ES2644499T3 - Kits que comprenden aptámeros - Google Patents

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Daniel J. Schneider
Daniel T. Nieuwlandt
Sheri. K Wilcox
Dominic Zichi
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Bruce Eaton
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Description

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DESCRIPCION
Kits que comprenden aptameros Campo de la invencion
La presente invencion se refiere, en general, a metodos, dispositivos, reactivos y kits para la deteccion de una molecula diana en una muestra y, mas concretamente, a la deteccion y/o cuantificacion de una o mas moleculas diana que puedan estar contenidas en una muestra de ensayo.
Antecedentes
La siguiente descripcion proporciona un resumen de la informacion relevante para la presente invencion, y no se admite que parte de la informacion proporcionada o de las publicaciones a las que se hace referencia en el presente documento sea tecnica anterior a la presente invencion reivindicada.
Los ensayos dirigidos a la deteccion y cuantificacion de moleculas fisiologicamente significativas en muestras biologicas y otras muestras son importantes herramientas en la investigacion cientlfica y en el campo de la atencion sanitaria. Una clase de dichos ensayos incluye el uso de una micromatriz que incluye uno o mas aptameros inmovilizados sobre un soporte solido. Todos los aptameros son capaces de unirse a una molecula diana de una manera muy especlfica y con muy alta afinidad. Vease, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N° 5.475.096 titulada "Nucleic Acid Ligands"; vease tambien, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N° 6.242.246, la patente de Estados Unidos N° 6.458.543 y la patente de Estados Unidos N° 6.503.715, todas ellas tituladas "Nucleic Acid Ligand Diagnostic Biochip". Una vez que la micromatriz se pone en contacto con una muestra, los aptameros se unen a sus respectivas moleculas diana presentes en la muestra, permitiendo as! determinar la ausencia, la presencia, la cantidad y/o la concentracion de las moleculas diana en la muestra.
Una variacion de este ensayo emplea aptameros que incluyen grupos funcionales fotorreactivos que permiten a los aptameros unirse covalentemente o "fotorreticular" sus moleculas diana. Vease, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N° 6.544.776 titulada "Nucleic Acid Ligand Diagnostic Biochip”. Estos aptameros fotorreactivos tambien se conocen como fotoaptameros. Vease, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N° 5.763.177, la patente de Estados Unidos N° 6.001.577 y la patente de Estados Unidos N° 6.291.184, todas ellas tituladas "Systematic Evolution of Nucleic Acid Ligands by Exponential Enrichment: Photoselection of Nucleic Acid Ligands and Solution SELEX"; vease tambien, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N° 6.458.539, titulada "Photoselection of Nucleic Acid Ligands". Una vez puesta en contacto la micromatriz con la muestra y que los fotoaptameros hayan tenido la oportunidad de unirse a sus moleculas diana, los fotoaptameros se fotoactivan, y se lava el soporte solido para eliminar cualquier molecula unida no especlficamente. Se pueden usar condiciones duras de lavado, ya que las moleculas diana que se unen a los fotoaptameros, en general, no se eliminan, debido a los enlaces covalentes efectuados por el/los grupo/s funcional/es fotoactivado/s en los fotoaptameros. De esta manera, el ensayo permite determinar la ausencia, presencia, cantidad y/o concentracion de las moleculas diana en la muestra de ensayo.
En ambos de estos formatos de ensayo, los aptameros se inmovilizan sobre el soporte solido antes de ponerlos en contacto con la muestra. En ciertas circunstancias, sin embargo, la inmovilizacion de los aptameros antes del contacto con la muestra puede no proporcionar un ensayo optimo. Por ejemplo, la inmovilizacion previa de los aptameros puede producir la mezcla ineficaz de los aptameros con las moleculas diana sobre la superficie del soporte solido, conduciendo tal vez a largos tiempos de reaccion y, por lo tanto, a perlodos de incubacion prolongados para permitir la union eficaz de los aptameros a sus moleculas diana. Ademas, cuando se emplean fotoaptameros en el ensayo, y dependiendo del material utilizado como soporte solido, el soporte solido puede tender a dispersar o absorber la luz usada para efectuar la formacion de los enlaces covalentes entre los fotoaptameros y sus moleculas diana. Ademas, dependiendo del metodo empleado, la deteccion de moleculas diana unidas a sus aptameros puede ser objeto de imprecision, ya que la superficie del soporte solido tambien se puede exponer a y ser afectada por cualquier agente de marcaje que se use. Finalmente, la inmovilizacion de los aptameros en el soporte solido, en general, implica una etapa de preparacion del aptamero (es decir, la inmovilizacion) antes de la exposicion de los aptameros a la muestra, y esta etapa de preparacion puede afectar a la actividad o funcionalidad de los aptameros.
Por consiguiente, existe la necesidad de metodos, dispositivos, reactivos y kits que proporcionen ensayos de alta sensibilidad para la deteccion y/o la cuantificacion de moleculas diana en una muestra de ensayo mediante la optimizacion de las condiciones que afectan (1) a la actividad de los aptameros; (2) la eficacia de alcanzar equilibrios de union para complejos de aptamero-molecula diana; (3) la formacion de enlace/s covalente/s entre un aptamero y su molecula diana; y (4) la deteccion de los complejos de aptamero-molecula diana. Baldrich, E. et al., “Analytical Chemistry” (2004), 76(23):7053-7063 ensena un ensayo de aptameros ligado a una enzima.
Sekiya. S. et al. Nurcleic Acids Symposium Series n.° 46 (2005) 361-362 ensena la union de alta afinidad de aptameros anti-PrPc en presencia de ARN competidor.
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Sumario
La presente divulgacion incluye metodos, dispositivos, reactivos y kits para la deteccion y/o la cuantificacion de una o mas moleculas diana que pueden estar presentes en una muestra de ensayo. En una realization, se pone en contacto una muestra de ensayo con un aptamero que incluye un marcador y que tiene una afinidad especlfica por una molecula diana. Se permite la formation de un complejo de afinidad de aptamero que incluye un aptamero unido a su molecula diana. Si la muestra de ensayo contiene la molecula diana, normalmente, se formara un complejo de afinidad de aptamero en la muestra de ensayo. Opcionalmente, el complejo de afinidad de aptamero se convierte en un complejo covalente de aptamero que incluye un aptamero unido covalentemente a su molecula diana. Entonces, es posible detectar y/o cuantificar el complejo de afinidad de aptamero (o complejo covalente de aptamero opcional) usando cualquiera de varios metodos conocidos por un experto en la materia, incluyendo, pero sin limitation, el uso de un soporte solido, usando espectrometrla de masas, y el uso de la reaction en cadena de la polimerasa cuantitativa (Q-PCR).
En una realizacion, el complejo de afinidad de aptamero (o complejo covalente de aptamero opcional) se detecta y/o cuantifica mediante el uso de un soporte solido. En dicha realizacion, el complejo de afinidad de aptamero (o complejo covalente de aptamero opcional) se une a un soporte solido. La union se realiza poniendo en contacto el soporte solido con el complejo de afinidad de aptamero (o complejo covalente de aptamero opcional) y permitiendo la asociacion de un marcador incluido en el aptamero, ya sea directa o indirectamente, a una sonda que se una al soporte solido. A continuation, se detecta y, opcionalmente, se cuantifica el complejo de afinidad de aptamero (o complejo covalente de aptamero opcional) que se ha asociado a la sonda en el soporte solido. En cualquier momento antes de la deteccion y cuantificacion opcional, es decir, ya sea en cualquier momento antes de la union o despues de la union del complejo de afinidad de aptamero (o complejo covalente de aptamero opcional) al soporte solido, el complejo se pone en contacto con un agente de marcaje para permitir la deteccion de la molecula diana unida.
En otra realizacion, el complejo de afinidad de aptamero (o complejo covalente de aptamero opcional) se detecta y/o cuantifica usando espectrometrla de masas. En dicha realizacion, el complejo de afinidad de aptamero (o complejo covalente de aptamero opcional) se une a un soporte solido poniendo en contacto el soporte solido con el complejo de afinidad de aptamero (o complejo covalente de aptamero opcional) y permitiendo la asociacion de un marcador incluido en el aptamero, ya sea directa o indirectamente, a una sonda que se una al soporte solido. Esto facilita la division del complejo de afinidad de aptamero (o complejo covalente de aptamero opcional) del resto de la muestra de ensayo, concentrando de ese modo la molecula diana antes del analisis de espectrometrla de masas y mejorando la deteccion y la cuantificacion de los analitos de mezclas complejas usando esta herramienta analltica. A continuacion, el complejo de afinidad de aptamero (o complejo covalente de aptamero opcional) que se ha asociado a la sonda en el soporte solido se eluye y se analiza usando espectrometrla de masas, lo que produce un espectro de picos que se puede usar para identificar, y por lo tanto, detectar la molecula diana. Una vez que se ha detectado la molecula diana, opcionalmente tambien se puede detectar mediante tecnicas convencionales conocidas para un experto en la materia. En una realizacion en la que la molecula diana es una protelna, antes de usar la espectrometrla de masas para analizar el complejo de aptamero de afinidad (o el complejo covalente de aptamero opcional), el complejo de afinidad de aptamero (o complejo covalente de aptamero opcional) puede ser digerido con enzimas proteasa tales como, por ejemplo, proteinasa K o tripsina, para producir fragmentos de la molecula diana unida que luego se pueden usar para identificar la molecula diana y, por lo tanto, permitir la deteccion y cuantificacion opcional de la molecula diana.
En una realizacion adicional, el complejo de afinidad de aptamero (o complejo covalente de aptamero opcional) se detecta y/o cuantifica usando Q-PCR. En dicha realizacion, el aptamero libre de la muestra de ensayo se separa del complejo de afinidad de aptamero (o complejo covalente de aptamero opcional) antes de la deteccion y/o cuantificacion. El complejo de afinidad de aptamero (o complejo covalente de aptamero opcional) se cuantifica mediante la realizacion de PCR y la determination, ya sea directa o indirectamente, de la cantidad o concentration de aptamero que se haya unido a su molecula diana en la muestra de ensayo. En general, la cantidad o concentracion de la molecula diana en la muestra de ensayo es directamente proporcional a la cantidad o concentracion de aptamero cuantificado mediante el uso de Q-PCR. Un metodo ilustrativo que se puede emplear para cuantificar un complejo de afinidad de aptamero (o complejo covalente de aptamero opcional) de esta manera es el ensayo TaqMan® (PE Biosystems, Foster City, Calif.; vease tambien la patente de EE.UU. N° 5.210.015).
Breve descripcion de las figuras
Las Fig. 1A y 1B ilustran metodos ilustrativos para la deteccion y/o cuantificacion de una o mas moleculas diana
que pueden estar presentes en una muestra de ensayo.
Las Fig. 2A, 2B y 2C ilustran metodos ilustrativos para la deteccion y/o cuantificacion de una o mas moleculas
diana que pueden estar presentes en una muestra de ensayo.
La Fig. 3 ilustra un metodo ilustrativo para la deteccion y/o cuantificacion de una o mas moleculas diana que
pueden estar presentes en una muestra de ensayo.
La Fig. 4 muestra curvas de dosis-respuesta para diluciones en serie de VEGF en tampon (Fig. 4A) y plasma
(Fig. 4B) usando el ensayo representado en las Fig. 2A, 2B y 2C. La respuesta del tampon sin protelna se ha
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Las Fig. 5A-5J muestran curvas de dosis-respuesta para diluciones en serie de 10 protelnas diana multiplexadas con 41 fotoaptameros en tampon usando el ensayo representado en las Fig. 2A, 2B y 2C. La respuesta del tampon sin protelna para cada aptamero se ha restado de cada punto de datos en ambos conjuntos. Tambien se representa el ajuste de la llnea de mlnimos cuadrados a los datos de registro transformados. Solo se muestran los puntos de datos usados en el ajuste lineal.
Las Fig. 6A y 6B muestran mediciones repetidas en RFU para la respuesta de 57 fotoaptameros en muestras de suero para dos individuos obtenidas a partir del ensayo mostrado en las Fig. 2A, 2B y 2C. Ambas mediciones repetidas muestran una reproducibilidad muy buena de las 57 dianas medidas, produciendo correlaciones de Pearson superiores a 0,99.
La Fig. 7 muestra curvas de dosis-respuesta de tPA en tampon (•) y plasma (▲) usando un ensayo de captura de hibridacion UPS con el desaflo cinetico opcional. Se promedio la respuesta del tampon no-proteico, y se resto de ambas curvas. Para la muestra de plasma sin protelna diana anadida, la respuesta del plasma diluido sin desaflo cinetico se denota con (□) y la de desaflo cinetico se indica con (A) en tPA 0,1 pM. La respuesta medida se reduce en casi un registro debido al desaflo cinetico en plasma, mientras que la respuesta de diana-aptamero permanece invariables, como se evidencia por (o) (buffer) y (A) (plasma) en tPA 10 nM anadido.
La Fig. 8 muestra las curvas de dosis-respuesta para tPA en plasma usando el ensayo con el desaflo cinetico opcional con competidor (■) y sin (•) competidor. El valor de plasma sin protelna se representa a 0,1 pM [tPA] y se reduce en un 70 % debido a la adicion del competidor, mientras que la respuesta de la diana-aptamero permanece invariable, como lo demuestran las respuestas en tPA 30 nM, que son esencialmente iguales en presencia o ausencia de competidor.
La Fig. 9 muestra las curvas de dosis-respuesta para tres protelnas diana (tPA (Fig. 9A), PAI-1 (Fig. 9B) e IL-6 (Fig. 9C)) en tampon (•) y plasma (▲). Los valores de RFU se han corregido restando el valor de RFU del tampon sin protelna para cada aptamero. Tambien se representa el ajuste de la llnea de mlnimos cuadrados a los datos de registro transformados para los datos del tampon. Los valores de RFU del plasma sin protelna corregidos para estos aptameros (A a 1pM) son 66, 26 y 49 RFU, respectivamente.
Las Fig. 10A-10D muestran curvas de dosis-respuesta para cuatro protelnas diana reticuladas en tampon y anadidas a plasma antes de la eliminacion opcional del aptamero libre usando la precipitacion en K+/SDS (•) en comparacion con las curvas generadas sin la eliminacion del aptamero libre (■). La senal se aumenta tras la retirada del aptamero libre y, en general, el rango dinamico de las mediciones aumenta.
La Fig. 11 muestra el efecto de la reticulacion qulmica inducida por la luz de una protelna diana (bFGF) a su fotoaptamero cuando se usan detergente y una alta concentracion de sal durante la hibridacion. En ausencia de luz y, por lo tanto, en ausencia de union covalente de la diana a su fotoaptamero, la senal de ensayo se reduce mas de dos ordenes de magnitud en tampon. La concentracion endogena de bFGF es bastante baja, lo que se refleja en la baja senal sobre el control sin luz y la respuesta de fondo general.
La Fig. 12 muestra la respuesta a la dosis en tampon de una protelna diana (C4b) usando un fotoaptamero desarrollado con una biblioteca modificada de 5-bencil-dT en lugar de dT. La respuesta lineal en 3 registros de concentracion diana demuestra la actividad del aptamero nucleotido modificado en el ensayo.
La Fig. 13 muestra la curva de dosis-respuesta generada con el marcaje directo de la protelna diana (▲) o la biotinilacion seguida por estreptavidina marcada fluorescente (■) en una superficie Schott Nexterion (Fig. 13A) o una superficie de copollmero de metacrilato de (Fig. 13B). Ambas superficies funcionan bien, y las dos estrategias de marcaje son comparables.
La Fig. 14 ilustra la hibridacion de complejos de aptamero-diana bien de tampon (Fig. 14A) o suero al 10 % (Fig. 14B) y marcados con NHS-PEO4-biotina en una matriz GeneChip1® Test3 de Affymetrix. La tincion con ficoeritrina-R se realiza en una estacion de fluidos GeneChip® de Affymetrix. En tampon (Fig. 14A), el aptamero de VEGF se hibrida a la sonda 201 (1) con una intensidad de 3.500 RFU, y el aptamero de bFGF se hibrida a la sonda 1121 (2) con una intensidad de 23.000 RFU. En el suero (Fig. 14b), las intensidades relativas son de 5.000 (1) y 18.000 (2) para los aptameros de VEGF y bFGF, respectivamente.
La Fig. 15 ilustra el efecto de bloqueo de una matriz GeneChip® Test3 de Affymetrix antes de la hibridacion de los complejos de aptamero-diana de muestras de plasma. Se hibridaron sondas biotiniladas en tampon (Fig. 15A) y en muestras de plasma a las superficies bloqueadas con leche desnatada (Fig. 15B), "bloque de arranque" (Fig. 15C) y plasma no marcado (Fig. 15D). Los valores de fondo para estas cuatro superficies son 49, 300, 400 y 500 RFU, mientras que las senales de hibridacion para las tres sondas son de 16.000, 33.000 y 18.000 en (Fig. 15A) y (Fig. 15B), 17.000, 35.000 y 18.000 en (Fig. 15C) y 20.000, 36.000 y 18.000 en (Fig. 15D).
La Fig. 16 ilustra la deteccion cuantitativa de protelnas diana anadidas a plasma, reticuladas a fotoaptameros e hibridadas en una matriz GeneChip® Test3 de Affymetrix. La respuesta de hibridacion para los complejos de aptamero de las protelnas diana IL1-R4 (▲) y bFGF (■) formados en el plasma tiene restado el valor de RFU de la respuesta sin protelna. Se observa un intervalo de cuantificacion de dos registros de las muestras de plasma tras bloquear la superficie de la matriz para reducir la adsorcion de moleculas en la matriz de la muestra.
La Fig. 17 muestra los valores de respuesta a la dosis de protelnas diana para diluciones en serie de tres protelnas diana multiplexadas con fotoaptameros en tampon. Las protelnas diana reticuladas a fotoaptameros fueron capturadas a traves de la hibridacion a microesferas Luminex SeroMap™ conjugadas a sondas de oligonucleotidos especlficos. Para la cuantificacion de la senal, se uso un sistema instrumental Luminex 100 IS.
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Los valores de IFM (intensidad de fluorescencia media) se han corregido restando el valor de IMF de control sin protelna para cada aptamero.
Descripcion detallada
La practica de la invencion desvelada en el presente documento emplea, a menos que se indique lo contrario, metodos convencionales de qulmica, microbiologla, biologla molecular y tecnicas de ADN recombinante, en el nivel de experiencia de la tecnica. Dichas tecnicas se explican de manera completa en la literatura. Vease, por ejemplo, Sambrook, et al. “Molecular Cloning: A Laboratory Manual” (Edicion actual); “DNA Cloning: A Practical Approach”, vol. I & II (D. Glover, ed.); “Oligonucleotide Synthesis” (N. Gait, ed., Edicion actual); “Nucleic Acid Hybridization” (B. Hames & S. Higgins, eds., Edicion actual); “Transcription and Transition” (B. Hames & S. Higgins, eds., Edicion actual).
Todas las publicaciones, los documentos de patente publicados y las solicitudes de patente que se citan en la presente memoria descriptiva son indicativos del nivel de experiencia en la/s tecnica/s a las que pertenece la invencion.
Como se usa en la presente memoria descriptiva, incluyendo las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "uno", "una" y "el/la" incluyen las referencias en plural a menos que el contenido indique claramente lo contrario, y se usan de forma indistinta con al "al menos uno/a" y "uno/a o mas". Por lo tanto, la referencia a "un aptamero" incluye mezclas de aptameros, la referencia a "una sonda" incluye mezclas de sondas y similares.
Como se usan en el presente documento, los terminos y las expresiones "comprende", "que comprende", "incluye", "que incluye", "contiene", "que contiene" y cualquier variacion de los mismos, pretenden abarcar una inclusion no exclusiva, de modo que un proceso, metodo, proceso por producto o composicion de materia que comprende, incluye o contiene un elemento o una lista de elementos no incluye solo dichos elemento, sino que puede incluir otros elementos no enumerados expresamente o inherentes a dicho proceso, metodo, proceso por producto o composicion de materia.
La presente divulgacion incluye metodos, dispositivos, reactivos y kits para la deteccion y/o cuantificacion de una o mas moleculas diana que pueden estar presentes en una muestra de ensayo. Los metodos, dispositivos, reactivos y kits desvelados proporcionan ensayos de alta sensibilidad para la deteccion y/o cuantificacion de moleculas diana en una muestra de ensayo mediante la optimizacion de las condiciones que afectan a (1) la actividad de los aptameros; (2) la eficacia de alcanzar equilibrios de union para los complejos de aptamero-molecula diana; (3) la formacion de enlace/s covalente/s entre un aptamero y su molecula diana; y (4) la deteccion de complejos de aptamero-molecula diana.
Con referencia a las Fig. 1A y 1B, la presencia de una molecula diana en una muestra de ensayo se detecta y/o cuantifica primero mediante la puesta de contacto de una muestra de ensayo con un aptamero que tiene una afinidad especlfica por una molecula diana. Se permite la formacion de un complejo de afinidad de aptamero que incluye un aptamero unido a su molecula diana. Si la muestra de ensayo contiene la molecula diana, en general, se formara un complejo de afinidad de aptamero en la muestra de ensayo. El complejo de afinidad de aptamero se convierte opcionalmente, usando un metodo apropiado para el aptamero que se este empleando, en un complejo covalente de aptamero que incluye un aptamero unido covalentemente a su molecula diana. A continuacion, se detecta y/o cuantifica el complejo de afinidad de aptamero (o complejo covalente de aptamero opcional).
En una realizacion, el complejo de afinidad de aptamero (o complejo covalente de aptamero opcional) se detecta y/o cuantifica mediante la union del complejo de afinidad de aptamero (o complejo covalente de aptamero opcional) a un soporte solido. Con referencia a las Fig. 2A, 2B y 2C, en un metodo ilustrativo para la deteccion y/o cuantificacion de una molecula diana que puede estar presente en una muestra de ensayo, se pone en contacto una muestra de ensayo con un aptamero que incluye un marcador y que tiene una afinidad especlfica hacia una molecula diana. Se permite la formacion de un complejo de afinidad de aptamero que incluye un aptamero unido a su molecula diana. Si la muestra de ensayo contiene la molecula diana, en general, se formara un complejo de afinidad de aptamero en la muestra de ensayo. Opcionalmente, el complejo de afinidad de aptamero se convierte, usando un metodo apropiado para el aptamero que se este empleando, en un complejo covalente de aptamero que incluye un aptamero unido covalentemente a su molecula diana. El complejo de afinidad de aptamero (o complejo covalente de aptamero opcional) se une a un soporte solido. La union se realiza poniendo en contacto el soporte solido con el complejo de afinidad de aptamero (o complejo covalente de aptamero opcional), y permitiendo que el marcador incluido en el aptamero se asocie, ya sea directa o indirectamente, a una sonda que esta unida al soporte solido. A continuacion, se detecta el complejo de afinidad de aptamero (o complejo covalente de aptamero opcional) que se ha asociado a la sonda en el soporte solido y, opcionalmente, se cuantifica. En cualquier momento previo a la deteccion y la cuantificacion opcional, es decir, en cualquier momento antes de la union o despues de la union del complejo de afinidad de aptamero (o complejo covalente de aptamero opcional) al soporte solido, el complejo se pone en contacto con un agente de marcaje para permitir la deteccion de la molecula diana unida.
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Como se usa en el presente documento, "acido nucleico", "oligonucleotido" y “polinucleotido” se usan de forma indistinta para hacer referencia a un polimero de nucleotidos de cualquier longitud, y dichos nucleotidos pueden incluir desoxirribonucleotidos, ribonucleotidos y/o analogos, o desoxirribonucleotidos o ribonucleotidos modificados quimicamente. Los terminos "polinucleotido", "oligonucleotido" y "acido nucleico" incluyen moleculas bi- o monocatenarias, asi como moleculas de triple helice.
Si estan presentes, las modificaciones qmmicas de un nucleotido pueden incluir, por separado o en cualquier combinacion, modificaciones del azucar en posicion 2', modificaciones de la pirimidina en posicion 5 (por ejemplo, 5- (N-bencilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina, 5-(N-isobutilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina, 5-(N-[2-(1H-indol-3-
il)etil]carboxiamida)-2'-desoxiuridina, cloruro de 5-(N-[1-(3-trimetilamonio)propil]carboxiamida)-2'-desoxiuridina, 5-(N- naftilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina o 5-(N-[1-(2,3-dihidroxipropil)]carboxiamida)-2'-desoxiuridina), modificaciones en la purina en posicion 8, modificaciones en las aminas exociclicas, sustitucion de 4-tiouridina, sustitucion de 5-bromo- o 5-yodo-uracilo, modificaciones en la estructura, metilaciones, combinaciones inusuales de pares de bases tales como las isobases isocitidina e isoguanidina, y similares. Las modificaciones tambien pueden incluir modificaciones en 3' y 5', tales como la proteccion de los extremos. Otras modificaciones pueden incluir la sustitucion de uno o mas nucleotidos de origen natural con un analogo, modificaciones internucleotidicas tales como, por ejemplo, aquellas con enlaces sin carga (por ejemplo, fosfonatos de metilo, fosfotriesteres, fosforoamidatos, carbamatos etc.) y aquellas con enlaces cargados (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos etc.), aquellas con intercalantes (por ejemplo, acridina, psoraleno etc.), aquellas que contienen quelantes (por ejemplo, metales, metales radiactivos, boro, metales oxidativos etc.), aquellas que contienen alquilantes y aquellas con enlaces modificados (por ejemplo, acidos nucleicos a anomericos etc.). Ademas, cualquiera de los grupos hidroxilo habitualmente presente en un azucar se puede sustituir con un grupo fosfonato o un grupo fosfato; proteger con grupos protectores convencionales; o activar para preparar enlaces adicionales a nucleotidos adicionales o a un soporte solido. Los grupos OH de los extremos 5' y 3' se pueden fosforilar o sustituir con aminas, restos de grupos protectores de extremos organicos o de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 atomos de carbono, o restos de grupos protectores de extremos organicos o de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 polimeros de polietilenglicol (PEG) u otros polimeros sinteticos o biologicos hidrofilos o hidrofobos. Si esta presente, se puede efectuar una modificacion en la estructura nucleotidica antes o despues del ensamblaje de un polimero. Se puede interrumpir una secuencia de nucleotidos mediante componentes no nucleotidicos. Se puede modificar mas un polinucleotido tras la polimerizacion, tal como mediante la conjugacion con un componente marcador.
Los polinucleotidos tambien pueden contener formas analogas de azucares ribosa o desoxirribosa que se conocen en general en a tecnica, incluyendo 2'-O-metil-, 2'-O-alil, 2'-fluoro- o 2'-azido-ribosa, analogos carbociclicos de azucar, azucares a-anomericos, azucares epimericos tales como arabinosa, xilosas o lisosa, azucares de piranosa, azucares de furanosa, seudoheptulosas, analogos aciclicos y analogos de nucleosidos abasicos tales como metilrribosido. Como se ha indicado anteriormente, se pueden sustituir uno o mas enlaces de fosfodiester con grupos de enlace alternativos. Estos grupos de enlace alternativos incluyen realizaciones en las que el fosfato esta sustituido con P(O)S ("tioato"), P(S)S ("ditioato"), (O)NR2 ("amidato"), P(O)R, P(O)OR', CO o CH2 ("formacetal"), en los que cada R o R' es independientemente H o alquilo (C1-20) sustituido o no sustituido que contiene opcionalmente un enlace eter (-O-), arilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo o araldilo. No todos los enlaces de un polinucleotido tienen que ser identicos. La sustitucion de las formas analogas de azucares, purinas y pirimidinas puede ser ventajosa en el diseno de un producto final, como lo pueden ser las estructuras de armazon alternativas como, por ejemplo, una estructura de poliamida.
Como se usa en el presente documento, "aptamero" y "ligando de acido nucleico" se usan indistintamente para referirse a un acido nucleico que tiene una afinidad de union especifica por una molecula diana. Se reconoce que las interacciones de afinidad son una cuestion de grado; sin embargo, en el presente contexto, la "afinidad de union especifica" de un aptamero por su diana significa que el aptamero se une a su diana en general con un grado mucho mayor de afinidad de la que se une a otros componentes de una muestra de ensayo. Un "aptamero" es un conjunto de copias de un tipo o una especie de molecula de acido nucleico que tiene una secuencia de nucleotidos particular. Un aptamero puede incluir cualquier numero adecuado de nucleotidos. El termino "aptameros" se refiere a mas de uno de dicho conjunto de moleculas. Diferentes aptameros pueden tener el mismo o diferente numero de nucleotidos. Cualquiera de los metodos desvelados en el presente documento puede incluir el uso de uno o mas aptameros. Cualquiera de los metodos desvelados en el presente documento tambien puede incluir el uso de dos o mas aptameros que se unen especificamente la misma molecula diana. Como se describe mas adelante, un aptamero puede incluir un marcador. Si un aptamero incluye un marcador, no es necesario que todas las copias del aptamero tengan el mismo marcador. Por otra parte, si los diferentes aptameros incluyen cada uno un marcador, estos aptameros diferentes pueden tener el mismo marcador o un marcador diferente.
Los aptameros se pueden identificar usando cualquier metodo conocido, incluyendo el proceso SELEX. Vease, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N° 5.475.096 titulada "Nucleic Acid Ligands". Una vez identificado, el aptamero se puede preparar o sintetizar de acuerdo con cualquier metodo conocido, incluyendo metodos sinteticos quimicos y metodos sinteticos enzimaticos.
El termino "SELEX" y la expresion "proceso SELEX" se usan indistintamente en el presente documento para referirse en general a una combinacion de (1) la seleccion de acidos nucleicos que interactuan con una molecula
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diana de una manera deseable, por ejemplo, la union con alta afinidad a una protelna, con (2) la amplificacion de los acidos nucleicos seleccionados. Vease, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N° 5.475.096 titulada "Nucleic Acid Ligands". El proceso SELEX se puede usar para generar un aptamero que se una covalentemente a su diana, as! como un aptamero que se une de forma no covalente a su diana. Vease, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N° 5.705.337 titulada "Systematic Evolution of Nucleic Acid Ligands by Exponential Enrichment: Chemi- SELEX".
Como se desvela en el presente documento, un aptamero puede comprender ademas un "marcador", que se refiere a un componente que proporciona un medio para unir o inmovilizar un aptamero (y cualquier molecula diana unida al mismo) a un soporte solido. Un "marcador" es un conjunto de copias de un tipo o una especie de componente que es capaz de asociarse a una sonda. "Marcadores" hace referencia a mas de uno de dichos conjuntos de componentes. El marcador se puede unir a o incluir en el aptamero mediante cualquier metodo conocido en la tecnica. En general, el marcador permite que el aptamero se asocie, ya sea directa o indirectamente, a una sonda que esta unida al soporte solido. Un marcador puede permitir la localizacion de un complejo covalente en una direccion definida espacialmente sobre un soporte solido. Por lo tanto, diferentes marcadores pueden permitir la localizacion de diferentes complejos covalentes de aptamero en diferentes direcciones espacialmente definidas sobre un soporte solido. Un marcador puede ser un polinucleotido, un polipeptido, un acido nucleico peptldico, un acido nucleico bloqueado, un oligosacarido, un polisacarido, un anticuerpo, un aficuerpo, un mimetico de anticuerpo, un receptor celular, un ligando, un llpido, cualquier fragmento o derivado de estas estructuras, cualquier combination de los anteriores o cualquier otra estructura con la que una sonda (o molecula enlazadora, tal como se describe a continuation) pueda disenarse configurarse para que se una o se asocie de otro modo a especificidad. En general, un marcador esta configurado de manera que no interaccione intramolecularmente consigo mismo o con el aptamero al que esta unido o del que forma parte. Si se usa SELEX para identificar un aptamero, el marcador se puede anadir al aptamero antes o despues del SELEX. En una realization, el marcador se incluye en el extremo 5' del aptamero despues de SELEX. En otra realizacion, el marcador se incluye en el extremo 3' del aptamero despues de SELEX.
En una realizacion, el marcador incluye un polinucleotido que esta disenado para asociarse directamente a una sonda que incluye una secuencia de polinucleotido complementaria mediante la hibridacion directa con la secuencia de la sonda. En dicha realizacion, el marcador se configura de manera general y la reaction de hibridacion se lleva a cabo en condiciones tales que el marcador no se hibride con una sonda distinta de la sonda para la que el marcador incluye un complemento perfecto.
En algunas realizaciones, el marcador comprende nucleotidos que forman parte del propio aptamero. Por ejemplo, si se usa SELEX para identificar un aptamero, el aptamero incluye en general un extremo fijo 5' separado de un extremo fijo 3' por una secuencia de nucleotidos que varla, dependiendo del aptamero, es decir, una region variable. En una realizacion, el marcador puede comprender cualquier numero adecuado de nucleotidos incluidos en un extremo fijo del aptamero, tal como, por ejemplo, un extremo fijo entero o cualquier parte de un extremo fijo, incluyendo nucleotidos que son internos a un extremo fijo. En otra realizacion, el marcador puede comprender cualquier numero adecuado de nucleotidos incluidos dentro de la region variable del aptamero, tal como, por ejemplo, toda la region variable o cualquier parte de la region variable. En una realizacion adicional, el marcador puede comprender cualquier numero adecuado de nucleotidos que solapan tanto la region variable como uno de los extremos fijos, es decir, el marcador puede comprender una secuencia de nucleotidos que incluye cualquier parte de (incluyendo toda) la region variable y cualquier parte de (incluyendo todo) un extremo fijo.
En otra realizacion, un marcador se puede asociar directamente a una sonda y unirse covalentemente a la sonda, de modo que una covalentemente el aptamero a la superficie del soporte solido. En dicha realizacion, el marcador y la sonda pueden incluir grupos reactivos adecuados que, tras la asociacion del marcador a la sonda, esten lo suficientemente proximos entre si para someterse a una reaccion qulmica que produzca un enlace covalente. La reaccion puede ocurrir espontaneamente o puede requerir la activation, tal como, por ejemplo, la fotoactivacion o activation qulmica. En una realizacion ilustrativa, el marcador incluye un resto dieno y la sonda incluye un dienofilo, y la formation del enlace covalente se produce como consecuencia de una reaccion de conjugation espontanea de Diels-Alder del dieno y dienofilo. Se puede usar cualquier qulmica complementaria apropiada tal como, por ejemplo, la reaccion de N-Mannich, la formacion de disulfuro, la reaccion de Curtius, la condensation aldolica, la formacion de base de Schiff y la adicion de Michael.
En otra realizacion, el marcador se asocia indirectamente a una sonda, tal como, por ejemplo, a traves de una molecula enlazadora, como se describe mas adelante. En dicha realizacion, el marcador puede incluir una secuencia de polinucleotido que sea complementaria a una determinada region o componente de una molecula enlazadora. El marcador se configura de manera general y la reaccion de hibridacion se lleva a cabo de manera que el marcador no se hibride con una secuencia de polinucleotido distinta de la secuencia de polinucleotido incluida en la molecula enlazadora.
Si el marcador incluye un polinucleotido, el polinucleotido puede incluir cualquier numero adecuado de nucleotidos. En una realizacion, un marcador incluye al menos aproximadamente 10 nucleotidos. En otra realizacion, el marcador incluye de aproximadamente 10 a aproximadamente 45 nucleotidos. En otra realizacion mas, el marcador incluye al menos aproximadamente 30 nucleotidos. Diferentes marcadores que incluyen un polinucleotido pueden incluir ya
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sea el mismo numero de nucleotidos o un numero diferente de nucleotidos.
Como se usa en el presente documento, el termino "aproximadamente" representa una modificacion o variation irrelevante de los valores numericos de manera que la funcion basica del elemento al que el valor numerico se refiere no varla.
Como se usa en el presente documento, "asociado", "asociados" y cualquier variacion de los mismos se refiere a una interaction o complejacion entre un marcador y una sonda que produce un complejo suficientemente estable con el fin de permitir la separation de los materiales “no asociados" o no unidos, tal como, por ejemplo, los componentes no unidos de una muestra de ensayo, del complejo de marcador-sonda en condiciones de complejacion o reaction dadas. Un marcador y una sonda se pueden asociar directamente entre si mediante la interaccion y la union entre si con especificidad. Un marcador y una sonda tambien se pueden asociar entre si indirectamente de modo que su complejacion este mediada por una molecula enlazadora.
Como se usa en el presente documento, "sonda" se refiere a una molecula que esta configurada para asociarse, ya sea directa o indirectamente, a un marcador. Una "sonda" es un conjunto de copias de un tipo de molecula o un tipo de estructura multimolecular que es capaz de inmovilizar un aptamero a un soporte solido mediante la asociacion, ya sea directa o indirectamente, a un marcador. "Sondas" se refiere a mas de una de dicho conjunto de moleculas. Una sonda puede ser un polinucleotido, un polipeptido, un acido nucleico peptldico, un acido nucleico bloqueado, un oligosacarido, un polisacarido, un anticuerpo, un aficuerpo, un mimetico de anticuerpo, un receptor celular, un ligando, un llpido, cualquier fragmento o derivado de estas estructuras, cualquier combination de los anteriores o cualquier otra estructura con la que un marcador (o molecula enlazadora) se puede disenar o configurar para unirse o asociarse de otra manera a especificidad. Una sonda se puede unir a un soporte solido, ya sea covalente o no covalentemente, mediante cualquier metodo conocido en la tecnica.
En una realization, la sonda incluye un polinucleotido que tiene una secuencia que es complementaria a una secuencia de marcador de polinucleotido. En dicha realizacion, la secuencia de sonda se configura de manera general y la reaccion de hibridacion se lleva a cabo en condiciones tales que la sonda no se hibrida con una secuencia de nucleotidos distinta del marcador para el que la sonda incluye la secuencia complementaria (es decir, la sonda se configura de manera general y la reaccion de hibridacion se lleva a cabo en condiciones tales que la sonda no se hibrida con un marcador diferente o un aptamero).
En otra realizacion, la sonda se asocia indirectamente a un marcador, por ejemplo, a traves de una molecula enlazadora. En dicha realizacion, la sonda puede incluir una secuencia de polinucleotido que sea complementaria a una region o un componente particular de una molecula enlazadora. La sonda se configura de manera general y la reaccion de hibridacion se lleva a cabo de manera que la sonda no se hibrida con una secuencia de polinucleotido distinta de la secuencia de polinucleotido incluida en la molecula enlazadora.
Si una sonda incluye un polinucleotido, el polinucleotido puede incluir cualquier numero adecuado de nucleotidos. En una realizacion, una sonda incluye al menos aproximadamente 10 nucleotidos. En otra realizacion, una sonda incluye de aproximadamente 10 a aproximadamente 45 nucleotidos. En otra realizacion mas, una sonda incluye al menos aproximadamente 30 nucleotidos. Diferentes sondas que incluyen un polinucleotido pueden incluir ya sea el mismo numero de nucleotidos o un numero diferente de nucleotidos.
Como se usa en el presente documento, "molecula enlazadora" se refiere a una o mas moleculas que estan configuradas para mediar en la asociacion de un marcador a una sonda. En general, la molecula enlazadora es bifuncional en tanto en cuanto incluye una funcionalidad para la union a un marcador y una funcionalidad para la union a una sonda. Una "molecula enlazadora" es un conjunto de copias de un tipo o una especie de molecula/s o estructura/s multimolecular/es que es capaz de asociar un marcador a una sonda. La expresion "moleculas enlazadoras" se refiere a mas de una de dicho conjunto de moleculas o estructuras multimoleculares. Una molecula enlazadora puede tener cualquier configuration adecuada, y puede incluir cualquier componente adecuado, incluyendo un polinucleotido, un polipeptido, un acido nucleico peptldico, un acido nucleico bloqueado, un oligosacarido, un polisacarido, un anticuerpo, un aficuerpo, un mimetico de anticuerpo, una molecula de polietilenglicol (PEG), un receptor celular, un ligando, un llpido, cualquier fragmento o derivado de estas estructuras, cualquier combinacion de los anteriores, o cualquier otra estructura o componente qulmico que se pueda disenar o configurar para mediar una asociacion entre un marcador y una sonda con especificidad. Una molecula enlazadora puede ser alifatica o aromatica.
La composition de la molecula enlazadora no es relevante para ninguno de los metodos desvelados en el presente documento. A menudo se prefiere que la molecula enlazadora sea hidrofila. Como regla general, la longitud de una determinada molecula enlazadora se puede seleccionar para por conveniencia de la slntesis y facilidad en la mediation de la asociacion de un marcador con una sonda. La molecula enlazadora no debe contener funcionalidades, ni ser de una longitud, que vaya a interferir con las reacciones que se desean de acuerdo con los metodos desvelados.
Con referencia a las Fig. 2A, 2B y 2C, cuando se emplea una molecula enlazadora en cualquiera de los metodos
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desvelados en el presente documento, la molecula enlazadora se puede introducir en cualquier momento adecuado durante la realizacion del ensayo y se puede poner primero en contacto con un marcador o una sonda. Por ejemplo, se puede poner en contacto un marcador incluido en un aptamero con la molecula enlazadora cualquier momento previo a que un complejo de aptamero covalente entre en contacto con la sonda sobre un soporte solido. En otra realizacion, se puede poner en contacto una sonda unida a un soporte solido con una molecula enlazadora cualquier momento previo a que la sonda se exponga al marcador en un complejo covalente de aptamero. En una realizacion adicional, dependiendo de la complejidad del ensayo realizado en particular y de las condiciones de reaccion, por ejemplo, se puede poner en contacto una sonda simultaneamente tanto con una molecula enlazadora como con un marcador en un complejo covalente de aptamero.
En general, una molecula enlazadora comprende un componente de asociacion del marcador y un componente de asociacion de la sonda. El componente de asociacion del marcador y el componente de asociacion de la sonda se seleccionan de manera independiente basandose en el marcador y en la sonda utilizados en particular en un determinado ensayo. En una realizacion, el componente de asociacion del marcador es un polinucleotido que es complementario a una secuencia de polinucleotido incluida en un marcador. En otra realizacion, el componente de asociacion de la sonda es un polinucleotido que es complementario a una secuencia de polinucleotido incluida en una sonda. En una realizacion adicional, el componente de asociacion del marcador es un polinucleotido y el componente de asociacion de la sonda tambien es un polinucleotido.
En una realizacion adicional, la molecula enlazadora incluye un componente de asociacion del marcador separado de un componente de asociacion de la sonda por un tercer componente. En dicha realizacion, el tercer componente puede incluir una o mas moleculas o subcomponentes, incluyendo un polinucleotido, un polipeptido, un acido nucleico peptldico, un acido nucleico bloqueado, un oligosacarido, un polisacarido, un anticuerpo, un aficuerpo, un mimetico de anticuerpo, una molecula alifatica de carbono, una molecula de polietilenglicol (PEG), un receptor celular, un ligando, un llpido, cualquier fragmento o derivado de estas estructuras, cualquier combination de los anteriores, o cualquier otra estructura qulmica o componente que pueda ayudar en la asociacion del marcador con la sonda, tal como, por ejemplo, mediante el aumento de la flexibilidad entre el componente de asociacion del marcador y el componente de asociacion de la sonda.
Un componente de polinucleotido de una molecula enlazadora puede incluir cualquier numero adecuado de nucleotidos. En una realizacion, un componente de polinucleotido de una molecula enlazadora incluye al menos aproximadamente 10 nucleotidos. En otra realizacion, un componente de polinucleotido de una molecula enlazadora incluye de aproximadamente 10 a aproximadamente 45 nucleotidos. En otra realizacion mas, un componente de polinucleotido de una molecula enlazadora incluye al menos aproximadamente 30 nucleotidos. Las moleculas enlazadoras usadas en cualquiera de los metodos desvelados en el presente documento pueden incluir componentes de polinucleotido que tienen bien el mismo numero de nucleotidos o un numero diferente de nucleotidos.
Como se usa en el presente documento, "fotoaptamero", "ligando de acido nucleico fotorreactivo" y "aptamero fotorreactivo" se usan indistintamente para hacer referencia a un aptamero que contiene uno o mas grupos funcionales fotorreactivos que se pueden unir de forma covalente o "reticular" con una molecula diana. Por ejemplo, un resto de acido nucleico de origen natural se puede modificar para que incluya un grupo funcional qulmico que confiera fotorreactividad al resto de acido nucleico tras la exposition a una fuente de radiation de una longitud de onda adecuada. Los fotoaptameros se pueden identificar y/o preparar usando cualquier metodo conocido. En algunas realizaciones, se identifica un aptamero fotorreactivo usando el proceso fotoSELEX. Vease, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N° 5.763.177, la patente de Estados Unidos N° 6.001.577 y la patente de Estados Unidos N° 6.291.184, toda ellas tituladas "Systematic Evolution of Nucleic Acid Ligands by Exponential Enrichment: Photoselection of Nucleic Acid Ligands and Solution SELEX"; vease tambien, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N° 6.458.539, titulada "Photoselection of Nucleic Acid Ligands”. En otras realizaciones, se prepara un aptamero y se modifica posteriormente para incorporar uno o mas grupos funcionales fotorreactivos, generando de este modo un fotoaptamero. En dichas realizaciones, se pueden incorporar uno o mas restos de acidos nucleicos fotorreactivos en un aptamero bien mediante la sustitucion de un resto de acido nucleico fotorreactivo en el lugar de uno o mas de otros nucleotidos, tales como uno o mas de los nucleotidos timidina y/o citidina en el aptamero, por ejemplo, o mediante la modification de uno o mas restos de acidos nucleicos para incluir un grupo funcional fotorreactivo.
Los grupos funcionales fotorreactivos ilustrativos que se pueden incorporar a un fotoaptamero incluyen 5- bromouracilo, 5-yodouracilo, 5-bromoviniluracilo, 5-yodoviniluracilo, 5-azidouracilo, 4-tiouracilo, 5-tiouracilo, 4- tiocitosina, 5-bromocitosina, 5-yodocitosina, 5-bromovinilcitosina, 5-yodovinilcitosina, 5-azidocitosina, 8-
azidoadenina, 8-bromoadenina, 8-yodoadenina, 8-azidodoguanina, 8-bromoguanina, 8-yodoguanina, 8-
azidohipoxantina, 8-bromohipoxantina, 8-yodohipoxantina, 8-azidoxantina, 8-bromoxantina, 8-yodoxantina, 5-[(4- azidofenacil)tio]citosina, 5-[(4-azidofenacil)tio]uracilo, 7-deaza-7-yodoadenina, 7-deaza-7-yodoguanina, 7-deaza-7- bromoadenina y 7-deaza-7-bromoguanina.
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Ademas de estos grupos funcionales fotorreactivos basados en nucleosidos de ejemplo, tambien se pueden usar otros grupos funcionales fotorreactivos que se pueden anadir a un extremo terminal de un aptamero usando una molecula enlazadora adecuada. Dichos grupos funcionales fotorreactivos incluyen benzofenona, antraquinona, 4- azido-2-nitroanilina, psoraleno, derivados de cualquiera de estos, y similares.
Un grupo funcional fotorreactivo incorporado a un fotoaptamero se puede activar mediante cualquier metodo adecuado. En una realizacion, un fotoaptamero que contiene un grupo funcional fotorreactivo se puede reticular con su diana mediante la exposicion del complejo de afinidad de fotoaptamero a una fuente de radiacion electromagnetica. Los tipos adecuados de radiacion electromagnetica incluyen luz ultravioleta, luz visible, rayos X y rayos g. Las fuentes de radiacion adecuadas incluyen fuentes que utilizan luz monocromatica o luz policromatica filtrada.
En una realizacion, un nucleotido fotorreactivo, tal como 4-azido-2-nitroanilina, por ejemplo, se puede incorporar a un fotoaptamero, y se pueden usar luz que tiene una longitud de onda que varla de aproximadamente 325 nm a aproximadamente 470 nm para irradiar una complejo de afinidad de fotoaptamero que incluye este fotoaptamero. La excitacion a estas longitudes de onda se puede lograr, por ejemplo, con diodos emisores de luz (LED) de bajo coste, usando ya sea un solo LED o una matriz de LED, ya que los requisitos de potencia son moderados. Luz casi monocromatica que tiene una longitud de onda que varla de 465 a 475 nm, un angulo de vision de 100 grados y que proporciona 38 lumenes de luz es suministrada por uno o mas LED de alta potencia. En el caso de que un grupo funcional fotorreactivo deseado no se pueda excitar a una longitud de onda producida por un LED, normalmente, se puede usar la sustitucion adecuada de grupos aceptores de electrones o donantes de electrones para cambiar moderadamente la longitud de onda de excitacion del grupo funcional fotorreactivo con el fin de permitir la excitacion del grupo funcional fotorreactivo a una longitud de onda producida por un LED.
En una realizacion, se incorpora un nucleotido fotorreactivo a un fotoaptamero, y se puede usar luz que tiene una longitud de onda que varla de aproximadamente 300 nm a aproximadamente 350 nm para irradiar un complejo de afinidad de fotoaptamero que incluya esta fotoaptamero para convertir el complejo de afinidad de fotoaptamero en un complejo covalente de fotoaptamero.
En una realizacion, un nucleotido fotorreactivo, tal como un 5-yodouracilo o una 5-yodocitosina, por ejemplo, se puede incorporar a un fotoaptamero, y se puede usar luz que tiene una longitud de onda que varla de aproximadamente 320 nm a aproximadamente 325 nm para irradiar un complejo de afinidad de fotoaptamero que incluye dicho fotoaptamero. Esta combinacion facilita la fotorreticulacion selectiva del fotoaptamero que contiene cromoforo a la molecula diana sin inducir otras fotorreacciones no especlficas. Por ejemplo, en el caso de la protelna diana, ningun resto de triptofano que se pudiera incluir en la protelna diana ni ninguna base de timina y uracilo que se pudiera incluir en el fotoaptamero puede ser tambien fotorreactivo. Dado que el 5-yodouracilo o la 5-yodocitosina absorbe la luz que tiene una longitud de onda de aproximadamente 325 nm, pero el triptofano y las bases de acidos nucleicos de origen natural no lo hacen, el uso de luz de esta longitud de onda permite una fotorreaccion selectiva en el/los 5-yodouracilo/s o la/s 5-yodocitosina/s dentro del complejo de afinidad de fotoaptamero. Se puede suministrar luz monocromatica que tiene una longitud de onda que varla de aproximadamente 320 nm a aproximadamente 325 nm, por ejemplo, mediante laser de colorante sintonizable de doble frecuencia emisor de luz a una longitud de onda de aproximadamente 320 nm o mediante un laser de helio y cadmio emisor de luz a una longitud de onda de aproximadamente 325 nm.
En una realizacion adicional, un complejo de afinidad de fotoaptamero se puede exponer a un laser excimer de cloruro de xenon (XeCl) configurado para emitir luz a una longitud de onda de aproximadamente 308 nm. En dicha realizacion, el fotoaptamero puede incluir un grupo funcional fotorreactivo (por ejemplo, un 5-bromouracilo o una 5- bromocitosina), y el tratamiento del complejo de afinidad de fotoaptamero con la fuente de luz sirve para fotoactivar el grupo funcional fotorreactivo de manera que el fotoaptamero se reticula con su molecula diana y se forma un complejo covalente de fotoaptamero.
En otra realizacion mas, un fotoaptamero se puede reticular con su diana mediante la exposicion de un complejo de afinidad de fotoaptamero a una lampara de mercurio de alta presion configurada para emitir luz a una longitud de onda de aproximadamente 313 nm. En otras realizaciones, se pueden emplear filtros de longitud de onda para restringir la luz emitida para que sea superior a aproximadamente 300 nm con el fin de reducir al mlnimo la activacion de cromoforos distintos de los incluidos en un complejo de afinidad de fotoaptamero.
En una realizacion adicional, un fotoaptamero se pueden reticular a su diana mediante la exposicion de un complejo de afinidad de fotoaptamero a una lampara de mercurio de baja presion configurada para emitir luz a una longitud de onda de aproximadamente 254 nm, que luego se absorbe por un fosforo y se vuelve a emitir a una longitud de onda que varla de aproximadamente 300 nm a aproximadamente 325 nm. En dicha realizacion, la luz remitida se filtra para eliminar cualquier luz de aproximadamente 254 nm que no sea absorbida por el fosforo, as! como cualquier luz de longitudes de onda que varlan de aproximadamente 290 nm a aproximadamente 305 nm, que pueda ser perjudicial para una protelna diana.
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En otra realization mas, un grupo funcional fotorreactivo de halogeno, tal como, por ejemplo, un yodouracilo o una bromocitosina se puede incorporar a un fotoaptamero, y un complejo de afinidad de fotoaptamero que incluye este fotoaptamero se puede tratar con luz que tenga una longitud de onda que varle de aproximadamente 350 nm a aproximadamente 400 nm. Por ejemplo, se puede usar la luz monocromatica del tercer armonico de un laser de neodimio YAG configurado a aproximadamente 355 nm o luz monocromatica del primer armonico de un laser excimer de fluoruro de xenon (XeF) a aproximadamente 351 nm.
Como se usa en el presente documento, "molecula diana" y "diana" se usan indistintamente para referirse a cualquier molecula de interes a la que un aptamero puede unirse con alta afinidad y especificidad, y que puede estar presente en una muestra de ensayo. Una "molecula de interes" incluye cualquier variation menor de una determinada molecula tal como, en el caso de una protelna, por ejemplo, las variaciones menores de la secuencia de aminoacido, la formation de enlaces disulfuro, la glucosilacion, la lipidacion, la acetilacion, la fosforilacion o cualquier otra manipulation o modification, tal como la conjugation con un componente de marcaje que no altere sustancialmente la identidad de la molecula. Una "molecula diana" o "diana" es un conjunto de copias de un tipo o una especie de molecula o estructura multimolecular que es capaz de unirse a un aptamero. La expresion "moleculas diana" o "dianas" se refiere a mas de una de dicho conjunto de moleculas. Las moleculas diana ilustrativas incluyen protelnas, polipeptidos, acidos nucleicos, hidratos de carbono, llpidos, polisacaridos, glucoprotelnas, hormonas, receptores, antlgenos, anticuerpos, aficuerpos, mimeticos de anticuerpos, virus, patogenos, sustancias toxicas, sustratos, metabolitos, analogos en estado de transition, cofactores, inhibidores, farmacos, colorantes, nutrientes, factores de crecimiento, celulas, tejidos, y cualquier fragmento o parte de cualquiera de los anteriores. Se pueden identificar aptameros para practicamente cualquier molecula qulmica o biologica de cualquier tamano y, por lo tanto, casi cualquier producto qulmico o molecula biologica de cualquier tamano puede ser una diana adecuada. Tambien es posible modificar una diana para mejorar la probabilidad o la fuerza de una interaction entre la diana y el aptamero. En realizaciones ilustrativas, la molecula diana es una protelna. Vease la patente de Estados Unidos N° 6.376.190 titulada "Modified SELEX Processes Without Purified Protein" para los metodos en los que la diana del SELEX es un peptido.
Los terminos "polipeptido", "peptido" y "protelna" se usan indistintamente en el presente documento para hacer referencia a pollmeros de aminoacidos de cualquier longitud. El pollmero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoacidos modificados y/o puede estar interrumpido por no aminoacidos. Los terminos tambien abarcan un pollmero de aminoacidos que se ha modificado de forma natural o artificial; por ejemplo, mediante la formation de puentes disulfuro, glucosilacion, lipidacion, acetilacion, fosforilacion o cualquier otra manipulation o modification, tal como conjugation con un componente de marcaje. Tambien se incluyen dentro de la definition, por ejemplo, los polipeptidos que contienen uno o mas analogos de un aminoacido (incluyendo, por ejemplo, aminoacidos no naturales etc.), as! como otras modificaciones conocidas en la tecnica. Los polipeptidos pueden ser de cadenas sencillas o cadenas asociadas.
Como se usan en el presente documento, "molecula no diana" y "no diana" se usan indistintamente para referirse a una molecula contenida en una muestra de ensayo que puede formar un complejo no especlfico con un aptamero. Una "molecula no diana" o "no diana" es un conjunto de copias de un tipo o una especie de molecula o estructura multimolecular que es capaz de unirse a un aptamero. La expresion "moleculas no diana" o "no dianas" se refieren a mas de una de dicho conjunto de moleculas. Se apreciara que una molecula que es una no diana para un primer aptamero puede ser una diana para un segundo aptamero. Del mismo modo, una molecula que es una diana para el primer aptamero puede ser una no diana para el segundo aptamero.
Como se usa en el presente documento, la expresion "complejo de afinidad de aptamero" se refiere a un complejo no covalente que se forma por la interaction de un aptamero con su molecula diana. Un "complejo de afinidad de aptamero" es un conjunto de copias de un tipo o una especie de complejo formado por un aptamero unido a su correspondiente molecula diana. La expresion "complejos de afinidad de aptamero" se refiere a mas de uno de dicho conjunto de complejos. En general, un complejo de afinidad de aptamero se puede invertir o disociar mediante un cambio en una condition ambiental, por ejemplo, un aumento de la temperatura, un aumento en la concentration de sal o una adicion de un desnaturalizante.
Como se usa en el presente documento, la expresion "complejo covalente de aptamero" se refiere a un complejo de afinidad de aptamero en el que el aptamero ha sido inducido a formar o forma de otro modo un enlace covalente con su molecula diana. Un "complejo covalente de aptamero" es un conjunto de copias de un tipo o una especie de complejo formado por un aptamero unido covalentemente con su correspondiente molecula diana. La expresion "complejos covalentes de aptamero" se refiere a mas de uno de dicho conjunto de complejos. Es posible inducir un enlace covalente entre un aptamero y su molecula diana mediante la fotoactivacion de un resto qulmico en el aptamero, incluyendo aquellos restos descritos anteriormente con respecto a los fotoaptameros. Tambien es posible inducir un enlace covalente entre un aptamero y su molecula diana qulmicamente. Los grupos qulmicos que se pueden incluir en un aptamero y usar para inducir un enlace covalente con la diana incluyen, pero sin limitation, aldehldos, maleimidas, derivados de acrililo, derivados de diazonio, tioles, etc. En algunas realizaciones, los grupos qulmicos de reticulation, tales como las sales de maleimida o diazonio, por ejemplo, pueden convertir los complejos de afinidad de aptamero en complejos covalentes de aptamero simplemente proporcionando el ambiente adecuado y la yuxtaposicion de grupos reactivos requeridos para que se produzca la reactividad qulmica especlfica y
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suficientemente aumentada. En otras realizaciones, los reticulantes qulmicos tales como los grupos aidehldo pueden requerir la adicion de otro componente, por ejemplo, cianoborohidruro de sodio, para convertir los complejos de afinidad de aptamero en complejos covalentes estables de aptamero, irreversibles. En otras realizaciones mas, no se incluyen dichos reticulantes qulmicos en un aptamero; mas bien, se usa un tercer reactivo para convertir un complejo de afinidad de aptamero en un complejo covalente de aptamero facilitando una union covalente entre el aptamero y su diana. Por ejemplo, un reactivo homo- o heterobifuncional que contiene tanto un resto de amina reactiva (por ejemplo, un N-hidroxisuccinimidilester, un aldehldo o un imidato) como un grupo nucleosido reactivo (por ejemplo, una yodoacetamida o un aldehldo activado) puede inducir la formacion de complejos covalentes de un complejo de afinidad de aptamero tal como un complejo de afinidad formado por un aptamero y una protelna diana.
En el presente documento, la expresion "muestra de ensayo" se refiere a cualquier material, solucion o mezcla que contenga una pluralidad de moleculas y pueda incluir al menos una molecula diana. La expresion “muestra de ensayo” incluye muestras biologicas, como se define a continuacion, y muestras que se pueden usar para ensayos ambientales o de toxicologla, tales como el agua contaminada o potencialmente contaminada y efluentes industriales, por ejemplo. Una muestra de ensayo tambien puede ser un producto final, un producto intermedio o un subproducto de un proceso de preparacion, por ejemplo, un proceso de fabricacion. Una muestra de ensayo puede incluir cualquier medio adecuado de ensayo, tampon o diluyente que se haya anadido a un material, una solucion o una mezcla obtenida a partir de un organismo o de alguna otra fuente (por ejemplo, el medio ambiente o una fuente industrial).
La expresion "muestra biologica" se refiere a cualquier material, solucion, o mezcla obtenida a partir de un organismo. Esto incluye sangre (incluyendo sangre entera, leucocitos, celulas mononucleares de sangre periferica, plasma y suero), esputo, aliento, orina, semen, saliva, llquido menlngeo, llquido amniotico, llquido glandular, llquido linfatico, aspirado de llquido del pezon, aspirado bronquial, llquido sinovial, aspirado articular, celulas, un extracto celular y llquido cefalorraquldeo. Esto tambien incluye fracciones separadas experimentalmente de todo lo anterior. La expresion "muestra biologica" tambien incluye materiales, soluciones o mezclas que contienen material solido homogeneizado, tales como procedentes de una muestra de heces, una muestra de tejido o una biopsia de tejido, por ejemplo. La expresion "muestra biologica" tambien incluye materiales, soluciones o mezclas derivadas de un cultivo de tejido, cultivo celular, cultivo bacteriano o cultivo viral.
La expresion "soporte solido" se refiere a cualquier sustrato que tenga una superficie a la que las moleculas se puedan unir, directa o indirectamente, a traves de enlaces covalentes o no covalentes. El soporte solido puede incluir cualquier material de sustrato que sea capaz de proporcionar soporte flsico a las sondas que estan unidas a la superficie. En general, el material puede soportar condiciones relativas a la union de las sondas a la superficie y cualquier tratamiento, manipulacion o procesamiento posterior encontrado durante la realizacion de un ensayo. Los materiales pueden ser de origen natural, sintetico, o una modificacion de un material de origen natural. Los materiales de soporte solido adecuados pueden incluir silicio, grafito, superficies especulares, laminados, ceramicas, plasticos (incluyendo pollmeros tales como, por ejemplo (cloruro de poli(vinilo), copollmeros de cicloolefina, poliacrilamida, poliacrilato, polietileno, polipropileno, poli(4-metilbuteno), poliestireno, polimetacrilato, poli(tereftalato de etileno), politetrafluoroetileno (PTFE o Teflon®), nylon, poli(butirato de vinilo), germanio, arsenuro de galio, oro, plata etc., usados por si solos o junto con otros materiales. Se pueden considerar materiales rlgidos adicionales, tales como vidrio, incluyendo sllice y ademas incluyendo, por ejemplo, vidrio que esta disponible como Bioglass. Otros materiales que se pueden emplear incluyen materiales porosos tales como, por ejemplo, esferas de vidrio de poro controlado. Tambien se contempla cualquier otro material conocido en la tecnica que sea capaz de tener uno o mas grupos funcionales, tales como cualquiera de un grupo funcional amino, carboxilo, tiol o hidroxilo, por ejemplo, incorporado en su superficie.
El material usado para un soporte solido puede adoptar cualquiera de varias configuraciones que varlan de sencillas a complejas. El soporte solido puede tener una cualquiera de una serie de formas, incluyendo una tira, placa, disco, rodillo, partlcula, incluyendo esferas, tubos, pocillos y similares. Normalmente, el material es relativamente plano, tal como, por ejemplo, un portaobjetos, aunque puede ser esferico, por ejemplo, una esfera, o cillndrico (por ejemplo, una columna). En muchas realizaciones, en general, el material tiene forma de un solido rectangular. Es posible sintetizar multiples disposiciones predeterminadas tales como, por ejemplo, matrices de sondas, sobre una lamina, que luego se troquelan, es decir, se cortan a lo largo de llneas marcadas en sustratos de matriz individuales. Los ejemplos de soportes solidos que se pueden usar incluyen pocillos de microtitulacion, portaobjetos de microscopio, membranas, perlas paramagneticas, papel cargado, pellculas de Langmuir-Blodgett, microplacas de obleas de silicio, microplacas de flujo continuo y microperlas.
Normalmente, la superficie del soporte solido es la parte externa del material de sustrato que forma el soporte solido. La superficie del soporte solido sobre la que se unen las sondas puede ser lisa o sustancialmente plana, o tener irregularidades tales como depresiones, surcos, elevaciones u otras texturas. La superficie se puede modificar con una o mas capas diferentes de compuestos que sirven para modificar las propiedades de la superficie de una manera deseada. En diversas realizaciones, dichas capas de modificacion de la superficie, cuando estan presente, en general, pueden variar de espesor de un espesor monomolecular a aproximadamente 1 mm, o de un espesor monomolecular a aproximadamente 0,1 mm, o de un espesor monomolecular a aproximadamente 0,001 mm.
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Las capas de modificacion de la superficie de interes incluyen capas inorganicas y organicas, tales como metales, oxidos metalicos, poKmeros, moleculas organicas pequenas, y similares. Las capas polimericas de interes incluyen copoKmeros de metacrilato, poliacrilamidas, polisacaridos, fosfohpidos, poliuretanos, poliesteres, policarbonatos, poliureas, poliamidas, polietilenaminas, sulfuros de poliarileno, polisiloxanos, poliimidas, poliacetatos, y similares, donde los polimeros pueden ser homo- o heteropolimericos y pueden no tener restos funcionales separados unidos a los mismos (por ejemplo, restos conjugados). Otras modificaciones de la superficie de interes incluyen redes tridimensionales tales como hidrogeles, por ejemplo. Se puede usar cualquier hidrogel adecuado conocido en la tecnica. Vease, por ejemplo, la publicacion de solicitud de patente de Estados Unidos N° 2003/0218130 titulada "Biochips with Surfaces Coated with Polysaccharide-Based Hydrogels", la publicacion de solicitud de patente de Estados Unidos N° 20050147994 titulada "Method for Immobilizing a Biologic in a Polyurethane-Hydrogel Composition, a Composition Prepared from the Method, and Biomedical Applications", la publicacion de solicitud de patente de Estados Unidos N° 2005005908 titulada "Photocrosslinked Hydrogel Blend Surface Coatings", y cualquiera de las referencias citadas en estas publicaciones.
En una realizacion, la superficie de un soporte solido incluye un hidrogel. El hidrogel puede comprender, por ejemplo, una matriz de polimero. El hidrogel se puede unir quimicamente a la superficie del soporte solido y puede incluir una funcionalidad de union que sea capaz de unir, ya sea directa o indirectamente, una sonda al hidrogel. Las funcionalidades de union ilustrativas incluyen un grupo hidrofobo, un grupo hidrofilo, grupos reactivos tales como aldehidos, epoxi, carbonatos y similares, un carboxilo, un tiol, un sulfonato, un sulfato, un amino, un amino sustituido, un fosfato, un grupo quelante de metales, un tioeter, una biotina, un boronato, etc.
Tambien se puede usar cualquier superficie adecuada para la expresion de genes o el analisis de SNP, incluyendo los sustratos y las superficies ofrecidos, por ejemplo, por Affymetrix, General Electric (por ejemplo, CodeLink), Agilent y Schott Nexterion, ya sea como sustratos y superficies o como componentes de productos que comprenden ademas otros componentes.
Una sonda se puede unir a la superficie del soporte solido de cualquier manera adecuada, siempre y cuando la sonda no deje de estar unida durante las etapas de incubacion y procesamiento posteriores de acuerdo con los metodos desvelados, tales como el lavado de la superficie para eliminar los complejos no especificos , por ejemplo. La sonda se puede unir estando unida no covalentemente, por ejemplo, adherida, absorbida, adsorbida, o estando unida covalentemente a la superficie del soporte solido. En el caso de una union covalente de la sonda al soporte solido, la superficie del soporte solido contendra un grupo funcional que se une a la sonda. La naturaleza del/ de los grupo/s funcional/es usado/s depende de la naturaleza de la sonda. Se ha informado de varios metodos para la union covalente de moleculas a una superficie. Por lo general, estas reacciones se llevan a cabo mediante la reaccion de un grupo funcional activo en una molecula con un grupo funcional activado en la superficie. Como ejemplo, un compuesto que contiene amina se puede unir a un acido carboxilico que contenga superficie mediante la formacion de un ester activado del acido carboxilico, tal como un derivado de N-hidroxisuccinimida. La amina reacciona facilmente con este ester activado para formar un enlace de amida estable. Esta reaccion es util en condiciones en las que la reaccion con la amina deseada es significativamente mas rapida que con otros nucleofilos del sistema.
Los ejemplos de metodos que se han descrito previamente en la tecnica incluyen la activacion de superficies con bromuro de cianogeno, esteres de N-hidroxisuccinimida, carbonildiimidazol, carbodiimidas, azlactonas, cloruros cianuricos, cloruros de sulfonilo organicos, divinilsulfona, esteres de nitrofenilo, yodoacetilo, maleimida, epoxi, hidrazida, aminacion reductora, sales de diazonio y condensaciones de Mannich. Las moleculas que reaccionan con la superficie activada incluyen aminas, alcoholes, acidos carboxilicos, tioles, carbonilos y compuestos que contienen hidrogenos activos.
En una realizacion, las sondas se unen a la superficie del soporte solido en una disposicion o un patron espacial predeterminado, lo que significa cualquier disposicion en la superficie donde se conocia la identidad de una sonda en una determinada ubicacion. En una realizacion, la disposicion predeterminada es una matriz. Una matriz en general incluye cualquier disposicion uni-, bi- o tridimensional de las regiones direccionables que llevan una sonda particular asociada a esa region. Una matriz es direccionable en tanto en cuanto tiene multiples regiones de diferentes sondas, de manera que una region o caracteristica o punto de la matriz en una ubicacion o direccion predeterminada en particular de la matriz detecta un determinado complejo covalente de aptamero, y por lo tanto, una determinada molecula diana, en virtud de su asociacion especifica con el marcador en dicho complejo covalente de aptamero.
Un conjunto de matrices de la superficie de un soporte solido se refiere a una o mas matrices dispuestas a lo largo de una superficie de un soporte solido individual, que estan separadas por zonas intermatriciales. Normalmente, la superficie del soporte solido opuesta a la superficie con las matrices (superficie opuesta) no porta ninguna matriz. Las matrices se pueden disenar para el ensayo de cualquier tipo de muestra de ensayo. La superficie del soporte solido puede portar al menos una, dos, cuatro, veinte, cien o al menos quinientas matrices. Dependiendo del uso previsto, cualquiera o todas las matrices pueden ser iguales o diferentes entre si, pudiendo contener cada una multiples puntos o caracteristicas de sondas dispuestas sobre las mismas. Una matriz tipica puede contener mas de diez, mas de cien, mas de mil o diez mil caracteristicas, o incluso mas de cien mil caracteristicas, en una zona de
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menos de aproximadamente 20 cm2 o incluso menos que aproximadamente 10 cm2. Por ejemplo, las caracterlsticas pueden tener anchuras (es decir, diametro, para una mancha circular) en el intervalo de aproximadamente 10 pm a aproximadamente 1,0 cm. En otras realizaciones, cada caracterlstica puede tener una anchura en el intervalo de aproximadamente 1,0 pm a aproximadamente 1,0 mm, o de aproximadamente 5,0 pm a aproximadamente 500 pm, o de aproximadamente 10 pm a aproximadamente 200 pm. Las caracterlsticas no circulares pueden tener intervalos de superficies equivalentes a los de las caracterlsticas circulares con los intervalos de anchura anteriores (diametro).
Se puede usar cualquiera de varias geometrlas de matrices sobre un soporte solido. Como se ha mencionado anteriormente, un soporte solido individual puede contener una sola matriz o varias matrices. Las caracterlsticas de la matriz pueden estar dispuestas en filas y columnas rectillneas. Esto es particularmente atractivo para las matrices individuales de un soporte solido. Cuando hay varias matrices presentes, dichas matrices pueden estar dispuestas, por ejemplo, en una secuencia de filas curvillneas por la superficie del soporte solido (por ejemplo, una secuencia de clrculos concentricos o semiclrculos de puntos), y similares. Del mismo modo, el patron de caracterlsticas puede variar de las filas y columnas rectillneas de puntos para incluir, por ejemplo, una secuencia de filas curvillneas por la superficie del soporte solido (por ejemplo, una secuencia de clrculos concentricos o semiclrculos de puntos), y similares. La configuracion de las matrices y sus caracterlsticas se puede seleccionar de acuerdo con las consideraciones de fabrication, manipulation y uso.
Cada caracterlstica o elemento de la matriz se define como una region pequena de forma regular de la superficie del soporte solido. Las caracterlsticas estan dispuestas de una manera predeterminada. Cada caracterlstica de una matriz, por lo general, lleva una sonda predeterminada o mezcla de sondas. Cada caracterlstica de la matriz molecular puede contener una sonda diferente, y la sonda de una determinada caracterlstica puede diferir de las sondas del resto de caracterlsticas de la matriz. Algunas o todas de las caracterlsticas pueden ser de diferentes composiciones. Cada matriz puede contener multiples puntos o caracterlsticas, y cada matriz puede estar separada de otra matriz por espacios o zonas. Tambien se apreciara que no es necesario que haya ningun espacio que separe las matrices entre si. Las zonas entre matrices y las zonas entre caracterlsticas normalmente estan presentes, pero no son esenciales. Al igual que con todas las zonas fronterizas, estas zonas entre matrices y entre caracterlsticas no llevan ninguna sonda. Se apreciara que las zonas entre matrices y entre caracterlsticas, cuando estan presentes, podrlan ser de varios tamanos y configuraciones.
En algunas realizaciones, se puede formar una matriz uniendo una sonda con un primer soporte solido, tal como una perla, por ejemplo, y luego disponiendo el primer soporte solido en un formato de matriz sobre un segundo soporte solido, tal como una placa de microtitulacion, por ejemplo. En otras realizaciones, se puede formar una matriz uniendo sondas a perlas direccionables. Las "perlas direccionables" incluyen colorantes, codigos de barras y transpondedores.
En algunas realizaciones, dependiendo de la superficie del soporte solido seleccionada, la superficie se puede "bloquear" o "pasivar" con el fin de reducir o inhibir la union no especlfica de las moleculas con la superficie del soporte solido. Los reactivos de bloqueo o pasivacion incluyen leche en polvo, caselna, suero combinado, plasma combinado, BSA, PEG-PLL, PEG-silano, SuperBlock o StarterBlock (Pierce Biotechnology, Rockford, III.), y cualquier combination de cualquiera de los anteriores.
Como se usa en el presente documento, la expresion "agente de marcaje" se refiere a uno o mas reactivos que se pueden usar para detectar una molecula diana que esta unida a un aptamero en un complejo covalente de aptamero.
En una realization para detectar una molecula diana, se pone en contacto un complejo covalente de aptamero con un agente de marcaje que incluye una pareja de union que sea especlfica de la molecula diana unida al aptamero. La pareja de union especlfica puede ser cualquier resto adecuado, incluyendo un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un mimetico de anticuerpo sintetico, un biomimetico, un aptamero, un ligando impreso molecular, y similares. La pareja de union especlfica se conjuga o se liga a otro componente de agente de marcaje, por lo general, un resto detectable o un marcador. La union de la pareja de union especlfica con el marcador se puede llevar a cabo mediante cualquiera de los metodos mencionados anteriormente para enlazar una sonda a la superficie del soporte solido. Se apreciara que, en el caso de la detection de multiples moleculas diana, se pueden poner en contacto multiples complejos covalentes de aptamero con una mezcla de pares de union especlficas, siendo cada una especlfica de una molecula diana sospechosa de estar presente. Los marcadores empleados pueden ser aquellos que son conocidos en la tecnica para la deteccion multiplexada de multiples moleculas diana.
El resto detectable o marcador se puede detectar directa o indirectamente. En general, cualquier molecula indicadora que sea detectable puede ser un marcador. Los marcadores incluyen, por ejemplo, (i) moleculas indicadoras que se pueden detectar directamente gracias a la generation de una senal; (ii) los miembros de pares de union especlficos que se pueden detectar indirectamente por la union posterior a un elemento afln que contiene una molecula indicadora; (iii) marcadores de masa detectables mediante espectrometrla de masas; (iv) cebadores oligonucleotldicos que pueden proporcionar un molde para la amplification o ligadura; y (v) una secuencia de polinucleotido o secuencia de reconocimiento especlfica que pueda actuar como un ligando, tal como, por ejemplo, una protelna represora, en la que en los ultimos dos casos, el cebador oligonucleotldico o la protelna represora
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tendran, o seran capaces de tener, una molecula indicadora y as! sucesivamente. La molecula indicadora puede ser un catalizador, tal como una enzima, un polinucleotido que codifica un catalizador, un promotor, un colorante, una molecula fluorescente, un punto cuantico, una molecula quimioluminiscente, una coenzima, un sustrato enzimatico, un grupo radiactivo, una molecula organica pequena, una secuencia polinucleotldica amplificable, una partlcula tal como una partlcula de carbono o de latex, sol metalicos, cristales, liposoma, celula etc., que pueden o no estar marcados adicionalmente con un colorante, un catalizador u otro grupo detectable, un marcador de masas que altere el peso de la molecula a la que esta conjugado con fines de espectrometrla de masas y similares. El marcador se puede seleccionar entre materiales electromagneticos o electroqulmicos. En una realization, el marcador detectable es un colorante fluorescente. Otros marcadores y esquemas de marcaje seran evidentes para un experto en la materia basandose en la divulgation del presente documento.
En otra realizacion para detectar una molecula diana, la molecula diana es una protelna, y el complejo covalente de aptamero se pone en contacto con un agente de marcaje que comprende una tincion proteica universal. Como se usa en el presente documento, "tincion proteica universal" y "UPS" se usan indistintamente para referirse a cualquier agente de marcaje que marca la mayorla, si no todas, las protelnas presentes en una muestra de ensayo con un resto detectable, pero tiende a no marcar, o marca solo mlnimamente, los acidos nucleicos u otros componentes del ensayo, tales como el soporte solido. Cualquier grupo reactivo qulmico que se encuentra en las protelnas, pero que no se encuentra en los acidos nucleicos ni en la superficie del sustrato, puede servir como sitio de union covalente. Los grupos qulmicos reactivos ilustrativos incluyen aminas primarias (por ejemplo, en restos de lisina), tioles (por ejemplo, en cistelna, que se puede producir mediante la reduction de los enlaces disulfuro), alcoholes (por ejemplo, en restos de serina, treonina, tirosina y azucar en las glucoprotelnas (incluyendo los productos de oxidation del cis- dioles en dichos azucares)) y carboxilatos (por ejemplo, en acido glutamico y acido aspartico).
El resto detectable puede incluir cualquiera de las moleculas indicadoras enumeradas anteriormente y cualquier otra sustancia qulmica o componente que se pueden usar de cualquier manera para generar una senal detectable. El resto detectable se puede detectar a traves de una senal fluorescente, una senal quimioluminiscente, o cualquier otra senal detectable que dependa de la identidad del resto. En caso de que el resto detectable sea una enzima (por ejemplo, fosfatasa alcalina), la senal se puede generar en presencia del sustrato enzimatico y cualquier factor adicional necesario para la actividad enzimatica. En caso de que el resto detectable sea un sustrato enzimatico, la senal se puede generar en presencia de la enzima y cualquier factor adicional necesario para la actividad enzimatica. Las configuraciones de los reactivos adecuadas para unir el resto detectable a una protelna diana incluyen la union covalente del resto detectable con la protelna diana, la asociacion no covalente del resto detectable con otro componente de agente de marcaje que este unido covalentemente a la protelna diana y la union covalente del resto detectable a un componente de agente de marcaje que no esta asociado covalentemente a la protelna diana. La tincion proteica universal se describe detalladamente en la publication de patente de Estados Unidos N° 2006-0057573, presentada el 12 de agosto de 2004, titulada "Methods and Reagents for Detecting Target Binding by Nucleic Acid Ligands".
En algunas realizaciones, la UPS es un solo reactivo qulmico que comprende un resto detectable y reacciona covalentemente con un grupo funcional que es caracterlstico de las protelnas, pero no de los aptameros y, en la reaction, une covalentemente el resto detectable a una protelna diana. Las UPS de acuerdo con dicha realizacion incluyen colorantes con grupos capaces de reaccionar covalentemente con grupos funcionales que son unicos de las protelnas. Dichos grupos se pueden anadir a los colorantes por derivatizacion o pueden estar presentes en el colorante no modificado. En una realizacion, la UPS comprende un colorante activado por N-hidroxisuccinimida que reacciona con grupos amina, tal como un fluoroforo activado por N-hidroxisuccinimida, incluyendo fluoroforos NHS- Alexa (tales como, por ejemplo, NHS-Alexa 647). Otra UPS que se puede usar es CBQCA (3-(4- carboxibenzoil)quinolin-2-carboxaldehldo), que tambien reacciona con aminas en presencia de cianuro o tioles para formar isoindoles altamente fluorescentes. Otros grupos reactivos de amina adecuados para su uso en reactivos UPS incluyen isocianatos, isotiocianatos, azidas de acilo, cloruros de sulfonilo, aldehldos, esteres de 4-sulfo-2,3,5,6- tetrafluorofenol (STP), TFP-Alexa 647 y agentes de arilacion tales como cloruro de NBD (7-nitrobenz-2-oxa-1,3- diazol), fluoruro de NBD y diclorotriazinas.
En otras realizaciones, la UPS comprende una pluralidad de reactivos. Por ejemplo, la UPS puede comprender un primer reactivo que reacciona covalentemente con una protelna diana, y uno o mas reactivos adicionales que unen el resto detectable, ya sea directa o indirectamente y, bien covalente o no covalentemente, con la protelna diana a traves de un grupo qulmico u otra funcionalidad introducida por el primer reactivo. Cuando la UPS comprende multiples reactivos, se apreciara que, en algunos casos, los reactivos se anaden secuencialmente y, en otros casos, se pueden anadir simultaneamente.
En una realizacion, una UPS adecuada comprende (a) un derivado de biotina que reacciona con una protelna diana; y (b) un conjugado de estreptavidina-resto detectable tal como, por ejemplo, un derivado de estreptavidina fluorescente o un conjugado de estreptavidina-enzima. El derivado de biotina reacciona con grupos amina, uniendo as! covalentemente la biotina con la protelna diana; el conjugado de estreptavidina-resto detectable se une a los grupos de biotina inmovilizados, localizando as! el resto detectable en el/los sitio/s del soporte solido al/ a los que se une la protelna diana. En dicha realizacion, los reactivos adecuados incluyen PFP-biotina, NHS-PEO4-biotina (brazo espaciador de 29 A), sulfo-NHS-LC-biotina (brazo espaciador de 22,4 A) y TFP-PEO3-biotina (brazo espaciador de
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En otra realization, una UPS adecuada comprende: (a) biotina, o un derivado de biotina, conjugada con un grupo reactivo que es capaz de unir covalentemente la biotina o el derivado de biotina con una proteina diana unida; (b) avidina y/o estreptavidina; y (c) un conjugado de biotina-resto detectable tal como, por ejemplo, un derivado de biotina fluorescente. El derivado de biotina de (a) anterior puede ser un derivado de biotina reactivo con amina, tal como, por ejemplo, NHS-Biotina, en el que la biotina esta opcionalmente separada de NHS por atomos espaciadores (Calbiocheni, Inc.). La reaction del grupo NHS con aminas primarias en la proteina diana unida conduce a la union covalente de la biotina con la proteina diana que esta unida a su correspondiente aptamero. A continuation, se puede tratar la proteina diana complejada con su correspondiente aptamero con la estreptavidina o la avidina. Dado que la estreptavidina y la avidina se pueden unir cada cuatro biotinas, la adicion de estas proteinas proporciona tres sitios de union de biotina para cada biotina originalmente acoplada a la proteina diana unida por el NHS-biotina. Entonces se puede anadir el derivado de biotina-resto detectable de (c) anterior, tras lo que se une estrechamente a los sitios de union desocupados de biotina de la estreptavidina o la avidina. En dicha realization, los reactivos adecuados incluyen PFP-biotina, NHS-PEO4-biotina (brazo espaciador de 29 A), sulfo-NHS-LC-biotina (brazo espaciador de 22,4 A) y TEP-PEO3-biotina (brazo espaciador de 32,6 A).
Las consideraciones tales como la naturaleza del agente de marcaje, la naturaleza de, y los niveles de corte predeterminados para, las moleculas diana, la importancia biologica de los niveles de diana especificos, etcetera, normalmente, determinan la concentration del agente de marcaje, incluyendo las concentraciones individuales de los reactivos particulares que se pueden usar. La concentration final de cada uno de los reactivos normalmente se determinara empiricamente para optimizar la sensibilidad del metodo. En una realization, la concentration del agente de marcaje normalmente es suficiente para detectar al menos aproximadamente el 1 % de las moleculas diana. En otra realization, la concentration del agente de marcaje normalmente es suficiente para detectar al menos aproximadamente el 10 % de las moleculas diana. En una realization adicional, la concentration del agente de marcaje normalmente es suficiente para detectar al menos aproximadamente el 90 % de las moleculas diana.
La activation del agente de marcaje depende de la naturaleza de los reactivos usados. Por ejemplo, para aquellos reactivos que se activan con luz, el reactivo se irradia con luz de una longitud de onda apropiada. Los expertos en la materia sugeriran otros metodos de activation en vista de las divulgaciones del presente documento. Para algunos agentes de marcaje, tales como agentes de marcaje que implican un marcador radiactivo, una enzima, etcetera, no se necesita ningun agente de activation. Para los sistemas de enzimas, se puede requerir la adicion de un sustrato y/o un cofactor.
El examen del soporte solido para la presencia y/o cantidad de la senal generada por el agente de marcaje incluye la detection de la senal que, en general, es meramente una etapa en la que se lee la senal. La senal se lee normalmente usando un instrumento, cuya naturaleza depende de la naturaleza de la senal. El instrumento puede ser un espectrofotometro, un fluorimetro, un espectrometro de absorcion, un luminometro, un quimioluminometro, un actinometro, un instrumento fotografico, y similares. La presencia y/o la cantidad de senal detectada se relacionan con la presencia y la cantidad de cualquier molecula diana presente en una muestra de ensayo por encima de un nivel de corte predeterminado. En general, las temperaturas durante las mediciones pueden variar de aproximadamente 10 °C a aproximadamente 70 °C, o de aproximadamente 20 °C aproximadamente 45 °C, o de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 25 °C. En una metodologia, se forman curvas de calibration usando concentraciones conocidas de las moleculas diana que se estan ensayando. Tambien se pueden usar calibradores y otros controles.
En una realization, un soporte solido, incluyendo, por ejemplo, una matriz, se desplaza a un dispositivo de examen donde la superficie del soporte solido es inspeccionada por la presencia de cualquier molecula diana unida. El dispositivo de examen puede ser un dispositivo de exploration que incluya un sistema optico. La matriz se puede examinar o leer, por ejemplo, mediante la iluminacion de la matriz, y la lectura de la ubicacion y la intensidad de una senal resultante (por ejemplo, fluorescencia) en cada caracteristica de la matriz. El escaner puede ser similar a, por ejemplo, el escaner tEcAN LS 300 disponible en Tecan Systems, San Jose, California. Sin embargo, las matrices se pueden examinar o leer usando metodos o un aparato que no sea el anterior, incluyendo otros metodos de examen de matrices otras tecnicas opticas (por ejemplo, la detection de marcadores quimioluminiscentes o electroluminiscentes) y tecnicas electricas.
Los resultados generados a partir de un examen de la matriz pueden ser resultados en bruto (tales como lecturas de la intensidad de fluorescencia para cada caracteristica en uno o mas canales de colore) o pueden ser resultados procesados, tales como los resultados obtenidos por el rechazo de una lectura para una caracteristica que este por debajo de un umbral predeterminado y/o la generation de conclusiones basadas en el patron de lectura de la matriz (por ejemplo, si una determinada molecula diana puede haber estado o no presente en la muestra de ensayo). Los resultados del examen (procesados o no) se pueden desviar (tal como por comunicacion) a una ubicacion remota, si se desea, y ser recibidos alli para su uso posterior (tales como un procesamiento adicional).
En otra realization, el metodo se lleva a cabo bajo el control de un ordenador, es decir, con la ayuda de un ordenador. Se puede utilizar, por ejemplo, un ordenador personal compatible IBM®. El ordenador funciona con un
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programa informatico especlfico de los metodos descritos en el presente documento. El soporte flsico informatico capaz de ayudar en la realizacion de los metodos desvelados en el presente documento puede incluir un sistema que tiene las siguientes especificaciones: procesador Pentium® o mejor con una velocidad del reloj de al menos 100 MHz, al menos 32 megabytes de memoria de acceso aleatorio (RAM) y al menos 80 megabytes de memoria virtual, que funciona con el sistema operativo Microsoft Windows® 95 o con Microsoft Windows NT® 4.0 (o sucesor del mismo), por ejemplo.
El soporte logico que se puede usar para llevar a cabo los metodos puede ser, por ejemplo, Microsoft Excel o Microsoft Access®, ampliado de manera adecuada a traves de funciones escritas por el usuario y plantillas, y conectado, cuando sea necesario, con los programas independientes que se puedan desear. Los ejemplos de soporte logico o programas informaticos usados en la asistencia de la realizacion de los presentes metodos pueden estar escritos en Visual BASIC®, FORTRAN, C, C++, Java, Python o cualquier otro lenguaje de programacion adecuado disponible actualmente o en el futuro. Se ha de entender que la anterior informacion informatica y el soporte logico usados en el presente documento son meramente ilustrativos, y no pretenden ser restrictivos. Cualquiera de los metodos desvelados en el presente documento se puede adaptar a otros ordenadores, sistemas informaticos y soporte logico. Otros lenguajes que se pueden usar incluyen, por ejemplo, PASCAL, PERL o lenguaje ensamblador.
En otra realizacion, el complejo de afinidad de aptamero (o complejo covalente de aptamero opcional) se detecta y/o cuantifica usando espectrometrla de masas. Con referencia a la Fig. 1B, en un metodo ilustrativo para la deteccion y/o cuantificacion de una molecula diana que puede estar presente en una muestra de ensayo, se pone en contacto una muestra de ensayo con un aptamero que incluye un marcador y tiene una afinidad especlfica por una molecula diana. Se permite la formacion de un complejo de afinidad de aptamero que incluye un aptamero unido a su molecula diana. Si la muestra de ensayo contiene la molecula diana, en general, se formara un complejo de afinidad de aptamero en la muestra de ensayo. El complejo de afinidad de aptamero se convierte opcionalmente, usando un metodo apropiado para el aptamero que se este empleando, en un complejo covalente de aptamero que incluye un aptamero unido covalentemente a su molecula diana. El complejo de afinidad de aptamero (o complejo covalente de aptamero opcional) se une a un soporte solido. La fijacion se lleva a cabo poniendo en contacto el soporte solido con el complejo de afinidad de aptamero (o complejo covalente de aptamero opcional) y permitiendo que el marcador incluido en el aptamero se asocie, ya sea directa o indirectamente, a una sonda unida al soporte solido. El complejo de afinidad de aptamero (o complejo covalente de aptamero opcional) que se ha asociado a la sonda en el soporte solido se prepara entonces para la deteccion (y cuantificacion opcional) usando espectrometrla de masas.
El complejo de afinidad de aptamero (o complejo covalente de aptamero opcional) se puede preparar para la deteccion y cuantificacion opcional mediante espectrometrla de masas usando cualquiera de varios metodos. Por ejemplo, en una realizacion, cuando la molecula diana es una protelna, el complejo de afinidad de aptamero (o complejo covalente de aptamero opcional) se prepara por digestion de la proteasa ya sea antes o despues de retirar el complejo del soporte solido. En otra realizacion, el complejo de afinidad de aptamero (o complejo covalente de aptamero opcional) se libera del soporte solido y despues se prepara para el analisis de espectrometrla de masas usando cualquiera de una serie de metodos conocidos en la tecnica, incluyendo la ionizacion por desorcion laser asistida por matriz (MALDI), la ionizacion por desorcion laser de superficie mejorada (SELDI), la ionizacion por electronebulizacion o la ionizacion por impacto de electrones. En una realizacion, el complejo de afinidad de aptamero (o complejo covalente de aptamero opcional) se puede eluir directamente en un espectrometro de masas de ionizacion por electronebulizacion. En otras realizaciones, la muestra de ensayo elulda se puede someter a un procesamiento adicional, tal como, por ejemplo, la digestion enzimatica o modificacion qulmica, antes del analisis de espectrometrla de masas. Los espectros de masas se pueden obtener mediante, por ejemplo, ionizacion por electronebulizacion, ionizacion por desorcion laser asistida por matriz o ionizacion por impacto electronico.
Por lo general, la cuantificacion de una molecula diana mediante espectrometrla de masas requiere un patron interno, es decir, un compuesto de concentracion conocida que se introduce en la muestra de ensayo que se va a analizar. Los patrones internos ideales tendran caracterlsticas de elucion y de ionizacion similares a las de la molecula diana, pero generaran iones con diferentes proporciones de masa-carga. Un patron interno comun es una version marcada con isotopo estable de la molecula diana. En una realizacion, como patron interno, se anade una version marcada con isotopo estable de la molecula diana a la muestra de ensayo. A continuacion, se comparan los picos espectrales correspondientes a los diversos componentes de la muestra de ensayo con la altura o superficie del pico del patron interno, permitiendose as! la cuantificacion de la molecula diana.
En otra realizacion, la cuantificacion de la molecula diana se lleva a cabo mediante la comparacion de la altura del pico o de la superficie de los picos espectrales correspondientes a la molecula diana con aquellos picos espectrales generados a partir de un conjunto de muestras con concentraciones conocidas de la molecula diana. Las alturas de los picos o las superficies de los picos espectrales obtenidas de las muestras que tienen concentraciones conocidas de la molecula diana constituyen una curva patron a partir de la cual se puede calcular la concentracion desconocida de la molecula diana en la muestra de ensayo.
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En otra realization, el complejo de afinidad de aptamero (o complejo covalente de aptamero optional) se detecta y/o cuantifica usando Q-PCR. Como se usa en el presente documento, "Q-PCR" se refiere a una reaction de pCr realizada de manera y en condiciones controladas que los resultados del ensayo son cuantitativos, es decir, el ensayo es capaz de cuantificar la cantidad o la concentration de aptamero presente en la muestra de ensayo. Con referencia a la Fig. 1B, en un metodo ilustrativo para la detection y/o cuantificacion de una molecula diana que puede estar presente en una muestra de ensayo, se pone en contacto una muestra de ensayo con un aptamero que puede incluir un marcador y tiene una afinidad especlfica por una molecula diana. Se permite la formation de un complejo de afinidad de aptamero que incluye un aptamero unido a su molecula diana. En general, si la muestra de ensayo contiene la molecula diana, se formara un complejo de afinidad de aptamero en la muestra de ensayo. El complejo de afinidad de aptamero se convierte opcionalmente, usando un metodo apropiado para el aptamero que se este empleando, en un complejo covalente de aptamero que incluye un aptamero unido covalentemente a su molecula diana. Como se describe ademas en el presente documento, tras la formation de un complejo de afinidad de aptamero y cualquier conversion opcional a un complejo covalente de aptamero, cualquier aptamero libre que pueda estar presente en la muestra de ensayo se separa despues del complejo de afinidad de aptamero (o complejo covalente de aptamero opcional). El complejo de afinidad de aptamero (u complejo covalente de aptamero opcional) se cuantifica despues usando tecnicas conocidas para la replication cuantitativa de polinucleotidos.
En una realization, la cantidad o la concentration del complejo de afinidad de aptamero (o complejo covalente de aptamero opcional) en la muestra de ensayo se determina usando PCR TaqMan®. Esta tecnica, en general, se basa en la actividad exonucleasa 5'-3' de la enzima oligonucleotldica en replication para generar una senal a partir de una secuencia diana. La sonda TaqMan se selecciona basandose en la secuencia del aptamero que se va a cuantificar y, en general, incluye un fluor de extremo 5', tal como 6-carboxifluorescelna, por ejemplo, y un inactivador de extremo 3' tal como, por ejemplo, una 6-carboxitetrametilfluorescelna, para generar la senal a medida que la secuencia de aptamero se amplifica usando la reaction en cadena de la polimerasa (PCR). Como las copias de polimerasa de la secuencia de aptamero, la actividad exonucleasa libera el fluor de la sonda, que se hibrida corriente abajo de los cebadores de PCR, generando de esta manera la senal. Se producen los aumentos de senal como producto replicado. La cantidad de producto de PCR depende tanto del numero de ciclos de duplication realizados, como de la concentration de partida del aptamero.
En otra realization, la cantidad o concentration de un complejo de afinidad de aptamero (o complejo covalente de aptamero opcional) se determina usando un colorante fluorescente de intercalation durante el proceso de replication. El colorante de intercalation, tal como, por ejemplo, SYBR® verde, genera una potente senal fluorescente en presencia de ADN de doble cadena en comparacion con la senal fluorescente generada en presencia de ADN monocatenario. A medida que se forma el producto de doble cadena de ADN durante la PCR, la senal producida por el colorante aumenta. La magnitud de la senal producida depende tanto del numero de ciclos de PCR como de la concentration de partida del aptamero.
En otra realization, la cantidad o la concentration del complejo de afinidad de aptamero (o complejo covalente de aptamero opcional) se determina usando una "baliza molecular" durante el proceso de replication (vease, por ejemplo, Tyagi et al, Nat. Biotech. 16:49 53, 1998; patente de EE.UU. N° 5.925.517). Una baliza molecular es una sonda de acido nucleico especlfica que se pliega en un bucle de horquilla y contiene un fluor en un extremo y un inactivador en el otro extremo de la estructura de horquilla, de manera que poca o ninguna senal es generada por el fluor cuando se forma la horquilla. La secuencia del bucle es especlfica de una secuencia de polinucleotido diana y, al hibridarse con la secuencia de aptamero, la horquilla se despliega y, de ese modo, genera una senal fluorescente.
Se puede utilizar un programa informatico para llevar a cabo una o mas etapas de cualquiera de los metodos desvelados en el presente documento. Otro aspecto de la presente divulgation es un producto de programa informatico que comprende un medio de almacenamiento legible por ordenador que tiene un programa informatico almacenado en el mismo que, cuando se carga en un ordenador, realiza o colabora en la realization de cualquiera de los metodos desvelados en el presente documento.
Un aspecto de la divulgation es un producto de cualquiera de los metodos desvelados en el presente documento, en concreto, un resultado del ensayo, que se puede evaluar en el sitio del ensayo o se puede enviar a otro sitio para la evaluation y la comunicacion a una parte interesada en una ubicacion remota, si se desea. Como se usa en el presente documento, "ubicacion remota" se refiere a una ubicacion que es flsicamente diferente de aquella en la que se obtienen los resultados. Por consiguiente, los resultados se pueden enviar a una sala diferente, un edificio diferente, una parte diferente de la ciudad, una ciudad diferente, etcetera. Los datos pueden ser transmitidos por medios convencionales tales como, por ejemplo, fax, correo, entrega al dla siguiente, correo electronico, ftp, correo de voz, y similares.
"Comunicar" la information se refiere a la transmision de los datos que representan esa information como senales electricas por un canal de comunicacion adecuado (por ejemplo, una red privada o publica). "Desviar" un artlculo se refiere a cualquier medio de conseguir que el artlculo vaya de un lugar a otro, ya sea por transporte flsico de ese elemento o de otra manera (si eso es posible) e incluye, al menos en el caso de los datos, el transporte flsico de un medio que porta los datos o la comunicacion de los datos.
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En relacion con la Fig. 3, en otro metodo ilustrativo para la deteccion y/o cuantificacion de una o mas moleculas diana que pueden estar presentes en una muestra de ensayo, una muestra de ensayo que puede comprender una molecula diana y al menos una molecula no diana se puede poner en contacto opcionalmente con una molecula competidora (indicada como Opcion A en la Fig. 3). Se pueden formar uno o mas complejos no especlficos. La muestra de ensayo se pone en contacto con un aptamero que incluye un marcador y tiene afinidad especlfica por una molecula diana. Se permite la formacion de un complejo de afinidad de aptamero que comprende un aptamero unido a su molecula diana. En general, si la muestra de ensayo contiene la molecula diana, se formara un complejo de afinidad de aptamero en la muestra de ensayo. Dependiendo de la naturaleza de la muestra de ensayo, tambien se pueden formar uno o mas complejos inespeclficos entre el aptamero y una o mas moleculas no diana. Si la muestra de ensayo se ha puesto en contacto con una molecula competidora, tambien se pueden haber formado diversos complejos no especlficos que comprenden el competidor y estar presentes en la muestra de ensayo.
Opcionalmente, luego se puede exponer la muestra de ensayo a condiciones que desaflan cineticamente los componentes de la muestra de ensayo (indicado como la Opcion B en la Fig. 3). Como se describe mas adelante, un desaflo cinetico puede comprender la dilucion de la muestra de ensayo, la introduccion de una molecula competidora en la muestra de ensayo o la captura de los complejos de afinidad de aptamero sobre un soporte solido seguida por el lavado, ya sea con o sin moleculas competidoras presentes en la solucion de lavado. Si se introduce un desaflo cinetico, es poco probable que, tras la disociacion, se vuelvan a formar complejos no especlficos entre el aptamero y cualquier molecula no diana. Dado que los complejos no especlficos, en general, se disocian mas rapidamente que un complejo de afinidad de aptamero, un desaflo cinetico reduce la probabilidad de que un aptamero este incluido en un complejo no especlfico con una no diana. Un desaflo cinetico eficaz puede proporcionar el ensayo con especificidad adicional, ademas de la union del aptamero inicial y la posterior interaccion covalente.
Independientemente de si se emplea un desaflo cinetico, el complejo de afinidad de aptamero que se ha formado se convierte despues, usando un metodo apropiado para el aptamero que se este empleando, en un complejo covalente de aptamero que comprende un aptamero unido covalentemente a su molecula diana. Tras la formacion del complejo covalente de aptamero, se puede separar de la muestra de ensayo opcionalmente cualquier aptamero libre o no complejado que pueda estar presente en la muestra de ensayo (indicado como Opcion C en la Fig. 3). Opcionalmente, se puede separar de la muestra de ensayo cualquier molecula libre o no diana y diana no complejada que pueda estar presente en la muestra de ensayo (indicado como Opcion D en la Fig. 3). Opcionalmente, tanto EL aptamero libre como las moleculas no diana y diana libres se pueden retirar, en cualquier orden, tras la formacion del complejo covalente de aptamero.
Si se usa dilucion para introducir un desaflo cinetico, preferentemente, la posterior muestra de ensayo que contiene el complejo covalente de aptamero se concentra. Si procede, esta concentracion se puede realizar usando metodos descritos a continuacion con respecto a la separation opcional de cualquier aptamero libres de la muestra de ensayo y/o la elimination opcional de otros componentes de la muestra de ensayo que puedan reaccionar con el agente de marcaje.
Entonces, el complejo covalente de aptamero de la muestra de ensayo se detecta y/o cuantifica usando cualquiera de los metodos descritos en el presente documento o cualquier otro metodo adecuado conocido por un experto habitual en la materia. Por ejemplo, el complejo covalente de aptamero se puede unir a una superficie de un soporte solido poniendo en contacto el soporte solido con la muestra de ensayo y permitiendo la asociacion de un marcador en el aptamero, ya sea directa o indirectamente, con una sonda que esta inmovilizada en la superficie del soporte solido. Entonces, el complejo covalente de aptamero que se ha asociado a la sonda en el soporte solido se detecta y, opcionalmente, se cuantifica. En cualquier momento previo a la deteccion y la cuantificacion opcional, es decir, ya sea en cualquier momento previo a la fijacion o posterior a la union del complejo covalente de aptamero con el soporte solido, el complejo covalente de aptamero se pone en contacto con un agente de marcaje para permitir la deteccion de la molecula diana unida. Como el experto habitual en la materia apreciara, el complejo covalente de aptamero tambien se puede detectar y/o cuantificar usando espectrometrla de masas, Q-PCR o cualquier otro metodo adecuado conocido en la tecnica.
Como se usa en el presente documento, "molecula competidora" y "competidor" se usan indistintamente para hacer referencia a cualquier molecula que puede formar un complejo inespeclfico con una molecula no diana. Una "molecula competidora" o "competidor" es un conjunto de copias de un tipo o especie de molecula. "Moleculas competidoras" o "competidores" hacen referencia a mas de una de dicho conjunto de moleculas. Las moleculas competidoras incluyen oligonucleotidos, polianiones (por ejemplo, heparina, ADN de esperma de salmon monocatenario y polidextranos (por ejemplo, sulfato de dextrano)), pollmeros de fosfodiester abasicos, dNTP y pirofosfato. En el caso de un desaflo cinetico que usa un competidor, el competidor tambien puede ser cualquier molecula que pueda formar un complejo no especlfico con un aptamero. Dichas moleculas competidoras incluyen policationes (por ejemplo, espermina, espermidina, polilisina y poliarginina) y aminoacidos (por ejemplo, arginina y lisina).
Como se usa en el presente documento, "complejo no especlfico" hace referencia a una asociacion no covalente entre dos o mas moleculas distintas a un aptamero y su molecula diana. Dado que un complejo no especlfico no se
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selecciona basandose en una interaccion de afinidad entre sus moleculas constituyentes, sino que representa una interaccion entre clases de moleculas, las moleculas asociadas en un complejo no especifico presentaran, como media, afinidades mucho mas bajas entre si y tendran una velocidad de disociacion correspondientemente mas elevada que un aptamero y su molecula diana. Los complejos no especificos incluyen complejos formados entre un aptamero y una molecula no diana, un competidor y una molecula no diana, un competidor y una molecula diana, y una molecula diana y una molecula no diana.
Como se usan en el presente documento, las expresiones "desafiar cineticamente" y "desafio cinetico" se refieren a un proceso de enriquecimiento en un complejo de afinidad de aptamero de un conjunto de complejos que incluye un complejo de afinidad de aptamero y complejos no especificos, mediante la aplicacion de presion cinetica y haciendo uso de las diferentes caracteristicas de afinidad de los constituyentes de dichas clases de complejos, incluyendo las velocidades de disociacion. En general, un desafio cinetico produce un aumento de la especificidad, ya que los complejos de aptamero-no diana normalmente se reducen en comparacion con los complejos de aptamero-diana. Como se usa en el presente documento, la expresion "presion cinetica" se refiere a un medio para proporcionar una oportunidad para la disociacion natural de complejos y/o inhibir la reunion de moleculas que se disocian de un complejo de manera natural. La presion cinetica se puede aplicar mediante la adicion de una molecula competidora, o mediante la dilucion de la muestra, o mediante extensos lavados cuando los complejos estan unidos a un soporte solido, o mediante cualquier otro medio conocido por un experto en la materia. Como el experto habitual en la materia apreciara, debido a que un desafio cinetico, en general, depende de las velocidades de disociacion diferentes de los complejos de afinidad de aptamero y los complejos de aptamero-no diana, la duracion del desafio cinetico se selecciona para conservar una alta proporcion de complejos de afinidad de aptamero, reduciendo a la vez sustancialmente el numero de complejos de aptamero-no diana. Para que un desafio cinetico sea eficaz, preferentemente, la velocidad de disociacion para el complejo de afinidad de aptamero es significativamente inferior a la de los complejos de aptamero-no diana. Dado que se puede seleccionar un aptamero para que incluya determinadas propiedades, los componentes de un complejo de afinidad de aptamero se pueden disenar para tener una velocidad de disociacion relativamente baja.
Como se usa en el presente documento, el termino "division" se refiere a una separacion o eliminacion de una o mas especies moleculares de la muestra de ensayo. La division se puede usar para aumentar la sensibilidad y/o reducir el fondo. La division es mas eficaz tras la formacion del complejo covalente de aptamero, cuando el complejo de afinidad de aptamero se vuelva irreversible debido a los enlaces covalentes.
Por ejemplo, la eliminacion del aptamero libre de la muestra de ensayo puede aumentar la sensibilidad del ensayo, ya que el aptamero libre puede competir con un complejo covalente de aptamero durante la union del complejo covalente de aptamero a una sonda en la superficie del soporte solido. Cuando se usa Q-PCR para la deteccion y cuantificacion opcional, la eliminacion del aptamero libre facilita la deteccion y cuantificacion de la molecula diana. En una realizacion, la molecula diana es una proteina y el aptamero libre se separa del complejo covalente de aptamero (y del resto de la muestra de ensayo) mediante el uso de reactivos que precipitan las proteinas y los complejos que incluyen proteinas, tales como el complejo covalente de aptamero, y no los acidos nucleicos libres de la muestra de ensayo. Dichos reactivos pueden incluir K+/SDS, acetona, (NH4)2SO4, ProCipitate y otros polimeros cargados que son conocidos en la tecnica.
En una realizacion, un aptamero tal como, por ejemplo, un fotoaptamero marcado con una afinidad especifica por una molecula diana, en este caso una proteina diana, se introduce en la muestra de ensayo. Como se describe ademas en el presente documento, tras la formacion de un complejo de afinidad de aptamero y la conversion en un complejo covalente de aptamero, el complejo covalente de aptamero-protema y la proteina no complejada se precipitan en la muestra de ensayo usando un reactivo apropiado, tal como cualquiera de los reactivos enumerados anteriormente o cualquier otro reactivo adecuado. Los componentes precipitados de la muestra de ensayo se sedimentan por centrifugacion y se desecha el sobrenadante que contiene aptamero libre. A continuacion, se suspende el sedimento, que contiene proteina libre y el complejo covalente de aptamero-protema, en una solucion apropiada tal como, por ejemplo, el diluyente de union del ensayo, y entonces, se puede poner en contacto el complejo covalente de aptamero con un agente de marcaje, ya sea antes o despues de la union del complejo covalente de aptamero al soporte solido. Entonces, la molecula diana, si esta presente en la muestra de ensayo, se detecta y/o cuantifica mediante la deteccion del agente de marcaje en el complejo covalente de aptamero.
Para reducir el fondo del ensayo, se pueden eliminar de la muestra de ensayo las moleculas que pueden reaccionar con el agente de marcaje y que no estan unidas covalentemente con el aptamero. En una realizacion, esto se realiza por precipitacion del aptamero, tanto libre como complejado, en la muestra de ensayo, dejando otras moleculas que pueden reaccionar con el agente de marcaje en el sobrenadante para su retirada. Dicha precipitacion de acido nucleico se puede realizar con reactivos que incluyen bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAb), bromuro de dodeciltrimetilamonio (DTAB) y disolventes organicos tales como etanol, por ejemplo. En otra realizacion, el aptamero, tanto libre como complejado, se separa de la muestra por hibridacion del aptamero en un soporte solido. En este caso, el soporte solido puede incluir microperlas (por ejemplo, perlas paramagneticas), cualquier otro soporte solido adecuado descrito en el presente documento, y similares. Tras dejar que el aptamero se hibride con la superficie de un soporte solido adecuado, la solucion que contiene moleculas que pueden reaccionar con el agente de marcaje se elimina facilmente, produciendo una concentracion del complejo covalente de aptamero. Como
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cualquier experto habitual en la materia apreciara, la separacion del aptamero de esta manera puede usar bien un marcador incluido en el aptamero o alguna otra secuencia de acido nucleico del aptamero para hibridar el aptamero a una secuencia de nucleotidos complementaria adecuadamente unida al soporte solido.
En una realizacion, un aptamero de marcaje, tal como una fotoaptamero marcado con una afinidad especlfica por una protelna diana, se introduce en la muestra de ensayo. Como se describe ademas en el presente documento, tras la formation de un complejo de afinidad de aptamero y la conversion en un complejo covalente de aptamero, el complejo covalente de aptamero-protelna y el aptamero libre se precipitan en la muestra de ensayo usando un reactivo apropiado tal como cualquiera de los reactivos mencionados anteriormente o cualquier otro reactivo adecuado. Los componentes precipitados de la muestra de ensayo se sedimentan por centrifugation, y se desecha el sobrenadante que contiene diana no complejada y el resto de la muestra de ensayo. Luego, se suspende el sedimento, que contiene el aptamero libre y el complejo covalente de aptamero, en una solution apropiada tal como, por ejemplo, el diluyente de union del ensayo, y entonces se pueden poner en contacto el complejo covalente de aptamero y el aptamero libre con un agente de marcaje, ya sea antes o despues de la union del complejo covalente de aptamero con el soporte solido. Entonces, se detecta y/o cuantifica la molecula diana, si esta presente en la muestra de ensayo, mediante la detection del agente de marcaje en el complejo covalente de aptamero.
En otra realizacion, un aptamero marcado, tal como un fotoaptamero marcado con una afinidad especlfica por una protelna diana, se introduce en la muestra de ensayo. Como se describe ademas en el presente documento, tras la formacion de un complejo de afinidad de aptamero y la conversion en un complejo covalente de aptamero, el complejo covalente de aptamero-protelna y el aptamero libre son capturados sobre un soporte solido usando, por ejemplo, perlas que contienen una sonda que es complementaria al marcador de aptamero. Las perlas se sedimentan por la fuerza magnetica, en el caso de la perlas paramagneticas, o por centrifugacion para las perlas no paramagneticas, y se desecha el sobrenadante que contiene diana no complejada y muestra de ensayo. Entonces, se suspende el sedimento en una solucion apropiada tal como, por ejemplo, el diluyente de union del ensayo, y el complejo covalente de aptamero y el aptamero libre se eluyen usando cualquier medio adecuado para interrumpir la interaction de hibridacion, incluyendo, por ejemplo, calor, pH alto, agua destilada, alguna combination de estos o cualquier otro metodo conocido. Se vuelven a sedimentar las perlas, y el sobrenadante, que contiene el aptamero libre y el complejo covalente de aptamero, se puede poner en contacto con un agente de marcaje, ya sea antes o despues de la union del complejo covalente de aptamero con el soporte solido. Entonces se detecta y/o cuantifica la molecula diana, si esta presente en la muestra de ensayo, mediante la deteccion del agente de marcaje en el complejo covalente de aptamero.
En otra realizacion, el ensayo se realiza como se ha descrito anteriormente, hasta e incluyendo la etapa en la que se suspenden las perlas tras desechar el sobrenadante que contiene diana no complejada y muestra de ensayo. Entonces, antes de eluir el aptamero libre y el complejo covalente de aptamero de las perlas, el complejo covalente de aptamero se puede poner en contacto con un agente de marcaje, seguido de la aglomeracion repetida y el lavado para eliminar el agente de marcaje no reactivo antes de poner en contacto el soporte solido con el complejo covalente de aptamero para la deteccion y/o cuantificacion de la molecula diana.
En cualquiera de los metodos desvelados en el presente documento, la muestra de ensayo se puede preparar como dos o mas diluciones de la muestra de ensayo, lo que pueden aumentar el intervalo dinamico de concentraciones a las que una molecula diana puede estar presente en una muestra de ensayo, y someterse a deteccion mediante los metodos desvelados en el presente documento. Las muestras de ensayo de dilution individuales se analizan por separado hasta e incluyendo la formacion del complejo covalente de aptamero, tras lo que las muestras de ensayo de dilucion se pueden combinar para el resto del ensayo y detectarse simultaneamente en un solo soporte solido. En una realizacion, cada muestra de ensayo de dilucion incluye un solo aptamero, permitiendo as! una sola medicion de la diana correspondiente. En otra realizacion, se puede anadir un aptamero a dos o mas diluciones, cada dilucion en contacto con un aptamero marcado distinto para una determinada diana, lo que permite la deteccion de una senal del aptamero especlfica para cada una de las diferentes muestras de dilucion en un solo soporte solido. El encadenamiento de muestras diluidas entre si de esta manera puede extender un intervalo dinamico para una sola molecula diana en muchos ordenes de magnitud y anadir exactitud cuando las regiones de cuantificacion en solapamiento conducen a multiples determinaciones de la concentration de una sola diana.
En una realizacion, se prepara un conjunto de muestras de ensayo como diluciones en serie en las que se introduce un aptamero marcado, tal como un fotoaptamero marcado con una afinidad especlfica por una molecula diana. Se puede anadir el mismo aptamero con un marcador diferente a cada dilucion de la muestra de ensayo. Como se describe ademas en el presente documento, tras la formacion de un complejo de afinidad de aptamero y la conversion en un complejo covalente de aptamero, se pueden combinar las muestras de ensayo individuales y ponerse en contacto con un agente de marcaje, ya sea antes o despues de la union del complejo covalente de aptamero al soporte solido. Entonces, se detecta y/o cuantifica la molecula diana, si esta presente en la muestra de ensayo, mediante la deteccion del agente de marcaje en el complejo covalente de aptamero. Las senales resultantes detectadas para cada aptamero que tiene un marcador diferente se pueden combinar para cuantificar con exactitud la cantidad o concentracion de la molecula diana en la muestra de ensayo original. Por ejemplo, la primera dilucion puede generar una senal maxima para la diana, produciendo solo information semicuantitativa, mientras que la segunda dilucion puede generar una senal que sea inferior a la saturation, permitiendo una cuantificacion exacta de
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la diana en el ensayo de muestra original.
En otra realization, se prepara un conjunto de muestras de ensayo como diluciones en serie en las que se introduce un aptamero marcado, tal como un fotoaptamero marcado con una afinidad especlfica por una molecula diana. Se pueden anadir diferentes aptameros que tienen marcadores unicos a cada dilution de la muestra. Como se describe ademas en el presente documento, tras la formation de los complejos de afinidad de aptamero y la conversion en los complejos covalentes de aptamero, se pueden combinar las muestras de ensayo individuales y ponerse en contacto con un agente de marcaje, ya sea antes o despues de la union de los complejos covalentes de aptamero al soporte solido. Las moleculas diana presentes en la muestra de ensayo se detectan y/o cuantifican mediante la detection del agente de marcaje en el complejo covalente de aptamero. Las senales resultantes se pueden cuantificar para intervalos de diana en muchos ordenes de magnitud en funcion de las diferentes diluciones en serie de la muestra original.
En cualquiera de los metodos desvelados en el presente documento, se puede comparar una muestra de ensayo con una muestra de referencia. Una "muestra de referenda" se refiere en el presente documento a cualquier material, solution o mezcla que contenga una pluralidad de moleculas, y que se sepa que incluye al menos una molecula diana. Tambien se pueden conocer la cantidad o la concentration exactas de cualquier molecula diana presente en la muestra de referencia. La expresion “muestra de referencia” incluye muestras biologicas, tal como las definidas en el presente documento, y muestras que se pueden usar para ensayos ambientales o de toxicologla, tales como los efluentes de agua e industriales contaminados o potencialmente contaminados, por ejemplo. Una muestra de referencia tambien puede ser un producto final, un producto intermedio o un subproducto de un proceso de preparation, por ejemplo, un proceso de fabrication. Una muestra de referencia puede incluir cualquier medio de ensayo adecuado, tampon o diluyente que se haya anadido a un material, una solucion o una mezcla obtenida de un organismo o de alguna otra fuente (por ejemplo, del medio ambiente o de una fuente industrial).
En una realizacion, se trata por separado una muestra de referencia de una muestra de ensayo de una manera identica hasta, pero sin incluir, la exposition al agente de marcaje, que, solo en dicha realizacion, se debe producir antes de la union del complejo covalente de aptamero con el soporte solido. Se usan dos agentes de marcaje diferentes para diferenciar los niveles de diana en la muestra de referencia de los niveles de diana en la muestra de ensayo. Una vez puestas en contacto las muestras con el agente de marcaje, se pueden mezclar uniformemente y ponerse en contacto con el soporte solido al mismo tiempo. Entonces se puede realizar una comparacion directa de cualquier expresion diferencial (es decir, la cantidad o concentracion diferencial de la diana en las muestras) entre la muestra de referencia y la muestra de ensayo mediante la medicion de la senal de cada agente de marcaje por separado. Los dos agentes de marcaje pueden incluir un par Cy3 y Cy5, y un par Alexa555 y Alexa647. En una realizacion, la muestra de referencia puede ser una muestra biologica combinada que representa un grupo de control. En otra realizacion, la muestra de referencia puede ser una muestra biologica obtenida de un individuo, recogida en primer lugar, y la muestra de ensayo se puede obtener del mismo individuo, pero en segundo lugar, facilitando as! un estudio longitudinal de un individuo mediante la medicion y evaluation de cualquier cambio en la cantidad o concentracion de una o mas moleculas diana en multiples muestras biologicas proporcionadas por el individuo a lo largo del tiempo.
En una realizacion, un aptamero marcado, tal como un fotoaptamero marcado con una afinidad especlfica por una molecula diana, se introduce tanto en una muestra de referencia como en una muestra de ensayo. Como se describe ademas en el presente documento, tras la formacion de un complejo de afinidad de aptamero y la conversion en un complejo covalente de aptamero, las dos muestras se pueden poner en contacto con dos agentes de marcaje distintos, que contienen dos moleculas de deteccion diferentes. Entonces, se pueden unir las dos muestras marcadas por separado que contienen el complejo covalente de aptamero al soporte solido. A continuation, se detecta y/o cuantifica la molecula diana, si esta presente en una o ambas de las muestras, mediante la deteccion de los dos agentes de marcaje en el complejo covalente de aptamero, normalmente mediante la realizacion de varias exploraciones a diferentes longitudes de onda de excitation y emision cuando el marcador de deteccion es una molecula fluorescente, por ejemplo. Dicha cuantificacion puede conducir a una evaluacion mas exacta de las cantidades o concentraciones diferenciales de diana en la muestra de referencia y la muestra de ensayo, y puede facilitar las comparaciones entre las diferentes muestras de ensayo cuando la muestra de referencia empleada sea la misma.
En cualquiera de los metodos desvelados en el presente documento, se pueden usar multiples agentes de marcaje para analizar una sola muestra de ensayo. En una realizacion, se pueden usar dos o mas agentes de marcaje, cada uno con una qulmica distinta para marcar diferentes restos de moleculas diana y un grupo de deteccion opcionalmente diferente, con una sola muestra de ensayo. Las diferentes qulmicas marcaran diferentes grupos funcionales en la molecula diana de la que se puede obtener information adicional. Por ejemplo, en el caso de una protelna diana, se puede unir un marcador a la diana usando qulmica que reaccione con aminas primarias (por ejemplo, lisinas), mientras que un segundo marcador se une a la diana a traves de la qulmica que reacciona con, por ejemplo, los grupos de hidrato de carbono que normalmente estan asociados a las protelnas glucosiladas. La cuantificacion relativa de estos dos restos en la misma molecula diana, reconocida por un aptamero comun, puede proporcionar informacion util sobre el grado de glucosilacion para esa diana dentro de la muestra de ensayo.
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En una realizacion, se introduce un aptamero marcado, tal como un fotoaptamero marcado con una afinidad especlfica por una molecula diana, en una muestra de ensayo. Como se describe ademas en el presente documento, tras la formation de un complejo de afinidad de aptamero y la conversion en un complejo covalente de aptamero, la muestra de ensayo se puede poner en contacto con dos agentes de marcaje distintos, que contienen dos moleculas de detection diferentes, ya sea antes o despues de la puesta en contacto del complejo de aptamero con el soporte solido. En una realizacion, los marcadores de deteccion y las qulmicas son unicos, lo que permite el marcaje secuencial de la misma muestra de ensayo que contiene un complejo covalente de aptamero. En otra realizacion, las qulmicas pueden llevarse a cabo simultaneamente en una reaction. Entonces, se puede detectar y/o cuantificar el complejo covalente de aptamero marcado de manera multiple mediante la deteccion de los dos agentes de marcaje en el complejo covalente de aptamero, normalmente, mediante la realizacion de varias exploraciones a diferentes longitudes de onda de excitation y emision cuando las marcadores de deteccion son, por ejemplo, moleculas fluorescentes.
En otra realizacion, dos o mas agentes de marcaje distintos emplean el mismo marcador de deteccion. El ensayo se produce como se ha descrito anteriormente, hasta e incluyendo la conversion en un complejo covalente de aptamero, tras lo que la muestra de ensayo se divide en tantas partes allcuotas como agentes de marcaje distintos haya, y se pone en contacto cada parte allcuota de la muestra de ensayo por separado con un agente de marcaje ya sea antes o despues de la union del complejo covalente de aptamero al soporte solido. Las partes allcuotas marcadas por separado de la muestra de ensayo que contiene el complejo covalente de aptamero se pueden detectar y/o cuantificar por separado.
Se puede usar cualquiera de los metodos descritos en el presente documento para llevar a cabo un analisis multiplexado de una muestra de ensayo. Cualquiera de dicho analisis multiplexado puede incluir el uso de al menos dos, al menos decenas, al menos cientos o al menos miles de aptameros para ensayar simultaneamente un numero igual de moleculas diana en una muestra de ensayo, tal como una muestra biologica, por ejemplo. En estas realizaciones, se introduce en la muestra de ensayo una pluralidad de aptameros marcados, tales como fotoaptameros marcados, que tienen cada uno una afinidad especlfica por una molecula diana. Como se describe ademas en el presente documento, tras la formacion de complejos de afinidad de aptamero y la conversion en complejos covalentes de aptamero, los complejos covalentes de aptamero se unen a un soporte solido a traves de una pluralidad de sondas correspondientes que estan inmovilizadas sobre el soporte solido. Los complejos covalentes de aptamero se pueden poner en contacto con un agente de marcaje, ya sea antes o despues de la union de los complejos covalentes de aptamero al soporte solido. Las moleculas diana presentes en la muestra de ensayo se detectan y/o cuantifican mediante la deteccion del agente de marcaje en el complejo covalente de aptamero.
Otro aspecto de la presente invention se refiere a kits utiles para realizar convenientemente cualquiera de los metodos desvelados en el presente documento para analizar muestras de ensayo. Para mejorar la versatilidad de la presente invencion, los reactivos se pueden proporcionar combinados en un envase, en el mismo o recipientes separados, de modo que la proportion de los reactivos proporcione una optimization sustancial del metodo y del ensayo. Los reactivos pueden estar cada uno en recipientes separados, o se pueden combinar varios reactivos en uno o mas recipientes dependiendo de la reactividad cruzada y de la estabilidad de los reactivos.
Un kit comprende, en un envase combinado, al menos un aptamero marcado, un soporte solido que incluye al menos una sonda, y un agente de marcaje adecuado. El kit tambien puede incluir soluciones de lavado tales como medio acuoso tamponado para la dilution de la muestra, as! como el lavado de matrices, reactivos de preparation de la muestra, etcetera. Las cantidades relativas de los diversos reactivos en los kits se pueden variar ampliamente para proporcionar concentraciones de los reactivos que optimicen sustancialmente las reacciones que tienen que ocurrir durante el ensayo y optimicen aun mas sustancialmente la sensibilidad del ensayo. En circunstancias apropiadas, se pueden proporcionar uno o mas de los reactivos del kit en forma de un polvo seco, en general, liofilizado, incluyendo excipientes, que, tras la disolucion, proporcionaran una solution de reactivos que tendra las concentraciones apropiadas para realizar un metodo o ensayo de acuerdo con la presente divulgation. El kit puede incluir ademas una description por escrito de un metodo segun lo descrito en el presente documento.
En una realizacion ilustrativa, un kit para la deteccion y/o cuantificacion de una o mas moleculas diana que pueden estar presentes en una muestra de ensayo incluye al menos un aptamero que tiene afinidad especlfica por una molecula diana y que comprende un marcador; un agente de marcaje; y un soporte solido, en el que el soporte solido incluye al menos una sonda dispuesta sobre el mismo, y en el que la sonda es capaz de asociarse al marcador en el aptamero.
Ejemplos
Ejemplo 1. Ensavo de fotoaptamero que mide el VEGF diluido en serie en tampon y plasma usando la captura por hibridacion mediante sondas inmovilizadas en una superficie para la deteccion y cuantificacion
El presente ejemplo ilustra las etapas del ensayo ilustrado en las Fig. 2A, 2B y 2C para un solo fotoaptamero y su protelna diana. El ensayo se realiza usando dos muestras de ensayo diferentes, tampon y plasma.
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A. Preparacion de oliaonucleotidos. En este caso, se uso un marcador de oligonucleotido de ADN incluido en el extremo 3' del fotoaptamero. En este caso, el marcador era la region fija 3' usada durante el protocolo SELEX. Se sintetizo el fotoaptamero 509-80 de VEGF usando protocolos convencionales para la slntesis de ADN de fosforamidita en fase solida usando un sintetizador convencional. El fotoaptamero que contenla 5-BrdU se escindio y desprotegio en condiciones mas suaves que las convencionales en la slntesis de ADN, usando t- butilamina:metanol:agua en una proportion de 1:1:2 a 70 °C durante 5 horas, se filtro y se evaporo hasta sequedad. Se purifico el aptamero mediante precipitation en etanol seguida de HPLC de fase inversa. Se sintetizaron sondas de ADN complementarias al marcador en el fotoaptamero y que inclulan un grupo reactivo de amina como se ha descrito anteriormente, y se escindieron y desprotegieron usando protocolos convencionales para el ADN. Las sondas se purificaron usando solo precipitacion en etanol.
B. Inmovilizacion de las sondas de captura sobre una superficie reactiva con amina. Se sintetizo el complemento inverso del marcador de captura como se ha descrito anteriormente con una amina 5' y se acoplo a la superficie de un portaobjetos reactiva con amina compuesta de un sustrato de copollmero de olefina clclica (COC) recubierto de un copollmero de metacrilato, como se ha descrito ademas en la solicitud internacional numero PCT/CTS2006/008877 (WO 2006/101798), presentada el 14 de marzo de 2006, titulada "Polymer Compound for Biomedical Use and Biochip Substrate Using Such a Polymer Compound", y a la que se hace referencia en el presente documento como la “superficie de copollmero de metacrilato”. Se imprimieron sobre la superficie micromatrices de sondas de captura. En resumen, se hicieron reaccionar sondas de captura que contenlan amina con grupos ester activos incrustados en la superficie. Se diluyeron las sondas de captura hasta 20 pM en un tampon que consistla en fosfato de sodio 300 mM, borato de sodio 25 mM (pH 9,5 a 21 °C), Tween® 20 al 0,01 % y 4-dimetilaminopiridina (DMAP) 1 mM. Se depositaron sondas de captura en puntos de 250 pl por triplicado en la superficie del portaobjetos en una matriz usando un microarrayer GeneMachines OmniGrid Accent. Se incubaron los portaobjetos dispuestos en humedad al 65 % durante 1 hora a temperatura ambiente, seguida de 65 °C durante 1 hora y, finalmente, durante la noche a temperatura ambiente. Se hidrolizaron el resto de los grupos de amina reactiva en NaOH 20 mM durante 5 minutos, seguido de 10 enjuagues de H2O, y luego se seco bajo una corriente de N2. Antes de su uso, se almacenaron los portaobjetos a oscuras a temperatura ambiente en una camara de desecacion.
Se incubo el aptamero 509-80 de VEGF a una concentration 1 nM con protelna diana VEGF diluida en serie, de 5 nM a 1,6 pM, en 100 pl de diluyente de ensayo (1 x SB17 (HEPES 40 mM, NaCl 102 mM, KCl 5 mM, MgCl2 5 mM, EDTA 1 mM), Tween® 20 al 0,1 %, BSA al 0,05 %, 100 pg/ml de ADN de esperma de arenque) o en plasma al 10 % (plasma al 10 % en 1 x SB18 (HEPES 40 mM, NaCl 102 mM, KCl 5 mM, MgCh 5 mM), 200 pg/ml de ADN de esperma de arenque, Tween® 20 al 0,1 %). Se mezclaron suavemente las muestras y se incubaron a 37 °C durante 30 minutos. Se irradiaron las muestras con 1 Julio de 308 nm de luz emitida por un laser excimer (Tui Laser ExciStar S200, longitud de pulso de 10 ns, 200 Hz, 0,8 mJ por pulso). Se inicio la tincion mediante la adicion a cada muestra de 1 pl de succinimidil-Alexa647 a 10 mg/ml en DMSO. Se mezclaron las soluciones y se hicieron reaccionar durante la noche a 4 °C. Se interrumpio la reaction de tincion mediante la adicion de 5 pl de BSA al 10 % y la incubation durante 2 horas. Finalmente, se anadieron 18 pl de NaCl 5 M y 4,5 pl de Triton al 10 % a 90 pl de las muestras de plasma. Se conecto una junta Proplate Grace a un portaobjetos que contenla las sondas inmovilizadas, creando 16 pocillos. Se incubo cada pocillo durante 15 minutos a 42 °C con 80 pl de una solution compuesta de 600 pl de NaCl 5 M, 30 pl de Triton al 10 % y 3 ml de diluyente de ensayo. A continuation, se retiro esta solucion y se reemplazo por 80 pl de muestra. Se sellaron los pocillos con pellcula “F” Microseal y se mezclo el portaobjetos a 600 rpm, 37 °C en un termomezclador R de Eppendorf durante 3 horas. Se retiraron las soluciones de hibridacion y se enjuagaron los pocillos 3 veces con una solucion compuesta de SB17, Triton al 0,5 %, 100 pg/ml de ADN de esperma de arenque y NaCl 1 M. A continuacion, se retiro la junta y se coloco todo el portaobjetos en un frasco de pap en 30 ml de una solucion compuesta de SB17, Triton al 0,5 % y NaCl 1 M durante 30 minutos, seguido de un enjuague de 2 minutos en 1 x SB17, Tween® 20 al 0,05 %, seguido de un segundo enjuague de 30 segundos en 0,5 x SB17. Se seco el portaobjetos bajo una corriente de N2 y se exploro con un escaner fluorescente LS300 TECAN (excitation a 633 nm/emision a 670 nm). Se analizo la imagen TIF resultante con el programa informatico ArrayVision de Imaging Research, Inc. para aislar caracterlsticas y calcular sus intensidades medias usando tecnicas convencionales para el procesamiento de imagenes de micromatrices.
Los resultados se exponen en la Fig. 4, donde se han cuantificado los resultados del tampon (Fig. 4A) y del plasma (Fig. 4B) como se ha descrito anteriormente para la sonda de captura de aptamero de VEGF. La respuesta lineal para la dilution en serie en ambos medios, obtenida con la sustraccion del control de protelna sin tampon de cada respuesta, abarca el intervalo de 2 pM a 5 nM en concentracion de VEGF.
Ejemplo 2. Ensayo de fotoaptamero usando la captura por hibridacion mediante sondas inmovilizadas en una superficie para la deteccion y cuantificacion de multiples proteinas diana en tampon
El presente ejemplo ilustra las etapas del ensayo ilustrado en las Fig. 2A, 2B y 2C en un formato multiplexado usando 10 fotoaptameros y sus proteinas diana en tampon.
A. Preparacion del fotoaptamero marcado. Se asignaron marcadores de oligonucleotido unicos a cada fotoaptamero de los complementos inversos de un conjunto de sondas de expresion genica obtenidas de la
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matriz Test3 GeneChip®de Affymetrix. Los fotoaptameros marcados se prepararon como se ha descrito en el Ejemplo 1, a excepcion de que el grupo amino se anadio en el extremo 5' de los fotoaptameros. Antes de su uso, se calentaron las soluciones de aptamero hasta 95 °C durante 3 minutos, tras lo que se enfriaron de manera controlada hasta 37 °C a una velocidad de 0,1 °C por segundo.
B. Inmovilizacion de las sondas de captura sobre una superficie reactiva con amina. Se inmovilizaron los complementos inversos de los marcadores de captura como se ha descrito en el Ejemplo 1, a excepcion de que, en este caso, se uso una amina 3' para las sondas y que se uso Tween® 20 al 0,0025 % mientras que se elimino el DMAP del tampon de impresion. Se incubaron los portaobjetos impresos a 65 °C durante 2 horas, tras lo que se almacenaron durante la noche en un desecador. A continuacion, se trataron los portaobjetos con una solucion de metoxietilamina (pH 9,5 a 37 °C) para eliminar la sonda no unida y consumir el exceso de grupos ester activos de la superficie.
El ensayo sigue el esquema expuesto en las Fig. 2A, 2B y 2C. Se uso el protocolo basico descrito en el Ejemplo 1. Sin embargo, se multiplexaron 41 fotoaptameros y se diluyeron en serie 10 protelnas diana para un subconjunto de estos aptameros en las muestras. Los pares de protelna:fotoaptamero cuantificados en el presente ejemplo incluyen bFGF:6-7, ERBB4:1797-38, IL-1 R4:1472-3, MCP- 3:851-90, PAI-1:1921-52, TIMP-1:90536, tPA:987-51, uPA:1162- 70, VEGF:509-80, VEGF sR2:1546-23.
Se incubaron 41 fotoaptameros, cada uno a una concentracion de 2 nM, con 6 diluciones en serie de 10 protelnas diana y un control sin protelna en 100 pl de tampon de ensayo (SB17, Tween® 20 al 0,1 %) durante 30 minutos a 37 °C. Se irradiaron las muestras y se tineron como se ha descrito en el Ejemplo 1, a excepcion del uso de 2,1 pl de succinimidil-Alexa647, y se incubo la reaccion durante 2 horas a temperatura ambiente a oscuras. Se detuvo la reaccion de tincion mediante la adicion de 25 pl de NaCl 5 M, 5 pl de Triton X-100, 13,5 pl de glicina 100 mM y 1,5 pl de 10 mg/ml de ADN de esperma de arenque, y se incubo durante 40 minutos a temperatura ambiente a oscuras, seguido de 2 minutos a 70 °C. Antes de la hibridacion, se prepararon portaobjetos con juntas dispuestos con sondas de hibridacion como se ha descrito en el Ejemplo 1. Se elimino la solucion de prehibridacion y se anadieron las muestras de hibridacion a los pocillos, y se incubaron a 45 °C durante 2 horas en una camara humeda. Se retiraron las soluciones de hibridacion y se enjuagaron los pocillos 3 veces con una solucion de lavado a 45 °C compuesta de 1 x SB17, Triton X-100 al 0,33 % y clorhidrato de guanidinio 1 M. A continuacion, se retiraron las juntas y se coloco cada portaobjetos entero en un frasco de pap con el tampon de lavado durante 20 minutos a 45 °C, tras lo que se enjuagaron durante 2 minutos en 1 x SB17, Tween® 20 al 0,1 % y un enjuague final en 0,25 x SB17. Se seco el portaobjetos, se examino y se cuantifico como se ha descrito en el Ejemplo 1. Los resultados se exponen en la Fig. 5, que ilustra la senal generada a partir del ensayo multiplexado para concentraciones de protelna que varlan de 10 pM a 1 nM en tampon para diez protelnas diana.
Ejemplo 3. Ensayo de fotoaptamero usando la captura por hibridacion mediante sondas inmovilizadas en una superficie para la deteccion y cuantificacion de multiples protelnas diana en suero
El presente ejemplo demuestra la utilidad del ensayo ilustrado en las Fig. 2A, 2B y 2C en un formato multiplexado usando 57 fotoaptameros para mediciones en muestras de suero.
A. Preparacion de fotoaptamero marcado. Los fotoaptameros marcados se prepararon como se ha descrito en el Ejemplo 2.
B. Inmovilizacion de sondas de captura en una superficie reactiva con amina. Los complementos inversos de los marcadores de captura se inmovilizaron como se ha descrito en el Ejemplo 2.
Se dividieron los 57 fotoaptameros en dos grupos para la multiplexacion, uno de 27 aptameros hacia dianas poco abundantes y otro de 30 aptameros hacia dianas muy abundantes en suero o plasma humano. Se prepararon 14 muestras de suero en dos diluciones y se mezclaron con los dos conjuntos de aptameros, dando una concentracion final de 1 nM para cada aptamero y suero al 10 %, 0,9 x SB1, Tween® 20 al 0,1 %, 50 mg/ml de ADN largo de esperma de arenque, 10 mg/ml (BrdU)30 para el conjunto de los 27 aptameros y suero al 1 %, 0,99 x SB1, Tween® 20 al 0,1 %, 5 mg/ml de ADN largo de esperma de arenque, 1 mg/ml de (BrdU)3o para el conjunto de los 30 aptameros. SB1 se compone de HEPES 40 mM, NaCl 102 mM, KCl 5 mM, MgCl2 1 mM y CaCl2 1 mM. Se equilibraron las muestras, se reticularon y se tineron como se ha descrito en el Ejemplo 2. Se detuvo la reaccion de tincion mediante la adicion de 10 pl de BSA baja en acidos grasos (FA) al 10 %, 25 pl de NaCl 5 nM, 5 pl de Triton X100 al 10 % y 7 pl de glicina 100 mM, y se incubaron durante 40 minutos a temperatura ambiente. Tras la inactivacion, se anadieron 1,5 pl de SDS al 10 % y se calentaron las muestras hasta 42 °C durante dos minutos.
Se prepararon portaobjetos con juntas como se ha descrito en el Ejemplo 1 y se incubaron con 1 x SB1, Tween® 20 al 0,1 %, BSA baja en acidos grasos (FA) al 0,66 %, NaCl 830 mM, Triton X100 al 0,33 %, SDS al 0,1 %, 50 mg/ml de ADN largo de esperma de arenque y 10 mg/ml de (BrdU)30 durante 15 minutos. Se retiro el tampon de prehibridacion, se anadieron las muestras tenidas y se incubaron en una camara humeda a 60 °C durante 2 horas. Tras la hibridacion, se lavaron, se secaron, se exploraron y se cuantificaron los portaobjetos como se ha descrito en el Ejemplo 2.
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La Fig. 6 muestra las senales cuantificadas de las imageries exploradas para las mediciones replicadas de los 57 fotoaptameros para las muestras de suero de dos individuos. Las mediciones demostraron ser altamente reproducibles, con correlaciones de Pearson mejores que 0,99 para las mediciones de aptamero entre las muestras replicadas.
Ejemplo 4. Desafio cinetico con dilucion en ensavos de fotoaptamero usando la captura por hibridacion mediante sondas inmovilizadas en una superficie
El presente ejemplo ilustra el uso de dos etapas opcionales en el ensayo representado en la Fig. 3, un desafio cinetico seguido de la eliminacion de protelna libre. El desafio cinetico, realizado por dilucion, ilustra la perdida de complejos no especlficos de protelna-aptamero con la retencion de los complejos de afinidad de aptamero-diana en plasma. El presente ejemplo tambien ilustra el uso de la captura de perlas para concentrar la muestra tras la dilucion y permitir la extraccion de protelna libre antes de la tincion.
A. Preparacion del fotoaptamero marcado 987-51. El fotoaptamero marcado se preparo como se ha descrito en el Ejemplo 2.
B. Inmovilizacion de sondas de captura sobre una superficie de reactiva con amina. Los complementos inversos de los marcadores de captura se inmovilizaron como se ha descrito en el Ejemplo 2.
Se mezclo el fotoaptamero 987-51 a una concentration 20 nM con dos controles sin protelna y 10 concentraciones diluidas en serie de protelna diana tPA, bien en tampon de ensayo (SB17, Tween® 20 al 0,1 %) o plasma (plasma al 10 % en SB18, Tween® 20 al 0,1 %). Para evaluar la respuesta en ausencia de un desafio cinetico, se prepararon dos muestras de control adicionales tanto en tampon como en plasma, uno sin protelna y otro con la concentracion de protelna mas alta. Estas 28 muestras en volumenes de 10 pl, 14 para cada tampon y plasma, se incubaron durante 30 minutos a 37 °C. Las primeras 12 muestras, tanto en tampon como en plasma, se diluyeron 50 veces mediante la adicion de SB17, Tween® 20 al 0,1 % y se incubaron durante 5 minutos, seguido de la irradiation de las veintiocho muestras con 1 J de luz UV (fuente de luz filtrada de lampara de Hg OAI). Tras la irradiacion, se diluyeron las dos muestras restantes cada una en tampon y plasma 50 veces como se ha descrito anteriormente.
Se ajusto cada muestra a NaCl 1 M y se incubo a 45 °C durante 90 minutos con 25 pg de perlas paramagneticas Dynal acopladas a un oligonucleotido complementario al extremo 3' del aptamero 987-51. Se centrifugaron las muestras a 1.000 g durante 2 minutos y se elimino el sobrenadante. Se lavaron las perlas 3 veces con 100 pl de SB17, Tween® 20 al 0,1 %. Se suspendieron las perlas en bicarbonato de sodio 100 mM, EDTA 1 mM, Tween® 20 al 0,02 %, 0,2 mg/ml de colorante Alexa647-NHS, y se agitaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Se elimino la solution de tincion y se reemplazo por 100 pl de SB17, Tween-20 al 0,1 %, glicina 10 mM para inactivar la reaction de tincion. A continuation, se lavaron las perlas 3 veces con volumenes de 100 pl de tampon de lavado de guanidina (SB17, Tween-20 al 0,1 %, Triton X-100 al 0,33 %, clorhidrato de guanidina 1 M), se suspendieron en 70 pl de Triton X-100 al 0,33 %, 1 mg/ml de sulfato de dextrano y se calentaron hasta 95 °C durante 5 minutos para eluir los aptameros de las perlas magneticas. Se prepararon portaobjetos con juntas y se prehibridaron como se ha descrito en el Ejemplo 2. Se transfirieron 65 pl de cada sobrenadante que contenla aptameros eluidos a un pocillo que contenla 25 pl de NaCl 3,6 M, HEpEs 144 mM, Triton X-100 al 0,33 %. Se incubaron los portaobjetos en una camara humeda a 45 °C durante la noche, luego se lavaron, se secaron, se exploraron y se cuantificaron como se ha descrito en el Ejemplo 2.
La Fig. 7 muestra una representation grafica de los resultados en tampon (•) y plasma (▲) despues de la dilucion de 50 veces. La senal obtenida a partir de las muestras de control con alto contenido de protelna sin dilucion ((o) tampon, (A) plasma) coincide bien con los valores diluidos, lo que indica poca perdida de senal diana durante el desafio cinetico. El RFU de plasma sin protelna sin y con dilucion es 838 RFU (□ a 0,1 pM) y 131 RFU (A), lo que resulta en una calda del 84 % de la senal, presumiblemente debida a la eliminacion de los complejos no especlficos de aptameros durante el desafio cinetico.
Ejemplo 5. Desafio cinetico con competidores en ensavos de fotoaptamero usando la captura por hibridacion mediante sondas inmovilizadas en una superficie
El presente ejemplo ilustra la etapa opcional de introducir un desafio cinetico en el ensayo representado en la Fig. 3. El desafio cinetico, realizado en el presente ejemplo mediante la adicion de una molecula competidora, ilustra la perdida de complejos no especlficos de aptamero-protelna manteniendo a la vez los complejos de afinidad de aptamero-diana en plasma.
A. Preparacion del fotoaptamero marcado 987-51. El fotoaptamero marcado se preparo como se ha descrito en el Ejemplo 2.
B. Inmovilizacion de sondas de captura sobre una superficie de reactiva con amina. Los complementos inversos de los marcadores de captura se inmovilizaron como se ha descrito en el Ejemplo 2.
Se mezclo el fotoaptamero 987-51 a una concentracion 20 nM con un control sin protelna y 6 concentraciones
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diluidas en serie de protelna diana tPA en plasma al 10 % diluido en SB18, Tween® 20 al 0,1 %. Se prepararon dos conjuntos de muestras para facilitar las comparaciones entre las muestras con y sin adicion de competidor. Cada solucion se incubo a 37 °C durante 30 minutos. Tras 30 minutos de equilibrado, se anadio la mitad de cada muestra de un conjunto al mismo volumen de competidor dN15 550 pM en SB17, Tween® 20 al 0,1 % a 37 °C y se incubo durante 9 minutos, seguido de la irradiacion como se ha descrito en el Ejemplo 4. Tras la irradiacion, se anadio SB17, Tween-20 al 0,1 %, al conjunto de muestras sin competidor para igualar el volumen de la adicion de competidor. Se tineron las muestras como se ha descrito en el Ejemplo 4, a excepcion de que el tiempo de incubacion fue de 2 horas. Se detuvo la reaccion de tincion con la adicion de 45 pl de NaCl 0,83 M, Triton X-100 al 0,33 %, 0,1 mg/ml de ADN largo de esperma de arenque y glicina 9 mM. Se mezclaron las muestras y se incubaron a oscuras a temperatura ambiente durante 40 minutos, tras lo que se calentaron hasta 70 °C durante 2 minutos.
Se prepararon portaobjetos con juntas como se ha descrito en el Ejemplo 2 y se incubaron en una solucion de SB18, Tween® 20 al 0,1 %, Triton X-100 al 0,33 % y 100 pg/ml de ADN largo de esperma de arenque. Se anadieron muestras a los pocillos de los portaobjetos y se incubaron en una camara humeda a 45 °C durante la noche, y luego se lavaron, se secaron, se exploraron y se cuantificaron como se ha descrito en el Ejemplo 2.
Los resultados se muestran en la Fig. 8, donde se presentan las curvas de dosis-respuesta para tPA en plasma con y sin la adicion de competidor. El valor del plasma sin adicion de protelna se reduce en un 70 % debido a la adicion del competidor, mientras que la respuesta a la concentracion de diana mas alta permanece invariable en presencia competidor.
Ejemplo 6. Desafio cinetico con captura de perlas v lavado de complejos de afinidad de aptamero en ensavo de fotoaptamero usando captura por hibridacion mediante sondas inmovilizadas en una superficie
El presente ejemplo ilustra la etapa opcional de introducir un desafio cinetico en el ensayo representado en la Fig. 3. El desafio cinetico del presente ejemplo se lleva a cabo mediante la captura de complejos de afinidad de aptamero sobre perlas y el lavado de los complejos inmovilizados de manera que las proteinas diana disociadas se eliminen antes de la reticulacion.
A. Preparacion de los fotoaptameros marcados 987-51, 1152-1146 v 1920-1. Los fotoaptameros marcados se
prepararon como se ha descrito en el Ejemplo 2.
B. Inmovilizacion de sondas de captura sobre una superficie reactiva con amina. Los complementos
inversos de los marcadores de captura se inmovilizaron como se ha descrito en el Ejemplo 2.
Se mezclaron los fotoaptameros 987-51, 1152-46 y 1920-1 a la concentracion 4 nM con sondas biotiniladas complementarias a la secuencia de marcador unica de cada fotoaptamero a la concentracion 8 nM, y se incubaron durante 15 segundos a 95 °C y, a continuacion, se enfriaron lentamente a 0,1 °C por segundo hasta 37 °C. Se mezclaron los complejos de fotoaptamero-sonda biotinilada a una concentracion de fotoaptamero 0,2 nM:sonda 0,4 nM con un control sin proteinas y 6 concentraciones diluidas en serie de proteinas diana de tPA, PAI-1 e IL-6, bien en tampon de ensayo (SB17, Tween® 20 al 0,1 %) o plasma (plasma al 10 % en SB18, Tween® 20 al 0,1 %). Se incubaron estas 14 muestras en volumenes de 100 pl, 7 para tampon y 7 para plasma, durante 30 minutos a 37 °C, tras lo que se anadieron 50 mg de perlas de estreptavidina Dynal MyOne a cada muestra y se incubaron durante 2 minutos a 37 °C con mezclado para capturar los complejos de fotoaptamero:sonda biotinilada:proteina no covalentes. Se lavaron las perlas 3 veces durante 30 segundos con 100 ul de SB17, Tween® 20 al 0,1 %, 0,1 mg/ml de ADN de esperma de arenque, se volvieron a suspender en 100 pl de lo mismo y se irradiaron con 4 J de luz UV (fuente de luz filtrada de lampara de Hg OAI) con mezclado.
Se lavaron las perlas una vez con bicarbonato de sodio 100 mM, EDTA 1 mM, Tween® 20 al 0,1 %, se volvieron a suspender en bicarbonato de sodio 100 mM, EDTA 1 mM, Tween® 20 al 0,1 %, 0,2 mg/ml de colorante Alexa647- NHS, y se agito a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuacion, se lavaron las perlas 3 veces con 100 pl de SB17, Tween® 20 al 0,1 %, Triton X-100 al 0,33 %, clorhidrato de guanidina 1 M, glicina 25 mM, una vez con 100 pl de SB17, Tween® 20 al 0,1 %, Triton X-100 al 0,33 %, y se suspendieron en 95 pl HEPES 40 mM, pH 7,5, Triton X- 100 al 0,33 % y se calentaron hasta 70 °C durante 5 minutos para eluir los aptameros de las perlas magneticas. Se prepararon portaobjetos con juntas y se prehibridaron como se ha descrito en el Ejemplo 2. Se combinaron 90 pl de cada sobrenadante que contenia aptameros eluidos con 30 pl de HEPES 40 mM, pH 7,5, NaCl 3 M, Triton X-100 al 0,33 %, se incubaron durante 2 minutos a 70 °C, y se transfirieron 110 pl de cada uno a los pocillos de los portaobjetos. Se incubaron los portaobjetos en una camara humeda a 45 °C durante la noche. Se retiraron las muestras y se enjuagaron tres veces con 150 pl de SB17, Tween® 20 al 0,1 %, Triton X-100 al 0,33 %, clorhidrato de guanidina 1 M a 45 °C. Se desmontaron los portaobjetos con juntas, se colocaron en un frasco de pap que contenia 30 ml de SB17, Tween® 20 al 0,1 %, Triton X-100 al 0,33 %, clorhidrato de guanidina 1 M, y se mezclaron por rotacion durante 20 minutos a 45 °C. A continuacion, se transfirieron los portaobjetos a un frasco de pap que contenia 30 ml de SB17, Tween® 20 al 0,1 %, y se mezclo por rotacion durante 2 minutos a 20 °C, se transfirio a un frasco de pap que contenia 30 ml de 0,2 x SB17, Tween® 20 al 0,02 % durante 15 segundos sin mezclar, y se seco, se exploro y se cuantifico como se ha descrito en el Ejemplo 2.
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La Fig. 9 muestra una representacion grafica de los resultados para el aptamero tPA 987-51 (Fig. 9A.), el aptamero PAI-1 1152-46 (Fig. 9B) y el aptamero IL-6 1920-1 (Fig. 9C) en tampon (•) y plasma (▲). Los valores de RfU se han corregido restando el valor de RFU de tampon sin protelna para cada aptamero. Los valores de RFU de plasma sin protelna corregidos para estos aptameros (A a 1 pM) son 66, 26 y 49 RFU, respectivamente.
Ejemplo 7. Eliminacion del fotoaptamero libre en el ensavo de fotoaptamero usando captura por hibridacion mediante sondas inmovilizadas en una superficie
El presente ejemplo ilustra la etapa opcional de eliminacion del aptamero libre antes de la captura por hibridacion en la superficie, como se representa en la Fig. 3. El aptamero libre se elimina por precipitacion de la protelna y los complejos covalentes de aptamero-protelna por K+/SDS, mientras que el aptamero libre permanece en solucion. Se desecha el sobrenadante que contiene aptamero libre y se suspende el sedimento para completar la etapa.
A. Preparacion de fotoaptameros marcados. El fotoaptamero marcado se preparo como se ha descrito en el Ejemplo 2
B. Inmovilizacion de sondas de captura sobre una superficie reactiva con amina. Los complementos inversos de los marcadores de captura se inmovilizaron como se ha descrito en el Ejemplo 2.
Se prepararon las reacciones de union en SB18 como se ha descrito en el Ejemplo 1 para contuvieran una concentracion final de fotoaptamero de 2 nM y protelnas diana diluidas en serie de 2 nM a 0,64 pM ademas de un control sin protelnas. Se incubaron las reacciones a 37 °C durante 30 minutos y se irradiaron como se ha descrito en el Ejemplo 1. Se transfirieron las muestras a tubos Eppendorf de 1,5 ml y se anadieron 10 ml de plasma combinado. Se anadieron 300 gl de la siguiente solucion de SDS a cada muestra: sDs al 1,33 %, 1,33 gg/ml de ARNt y HEPES 10 mM (pH 7,5) (400 gl de volumen final). Se agitaron las muestras vigorosamente durante 10 segundos, y a continuacion, se incubaron a 37 °C durante 10 minutos. Se anadieron 6 gl de KCl 2,5 M a cada reaccion y se agitaron vigorosamente las muestras durante 10 segundos y luego se mantuvieron en hielo durante 10 minutos. Se sedimentaron los precipitados por centrifugacion a 8.000 g durante 5 minutos a 4 °C en un microcentrifugador. Se desecharon los sobrenadantes resultantes. Se lavaron los sedimentos anadiendo KCl 200 mM frlo, HEPES 10 mM (pH 7,5), seguido de mezcla de vortice suave durante 5 segundos. Se volvio a sedimentar el precipitado de nuevo por centrifugacion a 8.000 g durante 5 minutos a 4 °C. Se desecharon los sobrenadantes lavados. Se suspendio cada sedimento en 200 gl de agua caliente (> 37 °C), EDTA 1 mM, HEPES 10 mM (pH 7,5). Se anadieron las perlas paramagneticas descritas en el Ejemplo 4 a cada muestra, y se mezclo vigorosamente la suspension de microesferas a 50 °C durante 30 minutos. Usando un iman de placa de micropocillos, se lavaron las perlas 3 veces con 100 gl de SB17, tampon de Tween® 20 al 0,1 %. Se suspendieron las perlas en tampon de carbonato (pH 8,5) que contenla 0,2 mg/ml de NHS-Alexa647 reactivo con amina y se incubaron a 25 °C durante 60 minutos con mezclado constante. Se detuvo la reaccion, se lavaron las perlas, se eluyeron los aptameros y se hibridaron como se ha descrito en el Ejemplo 4. Se exploraron los portaobjetos y se cuantificaron como se ha descrito en el Ejemplo 1.
La Fig. 10 muestra los resultados para las muestras tratadas con y sin eliminacion del aptamero libre. Las senales son mas altas cuando los aptameros no complejados se eliminan de la muestra antes de introducir la muestra en las sondas.
Ejemplo 8. Generacion de senal de ensavo UPS en condiciones que afectan a la senal del compleio de afinidad de aptamero pero no al compleio covalente de aptamero
El presente ejemplo demuestra el efecto de la union covalente de una molecula diana a su fotoaptamero cuando se usan detergente y una alta concentracion de sal durante la hibridacion del complejo de fotoaptamero con su sonda en el soporte solido. Se comparan los resultados de un ensayo realizado con y sin reticulacion covalente, mediado en este caso por fotoactivacion, para una muestra de plasma y una muestra que contiene bFGF en tampon.
A. Preparacion del fotoaptamero marcado 6-7. El marcador de oligonucleotido usado en el presente documento fue la region fijada 3' usada durante el protocolo SELEX. El fotoaptamero bFGF 6-7 se sintetizo como se ha descrito en el Ejemplo 1.
B. Inmovilizacion de sondas de captura sobre una superficie reactiva con amina. Los complementos inversos de los marcadores de captura se inmovilizaron como se ha descrito en el Ejemplo 1.
Se preparo 6-7 1 nM en las soluciones de union de tampon y de plasma como se ha descrito en el Ejemplo 1. Se anadio protelna bFGF 10 nM a la muestra de tampon solamente. Se mezclaron las muestras suavemente y se incubaron a 37 °C durante 30 minutos. Se irradio un conjunto de muestras como se ha descrito en el Ejemplo 1 y un conjunto repetido de las muestras no se irradio. Se tineron las muestras como se ha descrito en el Ejemplo 1, a excepcion de que el tiempo de reaccion fue de 3 horas a temperatura ambiente, seguido de la adicion de 10 gl de BSA, 25 gl de NaCl 5 M y 5 gl de Triton X-100 al 10 % y una incubacion de 2 horas. Se preparo el portaobjetos como en el Ejemplo 1 y se anadieron 80 gl de una solucion de prehibridacion (500 gl de NaCl 5 M y 100 gl de Triton al 10 % a 2 ml de tampon de muestra) a cada pocillo durante 15 minutos a 42 °C. Se retiro la solucion de prehibridacion y se reemplazo por 80 gl de muestra. Se sellaron los pocillos con una pellcula “F” de Microseal y, a
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continuacion, se mezclaron los portaobjetos a 600 rpm, 40 °C en un termomezclador R de Eppendorf durante 2 horas, seguido de 20 minutos a 35 °C. Se enjuagaron los pocillos dos veces con 1 x SB17, Triton al 0,5 %, NaCl 1 M y despues se incubaron en el segundo lavado durante 15 minutos. Tras la hibridacion, se trato el portaobjetos como se ha descrito en el Ejemplo 1, a excepcion de que las 3 veces de lavado fueron de 15 minutos, 2 minutos y 30 segundos. Se seco el portaobjetos, se exploro y se cuantifico como se ha descrito en el Ejemplo 1.
Los resultados para el fotoaptamero bFGF 6-7 se presentan en la Fig. 11. Las senales obtenidas para bGFG 10 nM en tampon y en plasma al 10 % se observan dependientes de la luz. La senal en las muestras sin luz, donde no puede ocurrir la union covalente de la diana con el fotoaptamero, es comparable a la senal observada fuera de una caracterlstica, denominada "fondo general" en el presente documento. La concentracion endogena de bFGF en el plasma al 10 % es bastante baja, como se refleja en la baja senal en el plasma frente a la respuesta de senal sin luz y de fondo general.
Ejemplo 9. Deteccion de C4b reticulado a un fotoaptamero de ADN compuesto de los nucleotidos 5-bencil-dT y 5-bromo-dC en tampon
El presente ejemplo ilustra la actividad de los fotoaptameros que contienen nucleotidos modificados en el formato de ensayo ilustrado en las Fig. 2A, 2B y 2C. El fotoaptamero de ADN (1987-74) hacia la protelna C4b se compone de los nucleotidos 5-bencil-dT y 5-bromo-dC en lugar de los dT y dC convencionales.
A. Preparacion de fotoaptamero 1987-74 marcado. Se amplificaron insertos vectoriales que contenlan las secuencias de aptamero a partir de celulas de E. coli por PCR con cebadores especlficos de las regiones de aptamero fijadas. Se biotinilo el cebador 3', permitiendo la captura del producto de PCR sobre perlas de estreptavidina MyOne. Despues del lavado, se elimino la cadena no biotinilada del duplex capturado con un lavado de NaOH 20 mM, y se crearon los aptameros mediante la extension del cebador con un oligonucleotido con un marcador de captura unico acoplado a la secuencia del cebador 5'. La extension del cebador se realizo con el molde de ADN todavla acoplado a la perla de estreptavidina en una mezcla que contenla dATP, 5-Br- dCTP, dGTP y 5-bencil-dUTP usando ADN polimerasa de KOD para incorporar los nucleotidos modificados. Se recogio el aptamero de las perlas con un lavado de NaOH 20 mM seguido de la neutralizacion con HCl.
B. Inmovilizacion de sondas de captura sobre una superficie reactiva con amina. Los complementos inversos de los marcadores de captura se inmovilizaron como se ha descrito en el Ejemplo 1.
Se incubo una concentracion final de 2 nM de 1987-74 con una serie de diluciones de protelna C4b en SB17, de Tween® 20 al 0,1 % a las siguientes concentraciones: 25 nM, 5 nM, 1 nM, 0,2 nM, 0.04 nM y un control sin protelna. Se equilibraron las muestras y se irradiaron como en el Ejemplo 1, tras lo que se anadieron 2 ml de ADN de esperma de arenque (10 mg/ml). Se marco con fluorescencia la protelna C4b mediante la adicion de 7,5 pl de NHS-Alexa-647 (1,33 mg/ml en DMSO) a cada muestra y se incubo durante 2 horas a temperatura ambiente. Se anadieron 25 pl de NaCl 5 M, 5 pl de Triton-100 al 10 % y 1 pl de glicina 100 mM para inactivar el marcador sin reaccionar, interrumpir las interacciones no covalentes y facilitar la posterior hibridacion.
Se prepararon portaobjetos con juntas como se ha descrito en el Ejemplo 1 y se incubaron con una solucion que contenla SB17, Tween® 20 al 0,1 %, NaCl 0,8 M, 20 pg/ml de ADN de esperma de arenque y Triton X-100 al 0,33 % durante 15 minutos a 42 °C. Despues de retirar la solucion, se anadieron 80 pl de muestra marcada al portaobjetos, uno por cada submatriz, y se incubo durante 30 minutos a 42 °C en una plataforma giratoria. Se retiraron las muestras y se lavaron los sustratos dos veces con la solucion de prehibridacion, una vez con solucion de prehibridacion sin ADN de esperma de arenque o Tween® 20, una vez con 1 x SB17, Tween® 20 al 0,1 %, y una vez con 0,25 x SB17. A continuacion, se secaron los portaobjetos, se exploraron y se cuantificaron como se ha descrito en el Ejemplo 1.
La Fig. 12 muestra la curva de dosis-respuesta resultante de 1987-74 obtenida en funcion de la concentracion diana, que ilustra la actividad de los aptameros de nucleotidos modificados en el ensayo.
Ejemplo 10. Ensayo de captura por hibridacion UPS en dos superficies diferentes usando dos metodos de tincion independientes
El presente ejemplo demuestra la funcionalidad del ensayo en dos superficies de diferente composicion, la superficie de copollmero de metacrilato de los ejemplos anteriores y una superficie reactiva con amina Schott Nexterion sobre un sustrato de vidrio. Ademas, se lleva a cabo la reaccion de tincion de protelnas dianas como en los ejemplos anteriores mediante la union directa de Alexa-647 a la protelna diana o marcando primero la protelna diana con biotina seguido del marcaje con estreptavidina-Alexa-647. El ensayo permite la deteccion cuantitativa de la protelna VEGF en tampon usando bien la superficie o el metodo de tincion.
A. Preparacion de fotoaptamero marcado 509-80. Los fotoaptameros marcados se prepararon como se ha descrito en el Ejemplo 1.
B. Inmovilizacion de sondas de captura sobre superficie reactiva con amina. Se sintetizo la sonda de captura con una amina 5' como se ha descrito en el Ejemplo 1 y se inmovilizo en ambas superficies. La
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inmovilizacion en el portaobjetos Schott Nexterion se llevo a cabo mediante la disolucion de la sonda, ya sea a 40 o 20 pM en un tampon compuesto de fosfato de sodio 300 mM (pH 8,5), Tween® 20 al 0,005 % y sarcosilo al 0,001 %. Se depositaron las sondas de captura como se ha descrito en el Ejemplo 1. Tras la deposition de la sonda, se incubaron los portaobjetos durante la noche en una caja seca y despues se incubaron con bicarbonato de sodio 100 mM (pH 8,5) y Tween® 20 al 0,1 % durante 8 horas a temperatura ambiente. Luego, se enjuagaron los portaobjetos con agua 10 veces y se secaron bajo una corriente de N2. Se inmovilizo la sonda de captura sobre la superficie de copollmero de metacrilato mediante el protocolo descrito en el Ejemplo 1.
Se incubo el aptamero 509-80 de VEGF a concentration de 1 nM en un volumen de 100 pl con 6 concentraciones de VEGF diluidas en serie, de 50 nM a 16 pM, y un control sin protelna en diluyente de ensayo (SB17, Tween® 20 al 0,1 %, BSA al 0,05 %, 100 pg/ml de ADN de esperma de arenque). Se mezclaron las muestras suavemente y se incubaron a 37 °C durante 15 minutos, tras lo que se irradiaron como se ha descrito en el Ejemplo 1. Se dividieron las muestras y se tineron directamente con NHS-Alexa-647 o mediante la reaction con NHS-PEO4-biotina y, posteriormente, se tineron con estreptavidina Alexa-647. Para la tincion con NHS-Alexa-647, se uso el procedimiento del Ejemplo 1, excepto que la reaccion se produjo a temperatura ambiente durante 4 horas. Para la reaccion con NHS-PEO4-biotina, se anadio 1 pl de NHS-pEO4-biotina 20 mM disuelto en DMSO a 100 pl de muestra. Se mezclo la solution y se incubo a temperatura ambiente durante 4 horas. Se detuvieron ambas reacciones de tincion mediante la adicion de 23 pl de NaCl 5 M, 11,4 pl de BSA al 10 % y 1,1 pl de Triton X-100 al 10 % y se dejo incubar durante 2 horas.
Se sellaron con una junta los dos portaobjetos diferentes como se ha descrito en el Ejemplo 1 y se prehibridaron con 1 x SB17, Triton X-100 al 0,1 %, BSA al 0,5 % y 100 pg/ml de ADN de esperma de arenque durante 15 minutos a 42 °C. Se retiro la solucion y se reemplazo por 80 pl de muestra. Se sellaron los pocillos con pellcula “F” Microseal y se mezclaron los portaobjetos a 600 rpm, 42 °C en un termomezclador R de Eppendorf durante 3 horas, seguidas de 1 hora a 34 °C. Para las muestras marcadas directamente con NHS-Alexa-647, se lavaron los pocillos 3 veces con 1 x SB17, Triton X-100 al 0,5 % y NaCl 1 M. Se retiro la junta y se coloco todo el portaobjetos en un frasco de pap en 30 ml de SB17, Triton al 0,5 %, NaCl 1 M durante 30 minutos, seguido de un enjuague de 2 minutos en 1 x SB17, Tween® 20 al 0,1 %, seguido de un enjuague de 20 segundos en 0,25 x SB17. Para las muestras que se hablan hecho reaccionar con NHS-PEO4-biotina, se enjuagaron los pocillos 3 veces con 1 x SB17, Tween® 20 al 0,1 %, NaCl 0,5 M, 100 pg/ml de ADN de esperma de arenque, BSA al 0,5 % (tampon de tincion de estreptavidina). Se preparo una solucion de 4 pg/ml de estreptavidina-Alexa 647 en tampon de tincion de estreptavidina y se anadieron 80 pl de esta solucion a cada pocillo durante 15 minutos a 37 °C. A continuation, se enjuagaron los pocillos 3 veces con 1 x SB17, Tween® 20 al 0,1 %. Se retiro la junta y se coloco todo el portaobjetos en un frasco de pap de 30 ml en 1 x SB17, Tween® 20 al 0,1 % durante 30 minutos, seguido de un enjuague 20 segundos en 0,25 x SB17. Los portaobjetos se secaron, se exploraron y se cuantificaron como se ha descrito en el Ejemplo 1.
La Fig. 13 muestra los resultados para la superficie Schott Nexterion (Fig. 13A) y la superficie de copollmero de metacrilato (Fig. 13B) para la respuesta a la dosis en funcion de la concentracion de protelnas. Ambas superficies dan resultados cuantitativos similares, lo que demuestra la independencia en la superficie del ensayo. Tambien se observa que las dos estrategias de tincion son comparativamente eficaces.
Ejemplo 11. Deteccion de protelnas diana VEGF y bFGF en tampon y suero mediante captura por hibridacion de las protelnas fotorreticuladas en una matriz GeneChip® Test3 de Affymetrix en una superficie de cuarzo recubierta
El presente ejemplo demuestra la utilidad de otra superficie mas, una matriz GeneChip® Test3 de Affymetrix (superficie de vidrio de cuarzo), para la etapa de captura por hibridacion del ensayo. Los ensayos se realizaron tanto en tampon como en suero.
A. Slntesis de fotoaptamero marcado 509-80 y 6-7. Se asignaron los complementos inversos de las dos sondas designadas 201 y 1121 en la matriz GeneChip® Test3 de Affymetrix a los aptameros 509-80 y 6-7, y se prepararon como se ha descrito en el Ejemplo 1.
B. Inmovilizacion de sondas de captura sobre superficie reactiva con amina. Se adquirio una matriz GeneChip® Test3 en Affymetrix con sondas que se sintetizaron in situ.
Se preparo un volumen de 100 pl de aptamero 509-80 de VEGF y aptamero 6-7 de bFGF, cada uno a una concentracion de 2 nM, con protelna VEGF y bFGF 20 nM en diluyente de ensayo (1 x SB17, Tween® 20 al 0,1 %, BSA al 0,02 %, 100 pg/ml de DNA de esperma de arenque). Se mezclaron las muestras suavemente y se incubaron a 37 °C durante 60 minutos, a continuacion, se irradiaron y se tineron con NHS-PEO4-biotina como se ha descrito en el Ejemplo 9, excepto que el tiempo de reaccion fue de 1 hora. Se detuvo la reaccion mediante la adicion de 10 pl de BSA al 10 %, 1 pl de 10 mg/ml de ADN de esperma de arenque, 5 pl de Triton X-100 al 10 % y 25 pl de NaCl 5 M. Se anadieron 10 pl de suero a una muestra para aproximarse a una muestra de suero al 10 %.
Se incubaron matrices GeneChip® Test3 de Affymetrix con 100 pl de una solucion compuesta de 100 pl de diluyente de ensayo, 10 pl de BSA al 10 %, 1 pl de 10 mg/ml de ADN de esperma de arenque, 25 pl de NaCl 5 M, 5 pl de
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Triton X-100 al 10 % y 7 |jl de DMSO durante 1 hora a 45 °C, tras lo que se anadieron 100 jl de la muestra a la camara de la matriz Test3 y se incubaron durante 60 minutos a 45 °C y luego se enjuagaron con un tampon compuesto de 1 x SB1, Triton X-100 al 0,5 % y NaCl 1 M. A continuacion, se colocaron las matrices en estacion de fluidos GeneChip® de Affymetrix, que realiza los procedimientos de lavado y tincion convencionales de Affymetrix. Luego se leyeron y cuantificaron las matrices en el escaner de Affymetrix. Los resultados se exponen en la Fig. 14. En tampon (Fig. 14a), el aptamero VEGF se hibrida a la sonda 201 (indicada como 1 en la figura) con una intensidad de 3.500 RFU, y el aptamero de bFGF se hibrida a la sonda 1121 (indicada como 2 en la figura) con una intensidad de 23.000 RFU. En el suero (Fig. 14B), las intensidades relativas son 5.000 (1) y 18.000 (2) para los aptameros de VEGF y bFGF.
Ejemplo 12. Pasivacion de la superficie de una matriz GeneChip® Test3 de Affymetrix sobre una superficie de cuarzo recubierta mediante el prebloqueo con leche desnatada, Superblock o plasma no tenido
El presente ejemplo ilustra la pasivacion de la superficie a la adsorcion de suero y plasma en una matriz GeneChip® Test3 de Affymetrix mediante el bloqueo con leche desnatada, Superblock o plasma no tenido.
A. Preparacion de oligonucleotidos biotinilados. Se sintetizaron oligonucleotidos biotinilados que se hibridan con tres sondas diferentes inmovilizadas en la matriz GeneChip® Test3, indicadas como 201, 1121 y 108, como se ha descrito en el Ejemplo 1.
B. Biotinilacion del plasma. Se anadieron 160 jl de NHS-PEO4-biotina 21 mM a 100 ml de plasma al 10 % en 1
x SB18, Tween® 20 al 0,1 %, y se dejo reaccionar la solucion durante 2 horas y luego se detuvo con la adicion de 1 ml de glicina 100 mM (pH 7,5). El plasma biotinilado se almaceno a -20 °C.
El tampon de control se compone de 0,75 x SB17, BSA al 0,1 %, 100 jg/ml de ADN de esperma de arenque,
Tween® 20 al 0,1 % y NaCl 0,8 M. Se preparo plasma biotinilado al 10 % con el tampon de control y plasma biotinilado. Se trato previamente el plasma mediante la adicion de 50 jl de Triton X-100 al 10 %, 10 jl de SDS al 10 % y 10 jl de 10 mg/ml de ADN de esperma de arenque a 1 ml de plasma biotinilado al 10 %, calentando hasta 95 °C durante 10 minutos y despues anadiendo 200 jl de NaCl 5 M. Se anadio 1 jl de 1.000 x mezcla de sonda biotinilada a 1 ml bien de tampon de control o de plasma al 10 %.
Se incubaron cuatro matrices Test3 de Affymetrix con 1 x SB17, BSA al 1 %, Triton X-100 al 0,4 %, SDS al 0,1 %, NaCl 1 M y 100 jg/ml de ADN de esperma de arenque. Se bloqueo la matriz B con una solucion de leche en polvo
desnatada al 2 % (Nestle Carnation, INSTANT NONFAT DRY MILK) suspendida en PBS, SDS al 0,1 % y 0,4 %. Se
bloqueo la matriz C con una solucion de StarterBlock (PIERCE), SDS al 0,1 % y 0,4 %. Se bloqueo la matriz D con una solucion de plasma combinado al 10 %, SDS al 0,1 % y Triton X-100 al 0,4 %. Se calento cada solucion de bloqueo hasta 95 °C durante 10 minutos y se dejo enfriar hasta la temperatura ambiente antes de la adicion a la matriz. Cada matriz Test3 se bloqueo con 100 jl de la solucion de bloqueo respectiva durante 1,5 horas a 45 °C. Se anadieron 100 jl de la muestra a cada matriz. La matriz A recibio el tampon de control con sondas y las matrices B, C y D recibieron el plasma al 10 % con sondas. Se incubaron las matrices a 45 °C durante 45 minutos.
A continuacion, se enjuagaron las matrices con 1 x SB17, Triton X-100 al 0,4 %, SDS al 0,1 %, NaCl 1 M, BSA al 1 % haciendo fluir 1 ml de lavado a traves de la camara, permitiendo que la matriz se incubara durante 5 minutos, a continuacion, luego haciendo fluir otro ml a traves de la camara y, finalmente, reemplazando los ultimos 100 jl de lavado por 100 jl de lavado recien preparado. Este procedimiento se realizo 3 veces. Las matrices se incubaron durante aproximadamente 1 hora antes de colocarlas en la estacion de fluidos GeneChip® de Affymetrix y realizar la lectura en el escaner de Affymetrix.
Los resultados se exponen en las Fig. 15A-D. El fondo general sobre las cuatro matrices fue de 40, 300, 400 y 500 RFU, mientras que las tres sondas biotiniladas miden -17.000, -34.000 y 18.000 en las matrices.
Ejemplo 13. Deteccion de proteinas diana mediante captura por hibridacion de proteinas fotorreticuladas en una matriz GeneChip® Test3 previamente bloqueada con leche desnatada
El presente ejemplo ilustra la captura por hibridacion de proteinas diana IL-1 R4 y bFGF en una matriz GeneChip® Test3 de Affymetrix sobre superficies de vidrio recubiertas bloqueadas con leche desnatada.
A. Sfntesis del fotoaptamero 1472-3 y 6-7 marcado. Se asignaron los complementos inversos de dos sondas indicadas como 1364 y 1121 en la matriz GeneChip® Test3 de Affymetrix a los aptameros 1472-3 y 6-7, y se sintetizaron como se ha descrito en el Ejemplo 1.
Se prepararon cuatro soluciones, cada una con una concentracion de 2 nM de cada aptamero 1472-3 y 6-7, en plasma al 10 %, dando las siguientes concentraciones finales para los pares de proteinas (IL-1 R4, bFGF): (0, 0), (1 nM, 30 pM), (100 pM, 1 nM) y (10 pM, 100 pM). El diluyente de plasma contenla 0,9 x sB18, 100 jg/ml de AdN de esperma de arenque, 5 jg/ml de (BrdU)30, Tween® 20 al 0,1 % y plasma al 10 %. Se incubaron las muestras a 37 °C durante 30 minutos y se irradiaron como se ha descrito en el Ejemplo 1. Se anadio 1 jl de 5 mg/ml de NHS-
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PEO4-biotina en DMSO a cada muestra y se incubo durante 2 horas a temperatura ambiente, tras lo que se anadieron 2 pl de glicina 100 mM (pH 7,5), 1 pl de SDS al 10 % y 5 pl de Triton X-100 al 10 %. Luego, se calentaron las muestras hasta 95 °C durante 10 minutos, se dejaron enfriar hasta la temperatura ambiente y se inactivaron con la adicion de 10 pl de BSA al 10 % y 25 pl de NaCl 5 M. A continuacion, se anadio 1 pl de 100 x sonda-108 como una secuencia de control.
Se bloquearon cuatro matrices Test3 durante 3 horas a 45 °C con la solucion de leche en polvo desnatada descrita en el Ejemplo 11 para la matriz B. A continuacion, se enjuagaron las matrices con PBS, SDS al 0,1 % y Triton X-100 al 0,4 %, y despues se incubaron con 1 x SB17, BSA al 1 %, Triton X-100 al 0,5 %, SDS al 0,1 %, NaCl 1 M y 0,1 mg/ml de ADN de esperma de arenque durante 20 minutos a 45 °C. Despues, se anadieron 100 pl de cada muestra a una matriz separada. Se incubaron las matrices a 45 °C durante 45 minutos. A continuacion, se completo el ensayo como se ha descrito en el Ejemplo 12. Los resultados se presentan en la Fig. 16, donde se observan las respuestas de dosis lineales para ambas dianas en plasma.
Ejemplo 14. Deteccion de las proteinas diana complejo C5b,6, neurotropina-3 y troponina I mediante captura por hibridacion de las proteinas fotorreticuladas en microesferas SeroMap™' de Luminex
El presente ejemplo demuestra el uso de microesferas SeroMap™ de Luminex como un soporte solido para detectar y, opcionalmente, cuantificar una molecula diana que puede estar presente en una muestra de ensayo. Estos ensayos se realizaron con proteinas diana anadidas a tampon. El instrumento de deteccion fue un sistema instrumental Luminex 100 IS.
Se conjugaron las sondas con terminacion amina asignadas a los fotoaptameros 2184-64 (aptamero de complejo C5b,6), 2273-34 (aptamero de neurotropina-3) y 2338-12 (aptamero de troponina I) con microesferas SeroMap™ funcionalizadas con -COOH usando qulmica de EDC (1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida).
Se hibridaron previamente los fotoaptameros 2184-64, 2273-34 y 23338-12, a una concentracion de ensayo final de 2 nM cada uno, con oligonucleotidos biotinilados complementarios a los extremos 3' de los aptameros, luego se combinaron con una mezcla de las proteinas complejo C5b,6, neurotropina-3 y troponina I en un intervalo de concentraciones (169 fM a 3,33 nM) en tampon de SB17, Tween® 20 al 0,05 %. Tambien se prepararon muestras de ensayo de control sin proteina por duplicado. Se incubaron estas muestras de ensayo, en volumenes de 100 pl, a 37 °C durante 15 minutos y luego se fotorreticularon. Se anadieron perlas de estreptavidina Dynal MyOne (400 pg) a cada muestra de ensayo y se incubaron durante 10 minutos a 25 °C con mezclado para capturar el fotoaptamero:oligo biotinilado y los hibridos de proteinas-fotoaptamero:oligo biotinilado. Se lavaron las perlas 2 veces durante 30 segundos cada vez con 100 pl de bicarbonato de sodio 100 mM, EDTA 1 mM, Tween® al 0,02 % y D-biotina 10 pM (pH 8,5). El proposito del componente de D-biotina de este tampon era el de saturar los sitios de union de estreptavidina libres. Se suspendieron las perlas lavadas en 100 pl de bicarbonato de sodio 100 mM (pH 8,5), EDTA 1 mM, Tween® 20 al 0,02 % y sulfo-NHS-LC-biotina 150 pM (Pierce Biotechnology) con el fin de marcar el conjugado de proteina diana-fotoaptamero con biotina. Se incubo esta reaccion de biotinilacion a 25 °C durante 1 hora mezclando constantemente. A continuacion, se lavaron las perlas 3 veces con 100 pl de SB17, clorhidrato de guanidina 3,14 M, Tween® 20 al 0,05 % seguidas de 2 veces de lavado con 100 pl de SB17, Triton X-100 al 0,33 %. Se suspendieron las perlas lavadas en 100 pl de D-biotina 10 pM, Tween® 20 al 0,05 %, HEPES 10 mM, pH 7,5 y despues se calentaron hasta 70 °C durante 5 min para liberar los fotoaptameros de sus oligonucleotidos biotinilados complementarios unidos a las perlas. Para cada muestra de ensayo, se combinaron 75 pl del volumen eluido de las perlas con 25 pl del siguiente tampon de alto contenido de sal: NaCl 4 M, Tween® 20 al 0,4 %, Tris-Cl 160 mM, pH 8,0. Se anadio SDS (11,25 pl de 20 %) y se transfirio cada muestra de ensayo a una mezcla de 30 pl de las microesfereas SeroMap™ conjugadas con la sonda apropiada (1.500 microesferas codificadas por color por sonda, Tween® 20 al 0,1 %, NaCl 1 M, BSA al 1,25 %, Tris-Cl 40 mM, pH 8,0). Para potenciar la hibridacion de los fotoaptameros a las microesferas conjugadas con las sondas, las muestras de ensayo se incubaron a 65 °C durante 2 horas mezclando de manera constante. A 65 °C, se transfirieron las muestras de ensayo a una placa de filtracion al vacio de microtitulacion de 96 pocillos, y se lavaron las microesferas 4 veces con NaCl 200 mM, Tween® 20 al 0,1 %, Tris-Cl 40 mM (pH 8,0) a 65 °C. A continuacion, se suspendieron las microesferas en 80 ml de NaCl 200 mM, Tween® 20 al 0,1 %, Tris-Cl 40 mM (pH 8,0) y se transfirieron a placas de microtitulacion de 96 pocillos. Se anadieron 20 pl de 10 pg/ml de estreptavidina-R-ficoeritrina (Molecular Probes # S866) para permitir la deteccion de las proteinas diana biotiniladas reticuladas con fotoaptamero. Tras una incubacion de 15 minutos a 37 °C, se sometieron las muestras de ensayo a un protocolo de cuantificacion de senales con instrumento Luminex convencional (R-ficoeritrina).
La Fig. 17 representa graficamente los resultados para el fotoaptamero de complejo C5b,6 2184-64 (Fig. 17A), fotoaptamero de neurotropina-3 2273-34 (Fig. 17B) y fotoaptamero de troponina I 2338-12 (Fig. 17C). Los valores de IFM (intensidad de fluorescencia media) se han corregido restando el valor de IMF del control sin proteina para cada aptamero.
La informacion anterior describe la invencion con referencia a diversas realizaciones y ejemplos. Ninguna realizacion, ejemplo o elemento en particular de una determinada realizacion o ejemplo se ha de interpretar como un
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elemento o una caracterlstica crltica, necesaria o esencial de ninguna de las reivindicaciones. Ademas, no se requiere ningun elemento descrito en el presente documento para la practica de la invencion a menos que se describa expresamente como "esencial" o "crltico".
Los siguientes parrafos numerados (parr.) contienen enunciados de combinaciones amplias de las caracterlsticas tecnicas de la invencion desveladas en el presente documento:
1. Un metodo de detection de una molecula diana que puede estar presente en una muestra de ensayo, comprendiendo el metodo:
(a) poner en contacto una muestra de ensayo con un aptamero que comprende un marcador y que tiene una afinidad especlfica hacia una molecula diana, en el que se forma un complejo de afinidad de aptamero si dicha molecula diana esta presente en dicha muestra de ensayo;
(b) poner en contacto una superficie de un soporte solido que comprende una sonda con dicho complejo de afinidad de aptamero, de modo que dicho marcador pueda asociarse a dicha sonda;
(c) en cualquier punto previo a (d), poner en contacto dicho complejo de afinidad de aptamero con un agente de marcaje; y
(d) detectar dicha molecula diana sobre dicha superficie detectando dicho agente de marcaje.
2. El metodo del parrafo 1, en el que dicho aptamero es un acido nucleico monocatenario o un acido nucleico bicatenario.
3. El metodo del parrafo 2, en el que dicho aptamero comprende ADN o ARN.
4. El parrafo 3, en el que dicho aptamero comprende al menos una modification qulmica.
5. El metodo del parrafo 4, en el que dicha al menos una modificacion qulmica es una sustitucion qulmica en una o mas posiciones seleccionadas independientemente entre una position de ribosa, una position de desoxirribosa, una position de fosfato y una posicion de base.
6. El metodo del parrafo 4, en el que dicha al menos una modificacion qulmica se selecciona independientemente de una modificacion de azucar en la posicion 2', un 2'-amino (2'-NH2), un 2'-fluoro (2'-F), un 2'-O-metilo (2'-OMe), una modificacion de pirimidina en la posicion 5, una modificacion de purina en la posicion 8, una modificacion en amina exoclclica de citosina, una sustitucion de 5-bromouracilo, una sustitucion de 5-bromodesoxiuridina, una sustitucion de 5-bromodesoxicitidina, una modificacion de la estructura principal, metilacion, una protection terminal de 3' y una protection terminal de 5'.
7. El metodo del parrafo 4, en el que dicha al menos una modificacion qulmica se selecciona independientemente de
5-(N-bencilcarboxiamida)-2’-desoxiuridina, 5-(N-isobutilcarboxiamida)-2’-desoxiuridina, 5-(N-[2-(1H-indol-3-
il)etil]carboxiamida)-2'-desoxiuridina, cloruro de 5-(N-[1-(3-trimetilamonio)propil]carboxiamida)-2’-desoxiuridina, 5-(N- naftilcarboxiamida)-2’-desoxiuridina y 5-(N-[1-(2,3-dihidroxipropil)]carboxiamida)-2’-desoxiuridina.
8. El metodo del parrafo 2, en el que dicho marcador es un extremo 5' de dicho aptamero.
9. El metodo del parrafo 2, en el que dicho marcador es un extremo 3' de dicho aptamero.
10. El metodo del parrafo 2, en el que dicho marcador es una secuencia de nucleotidos que esta situada entre un extremo 5’ y un extremo 3’ de dicho aptamero.
11. El metodo de parrafo 10, en el que dicho aptamero comprende un extremo fijo 5’ separado de un extremo fijo 3' por una secuencia variable, y en el que dicho marcador esta incluido dentro de bien el extremo fijo 5’ o el extremo fijo 3' de dicho aptamero.
12. El metodo del parrafo 10, en el que dicho aptamero comprende un extremo fijo 5’ separado de un extremo fijo 3'
por una secuencia variable, y en el que dicho marcador es la secuencia variable de dicho aptamero o cualquier parte
de la secuencia variable de dicho aptamero.
13. El metodo del parrafo 10, en el que dicho aptamero comprende un extremo fijo 5’ separado de un extremo fijo 3' por una secuencia variable, y en el que dicho marcador es una secuencia de nucleotidos que incluye al menos una parte de la secuencia variable y al menos una parte de uno de dichos extremos fijos de dicho aptamero.
14. El metodo del parrafo 10, en el que dicho aptamero comprende un extremo fijo 5’ separado de un extremo fijo 3' por una secuencia variable, y en el que dicho marcador es una secuencia de nucleotidos que incluye la secuencia variable y una parte de al menos uno de dichos extremos fijos de dicho aptamero.
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15. El metodo del parrafo 10, en el que dicho aptamero comprende un extremo fijo 5' separado de un extremo fijo 3' por una secuencia variable, y en el que dicho marcador es una secuencia de nucleotidos que incluye la secuencia variable y ambos extremos fijos de dicho aptamero.
16. El metodo del parrafo 1, en el que dicha molecula diana se selecciona del grupo que consiste en un protelna, un hidrato de carbono, un polisacarido, una glicoprotelna, una hormona, un receptor, un antlgeno, un anticuerpo, un virus, un sustrato, un metabolito, un analogo en estado de transicion, un cofactor, un inhibidor, un farmaco, un colorante, un nutriente, un factor de crecimiento, un tejido y una sustancia controlada.
17. El metodo del parrafo 16, en el que dicha molecula diana es una protelna.
18. El metodo del parrafo 1, en el que dicha muestra de ensayo es una muestra biologica.
19. El metodo del parrafo 18, en el que dicha muestra biologica se selecciona de sangre entera, leucocitos, celulas mononucleares de sangre periferica, plasma, suero, esputo, aliento, orina, semen, saliva, llquido menlngeo, llquido amniotico, llquido glandular, llquido linfatico, aspirado de llquido del pezon, aspirado bronquial, llquido sinovial, aspirado articular, celulas, un extracto celular, heces, tejido, un extracto tisular, una biopsia tisular y llquido cefalorraquldeo.
20. El metodo del parrafo 19, en el que dicha muestra biologica es plasma o suero.
21. El metodo del parrafo 1, en el que dicha sonda comprende al menos un componente seleccionado independientemente de un polinucleotido, un polipeptido, un acido nucleico peptldico, un acido nucleico bloqueado, un oligosacarido, un polisacarido, un anticuerpo, un aficuerpo, un anticuerpo mimetico, un receptor celular, un ligando, un llpido y cualquier parte de cualquiera de estas estructuras.
22. El metodo del parrafo 1, en el que dicho marcador comprende al menos un componente seleccionado independientemente de un polinucleotido, un polipeptido, un acido nucleico peptldico, un acido nucleico bloqueado, un oligosacarido, un polisacarido, un anticuerpo, un aficuerpo, un anticuerpo mimetico, un receptor celular, un ligando, un llpido y cualquier parte de cualquiera de estas estructuras.
23. El metodo del parrafo 1, en el que dicho marcador se asocia a dicha sonda a traves de hibridacion.
24. El metodo del parrafo 23, en el que dicho marcador comprende una primera secuencia de nucleotidos y dicha sonda comprende una segunda secuencia de nucleotidos, y en el que dicha primera secuencia de nucleotidos es complementaria a dicha segunda secuencia de nucleotidos.
25. El metodo de cualquiera del parrafo 1, que comprende ademas poner en contacto dicho marcador o dicha sonda con una molecula enlazadora, de manera que dicho marcador pueda asociarse a dicha sonda a traves de dicha molecula enlazadora.
26. El metodo del parrafo 25, en el que dicha molecula enlazadora comprende una o mas moleculas seleccionadas independientemente de un polinucleotido, un polipeptido, un acido nucleico peptldico, un acido nucleico bloqueado, un oligosacarido, un polisacarido, un anticuerpo, un aficuerpo, un anticuerpo mimetico, un receptor celular, un ligando, un llpido y cualquier parte de cualquiera de estas estructuras.
27. El metodo del parrafo 26, en el que dicha molecula enlazadora comprende al menos un polinucleotido monocatenario, comprendiendo dicho polinucleotido ADN, ARN o ambos.
28. El metodo del parrafo 27, en el que dicho marcador comprende una primera secuencia de nucleotidos, y dicha sonda comprende una segunda secuencia de nucleotidos, en el que dicho al menos un polinucleotido monocatenario comprende un componente de asociacion al marcador que es complementario a dicha primera secuencia de nucleotidos y un componente de asociacion a la sonda que es complementario a dicha segunda secuencia de nucleotidos, y en el que dicho componente de asociacion al marcador se hibrida con dicha primera secuencia de nucleotidos y dicho componente de asociacion a la sonda se hibrida a dicha segunda secuencia de nucleotidos.
29. El metodo del parrafo 1, en el que dicho soporte solido se selecciona de un pocillo de microtitulacion, un portaobjetos de microscopio, un sustrato de copollmero de cicloolefina, una membrana, un sustrato plastico, una perla paramagnetica, papel cargado, nylon, una pellcula de Langmuir-Bodgett, vidrio, un sustrato de germanio, un sustrato de silicio, un chip de oblea de silicio, un chip de flujo a traves, una microperla, un sustrato de politetrafluoroetileno, un sustrato de poliestireno, un sustrato de arseniuro de galio, un sustrato de oro y un sustrato de plata.
30. El metodo del parrafo 29, en el que dicha superficie comprende al menos una capa de modificacion superficial seleccionada independientemente entre un metal, un oxido metalico, un pollmero, una molecula organica pequena, un copollmero de metacrilato, una poliacrilamida, un polisacarido, un fosfollpido, un poliuretano, un poliester, un
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policarbonato, una poliurea, una poliamida, una polietilenoamina, un sulfuro de poliarileno, un polisiloxano, una poliimida, un poliacetato y una matriz polimerica tridimensional.
31. El metodo del parrafo 1, en el que dicha superficie comprende una pluralidad de direcciones espacialmente definidas, y en el que cada una de una pluralidad de dichas direcciones comprende al menos una sonda dispuesta en la misma.
32. El metodo del parrafo 31, en el que la deteccion de dicha molecula diana comprende detectar dicho agente de marcaje en una direccion sobre dicha superficie.
33. El metodo del parrafo 1, en el que dicho agente de marcaje comprende uno o mas reactivos que pueden marcar dicha molecula diana con una fraccion detectable.
34. El metodo del parrafo 33, en el que al menos uno de dichos reactivos reacciona con un grupo funcional en dicha molecula diana.
35. El metodo del parrafo 34, en el que dicho grupo funcional se selecciona del grupo que consiste en aminas primarias, tioles, alcoholes y carboxilatos.
36. El metodo del parrafo 33, en el que dicha fraccion detectable se selecciona del grupo que consiste en un colorante, un radiomarcador, una enzima y un sustrato enzimatico.
37. El metodo del parrafo 36, en el que dicho colorante es un fluoroforo.
38. El metodo del parrafo 36, en el que dicha enzima es fosfatasa alcalina o peroxidasa de rabano picante.
39. El metodo del parrafo 1, que comprende ademas cuantificar dicha molecula diana.
40. Un metodo de deteccion de una molecula diana que puede estar presente en una muestra de ensayo, comprendiendo el metodo:
(a) poner en contacto una muestra de ensayo con un aptamero que comprende un marcador y que tiene una afinidad especlfica hacia una molecula diana, en el que se forma un complejo de afinidad de aptamero si dicha molecula diana esta presente en dicha muestra de ensayo;
(b) poner en contacto una superficie de un soporte solido que comprende una sonda con dicho complejo de afinidad de aptamero, de modo que dicho marcador pueda asociarse a dicha sonda;
(c) preparar dicho complejo de afinidad de aptamero para la deteccion; y
(d) detectar dicha molecula diana usando espectrometrla de masas.
41. El metodo del parrafo 40, que comprende ademas cuantificar dicha molecula diana.
42. El metodo del parrafo 40, en el que dicha diana se detecta usando ionizacion por electronebulizacion, ionizacion
por desorcion laser asistida por matriz (MALDI), ionizacion por desorcion laser de superficie mejorada (SELDI) o ionizacion por impacto de electrones.
43. Un metodo de deteccion de una molecula diana que puede estar presente en una muestra de ensayo, comprendiendo el metodo:
(a) poner en contacto una muestra de ensayo con un aptamero que tiene una afinidad especlfica hacia una molecula diana, en el que se forma un complejo de afinidad de aptamero si dicha molecula diana esta presente en dicha muestra de ensayo;
(b) separar cualquier aptamero libre presente en dicha muestra de ensayo del complejo de afinidad de aptamero;
y
(c) detectar dicho complejo de afinidad de aptamero usando PCR cuantitativa (Q-PCR) y, de este modo, detectar dicha molecula diana.
44. El metodo del parrafo 43, que comprende ademas cuantificar dicha molecula diana.
45. El metodo del parrafo 43, en el que dicha Q-PCR se realiza usando PCR TaqMan®, un colorante fluorescente de intercalacion durante el proceso de PCR o una baliza molecular durante el proceso de PCR.
46. Un metodo de deteccion de una molecula diana que puede estar presente en una muestra de ensayo, comprendiendo el metodo:
(a) poner en contacto una muestra de ensayo con un aptamero que comprende un marcador y que tiene una afinidad especlfica hacia una molecula diana, en el que se forma un complejo de afinidad de aptamero si dicha
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molecula diana esta presente en dicha muestra de ensayo;
(b) convertir dicho complejo de afinidad de aptamero en un complejo covalente de aptamero.
(c) poner en contacto una superficie de un soporte solido que comprende una sonda con dicho complejo covalente de aptamero, de modo que dicho marcador pueda asociarse a dicha sonda;
(d) en cualquier punto previo a (e), poner en contacto dicho complejo covalente de aptamero con un agente de marcaje; y
(e) detectar dicha molecula diana sobre dicha superficie detectando dicho agente de marcaje.
47. El metodo del parrafo 46, en el que dicho aptamero es un acido nucleico monocatenario o un acido nucleico bicatenario.
48. El metodo del parrafo 47, en el que dicho aptamero comprende ADN o ARN.
49. El parrafo 48, en el que dicho aptamero comprende al menos una modification qulmica.
50. El metodo del parrafo 49, en el que dicha al menos una modificacion qulmica es una sustitucion qulmica en una o mas posiciones seleccionadas independientemente entre una position de ribosa, una position de desoxirribosa, una posicion de fosfato y una posicion de base.
51. El metodo del parrafo 49, en el que dicha al menos una modificacion qulmica se selecciona independientemente de una modificacion de azucar en la posicion 2', un 2'-amino (2'-NH2), un 2'-fluoro (2'-F), un 2'-O-metilo (2'-OMe), una modificacion de pirimidina en la posicion 5, una modificacion de purina en la posicion 8, una modificacion en amina exoclclica de citosina, una sustitucion de 5-bromouracilo, una sustitucion de 5-bromodesoxiuridina, una sustitucion de 5-bromodesoxicitidina, una modificacion de la estructura principal, metilacion, una protection terminal de 3' y una proteccion terminal de 5'.
52. El metodo del parrafo 49, en el que dicha al menos una modificacion qulmica se selecciona independientemente
de 5-(N-bencilcarboxiamida)-2’-desoxiuridina, 5-(N-isobutilcarboxiamida)-2’-desoxiuridina, 5-(N-[2-(1 H-indol-3-
il)etil]carboxiamida)-2'-desoxiuridina, cloruro de 5-(N-[1-(3-trimetilamonio)propil]carboxiamida)-2’-desoxiuridina, 5-(N- naftilcarboxiamida)-2’-desoxiuridina y 5-(N-[1-(2,3-dihidroxipropil)]carboxiamida)-2’-desoxiuridina.
53. El metodo del parrafo 46, en el que dicho marcador es un fotoaptamero.
54. El metodo del parrafo 53, en el que dicho fotoaptamero comprende uno o mas grupos funcionales fotorreactivos seleccionados independientemente entre 5-bromouracilo, 5-yodouracilo, 5-bromoviniluracilo, 5-yodoviniluracilo, 5- azidouracilo, 4-tiouracilo, 5-tiouracilo, 4-tiocitosina, 5-bromocitosina, 5-yodocitosina, 5-bromovinilcitosina, 5- yodovinilcitosina, 5-azidocitosina, 8-azidoadenina, 8-bromoadenina, 8-yodoadenina, 8-aziodoguanina, 8- bromoguanina, 8-yodoguanina, 8-azidohipoxantina, 8-bromohipoxantina, 8-yodohipoxantina, 8-azidoxantina, 8- bromoxantina, 8-yodoxantina, 5-[(4-azidofenacil)tio]citosina, 5-[(4-azidofenacil)tio]uracilo, 7-desaza-7-yodoadenina, 7-desaza-7-yodoguanina, 7-desaza-7-bromoadenina, 7-desaza-7-bromoguanina, benzofenona, antraquinona, 4- azido-2-nitro-anilina, psoraleno y derivados de cualquiera de los mismos.
55. El metodo del parrafo 54, en el que la conversion de dicho complejo de afinidad de fotoaptamero en un complejo covalente de fotoaptamero comprende exponer dicho complejo de afinidad de fotoaptamero a una fuente de radiation.
56. El metodo del parrafo 47, en el que dicho marcador es un extremo 5' de dicho aptamero.
57. El metodo del parrafo 47, en el que dicho marcador es un extremo 3' de dicho aptamero.
58. El metodo del parrafo 47, en el que dicho marcador es una secuencia de nucleotidos que esta situada entre un extremo 5’ y un extremo 3’ de dicho aptamero.
59. El metodo de parrafo 58, en el que dicho aptamero comprende un extremo fijo 5’ separado de un extremo fijo 3' por una secuencia variable, y en el que dicho marcador esta incluido dentro de bien el extremo fijo 5’ o el extremo fijo 3' de dicho aptamero.
60. El metodo del parrafo 58, en el que dicho aptamero comprende un extremo fijo 5’ separado de un extremo fijo 3'
por una secuencia variable, y en el que dicho marcador es la secuencia variable de dicho aptamero o cualquier parte
de la secuencia variable de dicho aptamero.
61. El metodo del parrafo 58, en el que dicho aptamero comprende un extremo fijo 5’ separado de un extremo fijo 3' por una secuencia variable, y en el que dicho marcador es una secuencia de nucleotidos que incluye al menos una parte de la secuencia variable y al menos una parte de uno de dichos extremos fijos de dicho aptamero.
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62. El metodo del parrafo 58, en el que dicho aptamero comprende un extremo fijo 5' separado de un extremo fijo 3' por una secuencia variable, y en el que dicho marcador es una secuencia de nucleotidos que incluye la secuencia variable y una parte de al menos uno de dichos extremos fijos de dicho aptamero.
63. El metodo del parrafo 58, en el que dicho aptamero comprende un extremo fijo 5' separado de un extremo fijo 3' por una secuencia variable, y en el que dicho marcador es una secuencia de nucleotidos que incluye la secuencia variable y ambos extremos fijos de dicho aptamero.
64. El metodo del parrafo 46, en el que dicha molecula diana se selecciona del grupo que consiste en un protelna, un hidrato de carbono, un polisacarido, una glicoprotelna, una hormona, un receptor, un antlgeno, un anticuerpo, un virus, un sustrato, un metabolito, un analogo en estado de transicion, un cofactor, un inhibidor, un farmaco, un colorante, un nutriente, un factor de crecimiento, un tejido y una sustancia controlada.
65. El metodo del parrafo 64, en el que dicha molecula diana es una protelna.
66. El metodo del parrafo 46, en el que dicha muestra de ensayo es una muestra biologica.
El metodo del parrafo 66, en el que dicha muestra biologica se selecciona de sangre entera, leucocitos, celulas mononucleares de sangre periferica, plasma, suero, esputo, aliento, orina, semen, saliva, llquido menlngeo, llquido amniotico, llquido glandular, llquido linfatico, aspirado de llquido del pezon, aspirado bronquial, llquido sinovial, aspirado articular, celulas, un extracto celular, heces, tejido, un extracto tisular, una biopsia tisular y llquido cefalorraquldeo.
68. El metodo del parrafo 66, en el que dicha muestra biologica es plasma o suero.
69. El metodo del parrafo 46, en el que dicha sonda comprende al menos un componente seleccionado independientemente de un polinucleotido, un polipeptido, un acido nucleico peptldico, un acido nucleico bloqueado, un oligosacarido, un polisacarido, un anticuerpo, un aficuerpo, un anticuerpo mimetico, un receptor celular, un ligando, un llpido y cualquier parte de cualquiera de estas estructuras.
70. El metodo del parrafo 46, en el que dicho marcador comprende al menos un componente seleccionado independientemente de un polinucleotido, un polipeptido, un acido nucleico peptldico, un acido nucleico bloqueado, un oligosacarido, un polisacarido, un anticuerpo, un aficuerpo, un anticuerpo mimetico, un receptor celular, un ligando, un llpido y cualquier parte de cualquiera de estas estructuras.
71. El metodo del parrafo 46, en el que dicho marcador se asocia a dicha sonda a traves de hibridacion.
72. El metodo del parrafo 71, en el que dicho marcador comprende una primera secuencia de nucleotidos y dicha sonda comprende una segunda secuencia de nucleotidos, y en el que dicha primera secuencia de nucleotidos es complementaria a dicha segunda secuencia de nucleotidos.
73. El metodo de cualquiera del parrafo 46, que comprende ademas poner en contacto dicho marcador o dicha sonda con una molecula enlazadora, de manera que dicho marcador pueda asociarse a dicha sonda a traves de dicha molecula enlazadora.
74. El metodo del parrafo 73, en el que dicha molecula enlazadora comprende una o mas moleculas seleccionadas independientemente de un polinucleotido, un polipeptido, un acido nucleico peptldico, un acido nucleico bloqueado, un oligosacarido, un polisacarido, un anticuerpo, un aficuerpo, un anticuerpo mimetico, un receptor celular, un ligando, un llpido y cualquier parte de cualquiera de estas estructuras.
75. El metodo del parrafo 74, en el que dicha molecula enlazadora comprende al menos un polinucleotido monocatenario, comprendiendo dicho polinucleotido ADN, ARN o ambos.
76. El metodo del parrafo 75, en el que dicho marcador comprende una primera secuencia de nucleotidos, y dicha sonda comprende una segunda secuencia de nucleotidos, en el que dicho al menos un polinucleotido monocatenario comprende un componente de asociacion al marcador que es complementario a dicha primera secuencia de nucleotidos y un componente de asociacion a la sonda que es complementario a dicha segunda secuencia de nucleotidos, y en el que dicho componente de asociacion al marcador se hibrida con dicha primera secuencia de nucleotidos y dicho componente de asociacion a la sonda se hibrida a dicha segunda secuencia de nucleotidos.
77. El metodo del parrafo 46, en el que dicho soporte solido se selecciona de un pocillo de microtitulacion, un portaobjetos de microscopio, un sustrato de copollmero de cicloolefina, una membrana, un sustrato plastico, una perla paramagnetica, papel cargado, nylon, una pellcula de Langmuir-Bodgett, vidrio, un sustrato de germanio, un sustrato de silicio, un chip de oblea de silicio, un chip de flujo a traves, una microperla, un sustrato de politetrafluoroetileno, un sustrato de poliestireno, un sustrato de arseniuro de galio, un sustrato de oro y un sustrato de plata.
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78. El metodo del parrafo 77, en el que dicha superficie comprende al menos una capa de modificacion superficial seleccionada independientemente entre un metal, un oxido metalico, un pollmero, una molecula organica pequena, un copollmero de metacrilato, una poliacrilamida, un polisacarido, un fosfollpido, un poliuretano, un poliester, un policarbonato, una poliurea, una poliamida, una polietilenoamina, un sulfuro de poliarileno, un polisiloxano, una poliimida, un poliacetato y una matriz polimerica tridimensional.
79. El metodo del parrafo 46, en el que dicha superficie comprende una pluralidad de direcciones espacialmente definidas, y en el que cada una de una pluralidad de dichas direcciones comprende al menos una sonda dispuesta en la misma.
80. El metodo del parrafo 79, en el que la deteccion de dicha molecula diana comprende detectar dicho agente de marcaje en una direccion sobre dicha superficie.
81. El metodo del parrafo 46, en el que dicho agente de marcaje comprende uno o mas reactivos que pueden marcar dicha molecula diana con una fraccion detectable.
82. El metodo del parrafo 81, en el que al menos uno de dichos reactivos reacciona con un grupo funcional en dicha molecula diana.
83. El metodo del parrafo 82, en el que dicho grupo funcional se selecciona del grupo que consiste en aminas primarias, tioles, alcoholes y carboxilatos.
84. El metodo del parrafo 81, en el que dicha fraccion detectable se selecciona del grupo que consiste en un colorante, un radiomarcador, una enzima y un sustrato enzimatico.
85. El metodo del parrafo 84, en el que dicho colorante es un fluoroforo.
86. El metodo del parrafo 84, en el que dicha enzima es fosfatasa alcalina o peroxidasa de rabano picante.
87. El metodo del parrafo 46, que comprende ademas cuantificar dicha molecula diana.
88. Un metodo de deteccion de una molecula diana que puede estar presente en una muestra de ensayo, comprendiendo el metodo:
(a) poner en contacto una muestra de ensayo con un aptamero que comprende un marcador y que tiene una afinidad especlfica hacia una molecula diana, en el que se forma un complejo de afinidad de aptamero si dicha molecula diana esta presente en dicha muestra de ensayo;
(b) convertir dicho complejo de afinidad de aptamero en un complejo covalente de aptamero.
(c) poner en contacto una superficie de un soporte solido que comprende una sonda con dicho complejo covalente de aptamero, de modo que dicho marcador pueda asociarse a dicha sonda;
(d) preparar dicho complejo covalente de aptamero para la deteccion; y
(e) detectar dicha molecula diana usando espectrometrla de masas.
89. El metodo del parrafo 88, que comprende ademas cuantificar dicha molecula diana.
90. El metodo del parrafo 88, en el que dicha diana se detecta usando ionizacion por electronebulizacion, ionizacion
por desorcion laser asistida por matriz (MALDI), ionizacion por desorcion laser de superficie mejorada (SELDI) o ionizacion por impacto de electrones.
91. Un metodo de deteccion de una molecula diana que puede estar presente en una muestra de ensayo, comprendiendo el metodo:
(a) poner en contacto una muestra de ensayo con un aptamero que tiene una afinidad especlfica hacia una molecula diana, en el que se forma un complejo de afinidad de aptamero si dicha molecula diana esta presente en dicha muestra de ensayo;
(b) convertir dicho complejo de afinidad de aptamero en un complejo covalente de aptamero.
(c) separar cualquier aptamero libre presente en dicha muestra de ensayo del complejo covalente de aptamero; y
(d) detectar dicho complejo covalente de aptamero usando PCR cuantitativa (Q-PCR) y, de este modo, detectar dicha molecula diana.
92. El metodo del parrafo 91, que comprende ademas cuantificar dicha molecula diana.
93. El metodo del parrafo 91, en el que dicha Q-PCR se realiza usando PCR TaqMan®, un colorante fluorescente de intercalacion durante el proceso de PCR o una baliza molecular durante el proceso de PCR.
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94. Un metodo de deteccion de una molecula diana que puede estar presente en una muestra de ensayo, comprendiendo el metodo:
(a) poner en contacto una muestra de ensayo con al menos una molecula competidora, de modo que se forma al menos un complejo inespeclfico si dicha muestra de ensayo comprende una molecula diana, una molecula no diana, o tanto una molecula diana como una molecula no diana.
(b) poner en contacto dicha muestra de ensayo con un aptamero que comprende un marcador y que tiene una afinidad especlfica hacia dicha molecula diana, en el que se forma un complejo de afinidad de aptamero si dicha molecula diana esta presente en dicha muestra de ensayo;
(c) convertir dicho complejo de afinidad de aptamero en un complejo covalente de aptamero;
(d) poner en contacto una superficie de un soporte solido que comprende una sonda con dicho complejo covalente de aptamero, de modo que dicho marcador pueda asociarse a dicha sonda;
(e) en cualquier punto previo a (f), poner en contacto dicho complejo covalente de aptamero con un agente de marcaje; y
(f) detectar dicha molecula diana sobre dicha superficie detectando dicho agente de marcaje.
95. El metodo del parrafo 94, en el que dicha al menos una molecula competidora se selecciona independientemente de un oligonucleotido, un polianion, un pollmero de fosfodiester abasico, un dNTP y un pirofosfato.
96. El metodo del parrafo 95, en el que dicha al menos una molecula competidora es heparina o un polidextrano.
97. El metodo del parrafo 95, en el que dicha al menos una molecula competidora es sulfato de dextrano.
98. Un metodo de deteccion de una molecula diana que puede estar presente en una muestra de ensayo, comprendiendo el metodo:
(a) poner en contacto una muestra de ensayo con un aptamero que comprende un marcador y que tiene una afinidad especlfica hacia una molecula diana, en el que se forma un complejo de afinidad de aptamero si dicha molecula diana esta presente en dicha muestra de ensayo;
(b) exponer dicha muestra de ensayo a una condicion o a un tratamiento que desafla cineticamente a dicho aptamero, dicha molecula diana y cualquier molecula no diana presentes en dicha muestra de ensayo;
(c) convertir dicho complejo de afinidad de aptamero en un complejo covalente de aptamero;
(d) poner en contacto una superficie de un soporte solido que comprende una sonda con dicho complejo covalente de aptamero, de modo que dicho marcador pueda asociarse a dicha sonda;
(e) en cualquier punto previo a (f), poner en contacto dicho complejo covalente de aptamero con un agente de marcaje; y
(f) detectar dicha molecula diana sobre dicha superficie detectando dicho agente de marcaje.
99. El metodo del parrafo 98, en el que dicha condicion o dicho tratamiento que desafla cineticamente a dicho aptamero comprende poner en contacto dicha muestra de ensayo con al menos una molecula competidora.
100. El metodo del parrafo 99, en el que dicha al menos una molecula competidora se selecciona independientemente de un oligonucleotido, un polianion, un pollmero de fosfodiester abasico, un dNTP y un pirofosfato.
101. El metodo del parrafo 100, en el que dicha al menos una molecula competidora es heparina o un polidextrano.
102. El metodo del parrafo 100, en el que dicha al menos una molecula competidora es sulfato de dextrano.
103. El metodo del parrafo 98, en el que dicha condicion o dicho tratamiento que desafla cineticamente a dicho aptamero comprende diluir dicha muestra de ensayo.
104. Un metodo de deteccion de una molecula diana que puede estar presente en una muestra de ensayo, comprendiendo el metodo:
(a) poner en contacto una muestra de ensayo con un aptamero que comprende un marcador y que tiene una afinidad especlfica hacia una molecula diana, en el que se forma un complejo de afinidad de aptamero si dicha molecula diana esta presente en dicha muestra de ensayo;
(b) convertir dicho complejo de afinidad de aptamero en un complejo covalente de aptamero.
(c) separar de dicha muestra de ensayo cualquier aptamero libre presente en dicha muestra de ensayo;
(d) poner en contacto una superficie de un soporte solido que comprende una sonda con dicho complejo covalente de aptamero, de modo que dicha secuencia de marcador pueda asociarse a dicha sonda;
(e) en cualquier punto previo a (f), poner en contacto dicho complejo covalente de aptamero con un agente de marcaje; y
(f) detectar dicha molecula diana sobre dicha superficie detectando dicho agente de marcaje.
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105. El metodo del parrafo 104, en el que la separacion de dicha muestra de ensayo de cualquier aptamero libre presente en dicha muestra de ensayo comprende hacer precipitar dicho complejo covalente de aptamero, cualquier protelna y cualquier complejo de protelna en dicha muestra de ensayo.
106. Un metodo de deteccion de una molecula diana que puede estar presente en una muestra de ensayo, comprendiendo el metodo:
(a) poner en contacto una muestra de ensayo con un aptamero que comprende un marcador y que tiene una afinidad especlfica hacia una molecula diana, en el que se forma un complejo de afinidad de aptamero si dicha molecula diana esta presente en dicha muestra de ensayo;
(b) convertir dicho complejo de afinidad de aptamero en un complejo covalente de aptamero.
(c) separar de dicha muestra de ensayo dicho complejo covalente de aptamero;
(d) poner en contacto una superficie de un soporte solido que comprende una sonda con dicho complejo covalente de aptamero, de modo que dicho marcador pueda asociarse a dicha sonda;
(e) en cualquier punto previo a (f), poner en contacto dicho complejo covalente de aptamero con un agente de marcaje; y
(f) detectar dicha molecula diana sobre dicha superficie detectando dicho agente de marcaje.
107. El metodo del parrafo 106, en el que la separacion de dicha muestra de ensayo de dicho complejo covalente de aptamero comprende hacer precipitar dicho complejo covalente de aptamero de dicha muestra de ensayo o capturar dicho complejo covalente de aptamero de dicha muestra de ensayo.
108. Un metodo de deteccion de una molecula diana que puede estar presente en una muestra de ensayo, comprendiendo el metodo:
(a) poner en contacto una muestra de ensayo con un aptamero que comprende un marcador y que tiene una afinidad especlfica hacia una molecula diana, en el que se forma un complejo de afinidad de aptamero si dicha molecula diana esta presente en dicha muestra de ensayo;
(b) convertir dicho complejo de afinidad de aptamero en un complejo covalente de aptamero.
(c) separar de dicha muestra de ensayo cualquier aptamero libre presente en dicha muestra de ensayo;
(d) separar de dicha muestra de ensayo dicho complejo covalente de aptamero;
(e) poner en contacto una superficie de un soporte solido que comprende una sonda con dicho complejo covalente de aptamero, de modo que dicho marcador pueda asociarse a dicha sonda;
(f) en cualquier punto previo a (g), poner en contacto dicho complejo covalente de aptamero con un agente de marcaje; y
(g) detectar dicha molecula diana sobre dicha superficie detectando dicho agente de marcaje.
109. El metodo del parrafo 108, en el que la separacion de dicha muestra de ensayo de cualquier aptamero libre presente en dicha muestra de ensayo comprende hacer precipitar dicho complejo covalente de aptamero, cualquier protelna y cualquier complejo de protelna en dicha muestra de ensayo.
110. El metodo del parrafo 108, en el que la separacion de dicha muestra de ensayo de dicho complejo covalente de aptamero comprende hacer precipitar dicho complejo covalente de aptamero de dicha muestra de ensayo o capturar dicho complejo covalente de aptamero de dicha muestra de ensayo.
111. Un metodo de deteccion de una molecula diana que puede estar presente en una muestra de ensayo, comprendiendo el metodo:
(a) poner en contacto una muestra de ensayo con un aptamero que comprende un marcador y que tiene una afinidad especlfica hacia una molecula diana, en el que se forma un complejo de afinidad de aptamero si dicha molecula diana esta presente en dicha muestra de ensayo;
(b) exponer dicha muestra de ensayo a una condicion o a un tratamiento que desafla cineticamente dicho aptamero, dicha molecula diana y cualquier molecula no diana presentes en dicha muestra de ensayo;
(c) convertir dicho complejo de afinidad de aptamero en un complejo covalente de aptamero;
(d) separar de dicha muestra de ensayo cualquier aptamero libre presente en dicha muestra de ensayo;
(e) separar de dicha muestra de ensayo dicho complejo covalente de aptamero;
(f) poner en contacto una superficie de un soporte solido que comprende una sonda con dicho complejo covalente de aptamero, de modo que dicho marcador pueda asociarse a dicha sonda;
(g) en cualquier punto previo a (h), poner en contacto dicho complejo covalente de aptamero con un agente de marcaje; y
(h) detectar dicha molecula diana sobre dicha superficie detectando dicho agente de marcaje.
112. El metodo del parrafo 111, en el que dicha condicion o dicho tratamiento que desafla cineticamente dicho aptamero comprende poner en contacto dicha muestra de ensayo con al menos una molecula competidora.
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113. El metodo del parrafo 112, en el que dicha al menos una molecula competidora se selecciona independientemente de un oligonucleotido, un polianion, un pollmero de fosfodiester abasico, un dNTP y un pirofosfato.
114. El metodo del parrafo 113, en el que dicha al menos una molecula competidora es heparina o un polidextrano.
115. El metodo del parrafo 113, en el que dicha al menos una molecula competidora es sulfato de dextrano.
116. El metodo del parrafo 111, en el que dicha condicion o dicho tratamiento que desafla cineticamente a dicho aptamero comprende diluir dicha muestra de ensayo.
117. El metodo del parrafo 111, en el que la separacion de dicha muestra de ensayo de cualquier aptamero libre presente en dicha muestra de ensayo comprende hacer precipitar dicho complejo covalente de aptamero, cualquier protelna y cualquier complejo de protelna en dicha muestra de ensayo.
118. El metodo del parrafo 111, en el que la separacion de dicha muestra de ensayo de dicho complejo covalente de aptamero comprende hacer precipitar dicho complejo covalente de aptamero de dicha muestra de ensayo o capturar dicho complejo covalente de aptamero de dicha muestra de ensayo.
119. Un metodo de detection de una o mas moleculas diana que pueden estar presentes en una muestra de ensayo, comprendiendo el metodo:
(a) poner en contacto una muestra de ensayo con una pluralidad de aptameros, comprendiendo cada uno de dichos aptameros un marcador y teniendo una afinidad especlfica por una molecula diana, en el que se forman uno o mas complejos de afinidad de aptamero si una molecula diana correspondiente a cualquiera de dichos aptameros esta presente en dicha muestra de ensayo;
(b) convertir dichos complejos de afinidad de aptamero en complejos covalentes de aptamero;
(c) poner en contacto una superficie de un soporte solido que comprende al menos una sonda con dichos complejos covalentes de aptamero, de modo que dicho marcador de cada uno de dichos aptameros pueda asociarse a su sonda correspondiente;
(d) en cualquier punto previo a (e), poner en contacto dichos complejos covalentes de aptamero con un agente de marcaje; y
(e) detectar una o mas moleculas diana sobre dicha superficie detectando dicho agente de marcaje.
120. Un metodo de determination de una cantidad o concentration de una molecula diana en una muestra de ensayo, metodo que comprende:
(a) poner en contacto una muestra de ensayo con un aptamero que comprende un marcador y que tiene una afinidad especlfica hacia una molecula diana, en el que la muestra;
(b) convertir dicho complejo de afinidad de aptamero en un complejo covalente de aptamero.
(c) poner en contacto una superficie de un soporte solido que comprende una sonda con dicho complejo covalente de aptamero, de modo que dicho marcador pueda asociarse a dicha sonda;
(d) en cualquier punto previo a (e), poner en contacto dicho complejo covalente de aptamero con un agente de marcaje; y
(e) determinar una cantidad o una concentracion de dicha molecula diana detectando cuantitativamente dicho agente de marcaje.
121. Un kit de deteccion de al menos una molecula diana que puede estar presente en una muestra de ensayo, comprendiendo el kit: al menos un aptamero que comprende un marcador y que tiene afinidad especlfica por una molecula diana; un agente de marcaje; y un soporte solido que comprende al menos una sonda capaz de asociarse a dicho marcador.

Claims (10)

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    REIVINDICACIONES
    1. Un kit de deteccion de al menos una molecula diana que puede estar presente en una muestra de ensayo, comprendiendo el kit:
    al menos un aptamero que comprende un marcador y que tiene afinidad especlfica por una molecula diana; un agente de marcaje;
    un soporte solido que comprende al menos una sonda; y
    una molecula competidora, en donde la molecula competidora se selecciona de un polidextrano, dNTP, pollmeros de fosfodiester abasicos, pirofosfato, sulfato de dextrano y heparina.
  2. 2. El kit de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el aptamero comprende una modification de pirimidina en la position 5.
  3. 3. El kit de acuerdo con la reivindicacion 2, en el que la modificacion de pirimidina de la posicion 5 se selecciona del grupo que consiste en 5-(N-bencilcarboxiamida)-2’-desoxiuridina, 5-(N-isobutilcarboxiamida)-2’-desoxiuridina, 5-(N- [2-(1H-indol-3-il)etil]carboxiamida)-2’-desoxiuridina, cloruro de 5-(N-[1-(3-trimetilamonio)propil]carboxiamida)-2’- desoxiuridina, 5-(N-naftilcarboxiamida)-2’-desoxiuridina y 5-(N-[1-(2,3-dihidroxipropil)]carboxiamida)-2’-desoxiuridina.
  4. 4. El kit de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que la sonda es capaz de asociarse al marcador.
  5. 5. El kit de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende ademas solution de lavado para la dilution de la muestra.
  6. 6. El kit de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el agente de marcaje incluye una pareja de union que es especlfica de la molecula diana y de un marcador.
  7. 7. El kit de acuerdo con la reivindicacion 6, en el que la pareja de union es un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un mimetico de anticuerpo sintetico, un biomimetico, un aptamero o un ligando impreso molecular.
  8. 8. El kit de acuerdo con la reivindicacion 6, en el que el marcador se selecciona de moleculas indicadoras, miembros de pares de union especlficos, marcadores de masa, cebadores de oligonucleotido y secuencias de polinucleotidos especlficas.
  9. 9. El kit de acuerdo con la reivindicacion 8, en el que el marcador que es molecula indicadora es un catalizador, una enzima, un polinucleotido que codifica el catalizador, un promotor, un colorante, un punto cuantico, una molecula quimioluminiscente, una coenzima, un sustrato enzimatico, un grupo radiactivo, una molecula organica pequena, una secuencia de polinucleotido amplificable, una partlcula, una partlcula de latex, una partlcula de carbono, un sol metalico, una cristalita, un liposoma, una celula, un marcador de masa que altera el peso de la molecula con la que se conjuga, un material electromagnetico o electroqulmico o un colorante fluorescente.
  10. 10. El kit de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que uno o mas de los reactivos se proporcionan como un polvo seco.
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