NL1003839C2 - Diagnostische test. - Google Patents

Description

DIAGNOSTISCHE TEST

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op diagnostische werkwijzen, die in het bijzonder bedoeld 5 zijn voor het aantonen van nucleïnezuurbindende moleculen, zoals eiwitten. De uitvinding heeft verder betrekking op kits voor het uitvoeren van de werkwijze.

Diagnostische tests maken meestal gebruik van het specifiek bindend vermogen van antilichamen om de 10 aanwezigheid van een bepaald molecuul in een monster aan te tonen. De bekendste diagnostische tests zijn de ELISA en de EIA of RIA. Om de aanwezigheid van antilichamen tegen een bekend antigeen aan te tonen wordt bij een ELISA het antigeen gekoppeld aan een vaste drager, zoals 15 een microtiterplaat. Door het monster in contact te brengen met de drager zullen antilichamen, die specifiek zijn voor het antigeen, daaraan binden. Na verwijderen van niet gebonden monstermateriaal en labeling van het gebonden antilichaam kan de binding gevisualiseerd en 20 eventueel gekwantificeerd worden.

Wanneer de aanwezigheid van een antigeen in het monster moet worden aangetoond wordt vaak gebruik gemaakt van een zogeheten sandwich ELISA. Hierbij is een antilichaam, dat specifiek is voor het te detecteren antigeen 25 aan een vaste drager gebonden. Na contact met het monster en verwijderen van niet-gebonden monstermateriaal wordt het aan het primaire antilichaam gebonden antigeen gedetecteerd met een secundair antilichaam gericht tegen een ander epitoop op het molecuul. De bruikbaarheid van deze 30 methode vereist echter wel de aanwezigheid van tenminste twee verschillende, voldoende immunogene epitopen. Sommige te detecteren moleculen zijn echter te klein of te weinig immunogeen om op deze wijze gedetecteerd te kunnen worden.

35 Een dergelijk molecuul is bijvoorbeeld het p7- eiwit van humaan immuundeficiëntievirus 1 (HIV-1). P7, ook welk NCP7 of nucleocapside genoemd, is één van de vier eiwitten, die samen het nucleocapside van het virus 1003839 2 vormen. Ze komen voort uit één 55 kDa eiwit (Pr55) dat gecodeerd wordt door het gag gen van HIV. P7 bestaat uit 55 of 72 aminozuren en de massa is ongeveer 7 kDa. Het bindt, in beginsel willekeurig, aan een stuk nucleïnezuur 5 van minimaal 6 basen lang in elke volgorde, dus bijvoorbeeld stukken nucleïnezuur van minimaal 6 basen lang verspreid over het gehele HIV RNA, maar met een hogere specificiteit aan de zogeheten T-structuur. Dit is één van de hairpin-structuren aan het begin van het HIV-1 10 RNA, die waarschijnlijk betrokken zijn bij de koppeling tussen de beide RNA moleculen van een virusdeeltje.

Doordat p7 relatief klein is, is het ook weinig immunogeen. Dit bemoeilijkt detectie van het eiwit door middel van antilichamen. De normale diagnostische tests 15 zijn daarom niet geschikt om aanwezigheid van p7 in een monster aan te tonen.

Het is het doel van de onderhavige uitvinding een diagnostische test te verschaffen voor het aantonen van (kleine of weinig immunogene), nucleïnezuurbindende 20 moleculen in het algemeen en p7 in het bijzonder in monsters, in het bijzonder van lichaamsvloeistoffen.

Dit wordt door de uitvinding bereikt door een werkwijze, omvattende het doen binden van het te detecteren molecuul aan een eerste ligande en het detecteren 25 van de binding tussen het molecuul en de eerste ligande door binding van een tweede ligande aan het molecuul, waarbij tenminste één van beide liganden een nucleïnezuur gevormd door minimaal 3 basen is. Met "nucleïnezuur" wordt in deze tekst telkens een stuk nucleïnezuur met een 30 lengte van minimaal 3 basen in willekeurige volgorde bedoeld.

De basiswerkwijze volgens de uitvinding kent een drietal algemene uitvoeringsvormen, die elk weer meerdere specifieke uitvoeringsvormen omvatten. Zo is het 35 mogelijk een nucleïnezuur voor binding en andere middelen, in het bijzonder een antilichaam, voor detectie te gebruiken, maar ook kan een antilichaam voor binding en een nucleïnezuur voor detectie gebruikt worden. Tenslotte 1003839 3 kunnen zowel binding als detectie door middel van nucleï-nezuren tot stand gebracht worden.

De eerste uitvoeringsvorm omvat: a) het in contact brengen van de lichaamsvloei-5 stof met een drager met als eerste ligande tenminste één daaraan gebonden nucleïnezuur teneinde binding tussen het aan te tonen molecuul en het nucleïnezuur mogelijk te maken, b) het zichtbaar maken van de binding tussen 10 het nucleïnezuur en het nucleïnezuurbindende molecuul door middel van tenminste één tegen het molecuul gericht antilichaam als tweede ligande, en c) het visualiseren en eventueel kwantificeren van de binding.

15 Deze werkwijze wordt geïllustreerd in Fig. lmet p7 als te detecteren eiwit.

In de tweede uitvoeringsvorm worden de functies van het nucleïnezuur en het antilichaam omgewisseld. Deze werkwijze omvat: 20 a) het in contact brengen van de lichaamsvloei stof met een drager met als eerste ligande tenminste één daaraan gebonden antilichaam gericht tegen het aan te tonen molecuul teneinde binding tussen de moleculen en het antilichaam mogelijk te maken, 25 b) het zichtbaar maken van de binding tussen het antilichaam en het nucleïnezuurbindende molecuul door middel van tenminste één het molecuul bindend nucleïnezuur als tweede ligande, en c) het visualiseren en eventueel kwantificeren 30 van de binding.

Fig. 2 geeft een schematische weergave van deze werkwijze.

De derde uitvoeringsvorm (getoond in Fig. 3) betreft een werkwijze, waarbij voor beide functie (bin-35 ding en detectie) nucleïnezuren worden toegepast, omvat: a) het in contact brengen van de lichaamsvloeistof met een drager met als eerste ligande tenminste één 1003839 4 nucleïnezuur teneinde binding tussen het molecuul en het nucleïnezuur mogelijk te maken, b) het zichtbaar maken van de binding tussen het nucleïnezuur en het nucleïnezuurbindende molecuul 5 door middel van tenminste één het molecuul bindend nucleïnezuur als tweede ligande, en c) het visualiseren en eventueel kwantificeren van de binding.

Anders dan bij de sandwich ELISA wordt de 10 primaire binding van het te detecteren molecuul aan de drager volgens de eerste uitvoeringsvorm van de uitvinding tot stand gebracht door middel van een nucleïnezuur. De secundaire binding (detectie) gebeurt in die eerste uitvoeringsvorm wel nog via een antilichaam. Het voordeel 15 is echter dat het te detecteren molecuul nog slechts één epitoop behoeft te hebben om gedetecteerd te kunnen worden. Ook de methode volgens de tweede uitvoeringsvorm heeft het bovengenoemde voordeel dat slechts één epitoop nodig is. In geval van de derde uitvoeringsvorm zijn 20 zelfs helemaal geen epitopen meer nodig. Voorwaarde is slechts dat het aan te tonen molecuul aan de gebruikte nucleïnezuren bindt, maar deze voorwaarde geldt uiteraard voor alle uitvoeringsvormen.

Het nucleïnezuur kan RNA, enkelstrengs DNA of 25 dubbelstrengs DNA zijn. De sequentie van het nucleïnezuur komt bij voorkeur tenminste ten dele overeen met die van natuurlijk voorkomend nucleïnezuur, zoals HIV-1 RNA, waarbij modificaties, die het bindend vermogen van het nucleïnezuur aan het aan te tonen molecuul niet negatief 30 beïnvloeden, toegestaan zijn.

Modificaties kunnen sequentie-modificaties of chemische modificaties zijn. Zo kunnen behalve natuurlijk voorkomende nucleïnezuren of synthetische homologen daarvan ook sequentie-gemodificeerde versies gebruikt 35 worden. Hieronder wordt in dit geval elk molecuul verstaan, dat niet in de natuur voorkomt, maar voor de test gunstige eigenschappen heeft. Als voorbeeld kan een repeterende sequentie van de voor binding relevante 1003839 5 onderdelen van een in de natuur voorkomend nucleïnezuur genoemd worden. Voor p7 zou dat bijvoorbeeld een sequentie van repeterende f-structuren kunnen zijn.

Chemische modificatie kan nodig zijn om het 5 nuclenezuur te beschermen tegen afbraak door nucleïne-zuur-afbrekende enzymen uit het monster, zoals RNase of DNase. Aanwezigheid van deze enzymen in het monster zou de test onbruikbaar kunnen maken. Voorbeelden van dergelijke tegen afbraak beschermende modificaties zijn het 10 complexeren van het RNA met vanadium.

Bescherming tegen nucleïnezuur-afbrekende enzymen kan ook tot stand gebracht worden door vóór het in contact brengen van het monster met de drager met het nucleïnezuur één of meer RNase- of DNase-remmende midde-15 len toe te voegen aan het monster of aan de drager.

Het nucleïnezuur voor detectie volgens de derde uitvoeringsvorm kan specifiek binden aan het aan te tonen molecuul, maar kan ook heel algemene (eiwit)bindende eigenschappen hebben.

20 De drager kan verschillende vormen aannemen, zoals een microtiterplaat, een kolom, een membraan of korrels. Deze laatsten kunnen bijvoorbeeld magnetische korrels zijn, zoals Dynabeads™.

Binding van het antilichaam aan het aan te 25 tonen molecuul in de eerste uitvoeringsvorm van de uitvinding kan op verschillende manieren gedetecteerd worden. De methode, die de bijzondere voorkeur verdient, is labeling van het antilichaam met een radioactief of fluorescent label of met een enzym, dat aanleiding kan 30 geven tot een kleurreactie, zoals mierikswortelperoxida-se. Een methode die werkt via een electrochemiluminesce-rend label is mogelijk als de antilichamen of de nucle-nezuren welke nodig zijn voor detectie worden gelabeld met een electrochemiluminescerend label, waarbij de 35 systematiek voor detectie hetzelfde is als van de NASBA RNA (Organon Technika, Oss). Deze stof kan energetisch worden aangeslagen door een intermediaire stof, nadat electronenoverdracht van en het electrochemiluminesceren- 1003839 6 de label en de intermediaire stof heeft plaatsgevonden via een electrode in de analysator. Als het label daarna weer energetisch terugvalt naar een normaal niveau, komt er een bepaalde hoeveelheid energie vrij, welke in de 5 vorm van een foton vrijkomt. Deze fotonen zijn te detecteren en te meten in een zogenaamde fotonvermenigvuldigs-buis (photon multiplier tube) en te kwantificeren.

In geval van de tweede en de derde uitvoeringsvorm van de uitvinding is het nucleïnezuur voor detectie 10 gelabeld. Hierbij kunnen dezelfde labels gebruikt worden als voor labeling van een antilichaam voor detectie.

Naast compleet antilichaam kunnen ook antili-chaamfragmenten, als Fv, Fab, F(ab)2, chimere of bispeci-fieke antilichamen gebruikt worden.

15 Het is voor de deskundige op dit gebied vrij eenvoudig om op basis van zijn kennis van het te detecteren molecuul een geschikt nucleïnezuur te isoleren of synthetiseren. Ook produktie van het antilichaam voor primaire binding of detectie is voor een deskundige 20 routine en wordt bijvoorbeeld beschreven in: "Antibodies, a laboratory manual" (Harlow and Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988). Binding van nucleïnezuren aan verschillende dragers kan worden uitgevoerd via een strepta-vidine-biotine binding. Dragers zijn te bekleden met 25 streptavidine en nucleïnezuur is te labelen met biotine via de inbouw van een biotine gelabeld nucleoside tri-fosfaat tijdens de synthese van het nucleïnezuur. Nadat de drager is bekleed met streptavidine voegt men met biotine gelabeld nucleïnezuur toe en de binding vindt 30 plaats. Binding van het antilichaam voor primaire binding aan de drager is standaardtechniek en wordt bijvoorbeeld beschreven in Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology. Practice and theory of enzyme immunoassays., P. Tijssen, Elsevier Amsterdam 1987. Labeling 35 van het antilichaam voor detectie is ook een op zichzelf bekende techniek (Tijssen, supra).

Labeling van nucleïnezuren voor detectie kan als volgt gebeuren. Het nucleoside tri-fosfaat GTP leent 1003839 7 zich voor een labeling met een aan een N-hydroxysuccini-midine-ester gekoppeld enzym of label. De vrije amine-groep aan dit nucleoside wordt niet gebruikt voor hybridisatie van de nucleïnezuren aan elkaar via waterstof 5 bruggen en kan dus gelabeld worden. Een andere mogelijkheid is het nucleïnezuur aan het 5'-terminale eind te labelen met een aminolinker, zodat het geactiveerde enzym of label hiermee kan reageren en binden.

Naast de werkwijzen verschaft de uitvinding 10 verder diagnostische kits voor het uitvoeren daarvan.

Heel algemeen omvat een basiskit een drager met een daaraan gebonden eerste ligande voor binding van het te detecteren molecuul en een tweede ligande voor het binden van het molecuul ter detectie van de binding tussen het 15 molecuul en de eerste ligande, waarbij tenminste één van beide ligande een nucleïnezuur is.

In de eerste algemene uitvoeringsvorm omvat de kit een drager met als eerste ligande tenminste één daaraan gebonden nucleïnezuur en middelen voor het aanto-20 nen van binding van het nucleïnezuur met het aan te tonen nucleïnezuurbindende molecuul. In een meer specifieke uitvoeringsvorm omvat de diagnostische kit een microti-terplaat als drager voor het nuclenezuur, en middelen voor het aantonen van binding van het nucleïnezuur met 25 het aan te tonen nucleïnezuurbindende molecuul. Welke deze middelen kunnen zijn is boven voor de werkwijze reeds beschreven. Bij voorkeur zijn de middelen voor detectie (gelabelde) antilichamen.

In een andere specifieke uitvoeringsvorm omvat 30 de diagnostische kit magnetische korrels als drager voor het nucleïnezuur en voor chemiluminescentie gelabelde antilichamen als de middelen voor het aantonen van binding van het nuclenezuur met het aan te tonen nucleïnezuurbindende molecuul.

35 In een nog specifiekere uitvoeringsvorm is de diagnostische kit bedoeld voor het aantonen van de aanwezigheid van HIV-1 in een lichaamsvloeistof, en omvat Dynabeads™ met een daaraan gebonden nucleïnezuur, be- 1003839 8 staande uit een repeterende sequentie van de p7-bindende psi-structuur van HIV-1, en een voor chemiluminescentie gelabeld (monoclonaal) antilichaam gericht tegen p7 voor de detectie van aan het nucleïnezuur gebonden p7 eiwit.

5 Kits volgens de tweede algemene uitvoeringsvorm van de uitvinding omvatten een drager met als eerste ligande tenminste één daaraan gebonden antilichaam gericht tegen het aan te tonen molecuul en een het aan te tonen molecuul bindend nucleïnezuur voor het aantonen van 10 binding van het antilichaam met het aan te tonen nucleï-nezuurbindende molecuul als tweede ligande.

Kits volgens de derde algemene uitvoeringsvorm omvatten een drager met als eerste ligande tenminste één daaraan gebonden eerste nucleïnezuur dat kan binden aan 15 het aan te tonen molecuul, en als tweede ligande een het aan te tonen molecuul bindend, voor detectie gelabeld tweede nucleïnezuur voor het aantonen van binding van het eerste nucleïnezuur aan het aan te tonen nucleïnezuurbin-dende molecuul.

20 Alle kits kunnen bovendien middelen bevatten voor het remmen van potentieel in het monster aanwezige nucleïnezuur-afbrekende enzymen.

De werkwijzen en kits volgens de uitvinding zijn bijzonder geschikt voor het testen van verschillende 25 lichaamsvloeistoffen, zoals bloed, serum, plasma, sperma, urine, speeksel, traanvocht, liquor of zweet.

De onderhavige uitvinding kan een grote verscheidenheid aan toepassingen hebben. In de voorbeelden zal echter alleen worden ingegaan op één specifieke 30 uitvoeringsvorm voor het aantonen van p7 in serum. Het zal de deskundige duidelijk zijn dat de vinding heel algemeen is en niet gelegen is in deze specifieke uitvoeringsvorm. Met behulp van zijn gemiddelde vakkennis zal de deskundige op dit gebied het principe van de uitvin-35 ding, namelijk het aantonen van een molecuul door gebruik te maken van het vermogen van dat molecuul om te binden aan nucleïnezuur, kunnen toepassen. Dat kan gebeuren door primaire binding aan een nucleïnezuur en detectie door 1003839 9 middel van secundaire binding aan een antilichaam, door primaire binding aan een antilichaam en detectie door secundaire binding aan een nucleïnezuur of door zowel primaire als secundaire binding aan een nucleïnezuur. De 5 hierna volgende voorbeelden zijn daarom slechts gegeven ter illustratie.

VOORBEELDEN VOORBEELD 1

Diagnostische test op basis van microtiterplaat 10 Een microtiterplaat met 96 putjes werd gecoat met volledig HIV-1 RNA door virus-gezuiverd RNA in een concentratie van 105 moleculen in 100 μΐ gedemineraliseerd en geautoclaveerd water overnacht te incuberen op kamertemperatuur. De volgende dag werden de putjes gewassen 15 met een geautoclaveerde wasbuffer, welke bestaat uit 25 Mg/ml gist tRNA, 200 mM KCl en 40 mM MgCl2 in dH20.

Vervolgens werden 25 μΐ serummonster met 100 μΐ wasbuffer en 8 serummonsters met een bekende hoeveelheid HIV-1 p7 in drievoud in de putjes gebracht. Na 45 minuten 20 incubatie bij kamertemperatuur werd het monster verwijderd en werden de putjes gewassen met wasbuffer. Hierna werd 100 μΐ met mierikswortelperoxidase gelabeld anti-HIV-l p7 antilichaam (vervaardigd, zoals beschreven in "Antibodies, a laboratory manual", supra) in de putjes 25 gebracht in een concentratie van 2 Mg/ml. Na 1 uur incuberen bij 37eC werd de antilichaamoplossing verwijderd en werden de putjes gewassen met wasbuffer.

Het te detecteren eiwit werd vervolgens gekwantificeerd door 100 μΐ substraatoplossing (OPD) in de 30 putjes te brengen. De kleurreactie, die vervolgens ontstond, werd na 30 minuten gestopt door 50μ1 van een 0.5M zwavelzuuroplossing toe te voegen. De optische dichtheid van de inhoud van de putjes werd vervolgens bij 450 nm gemeten in een spectrofotometer. De waarden van de 8 35 calibratiemonsters werden vervolgens uitgezet tegen de bekende concentratie p7, waardoor een ijklijn ontstond en de p7 concentratie in de serummonsters bepaald kon worden door de waarde af te lezen op de ijklijn.

1003839 10 VOORBEELD 2

Diagnostische test op basis van DynabeadsTM

12x75 mm buisjes met een ronde bodem werden 5 gevuld met 25 μΐ biotine-gelabeld RNA in verdunningsbuf-fer (25 Mg/ml gist tRNA, 200 mM KC1, 40 mM Mgcl2 en 5U/ml RNasin (Promega) in dH20) , 25μ1 van een oplossing van een met een electrochemiluminescerend label gelabeld anti-HIV-1 p7 antilichaam (2 μg/ml), en 25 μΐ serummonster. Er 10 werd een ijklijn gemaakt door de te testen serummonsters te vervangen door 25 μΐ serummonsters met een bekende hoeveelheid p7. Na 30 minuten bij kamertemperatuur onder continu schudden, werd 2,5 μg Dynabeads™ (M-280, gecoat met streptavidine) in 25 μΐ verdunningsbuffer toegevoegd. 15 Na 15 minuten incubatie bij kamertemperatuur onder continu schudden werd hieraan 200 μΐ assaybuffer (IGEN Ine., Gaithersburg, MD, V.S.) toegevoegd en de monsters werden geanalyseerd in de ORIGEN-analysator (IGEN Inc., Gaithersburg, MD, V.S.).

20 VOORBEELD 3

Diagnostische test met sequentie-aemodificeerd nucleïne-zuur

De test werd op dezelfde wijze uitgevoerd als 25 in Voorbeeld 2, maar in plaats van volledig RNA werd een synthetisch RNA gebruikt dat bestond uit 10 maal achter elkaar de sequentie van HIV-1hn nucleotiden 300 tot en met 337, welke sequentie de Ψ-hairpin bevat.

30 VOORBEELD 4

Diagnostische test met chemisch gemodificeerd nucleïne-zuur

Om afbraak van het nucleïnezuur door RNase tegen te gaan werd hetzelfde RNA als in Voorbeeld 3 35 gecomplexeerd met vanadyl sulfaat volgens het protocol beschreven in Maniatis, Fritsc en Sambrook, Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982.

1003839 11 VOORBEELD 5

Diagnostische test met nucleïnezuur als detectieroiddel

Voorbeelden 1 tot en met 4 betroffen diagnostische tests, waarbij het te detecteren molecuul primair 5 werd gebonden door een nucleïnezuur en secundair gedetecteerd door middel van een antilichaam. In dit voorbeeld wordt het omgekeerde geval beschreven, waarbij primaire binding plaatsvindt door middel van een antilichaam en detectie door middel van een gelabeld nucleïnezuur.

10 Een microtiterplaat met 96 putjes werd gecoat met anti-HIV-1 p7 antilichaam (vervaardigd, zoals beschreven in "Antibodies, a laboratory manual", supra) door deze met 100 μΐ van een antilichaamoplossing met een concentratie van 2 Mg/ml in gedemineraliseerd en geauto-15 claveerd water overnacht te incuberen op kamertemperatuur. De volgende dag werden de putjes gewassen met een geautoclaveerde wasbuffer, welke bestaat uit PBS/0,5% Tween-20™

Vervolgens werden 25 μΐ serummonster met 100 μΐ 20 wasbuffer en 8 serummonsters met een bekende hoeveelheid HIV-1 p7 in drievoud in de putjes gebracht. Na 60 minuten incubatie bij kamertemperatuur werd het monster verwijderd en werden de putjes gewassen met 25 μg/ml gist tRNA, 200 mM KCl, 40 mM MgCl2 en 5 U/ml RNasin (Promega) in 25 dH20. Hierna werd 100 μΐ van een oplossing van het met mierikswortelperoxidase gelabelde nucleïnezuur uit Voorbeeld 3 in de putjes gebracht in een concentratie van 105 nucleïnezuurmoleculen per 100 μΐ. Na 30 minuten incuberen bij kamertemperatuur werd de nucleïnezuuroplossing ver-30 wijderd en werden de putjes gewassen met 25 μg/ml gist tRNA, 200 mM KCl, 40 mM MgCl2 en 5 U/ml RNasin (Promega) in dH20.

Het te detecteren eiwit werd vervolgens gekwantificeerd door 100 μΐ substraatoplossing (OPD) in de 35 putjes te brengen. De kleurreactie, die vervolgens ontstond, werd na 30 minuten gestopt door 50 μΐ 0,5 M H2S04 toe te voegen. De optische dichtheid van de inhoud van de putjes werd vervolgens bij 450 nm gemeten in een spectro- 1003839 12 fotometer. De waarden van de 8 calibratiemonsters werden vervolgens uitgezet tegen de bekende concentratie p7, waardoor een ijklijn ontstond en de p7 concentratie in de serummonsters bepaald kon worden door de waarde af te 5 lezen op de ijklijn.

VOORBEELD 6

Diagnostische kit roet nucleïnezuren voor zowel binding als detectie 10 In een derde alternatieve uitvoeringsvorm volgens de uitvinding worden zowel primaire binding als secundaire binding voor detectie tot stand gebracht door middel van nuclenezuren. Dit voorbeeld illustreert deze uitvoeringsvorm.

15 Een microtiterplaat met 96 putjes werd gecoat met volledig HIV-l RNA door virus-gezuiverd RNA in een concentratie van 105 moleculen in 100 μΐ gedemineraliseerd en geautoclaveerd water overnacht te incuberen op kamertemperatuur. De volgende dag werden de putjes gewassen 20 met een geautoclaveerde wasbuffer, welke bestaat uit 25 μg/ml gist tRNA, 200 mM KC1 en 40 mM MgCl2 in dHzO.

Vervolgens werden 25 μΐ serummonster met 100 μΐ wasbuffer en 8 serummonsters met een bekende hoeveelheid HIV-1 p7 in drievoud in de putjes gebracht. Na 45 minuten 25 incubatie bij kamertemperatuur werd het monster verwijderd en werden de putjes gewassen met wasbuffer.

Hierna werd 100 μΐ van een oplossing van het met mierikswortelperoxidase gelabeld nucleïnezuur uit Voorbeeld 3 in de putjes gebracht in een concentratie van 30 105 moleculen per 100 μΐ. Na 45 minuten incuberen bij kamertemperatuur werd de nucleïnezuuroplossing verwijderd en werden de putjes gewassen met wasbuffer als boven beschreven.

Het te detecteren eiwit werd vervolgens gekwan-35 tificeerd door 100 μΐ substraatoplossing (OPD) in de putjes te brengen. De kleurreactie, die vervolgens ontstond, werd na 30 minuten gestopt door 50 μΐ 0,5 M H2S04 toe te voegen. De optische dichtheid van de inhoud van de 1003839 13 putjes werd vervolgens bij 450 nm gemeten in een spectro-fotometer. De waarden van de 8 calibratiemonsters werden vervolgens uitgezet tegen de bekende concentratie p7, waardoor een ijklijn ontstond en de p7 concentratie in de 5 serummonsters bepaald kon worden door de waarde af te lezen op de ijklijn.

1003839

Claims (15)

1. Werkwijze voor het aantonen van nucleïne-zuurbindende moleculen, in het bijzonder eiwitten, in een 5 monster van bijvoorbeeld een lichaamsvloeistof, omvattende het doen binden van het te detecteren molecuul aan een eerste ligande en het detecteren van de binding tussen het molecuul en de eerste ligande door binding van een tweede ligande aan het molecuul, waarbij tenminste 10 één van beide liganden een nucleïnezuur is.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, omvattende: a) het in contact brengen van de lichaamsvloeistof met een drager met als eerste ligande tenminste één daaraan gebonden nucleïnezuur teneinde binding tussen het 15 aan te tonen molecuul en het nucleïnezuur mogelijk te maken, b) het zichtbaar maken van de binding tussen het nucleïnezuur en het nucleïnezuurbindende molecuul door middel van tenminste één tegen het molecuul gericht 20 antilichaam als tweede ligande, en c) het visualiseren en eventueel kwantificeren van de binding.

3. Werkwijze volgens conclusie 1, omvattende: a) het in contact brengen van de lichaarosvloei- 25 stof met een drager met als eerste ligande tenminste één daaraan gebonden antilichaam gericht tegen het aan te tonen molecuul teneinde binding tussen het molecuul en het antilichaam mogelijk te maken, b) het zichtbaar maken van de binding tussen 30 het antilichaam en het nucleïnezuurbindende molecuul door middel van tenminste één het molecuul bindend nucleïnezuur als tweede ligande, en c) het visualiseren en eventueel kwantificeren van de binding.

4. Werkwijze volgens conclusie 1, omvattende: a) het in contact brengen van de lichaamsvloeistof met een drager met als eerste ligande tenminste één 1 0 0 383 9 nucleïnezuur teneinde binding tussen het molecuul en het nucleïnezuur mogelijk te maken, b) het zichtbaar maken van de binding tussen het nucleïnezuur en het nucleïnezuurbindende molecuul 5 door middel van tenminste één het molecuul bindend nucleïnezuur als tweede ligande, en c) het visualiseren en eventueel kwantificeren van de binding.

5. Werkwijze volgens één der conclusies 1-4, 10 met het kenmerk, dat het nucleïnezuur wordt gevormd door RNA en/of enkelstrengs DNA en/of dubbelstrengs DNA, of gemodificeerde versies daarvan.

6. Werkwijze volgens één der conclusies 1-5, met het kenmerk, dat de sequentie van het nucleïnezuur 15 tenminste ten dele overeenkomt met die van natuurlijk voorkomend HIV-1 RNA, waarbij modificaties, die het bindend vermogen van het nucleïnezuur aan het aan te tonen molecuul niet negatief beïnvloeden, toegestaan zijn.

7. Werkwijze volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat het aan te tonen nucleïnezuurbindende molecuul HIV-1 p7 is en het nucleïnezuur tenminste één HIV-1 p7-bindende sequentie bevat.

8. Werkwijze volgens één der conclusies 1-7, 25 met het kenmerk, dat de lichaamsvloeistof bloed, serum, plasma, sperma, urine, speeksel, traanvocht, liquor of zweet is.

9. Diagnostische kit voor het uitvoeren van de werkwijze volgens één der conclusies 1-8, omvattende een 30 drager met een daaraan gebonden eerste ligande voor binding van het te detecteren molecuul en een tweede ligande voor het binden van het molecuul ter detectie van de binding tussen het molecuul en de eerste ligande, waarbij tenminste één van beide ligande een nucleïnezuur 35 is.

10. Diagnostische kit volgens conclusie 9 voor het uitvoeren van de werkwijze volgens één der conclusies 1, 2 en 5-8, omvattende een drager met als eerste ligande 1003839 tenminste één daaraan gebonden nucleïnezuur en middelen voor het aantonen van binding van het nucleïnezuur met het aan te tonen nucleïnezuurbindende molecuul als tweede ligande.

11. Diagnostische kit volgens conclusie 10, met het kenmerk, dat de drager voor het nucleïnezuur een microtiterplaat is, en de middelen voor het aantonen van binding van het nucleïnezuur met het aan te tonen nucleïnezuurbindende molecuul antilichamen zijn.

12. Diagnostische kit volgens conclusie 10, met het kenmerk, dat de drager voor het nucleïnezuur wordt gevormd door magnetische korrels en de middelen voor het aantonen van binding van het nucleïnezuur met het aan te tonen nucleïnezuurbindende molecuul voor chemiluminescen-15 tie gelabelde antilichamen zijn.

13. Diagnostische kit volgens conclusie 12 voor het aantonen van de aanwezigheid van HIV-1 in een lichaamsvloeistof, omvattende Dynabeads™ met als eerste ligande een daaraan gebonden nucleïnezuur, bestaande uit 20 een repeterende sequentie van de p7-bindende psi-struc-tuur van HIV-1, en een voor chemiluminescentie gelabeld monoclonaal antilichaam gericht tegen p7 als tweede ligande voor de detectie van aan het nucleïnezuur gebonden p7 eiwit.

14. Diagnostische kit volgens conclusie 9 voor het uitvoeren van de werkwijze volgens één der conclusies 1, 3 en 5-8, omvattende een drager met als eerste ligande tenminste één daaraan gebonden antilichaam gericht tegen het aan te tonen molecuul en een het aan te tonen mole-30 cuul bindend, voor detectie gelabeld nucleïnezuur voor het aantonen van binding van het antilichaam met het aan te tonen nucleïnezuurbindende molecuul als tweede ligande.

15. Diagnostische kit volgens conclusie 9 voor 35 het uitvoeren van de werkwijze volgens één der conclusies 1 en 4-8, omvattende een drager met als eerste ligande tenminste één daaraan gebonden eerste nucleïnezuur dat kan binden aan het aan te tonen molecuul, en als tweede 1003839 ligande een het aan te tonen molecuul bindend, voor detectie gelabeld tweede nucleïnezuur voor het aantonen van binding van het eerste nucleïnezuur aan het aan te tonen nucleïnezuurbindende molecuul. 1003839