DE60111927T2

DE60111927T2 - Methode und kit zum auffinden, zum nachweis und/oder zur quantifizierung von transkriptionsfaktoren

Info

Publication number: DE60111927T2
Application number: DE60111927T
Authority: DE
Inventors: Jose Remacle; Patricia Renard; Muriel Art
Original assignee: Eppendorf Array Technologies SA
Current assignee: Eppendorf Array Technologies SA
Priority date: 2000-03-24
Filing date: 2001-03-26
Publication date: 2006-05-24
Anticipated expiration: 2021-03-27
Also published as: EP1266039A1; JP2003528624A; US20020110814A1; DE60111927D1; US7396643B2; EP1266039B1; US20040185497A1; US20090082223A1; US7892818B2; WO2001073115A1; AU2001248159A1; EP1136567A1; ATE299533T1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und Kit, umfassend Mittel und Medien für das Durchmustern, den Nachweis und/oder die Quantifizierung von Transkriptionsfaktoren oder Verbindungen, die an die Faktoren binden, durch nicht-radioaktive Nachweismittel.
Hintergrund der Erfindung
Transkriptionsfaktoren sind Proteine, die an spezifische DNA-Sequenzen, genannt Konsensussequenzen, binden und die Transkription der DNA in mRNA beeinflussen. Einige dieser Faktoren nehmen direkt durch Aktivieren oder Inhibieren der Transkription am Transkriptionsprozess teil und regeln die Synthese von Proteinen, die von Zellen benötigt werden, um zu funktionieren, sich anzupassen, zu antworten oder zu differenzieren. Einige dieser Proteine müssen in einer konstitutiven Weise transkribiert werden (wesentliche Rolle in Zellfunktionen) während andere nur als Antwort auf bestimmte Reize oder, wenn die Zelle beispielsweise in einer pathologischen Umgebung ist, synthetisiert werden. Externe Signale werden durch Rezeptoren wahrgenommen und durch die Plasmamembran umgewandelt, gefolgt von Kaskaden von enzymatischen Kinasereaktionen, die eine Phosphorylierung oder Dephosphorylierung der Transkriptionsfaktoren ergibt, was positiv oder negativ ihre Bindung an ihre Konsensussequenz beeinflusst.
Ein Beispiel eines Arzneimittels, das indirekt auf einen Transkriptionsfaktor wirkt, ist Compactin, ein Inhibitor der HMG CoA Reduktase, was zur einer Aufregulierung der Transkription des LDL-Rezeptorgens führt, unter Ermöglichung der Ausscheidung von Cholesterin (US-A-5 563 036).
Stand der Technik
Es gibt einen Bedarf für den Nachweis und die Quantifizierung von Transkriptionsfaktoren (die als Regulatoren und Adaptoren arbeiten) zur Verbesserung der Diagnostik von Pathologien oder zur Entwicklung von Arzneimitteln, die ihre Aktivität beeinflussen.
Gegenwärtig werden mehrere Verfahren verwendet, um die Aktivierung von Transkriptionsfaktoren wie NFκB abzuschätzen. Das häufigste Verfahren besteht darin, ihre DNA-Bindungskapazität durch Gelretardierung, auch Elektrophoretischer Mobilitätsverschiebungs-Assay (EMSA) genannt (Schreck, R. et al., Nucleic Acids Res, 18 (22), 6497-502 (1990)) zu messen. Dieses Verfahren ist empfindlich, aber ermöglicht nicht die gleichzeitige Verarbeitung von zahlreichen Proben und erfordert besondere Vorsichtsmaßnahmen und Ausrüstungen, die für den Umgang mit Radioaktivität notwendig sind.
Ein zweites, oft verwendetes Verfahren basiert auf Reportergenen (Luciferase- oder β-Galactosidasegenen), die unter der Kontrolle eines, die Konsensussequenz enthaltenden, Promotors platziert wurden. Dieser Promotor kann künstlich sein, hergestellt aus mehreren, spezifischen cis-Elementen und einer TATA-Box, oder natürlich, wie das Element mit langen, terminalen Wiederholungssequenzen (LTR) aus HIV. Andere Transkriptionsfaktoren beeinflussen jedoch die Expressionshöhe des Reportergens. Da der Ablesewert beispielsweise die enzymatische Aktivität von Luciferase ist, können die Ergebnisse zusätzlich durch Interferenzen mit stromabwärts liegenden Vorgängen, wie der allgemeinen Transkriptions- oder Transduktionsmaschinerie beeinflusst werden. Diese Verfahren wird häufig verwendet, vorausgesetzt dass die Zellen wirksam mit dem Reporterplasmid transfiziert sind.
Zwei andere, indirekte Verfahren sind auf wenige Transkriptionsfaktoren beschränkt. Das Erste verwendet Antikörper, die spezifisch gegen die nukleäre Lokalisierungssequenz (NLS) von Transkriptionsfaktoren wie NFκB gezüchtet wurden, einen Teil des Proteins, der durch IκB maskiert ist, wenn der Transkriptionsfaktor inaktiviert ist (Zabel, U. et al., EMBO J., 12 (1), 20–211 (1993)). Die Aktivierung von NFκB kann durch Immunfluoreszenz mit diesem Antikörper sichtbar gemacht werden. Dieses Verfahren eignet sich für eine Analyse von vielen Proben.
Diese verschiedenen Verfahren sind während der letzten 10 Jahre sehr hilfreich für die Grundlagenforschung gewesen, um die molekularen Aktivierungsmechanismen von Transkriptionsfaktoren wie NFκB oder AP-1 zu enträtseln. Nichtsdestoweniger wurde Forschung auf diesem Gebiet durch die Tatsache behindert, dass kein zweckdienlicher Assay, der für Durchmusterungsverfahren im großen Maßstab geeignet ist, verfügbar war.
Ein Assay zum Testen der Inhibition von Transkriptionsfaktoren, die an ihre spezifische Sequenz binden, durch pharmakologische Agenzien ist im Patent US-A-5 563 036 beschrieben. Das möglicherweise aktive Agens wird mit dem radioaktiv markierten Transkriptionsfaktor inkubiert und die Inhibition seiner Bindung an die spezifische Sequenz wird dann gemessen. Diese Sequenz ist mit Biotin konjugiert, das in der Lage ist, spezifisch an Avidin zu binden, welches in Mikrovertiefungen immobilisiert ist. Ein Faktor, der an die Sequenz gebunden ist und Biotin trägt, wird durch die Avidin-beschichteten Platten eingefangen und gemessen. Das markierte Protein, das Nukleinsäurekonjugat und die Verbindung bilden eine Mischung, die mit dem, auf dem festen Substrat immobilisierten, Avidin inkubiert wird. Die Bindung des Faktors an seine Sequenz wird in Lösung durchgeführt, zum Testen einer möglichen Inhibition durch ein pharmakologisches Agens, das in Lösung vorhanden ist.
In Lösung bewegt sich die Länge der Nukleinsäuresonde zwischen 28 und 60 Basenpaaren. Dieser Assay arbeitet mit hoher Faktorkonzentration in Lösung, ist aber für einen diagnostischen Assay in biologischen Proben überhaupt nicht empfindlich. Außerdem muss ein Sondenüberschuss in Lösung zugefügt werden. Die Sonde, die an Avidin auf dem Träger bindet, ist vorzugsweise eine freie Sonde, die eine kleinere Größe und daher eine höhere Diffusionsgeschwindigkeit aufweist, so dass der Grad der Bindung von Sonde/Faktorkomplex gering ist.
Das Patent US-5 747 253 beschreibt ein Verfahren zur Identifizierung von Oligomeren, die eine sehr hohe, spezifische Bindungskapazität für Transkriptionsfaktoren aufweisen. Synthetisierte Oligonukleotide werden zuerst mit Faktoren in Lösung inkubiert, um ihre Bindungsaffinität für den Faktor zu testen, und dann durch Anheften des Oligonukleotids von bis zu 25 Basenpaare über einen Verknüpfungsrest an einen Träger, der auf den Oligonukleotiden vorhanden ist, gemessen. Die Reaktion zwischen dem Faktor und dem Oligonukleotid wird in Lösung durchgeführt, wodurch die Sensitivität begrenzt wird.
Magnetische Mikroteilchen können ebenfalls verwendet werden, um Komplexe einzufangen, die zwischen Nukleinsäuren und Proteinen gebildet wurden, wie im Dokument US-A-5 939 261 vorgeschlagen. Die Reaktion wird in Lösung durchgeführt, was zu den bereits erwähnten Beschränkungen führt.
Gubler und Abarzua (Biotechniques, 18,1008, 1011–4 (1995)) beschreiben immobilisierte Antikörper auf der Oberfläche von Vertiefungen, um den, in einer Lösung vorhandenen, Transkriptionsfaktor einzufangen. Eine biotinylierte Sonde wird zu der Lösung hinzugefügt, so dass die aktiven Faktoren zusammen mit ihren Sonden immobilisiert werden, die dann mit Alkalischer Phosphatase-Streptavidin-Konjugat nachgewiesen werden können. Es werden jedoch alle Transkriptionsfaktoren, entweder aktiv oder nicht, an die Antikörper binden. Es wird eine Konkurrenz um die Bindung an die Antikörper geben. Ergebnisse an Zellextrakten zeigten eine Sensitivität von 2 μg im Assay für das p53 Protein.
Benotmane et al. (Analytical Biochemistry 250, 185–185 (1997)) beschreiben eine DNA-Protein-Bindung eines rekombinanten Proteins im Gleichgewicht, wobei das rekombinante Protein, ein Fragment 6D3 von HTLF, eine DNA-Bindungsdomäne, der 6D3 Anteil einer Helicase, verknüpft mit der Glutathion S-Transferase (GST), aufweist. Der Bindungskoeffizient und der Dissoziationskoeffizient werden in zwei experimentellen Systemen durch Testen der Bindung der biotinylierten Sonde an ein Protein auf der Oberfläche von Vertiefungen oder durch Binden des Proteins an eine Konsensussequenz von 27 Basenpaaren, die an der Vertiefungsoberfläche fixiert ist, bestimmt. In beiden Fällen weisen sie die Protein-DNA-Bindung nach. Sie fanden jedoch eine niedrigere Dissoziationskonstante im zweiten Test. Es gab keinen Versuch das Verfahren auf Zellextrakten zu testen und es ist schwierig, die wirkliche Sensitivität des Verfahrens abzuschätzen, angesichts der Tatsache dass reines, rekombinantes Protein in diesem Assay verwendet wurde.
In Zellen oder Geweben sind die Transkriptionsfaktoren in extrem geringen Mengen vorhanden und dies ist der Grund, warum der EMSA, der auf der Inkubation des großen Überschusses an radioaktiv markierten Sonden in Lösung basiert, der Standardassay in den Laboratorien ist. In vielen Fällen liegt die Konzentration des Transkriptionsfaktors unter der Dissoziationskonstante, weil die Faktoren während der Herstellung von Zelllysaten verdünnt werden. Aus diesem Grund ermöglicht ein Überschuss von Sonden die Verdrängung der Bindungsreaktion in Richtung der Bildung des DNA-Protein-Komplexes. Zweitens kann das geringe Ausmaß an Bindung wegen der hohen Sensitivität der P³²-Messung nachgewiesen werden. Diese Schwierigkeiten erklären auch, weswegen alternative Assays ebenfalls radioaktive Markierung verwenden oder nur wirksam sind, wenn sie an gereinigten Proteinen durchgeführt werden.
Die Veröffentlichung von Hibma M. H. et al. (Nucleic Acid Research, 1994, 22, (18) 3806–3807) und die internationale Patentanmeldung WO 98/08096 offenbaren ein Verfahren zum Durchmustern und/oder Quantifizieren von Transkriptionsfaktoren, welches die Schritte umfasst: des Bindens von doppelsträngigen DNA-Sequenzen, umfassend eine spezifische Sequenz, die in der Lage ist, die Transkriptionsfaktoren zu binden an einen unlöslichen, festen Träger, des in Kontakt Bringens der Transkriptionsfaktoren mit diesen gebundenen, doppelsträngigen DNA-Sequenzen und des Identifizierens und/oder Quantifizierens eines Signals, das sich aus der Bindung dieser Transkriptionsfaktoren an die doppelsträngigen DNA-Sequenzen ergibt.
Die Veröffentlichung von Guo et al. (Nucleic Acids Research, Vol. 22 (24) 5456–5465) beschreibt durch einen Abstandshalter immobilisierte DNA-Sequenzen auf einer festen Trägeroberfläche.
Die internationale Anmeldung WO 95/30026 beschreibt ein Verfahren zum Durchmustern von Agenzien, welche die DNA-Bindung von Transkriptionsfaktoren stören könnten.
Die Veröffentlichung von Driscoll et al. (Journal of Biological Chemistry, 1996, 271 (38) S. 22969–22975) beschreibt einen Antikörper, der in der Lage ist, spezifisch an aktivierte Transkriptionsfaktoren zu binden, die an eine doppelsträngige DNA gebunden sind.
Keines dieser Dokumente beschreibt jedoch Verfahren und Mittel, DNA-gebundene, aber inaktive Transkriptionsfaktoren von DNA-gebundenen, aktivierten Transkriptionsfaktoren zu unterscheiden.
Ziele der Erfindung
Die vorliegende Erfindung zielt darauf ab, ein neues und verbessertes Verfahren und Vorrichtung für die Durchmusterung, den Nachweis (und möglicherweise die Quantifizierung) von aktivierten Transkriptionsfaktoren unter aktivierten und nicht-aktivierten Transkriptionsfaktoren, oder Verbindungen, welche die Faktoren binden, vorzugsweise unter Verwendung nicht-radioaktiver Nachweismittel, bereitzustellen.
Definition
Transkriptionsfaktoren sind Proteine, welche an spezifische Sequenzen von doppelsträngiger DNA, genannt Konsensussequenzen, binden und die, wenn aktiviert entweder durch sich selbst oder mit der Hilfe von anderen Proteinen oder Enzymen, die Transkription der DNA modulieren, entweder aktivieren oder unterdrücken, werden.
Die Transkriptionsfaktoren werden normalerweise in sowohl aktiven als auch inaktiven Formen gefunden, wobei die Verwandlung von einer Form in die andere normalerweise umkehrbar ist. Sie setzen sich aus einer DNA-Bindungsdomäne und einer, für ihre Aktivität verantwortlichen, transaktivierenden Domäne zusammen, und sie können Teil eines großen Protein-Komplexes sein, der mit der Transkriptionsmaschinerie zur Regulierung seiner Aktivität zusammenwirkt.
Das folgende erfindungsgemäße Verfahren kann ebenfalls zur Durchmusterung, zum Nachweis und/oder zur Quantifizierung von Proteinen, die an spezifische, doppelsträngige DNA binden, verwendet werden. Ein solches Protein ist die HIV-Integrase, welche die Sequenz 5'- GTGTGGAAAATCTCTAGCA-3' mit einem möglichen GT am 3'-Ende erkennt, die durch das Enzym geschnitten wird. Das Enzym kann in seiner bindenden Form, unter Verwendung von spezifischen, experimentellen Bedingungen, hauptsächlich der Gegenwart von Me++ (Yi et al. Biochemistry 38, 8458, 1999), stabilisiert werden. Andere virale Proteine, die an DNA-Sequenzen binden, werden in Tabelle 1 aufgelistet und werden möglicherweise ebenfalls durch die vorliegende Erfindung nachgewiesen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Durchmusterungs- und/oder Quantifizierungsverfahren von einem oder mehreren aktivierten Transkriptionsfaktor(en) 1, vorzugsweise phosphorylierte oder dephosphorylierte Transkriptionsfaktor(en), die in einer Zelle oder einem Zelllysat vorhanden sind (einschließlich nukleären Lysaten einer Zelle), wobei das Verfahren, beschrieben in der beigefügten 1, die Schritte von:

– Binden von doppelsträngiger(n) DNA-Sequenz(en) 2 an einen unlöslichen, festen Träger 3 in einer Konzentration von mindestens 0,01 pmol/cm², vorzugsweise 0,1 pmol/cm², der Oberfläche des festen Trägers (Schritt 1), wobei die doppelsträngige DNA-Sequenz 2 weiterhin eine spezifische Sequenz umfasst, die in der Lage ist, den (die) Transkriptionsfaktor(en) 1 spezifisch zu binden, und mit einem Abstandshalter verknüpft ist, der eine Länge von mindestens 6,8 nm aufweist,
– In Kontakt bringen des (der) Transkriptionsfaktor(s)(en) 1 mit der (den) gebundenen, doppelsträngigen DNA-Sequenz(en) 2 und
– Identifizieren und/oder Quantifizieren eines Signals, das sich aus der Bindung des (der) Transkriptionsfaktor(s)(en) 1 an die doppelsträngige(n) DNA-Sequenz(en) 2 ergibt,
– wobei das Signal, das sich aus der Bindung des (der) aktivierten Transkriptionsfaktor(s)(en) 1 an die doppelsträngige(n) DNA-Sequenz(en) 2 ergibt, nachgewiesen wird unter Verwendung von:
– erstens einem primären Antikörper 4 oder einem hypervariablen Anteil davon, der spezifisch für den (die) aktivierten Transkriptionsfaktor(en) ist und;
– einem sekundären, markierten Antikörper 5, der gegen den primären Antikörper 4 oder den spezifischen, hypervariablen Anteil davon gerichtet ist.

Möglicherweise kann das erfindungsgemäße Verfahren auch den Schritt des Identifizierens und/oder Quantifizierens eines Signals umfassen, das sich aus der Bindung von aktiviertem(n) und nicht-aktiviertem(n) Transkriptionsfaktor(en) an die doppelsträngige(n) DNA-Sequenz(en) 2 ergibt, wobei das Signal, das sich aus der Bindung von aktivierten und nicht-aktivierten Transkriptionsfaktor(en) an die doppelsträngige(n) DNA-Sequenz(en) 2 ergibt, nachgewiesen wird unter Verwendung von:

– erstens einem primären Antikörper 4 oder einem hypervariablen Anteil davon, der spezifisch für den (die) aktivierten und nicht-aktivierten Transkriptionsfaktor(en) ist und;
– einem sekundären, markierten Antikörper 5, der gegen den primären Antikörper 4 oder den spezifische hypervariablen Anteil davon gerichtet ist.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren ist der (die) aktivierte(n) Transkriptionsfaktor(en) (1) ein an ein Protein gebundener Transkriptionsfaktor, der Teil seines aktiven Komplexes ist, vorzugsweise ist dieses Protein ein Aktivator oder Inhibitor der Transkriptionsfaktor-Aktivierung.
Vorzugsweise wird das Signal durch die folgenden Schritte erhalten:

– nach dem Waschen wird das Vorhandensein des fixierten Transkriptionsfaktor 1 unter Verwendung von erstens einem primären Antikörper 4, der gegen den Faktor 1 (Schritt 2) gezüchtet wurde, und dann einem sekundären, markierten Antikörper 5 (zum Beispiel konjugiert mit einem Enzym wie Meerrettichperoxidase), gerichtet gegen den primären Antikörper 4 (Schritt 3), nachgewiesen.

Das Vorhandensein der Peroxidase wird dann vorteilhafterweise, durch die Zugabe eines geeigneten Substrats, durch einen colorimetrischen Nachweis des Reaktionsprodukts in der Lösung (Schritt 4) gemessen. Ein solches nicht-radioaktives Verfahren ist schnell, empfindlicher als Gelretardierung und geeignet für Durchmusterung im großen Maßstab oder Nachweis auf verschiedenen, festen Trägern.
Mit „einer spezifische Nukleotidsequenz einer doppelsträngigen DNA-Sequenz, die in der Lage ist, einen Transkriptionsfaktor zu binden" ist eine Nukleotidsequenz gemeint, die spezifisch durch biochemische Wechselwirkungen durch den (die) Transkriptionsfaktor(en) erkannt werden kann.
Die vorliegende Erfindung ist empfindlich genug, um auf den Nachweis von Transkriptionsfaktoren oder Proteinen, die in der Lage sind, DNA-Sequenzen zu binden, welche in Zelllysat (einschließlich nukleärem Lysat) vorhanden sind, oder in einer Körperflüssigkeit vorhanden sind, angewandt zu werden. Unerwarteterweise können, unter Verwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung, weniger als ungefähr 10^–12 Mol Transkriptionsfaktor in 50 Mikrolitern in einem Assay nachgewiesen werden, und es wurde herausgefunden, dass die Nachweisgrenze bei ungefähr 5,10^–16 Mol für einen NFκB-Assay liegt. Diese Sensitivität erklärt die Möglichkeit, solch eine Erfindung für den Nachweis von Transkriptionsfaktoren, die natürlicherweise in einem Zelllysat vorhanden sind, zu verwenden. Die erhaltene Sensitivität, die mindestens so gut wie das EMSA-Verfahren ist (Beispiel 2), ist ein überraschendes Ergebnis, da sich die Konsensussequenz nicht in Lösung befindet, sondern an einer festen Oberfläche fixiert (gebunden) ist (wo die Reaktion langsamer als in Lösung ist) und der Nachweis erfordert keine radioaktive Messung, sondern kann durch einfache Colorimetrie erhalten werden.
Vorzugweise ist im erfindungsgemäßen Verfahren die spezifische Nukleotidsequenz der doppelsträngigen DNA-Sequenz(en), die in der Lage ist, an den (die) Transkriptionsfaktor(en) zu binden, in einer Entfernung von mindestens 6,8 nm von der Oberfläche des festen Trägers lokalisiert.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die doppelsträngige DNA-Sequenz einen Abstandshalter von mindestens ungefähr 13,5 nm zwischen der spezifischen Sequenz und der Oberfläche des festen Trägers umfassen.
Vorzugsweise ist der Abstandhalter eine doppelsträngige DNA-Nukleotidsequenz von mindestens 20 Basenpaaren, vorzugsweise mindestens 50, 100, 150 oder 250 Basenpaaren.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen Durchmusterungs-, diagnostischen und/oder Quantifizierungs-Kit, der Mittel und Medien zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst.
Vorzugsweise betrifft die Erfindung auch einen Durchmusterungs und/oder Quantifizierungs-Kit oder -vorrichtung, einschließlich einer Vorrichtung für hohen Durchsatz, möglicherweise Computer-kontrollierbare, elektromagnetische Mittel und Roboter umfassend (wie eine Durchmusterungsvorrichtung für hohen Durchsatz), die das Durchmustern und den Nachweis auf jeder Art von festem Träger 1 ermöglichen, und verwendet werden für das Durchmustern und/oder Quantifizieren von aktivierten Transkriptionsfaktor(en) 1, unter aktivierten und nicht- aktivierten Transkriptionsfaktor(en), die in einer Zelle oder einem Zelllysat vorhanden sind, oder für das Durchmustern und/oder Quantifizieren von Verbindungen, die in der Lage sind, an den (die) aktivierten Transkriptionsfaktor(en) 1 zu binden oder die Bindung des (der) aktivierten Transkriptionsfaktors(en) an eine spezifische Nukleotidsequenz zu inhibieren, welche in der doppelsträngigen DNA-Sequenz enthalten ist, die über einen Abstandshalter, der eine Länge von mindestens 6,8 nm aufweist, an den unlöslichen, festen Träger, in einer Konzentration von mindestens 0,01 pmol/cm² der Oberfläche des festen Trägers 3, gebunden ist und einen primären Antikörper 4 oder einem hypervariablen Anteil davon, wobei beide spezifisch für die aktivierte Form des (der) Transkriptionsfaktors(en) sind und möglicherweise einem sekundären, markierten Antikörper 5, der gegen den primären Antikörper 4 oder den spezifischen, hypervariablen Anteil davon gerichtet ist.
Der erfindungsgemäße Durchmusterungs- und/oder Quantifizierungs-Kit umfasst ebenfalls Mittel und Medien zum Nachweis des Signals, das sich aus der Bindung des (der) Transkriptionsfaktor(s/en) an die doppelsträngige(n) DNA-Sequenz(en) ergibt, wobei das Signal ein nicht-radioaktives Ergebnissignal ist.
Das Verfahren und der Kit gemäß der Erfindung sind ebenfalls für die (möglicherweise gleichzeitige) Durchmusterung und/oder Quantifizierung von mehreren, unterschiedlichen Transkriptionsfaktoren, die in der gleichen biologischen Probe (Zelle oder Zelllysat) vorhanden sind, geeignet. Das Verfahren ist besonders gut an den Nachweis von mehreren Transkriptionsfaktoren auf dem gleichen Träger (ein Biochip oder eine Platte mit mehreren Vertiefungen (Multiwell-Platte)) angepasst. Der Nachweis der verschiedenen Faktoren aus der gleichen Probe kann jedoch auch in Vertiefungen unterschiedlicher Platten durchgeführt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch den Schritt des Durchmusterns und/oder Quantifizierens von (einer) Verbindung(en) umfassen, die in der Lage ist (sind), an den (die) Transkriptionsfaktor(en) zu binden oder ihre Bindung an die spezifische Sequenz zu inhibieren, vorzugsweise unter Verwendung von Schritten, Mitteln und Medien, wie die, welche im US Patent 5,563,036 beschrieben sind.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch den Schritt der Identifizierung von mindestens einem Merkmal, das spezifisch für eine gegebene Transkriptionsfaktor-Aktivierung ist, umfassen. Einige Transkriptionsfaktoren können an ihre Konsensussequenz binden, ohne die Transkriptionsmaschinerie zu aktivieren. Die Aktivierung ist dann mit einem oder mehreren spezifischen Veränderungen verbunden, wobei die häufigste die Phosphorylierung (oder Dephosphorylierung) an (einer) spezifischen Aminosäure(n) des Proteins ist. Ein Beispiel für einen solchen Transkriptionsfaktor ist CREB, der nur aktiv ist, wenn er phosphoryliert ist (Beispiel 1).
Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch den Schritt des Durchmusterns und/oder Quantifizierens von (einer) bekannten und unbekannten Verbindung(en) umfassen, welche(r) in der Lage ist (sind) die Aktivierung des (der) Transkriptionsfaktor(s/en) in Zellen, Geweben oder Organismen zu modulieren und die restliche Aktivität des (der) Transkriptionsfaktore(en) in Zelllysat nachzuweisen. Externes Protein, das mindestens teilweise die bindende DNA-Domäne aufweist, kann auch zur Inkubationslösung hinzugefügt werden, um seine mögliche Aktivierung durch Zelllysat zu bestimmen und um eine Durchmusterung von Verbindungen zu erhalten, die auf diese Aktivierung wirken. Wenn ein gereinigter Transkriptionsfaktor zum Zelllysat hinzugefügt wird, kann seine Aktivierung durch Bestimmung von einem oder mehreren seiner spezifischen Merkmale quantifiziert werden. Proteine, die als Aktivatoren oder Inhibitoren auf eine Transkriptionsfaktor-Aktivierung wirken, können ebenfalls zum Inkubationsmedium hinzugefügt werden und in einem Durchmusterungsverfahren von Verbindungen, die auf diese Proteine wirken, dienen.
Das Verfahren kann auch den Schritt des Bildens einer Mischung durch Vereinigen eines, einen Anteil des Transkriptionsfaktors umfassenden, markierten Proteins mit der spezifischen Nukleotidsequenz, die an den unlöslichen, festen Träger gebunden ist, umfassen. Danach umfasst das Verfahren den Schritt des Inkubierens der Mischung unter den Bedingungen, wobei beim Fehlen der Verbindung das markierte Protein an die Nukleotidsequenz bindet, den Schritt des Abtrennens einer Fraktion der Mischung vom festen Träger, wobei die Fraktion das markierte Protein umfasst, wenn das markierte Protein nicht an die Sequenz gebunden ist und den Schritt des Nachweisens des Vorhandenseins oder Fehlens des markierten Proteins auf dem festen Träger; wobei das Fehlen der nachgewiesenen Markierung auf dem festen Träger bedeutet, dass die Verbindung die Bindung eines Transkriptionsfaktors an die Nukleotidsequenz inhibiert. Vorzugsweise umfasst das Verfahren ebenfalls den Schritt des Rückgewinnens der nachgewiesenen, unbekannten Verbindung.
Gemäß der Erfindung ist der der feste Träger vorzugsweise eine Anordnung (Array), die mindestens 4, 10, 16, 25, 100, 1000, 10 000 oder mehr Spots (Tupfen)/cm² der Oberfläche des festen Trägers trägt, wobei jeder Spots an einem spezifischen Ort doppelsträngige DNA-Sequenz(en) zum Binden des (der) Transkriptionsfaktor(s/en) enthält.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die doppelsträngige DNA-Sequenz 2 an ein erstes Mitglied 6 eines Bindungspaars, wie Biotin/Streptavidin, Hapten/Rezeptor, Antigen/Antikörper gebunden, welches in der Lage ist mit dem zweiten Mitglied 7 des Bindungspaares, das an die Oberfläche des festen Trägers 3 gebunden ist, zu interagieren.
Als Alternative kann (können) die doppelsträngige(n) DNA-Sequenz(en) kovalent an die Oberfläche des unlöslichen, festen Trägers gebunden sein.
Als Alternative kann das erfindungsgemäße Verfahren auch den Schritt des Identifizierens des (der) Transkriptionsfaktor(s/en) und/oder Proteins(e), die Teil ihres aktiven Komplexes sind, umfassen.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann ebenfalls den Schritt des Durchmusterns oder Nachweisens des (der) „fixierten" Transkriptionsfaktor(s/en) und möglicherweise Quantifizierens des Vorhandenseins des (der) „fixierten" Transkriptionsfaktor(s/en) (und/oder möglicherweise Quantifizieren der Konzentration des (der) Transkriptionsfaktor(s/en), der (die) in einer biologischen Probe (Zelle oder Zelllysat) vorhanden ist (sind)) umfassen.
Die Verwendung einer Konsensus-DNA-Sequenz 2, die bereits auf einem festen Träger 3 fixiert ist, ermöglicht die industrielle Herstellung mit Reproduzierbarkeits- und Qualitätskontrolle des Kits oder der Vorrichtung, die eine solchen hergestellten Träger enthält. Sie vereinfacht auch die Verwendung des Kits, da eine biologische Probe (Zelle oder Zelllysat) direkt auf einer solchen, hergestellten Oberfläche eines festen Trägers inkubiert werden kann, ohne die Zugabe irgendeines anderen Reagenzes zu erfordern.
Das allgemeine Verfahren zum Nachweis der DNA-Bindungskapazität der Transkriptionsfaktoren ist ausreichend empfindlich, spezifisch und geeignet für die meisten (wenn nicht alle) Transkriptionsfaktoren. Unerwarteterweise ist es möglich, das empfindliche Verfahren durch Erhöhen der Größe des Abstandshalters zwischen einer Konsensussequenz an die der Transkriptionsfaktor binden wird, und durch Verwendung eine sehr hohen Dichte dieser an der Oberfläche des festen Trägers befestigten Nukleotidsequenzen zu verbessern. Das Verfahren ist so empfindlich, dass es für den Nachweis eines Faktors, der in einer biologischen Probe vorhanden ist, aber auch für den Nachweis von mehreren Faktoren verwendet werden kann, durch Verwendung von mehreren Nukleotidsequenzen, die in bestimmten Spots auf einer festen Oberfläche wie Biochips (Mikroarrays) befestigt sind.
Es wurde herausgefunden, dass der minimale Abstandshalter eine Nukleotidsequenz, wie eine DNA-Sequenz, von 20 Basenpaaren (bp) ist, aber der Abstandshalter kann zwischen 50 und 250 Basenpaare haben, entsprechend der Art des festen Trägers und des verwendeten Antikörpers (Beispiel 4). Das Vorhandensein der Konsensus-Nukleotidsequenz in einer großen Entfernung von der Oberfläche des festen Trägers kann in ähnlicher Weise auch durch das Vorhandensein eines chemischen Abstandshalters von mindestens 10 Atomen, vorzugsweise von mindestens 44 Atomen und weiter bevorzugt von mindestens 50 Atomen oder mehr, erzielt werden.
Das Verfahren, der Kit oder die Vorrichtung sind zum Testen der Aktivität von pharmazeutischen Arzneimitteln oder von Verfahren geeignet, die auf diese Transkriptionsfaktoren (z.B. als Inhibitoren und/oder Aktivatoren ihrer Bindung an die DNA) oder auf ihre regulatorischen Vorgänge, Aktivierung oder Repression, wirken.
Die Erfindung betrifft ebenfalls die Verbindung, welche identifiziert oder rückgewonnen und möglicherweise in einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verhinderung oder Behandlung von verschiedenen Symptomen oder Erkrankungen eingebunden wurde.
Das Durchmusterungs-, Nachweis- und/oder Quantifizierungsverfahren und der Kit sind zum Nachweisen und Quantifizieren von all den Transkriptionsfaktoren geeignet, für welche die DNA-Bindungssequenz bekannt ist. Diese Transkriptionsfaktoren und ihre Eigenschaften sind auf der Web-Seite "http://transfac.gbf.de/TRANSFAC/cl/cl.html" aufgelistet. Die am häufigsten getesteten Faktoren werden ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus NF-κB, AP-1, CREB, SP-1, C/EBP, GR, HIF-1, Myc, NF-AT, Oct, TBP und CBF-1. Eine Liste einiger Transkriptionsfaktoren und ihre entsprechenden Konsensussequenzen (Sequenzen SEQ ID NR. 1 bis 125) wird in Tabelle 1 gegeben.
NF-κB ist ein wichtiger, ubiquitärer, nach Zellstimulierung aktivierter Transkriptionsfaktor, der an der Immunantwort auf einige virale und bakterielle Produkte, oxidativen Stress oder entzündungsfördernde Cytokine (Baeuerle, P. A. und Baichwal, V. R., Adv. Immunol., 65, 111–37 (1997)) beteiligt ist.
AP-1 ist ebenfalls ein dimerer Transkriptionsfaktor, der an vielen Zellantworten durch Aktivierung einer Kinasekaskade beteiligt ist. Dieser Transkriptionsfaktor ist an einer Vielfalt von biologischen Vorgängen, wie Zellwachstum, Differenzierung oder Apoptose, beteiligt.
Vorzugsweise wird der Nachweis und möglicherweise die Quantifizierung durch die Verwendung von Verbindungen erzielt, die in der Lage sind, spezifisch an den Transkriptionsfaktor zu binden, welcher an der doppelsträngigen DNA fixiert ist, wie (vorzugsweise monoklonale) Antikörper oder spezifische, hypervariable Anteile davon (Fab', Fab2', usw.).
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Bindung von einer Inkubation (und einem Waschschritt) mit markierten Verbindungen gefolgt, die in der Lage sind, mit der ersten, an den Transkriptionsfaktor bindenden Verbindung zu reagieren, vorzugsweise (monoklonale) Antikörper, gerichtet gegen die anti-Transkriptionsfaktor-Antikörper oder spezifischen, hypervariablen Anteilen davon (Fab', Fab2', usw.). Die letzten Antikörper sind vorzugsweise mit nicht-radioaktiven Markierungen markiert, die einen Nachweis durch vorzugsweise Colorimetrie, Fluoreszenz, Biolumineszenz, Elektrolumineszenz oder Ausfällung eines Metallniederschlags (wie Silberfärbung) wie in Beispiel 3 ermöglichen. Andere sekundäre Bindungsproteine, die an Antikörper binden, wie Protein A, sind ebenfalls eine Ausführungsform des Verfahrens. Der nicht-radioaktive Test basiert vorzugsweise auf einem colorimetrischen Assay, welcher sich aus einer enzymatischen Aktivität ergibt, wie in der beigefügten 1 beschrieben. Wenn ein direktes Verfahren wie Massenspektrumanalyse empfindlich genug ist, kann es zum direkten Nachweis des gebundenen Faktors verwendet werden.
Der ausgewählte Antikörper erkennt ein Epitop, das zugänglich ist, wenn der Faktor sich in seiner aktiven Form befindet und an DNA gebunden ist. Normalerweise unterscheiden sich die aktiven und inaktiven Formen der Faktoren in ihrem Phosphorylierungszustand oder durch das Vorhandensein eines Inaktivatorproteins. Der Antikörper muss die aktive Form erkennen. Die Konzentration dieser Transkriptionsfaktoren in einer Zelle ist sehr gering und kann die Grenze des Affinitätskoeffizienten der Antikörper erreichen. Ein Antikörper mit einer hohen Affinität (d.h. mit einem sehr geringen Dissoziationskoeffizienten) kann das erzielte Signal sehr stark erhöhen. Es kann jedoch auch jedes andere Protein, das eine Affinität für den Faktor aufweist, für den Nachweis verwendet werden.
Besondere Anwendungen sind die Verwendung von spezifischen Antikörpern, die gegen Phosphoprotein-Epitope oder gegen spezifische Proteine gerichtet sind, welche Teil des Transkriptionsfaktors sind oder an ihm befestigt werden können (siehe Beispiel 1). Für NFκB ermöglichen Antikörper, die entweder gegen P-50 oder P-65 gerichtet sind, das Muster der Assoziierung von Proteinen, welche die NFκB-Aktivität geben, zu bestimmen.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht ebenfalls eine Unterscheidung zwischen der DNA-Bindung des Transkriptionsfaktors und seiner Aktivität. Die Aktivität ist mit einem oder mehreren, besonderen Merkmalen dieser Faktoren verbunden, wovon das häufigste die Phosphorylierung an spezifischen Orten oder die Dissoziation von inhibitorischen Proteinen ist. Durch Verwendung von passenden Antikörpern, die gegen diese Elemente gerichtet sind, ist es möglich, die Menge an Transkriptionsfaktoren in ihrer aktiven Form zu bestimmen. Als ein Beispiel kann CREB an seine DNA-Konsensussequenz binden, ohne aktiv zu sein. Seine Aktivierung ergibt sich aus einer spezifischen Phosphorylierung an einer Seringruppe, was das P-CREB herstellt. Die vorliegende Erfindung weist sowohl die CREB-Bindung als auch die P-CREB-Aktivierung durch Verwendung von Antikörpern, die entweder gegen CREB gerichtet oder spezifisch für das P-CREB sind, nach (Beispiel 1).
Der befestigte Transkriptionsfaktor kann ebenfalls verwendet werden, um auf das Vorhandensein von Proteinen zu testen, die eine Affinität für den Transkriptionsfaktor aufweisen.
Das Verfahren umfasst ebenfalls den Schritt des Durchmusterns und/oder Quantifizierens von (einer) bekannten und unbekannten Verbindung(en), welche in der Lage ist (sind), die Aktivierung des Transkriptionsfaktors durch Modifizierung des Grads von spezifischen Merkmalen des Faktors zu modulieren.
Wenn die Bindung spezifisch ist und wenn keine anderen Proteine auf der, an die Oberfläche gebundene, Nukleotidsequenz verwendet werden, zum Beispiel wenn die Nukleotidsequenzen direkt mit der Oberfläche verknüpft sind, dann kann ein direkter Nachweis von Protein eine Abschätzung und/oder Quantifizierung des gebundenen Faktors geben.
Es wird ein Signal, das in jeder Vertiefung oder für jeden Spot eines Biochips erhalten wird, aufgezeichnet und die Mittelwerte des Signals werden für jede identische Konsensussequenz berechnet. Normalerweise sind zwei (und vorzugsweise drei bis fünf) identische Spots auf jedem Array vorhanden, um Abweichungen, die in jedem Schritt des Verfahrens auftreten können, zu korrigieren. Die Hintergrundwerte sind Vertiefungen oder Spots, die mit einer Konsensussequenz beschichtet sind, zu denen Bindungspuffer und Lysispuffer, anstatt eines Zellextraktes oder gereinigtem Transkriptionsfaktors (negative Kontrolle), zugefügt wird. Eine positive Kontrolle wird vorzugsweise als ein Faktor zugefügt, der in einer reinen, aktiven Form erhalten wurde und für den eine Konsensus-Nukleotidsequenz an die Oberfläche des festen Trägers im Test befestigt wurde.
Quantifizierung muss nicht nur für die Bindungsausbeute berücksichtigt werden, sondern auch für den Nachweisteil des Verfahrens und die Ableseskala. Interne oder externe Eichlösungen können unter Verwendung von gereinigtem, aktiven Transkriptionsfaktor in jedem Schritt des Verfahrens in einer gegebenen Menge als Vergleichswert zur Probe hinzugefügt werden, mit dem die Ergebnisse verglichen werden. Eine Validierung der Verwendung dieser Eichlösungen muss vorher durchgeführt werden, um ihre Bindungseffizienz, verglichen mit den getesteten Faktoren, zu bestätigen.
Im Fall von biologischen Anwendungen können Transkriptionsfaktoren, die an der Zellantwort beteiligt sind, im Vergleich zu Transkriptionsfaktoren, die konstitutiv aktiv sind (es gibt Faktoren, welche die Expression von Housekeeping-Genen regulieren) quantifiziert werden. Die Verwendung dieser „relativen" Quantifizierung vereinfacht die Assays, da alle Faktoren während der verschiedenen Schritte in der gleichen Weise behandelt werden.
Der gleichzeitige Nachweis des Bindens oder der Aktivität von mehreren Transkriptionsfaktoren ist besonders nützlich, weil es ein Muster von Antworten der Zelle oder des Gewebes auf eine besondere biologische Situation, auf Moleküle oder Arzneimittelwirkung ergibt. Die Transkriptionsfaktoren werden durch komplexe Stoffwechselwege, die miteinander verbunden sind, aktiviert. Eine allgemeine Durchmusterungsanalyse von verschiedenen Transkriptionsfaktoren wird eine bessere Sicht ergeben und bei der Interpretation der studierten Wirkungen helfen.
Des Weiteren können feste Träger, wie ein Biochip, in einen Maschinenträger eingesetzt werden, der mit einer weiteren Kammer und automatischen Maschine über die Kontrolle einer flüssigen Lösung, basierend auf der Verwendung von Mikrofluidics-Technologie, verbunden ist. Durch das Eingesetzt-werden in ein solches Mikrolaborsystem, kann er durch Automaten inkubiert, erhitzt, gewaschen und markiert werden, auch für vorhergehende Schritte (wie eine PCR-Amplifikation) oder den nachfolgenden Schritt (Markierung und Nachweis). All diese Schritte können auf dem gleichen, festen Träger durchgeführt werden.
Gemäß der Erfindung wird der feste Träger vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Glas, metallischen Trägern, polymeren Trägern (vorzugsweise ein Polystyrolträger, aktiviert mit Carboxyl- oder Aminogruppen, die auf seiner Oberfläche vorhanden sind) oder jedem anderen Träger, der in der Mikrochip-(oder Mikroarray-)technologie verwendet wird (vorzugsweise aktiviertes, Aldehydgruppen-tragendes Glas), wobei der Träger ebenfalls spezifische Beschichtungen, Markierungen oder Vorrichtungen (Barcodes, elektronische Vorrichtungen ...) zur Verbesserung des Assays umfasst.
Auch wenn Glas viele Vorteile bietet (wie inert zu sein und eine geringe Autofluoreszenz aufzuweisen) sind andere Träger, wie Polymere mit verschiedenen, chemisch gut definierten Gruppen an ihrer Oberfläche, welche die Bindung der Nukleotidsequenzen ermöglichen, verwendbar.
Miniaturisierung ermöglicht es, einen Assay auf einer Oberfläche (normalerweise runde Spots von ungefähr 0,1 bis ungefähr 1 mm Durchmesser) durchzuführen. Ein Array mit geringer Dichte, der 20 bis 400 Spots enthält, wird leicht mit Nadeln von 0,25 mm bei geringen Kosten erhalten. Eine höhere Dichte von Spots, bis auf 1600 Spots pro cm² heraufgehend, kann durch Verringerung der Größe der Spots, zum Beispiel auf 0,15 mm, erhalten werden. Die Vorteile dieser Technologie sind die hohe Zahl von Daten, die erhalten und gleichzeitig analysiert werden kann, die Möglichkeit, Wiederholungen durchzuführen und die geringe Menge an für den Assay notwendiger, biologischer Probe.
Die Arraytechnologie ermöglicht den gleichzeitigen Nachweis von verschiedenen Faktoren, die in der gleichen Probe vorhanden sind, was auf Grund der Tatsache möglich ist, dass mehrere Faktoren in den gleichen Reaktionsbedingungen an ihre Konsensussequenz binden. Lösungen für die Bindung von mehreren Faktoren sind beispielsweise von Promega (Madison, Wisconsin, USA) erhältlich (Katalog E3581). Bedingungen, welche die Bindung der studierten Faktoren ermöglichen, können durch den Fachmann optimiert werden. Andere Bindungsassay, die DNA-DNA-Erkennung, Antigen-Antikörper- oder Rezeptor-Ligand-Erkennung beinhalten, können gleichzeitig auf dem gleichen Chip für andere Moleküle durchgeführt werden.
Der Nachweis der spezifischen Bindung zwischen dem Transkriptionsfaktor und der doppelsträngigen DNA-Sequenz wird durch jedes der vorher beschriebenen Verfahren erzielt, oder vorzugsweise durch ein Verfahren, das die Ausfällung einer Metallablagerung (wie Silberfärbung) an dem Ort, wo der Transkriptionsfaktor die doppelsträngige DNA fixiert (erkannt) hat, ermöglicht.
Da nur aktivierte Transkriptionsfaktoren durch die, an den festen Träger (vorzugsweise Platte mit Mikrovertiefungen oder Mikroarray) gebundenen, Nukleotidsequenzen eingefangen werden, ermöglichen das Design dieser Sequenzen und die Bindungsbedingungen eine sehr hohe Sensitivität, die für Assays in biologischen Proben notwendig ist.
Die vorliegende Erfindung wird detaillierter in den folgenden, nicht einschränkenden Beispielen beschrieben, mit Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 ist eine schematische Darstellung des Verfahrens für einen Assay auf einen Transkriptionsfaktor gemäß der Erfindung.
2 stellt einen DNA-Bindungsassay von 3 unterschiedlichen Transkriptionsfaktoren (NFκB, CREB und AP-1) dar, gleichzeitig in Mikrovertiefungen in den gleichen Zellextrakten gemessen. Mikrovertiefungen enthalten eine 100 bp DNA, beendet durch eine für entweder NFκB, CREB oder AP-1 spezifische Sequenz, und die DNA-Bindungskapazität der Transkription wird mit anti-p65, anti-Phospho-CREB beziehungsweise anti-cfos (für den AP-1-Assay) nachgewiesen. Der DNA-Bindungsassay wird an Zelllysaten durchgeführt, die entweder von unstimuliert gebliebenen oder von mit IL-1, mit Forskolin, mit PMA + Ionomycin, mit IL-1 und Forskolin, mit IL-1 und PMA + Ionomycin, mit Forskolin und PMA + Ionomycin und IL-1 und Forskolin und PMA + Ionomycin stimulierten, Zellen kommen. Die Ergebnisse zeigen das Signal, das für den Assay auf NFκB (A), P-CREB (B) und c-fos (C) in den verschiedenen Zellextrakten erhalten wurde (NF-κB wird in Il-1-stimulierten Zellen stark induziert, P-CREB durch Forskolinstimulation und AP-1 durch PMA).
3 stellt die Sensitivität des DNA-Bindungsassays dar. DNA-Bindungsaktivität von gereinigtem NFκB (p50) wurde in Mikrovertiefungen gemessen, die eine für NFκB spezifische DNA-Sonde enthielten. Die Konzentrationen des in diesem Assay verwendeten p50 reichen von 10^–12 Mol bis 5 10^–16 Mol/Vertiefung.
4 stellt die Sensitivität des DNA-Bindungsassays dar. DNA-Bindungsaktivität von stimulierten Zellen und nicht-stimulierten Zellen für NFκB.
5 stellt die Werte dar, die für den Nachweis von NFκB erhalten wurden, das in Zellen vorhanden ist, die mit oder nicht mit IL-1 stimuliert wurden, auf einem Mikroarray unter Verwendung von DNA-Sonden von unterschiedlichen Längen, die eine aufgetupfte Konsensussequenz für NFκB enthalten.
6 stellt die Wirkung von verschiedenen Arzneimitteln auf die DNA-Bindungsaktivität von IL-1-induziertem NFκB dar.
Beispiele
Beispiel 1: Colorimetrischer DNA-Bindungsassay in Mikrovertiefungen. (1 und 2)
Schritt 1: Bindung der doppelsträngigen Oligonukleotidsonde an Platten mit vielen Vertiefungen
Die doppelsträngigen Nukleotidsequenzen des Abstandshalters wurden aus der folgenden CMV-Sequenz konstruiert:
als Abstandshalter wirkend, wurde verknüpft mit a) dem Oligonukleotid der NFκB-Konsensussequenz 5'-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3' b) dem Oligonukleotid der CREB-Konsensussequenz 5'-ATTGCCTGACGTCAGAGAGCTAG-3' und c) dem Oligonukleotid der AP-1-Konsensussequenz 5'-CCGTTCCGGCTGACTCATCAAGCG-3'. In dem Beispiel war der Abstandshalter aus 100 Basenpaaren. Da äußere Ende von CMV ist 5'-biotinyliert, so dass diese Sonden mit Streptavidinbeschichteten Platten mit 96-Vertiefungen verknüpft werden können: 2 pmol Sonden pro Vertiefung werden 1 Std. bei 37°C in 50 μl 10 mM Phosphatpuffer, 150 mM NaCl (nachfolgend PBS₁₅₀ genannt) inkubiert. Platten werden dann gewaschen und die Menge der auf Streptavidin-beschichteten Platten fixierten DNA wurde unter Verwendung des Picogreen-Assays (Molecular Probes, OR, USA) quantifiziert. Es wurde herausgefunden, dass ein Picomol DNA in den Vertiefungen fixiert war, unter Verwendung einer DNA-Eichlösung zur Kalibrierung des Assays.
Schritt 2: Bindung des Transkriptionsfaktors an die doppelsträngige Sonde
Dieser Assay wurde entweder mit gereinigtem p50-p50 (Promega, Madison, WI, USA), oder mit nukleären Zellextrakten von mit SV-40 transformierten WI-38 Fibroblasten (WI-38 VA13 Zelllinie) durchgeführt. Zellen wurden von der ATCC gekauft und in 75 cm² Flaschen ausplattiert. Sie wurden seriell in Minimum Essential Medium (Gibco, GB), ergänzt mit Na₂SeO₃ 10^–7 M und Antibiotika, in der Gegenwart von 10% fötalem Kälberserum kultiviert. Zellen wurden für 30 Min. mit IL-1 (um NFκB zu aktivieren), Forskolin (um CREB zu aktivieren), PMA + Ionomycin (um AP-1 zu aktivieren) stimuliert oder blieben unstimuliert.
Die nukleären Zellextrakte wurden wie folgt hergestellt:

– Zellen wurden mit kaltem PBS₁₅₀ abgespült.
– Zellen wurden während 3 Min. in einem kalten, hypotonischen Puffer (20 mM Hepes pH 7,4, 5 mM NaF, 1 mM Na₂MoO₄, 0,1 mM EDTA) anschwellen gelassen.
– Zellen wurden in 0,5 ml 0,2% Nonidet P40 enthaltenden, hypotonischen Puffer abgeschabt und unmittelbar während 30 Sek. bei maximaler Geschwindigkeit (13 000 UpM) zentrifugiert.
– Das Pellet wurde in 100 μl Lysispuffer (hypotonischer Puffer, enthaltend 20% Glycerol, 0,4 M NaCl, Phosphatasen- und Proteasen-Inhibitoren-Cocktail) resuspendiert.
– Der nukleäre Extrakt wurde 30 Min. bei 4°C bewegt und dann für 10 Min. bei maximaler Geschwindigkeit (13 000 UpM) bei 4°C zentrifugiert.
– Der Überstand (= nukleärer Extrakt) wurde bei –80°C eingefroren und sein Proteingehalt durch den Bradford Assay bestimmt.

20 μl p50, verdünnt in Lysispuffer, oder 20 μl nukleärer Zellextrakt werden mit 30 μl Bindungspuffer (AAT, Namur) in Mikrovertiefungen inkubiert, die entweder mit dem Konsensus-Oligonukleotid für NFκB, oder mit dem Konsensus-Oligonukleotid für CREB, oder mit dem Konsensus-Oligonukleotid für AP-1 beschichtet waren. Nach 2 Std. Inkubation bei Raumtemperatur mit einer sanften Bewegung (200 UpM. auf einem IKA MS2 Vortex, Deutschland) werden die Mikrovertiefungen 3 mal mit PBS₁₅₀ mit 10 mM Phosphatpuffer, 50 mM NaCl (nachfolgend PBS₅₀ genannt) + Tween 0,1%, und einmal mit PBS₅₀ allein gewaschen.
Schritt 3: Bindung von anti-NFκB an den NFκB-DNA-Komplex
100 μl Kaninchen-Antikörper, 500- oder 1000fach in 10 mM Phosphatpuffer, 50 mM NaCl (nachfolgend PBS₅₀ genannt) und 1% Rinderserumalbumin verdünnt, werden in jeder Vertiefung für 1 Std. bei Raumtemperatur inkubiert. Die verwendeten, unterschiedlichen Antikörper sind:

– Für NFκB: anti-p65 (Santa Cruz # sc-372) oder anti-p50 (Santa Cruz # sc-7178)
– für CREB: anti-CREB (Rockland, # 100-401-195) oder anti-phospho-CREB (Upstate Biotechnology 06-519).
– für AP-1: anti-c-fos (Santa Cruz, # sc-7202) oder anti-c-jun (Biolabs # 9164).

Die Mikrovertiefungen werden dann 3 mal mit PBS₁₅₀ + 0,1% Tween gewaschen.
Schritt 4: Bindung von Peroxidase-konjugiertem anti-Kaninchen IgG
100 μl verdünntes, Peroxidase-konjugiertes anti-Kaninchen IgG (# 611-1302, Rockland, Gilbertsville, PA, USA) 1000fach in PBS₅₀ und 1% fettfreiem Milchpulver verdünnt, werden in jeder Vertiefung für 1 Std. bei Raumtemperatur inkubiert. Die Mikrovertiefungen werden dann mit 200 μl PBS₅₀ + 0,1% Tween gewaschen.
Schritt 5: Colorimetrische Entwicklung
100 μl Tetramethylbenzidin (Biosource, Belgien) werden vor dem Zugeben von 100 μl Stopplösung (Biosource, Belgien), 10 Min. bei Raumtemperatur inkubiert. Die optische Dichte wird dann bei at 450 oder 405 nm mit einem Ultramark Mikroplatten Lesegerät (Biorad, CA, USA) abgelesen.
Diese Verfahrensweise kann verfolgt werden, um die DNA-Bindungsaktivität von verschiedenen Transkriptionsfaktoren im gleichen nukleären Extrakt zu quantifizieren. In 2 wurde die DNA-Bindungsaktivität von NFκB (a), CREB (b) und AP-1 (c) in den gleichen Proben gemessen, unter Befolgung der hier oben beschriebenen Verfahrensweise. Die Proben sind nukleäre Extrakte von WI- 38 VA13 Zellen, die unstimuliert blieben oder während 30 Min. mit 5 ng/ml IL-1 (einem NFκB-Aktivator), 10 μg/ml Forskolin (einem CREB-Aktivator), 0,1 μg/ml PMA +1 μM Ionomycin (ein Cocktail, der bekannt dafür ist, AP-1 zu aktivieren), oder den verschiedenen Kombinationen dieser Aktivatoren stimuliert wurden. Die Ergebnisse werden als Prozentsatz des mit dem regulären Aktivator des gemessenen Transkriptionsfaktors erhaltenen Signals ausgedrückt (zum Beispiel wird die NFκB DNA-Bindungsaktivität als der Prozentsatz der NFκB DNA-Bindungsaktivität ausgedrückt, die in mit IL-1 allein stimulierten Zellen gemessen wurde).
Die Ergebnisse zeigen deutlich, dass der colorimetrische DNA-Bindungsassay es ermöglicht, gleichzeitig die DNA-Bindungsaktivität von mehreren Transkriptionsfaktoren in der gleichen biologischen Probe zu messen.
Beispiel 2: Sensitivität des colorimetrischen DNA-Bindungsaktivitäts-Assays in Mehrfachvertiefungen (3 und 4)
Um die Sensitivität des, in Beispiel 1 beschriebenen, colorimetrischen DNA-Bindungsassays abzuschätzen, wurde der Assay mit der NFκB-spezifischen Sonde zuerst an verschiedenen Mengen von gereinigtem p50 (3) und dann an verschiedenen Mengen von nukleären Zelllysaten (4) durchgeführt.
Verschiedene Mengen von gereinigtem p50, von 10^–13 M bis 5,10^–16 M reichend, wurden in den Mikrovertiefungen inkubiert, welche die NFκB-spezifische Sonde enthielten, und der Assay wurde wie in Beispiel 1 beschrieben, unter Verwendung von anti-p50-Antikörper ausgeführt. Die in 3 gezeigten Ergebnisse zeigen deutlich, dass dieser Assay extrem empfindlich ist, da eine so geringe DNA-Bindungsaktivität wie 5,10^–16 Mol/Vertiefung von gereinigtem p50 nachgewiesen werden kann.
Die Sensitivität des colorimetrischen DNA-Bindungsassay mit Zelllysaten ist ebenfalls sehr hoch, wie in 3 gezeigt. Zellextrakte kommen entweder von unstimulierten Zellen oder von Zellen, die mit IL-1 stimuliert wurden, um zum Assay überzugehen, wie im Beispiel 1 beschrieben. In diesem Experiment schwankten die Konzentrationen zwischen 0,5 und 50 μg pro Vertiefung. Der Assay wurde parallel mit EMSA an den gleichen Proteinextrakten durchgeführt. Die in 4 gezeigten Ergebnisse zeigen deutlich, dass der NFκB DNA-Bindungsassay in Mikrovertiefungen mehr als 10 mal empfindlicher ist, als der EMSA: 5 μg Proteine waren erforderlich um ein erstes Nachweissignal durch EMSA nachzuweisen, aber weniger als 0,5 μg Proteine waren für den Mikrovertiefungs-Assay notwendig.
Beispiel 3: Mikorarray-Assay auf DNA-Bindungsaktivität von NFκB CREB in biologischen Proben
Schritt 1: Binden der Sonden an Glas
Aldehydgruppen-tragende, aktivierte Glasobjektträger wurden von AAT (Belgien) gekauft.
Die Objektträger wurden zuerst in 0,8 ml 50 μg/ml Streptavidinlösung in einem 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,4), enthaltend 10 mM NaCl (PBS₁₀ Puffer), inkubiert. Nach 1 Std. Inkubation bei 20°C, wurden die Platten 3 mal für 2 Min. in PBS₁₅₀, enthaltend 0,02% Tween 20, und dann 2 mal 2 Min. mit Wasser gewaschen. Die Platten wurden dann für 2 Std. bei 20°C in 20 ml PBS₁₅₀-Lösung, enthaltend 10 fettfreies Milchpulver, inkubiert und dann 5 mal 2 Min. in PBS₁₅₀-Lösung gewaschen.
Das Auftupfen wurde mit der NFκB-Konsensussonde oder mit der CREB-Konsensussonde wie in Beispiel 1 durchgeführt. Die Einfangsonden wurden mit einer selbstgemachten Robotervorrichtung auf die Mikroskopobjektträger gedruckt. 250 μm-Nadeln von Genetix (GB) wurden verwendet. Die Spots haben einen Durchschnitt von 400 μm im Durchmesser und das verteilte Volumen beträgt ungefähr 1 nl. Die Konzentration der verwendeten Sonden war 3000 nmolar. Objektträger wurden für 1 Std. bei Raumtemperatur inkubiert, zweimal für 2 Min. mit PBS₅₀, enthaltend 0,02% Tween 20, und dann 3 mal für 2 Min. in Wasser gewaschen.
Schritt 2: Binden des Transkriptionfaktors an die am Mikroarray fixierte, doppelsträngige Sonde
Dieser Assay wurde mit nukleären Extrakten von, mit IL-1 stimulierten oder unstimuliert gelassenen WI-38. VA 13 Fibroblasten durchgeführt. Die Zellextrakte wurden wie im Beispiel 1 beschrieben hergestellt. Die negative Kontrolle war 20 μl Lysispuffer gemischt mit 30 μl Bindungspuffer. 20 μl p50, verdünnt in Lysispuffer, oder 20 μl nukleärer Zellextrakt werden mit 30 μl Bindungspuffer (AAT, Namur, Belgien) pro Inkubationskammer inkubiert. Nach 1 Std. Inkubation bei Raumtemperatur mit einer sanften Bewegung (200 UpM. auf einem IKA MS2 Vortex, Deutschland) wurden die Arrays 3 mal gewaschen.
Schritte 3, 4 und 5: Binden von anti-NFκB an den NFκB-DNA-Komplex und Nachweis
Die Bindung des primären anti-NFκB (anti-p50) Antikörpers wurde dann für eine Reaktion auf dem Faktor verwendet, gefolgt von einem Waschschritt und einer Inkubation mit einem sekundärem Antikörper. In diesem Fall war der zweite Antikörper Gold-markiert. Nach 3 Inkubationen von 10 Min. in einer Mischung aus Silber-Verstärker A wurden die Objektträger mit Wasser gewaschen.
Es gab kein Signal für die negative Kontrolle, während in nukleären Zellextrakten, aktivierter NFκB in mit IL-1 stimulierten Zellen mit sehr viel höherer Intensität nachweisbar ist, als in unstimulierten. Die Ergebnisse, die mit nukleären Zellextrakten erhalten wurden, sind unter Verwendung eines colorimetrischen Mikroarray-Lesegeräts, einschließlich der Quantifizierungssoftware (AAT, Namur, Belgien) quantifiziert worden. Die Intensität jedes Spots wurde durch Errechnen des Durchschnitts der Werte aller Pixel innerhalb seiner Grenzen abgeschätzt. Der Wert des Hintergrundmittelwerts um den Spot herum wurde von den Spot-Werten abgezogen. Der Wert für die unstimulierten Zellen war von einer Grauintensität von 10, der für die stimulierte Zelle von einer Grauintensität von 175.
Als eine alternative Fixierung der Sonden wurden die Konsensussequenzen unter Verwendung eines am 5'-Terminus aminierten Primers aminiert und durch PCR amplifiziert, bevor sie direkt auf die Aldehyd-Glasobjektträger aufgetupft wurden. Das Nachweisverfahren wurde dann in der gleichen Weise wie hier oben fortgeführt.
Beispiel 4: Einfluss des Abstandshalters auf einen Mikroarray-Assay des NFκB- und CREB-Assays an biologischen Proben (5)
Schritt 1: Binden der Sonden an Glas
Das Binden der Sonden wurde wie im Beispiel 3 beschrieben, unter Verwendung der Konsensussequenz von NFκB oder CREB allein, oder mit einem Abstandshalter von 50, 100, 150 und 250 bp, konstruiert aus der in Beispiel 1 gegebenen Sequenz, erzielt.
Schritt 2: Binden von NFκB an die auf einem Mikroarray fixierte, doppelsträngige Sonde
Dieser Assay wurde mit Gesamtzelllysaten aus mit IL-1β (einem NFκB-Aktivator) oder 10 μg/ml Forskolin (um CREB zu aktivieren) stimulierten WI-38 VA 13 Fibroblasten durchgeführt. Die Kontrolle war 20 μl Lysispuffer gemischt mit 30 μl Bindungspuffer.
Schritte 3, 4 und 5: Binden der Antikörper und Nachweis
Das Binden der primären anti-NFκB und anti-PCREB Antikörper wurde dann für eine Reaktion auf den Faktoren verwendet, gefolgt von einem zweiten, Gold-markierten Antikörper und einem colorimetrischen Nachweis, wie in Beispiel 3. Die Ergebnisse mit größer werdender Abstandshalterlänge für den NFκB werden in 5 gezeigt. Die Figur zeigt die Gesamtlängen der fixierten DNA-Sonden. Die Werte für P-CREB mit unstimulierten Zellen betrugen 5,5 beziehungsweise 4 ohne Abstandshalter und mit einem 100 Basen Abstandshalter. Die Werte für stimulierte Zellen betrugen 7 beziehungsweise 21 ohne Abstandshalter und mit einem Abstandshalter von 100 Basenpaaren.
Beispiel 5: Verwendung des colorimetrischen DNA-Bindungsassays um nach Arzneimitteln zu suchen, die mit der DNA-Bindung interagieren (6)
Der colorimetrische DNA-Bindungsassay wurde zur Durchmusterung von Molekülen, wie Arzneimitteln verwendet, die entweder direkt mit der DNA-Bindungskapazität eines Transkriptionsfaktors oder mit dem stromaufwärts gelegenen, zellulären Aktivierungprozess eines Transkriptionsfaktors interagieren.
In 6 wurden mehrere Moleküle, die als Arzneimittel bekannt sind, auf ihre eventuelle inhibitorische Wirkung auf die DNA-Bindungskapazität von 3 Transkriptionsfaktoren durchgemustert. 5 μg nukleäre Extrakte, hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben aus a) mit IL-1 stimulierten Fibroblasten oder b) mit Forskolin stimulierten Zellen oder c) mit PMA + Ionomycin stimulierten Zellen, wurden jeweils auf die DNA-Bindungkapazität von NFκB, CREB und AP-1, in der Gegenwart oder ohne verschiedene venotrope Arzneimittel bei 10^–4 M gemessen.
Die Moleküle wurden in der folgenden Weise auf die Aktivierung der Faktoren getestet. Zellen wurden in der Gegenwart der Moleküle bei einer Konzentration von 10^–5 M für eine Stunde inkubiert, vor der Stimulierung mit IL-1, Forskolin oder PMA + Ionomycin. Nukleäre Extrakte wurden hergestellt und die Aktivität der Transkriptionsfaktoren, wie in Beispiel 1 beschrieben, gemessen. Tabelle 1: Liste von Transkriptionsfaktoren und deren Konsensussequenzen

Liste von viralen Proteinen, die an DNA binden
Abkürzungen: R = (A, g) – Y = (C, T) – M = (A, C) – K = (g, T) – S = (g, C) – H = (A, T, C) – B = (g, T, C) – D = (g, A, T) – N = (A, g, C, T) – V = (g, A, C) – X = (C, I) W = (A, T) – 0 = Sme-dC – Q = 5Br-dU – I = Inosin

Claims

Durchmusterungs- und/oder Quantifizierungsverfahren von einem oder mehreren aktivierten Transkriptionsfaktor(en) (1), unter aktivierten und nicht-aktivierten Transkriptionsfaktor(en) die in einer Zelle oder einem Zelllysat vorhanden sind, wobei das Verfahren die Schritte von: – Binden von doppelsträngigen DNA-Sequenz(en) (2) an einen unlöslichen, festen Träger (3) in der Konzentration von mindestens 0,01 pmol/cm² der Oberfläche des festen Trägers, wobei die doppelsträngige DNA-Sequenz(en) (2) eine spezifische Sequenz umfass(t)(en), die in der Lage ist, den (die) Transkriptionsfaktor(en) zu binden und mit einem Abstandshalter verknüpft ist (sind), der eine Länge von mindestens 6,8 nm aufweist, – In Kontakt bringen des (der) Transkriptionsfaktor (s)(en) mit der (den) gebundenen, doppelsträngigen DNA-Sequenz(en) (2); – Identifizieren und/oder Quantifizieren eines Signals, das sich aus der Bindung des (der) aktivierten Transkriptionsfaktor(s)(en) (1) an die doppelsträngige(n) DNA-Sequenz(en) (2) ergibt, – wobei das Signal, das sich aus der Bindung des (der) aktivierten Transkriptionsfaktor(s)(en) (1) an die doppelsträngige(n) DNA-Sequenz(en) (2) ergibt, nachgewiesen wird unter Verwendung von: – erstens einem primären Antikörper (4) oder einem hypervariablen Anteil davon, der spezifisch für den (die) aktivierten Transkriptionsfaktor(en) ist und; – einem sekundären, markierten Antikörper (5), der gegen den primären Antikörper (4) oder den spezifische hypervariablen Anteil davon gerichtet ist und – möglicherweise Identifizieren und/oder Quantifizieren eines Signals, das sich aus der Bindung von aktivierten und nicht-aktivierten Transkriptionsfaktor(en) an die doppelsträngige(n) DNA-Sequenz(en) (2) ergibt, – wobei das Signal, das sich aus der Bindung von aktivierten und nicht-aktivierten Transkriptionsfaktor(en) an die doppelsträngige(n) DNA-Sequenz(en) (2) ergibt, nachgewiesen wird unter Verwendung von: – erstens einem primären Antikörper (4) oder einem hypervariablen Anteil davon, der spezifisch für den (die) aktivierten und nicht-aktivierten Transkriptionsfaktor(en) ist und; – einem sekundären, markierten Antikörper (5), der gegen den primären Antikörper (4) oder den spezifische hypervariablen Anteil davon gerichtet ist umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der (die) aktivierte(n) Transkriptionsfaktor(en) (1) phosphorylierte oder dephosphorylierte Transkriptionsfaktor(en) sind.
Durchmusterungs- und/oder Quantifizierungsverfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der aktivierte Transkriptionsfaktor (1) ein Transkriptionsfaktor ist, welcher an ein Protein gebunden ist, das Teil seines aktiven Komplexes ist.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Protein ein Aktivator oder ein Inhibitor der Transkriptionsfaktor-Aktivierung ist.
Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der sekundäre, markierte Antikörper (5) mit einem Enzym wie einer Peroxidase konjugiert ist.
Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Abstandshalter einer doppelsträngigen DNA-Sequenz von mindestens 20 Basenpaaren entspricht.
Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Abstandshalter einer doppelsträngigen DNA-Sequenz von mindestens 50, 100, 150 oder 250 Basenpaaren entspricht.
Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Abstandshalter einem chemischen Abstandshalter von mindestens 10 Atomen entspricht.
Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Abstandshalter einem chemischen Abstandshalter von mindestens 44 Atomen, weiter bevorzugt von mindestens 50 Atomen oder mehr, entspricht.
Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Bindung der doppelsträngigen DNA- Sequenz(en) (2) an den unlöslichen, festen Träger (3) von kovalenter Art ist.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Bindung der doppelsträngigen DNA-Sequenz(en) (2) an den unlöslichen, festen Träger (3) von nicht-kovalenter Art ist und einem Bindungspaar entspricht, das ein erstes Mitglied (6) und ein zweites Mitglied (7) umfasst, wobei das erste Mitglied an die doppelsträngige DNA-Sequenz gebunden ist, das zweite Mitglied (7) an die Oberfläche des festen Trägers (3) gebunden ist, wobei das erste Mitglied (6) in der Lage ist, mit dem zweiten Mitglied (7) zu interagieren.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Bindungspaar ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Biotin/Streptavidin, Hapten/Rezeptor und Antigen/Antikörper.
Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Transkriptionsfaktor in Lösung in einer Konzentration unterhalb von 20 nmolar (nM) vorhanden ist.
Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Signal, das sich aus der Bindung des (der) aktivierten Transkriptionsfaktor(s)(en) (1) an die doppelsträngige(n) DNA-Sequenz(en) (2) ergibt, ein nicht-radioaktives Ergebnissignal ist.
Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Signal, das sich aus der Bindung des (der) aktivierten Transkriptionsfaktor(s)(en) (1) an die doppelsträngige(n) DNA-Sequenz(en) (2) ergibt, durch eine enzymatische Reaktion erhalten wird.
Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, wobei mehrere, unterschiedliche Transkriptionsfaktoren in einer gleichen biologischen Probe vorhanden sind.
Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Transkriptionsfaktoren aus der Gruppe, bestehend aus NF-KB, AP-1, CREB, SP-1, C/EBP, GR, HIF-1, Myc, NF-AT, Oct, TBP und CBF-1 oder in Tabelle 1 aufgelisteten Faktoren, ausgewählt sind.
Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche für die Durchmusterung und/oder Quantifizierung von mehreren, unterschiedlichen Transkriptionsfaktoren (1) auf einem gleichen Träger (3), vorzugsweise auf einer gleichen Platte mit mehreren Vertiefungen (Multiwell-Platte).
Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der feste Träger (3) ein Array ist, das mindestens 4 Spots/cm² Oberfläche des festen Trägers trägt, wobei jeder Spot doppelsträngige DNA-Sequenz(en) (2) zum Binden von Transkriptionsfaktor(en) (1) enthält.
Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die, auf der Trägeroberfläche fixierten, doppelsträngigen DNA-Sequenzen teilweise oder insgesamt eine oder mehrere der DNA-Konsensussequenzen enthalten, die in Tabelle 1 dargestellt wurden.
Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der (die) Transkriptionsfaktor(en) die HIV-Integrase ist.
Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, welches die Schritte des Durchmusterns, Quantifizierens und/oder Rückgewinnens von Verbindungen umfasst, die in der Lage sind, an den (die) aktivierten Transkriptionsfaktor(en) zu binden oder die Bindung von aktivierte(m)(n) Transkriptionsfaktor(en) (1) an die spezifische Sequenz auf der (den) doppelsträngigen DNA-Sequenz(en) (2), die an den festen Träger (3) gebunden sind, zu inhibieren.
Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, welches den Schritt des Durchmusterns und/oder Quantifizierens einer Verbindung umfasst, die in der Lage ist, die Aktivität des (der) aktivierten Transkriptionsfaktor(s)(en) (1) durch eine Modifikation des Grads eines Merkmals der Transkriptionsfaktor-Aktivierung zu modulieren.
Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, welches die Schritte des Durchmusterns, Quantifizierens und/oder Rückgewinnens von Verbindungen umfasst, welche die Bindung und/oder Aktivität des (der) aktivierten Transkriptionsfaktor(s)(en) (1) modulieren, wenn sie mit Zellen, Geweben oder Organismen in Kontakt gebracht werden.
Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, welches die Schritte des Durchmusterns, Quantifizierens und/oder Rückgewinnens von Verbindungen umfasst, welche die Aktivität von Enzym(en) oder Protein(en), das (die) auf Transkriptionsfaktor(en) wirk(t)(en), modulieren und dann auf die Aktivität des (der) aktivierten Transkriptionsfaktor(s)(en) getestet werden.
Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, das weiterhin den Schritt der Identifikation des (der) Transkriptionsfaktor(s)(en) und/oder von Peptiden, die Teil von deren aktivem Komplex sind, umfasst.
Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, das den Schritt der Zugabe eines extern zugefügten Transkriptionsfaktors oder einer Verbindung, die in der Lage ist, an die Konsensussequenz zu binden, zum Zelllysat umfasst.
Kit zum Durchmustern und/oder Quantifizieren von aktivierten Transkriptionsfaktor(en) (1), unter aktivierten und nicht-aktivierten Transkriptionsfaktor(en), die in einer Zelle oder einem Zelllysat vorhanden sind, oder zum Durchmustern und/oder Quantifizieren einer Verbindung, die in der Lage ist, an den (die) aktivierten Transkriptionsfaktor(en) (1) zu binden oder die Bindung des (der) aktivierten Transkriptionsfaktor(s)(en) an eine spezifische Nukleotidsequenz zu inhibieren, welche eine für Transkriptionsfaktor(en) spezifische, doppelsträngige DNA-Sequenz (2) umfasst, wobei die doppelsträngige DNA-Sequenz (2) über einen Abstandshalter, der eine Länge von mindestens 6,8 nm aufweist, an einen unlöslichen, festen Träger (3) in einer Konzentration von mindestens 0,01 pmol/cm² der Oberfläche des festen Trägers (3) gebunden ist und einen primären Antikörper (4) oder einen spezifischen hypervariablen Anteil davon, wobei beide spezifisch für die aktivierte Form des (der) Transkriptionsfaktor(s)(en) sind und möglicherweise einen sekundären, markierten Antikörper (5), der gegen den primären Antikörper (4) oder den spezifischen, hypervariablen Anteil davon gerichtet ist.
Kit zum Durchmustern und/oder Quantifizieren von aktivierten und nicht-aktivierten Transkriptionsfaktor(en) (1) nach Anspruch 28, der weiterhin einen anderen primären Antikörper (4) oder einen hypervariablen Anteil davon, der spezifisch sowohl für die aktivierten als auch die nicht-aktivierten Formen der Transkriptionsfaktoren ist, umfasst.
Kit nach Anspruch 28, wobei der sekundäre, markierte Antikörper (5) mit einem Enzym wie einer Peroxidase konjugiert ist.
Kit nach Ansprüchen 28 bis 30, umfassend einen festen Träger, der auf seiner Oberfläche eine oder mehrere doppelsträngige DNA-Sequenzen in einer Konzentration von mindestens 0,01 pmol/cm² trägt, welche teilweise oder insgesamt eine oder mehrere der in Tabelle 1 aufgelisteten Konsensussequenz(en) umfasst, unter Ermöglichung des Bindens des (der) in Lösung vorhandenen Transkriptionsfaktor(s)(en) und deren Nachweis und/oder Quantifizierung.
Kit nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche 28 bis 31, wobei der feste Träger ein Array ist, das mindestens 4 Spots/cm² der Oberfläche des festen Trägers aufweist, wobei jeder Spot doppelsträngige DNA-Sequenz(en) (2) zur Bindung des (der) aktivierten Transkriptionsfaktor(s)(en) (1) enthält.
Kit nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche 28 bis 32, wobei der Abstandshalter eine doppelsträngige DNA-Nukleotidsequenz von mindestens 20 Basenpaaren ist.
Kit nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche 28 bis 33, wobei der Abstandshalter eine doppelsträngige DNA-Nukleotidsequenz von mindestens 40 Basenpaaren ist.
Kit nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche 28 bis 34, wobei die doppelsträngige DNA-Sequenz (2) an ein erstes Mitglied (6) eines Bindungspaares (vorzugsweise Biotin) gebunden ist, welches in der Lage ist, mit einem zweiten Mitglied (7) des Bindungspaares (vorzugsweise Streptavidin), das an die Oberfläche des festen Trägers (3) gebunden ist, zu interagieren.
Kit nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche 28 bis 34, wobei die doppelsträngige DNA-Sequenz (2) kovalent an die Oberfläche des festen Trägers gebunden ist.