hin überprüft werden. Eine pure zn-vztro-Technologie zur globalen Analyse von DNA-Protein- Wechselwirkungen innerhalb eines sequenzierten oder nicht-sequenzierten Genoms, wie sie Gegenstand dieser Erfindung ist, wurde bisher noch nicht beschrieben.
Bei in-vivo- Analysen wird die Auswirkung eines DNA-Bindeproteins in Zusammenhang mit einer möglichen DNA-Bindestelle auf die Transkriptionsrate eines in eis stromabwärtsliegenden Gens ermittelt. Die gebildete mRNA wird detektiert und evtl. quantifiziert, indem z. B. die mRNA während der in vivo -Transkription radioaktiv markiert oder aber nachträglich die mRNA mit radioaktiv- oder fluoureszenzmarkierten Sonden hybridisiert wird. Bei Verwendung von gekoppelten Systemen in sog. Reportergenanalysen lässt sich indirekt die Transkriptionsrate mit der Menge des von dieser mRNA translatierten Proteins bzw. mit der daraus ableitbaren Enzymaktivität korrelieren.
Bei zn-vz'tro-Nach weis verfahren für Protein-DNA- Wechsel Wirkungen wird der DNA-Partner in der Regel radioaktiv markiert. Protein und DNA werden unter verschiedenen Bedingungen in Lösung inkubiert und dann als Paar entweder von einer Nitrocellulosemembran zurückgehalten (Filterbindung) oder mit einem Antikörper immunpräzipitiert (McCay-Assay). Eine weitere gän- gige Methode ist der Gelretardationsstest (Gel retardation assay), in dem das elektrophoretische Laufverhalten von proteingebundener DNA mit dem von nicht gebundener DNA verglichen wird. Mit Hilfe unterschiedlicher Inkubationsbedingungen wie Salzkonzentration, pH- Wert, Kompetitor-DNA etc. sind Rückschlüsse auf Spezifität und Bindungskonstanten zwischen Protein und DNA-Fragment möglich.
Die Chromatin-Immunpräzipitation mit anschließender DNA-Microarray-Hybridisierung (Iyer, V.R., Horak, C.E., Scafe C.S., Botstein, D., Snyder, M., Brown, P.O., (2001) Geno ic binding sites of the yeast cell-cycle transcription factors SBF and MBF. Nature 409, 533-538) basiert auf der durch Formaldehyd oder Glutaraldehyd katalysierten kovalenten Verknüpfung von DNA mit zellulären Proteinen in einem intakten Zellsystem. DNA-Bindeproteine werden aufgrund der räumlichen Nähe bevorzugt an die DNA gebunden. Die DNA aus den auf diese Weise behandelten Zellen wird extrahiert, fragmentiert (z. B. durch Scheren) und anschliessend mit Hilfe eines gegen das zu untersuchende DNA-Bindeprotein gerichteten Antikörpers immunpräzipitiert. Nach Abtrennung des DNA-Bindeproteins kann die DNA amplifiziert, markiert und gegen auf Microarrays gespottete DNA hybridisiert werden. Im Vergleich zu einer Kontrolle, z. B. eine das zu untersuchende Protein betreffende Deletionsmutante, können so spezifisch gebundene DNA- Fragmente parallel identifiziert werden. Die Nachweisgrenze dieser Methode steht in direkter Abhängigkeit von dem Vorhandensein bzw. von der vorhandenen Menge des zu untersuchenden Regulatorproteins, dessen intrazelluläre Konzentration in der Regel sehr gering ist.
b) Methoden der Immobilisierung von DNA oder Proteinen
Zur Kopplung von DNA-Fragmenten (oder Oligonukleotiden, PCR-Produkten) stehen unterschiedliche Methoden zur Verfügung, die verschiedene Eigenschaften von Nukleinsäuren ausnutzen:
• Nukleinsäuren sind Polymere und binden deshalb rein adsorptiv an geeignete Trägermate- rialien, wie z.B. Membranen.
• Nukleinsäuren sind aufgrund der Phosphatreste der Nukleotide immer negativ geladen. Dementsprechend lassen sie sich über rein elektrostatische Kräfte an positive Trägerober- flächen binden. Dies wird bei der Verwendung von Trägem ausgenutzt, die mit Amino- gruppen funktionalisiert sind (z.B. Polylysin-beschichtete Träger, oder Träger,, die mit Aminopropyltriethoxysilan (APTS) modifiziert sind), oder von Membranen mit positiv geladenen Seitengruppen. Beide Methoden (reine Adsorption, bzw. durch elektrostatische Kräfte unterstützte Adsorption) zeichnen sich dadurch aus, dass sie einfach durchzuführen sind, da die einfache Inkubation des Trägers mit der Nukleinsäure für eine Kopplung ausreichend ist, und dass sie die Funktionalität der gebundenen Moleküle weitestgehend erhalten, da sie keine weiteren Manipulationen an den Biomolekülen benötigen. Diese Methoden sind deshalb für die Kombination mit Spottern etc. und damit für die Herstellung von Arrays geeignet. • Die Haftung der Nukleinsäuren an den Träger wird verbessert, wenn es sich um kovalente Bindungen zwischen Träger und Biomolekül handelt. Nukleinsäuren besitzen an ihrem 5'- Ende eine Phosphatgruppe. Diese kann aktiviert werden (z.B. durch Carbodiimide und Succinimide), so dass eine chemische Kopplung an Aminogruppen stattfinden kann. Eine • Alternative zu diesem bislang noch wenig erprobten Verfahren stellt die Verwendung von modifizierten Nukleinsäuren dar, insbesondere von Nukleinsäuren, die an einem Ende eine Aminogruppe oder aber einen Biotinrest besitzen. Derartige Nukleinsäuren (Oligonukleo- tide) sind kommerziell verfügbar und können über Polymerasereaktionen in die zu untersuchende Nukleinsäure eingebaut werden. Aminofunktionalisierte Nukleinsäuren binden rasch an Aldehyd-modifizierte Träger (Ausbildung Schiff 'scher Basen), die als Glasträger ebenfalls .kommerziell verfügbar sind. Alternativ können sie an Epoxidfunktionalisierte Träger (Modifizierung z.B. durch geeignete Silanisierungsreagenzien) oder aber an Träger mit Carboxylgruppen (nach Aktivieren mit Carbodiimid und Succinimd) gekoppelt werden. Die Verwendung biotinylierter Nukleinsäure erlaubt die stabile Kopplung an Avidin- bzw. Streptavidin-modifizierte Träger. Insbesondere die Kopplungen über Reaktionen der Aminogruppen mit Aldehydgruppen bzw. über Biotin-(Strept)avidin erfolgen so schnell, dass sie auch für die Herstellung von Arrays mit Spottern geeignet sind.
Die Kopplung von Nukleinsäuren (oder Proteinen z.B. Avidin bzw. Streptavidin) erfordert häufig eine Modifizierung der Trägeroberfläche mit geeigneten funktionellen Gruppen (z.B. Amino- , Aldehyd-, Epoxid-, Carboxylgruppen). In einzelnen Fällen sind solche Träger kommerziell ver- fügbar, in anderen müssen diese Modifizierungen selber durchgeführt werden, was in der Regel durch Reaktion des Trägers mit geeigneten Silanisierungsreagenzien erfolgt. An den Träger werden dabei weiter keine besonderen Anforderungen gestellt, so dass planare Glasträger genauso silanisiert werden können wie Glasbeads, oder metallische Träger.
Eine weitere Modifizierung von Trägeroberflächen wird häufig beschrieben, um unspezifische Wechselwirkungen später zugegebener Moleküle mit dem Träger zu unterdrücken. Zu solchen weiteren Modifizierungen gehören das Absättigen von Trägeroberflächen mit inerten Proteinen, wie Rinderserumalbumin, aber auch die Beschichtung mit Polymeren, wie Dextranen, oder Po- lyacrylamid-Gel, die auch als Basis für die Immobilisierung dienen können und so die Beladekapazität der Oberfläche erhöhen. Die oben beschriebenen Immobilisierungsprinzipien können auch für Proteine eingesetzt werden, da Proteine durch die Seitengruppen der Aminosäuren ausreichend funktioneile Gruppen insbesondere für kovalente Kopplungen besitzen. Da die Ladung von Proteinen nicht so einheitlich ist wie von Nukleinsäuren, hat die Immobilisierung aufgrund elektrostatischer Wechselwirkungen eine nicht so hohe Bedeutung, aber reine Adsorptionsreaktionen, die auch hydrophobe Wechselwirkungen umfassen, führen oft zu stabilen Proteinschichten.
c) Nachweis von Affinitätsreaktionen
Die klassische Detektion von gebundenen Proteinen oder Nukleinsäuren erfolgt über eingefügte radioaktive Isotope, wie z.B. 32P. Diese Methode ist für einige Anwendungen nach wie vor die sensitivste Methode und damit die Methode der Wahl (z.B. bei Untersuchungen zur Expression von Genen aus einer geringen mRNA-Menge). Als Alternative hat sich vor allem im Bereich der DNA- Analytik die Fluoreszenzdetektion etabliert. Hier werden in Polymerasereaktionen Nu- kleotide verwendet, die mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind, so dass die Reaktionsprodukte ebenfalls eine Fluoreszenzmarkierung tragen. Ihre Bindung an einen Träger z.B. nach einer Hy- bridisierungsreaktion kann dann mit Hilfe von Fluoreszenzscannern nachgewiesen werden. Auch Proteine lassen sich problemlos mit Fluoreszenzfarbstoffen markieren, wie es vor allem für die Fluoreszenzmarkierung von Antikörpern bekannt ist. Zu beachten ist, dass durch die Markierung die Bindungseigenschaften des Proteins nicht verändert werden. So könnte die Kopplung des Fluoreszenzfarbstoffes im Bereich der Bindungsstelle des Proteins die Bindung verhindern, oder die Kopplung stark hydrophober Farbstoffe kann zu zusätzlichen unspezifischen hydrophoben Wechselwirkungen mit einer Trägeroberfläche führen.
Neben diesen Detektionen über direkt detektierbare Marker (Radioisotope, Fluoreszenzfarbstoffe) ist auch die Detektion über Folgereaktionen der Marker bekannt. So werden als Marker auch Enzyme verwendet, deren Reaktionsprodukte nachgewiesen werden (Prinzip der En- zymimmunoassays), oder Label, für die Bindepartner existieren (z.B. Biotin mit Streptavidin- Peroxidase und enzymat. Reaktion; Digoxigenin mit enzymmarkiertem Antikörper und enzyma- tischer Folgereaktion; His6 mit entsprechendem Antikörper). Derartige Marker sind sowohl für den Nachweis von gebundenen Nukleinsäuren als auch für den Nachweis von gebundenen Proteinen geeignet.
Die elegantesten Nachweismethoden beruhen jedoch auf dem direkten, markierungsfreien Nachweis einer Affinitätsreaktion. Sie erlauben nicht nur den Nachweis der Bindung eines un- modifizierten Bindungspartners, sondern auch die Quantifizierung dieser Bindung und die Verfolgung der Bindungsreaktion in Echtzeit und damit die Bestimmung kinetischer Konstanten, d.h. der Assoziations- und Dissoziationskonstanten. Diese Methoden beruhen im wesentlichen darauf, dass sich durch die Bindungsreaktion zu einem an einem Träger immobilisierten Partner die Massenbelegung dieses Trägers, oder / und die Dicke der Schichten auf diesem Träger ändert. Die Änderung der Schichtdicke lässt sich mit interferometrischen, also optischen Methoden verfolgen (Rifs-Prinzip), zur Detektion der Veränderungen der Massenbelegung werden sowohl optische (Oberflächenplasmonenresonanz (SPR), Interferometer, „Resonant Mirror", Gitter- koppler) als auch piezoelektrische Methoden eingesetzt. Die Messfühler (Transducer), auf denen der eine Reaktionspartner der Affinitätsreaktion immobilisiert wird, ist dementsprechend häufig ein Glasträger (Interferometer, „resonant mirror", Gitterkoppler), der unter Umständen mit Gold oder Silber beschichtet ist (Oberflächenplasmonenresonanz), oder aber eine Goldelektrode (piezoelektrische Messungen). Während Radioisotope und Fluoreszenzfarbstoffe nach Trocknen des Trägers nachgewiesen werden können, erfordern Enzymmarkierungen noch die Inkubation mit den Enzymsubstratlösungen, wobei sich dann (mit geeigneten Substraten) unlösliche Niederschläge am Ort der Enzymreaktion bilden können. Die markierungsfreie Detektion biochemischer Reaktionen erfolgt bislang überwiegend in Gegenwart einer flüssigen Phase, wobei Oberflächenplasmonenresonanz-, Interferometer- und piezoelektrische Messungen auch in der Gasphase durchgeführt werden können.
Für die Auswertung von Arrays wird eine ortsaufgelöste Detektion benötigt. Diese ist bislang für radioaktive und fluorimetrische Messungen gut etabliert. Auch der Nachweis von unlöslichen Produkten von Enzymreaktionen gelingt mit geeigneten densitometrischen Scannern (analog zur Auswertung von Western Blots). Die Parallelauswertung bei markierungsfreien Verfahren ist bislang eingeschränkt. So gibt es kommerzielle SPR-Geräte nur mit bis zu 4 Kanälen für die parallele Untersuchung von bis zu 4 Affinitätsreaktionen. Allerdings sind auch hier Systeme zur parallelen Auswertung von mehr Reaktionen in der Entwicklung.
Bislang werden Arrays vor allem zur Detektion von DNA-DNA-Wechselwirkungen eingesetzt (Expressionanalytik oder Sequenzieren mit Genchips). Durch den Bedarf nach der Aufklärung der Funktionen der von den Genen kodierten Proteine rückt die Entwicklung von Protein- Arrays stärker in den Blickpunkt. Dabei geht es vor allem um den'Nachweis von Proteinen durch spezifische Antikörper oder ähnliche Bindeproteine (Protein A / G; Rezeptoren), oder aber von Enzymaktivitäten. DNA-Protein-Wechselwirkungen mit im Arrayformat immobilisierten DNA- Fragmenten sind bislang nicht beschrieben. Allerdings gibt es Publikationen zum Nachweis von DNA-Protein- Wechselwirkungen. Dabei werden jedoch entweder immobilisierte Proteine verwendet (UPA: radioaktive Detektion; viele Proteine werden simultan auf Bindung von einer DNA-Sequenz untersucht; keine Modulation der Proteinbindungsaktivität durch Additive; s.2.b), oder es wird die Bindung nur eines einzelnen DNA-Protein-Paares beobachtet (piezoelektrische Detektion; immobilisiertes doppelsträngiges 29mer; s. lb). Beschreibung der Erfindung
Die rasch zunehmende Verfügbarkeit von vollständig sequenzierten Genomen zeigt, dass häufig mehr als 50 % aller annotierten Gene keine Funktion oder nur eine vermutete Funktion zugeschrieben werden kann. Bei einem Teil dieser Gene bzw. Genprodukte handelt es sich um Transkriptionsfaktoren, die als solche aufgrund von Protein vergleichen annotiert wurden. Der Anteil' dieser nur vermuteten Regulatorproteine steigt mit zunehmender Komplexität der Organismen.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht eine Funktionszuweisung von Proteinen, bzw. Genen, deren biologische Funktion bisher nicht oder nur teilweise bekannt ist. Diese Erfindung erlaubt erstmals eine umfassende, parallel erfolgende in vitro Identifizierung von DNA-Protein-Wechselwirkungen und ist unabhängig von der Expression des zu untersuchenden Regulatorproteins im eigentlichen Wirt. Dadurch ist es möglich, unbeeinflusst von Umweltbedingungen, globale Regulationsnetzwerke bei Organismen aufzuklären, um diese auf Eignung für die Verwendung zur Modulation von Stoffwechselwegen zu prüfen. Ein sich anschließendes „genetic engineering" erlaubt die Optimierung von z. B. Fermentationsprozessen für die Gewinnung von Enzymen, Chemikalien und pharmazeutisch nutzbaren Substanzen. Zudem können die auf Basis dieser Erfindung entdeckten regulatorischen Netzwerke zur Identifizierung von neuen „Wirkstoff-Targets" für die Behandlung von Krankheiten bei Mensch, Tier und Pflanze führen.
So wird die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe durch ein Verfahren zur Identifizierung von Wechselwirkungen zwischen Proteinen und DNA-Fragmenten eines Genoms gelöst, bei dem man mindestens ein Protein mit mindestens einem DNA-Fragment eines Genoms in vitro inkubiert und danach die Protein- und/oder DNA-Sequenzen identifiziert, die in Wechselwirkung getreten sind.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann man mit DNA-Fragmenten inkubieren, die das gesamte Genom eines Organismus abbilden.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren können die DNA -Fragmente das Genom eines Proka- ryonten oder Eukaryonten abbilden, insbesondere eines Bakteriums, einer Hefe oder eines Pilzes. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann man von DNA-Fragmenten ausgehen, die als "Shot-gun"-DNA-Bibliothek vorliegen.
Ferner kann man bei dem erfindungsgemäßen Verfahren von DNA-Fragmenten ausgehen, die als DNA- Vektor-Bibliothek vorliegen, insbesondere als DNA-Plasmid-Bibliothek.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann die DNA- Vektor-Bibliothek mit Escherichia-coli- Klonen vorgesehen sein.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren können die DNA-Fragmente als DNA-Bibiothek oder als DNA- Vektor-Bibliothek in Mikrotiterplatten angeordnet sein.
Dabei können die DNA-Fragmente mehrfach dupliziert angeordnet sein.
Ferner kann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die Vektor-DNA der Bibliothek doppel- strängig und immobilisiert auf einer festen Matrix vorgesehen sein.
Dabei kann die Vektor-DNA in geordneter bzw. systematisierter Weise vorgesehen sein.
Als feste Matrix kann man bei dem erfindungsgemäßen Verfahren einen gegebenenfalls funktio- nalisierten Träger vorsehen, bei dem es sich um einen Glasträger, eine Membran oder ein Gel handelt.
Dabei kann für das erfindungsgemäße Verfahren eine Funktionalisierang des Trägers vorgesehen sein, die die immobilisierten DNA-Fragmente koppeln kann, insbesondere kovalent oder elektrostatisch binden kann.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann der gegebenenfalls funktionalisierte Träger auf einem planaren Stützelement, in einer Säule oder in oder auf einer Kapillare vorgesehen sein. Femer kann man bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ein Protein einsetzen, das von dem abgebildeten Genom abgeleitet ist.
Dabei kann für das erfindungsgemäße Verfahren das abgeleitete Protein heterolog in einem pro- karyontischen, insbesondere einem bakteriellen, oder in einem eukaryoiitischen Expressions- System exprimiert worden sein. . ' ': . :'. ::v
So kann erfindungsgemäß das abgeleitete Protein mit einem artifiziellen Epitop-tag exprimiert worden sein, insbesondere einem Histidin-Hexapeptid als Epitop-tag.
Bei dem erfmdungsgemäßen Verfahren kann man die Inkubation simultan an allen immobilisierten DNA-Fragmenten batchweise oder im Durchfluß durchführen.
Femer kann man bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die Inkubation sequentiell durchführen, insbesondere bei Immobilisierung in einer Säule oder in oder auf einer Kapillare.
Femer kann man bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die wechselwirkenden Partner, DNA- Fragment und Protein, kovalent miteinander verknüpfen, insbesondere mit einem Aldehyd, vorzugsweise Formaldehyd oder Glutaraldehyd.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann man das wechselwirkende Protein nachweisen, indem man das Protein
- mit Hilfe mindestens eines Antikörpers detektiert, der gegen das Protein oder das Epitop-tag des Proteins gerichtet ist,
- durch Oberflächenplasmonen-Resonanz detektiert, insbesondere bei Goldbeschichtung des Trägers,
- mit Hilfe der Resonant-Mirror-Methode detektiert,
- mit Hilfe eines Interferometers detektiert,
- mit Hilfe von Piezokristallen detektiert oder
- . mit Hilfe eines Markers detektiert, insbesondere eines Fluorophors oder eines radiaktiven Markers. Erfindungsgemäß können die DNA-Fragmente eine Größe von 1,5 bis 2,5 kB, 1,0 bis 2,0 kB, 0,5 bis 1,5 kB, 0,3 bis 0,8 kB oder 0.03 bis 0.5 kB besitzen.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann zur Identifizierang von DNA-Protein-Wechselwirkungen in komplexen DNA-Fragment-Gemischen durchgeführt werden, insbesondere zur Identifizierung von DNA-Bindestellen für Proteine bekannter oder unbekannter Funktion.
Femer kann das erfindungs gemäße Verfahren zur Identifizierung von cis-angeordneten Regulatorelementen für die Transkription von eukaryontischen oder prokaryontischen Genen durchgeführt werden.
Ferner kann das erfindungsgemäße Verfahren für die Funktionszuweisung von Genen und/oder Proteinen durchgeführt werden, die einen Bezug zur Genregulation aufweisen, insbesondere zur Identifizierung von Transkriptionsfaktoren oder von Genen, die von Transkriptionsfaktoren reguliert werden.
Femer kann das erfindungsgemäße Verfahren zur Aufklärung von Regulationsnetzwerken in komplexen biologischen Systemen durchgeführt werden, insbesondere zur Optimierung der Kultivierung von Prokaryonten oder Eukaryonten auf der Basis von Regulationsnetzwerken.
So kann man das erfindungsgemäße Verfahren zur Optimierng von Fermentationsprozessen mit Hilfe von Prokaryonten oder Eukaryonten auf der Basis von Regulationsnetzwerken durchführen.
Femer kann man das erfindungsgemäße Verfahren zurldentifizierung von Targets für die Entwicklung von Wirkstoffen oder von Methoden zur Behandlung von Krankheiten durchführen.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft eine Mikrotiterplatte mit darin angeordneter DNA-Bibliothek oder DNA- Vektor-Bibliothek zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft eine feste Matrix gemäß der Erfindung mit auf der Matrix immobilisierten DNA-Fragmenten.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein planares Stützelement gemäß der Erfindung mit einer darauf aufgebrachten festen erfindungsgemäßen Matrix.
Nachstehend wird die Erfindung durch Beispiele näher erläutert.
Beispiel 1:
1) Anlegen einer „Shot-gun"-DNA-Plasmid-Bibliothek mit einer durchschnittlichen „In'sert"- Grösse von entweder 2 kb, 1,5 kb, 1 kb oder 0,5 kb des zu untersuchenden Bakteriums. Die DNA-Bibliothek deckt das Genom des zu untersuchenden Bakteriums mehrfach ab. Die die Plasmid-Bibliothek enthaltenden E. coli Klone werden in Mikrotiterplaten angeordnet, mehrfach dupliziert und dauerkonserviert.
2) Die Plasmid-DNA der Bibliothek wird in geordneter Weise als Doppelstrang' auf einer festen Matrix immobilisiert. Als Matrix kann eine behandelte / beschichtete Glasoberfläche, eine Membran oder ein Gel unterschiedlichen Materials eingesetzt werden. Die Behandlung bzw. Beschichtung der Glasoberfläche kann durchgeführt werden, um die Kopplung der DNA zuzulassen (kovalent oder elektrostatisch), unspezifische Bindungen zu unterdrücken (s. 5.), oder die Detektion zu ermöglichen (Beschichtung mit z.B. einer Goldschicht für Detektionen über Oberflächenplasmonenresonanz). Auch andere Träger als Glasträger sind einsetzbar, wenn andere Detektionsmethoden als optische ausgewählt werden. Alternativ kann auch nur die „Insert- DNA" der rekombinanten Plasmide gerichtet immobilisiert werden. Die Amplifikation der „Insert-DNA" kann z. B. unter Verwendung der PCR erfolgen. Die Matrix kann sich auf einem planaren Träger, aber auch in einer Säule oder auf der Wandung einer Kapillare befinden. 3) Die Auswahl des zu untersuchenden Proteins erfolgt durch computergestützte Analyse von DNA- und Protein-Sequenzen, die bereits vorliegen, z. B. aus vollständig oder teilweise sequenzierten Genomen. Ein Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenzen von ORFs mit Proteindatenbanken kann erste Hinweise auf DNA-Bindeproteine liefern. Ebenfalls kann die Zuordnung der abgeleiteten Proteine zu sogenannten COGs (Clusters of orthologous groups) oder das Vorhandenseins spezieller Strukturmotive (z. B. „Helix-Turn-Helix "-Motive) Vorhersagen auf eine potentielle DNA-Bindeaktivität ermöglichen.
4) Das unter 3) ausgewählte Gen/Genprodukt wird heterolog in einem bakteriellen oder euka- ryontischen Expressionssystem mit oder ohne artifiziellem „Epitop-tag (z. B. Histidin-Hexapep- tid) exprimiert und anschliessend in nativem Zustand gereinigt.
5) Das in Pufferlösung vorliegende Protein wird mit der an einer Matrix immobilisierten, dop- pelsträngig vorliegenden DNA inkubiert. Unspezifische Wechselwirkungen des Proteins mit der Matrix oder der DNA werden durch geeignete Oberflächenbehandlungen bzw. Waschschritte unterdrückt, bzw. durch Kompetitionsexperimente sichtbar gemacht. Die Inkubation kann simultan an allen immobilisierten DNA-Proben im Batch oder im Durchfluss durchgeführt werden, oder aber sequentiell (bevorzugt bei Immobilisierung der DNA in Säulchen oder Kapillaren und entsprechenden Durchflußsystemen).
6) In dem unter 5 beschriebenen System werden nach Inkubation des Proteins mit den immobilisierten DNA-Proben sowie nach den entsprechenden Waschvorgängen die wechselwirkenden Partner gegebenenfalls mit Hilfe von Crosslinkern (z. B. Formaldehyd oder Glutaraldehyd) ko- valent miteinander verknüpft. Der Nachweis des Regulatorproteins erfolgt anschließend mittels immunologischer Methoden unter Verwendung von (enzym-, fluoreszenz oder radioaktiv) markierten Antikörpern, die gegen das Regulatorprotein oder das am Regulatorprotein vorhandene „Epitop-tag" gerichtet sind. Werden Detektionsmethoden eingesetzt, die ein markierungsfreies Messen erlauben (z. B. Oberflächenplasmonenresonanz; „Resonant mirror"; Interferometer; Piezokristalle), kann die Anlagerung des Proteins direkt verfolgt werden, ohne dass Antikörper notwendig sind. Dies gelingt auch, wenn es möglich ist, das zu untersuchende Protein so zu markieren (z.B. mit einem Fluorophor oder aber radioaktiv), dass die Bindung zur DNA nicht beein- trächtigt wird. Wichtig ist, dass die Detektion so erfolgt, dass eine Zuordnung des Signals zu einem bestimmten DNA-Fragment möglich ist.
7) Durch die oben beschriebene Methode werden Protein-DNA-Bindungspartner mit Hilfe eines heterolog exprimierten Proteins und einer DNA-Bibliothek identifiziert. Die geordnete Plasmid- Bibliothek erlaubt die eindeutige Zuordnung zu genomischen DNA-Regionen des zu untersuchenden Organismus'. Die Sequenzierung der „Inserts" der heraus gefilterten Plasmide ermöglicht die Identifizierang der Gene, die in unmittelbarer Nachbarschaft zu der Protein-Binderegion liegen. Bei vollständig sequenzierten Genomen können auf diese Weise DNA-Sequenzen mit Einfluss auf die Regulation von Genen und Operonen identifiziert werden. Die biochemische und biologische Charakterisierung der DNA-Protein-Wechselwirkungen kann anschliessend mit verschiedenen „state-of-the-art"-Methoden erfolgen (z.B. durch Sequenzvergleich, Marker- genanalyse in Kombination mit Deletionsstudien, DNAse Protektionsanalyse, Reportergenanalysen etc.).
Beispiele 2 bis 3:
• Untersuchungen zur Regulation der morphologischen und physiologischen Differenzierung bei sekundärstoffproduzierenden Bakterien wie z. B. Myxobakterien.
• Identifizierang von stoffwechselweg-spezifischen und pleiotropen Regulatoren und den durch diese in der Transkription beeinflussten Genen und Operone, bzw. Regulons und Modulons
Beispiele 4 bis 8:
Beispiele in Analogie zum Stand der Technik für die Regulation von Modulons durch einzelne DNA-bindende Proteine in E. coli sind u. a.:
• LexA moduliert die Expression vieler Regulons des SOS-Systems.
• TyrA steuert bifunktional als Repressor und Aktivator 8 Operone.
• FnrR ist an der Regulation von mehr als 30 Transkriptionseinheiten beteiligt. LrpR beeinflusst die Transkription von 8 Operonen.
PhoPQ ist an der Regulation von mindestens 7 Operonen beteiligt.
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Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Identifizierung von Wechselwirkungen zwischen Proteinen und DNA-Fragmenten eines Genoms, bei dem man mindestens ein Protein mit mindestens einem DNA-Fragment eines Genoms in vitro inkubiert und danach die Protein- und/oder DNA-Sequenzen identifiziert, die in Wechselwirkung getreten sind.
2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem man mit DNA-Fragmenten inkubiert, die das gesamte Genom eines Organismus abbilden.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und/oder 2, bei dem die DNA-Fragmente das Genom eines Prokaryonten oder Eukaryonten abbilden, insbesondere eines Bakteriums, einer Hefe oder eines Pilzes.
4. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem man von DNA-Fragmenten ausgeht, die als "Shot-gun" -DNA- Bibliothek vorliegen.
5. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem man von DNA-Fragmenten ausgeht, die als DNA- ektor- Bibliothek vorliegen, insbesondere als DNA-Plasmid-Bibliothek.
6. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die DNA-Vektor-Bibliothek mit Escherichia-coli- lonen vorgesehen ist.
7. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die DNA-Fragmente als DNA-Bibiothek oder als DNA-Vektor- Bibliothek in Mikrotiterplatten angeordnet sind.
8. Verfahren nach Anspruch 7, bei dem die DNA-Fragmente mehrfach dupliziert angeordnet sind.
9. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem man die Vektor-DNA der Bibliothek doppelsträngig und immobilisiert auf einer festen Matrix vorsieht.
10. Verfahren nach Anspruch 9, bei dem man die Vektor-DNA in geordneter bzw. systematisierter Weise vorsieht.
11. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 8 und 9, bei dem man als feste Matrix einen gegebenenfalls funktionalisierten Träger vorsieht, bei dem es sich um einen Glasträger, eine Membran oder ein Gel handelt.
12. Verfahren nach Anspruch 11, bei dem eine Funktionalisierung des Trägers vorgesehen ist, die die immobilisierten DNA-Fragmente koppeln kann, insbesondere kovalent oder elektrostatisch -binden kann.
13. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem der gegebenenfalls funktionalisierte Träger auf einem plan- aren Stützelement, in einer Säule oder in oder auf einer Kapillare vorgesehen ist.
14. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem man ein Protein einsetzt, das von dem abgebildeten Genom abgeleitet ist.
15. Verfahren nach Anspruch 14, bei dem das abgeleitete Protein heterolog in einem prokaryontisehen, insbesondere einem bakteriellen, oder in einem eukaryontisehen Expressionssystem exprimiert worden ist.
16. Verfahren nach Anspruch 15, bei dem das abgeleitete Protein mit einem artifiziellen Epitop-tag exprimiert worden ist, insbesondere einem Histidin-Hexapeptid als Epitop-tag.
17. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem man die Inkubation simultan an allen immobilisierten DNA- Fragmenten batchweise oder im Durchfluß durchführt.
18. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 14, bei dem man die Inkubation sequentiell durchführt, insbesondere bei Immobilisierung in einer Säule oder in oder auf einer Kapillare.
19. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem man die wechselwirkenden Partner, DNA-Fragment und Protein, kovalent miteinander verknüpft, insbesondere mit einem Aldehyd, vorzugsweise Formaldehyd oder Glutaraldehyd.
20. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem man das wechselwirkende Proten nachweist, indem man das Protein
- mit Hilfe mindestens eines Antikörpers detektiert, der gegen das .Protein oder das Epitop-tag des Proteins gerichtet ist,
- durch Oberflächenplasmonen-Resonanz detektiert, insbesondere bei .Goldbeschichtung des Trägers,
- mit Hilfe der Resonant-Mirror-Methode detektiert, mit Hilfe eines Interferometers detektiert,
- mit Hilfe von Piezokristallen detektiert oder
- mit Hilfe eines Markers detektiert, insbesondere eines Fluoro- phors oder eines radiaktiven Markers .
21. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die DNA-Fragmente eine Größe von 1,5 bis 2,5 kB, 1,0 bis 2,0 kB, 0,5 bis 1,5 kB, 0,3 bis 0,8 kB oder 0.03 bis 0.5 kB besitzen.
22. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, indem man das Verfahren zur Identifizierung von DNA-Protein-Wechselwirkungen in komplexen DNA-Fragment-Gemischen durchführt, insbesondere zur Identifizierung von DNA-Bindestellen für Proteine bekannter oder unbekannter Funktion.
23. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, indem man das Verfahren zur Identifizierung von cis-angeordneten Regulatorelementen für die Transkription von eukaryontisehen oder prokaryontisehen Genen durchführt.
24. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, indem man das Verfahren für die Funktionszuweisung von Genen und/oder Proteinen durchführt, die einen Bezug zur Genregulation aufweisen, insbesondere zur Identifizierung von Transkriptionsfaktoren oder von Genen, die von Transkriptionsfaktoren reguliert werden.
25. Vefahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, indem man das Verfahren zur Aufklärung von Regulationsnetzwerken in komplexen biologischen Systemen durchführt, insbesondere zur Opti- mierung der Kultivierung von Prokaryonten oder Eukaryonten auf der Basis von Regulationsnetzwerken.
26. Verfahren nach Anspruch 25, indem man das Verfahren zur Optimierng von Fermentationsprozessen mit Hilfe von Prokaryonten oder Eukaryonten auf der Basis von Regulationsnetzwerken durchführt.
27. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 25, indem man das Verfahren zur Identifizierung, von Targets für die Entwicklung von Wirkstoffen oder von Methoden zur Behandlung von Krankheiten durchführt .
28. Mikrotiterplatte mit darin angeordneter DNA-Bibliothek oder DNA-Vektor-Bibliothek zur Durchführung eines Verfahrens gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche .
29. Feste Matrix insbesondere gemäß Anspruch 9 mit auf der Matrix immobilisierten DNA-Fragmenten.
30. Planares Stützelement insbesondere gemäß Anspruch 13 mit einer darauf aufgebrachten festen Matrix gemäß Anspruch 29.
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