ES2742284T3 - Aptámeros contra PDGF y VEGF y su utilización en el tratamiento de afecciones mediadas por PDGF y VEGF - Google Patents

Aptámeros contra PDGF y VEGF y su utilización en el tratamiento de afecciones mediadas por PDGF y VEGF Download PDF

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Abstract

Un aptámero que comprende la secuencia: (A) 5-'ACALnZGZAZGLmZLZ-3' (SEQ ID NO 512). en la que; el aptámero se une a PDGF; cada Z es, independientemente, una pirimidina modificada; cada L se selecciona independientemente de un enlazador C2-C50 sustituido o no sustituido, un enlazador de polietilenglicol, y un nucleótido modificado o no modificado; n es de 1 a 5; y m es de 1 a 10; opcionalmente en la que: i) n es 1, 2, 3, o 4; y en la que m es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, o 9; ii) L independientemente, en cada caso, se selecciona del grupo que consiste en un enlazador C2-C10 sustituido o no sustituido, un enlazador C2-C8 sustituido o no sustituido, un enlazador C2-C6 sustituido o no sustituido, un enlazador C2-C5 sustituido o no sustituido, un enlazador C2-C4 sustituido o no sustituido, y un enlazador C3 sustituido o no sustituido; iii) el aptámero inhibe la fosforilación mediada por PDGF de un receptor de PDGF; o iv) el aptámero se une a PDGF con una afinidad de menos de 10 nM, menos de 5 nM, menos de 2 nM o menos de 1 nM; (B) 5-'GZZQAAEZECZZEZDRGAZZZAAAZG-3' en la que; el aptámero se une a VEGF; el aptámero se une a VEGF-121 con una afinidad de menos de 10 nM, menos de 5 nM, menos de 2 nM, o menos de 1 nM, en el que el aptámero comprende al menos un nucleósido modificado que comprende una modificación de nucleobase hidrófoba; cada Z es una pirimidina modificada; Q se selecciona de cualquier nucleótido modificado o no modificado y un enlazador C2-C50 sustituido o no sustituido, o está ausente; cada E se selecciona independientemente de una G y un enlazador C2-C50 sustituido o no sustituido; D se selecciona de una A y un enlazador C2-C50 sustituido o no sustituido; y R se selecciona de cualquier nucleótido modificado o no modificado y un enlazador C2-C50 sustituido o no sustituido; opcionalmente en la que: (i) E independientemente, en cada caso, se selecciona del grupo que consiste en un enlazador C2-C10 sustituido o no sustituido, un enlazador C2-C8 sustituido o no sustituido, un enlazador C2-C6 sustituido o no sustituido, un enlazador C2-C5 sustituido o no sustituido, un enlazador C2-C4 sustituido o no sustituido, y un enlazador C3 sustituido o no sustituido; y una G; (ii) R, independientemente, en cada caso, se selecciona del grupo que consiste en un enlazador C2-C10 sustituido o no sustituido, un enlazador C2-C8 sustituido o no sustituido, un enlazador C2-C6 sustituido o no sustituido, un enlazador C2-C5 sustituido o no sustituido, un enlazador C2-C4 sustituido o no sustituido, y un enlazador C3 sustituido o no sustituido; (iii) D independientemente, en cada caso, se selecciona del grupo que consiste en un enlazador C2-C10 sustituido o no sustituido, un enlazador C2-C8 sustituido o no sustituido, un enlazador C2-C6 sustituido o no sustituido, un enlazador C2-C5 sustituido o no sustituido, un enlazador C2-C4 sustituido o no sustituido, y un enlazador C3 sustituido o no sustituido; (iv) Q independientemente, en cada caso, se selecciona del grupo que consiste en un enlazador C2-C10 sustituido o no sustituido, un enlazador C2-C8 sustituido o no sustituido, un enlazador C2-C6 sustituido o no sustituido, un enlazador C2-C5 sustituido o no sustituido, un enlazador C2-C4 sustituido o no sustituido, y un enlazador C3 sustituido o no sustituido; o (v) el aptámero inhibe la fosforilación de un receptor de VEGF mediada por VEGF-121; (C) 5-'NZVSLnS'V'ZACNNmGCGZZZAZAGCG-3' (SEQ ID NO: 500), en la que, el aptámero se une a PDGF; V se selecciona entre A, C o G; V' se selecciona entre C, G o Z, en el que V' es complementaria a V; S y S' se seleccionan independientemente entre C o G, en el que S y S' son complementarias entre sí; N se selecciona independientemente de cualquier nucleótido que sea natural o modificado; Z se selecciona independientemente de una pirimidina modificada; L es un separador seleccionado de cualquier nucleótido natural o modificado, un enlazador de hidrocarburo, un enlazador de polietilenglicol o una combinación de los mismos; n es de 0 a 20; y m es de 0 a 20; (D) seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 410-499 y 517-545, en la que el aptámero se une a PDGF; (E) seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 546-706 y 729-739, en la que el aptámero se une a VEGF; o (F) seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 749-760, en la que el aptámero se une a VEGF y/o PDGF.

Description

DESCRIPCIÓN
Aptámeros contra PDGF y VEGF y su utilización en el tratamiento de afecciones mediadas por PDGF y VEGF
CAMPO DE LA INVENCIÓN
[0001] La presente descripción se refiere en general al campo de los ácidos nucleicos y más particularmente a aptámeros capaces de unirse al factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y a aptámeros capaces de unirse al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). En algunas realizaciones, tales aptámeros son útiles como agentes terapéuticos para prevenir, tratar y/o mejorar trastornos proliferativos, incluyendo, pero no limitado a, aterosclerosis, degeneración macular, fibrosis, cáncer y otros trastornos en los que PDGF y/o VEGF se han implicado. En algunas realizaciones, la presente descripción se refiere a construcciones de aptámeros que son capaces de unirse a VEGF y PDGF, simultáneamente o de una manera mutuamente exclusiva, y son útiles como agentes terapéuticos.
ANTECEDENTES
[0002] La siguiente descripción proporciona un resumen de la información y no es una admisión de que cualquier información proporcionada o publicaciones referenciadas en el presente documento sean técnica anterior a la presente descri pción.
[0003] Los factores de crecimiento derivados de plaquetas (PDGF-A, -B, -C y -D) son mitógenos ubicuos y factores quimiotácticos para muchas células del tejido conectivo (Fredriksson, L., et al. (2004) Cytokine Growth Factor Rev. 15 [4] : 197). Los PDGF se producen como dímeros unidos por disulfuro y contienen un dominio de factor de crecimiento con pliegue con nudo de cisteína que funciona a través de la unión a los receptores de PDGF a y p en la superficie de una célula (Claesson-Welsh, L., et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 4917). La unión a PDGF induce la dimerización del receptor, lo que conduce a la autofosforilación en residuos de tirosina intracelulares (Claesson-Welsh, J. (1994) Biol Chem. 269:. 32023). PDGF-BB participa en varios trastornos proliferativos, incluyendo la aterosclerosis, fibrosis, degeneración macular y cáncer (Ostman, A., et al (2001) Adv Cancer Res 80: 1; Appelmann, I., et al (2010) Recent Results Cancer Res 180: 51; Trojanowska, M., et al (2008) Rheumatology (Oxford) 47 (Suppl 5): 2; Rutherford et al (1997) Atherosclerosis 130: 45; Smits et al. (1992) Am J. Pathol 140: 639; Heldin et al (1991) Endocrinology 129: 2187; Floege y Johnson (1995) Miner Electrolyte Metab 21: 271; Raines et al (1990) Experimental Pharmacology, Peptide Growth Factors and their Receptors, Sporn y Roberts, pp. 173-262, Springer, Heidelberg.).
[0004] El VEGF es un homodímero unido por disulfuro secretado que estimula selectivamente las células endoteliales para proliferar, migrar y producir enzimas degradantes de la matriz, todos los cuales son procesos requeridos para la formación de nuevos vasos sanguíneos (Conn, G., et al. (1990) Proc Natl Acad Sci USA. 87: 1323; Ferrara, N. et al (1989) Biochem Biophys Res Commun 161: 851; Gospodarowicz, D., et al (1989) Proc. Natl Acad Sci USA. 86: 7311; Pepper, MS, et al (1991) Biochem Biophys Res Commun 181: 902; Unemori, En , et al (1992) J. Cell Physiol 153: 557). Además de ser el único mitógeno específico de células endoteliales conocido, el VEGF es el único entre los factores de crecimiento angiogénicos en su capacidad para inducir un aumento transitorio de la permeabilidad de los vasos sanguíneos a macromoléculas (Dvorak, HF, et al. (1979) J. Immunol. 122: 166; Senger, DR, et al (1983) Science 219: 983; Senger, DR, et al (1986) Cancer Res 46: 5629). El aumento de la permeabilidad vascular y la deposición resultante de las proteínas del plasma en el espacio extravascular facilitan la formación de nuevos vasos mediante la disposición de una matriz provisional para la migración de células endoteliales. La hiperpermeabilidad es de hecho un rasgo característico de nuevos vasos (Dvorak, HF, et al (1995) Am J. Pathol 146: 1029). Además, la angiogénesis compensatoria inducida por hipoxia tisular también está mediada por VEGF (Levy, AP, et al (1996) J. Biol Chem 271: 2746; Shweiki, D., et al (1991) Nature 359: 843). La identificación de VEGF como una proteína inducible por hipoxia, junto con la observación complementaria de que la hiperoxia provoca la supresión de la expresión de VEGF, proporciona un mecanismo atractivo para relacionar la demanda de oxígeno con el suministro vascular (Benjamin, LE, et al. (1999) J. Clin. Invest 103: 159; Alon, T., et al (1995) Nat Med. 1: 1024).
[0005] Varias isoformas de la proteína VEGF se producen como resultado de corte y empalme alternativo de los ocho exones del gen que codifica VEGF (Eming, SA, et al (2006) J. Invest Dermatol Symp Proc.11: 79). Las isoformas más prevalentes son VEGF-121, VEGF-165 y VEGF-189. El procesamiento proteolítico de VEGF puede generar isoformas adicionales. VEGF-165 puede ser escindido por la plasmina entre Arg-110 y Ala-111 para generar VEGF-110, que es funcionalmente equivalente a VEGF-121 (Keyt, BA, et al (1996) J. Biol Chem 271: 7788). VEGF-189 puede ser escindido por uroquinasa dentro del dominio exón 6 y a continuación puede ser escindido adicionalmente por plasmina para generar VEGF-110 (Plouet, J., et al, (1997) J. Biol Chem 272: 13390). Además, un subconjunto de metaloproteasas de matriz (MMP), incluyendo MMP-3, -7, -9 y -19, son capaces de escindir VEGF-165 y VEGF-189 en etapas secuenciales para generar VEGF-113, que es funcionalmente equivalente a VEGF-110. Por lo tanto, la abundancia relativa de las formas unidas a la matriz y difusibles de VEGF en un tejido determinado se determina mediante la combinación de procesado de corte y empalme alternativo y proteolítico que se produce en las células del tejido (Ferrara, N., et al. (2006) Retina 26: 859).
[0006] La degeneración macular relacionada con la edad (AMD) sigue siendo la causa principal de ceguera en personas mayores de 55 años de edad. La enfermedad se caracteriza por la formación de depósitos insolubles llamados drusas dentro de la mácula, la parte de la retina que tiene la mayor densidad de fotorreceptores y está implicada en la visión central. En las etapas iniciales de la AMD, los depósitos son avasculares y la enfermedad generalmente progresa lentamente. Sin embargo, en aproximadamente el 10% de los pacientes, esta llamada forma "seca" de AMD se vasculariza y se convierte en la forma "húmeda" de AMD, durante la cual la enfermedad se vuelve más progresiva y la visión se deteriora a un ritmo más rápido. En muchos casos, la progresión desde la borrosidad de la visión central a prácticamente la ceguera se produce en menos de dos años. En la etapa avanzada de la enfermedad, a forma exudativa o húmeda de AMD, los nuevos vasos sanguíneos penetran desde el coriocapilar en la parte central de la retina (mácula), ocluyendo la visión central. En los Estados Unidos, la prevalencia de la AMD húmeda es de aproximadamente 1,8 millones y se espera que aumente a cerca de 3 millones en 2020. La incidencia de la AMD húmeda en los Estados Unidos es de alrededor de 210.000 personas cada año.
[0007] Recientemente, la AMD ha sido tratada mediante el bloqueo de la inducción mediada por VEGF de la angiogénesis y la permeabilidad de los vasos sanguíneos por inyección directa en el ojo de antagonistas de alta afinidad que se unen a VEGF, impidiendo la interacción de VEGF con sus receptores de la superficie celular sobre las células endoteliales.
[0008] Existen evidencias considerables que la inhibición dual de la señalización de VEGF y PDGF-B conduce a un bloqueo más eficaz de la angiogénesis acoplado con la regresión de nuevos vasos sanguíneos. Por ejemplo, la evidencia clínica sugiere que la inhibición dual de VEGF y PDGF-B puede lograr una inhibición más completa de angiogénesis ocular en pacientes con AMD. Un inhibidor de aptámero de PDGF-B (E10030), descubierto originalmente en NeXstar Pharmaceuticals (Green, LS, et al (1996) Biochemistry 35: 14413; patentes de Estados Unidos No.
6.207.816; 5.731.144; 5.731.424 y 6.124.449), está siendo desarrollado por Ophthotech Corporation como un tratamiento para AMD. E10030 (Fovista®) es un aptámero modificado basado en el ADN que se une a PDGF-AB o PDGF-BB con una Kd de aproximadamente 100 pM e inhibe las funciones de PDGF-B tanto in vitro como in vivo.
[0009] En un estudio de fase 1, la terapia anti-PDGF con E10030 probado en combinación con la terapia de Lucentis® anti-VEGF dio como resultado el aumento de la visión de tres líneas en el 59% de los pacientes tratados después de 12 semanas de tratamiento. Este es un porcentaje considerablemente mayor de pacientes con una mejora de la agudeza visual en comparación con el 34-40% observado históricamente con Lucentis solo. Además, el tratamiento de combinación fue acompañado con una regresión neovascular destacada en todos los participantes del estudio. Una eficacia mejorada con el tratamiento de combinación fue corroborada recientemente en un estudio de fase 2 de 449 pacientes con DMAE húmeda. Los pacientes que recibieron la combinación de Fovista (1,5 mg) y Lucentis ganaron una media de 10,6 letras de visión a las 24 semanas, en comparación con 6,5 letras para los pacientes que recibieron monoterapia de Lucentis (p = 0,019), lo que representa un beneficio adicional de agudeza visual del 62%.
[0010] Jo N. et al., (2006) American Journal of Pathology. 168 (6): 2036-2053 menciona aptámeros y afirma que la inhibición de la señalización de PDGF B mejora la eficacia de la terapia contra el factor de crecimiento endotelial vascular en múltiples modelos de neovascularización ocular. El documento WO 2005/020972 menciona aptámeros y se refiere a la terapia de combinación para el tratamiento de trastornos neovasculares oculares. El documento WO 2004/094614 menciona aptámeros estabilizados para PDGF y su uso como agentes terapéuticos oncológicos.
CARACTERÍSTICAS DE LA INVENCIÓN
[0011] La invención se define de acuerdo con las reivindicaciones. Por lo tanto, la presente invención proporciona un aptámero que comprende la secuencia:
(A) 5-'ACALnZGZAZGLmZLZ-3' (SEQ ID NO 512).
en la que; el aptámero se une a PDGF; cada Z es, independientemente, una pirimidina modificada; cada L se selecciona independientemente de un enlazador C2-C50 sustituido o no sustituido, un enlazador de polietilenglicol, y un nucleótido modificado o no modificado; n es de 1 a 5; y m es de 1 a 10; opcionalmente en la que: i) n es 1, 2, 3, o 4; y en la que m es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, o 9; (ii) L independientemente, en cada caso, se selecciona del grupo que consiste en un enlazador C2-C10 sustituido o no sustituido, un enlazador C2-C8 sustituido o no sustituido, un enlazador C2-C6 sustituido o no sustituido, un enlazador C2-C5 sustituido o no sustituido, un enlazador C2-C4 sustituido o no sustituido, y un enlazador C3 sustituido o no sustituido; (iii) el aptámero inhibe la fosforilación mediada por PDGF de un receptor de PDGF; o (iv) el aptámero se une a PDGF con una afinidad de menos de 10 nM, menos de 5 nM, menos de 2 nM, o menos de 1 nM;
(B) 5-'GZZQAAEZECZZEZDRGAZZZAAAZG-3'
en la que; el aptámero se une a VEGF; el aptámero se une a VEGF-121 con una afinidad afinidad de menos 10 nM, menos de 5 nM, menos de 2 nM, o menos de 1 nM, en el que el aptámero comprende al menos un nucleósido modificado que comprende una modificación de nucleobase hidrófoba; cada Z es una pirimidina modificada; Q se selecciona de cualquier nucleótido modificado o no modificado y un enlazador C2-C50 sustituido o no sustituido, o está ausente; cada E se selecciona independientemente de una G y un enlazador C2-C50 sustituido o no sustituido; D se selecciona de una A y un enlazador C2-C50 sustituido o no sustituido; y R se selecciona de cualquier nucleótido modificado o no modificado y un enlazador C2-C50 sustituido o no sustituido; opcionalmente en la que: (i) E independientemente, en cada caso, se selecciona del grupo que consiste en un enlazador C2-C10 sustituido o no sustituido, un enlazador C2-C8 sustituido o no sustituido, un enlazador C2-C6 sustituido o no sustituido, un enlazador C2-C5 sustituido o no sustituido, un enlazador C2-C4 sustituido o no sustituido, y un enlazador C3 sustituido o no sustituido; y una G; (ii) R, independientemente, en cada caso, se selecciona del grupo que consiste en un enlazador C2-C10 sustituido o no sustituido, un enlazador C2-C8 sustituido o no sustituido, un enlazador C2-C6 sustituido o no sustituido, un enlazador C2-C5 sustituido o no sustituido, un enlazador C2-C4 sustituido o no sustituido, y un enlazador C3 sustituido o no sustituido; (iii) D independientemente, en cada caso, se selecciona del grupo que consiste en un enlazador C2-C10 sustituido o no sustituido, un enlazador C2-C8 sustituido o no sustituido, un enlazador C2-C6 sustituido o no sustituido, un enlazador C2-C5 sustituido o no sustituido, un enlazador C2-C4 sustituido o no sustituido, y un enlazador C3 sustituido o no sustituido; (iv) Q independientemente, en cada caso, se selecciona del grupo que consiste en un enlazador C2-C10 sustituido o no sustituido, un enlazador C2-C8 sustituido o no sustituido, un enlazador C2-C6 sustituido o no sustituido, un enlazador C2-C5 sustituido o no sustituido, un enlazador C2-C4 sustituido o no sustituido, y un enlazador C3 sustituido o no sustituido; o (v) el aptámero inhibe la fosforilación de un receptor de VEGF mediada por VEGF-121;
(C) 5-'NZVSLnS'V'ZACNNmGCGZZZAZAGCG-3' (SEQ ID NO: 500),
en la que, el aptámero se une a PDGF; V se selecciona entre A, C o G; V' se selecciona entre C, G o Z, en el que V' es complementaria a V; S y S 'se seleccionan independientemente entre C o G, en el que S y S' son complementarias entre sí; N se selecciona independientemente de cualquier nucleótido que sea natural o modificado; Z se selecciona independientemente de una pirimidina modificada; L es un separador seleccionado de cualquier nucleótido natural o modificado, un enlazador de hidrocarburo, un enlazador de polietilenglicol o una combinación de los mismos; n es de 0 a 20; y m es de 0 a 20;
(D) seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 410-499 y 517-545, en la que el aptámero se une a PDGF;
(E) seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 546-706 y 729-739,
en la que el aptámero se une a VEGF; o
(F) seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 749-760, en la que el aptámero se une a VEGF y/o PDGF.
[0012] En una realización de la invención, en el que el aptámero es el aptámero de la reivindicación 1(A) o (B), cada Z se selecciona independientemte de 5-(N-bencilcarboxamida)-2'-desoxiuridina (BndU), 5-(N-bencilcarboxamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-bencilcarboxamida)-2'-fluorouridina, 5-(N-fenetilcarboxamida)-2'-desoxiuridina (PedU), 5-(N-tiofenilmetilcarboxamida)-2'-desoxiuridina (ThdU), 5-(N-isobutilcarboxamida)-2'-desoxiuridina (iBudU), 5-(N-isobutilcarboxamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-isobutilcarboxamida)-2'-fluorouridina, 5-(N-triptaminocarboxamida)-2'-desoxiuridina (TrpdU), 5-(N-triptaminocarboxamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-triptaminocarboxamida)-2'-fluorouridina, cloruro de 5-(N-[1-(3-trimetilamonio)propil]carboxamida)-2'-desoxiuridina, 5-(N-naftilmetilcarboxamida)-2'-desoxiuridina (NapdU), 5-(N-naftilmetilcarboxamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-naftilmetilcarboxamida)-2'-fluorouridina, y 5-(N-[1-(2,3-dihidroxipropil)]carboxamida)-2'-desoxiuridina).
[0013] En una realización de la invención, el aptámero de la reivindicación 1 (A) o (B) comprende además al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, o al menos cinco nucleósidos que comprenden un 2'- OMe.
[0014] En una realización de la invención, el aptámero de la reivindicación 1 (A) o (B) comprende además al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, o al menos cinco enlaces internucleósido que son enlaces fosforotioato.
[0015] La presente invención también proporciona una construcción de aptámero que comprende un primer aptámero y un segundo aptámero, en la que: (a) el primer aptámero y el segundo aptámero se seleccionan independientemente de los aptámeros de la reivindicación 1 (D), en el que el primer aptámero y el segundo aptámero son los mismos o diferentes; (b) el primer aptámero y el segundo aptámero se seleccionan independientemente de los aptámeros de la reivindicación 1 (E), en el que el primer aptámero y el segundo aptámero son los mismos o diferentes; o (c) el primer aptámero se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 546-706 y el segundo aptámero se selecciona del grupo que consiste en 410 a 499 y 517 a 545. En una realización, el primer aptámero y el segundo aptámero están unidos covalentemente.
[0016] La invención también proporciona el aptámero de la reivindicación 1 para uso en un procedimiento para tratar y/o prevenir una afección seleccionada del grupo que consiste en la degeneración macular, una afección oftálmica, fibrosis, una enfermedad cardiovascular y un cáncer.
[0017] La presente descripción proporciona aptámeros que se unen al factor de crecimiento B derivado de plaquetas (PDGF-B, incluyendo PDGF-BB y PDGF-AB), aptámeros que se unen al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF, incluyendo VEGF-121 y VEGF-165), y construcciones de aptámeros que comprenden un aptámero que se une a PDGF-B y un aptámero que se une a VEGF. Los aptámeros y construcciones de aptámeros decritos son útiles como agentes terapéuticos para prevenir, tratar y/o mejorar enfermedades o afecciones proliferativas, incluyendo, pero no limitado a, la aterosclerosis, la degeneración macular, la fibrosis, la retinopatía diabética y el cáncer, y/u otras enfermedades o afecciones en las que están implicados PDGF y/o VEGF. En diversas realizaciones, las construcciones de aptámeros son capaces de unirse a cada uno de VEGF y PDGF-B de forma independiente y/o VEGF y PDGF-B simultáneamente. Se incluyen composiciones farmacéuticas o formulaciones que comprenden un aptámero de PDGF, un aptámero VEGF o una construcción de aptámero VEGF/PDGF-B, o una sal farmacéuticamente aceptable de cualquiera de los anteriores, y al menos un portador farmacéuticamente aceptable. Tales composiciones se pueden preparar en cualquier forma de dosificación aceptable farmacéuticamente adecuada.
[0018] En otro aspecto, la presente descripción proporciona procedimientos para prevenir, tratar y/o mejorar una enfermedad o afección mediada por PDGF y/o VEGF. En algunas realizaciones, un procedimiento comprende administrar un aptámero de PDGF, un aptámero de VEGF y/o una construcción de aptámeros de VEGF/PDGF-B, o composiciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de estos, a un sujeto, tal como un mamífero. En algunas realizaciones, el sujeto es un ser humano. Específicamente, se proporcionan procedimientos para tratar, prevenir y/o mejorar la fibrosis, aterosclerosis, degeneración macular, retinopatía diabética y/o cáncer. En algunas realizaciones, una enfermedad o afección mediada por PDGF y/o VEGF es una en la que actividad de PDGF y/o VEGF puede directa o indirectamente contribuir a la enfermedad o afección. Tales enfermedades o afecciones incluyen, pero no se limitan a, fibrosis, aterosclerosis, degeneración macular, retinopatía diabética y cáncer. En algunas realizaciones, la enfermedad o afección a tratar, prevenir y/o mejorar es la degeneración macular relacionada con la edad (AMD), retinopatía diabética, u otras enfermedades oculares, tales como glaucoma, ojo seco crónico, pérdida de visión relacionada con el SIDA, ambliopía, hemianopsia, oclusiones de la vena de la retina, tracoma, queratocono, inflamación coriorretiniana, retinopatía serosa central, uveítis, retinitis, retinopatía hipertensiva, distrofia de la retina, etc. En algunas realizaciones, la enfermedad o afección a tratar, prevenir y/o mejorar es fibrosis renal o cáncer renal.
[0019] En algunas realizaciones, aptámeros y construcciones de aptámeros descritos en este documento tienen aplicaciones potenciales que van desde el descubrimiento de biomarcadores y diagnóstico (Ostroff, RM, et al (2010) PLoS One 5: E15003; Mehan, M., et al (2012) PLoS One 7: e35157) a histoquímica y obtención de imágnenes(Gupta S., et al. (2011) Appl Immunohistochem Mol Morphol 19: 273).
[0020] En algunas realizaciones, un efecto terapéutico (por ejemplo, tratar, prevenir y/o mejorar la fibrosis, aterosclerosis, degeneración macular, o cáncer, etc.) se puede conseguir mediante la administración de un aptámero de PDGF, un aptámero VEGF y/o una construcción de aptámeros de PDGF/VEGF de tal manera que el aptámero o construcción de aptámeros se expone a, y se puede unir a, PDGF y/o VEGF. En algunas realizaciones, dicha unión se produce independientemente del procedimiento de liberación del aptámero al sujeto a tratar. En algunas realizaciones, el efecto terapéutico puede conseguirse mediante la administración del aptámero de PDGF, el aptámero VEGF y/o la construcción de aptámeros de PDGF/VEGF de tal manera que se expone a, y se une a, PDGF y/o VEGF y previene o reduce la unión de PDGF y/o VEGF a uno o más receptores celulares.
[0021] En algunas realizaciones, la unión de un aptámero de PDGF a PDGF-BB o PDGF-AB interfiere con la unión de PDGF-BB o PDGF-AB al receptor PDGF-a. En algunas realizaciones, la unión de un aptámero de PDGF a PDGF-BB o PDGF-AB interfiere con la unión de PDGF-BB o PDGF-AB con el receptor PDGF-p. En algunas realizaciones, un aptámero de PDGF a PDGF-BB o PDGF-AB reduce la fosforilación de un receptor de PDGF (tal como receptor PDGF-a y/o receptor PDGF-p).
[0022] En algunas realizaciones, la unión de un aptámero de VEGF a VEGF-121, VEGF-110, VEGF-165, VEGF-189, u otro fragmento proteolítico de corte y empalme alternativo o funcionalmente activo de VEGF interfiere con la unión del factor de crecimiento a VEGFR-1 (Flt-1). En algunas realizaciones, la unión de un aptámero de VEGF a VEGF-121, VEGF-110, VEGF-165, VEGF-189, u otro fragmento proteolítico de corte y empalme alternativo o funcionalmente activo de VEGF, interfiere con la unión del factor de crecimiento a VEGFR-2 (KDR). En algunas realizaciones, un aptámero de VEGF reduce la fosforilación de un receptor de VEGF (tal como un receptor VEGF-1 y/o un receptor VEGF-1).
[0023] En algunas realizaciones, una construcción de aptámeros de PDGF/VEGF reduce el nivel de fosforilación de un receptor de PDGF (tal como un receptor PDGF-a y/o un receptor de PDGF-p) y reduce el nivel de fosforilación de un receptor de VEGF (por ejemplo, VEGFR-1 y/o v Eg FR-2). En algunas realizaciones, un aptámero de PDGF, un aptámero VEGF o una construcción de aptámeros de PDGF/VEGF reducen la señalización a lo largo de la vía de transducción de señales de un receptor de PDGF y/o un receptor de VEGF.
[0024] En algunas realizaciones, un aptámero de PDGF, un aptámero VEGF o una construcción de aptámeros de PDGF/VEGF se administran con uno o más agentes activos adicionales. Dicha administración puede ser secuencial o en combinación.
[0025] En algunas realizaciones, un procedimiento de diagnóstico in vitro comprende poner en contacto un aptámero de PDGF con una muestra sospechosa de comprender PDGF. En algunas realizaciones, un procedimiento de diagnóstico in vivo comprende administrar un aptámero de PDGF convenientemente marcado a un individuo sospechoso de tener una enfermedad o trastorno mediado por PDGF, en el que se detecta el aptámero de PDGF marcado con el fin de diagnosticar o evaluar el estado de salud del individuo. El marcador puede seleccionarse de acuerdo con la modalidad de imagen utilizado a utilizar.
[0026] En algunas realizaciones, un procedimiento de diagnóstico in vitro comprende poner en contacto un aptámero de VEGF con una muestra sospechosa de comprender VEGF. En algunas realizaciones, un procedimiento de diagnóstico in vivo comprende administrar un aptámero de VEGF convenientemente marcado a un individuo sospechoso de tener una enfermedad o trastorno mediado por VEGF, en el que se detecta el aptámero VEGF marcado con el fin de diagnosticar o evaluar el estado de salud del individuo. El marcador puede seleccionarse de acuerdo con la modalidad de imagen a utilizar.
[0027] En algunas realizaciones, un procedimiento de diagnóstico in vitro comprende poner en contacto una construcción de aptámeros de PEGF/VEGF con una muestra sospechosa de comprender PDGF y/o VEGF. En otro aspecto, la presente descripción proporciona un procedimiento de diagnóstico in vivo que comprende obtener una construcción de aptámeros de PDGF/VEGF convenientemente marcada, inyectar la construcción de aptámeros de PEGF/VEGF marcada en un individuo sospechoso de tener una enfermedad o trastorno mediado por PDGF/VEGF, y detectar la construcción de aptámeros de PDGF/VEGF marcada con el fin de diagnosticar o evaluar el estado de salud del individuo. El marcador puede seleccionarse de acuerdo con la modalidad de imagen a utilizar.
[0028] En algunas realizaciones, la presente invención proporciona construcciones de aptámeros que comprenden un aptámero de PDGF y un aptámero VEGF.
[0029] En algunas realizaciones, la presente descripción proporciona dos estructuras cocristalinas discretas, separado a resoluciones de 2,2 Á y 2,3 Á, conteniendo cada una dos copias de un aptámero unido a PDGF-BB.
[0030] En algunas realizaciones, la presente descripción proporciona un aptámero que se une de manera eficiente a una proteína predominantemente a través de interacciones hidrófobas.
[0031] En algunas realizaciones, la presente descripción proporciona un complejo de aptámero-proteína, en el que el aptámero se une a la proteína sustancialmente a través de interacciones hidrófobas.
[0032] En algunas realizaciones, la presente descripción proporciona un aptámero capaz de formar un complejo de co-cristal con una proteína diana, en el que el complejo comprende menos de 7 enlaces de hidrógeno.
[0033] En algunas realizaciones, la presente descripción proporciona un aptámero capaz de formar un complejo de co-cristal con una proteína diana, en el que el complejo comprende un dominio “pseudoknot” (pseudonudo) que implica 16 nucleótidos o menos.
[0034] En algunas realizaciones, la presente descripción proporciona un aptámero capaz de unirse a una proteína diana, en el que el aptámero se une a la proteína diana con menos de o igual a 1 contacto polar por cada 100 Á2 de la zona de interfase, en el que el contacto polar comprende uno o más enlaces de hidrógeno y una o más interacciones carga-carga, y en el que el área de interfase es una fracción del área de superficie de la proteína ocupado por el aptámero.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
[0035] La figura 1 muestra (A) determinación de los valores de Kd para tres aptámeros modificados de velocidad de disociación lenta y aptámero E10030; (B) inhibición de la fosforilación de PDGFRI3 estimulada por PDGF-BB por tres aptámeros de PDGF descritos en este documento y un oligonucleótido control combinado; (C) las proporciones de Kd para aptámeros modificados frente al aptámero original, 4149-8_130, en las que una determinada nucleobase BndU ha sido sustituida por otro nucleobasa dU modificada, en relación con el aptámero original (un valor de 1 indica que el aptámero modificado inhibe la fosforilación de PDGFRb igualmente, igual que el original, mientras que un valor > 1 indica que el aptámero modificado tiene una actividad inhibidora menos potente en comparación con el original).
La figura 2 muestra (A) una tabla de contactos intramoleculares de 4149-8_260 y contactos del aptámero de PDGF; (B) una representación de contractos intramoleculares no polares y el aptámero de PDGF; y (C) una representación de contactos intramoleculares polares y aptámero de PDGF; tal como se describe en el Ejemplo 2. Las interacciones hidrofóbicas (no polares) incluyen interacciones p-p (interacciones aromáticas cara a cara y borde a cara) y contacto de van der Waals (vW). Las interacciones polares incluyen enlaces de hidrógeno (líneas de trazos) e interacciones carga-carga (líneas continuas. Ciertos residuos de aptámeros (por ejemplo, dC4, dG6, dA9, dC10, dC12, dG13, dC14, dG15, dG22, dC23 y G242'-O-metilo) participan en el apareamiento de bases canónicas y el apilamiento de bases, tal como se muestra en B y C, y se extruye A112'-O-metilo.
La figura 3 muestra (a) la secuencia de consenso para un conjunto de clones del grupo de SELEX, tal como se determina mediante pirosecuenciación 454 y la frecuencia de nucleótidos en cada posición, y las secuencias para seis de los clones; y (B) valores de Kd para aptámeros modificados basados en aptámero original 4149-8, que se modificó tal como se muestra, tal como se describe en el Ejemplo 1.
La Figura 4 ilustra ciertas estereovistas de un complejo PDGF-BB:4149-8_260, tal como se describe en el Ejemplo 2.
La Figura 5 muestra (A) afinidad de unión de diversos aptámeros para diferentes isoformas diméricas de PDGF, en presencia y ausencia de ARNt 200 nM; y (B) una alineación de las secuencias de aminoácidos para las formas maduras de PDGF-A, -B, -C y -D; tal como se describe en el Ejemplo 3. Los residuos de aminoácidos para PDGF-A que se muestran en negrita están implicados en la unión del propéptido, y los residuos de aminoácidos para PDGF-B que se muestran en negrita están implicados en la unión a PDGFRr. (Calce et al, (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
107 (25): 11307). El sombreado en cajas indica residuos que participan en la unión del aptámero 4149-8_260 a la cadena 1 de PDGF-B (sombreado oscuro) y la cadena 2 de PDGF-B (sombreado claro).
La figura 6 muestra (A) proporción de Kd para aptámeros modificados preparados sustituyendo cada posición indicada en el aptámero 4149-8_38 (SED ID NO: 38) por un enlazador de tres carbonos C-3, y los valores de Kd para la unión a PDGF-BB , unión a PDGF-AB, así como la IC50 celular para cinco aptámeros modificados basados en el aptámero original 4149-8; y (B) proporciones de Kd para aptámeros modificados basados en el aptámero original 4149-8_130 (SEQ ID NO: 130), en el que una determinada nucleobase Bn-dU se ha sustituido por otra nucleobase dU modificada, en relación con el aptámero original (números < 1 indican que el aptámero modificado tiene mayor afinidad que el aptámero original y los números > 1 indican que el aptámero modificado tiene menor afinidad que el aptámero original); tal como se describe en el Ejemplo 1.
La figura 7 muestra (A) un diagrama de cintas del homodímero de PDGF-BB unido al aptámero 4149-8_260 (SEQ ID NO: 211); y (B) una representación esquemática y representación estructural de la conformación de aptámero cuando se une a una subunidad de PDGF-B; tal como se describe en el Ejemplo 2. Los pares de bases no canónicas están codificados basados en la nomenclatura de Leontis y Westhof (Leontis NB et al (2003) Curr Opin Struct Biol 13 (3): 300). Gris oscuro = cadena 1 de PDGF-B; Gris claro = cadena 2 de PDGF-B; Bn = Bn-dU, Pe = Pe-dU, Th = Th-dU.
Las figuras 8A-L ilustran ciertas características estructurales del aptámero de PDGF a partir de la estructura cristalina del complejo PDGF-BB: aptámero 4149-8_260, tal como se describe en el Ejemplo 2. La Figura 8A ilustra la estructura de aptámero, que muestra dominios, pares de bases y las interacciones de apilamiento. Los tallos del “miniknot” se desvían significativamente del ADN de forma B debido a los ángulos sustanciales de “buckling” y “propeller”, así como de subenrollado helicoidal. Bn20 es la bisagra que hace de interfase con el tallo 5' a través de apilamiento con U8. La figura 8B ilustra la vista del extremo del tallo 1 (S1). La figura 8C ilustra vistas laterales S1 y L2. Los nucleótidos modificados forman un grupo hidrofóbico con Bn2, Bn7 y Bn8 del tallo 5' que interacciona con Bn16, Pe17, Th18 y Bn20 del “miniknot”. Bn8 forma interacciones p-p borde a cara con Bn16 y Bn20. El par de bases dU-dU no canónicas utiliza un enlace de H al enlazador amida de Bn20. La figura 8D ilustra los detalles de los pares de bases no canónicas entre PE-dU17 y BN-dU20. La figura 8E ilustra interacciones aromáticas que estabilizan la base de S1 de “miniknot”. La figura 8F ilustra una base triple, que se forma entre el par de Watson-Crick C10-G15 en el S1 y el nucleótido de L2, A21. La clasificación Leontis-Westhof de esta base triple es cis Watson-Crick/Watson-Crick, trans borde de azúcar/Hoogsteen (Leontis NB et al (2003) Curr Opin Struct Biol 13: 300). La base de triple no es plana ya que hay un ángulo de torsión “propeller” de 34° entre A21 y G15, así como una considerable torsión de “buckling” y “propeller” entre el par de bases de Watson-Crick (Tabla 5). La figura 8G ilustra el residuo mA11, la base extrusionada única en L1 y el giro del esqueleto. La figura 8H ilustra una vista axial de S2. La figura 8I ilustra una vista axial del motivo del tallo 5' que pone de manifiesto la desviación significativa del ADN de forma B. Los parámetros helicoidales globales C1'-C1' indican que el par dU-dU está sobretorsionado (40°) lo que da lugar a una curva de ~124° en el esqueleto que se aplana a casi lineal (~172°) entre Bn-dU1 y Bn-dU2. El desplazamiento radial significativo entre BndU7-Bn-Du8 y el desplazamiento casi cero entre Bn-dU2-dA3 da lugar a un mayor solapamiento por apilamiento entre las bases 2-4 y 6-7. La figura 8J ilustra el par de bases no canónicas entre Bn-dU2 y Bn-dU8. La figura 8K ilustra la unión entre dominios formada por nucleótidos modificados. La figura 8L ilustra Bn8 que forma interacciones p-p borde a cara con Bn16 y Bn20 que definen la topología de la unión entre dominios. El impacto perjudicial de sustituir Bn-dU en la posición 8 del aptámero 4149-8_260 (SEQ ID NO: 211) por un iB-dU (SEQ ID No : 255) es evidente en las imágenes de relleno de espacios que se muestran en la figura 8M y la figura 8N. Bn8 (8M) es capaz de formar energéticamente interacciones p-p favorables con grupos aromáticos vecinos y permite que SOMAmer se empaquete con más fuerza. En cambio, iB8 (8N) no es aromático y por lo tanto carece de la capacidad para las interacciones de apilamiento p con grupos aromáticos vecinos. Además, el grupo iB no es tan grande y deja un agujero en el centro de la agrupación hidrófoba.
La figura 9 ilustra ciertas interacciones proteína-aptámero, tal como se describe en el Ejemplo 2. En la figura 9A , BndU1 ocupa un bolsillo debajo de un puente salino en la interfase del homodímero. La base U1 forma enlaces de hidrógeno con la cadena principal de proteína en Val39, mientras que el anillo de bencilo se intercala entre la cadena lateral alifática de Arg 56 y el enlace disulfuro de Cys43-Cys52. En la figura 9B , Bn2 tiene una interacción de de tipo borde con Trp40 y se encuentra entre las cadenas laterales de metileno de Asn55 y Leu38. La figura 9C ilustra que el anillo aromático de Bn7 está metido en contra de las partes alifáticas de las cadenas laterales de Asn54 y Asn55. La figura 9D ilustra que las cadenas laterales de Leu38 y Ile75 presentan una superficie hidrófoba para el anillo de bencilo de Bn-dU8 para contactar con la proteína. La figura 9E ilustra que Bn16 tiene un apilamiento p de borde a cara con Trp40 y un contacto de van der Waals con la región alifática de Arg73. La figura 9F ilustra que Pe17 está rodeada por las cadenas laterales hidrófobas de Leu38, Trp40, Arg73 y Ile75. Arg73 forma un enlace de hidrógeno con el enlazador de amida de Pe-dU17 y una interacción carga-carga con la cadena principal del aptámero. La figura 9G ilustra Th18 rodeada por las cadenas laterales hidrófobas de Arg73, Ile75 y Phe84. La figura 9H ilustra que las interacciones por apilamiento entre la proteína y el aptámero están presentes entre Pro82 y Bn20 y U8, y Phe84 forma un contacto de borde a cara con U20. Bn20 forma un contacto hidrófobo adicional con Ile77 y Lys80.
La figura 10 muestra las seis estructuras cocristalinas de aptámeros tradicionales (PDB IDs: vWF, 3HXO; trombina, 3QLP; ARNt de GlnRs, 1EXD; IgG humana, 3AGV; proteína de cubierta de Ms 2, 6MSF; NF-kB, 1OOA) que se analizaron por el número de contactos polares (enlaces de hidrógeno más interacciones carga-carga), y el área de superficie de contacto. Los resultados se representan frente a las afinidades de unión descritas para estos seis complejos aptámero-diana (barras gris oscuro) y para tres SOMAmers (barras gris claro), incluyendo el complejo PDGF-SL5 (4149-8_260) y dos estructuras SOMAmer-diana no publicadas. La relación entre el número de contactos polares y el área de superficie de contacto para los seis aptámeros tradicionales se analizó mediante regresión lineal, y el intervalo de confianza del 99% se indica por el sombreado gris en la base de la figura. La figura 10B ilustra la complementariedad de forma del complejo de PDGF-SOMAmer tal como se muestra por Pe-dU17 y Th-dU18. A la izquierda, la cadena 1 de PDGF se muestra como una superficie de color gris oscuro, Pe-dU17 y Th-dU18 se muestran como representaciones que llenan el espacio. A la derecha, la misma vista que el panel de la izquierda, excepto que Pe-dU17 se muestra como una representación en palo. La figura 10C ilustra el detalle de la interacción Bn-dU1 con PDGF, con la cadena 1 de PDGF mostrada como una superficie de color gris oscuro, la cadena 2 de PDGF mostrada como una superficie de color gris claro y Bn-dU1 mostrado como una representación de relleno del espacio.
La figura 11 muestra una comparación de la unión de SL5 y PDGFRI3 a PDGF-BB. (A) Cocristal del receptor que muestra el homodímero de PDGF (cadena 1, gris medio; cadena 2, gris claro) y el dominio extracelular del receptor de color gris oscuro (de Shim, AH, et al (2010) Proc Natl Acad Sci USA. 107 (25): 11307). (B) Complejo de homodímero de PDGF (cadena 1, gris medio; cadena 2, gris claro) y SL5 (gris oscuro) (C) Secuencia de aminoácidos de la forma madura de PDGF-B. El sombreado las cajas indica residuos de contacto a 4149-8_260, PDGFRI3 o ambos. Los residuos de PDGF que forman un contacto de 4 Á con 4149-8_260, pero no entran en contacto con PDGFRI3 están en una caja sin sombreado. Los residuos de PDGF que forman un contacto de 4 Á con PDGFRp, pero no entran en contacto con 4149-8_260 están en una caja con sombreado oscuro. Los residuos de PDGF que forman un contacto de 4 Á con 4149-8_260 y PDGFR están en una caja con sombreado gris medio.
La figura 12 ilustra ciertas modificaciones de pirimidina C-5 de ejemplo que se pueden incorporar en aptámeros, tales como aptámeros de velocidad de disociación lenta.
La figura 13 muestra una gráfica representativa de la inhibición de fosforilación de PDGF Rp inducida por PDGF-BB en fibroblastos Hs27 con SOMAmers 4149-8_379 (marcados como OH-4149-8_379) o SOMAmer 4149-8_379 modificado con el enlazador de 5'-amino (marcado como N -4149-8_379), tal como se describe en el Ejemplo 4.
La figura 14 muestra la secuencia de consenso para un conjunto de clones de unión a PDGF del grupo de SELEX, tal como se determina mediante pirosecuenciación 454 y la frecuencia de nucleótidos en cada posición, tal como se describe en el Ejemplo 5.
La figura 15 muestra proporciones de Kd para aptámeros modificados basados en el aptámero original 4867-31_143, en las que una determinada nucleobase Nap-dU se ha sustituido por otra nucleobase dU modificada, en relación con el aptámero original (números < 1 indican que el aptámero modificado tiene mayor afinidad que el aptámero original y los números > 1 indican que el aptámero modificado tiene menor afinidad que el aptámero original); tal como se describe en el Ejemplo 7.
La figura 16 muestra la secuencia de consenso para un conjunto de clones de unión a VEGF del grupo de SELEX, tal como se determina mediante pirosecuenciación 454 y la frecuencia de nucleótidos en cada posición, tal como se describe en el Ejemplo 7.
La figura 17 muestra el porcentaje de fosforilación de VEGFR2 en células endoteliales de la vena umbilical humanas (HUVEC) estimuladas con VEGF-121 o VEGF-165 y aptámeros de VEGF 4867-31_43 y 4867-31_192, tal como se describe en el Ejemplo 9.
La figura 18 muestra (A) la inhibición de la fosforilación de PDGF Rp inducida por PDGF en fibroblastos Hs27 con aptámero de PDGF 4149-8_379 (círculos abiertos) y la construcción de aptameros de PDGF/VEGF 4149-8_401 (círculos cerrados); y (B) la inhibición de la fosforilación de VEGF R2 inducida por VEGF en HUVEC con el aptámero de VEGF 4867-31_192 (círculos abiertos) y la construcción de aptámeros de PDGF/VEGF 4149-8_401 (círculos cerrados); tal como se describe en el Ejemplo 11.
La figura 19 muestra la unión simultánea de PDGF y VEGF por la construcción de aptámeros de PDGF/VEGF SL1012 (20 kDa PEG-N-4149-8_401) en (A) placas de microtitulación recubiertas con el VEGF con adición de PDGF biotinilado, y (B) placas de microtitulación recubiertas con PDGF con la adición de VEGF biotinilado, tal como se describe en el Ejemplo 12.
La figura 20 muestra la unión simultánea de PDGF y VEGF por construcciones de aptámeros de PDGF/VEGF (A) SL1012 (20 kDa PEG-N-4149-8_401) y (B) SL1013 (40 kDa PEG-N-4149-8-401), en placas de microtitulación que se recubrieron con PDGF con la adición de VEGF biotinilado, tal como se describe en el Ejemplo 12.
La figura 21 muestra la unión simultánea de PDGF y VEGF por diversas construcciones de aptámeros de PDGF/VEGF en (A) placas de microtitulación recubiertas con VEGF con la adición de PDGF biotinilado, y (B) placas de microtitulación recubiertas con PDGF con la adición de VEGF biotinilado, tal como se describe en el Ejemplo 12.
La figura 22 muestra (A) una representación de un número de contactos polares (definidos como la suma de enlaces de hidrógeno e interacciones carga-carga) frente al área de interfase para aptámeros tradicionales (diamantes) y SOMAmers (círculos) (el ajuste de regresión lineal tiene un R2 = 0,91 con una pendiente de 0,016; las líneas de trazos representan los intervalos de confianza del 99% de esta tendencia, cayendo los SOMAmers fuera de estos límites), (B) una representación de la energía libre de unión frente a los contactos polares para aptámeros tradicionales (diamantes) y SOMAmers (círculos) (el ajuste de regresión lineal tiene un R2 = 0,64 con una pendiente de 0,073), y (C) una tabla que muestra diversas propiedades termodinámicas y características de contacto de seis estructuras cristalinas anteriores de aptámero-proteína y tres estructuras cristalinas de SOMAmer-proteína, incluyendo PDGF-BB: 4149-8_260, tal como se describe en el Ejemplo 2. (C) Características de interacción para aptámeros y SOMAmers unidos a dianas proteicas (referencias de las figuras: (a) Convery et al (1998) Nat Struct Biol 5 (2): 133; (b) Nomura et al (2010) Nucleic Acids Res 38 (21): 7822; (c) Pagano et al (2008) Biophys J. 94 (2): 562; (d) Huang et al (2003) Proc. Natl Acad Sci USA. 100 (16): 9268; (e) Huang et al (2009) Structure 17 (11): 1476; (f) Bullock et al (2000) Nat Struct Biol 7 (6): 497. Los cálculos de energía libre se determinaron a partir de las afinidades de unión medidas para SOMAmers, o los valores de Kd publicados utilizando las siguientes temperaturas: MS2, trombina, NFkB, vWF y GlnRS, temperatura ambiente (296 K); IgG, 298 K; SOMAmers, 310 K. SOMAmers muestran una tendencia hacia mayores afinidades de unión; energía libre de unión promedio o el valor -AG es de 11,4 ± 1,3 kcal/mol para los seis aptámeros y 14,3 kcal/mol ± 0,8 kcal/mol para los tres SOMAmers. Los átomos de contacto de la proteína dentro de 4 Á de cada ligando se determinaron en PyMOL. Los cálculos del área de interfase se realizaron con PISA (aptámeros) (Krissinel et al (2007) J. Mol Biol 372 (3): 774) o PyMOL (SOMAmers) (DeLano (2002) The Pymol Molecular Graphics System, Delano Scientific, San Carlos, CA). Dentro de este conjunto de datos relativamente pequeño de interacciones evaluadas cristalográficamente, los aptámeros se acoplan a sus dianas con una eficiencia de ligando promedio de 0,21 ± 0,14 kcal/mol por átomo de contacto sin hidrógeno, en comparación con 0,16 ± 0,04 kcal/mol por átomo de contacto sin hidrógeno para SOMAmers. Las energías libres de unión por área de interfase también son similares, con un valor promedio de 0,017 ± 0,009 kcal-moMÁ'2 para aptámeros y 0,012 ± 0,001 kca lm oM Á'2 para SOMAmers. El valor de la energía libre de la unión por contacto polar, calculado a partir de valores de la tabla, es aproximadamente dos veces tan grande para SOMAmers (promedio de 1,75 ± 0,36 kcal/mol por contacto polar) como para los aptámeros (0,89 ± 0,56 kcal/mol por contacto polar).
DESCRIPCIÓN DETALLADA
[0036] A continuación se hará referencia en detalle a realizaciones representativas de la invención. Aunque la invención se describirá en conjunción con las realizaciones enumeradas, se entenderá que la invención no se pretende que esté limitada a estas realizaciones. Por el contrario, la invención pretende cubrir todas las alternativas, modificaciones y equivalentes que pueden incluirse dentro del alcance de la presente invención, tal como se define por las reivindicaciones.
[0037] Un experto en la técnica reconocerá muchos procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento que podrían ser utilizados en y están dentro del alcance de la práctica de la presente invención. La presente invención no está en modo alguno limitada a los procedimientos y materiales descritos.
[0038] A menos que se defina lo contrario, los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por un experto en la técnica a la que pertenece la presente invención. Aunque en la práctica o ensayo de la invención pueden usarse cualquier procedimiento, dispositivo y material similares o equivalentes a los descritos en el presente documento, a continuación se describen los procedimientos, dispositivos y materiales preferidos.
[0039] Todas las publicaciones, los documentos de patente publicados y solicitudes de patente citadas en esta descripción son indicativas del nivel de habilidad en la técnica o técnicas a la que la descripción se refiere.
[0040] Tal como se utiliza en esta descripción, incluyendo las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el/la" incluyen referencias en plural, a menos que el contenido indique claramente lo contrario, y se usan de manera intercambiable con "al menos uno" y "uno o más". Por lo tanto, la referencia a "un aptámero" incluye mezclas de aptámeros, y similares.
[0041] Tal como se usa en el presente documento, el término "aproximadamente" representa una modificación o variación insignificante del valor numérico de tal manera que la función básica del elemento al que se refiere el valor numérico no cambia.
[0042] Tal como se usa en este documento, los términos "comprende", "que comprende", "incluye", "que incluye", "contiene", "que contiene", y cualquier variación de los mismos, pretenden cubrir una inclusión no exclusiva, de tal manera que un proceso, procedimiento, producto por proceso, o composición de materia que comprende, incluye, o contiene un elemento o una lista de elementos no incluye sólo esos elementos, sino que puede incluir otros elementos no enumerados expresamente o inherentes a tal proceso, procedimiento, producto por proceso o composición de la materia.
[0043] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "nucleótido" se refiere a un ribonucleótido o un desoxirribonucleótido, o una forma modificada de los mismos, así como un análogo de los mismos. Los nucleótidos incluyen especies que incluyen purinas (por ejemplo, adenina, hipoxantina, guanina, y sus derivados y análogos), así como pirimidinas (por ejemplo, citosina, uracilo, timina, y sus derivados y análogos).
[0044] Tal como se usa en el presente documento, "ácido nucleico", "oligonucleótido" y "polinucleótido" se usan indistintamente para referirse a un polímero de nucleótidos e incluyen ADN, ARN, híbridos de ADN/ARN y modificaciones de este tipo de ácidos nucleicos, oligonucleótidos y polinucleótidos, en los que se incluyen la unión de diversas entidades o restos a las unidades de nucleótidos en cualquier posición. Los términos "polinucleótido", "oligonucleótido" y "ácido nucleico" incluyen moléculas de doble cadena o de cadena sencilla así como moléculas de triple hélice. Ácido nucleico, oligonucleótido, y polinucleótido son términos más amplios que el término aptámero y, por lo tanto, los términos ácido nucleico, oligonucleótidos, y polinucleótidos incluyen polímeros de nucleótidos que son aptámeros pero los términos ácido nucleico, oligonucleótido, y polinucleótido no se limitan a los aptámeros.
[0045] Tal como se usa en el presente documento, los términos "modificar", "modificación", "modificado", y cualquier variación de los mismos, cuando se utiliza en referencia a un oligonucleótido, significa que al menos una de las cuatro bases de nucleótidos constituyentes (es decir, A, G, T/U y C) del oligonucleótido es un análogo o un éster de un nucleótido de origen natural. En algunas realizaciones, el nucleótido modificado confiere resistencia a las nucleasas al oligonucleótido. En algunas realizaciones, los nucleótidos modificados conducen a interacciones predominantemente hidrófobas de aptámeros con dianas proteicas que dan lugar a una alta eficacia de unión y complejos cocristalinos estables. Una pirimidina con una sustitución en la posición C-5 es un ejemplo de un nucleótido modificado. Las modificaciones pueden incluir modificaciones del esqueleto, metilaciones, combinaciones de emparejamiento de bases inusuales, tales como las isobases isocitidina e isoguanidina, y similares. Las modificaciones también pueden incluir modificaciones 3' y 5', tales como bloqueo. Otras modificaciones pueden incluir la sustitución de uno o más de los nucleótidos naturales por un análogo, modificaciones internucleótidos, tales como, por ejemplo, aquellos con enlaces no cargados (por ejemplo, fosfonatos de metilo, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) y aquellos con enlaces cargados (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), aquellos con intercaladores (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.), aquellos que contienen quelantes (por ejemplo, metales, metales radiactivos, boro, metales oxidantes, etc.), aquellos que contienen alquilantes, y aquellos con enlaces modificados (por ejemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.). Además, cualquiera de los grupos hidroxilo ordinariamente presentes en el azúcar de un nucleótido puede estar reemplazado por un grupo fosfonato o un grupo fosfato; puede estar protegido por grupos protectores estándar; o activados para preparar enlaces adicionales para nucleótidos adicionales, o a un soporte sólido. Los grupos OH terminales 5' y 3' se pueden fosforilar o sustituir con aminas, restos de grupos de bloqueo orgánicos de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 átomos de carbono, polímeros de polietilenglicol (PEG) en algunas realizaciones que van desde aproximadamente 10 a aproximadamente 80 kDa, polímeros PEG en algunas realizaciones que van desde aproximadamente 20 a aproximadamente 60 kDa, u otros polímeros biológicos o sintéticos hidrófilos o hidrófobos. En algunas realizaciones, las modificaciones son de la posición C-5 de las pirimidinas. Estas modificaciones pueden producirse a través de un enlace amida directamente en la posición C-5 o por otros tipos de enlaces.
[0046] Los polinucleótidos también pueden contener formas análogas de azúcares de ribosa o desoxirribosa que se conocen generalmente en la técnica, incluyendo 2'-O-metil-, 2'-O-alil, 2'-fluoro- o 2 '-azido-ribosa, análogos de azúcares carbocíclicos, azúcares alfa-anoméricos, azúcares epiméricos, tales como arabinosa, xilosas o lixosas, azúcares de piranosa, azúcares de furanosa, sedoheptulosas, análogos acíclicos y análogos de nucleósidos abásicos, tales como metil ribósido. Tal como se señaló anteriormente, pueden sustituirse uno o más enlaces fosfodiéster por grupos de enlace alternativos. Estos grupos de enlace alternativos incluyen realizaciones en las que el fosfato se sustituye por P(O)S ( "tioato"), P(S)S ("ditioato"), (O)NR2 ("amidato"), P(O)R, P(O)OR', CO o CH2 ("formacetal"), en los que cada R o R' es independientemente H o alquilo sustituido o no sustituido (1-20 C) que contiene opcionalmente un éter (-O-), arilo , alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo o araldilo. No todos los enlaces en un polinucleótido necesitan ser idénticos. La sustitución de formas análogas de azúcares, purinas y pirimidinas puede ser ventajosa en el diseño de un producto final, al igual que estructuras de cadena principal alternativa como un esqueleto de poliamida, por ejemplo.
[0047] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "nucleasa" se refiere a una enzima capaz de escindir el enlace fosfodiéster entre las subunidades de nucleótidos de un oligonucleótido. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "endonucleasa" se refiere a una enzima que escinde un enlace o enlaces fosfodiéster en un sitio interno al oligonucleótido. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "exonucleasa" se refiere a una enzima que escinde un enlace o enlaces fosfodiéster que unen los nucleótidos del extremo de un oligonucleótido. Los fluidos biológicos contienen típicamente una mezcla de endonucleasas y exonucleasas.
[0048] Tal como se usa en el presente documento, los términos "resistente a nucleasa" y "resistencia a la nucleasa" se refiere a la disminución de la capacidad de un oligonucleótido para servir como un sustrato para una endo- o exonucleasa, de manera que, cuando entra en contacto con tal enzima, el oligonucleótido no se degrada o se degrada más lentamente que un oligonucleótido compuesto de nucleótidos no modificados.
[0049] Tal como se utiliza aquí, el término "pirimidina modificada en C-5" se refiere a una pirimidina con una modificación en la posición C-5, incluyendo, pero no limitado a, los restos ilustrados en la figura. 12. Ejemplos de una pirimidina modificada en C-5 incluyen las descritas en las Patentes de Estados Unidos Nos. 5.719.273 y 5.945.527. Ejemplos de una modificación C-5 incluyen la sustitución de desoxiuridina en la posición C-5 con un sustituyente seleccionado independientemente de: bencilcarboxamida (alternativamente bencilaminocarbonilo) (Bn), naftilmetilcarboxamida (alternativamente naftilmetilaminocarbonilo) (Nap), triptaminocarboxamida (alternativamente triptaminocarbonilo) (Trp), fenetilcarboxamida (alternativamente fenetilamino carbonilo) (Pe), tiofenilmetilcarboxamida (alternativamente tiofenilmetilaminocarbonilo) (Th) e isobutilcarboxamida (alternativamente isobutilaminocarbonilo) (iBu), tal como se ilustra inmediatamente a continuación.
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[0050] Las modificaciones químicas de una pirimidina modificada con C-5 también se pueden combinar con, por separado o en cualquier combinación, las modificaciones de azúcares en la posición 2', modificaciones en aminas exocíclicas, y la sustitución de 4-tiouridina y similares.
[0051] Las pirmidinas modificadas en C-5 representativas incluyen: 5-(N-bencilcarboxamida)-2'-desoxiuridina (BndU), 5-(N-bencilcarboxamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-bencilcarboxamida)-2'-fluorouridina, 5-(N-isobutilcarboxamida)-2'-desoxiuridina (iBudU), 5-(N-isobutilcarboxamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-fenetilcarboxamida)-2'-desoxiuridina (PedU), 5-(N-tiofenilmetilcarboxamida)-2'-desoxiuridina (ThdU), 5-(N-isobutilcarboxamida)-2-'fluorouridina, 5-(N-triptaminocarboxamida)-2'-desoxiuridina (TrpdU), 5-(N-triptaminocarboxamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-triptaminocarboxamida)-2'-fluorouridina, cloruro de 5-(N-[1-(3-trimetilamonio) propil] carboxamida)-2'-desoxiuridina, 5-(N-naftilmetilcarboxamida)-2'-desoxiuridina (NapdU), 5-(N-naftilmetilcarboxamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-naftilmetilcarboxamida)-2'-fluorouridina o 5-(N-[1-(2,3-dihidroxipropil)] carboxamida)-2'-desoxiuridina).
[0052] Los nucleótidos se puede modificar ya sea antes o después de la síntesis de un oligonucleótido. Una secuencia de nucleótidos en un oligonucleótido puede interrumpirse por uno o más componentes no nucleótidos. Un oligonucleótido modificado se puede modificar adicionalmente después de la polimerización, tal como, por ejemplo, mediante conjugación con cualquier componente de marcaje adecuado.
[0053] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "al menos una pirimidina," cuando se refiere a las modificaciones de un ácido nucleico, se refiere a una, varias o todas los pirimidinas en el ácido nucleico, lo que indica que cualquiera o todas las apariciones de cualquiera o todas de C, T o U en un ácido nucleico pueden ser modificadas o no.
[0054] Tal como se usa en este documento, A, C, G, T y T indican dA, dC, dG, dU y dT respectivamente, a menos que se especifique lo contrario.
[0055] Tal como se usa en este documento, "ligando de ácido nucleico", "aptámero", y "clon" se usan indistintamente para referirse a un ácido nucleico de origen no natural que tiene una acción deseable sobre una molécula diana. Una acción deseable incluye, pero no se limita a, la unión de la diana, cambiar catalíticamente la diana, reaccionar con la diana de manera que modifica o altera la diana o la actividad funcional de la diana, la unión covalente a la diana (como en un inhibidor suicida) y facilitar la reacción entre la diana y otra molécula. En algunas realizaciones, la acción es la afinidad de unión específica para una molécula diana, siendo dicha molécula diana una estructura química tridimensional distinta de un polinucleótido que se une al ligando de ácido nucleico a través de un mecanismo que es independiente del emparejamiento de bases de Watson/Crick o la formación de una triple hélice, en el que el aptámero no es un ácido nucleico que tiene la función fisiológica conocida de unirse por la molécula diana. Los aptámeros a una diana determinada incluyen ácidos nucleicos que son identificados a partir de una mezcla de candidatos de ácidos nucleicos, donde el aptámero es un ligando de la diana, mediante un procedimiento que comprende: (a) poner en contacto la mezcla de candidatos con la diana, donde los ácidos nucleicos que tienen un aumento de la afinidad por la diana con respecto a otros ácidos nucleicos en la mezcla de candidatos se pueden separar del resto de la mezcla de candidatos; (b) separar los ácidos nucleicos de mayor afinidad del resto de la mezcla de candidatos; y (c) amplificar los ácidos nucleicos de mayor afinidad para producir una mezcla enriquecida en ligandos de ácidos nucleicos, mediante el cual se identifican los aptámeros de la molécula diana. Se reconoce que las interacciones de afinidad son una cuestión de grado; sin embargo, en este contexto, la "afinidad de unión específica" de un aptámero para su diana significa que el aptámero se une a su diana generalmente con un grado mucho mayor de afinidad del que se une a otros componentes no diana de una mezcla o de la muestra. Un "aptámero" o "ligando de ácido nucleico" es un conjunto de copias de un tipo o especie de molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos particular. Un aptámero puede incluir cualquier número adecuado de nucleótidos. "Aptámeros" se refiere a más de uno de dicho conjunto de moléculas. Aptámeros diferentes pueden tener el mismo o diferente número de nucleótidos. Los aptámeros pueden ser ADN o ARN y pueden ser de cadena sencilla, de cadena doble, o contienen regiones de cadena doble o cadena triple.
[0056] Tal como se usa en este documento, un "SOMAmer" o aptámero modificado de velocidad de disociación lenta se refiere a un aptámero (incluyendo un aptámero que comprenden al menos un nucleótido con una modificación hidrófoba) con una velocidad de disociación (ty2) de > 30 minutos, > 60 minutos, > 90 minutos, > 120 minutos, > 150 minutos, > 180 minutos, > 210 minutos o > 240 minutos. En algunas realizaciones, los SOMAmers se generan usando los procedimientos SELEX mejorados descrito en la Patente de Estados Unidos N° 7.947.447, titulada "Procedimiento para la generación de aptámeros con mejores velocidades de disociación".
[0057] Tal como se usa en el presente documento, "proteína" se usa como sinónimo de "péptido", "polipéptido", o "fragmento de péptido." Un polipéptido, proteína, péptido o fragmento de péptido "purificado" está sustancialmente libre de material celular u otras proteínas contaminantes de la célula, tejido o fuente libre de células de los que se obtiene la secuencia de aminoácidos, o sustancialmente libre de precursores químicos o de otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente.
[0058] Tal como se usa en este documento, "co-estructura cristalina" o "complejo de co-cristal" es una estructura cristalina que comprende dos o más moléculas que interactúan.
[0059] Tal como se usa en este documento, "afección o enfermedad cardiovascular" significa una afección o enfermedad relacionada con el corazón y su sistema vascular. Algunos ejemplos de tales afecciones o enfermedades son aneurisma, angina, arritmia, aterosclerosis, fibrilación auricular, insuficiencia cardíaca congestiva, cardiomiopatía, enfermedad cardíaca coronaria, restenosis, isquemia, hipertrofia ventricular izquierda, enfermedad vascular periférica, infarto de miocardio, hipertensión, enfermedad cardíaca valvular y enfermedad cardíaca restrictiva.
[0060] Tal como se usa en este documento, "fibrosis" significa una enfermedad o afección causada por la formación de una cantidad excesiva y anormal de tejido conectivo fibroso en un órgano que da lugar al engrosamiento y cicatrización del tejido conectivo, lo que conduce a un mal funcionamiento del órgano. Ejemplos de tales enfermedades y afecciones son fibrosis pulmonar, fibrosis renal, fibrosis hepática y fibrosis quística.
[0061] Tal como se usa en el presente documento, "AMD" o "degeneración macular relacionada con la edad" o "degeneración macular" significa una afección del ojo que es causada por daño a la retina y da lugar a una pérdida de la visión en el centro del campo visual, llamado mácula. La AMD se produce en las formas "húmeda" y "seca". En AMD "húmeda", los vasos sanguíneos crecen desde la coroides detrás de la retina. En AMD "seca", se acumulan restos celulares (drusas) entre la retina y la coroides. En cualquiera de las formas, la retina puede desprenderse.
[0062] Tal como se usa en el presente documento, "enfermedad oftálmica" o "afección oftálmica" o "enfermedad ocular" o "afección ocular" se refiere a cualquier enfermedad o afección que afecta o implica trastornos de neovascularización oculares, tales como la degeneración macular ("húmeda" y " seca"), retinopatía del premadurez, retinopatía diabética, glaucoma neovascular, neovascularización corneal, retinopatía diabética proliferativa (la etapa más severa de la retinopatía diabética), uveítis (una afección inflamatoria del ojo que a menudo conduce a edema macular), edema macular cistoide después de cirugía de cataratas, degeneración miópica (una afección en la que un paciente con un alto grado de miopía desarrolla neovascularización coroidea), degeneración macular inflamatoria (una afección en la que un paciente con inflamación en el área macular debido a infecciones u otras causas, desarrolla neovascularización coroidea) y la neovascularización del iris (una complicación grave de la retinopatía diabética o la oclusión venosa de la retina que implican el crecimiento de nuevos vasos saguíneos en la superficie del iris).
[0063] Tal como se usa en el presente documento, "enfermedad renal" o "afección renal" se refiere a cualquier enfermedad o afección que afecta o implica trastornos renales proliferativos, tales como glomerulonefritis, enfermedades proliferativas renales masangiales, enfermedad renal poliquística, cánceres renales, insuficiencia renal aguda, nefropatía , amiloidosis, edema, fibrosis, enfermedades glomerulares, infarto renal y nefritis.
[0064] Tal como se usa en el presente documento "cáncer" significa una enfermedad o afección que implica un crecimiento celular no regulado y anormal. Algunos ejemplos de los tipos comunes de cáncer son el cáncer de vejiga, cáncer de pulmón, cáncer de mama, melanoma, cáncer de colon y rectal, linfoma, cáncer de endometrio, cáncer de páncreas, cáncer de hígado, cáncer renal, cáncer de próstata, leucemia y cáncer de tiroides.
[0065] Tal como se usa en este documento, "modular" significa alterar, ya sea aumentando o disminuyendo, el nivel de un péptido o polipéptido, o alterar, ya sea aumentando o disminuyendo, la estabilidad o la actividad de un péptido o un polipéptido. El término "inhibir" significa disminuir el nivel de un péptido o un polipéptido o disminuir la estabilidad o actividad de un péptido o un polipéptido. Tal como se describe en el presente documento, la proteína que se modula o inhibe es PDGF.
[0066] Tal como se usa en este documento, el término "bioactividad" indica un efecto sobre uno o más procesos celulares o extracelulares (por ejemplo, mediante la unión, señalización, etc.) que puede afectar a procesos fisiológicos o fisiopatológicos.
[0067] Tal como se usa en el presente documento, los términos "factor de crecimiento derivado de plaquetas" y "PDGF" se refieren a las isoformas de PDGF A, B, C, y D y sus homo o heterodímeros AA, BB, AB, CC y DD. En algunos casos, el contexto determinará qué isoforma y/o heterodímero de PDGF se entiende. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los aptámeros de PDGF descritos en este documento se unen a la isoforma PDGF-B y homodímeros y heterodímeros que comprenden esa isoforma, aunque los aptámeros pueden ser descritos como la unión a PDGF. Específicamente incluidos en la definición son las isoformas AA, AB y BB de PDGF humanas naturales y sus variantes. Tal como se usa en el presente documento, PDGF incluye todas las especies de mamíferos de PDGF, incluyendo humano, canino, felino, murino, primate, equino y bovino. Un precursor de isoforma PDGF-B humano de ejemplo no limitante tiene la secuencia mostrada en Swiss-Prot N° de acceso P01127.1. Proteínas maduras de isoforma PDGF-B humanas de ejemplo no limitantes pueden tener la secuencia de aminoácidos 82 a 241 ó 82 a 190 de Swiss-Prot N° de acceso P01127.1 (denominado en este documento como los aminoácidos 1 a 160 o 1 a 109 de PDGF B).
[0068] Tal como se usa en el presente documento, "receptor de PDGF" se refiere a un receptor que se une por y es activado por PDGF, tal como receptor a de PDGF y receptor p de PDGF. Los receptores de PDGF incluyen los receptores de cualquier especie de mamífero, incluyendo, pero no limitado a, humano, canino, felino, murino, equino, primate y bovino. Un precursor de PDGFRb humano de ejemplo no limitante tiene la secuencia mostrada en Swiss-Prot N° de acceso P09619.1. Una proteína madura de PDGFRb humana de ejemplo no limitante tiene la secuencia de aminoácidos 33 a 1106 de Swiss-Prot N° de acceso P09619.1. Un precursor de PDGFRa humano de ejemplo no limitante tiene la secuencia mostrada en Swiss-Prot N° de acceso P16234.1. Una proteína madura de PDGFRa humana de ejemplo no limitante tiene la secuencia de aminoácidos 24 a 1089 de Swiss-Prot N° de acceso P16234.1.
[0069] Un "aptámero de PDGF" es un aptámero que es capaz de unirse a y modificar la actividad de PDGF. En algunas realizaciones, un aptámero de PDGF inhibe la actividad de PDGF in vitro. En algunas realizaciones, un aptámero de PDGF inhibe la actividad de PDGF in vivo. Una actividad de ejemplo no limitante de PDGF es la fosforilación mediada por PDGF del receptor de PDGF, tal como receptor a de PDGF (PDGF Ra ) o receptor b de PDGF (PDGF Rp).
[0070] En algunas realizaciones, el "aptámero de VEGF" como se define en el presente documento es un monómero, dímero o una construcción de multímero, opcionalmente conectados por un enlazador.
[0071] Tal como se usa en el presente documento, los términos "factor de crecimiento endotelial vascular", y "VEGF" se refieren a VEGF natural, incluyendo isoformas y variantes, tales como VEGF-121, VEGF-145, VEGF-165, VEGF-183, VEGF-189, y VEGF-206. Tal como se usa en el presente documento, VEGF incluye todas las especies de mamíferos de VEGF, incluyendo humano, canino, felino, murino, primate, equino y bovino. Un precursor de VEGF humano de ejemplo no limitante tiene la secuencia mostrada en Swiss-Prot N° de acceso P15692.2. VEGF-121 se describe, por ejemplo, en Tee et al. (2001) Biochem. J. 359: 219; Bornes et al. (2004) J. Biol. Chem. 279: 18717.
[0072] Tal como se usa en el presente documento, "receptor de VEGF" se refiere a un receptor que se une por y es activa por VEGF, tal como VEGFR-1 y VEGFR-2. Los receptores de VEGF incluyen los receptores de cualquier especie de mamífero, incluyendo, pero no limitado a, humano, canino, felino, murino, equino, primate y bovino. Un precursor de VEGFR-1 humano de ejemplo no limitante tiene la secuencia mostrada en Swiss-Prot N° de acceso P17948.2. Una proteína madura de VEGFR-1 humana de ejemplo no limitante tiene la secuencia de aminoácidos 27 a 1338 de Swiss-Prot N° de acceso P17948.2. Un precursor de VEGFR-2 humano de ejemplo no limitante tiene la secuencia mostrada en Swiss-Prot N° de acceso P35968.2. Una proteína madura de VEGFR-2 de ejemplo no limitante tiene la secuencia de los aminoácidos 20 a 1356 Swiss-Prot N° de acceso P35968.2.
[0073] Un "aptámero de VEGF" es un aptámero que es capaz de unirse a y modificar la actividad de VEGF. En algunas realizaciones, un aptámero de VEGF inhibe la actividad de VEGF in vitro. En algunas realizaciones, un aptámero d VEGF inhibe la actividad de VEGF in vivo. Actividades de ejemplo no limitantes de VEGF incluyen la fosforilación mediada por VEGF del receptor de VEGF, tal como VEGFR-1 o VEGFR-2. En algunas realizaciones, se proporciona un aptámero de VEGF que compite por la unión a VEGF-121 con el aptámero 4867-31_183.
[0074] En algunas realizaciones, el "aptámero de VEGF" como se define en el presente documento es un monómero, dímero o una construcción de multímero, opcionalmente conectados por un enlazador.
[0075] Los términos "construcción de aptámeros de PDGF/VEGF" y " construcción de aptámeros de VEGF/PDGF" se utilizan indistintamente para referirse a una construcción que comprende un aptámero de PDGF y un aptámero VEGF. El orden de las palabras "PDGF" y "VEGF" en "la construcción de aptámeros de PDGF/VEGF" y "la construcción de aptámeros de VEGF/PDGF" no es indicativo de cómo están unidos los aptámeros, por ejemplo, el orden no indica qué aptámero se encuentra en la posición más 5' de una construcción de aptámero y qué aptámero se encuentra en la posición más 3' en la construcción de aptámeros. En algunas realizaciones, una construcción de aptámero de PDGF/VEGF es capaz de unirse a PDGF y VEGF de forma simultánea. En algunas realizaciones, una construcción de aptámero de PDGF/VEGF n PDGF es capaz de unirse a cada uno de PDGF y VEGF por separado. En una construcción de aptámero de PDGF/VEGF, el aptámero de PDGF y el aptámero VEGF pueden estar unidos de forma covalente o no covalente, por ejemplo, a través de una pareja de unión, tal como estreptavidina y biotina. Una construcción de aptámero de PDGf/VEGF puede comprender un enlazador entre el aptámero de PDGF y el aptámero de VEGF.
[0076] Tal como se usa en el presente documento, "enfermedad o afección mediada por PDGF" se refiere a enfermedades o afecciones en las que la actividad de PDGF puede directa o indirectamente conducir a la enfermedad o afección. Las enfermedades o afecciones mediadas por PDGF de ejemplo no limitativas incluyen enfermedades cardiovasculares, tales como aterosclerosis, restenosis, afecciones relacionadas con la hipertrofia cardíaca, y trastornos vasculares; enfermedades oftálmicas tales como degeneración macular; fibrosis; y cánceres.
[0077] Tal como se usa en el presente documento, "enfermedad o afección mediada por VEGF" se refiere a enfermedades o afecciones en las que la actividad de VEGF puede directa o indirectamente conducir a la enfermedad o afección. Las enfermedades o afecciones mediadas por VEGF de ejemplo no limitativas incluyen enfermedades cardiovasculares, enfermedades autoinmunes, enfermedades reumáticas inflamatorias, enfermedades oftálmicas, y cánceres en diversas etapas en el proceso de la enfermedad. Ejemplos no limitativos de las enfermedades cardiovasculares son la aterosclerosis, restenosis, afecciones relacionadas con la hipertrofia cardíaca, y trastornos vasculares. Ejemplos no limitantes de enfermedades oftálmicas son retinitis, degeneración macular, coroiditis, retinopatía, edema, glaucoma y cataratas.
[0078] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por una agencia reguladora de un gobierno federal o estatal o listado en la Farmacopea de Estados Unidos u otra farmacopea reconocida generalmente para uso en animales y, más particularmente, en seres humanos. El término "portador" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el que se administra el tratamiento terapéutico e incluye, pero no está limitado a, líquidos estériles, tales como agua y aceites.
[0079] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "sal farmacéuticamente aceptable" o "sal" de un aptámero de PDGF, aptámero VEGf o una construcción de aptámeros de PDGF/VEGF es un producto del compuesto divulgado que contiene un enlace iónico y se produce típicamente mediante la reacción del compuesto divulgado con un ácido o una base, adecuada para administrar a un individuo. Una sal farmacéuticamente aceptable puede incluir, pero no se limitan a, sales de adición de ácido, incluyendo clorhidratos, bromhidratos, fosfatos, sulfatos, hidrogenosulfatos, alquilsulfonatos, arilsulfonatos, arilalquilsulfonatos, acetatos, benzoatos, citratos, maleatos, fumaratos, succinatos, lactatos, y tartratos; cationes de metales alcalinos, tales como Li, Na, K, sales de metales alcalinos, tales como sales de Mg, Ca o aminas orgánicas.
[0080] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "composición farmacéutica" es una formulación que comprende un aptámero de PDGF, un aptámero VEGF o una construcción de aptámeros de PDGF/VEGF en una forma adecuada para la administración a un individuo. Una composición farmacéutica se formula típicamente para que sea compatible con su vía de administración prevista. Los ejemplos de vías de administración incluyen, pero no se limitan a, oral y parenteral, por ejemplo, intravenosa, intradérmica, subcutánea, por inhalación, tópica, transdérmica, transmucosal y rectal.
[0081] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "cantidad terapéuticamente eficaz" significa generalmente la cantidad necesaria para mejorar al menos un síntoma de un trastorno o afección a prevenir, reducir o tratar, tal como se describe en el presente documento. La frase "cantidad terapéuticamente eficaz", tal como se relaciona con los aptámeros de PDGF, aptámeros de VEGF, o construcciones de aptámeros de PDGF/VEGF de la presente descripción significa la dosis de aptámero que proporciona la respuesta farmacológica específica para la que se administra el aptámero en un número significativo de individuos en necesidad de tal tratamiento. Se destaca que una cantidad terapéuticamente eficaz de un aptámero que se administra a un individuo en particular en un caso particular no siempre será efectiva en el tratamiento de las afecciones/enfermedades aquí descritas, a pesar de que tales dosis se considera que son una cantidad terapéuticamente efectiva por aquellos expertos en la técnica.
[0082] Los términos "SELEX" y "proceso SELEX" se usan indistintamente en este documento para referirse en general a una combinación de (1) la selección de ácidos nucleicos que interactúan con una molécula diana de una manera deseable, por ejemplo mediante la unión con alta afinidad a una proteína, con (2) la amplificación de los ácidos nucleicos seleccionados. El proceso SELEX se puede utilizar para identificar aptámeros con alta afinidad a una molécula diana específica.
[0083] SELEX incluye generalmente la preparación de una mezcla de candidatos de ácidos nucleicos, la unión de la mezcla de candidatos a la molécula diana deseada para formar un complejo de afinidad, separación de los complejos de afinidad de los ácidos nucleicos candidatos no unidos, separación y aislamiento del ácido nucleico del complejo de afinidad, purificación del ácido nucleico e identificación de una secuencia de aptámero específica. El proceso puede incluir múltiples rondas para refinar la afinidad del aptámero seleccionado. El proceso puede incluir etapas de amplificación en uno o más puntos en el proceso. Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 5.475.096, titulada "Ligandos de ácido nucleico." El proceso SELEX se puede utilizar para generar un aptámero que se une covalentemente a su diana, así como un aptámero que se une no covalentemente a su diana. Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 5.705.337 titulada "Evolución Sistemática de Ligandos de Ácido Nucleico mediante Enriquecimiento Exponencial: Chemi-SELEX."
[0084] El proceso SELEX se puede utilizar para identificar aptámeros de alta afinidad que contienen nucleótidos modificados que confieren características mejoradas en el aptámero, como, por ejemplo, estabilidad in vivo mejorada o características de liberación mejoradas. Ejemplos de tales modificaciones incluyen sustituciones químicas en la ribosa y/o fosfato y/o posiciones de base. Los aptámeros identificados mediante proceso SELEX que contienen nucleótidos modificados se describen en la Patente de Estados Unidos N° 5.660.985, titulada "Ligandos de ácido nucleico de alta afinidad que contienen nucleótidos modificados", que describe oligonucleótidos que contienen derivados de nucleótidos modificados químicamente en las posiciones C5 y/o 2' de las pirimidinas. La patente de Estados Unidos N° 5.580.737, véase supra, describe aptámeros altamente específicos que contienen uno o más nucleótidos modificados con 2'-amino (2'-NFh), 2'-fluoro (2'-F) y/o 2'-O metil (2'-OMe). Véase también, la Publicación de Patente de Estados Unidos N° 20090098549, titulada "SELEX y PHOTOs El EX", que describe bibliotecas de ácido nucleico que tienen propiedades físicas y químicas expandidas y su uso en SELEX y photoSELEX.
[0085] SELEX también se puede utilizar para identificar aptámeros que tienen características deseables de la velocidad de disociación. Véase la patente de Estados Unidos No.7,947,447, "Procedimiento para la generación de aptámeros con mejores velocidades de disoaciación", que describe procedimientos mejorados de SELEX para la generación de aptámeros que pueden unirse a moléculas diana. Se describen procedimientos para la producción de aptámeros y fotoaptámeros que tienen velocidades de disociación más lentas de sus respectivas moléculas diana. Los procedimientos implican poner en contacto la mezcla candidata con la molécula diana, lo que permite que tenga lugar la formación de complejos ácido nucleico-diana, y la realización de un proceso de enriquecimiento con una velocidad de disociación lenta en la que los complejos ácido nucleico-diana con velocidades de disociación rápida se disocian y no se vuelven a formar, mientras que complejos con velocidades de disociación lentas permanecen intactos. Además, los procedimientos incluyen el uso de nucleótidos modificados en la producción de mezclas de ácidos nucleicos candidatos para generar aptámeros con una acción de la velocidad de disociación mejorada (véase la Publicación de Patente N° 2009/0098549, titulada "SELEX y PhotoSELEX"). (Véase también la Patente de Estados Unidos N° 7.855.054 y la publicación de patente de Estados Unidos No. 2007/0166740).
[0086] En algunas realizaciones, se proporcionan procedimientos de selección de aptámeros que se unen a una molécula diana, que comprende: (a) preparar una mezcla de candidatos de ácidos nucleicos, en el que la mezcla de candidatos comprende ácidos nucleicos modificados en los que al menos una pirimidina en al menos uno, o en cada uno, de los ácidos nucleicos de la mezcla de candidatos está modificado químicamente en la posición C5; (b) poner en contacto la mezcla de candidatos con una molécula diana, en el que los ácidos nucleicos que tienen una mayor afinidad a la molécula diana con respecto a otros ácidos nucleicos en la mezcla de candidatos se unen a la molécula diana, formando complejos de moléculas de ácido nucleico-diana; (c) separar los ácidos nucleicos de mayor afinidad del resto de la mezcla de candidatos; y (d) amplificar los ácidos nucleicos de mayor afinidad para producir una mezcla de ácidos nucleicos enriquecidos en secuencias de ácidos nucleicos que son capaces de unirse a la molécula diana con una mayor afinidad, mediante el cual se identifica un aptámero para la molécula diana. En ciertas realizaciones, el procedimiento incluye además la realización de un proceso de enriquecimiento con una velocidad de disociación lenta.
[0087] "Target" o "molécula diana" o "diana" se refiere en el presente documento a cualquier compuesto sobre el que un ácido nucleico puede actuar de una manera deseable. Una molécula diana puede ser una proteína, péptido, ácido nucleico, carbohidrato, lípido, polisacárido, glicoproteína, hormona, receptor, antígeno, anticuerpo, virus, patógeno, sustancia tóxica, sustrato, metabolito, análogo de estado de transición, cofactor, inhibidor, fármaco, colorante, nutriente, factor de crecimiento, célula, tejido, cualquier porción o fragmento de cualquiera de los anteriores, etc., sin limitación. Prácticamente cualquier efector químico o biológico puede ser una diana adecuada. Las moléculas de cualquier tamaño pueden servir como dianas. Una diana también se puede modificar de determinadas maneras para mejorar la probabilidad o la fuerza de una interacción entre la diana y el ácido nucleico. Una diana también puede incluir cualquier variación menor de un compuesto o molécula particular, tal como, en el caso de una proteína, por ejemplo, variaciones menores en la secuencia de aminoácidos, formación de enlaces disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación, o cualquier otra manipulación o modificación, tal como conjugación con un componente marcador, que no altera sustancialmente la identidad de la molécula. Una "molécula diana" o "diana" es un conjunto de copias de un tipo o especies de molécula o estructura multimolecular que es capaz de unirse a un aptámero. "Las moléculas diana" o "dianas" se refieren a más de uno de dichos conjuntos de moléculas. Las realizaciones del proceso SELEX en el que la diana es un péptido se describen en la patente de Estados Unidos N° 6.376.190, titulada "Procesos SELEX modificados sin proteína purificada."
APTÁMEROS DE PDGF DE EJEMPLO
[0088] Se identificaron los aptámeros de PDGF de la presente descripción usando el procedimiento SELEX mejorado para identificar aptámeros que tienen velocidades de disociación lentas, tal como se describe en el Ejemplo 1, que describe un procedimiento representativo para la selección y producción de un aptámero que se une a PDGF con una velocidad de disociación lenta. Se utilizó una biblioteca de ADN al azar compuesta de bencil-dU (Bn-dU), dA, dC y dG para la selección. Usando este procedimiento, se identificó el aptámero de ADN a PDGF-BB designado como aptámero 4149-8_1 (SEQ ID NO: 1).
[0089] Usando el aptámero 4149-8_1 (SEQ ID NO: 1), se realizaron estudios para identificar la longitud de secuencia mínima requerida para mantener una fuerte afinidad por PDGF. El truncamiento sistemático desde los extremos 5' y 3' condujo a la identificación de un motivo central que consiste en 29 nucleótidos (4149-8_38; SEQ ID NO. 38). El aptámero 4149-8_38 mostró la unión con alta afinidad a PDGF-BB (valor de Kd de 20 pM.; la figura 6).
[0090] Se llevaron a cabo estudios adicionales de secuenciación sobre grupos de secuencias de las que se seleccionó el aptámero 4149-8_1 (SEQ ID NO: 1). La secuenciación 454, que es un procedimiento de alto rendimiento a gran escala que utiliza pirosecuenciación paralela, proporciona una preparación de muestras imparcial y análisis de secuencia muy precisa. Se utilizaron los datos de secuenciación de datos para identificar una secuencia de consenso para un aptámero de PDGF, tal como se muestra en la figura. 3. Además, los estudios de sustitución de nucleótidos ilustrados en la figura 6 condujeron al descubrimiento de que seis de ocho posiciones BndU en la secuencia de consenso eran deseables para la unión de PDGF, pero cuatro posiciones de BndU podrían ser reemplazados por dT con poca o ninguna pérdida de actividad de unión. Una secuencia de consenso se muestra en la figura 3A, junto con una representación gráfica de la frecuencia de nucleótidos en cada posición en relación con el aptámero 4149-8_1 (SEQ ID NO: 1).
[0091] En algunas realizaciones, un aptámero de PDGF comprende la secuencia:
5'-NZVSLnS'V'ZACNNmGCGZZZAZAGCG-3' (SEQ ID NO: 500),
en donde
V se selecciona de A, C o G;
V' se selecciona de C, G o Z, en la que V' es complementaria a V;
S y S' se seleccionan independientemente de C o G, en la que S y S' son complementarias entre sí;
cada N se selecciona independientemente de cualquier nucleótido natural o modificado;
cada Z se selecciona independientemente de una pirimidina modificada;
L se selecciona de cualquier nucleótido natural o modificado, un enlazador de hidrocarburo, un enlazador de polietilenglicol o una combinación de los mismos;
n es de 0 a 20; y m es de 0 a 20; y en la que se incluyen opcionalmente una o más inserciones de nucleótidos.
[0092] En algunas realizaciones, un aptámero de PDGF comprende la secuencia: 5'-ZZVSLnS'V'ZACNNmGCGZZZAZAGCG-3' (SEQ ID NO: 501), donde V, V', N, S, S', Z, L, n, y m son como se definen anteriormente.
[0093] En algunas realizaciones, un aptámero de PDGF comprende la secuencia: 5'-ZZVCLnGV'ZACNMGCGZZZAZAGCG-3' (SEQ ID NO: 502),
en la que Z, V, V', N, Z, L, y n son son como se han definido anteriormente y M se selecciona de entre C y A.
[0094] En algunas realizaciones, un aptámero de PDGF comprende la secuencia: 5'-ZZACLnGZZACACGCGZZZAZAGCG-3' (SEQ ID NO: 503), donde Z, L, y n son como se han definido anteriormente.
[0095] En algunas realizaciones, un aptámero de PDGF comprende la secuencia: 5'-ZZACGACZACGZZACACGCGZZZAZAGCG-3' (SEQ ID NO: 504), donde Z es como se ha definido anteriormente.
[0096] En algunas realizaciones, un aptámero de PDGF comprende la secuencia: 5'-ZVSLnS'V'ZACNNmGCGZZZAZAG-3' (SEQ ID NO: 507),
en donde
V se selecciona de A, C o G;
V' se selecciona de C, G o Z, en la que V' es complementaria a V;
S y S' se seleccionan independientemente de C o G, en la que S y S' son complementarias entre sí;
cada N se selecciona independientemente de nucleótido modificado o sin modificar;
cada Z se selecciona independientemente de una pirimidina modificada;
L se selecciona de un enlazador C2-C20 sustituido o no sustituido y un nucleótido modificado o sin modificar;
n es de 1 a 50; y m es de 0 a 50; y
en la que se incluyen opcionalmente una o más inserciones de nucleótidos.
[0097] En algunas realizaciones, un aptámero de PDGF comprende la secuencia: 5'-Z'ZVSLnS'V'ZACNNmGCGZZZAZAGC-3' (SEQ ID NO: 508), donde Z' es una pirimidina modificada o dT; y V, V', N, S, S', Z, L, n, y m son como se han definido anteriormente.
[0098] En algunas realizaciones, un aptámero de PDGF comprende la secuencia: 5'-Z'ZVCLnGV'ZACNMGCGZZZAZAGC-3' (SEQ ID NO: 509),
donde Z, Z', V, V', N, Z, L, y n son como se han definido anteriormente y M se selecciona entre C y A.
[0099] En algunas realizaciones, un aptámero de PDGF comprende la secuencia: 5'-Z'ZACLnGZZACACGCGZZZAZAGC-3' (SEQ ID NO: 510), donde Z, Z', L, y n son como se han dedinido anteriormente.
[0100] En algunas realizaciones, un aptámero de PDGF comprende la secuencia: 5'-Z'ZACGACZACGZZACACGCGZZZAZAGC-3' (SEQ ID NO: 511), donde Z y Z' son como se han definido anteriormente.
[0101] En algunas realizaciones, un aptámero de PDGF comprende la secuencia:
5'-ZABLpGYZABKqGCGZZYDYAG-3' (SEQ ID NO: 505)
en la que cada Z es, independientemente, una pirimidina modificada;
cada B se selecciona independientemente de C y un enlazador C2-C10 sustituido o no sustituido;
cada L se selecciona independientemente de un enlazador C2-C10 sustituido o no sustituido, un enlazador de hexaetilenglicol, y un nucleótido modificado o no modificado, en el que p es de 1 a 10; cada Y se selecciona independientemente de una pirimidina modificada o sin modificar;
cada K se selecciona independientemente de un enlazador C2-C10 sustituido o no sustituido, un enlazador de hexaetilenglicol, y un nucleótido modificado o no modificado, en el que q es de 1 a 5; y D se selecciona de A y un enlazador C2-C10 sustituido o no sustituido.
[0102] En algunas realizaciones, un aptámero de PDGF comprende la secuencia:
5'-XZABLnGYZABLnGCGZZYDYAGBE-3' (SEQ ID NO: 506),
en la que X se selecciona de una pirimidina modificada o no modificada y un enlazador C2-C10 sustituido o no sustituido, o está ausente; y E se selecciona entre G y enlazador C2-C10 sustituido o no sustituido, o está ausente.
[0103] Una construcción de aptámero que comprende las secuencias NZVS (SEQ ID NO 761) y S'V'ZACNNmGCGZZZAZAGCG (SEQ ID NO: 762),
en las que
V se selecciona de A, C o G; V' se selecciona de C, G o Z, en el que V' se selecciona de C, G o Z, en el que V' es complementaria a V;
S y S' se seleccionan independientemente de C o G, en el que S y S' son complementarias entre sí;
N se selecciona independientemente de cualquier nucleótido natural o modificado;
Z se selecciona independientemente de una pirimidina modificada;
m es de 1 a 20; y
en el que una o más inserciones de nucleótidos se incluyen opcionalmente.
[0104] En algunas realizaciones, Z es una uridina modificada. En algunas realizaciones, cada Z se selecciona independientemente de las pirimidinas modificadas en C-5 como se definen en el presente documneto. En algunas realizaciones, cada Z se selecciona independientemente de
5-(N-bencilcarboxamida)-2'-desoxiuridina (BndU),
5-(N-bencilcarboxamida)-2'-O-metiluridina,
5-(N-bencilcarboxamida)-2'-fluorouridina,
5-(N-fenetilcarboxamida)-2'-desoxiuridina (Pedu),
5-(N-tiofenilmetilcarboxamida)-2'-desoxiuridina (THDU),
5-(N-isobutilcarboxamida)-2'-desoxiuridina (iBudU),
5-(N-tirosilcarboxamida)-2'-desoxiuridina (TyrdU),
5-(N-3,4-metilendioxibencilcarboxamida)-2'-desoxiuridina (MBndU),
5-(N-4-fluorobencilcarboxamida)-2'-dseoxiuridina (FBndU),
5-(N-3-fenilpropilcarboxamida)-2'-desoxiuridina (PPdU),
5-(N-imidizoliletilcarboxamida)-2'-desoxiuridina (ImdU),
5-(N-isobutilcarboxamida)-2' -O-metiluridina,
5-(N-isobutilcarboxamida)-2'-fluorouridina,
5-(N-triptaminocarboxamida)-2'-desoxiuridina (TrpdU),
5-(N-R-treoninilcarboxamida)-2'-desoxiuridina (ThrdU),
5-(N-triptaminocarboxamida)-2'-O-metiluridina,
5-(N-triptaminocarboxamida)-2'-fluorouridina,
Cloruro de 5-(N-[1-(3-trimetilamonio)propil] carboxamida)-2'-desoxiuridina,
5-(N-naftilmetilcarboxamida)-2'-desoxiuridina (NapdU),
5-(N-naftilmetilcarboxamida)-2'-O-metiluridina,
5-(N-naftilmetilcarboxamida)-2'-fluorouridina,
5-(N-[1 -(2,3-dihidroxipropil)] carboxamida)-2'-desoxiuridina),
5-(N-2-naftilmetilcarboxamida)-2'-desoxiuridina (2NapdU),
5-(N-2-naftilmetilcarboxamida)-2'-O-metiluridina,
5-(N-2-naftilmetilcarboxamida)-2'-fluorouridina,
5-(N-1-naftiletilcarboxamida)-2'-desoxiuridina (NEdU),
5-(N-1-naftiletilcarboxamida)-2'-O-metiluridina,
5-(N-1-naftiletilcarboxamida)-2'-fluorouridina,
5-(N-2-naftiletilcarboxamida)-2'-desoxiuridina (2NEdU),
5-(N-2-naftiletilcarboxamida)-2'-O-metiluridina,
5-(N-2-naftiletilcarboxamida)-2'-fluorouridina,
5-(N-3-benzofuraniletilcarboxamida)-2'-desoxiuridina (BFdU),
5-(N-3-benzofuraniletilcarboxamida)-2'-O-metiluridina,
5-(N-3-benzofuraniletilcarboxamida)-2'-fluorouridina,
5-(N-3-benzotiofeniletilcarboxamida)-2'-desoxiuridina (BTdU),
5-(N-3-benzotiofeniletilcarboxamida)-2'-O-metiluridina, y
5-(N-3-benzotiofeniletilcarboxamida)-2'-fluorouridina.
[0105] En ciertas realizaciones, las porciones del aptámero (Y) de PDGF y/o VEGF pueden no ser necesarias para mantener la unión y ciertas porciones del aptámero de PDGF y/o VEGF pueden ser modificadas, incluyendo, pero no limitado a, reemplazo con un separador o resto enlazador. En estas realizaciones, por ejemplo, Y puede ser representada como Y'-QY"-Q'-Y"', en donde Y', Y" e Y"" son partes de un aptámero de PDGF y/o VEGF o segmentos de diferentes aptámeros de PDGF y/o VEGF y Q y/o Q' son separadores o moléculas enlazadoras que modifican ciertas características de ácido nucleico del aptámero de PDGF y/o VEGF original. Cuando Q y Q' no están presentes, Y', Y", e Y"' representan un aptámero (Y) de PDGF y/o VEGF contiguo.
[0106] Tal como se usa en el presente documento, un "enlazador" es una entidad molecular que conecta dos o más entidades moleculares a través de enlace covalente o interacciones no covalentes y puede permitir la separación espacial de las entidades moleculares de manera que conserva las propiedades funcionales de una o más de las entidades moleculares. Un enlazador también puede ser conocido como un separador. Las secuencias enlazadoras apropiadas serán fácilmente determinadas por los expertos en la técnica basándose en la presente descripción.
[0107] Tal como se usa en este documento, un enlazador puede comprender una o más moléculas o subcomponentes, seleccionados de entre el grupo que incluye, pero no limitado a, un polinucleótido, un polipéptido, un ácido nucleico de péptido, un ácido nucleico bloqueado, un oligosacárido, un polisacárido, un anticuerpo, un “affybody”, un mimético de anticuerpo, una molécula de carbono alifática, aromática o heteroaromática, una molécula de polietilenglicol (PEG), un receptor celular, un ligando, un lípido, cualquier fragmento o derivado de estas estructuras, cualquier combinación de los anteriores, o cualquier otra estructura o componente químico.
[0108] En algunas realizaciones, al menos una L es un enlazador de polietilenglicol. En algunas realizaciones, al menos un L es un enlazador de hexaetilenglicol. En algunas realizaciones, L es un enlazador C2-C10 sustituido o no sustituido. En algunas realizaciones, p es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8. En algunas realizaciones, p es 1, 2 ó 3. En algunas realizaciones, al menos una K es un enlazador de polietilenglicol. En algunas realizaciones, al menos una K es un enlazador de hexaetilenglicol. En algunas realizaciones, K es un enlazador C2-C10 sustituido o no sustituido. En algunas realizaciones, q es 1 o 2. En algunas realizaciones, q es 1.
[0109] En diversas realizaciones, m puede ser de 0 a 20, de 0 a 19, de 0 a 18, de 0 a 17, de 0 a 16, de 0 a 15, de 0 a 15, de 0 a 14, de 0 a 13, de 0 a 12, de 0 a 11, de 0 a 10, de 0 a 9, de 0 a 8, de 0 a 7, de 0 a 6, de 0 a 5, de 0 a 4, o de 0 a 3.
[0110] En algunas realizaciones, L puede ser un enlazador tal como un enlazador de hexaetilenglicol de 18 átomos. En algunas realizaciones, L puede ser una combinación de nucleótidos y un enlazador. Como un ejemplo no limitativo, los siguientes aptámeros (SEQ ID NOs 67 y 69) incluyen un enlazador de hexaetilenglicol (Heg):
(SEQ ID NO. 67) 5'-Bn-Bn-A-C-Heg-G-Bn-Bn-A-C-A-C-G-C-G-Bn-Bn-Bn-A-Bn-A-G-C-G-3'
(SEQ ID NO. 69) 5'-Bn-Bn-A-C-G-Heg-C-G-Bn-Bn-A-C-A-C-G-C-G-Bn-Bn-Bn-A-Bn-A-G-C-G-3'
en la que Bn es bencil-dU y Heg es un enlazador de hexaetilenglicol.
[0111] En algunas realizaciones, N puede ser reemplazado por un enlazador, tal como en los siguientes aptámeros: (SEQ ID NO. 329) 5'-Bn-Bn-A-C-Heg-G-Bn-Bn-A-C-C3-G-C-G-Bn-Bn-Bn-A-Bn-A-G-C-3'
(SEQ ID NO. 408 ) 5'-Bn-Bn-A-C-Heg-G-Bn-Bn-A-C-C3-C-G-Bn-Bn-Bn-A-Bn-AG-3' en la que Bn es bencil-dU, Heg es un enlazador de hexaetilenglicol y C3 es un enlazador de tres carbonos.
[0112] Se identificaron otros aptámeros de PDGF utilizando el procedimiento SELEX mejorado para identificar aptámeros que tienen velocidades de disociación lentas, tal como se describe en el Ejemplo 5, que describe un procedimiento representativo para la selección y producción de un aptámero que se une a PDGF con una velocidad de disociación lenta. Se usó una biblioteca de ADN al azar compuesta por naftil-dU (Nap-dU), dA, dC y dG para la selección. El aptámero de PDGF 5169-4_26 fue identificado en la cribado.
[0113] En algunas realizaciones, se proporciona un aptámero que se une específicamente a PDGF, en el que el aptámero compite por la unión a PDGF con el aptámero de PDGF 5169-4_26. En algunas de dichas realizaciones, el aptámero comprende al menos un nucleósido modificado que comprende una modificación de nucleobase hidrófoba. Además, en algunas de tales realizaciones, la modificación de nucleobase hidrófoba es una pirimidina modificada. En algunas realizaciones, cada pirimidina modificada puede seleccionarse independientemente de 5-(N-bencilcarboxamida)-2'-desoxiuridina (BndU), 5-(N-bencilcarboxamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-bencilcarboxamida)-2'-fluorouridina, 5-(N-fenetilcarboxamida)-2'-desoxiuridina (PedU), 5-(N-tiofenilmetilcarboxamida)-2'-desoxiuridina (ThdU), 5-(N-isobutilcarboxamida)-2'-desoxiuridina (iBudU), 5-(N-isobutilcarboxamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-isobutilcarboxamida)-2'-fluorouridina, 5-(N-triptaminocarboxamida)-2'-desoxiuridina (TrpdU), 5-(N-triptaminocarboxamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-triptaminocarboxamida)-2'-fluorouridina, cloruro de 5-(N-[1-(3-trimetilamonio)propil]carboxamida) 2'-desoxiuridina, 5-(N-naftilmetilcarboxamida)-2'-desoxiuridina (NapdU), 5-(N-naftilmetilcarboxamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-naftilmetilcarboxamida)-2'-fluorouridina, y 5-(N-[1-(2,3-dihidroxipropil)] carboxamida)-2'-desoxiuridina).
[0114] En algunas realizaciones, se proporciona un aptámero que se une específicamente a PDGF, en el que el aptámero comprende la secuencia:
5'-ACALnZGZAZGLmZLZ-3'; (SEQ ID N° 512).
en el que cada Z es, independientemente, una pirimidina modificada; cada L se selecciona independientemente de un enlazador C2-C50 sustituido o no sustituido, un enlazador de polietilenglicol, y un nucleótido modificado o no modificado; n es de 1 a 5; y m es de 1 a 10.
[0115] En algunas realizaciones, cada uno se selecciona independientemente de 5-(N-bencilcarboxamida)-2'-desoxiuridina (BndU), 5-(N-bencilcarboxamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-bencilcarboxamida)-2'-fluorouridina, 5-(N-fenetilcarboxamida)-2'-desoxiuridina (PedU), 5-(N-tiofenilmetilcarboxamida)-2'-desoxiuridina (ThdU), 5-(N-isobutilcarboxamida)-2'-desoxiuridina (iBudU), 5-(N-isobutilcarboxamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-isobutilcarboxamida)-2'-fluorouridina, 5-(N-triptaminocarboxamida)-2'-desoxiuridina (TrpdU), 5-(N-triptaminocarboxamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-triptaminocarboxamida)-2'-fluorouridina, cloruro de 5-(N-[1-(3-trimetilamonio)propil]carboxamida) 2'-desoxiuridina, 5-(N-naftilmetilcarboxamida)-2'-desoxiuridina (NapdU), 5-(N-naftilmetilcarboxamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-naftilmetilcarboxamida)-2'-fluorouridina y 5-(N-[1-(2,3-dihidroxipropil)] carboxamida)-2'-desoxiuridina). En algunas realizaciones, al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, o cada Z es 5-(N-naftilmetilcarboxamida)-2'-desoxiuridina (NapdU). En algunas realizaciones, n es 1, 2, 3, 4, ó 5. En algunas realizaciones, m es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10. En algunas realizaciones, n es 3. En algunas realizaciones, m es 4. En algunas de tales realizaciones, cada L se selecciona independientemente de un nucleótido modificado, un nucleótido sin modificar, y un enlazador C3.
[0116] Un enlazador o separador C2-C50 puede ser una cadena principal que comprende una cadena de 2 a 50 átomos de carbono (C2-C50) (saturada, insaturada, de cadena lineal, ramificada o cíclica), de 0 a 10 grupos arilo, de 0 a 10 grupos heteroarilo y de 0 a 10 grupos heterocíclicos, que comprenden opcionalmente un enlace éter (-O-), (por ejemplo, una o más unidades de alquilenglicol, incluyendo, pero no limitado a, una o más unidades de etilenglicol -O-(CH2CH2O)-; una o más unidades de 1,3-propanodiol -O-(CH2CH2CH2O)-, etc.); un enlace amina (-NH-); un enlace amida (-NC(O)-); y un enlace tioéter (-S-); etc.; en el que cada carbono de la cadena principal puede estar independientemente sin sustituir (es decir, que comprende sustituyentes -H) o puede estar sustituido con uno o más grupos seleccionados de un alquilo C1 a C3 , -OH, -NH2 , -SH, -O-(alquilo C1 a C6), -S-(alquilo C1 a C6), halógeno, -OC(O)(alquilo C1 a C6), -NH-(alquilo C1 a C6), y similares. En algunas realizaciones, un enlazador C2-C50 es un enlazador C2-C20, un enlazador C2-C10, un enlazador C2-C8 , un enlazador C2-C6 , un enlazador C2-C5 , enlazador C2C4 , o enlazador C3 , en donde cada carbono puede estar independientemente sustituido como se describe anteriormente.
[0117] En algunas realizaciones, uno o más nucleósidos de un aptámero de PDGF comprenden una modificación seleccionada de una modificación de azúcar de a posición 2' (tal como un 2'-amino (2-NH2), un 2'-fluoro (2'-F) o un 2'-O-metil (2'-OMe)), una modificación en una amina exocíclica de citosina, una modificación del enlace internucleosídico, y una 5-metil-citosina. En algunas realizaciones, un aptámero de PDGF comprende una caperuza 5', una caperuza 3' y/o una desoxitimidina invertida en el extremo 3'.
[0118] En algunas realizaciones, un aptámero de PDGF comprende al menos un enlace internucleosídico modificado. En algunas realizaciones, al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o al menos cinco enlaces internucleósido son enlaces fosforotioato.
[0119] En algunas realizaciones, un aptámero de PDGF tiene una secuencia seleccionada de las secuencias mostradas en las Tablas 1, 2 y 6 a 9 (SEQ ID NOS: 1 a 1 a 499 y 517 a 545). En algunas realizaciones, un aptámero de PDGF tiene una secuencia seleccionada de las secuencias mostradas en la Tabla 1 y las secuencias mostradas en las Tablas 6 a 9 que se unen a PDGF con una afinidad (Kd) de menos de 10 nM. En algunas realizaciones, un aptámero de PDGF tiene una secuencia que es al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97 %, al menos 98%, al menos 99%, o 100% idéntica a las secuencias mostradas en las Tablas 1,2, y 6 a 9 (SEQ ID NOS: 1 a 1 a 499 y 517 a 545). En algunas realizaciones, un aptámero de PDGF tiene una secuencia que es al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%, o 100% idéntica a las secuencias mostradas en la Tabla 1 y las secuencias mostradas en las Tablas 6 a 9 que se unen a PDGF con una afinidad (Kd) de menos de 10 nM.
[0120] Los términos "identidad de secuencia", "porcentaje de identidad de secuencia", "porcentaje de identidad", "% idéntico", "% de identidad", y variaciones de los mismos, cuando se utilizan en el contexto de dos secuencias de ácido nucleico, se utilizan indistintamente para referirse al número de bases de nucleótidos que son las mismas en un ácido nucleico de consulta o una porción de un ácido nucleico de consulta, cuando se comparan y alinean para la máxima correspondencia a un ácido nucleico de referencia, dividido por cualquiera de (1) el número de bases de nucleótidos en la secuencia de consulta entre e incluyendo la base de nucleótido correspondiente más 5' (es decir, alineadas) y la base de nucleótido correspondiente más 3' (es decir, alineadas) o (2) la longitud total de la secuencia de referencia, lo que sea mayor. Una alineación de secuencias se ejemplo para comparación puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482, mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443, mediante la búsqueda del procedimiento de similitud de Pearson y Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85: 2444, mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete informático de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), o mediante inspección visual (véase, en general, Ausubel, FM et al. (1987), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. y Wiley-Interscience).
[0121] Un ejemplo de un algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencias es el algoritmo utilizado en la herramienta de búsqueda de alineamiento local básico (en adelante "BLAST"), véase, por ejemplo, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403 y Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 15: 3389. El software para realizar el análisis BLAST está disponible públicamente a través del Centro Nacional para la Información Biotecnológica (en adelante "NCBI"). Los parámetros por defecto utilizados en la determinación de la identidad de secuencias utilizando el software disponible de NCBI, por ejemplo, BLASTN (para secuencias de nucleótidos) se describen en McGinnis et al. (2004) Nucleic Acids Res. 32: w 20.
[0122] Tal como se usa en el presente documento, cuando se describe el porcentaje de identidad de un ácido nucleico, tal como un aptámero de PDGf , la secuencia del mismo es al menos, por ejemplo, aproximadamente el 95% idéntica a una secuencia de nucleótidos de referencia, se pretende que la secuencia de ácido nucleico es idéntica a la secuencia de referencia excepto que la secuencia de ácido nucleico puede incluir hasta cinco mutaciones puntuales por cada 100 nucleótidos de la secuencia de ácido nucleico de referencia. En otras palabras, para obtener una secuencia de ácido nucleico deseada, la secuencia del cual es al menos aproximadamente 95% idéntica a una secuencia de ácido nucleico de referencia, hasta el 5% de los nucleótidos en la secuencia de referencia puede eliminarse o sustituirse por otro nucleótido, o ciero número de nucleótidos hasta el 5% del número total de nucleótidos en la secuencia de referencia puede insertarse en la secuencia de referencia (denominado en este documento como una inserción). Estas mutaciones de la secuencia de referencia para generar la secuencia deseada puede tener lugar en las posiciones terminales 5' o 3' de la secuencia de nucleótidos de referencia o en cualquier lugar entre estas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre los nucleótidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. Además, se pretende que una base de nucleótidos se considera "idéntica" a los efectos de determinar el porcentaje de identidad, cuando la base de nucleótido (1) es la misma que la base de nucleótido en la secuencia de referencia, o (2) se deriva de la base de nucleótido en la secuencia de referencia, o (3) se deriva de la misma base de nucleótido de la que deriva la base de nucleótido en la secuencia de referencia. Por ejemplo, 5-metil citosina se considera que es "idéntica" a citosina para los propósitos de calcular el porcentaje de identidad. Del mismo modo, las uridinas modificados que se muestran en la figura 12 se consideran que son idénticas entre sí con el propósito de determinar el porcentaje de identidad. La secuencia de referencia puede ser una cualquiera de las secuencias de nucleótidos mostradas en SEQ ID NOS: 1 a 437.
[0123] En algunas realizaciones, la presente descripción proporciona un aptámero de PDGF que, tras la unión a PDGF, modula una función de PDGF. En algunas realizaciones, un aptámero de PDGF que se describe en el presente documento inhibe la fosforilación mediada por PDGF de un receptor de PDGF, tal como PDGF Ra o PDGF Rp. En algunas realizaciones, un aptámero de PDGF que se describe en el presente documento inhibe la fosforilación mediada por PDGF de PDGF Rp. En diversas realizaciones, el aptámero de PDGF modula una función de PDGF in vivo, tales como la inhibición de la fosforilación del receptor mediada por PDGF in vivo. En diversas realizaciones, el aptámero de PDGF tiene una secuencia seleccionada de entre las secuencias de SEQ ID NOS: 1 a 437. En diversas realizaciones, el aptámero de PDGF se selecciona de los aptámeros que se muestran en las Tablas 1 y 2. En diversas realizaciones, el aptámero de PDGF se selecciona de los aptámeros que se muestran en la Tabla 1. En algunas realizaciones, el aptámero de PDGF comprende al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24, al menos 25, al menos 26, al menos 27, al menos 28, al menos 29 o al menos 30 nucleótidos contiguos de una secuencia seleccionada de las SEQ ID NOS: 1 a 1 a 499 y 517 a 545. En algunas realizaciones, un aptámero de PDGF consiste en al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24, al menos 25, al menos 26, al menos 27, al menos 28, al menos 29, o al menos 30 nucleótidos contiguos que son idénticos en la secuencia de nucleobase a una secuencia seleccionada de las SEQ ID NOS: 1 a 1 a 499 y 517 a 545. En algunas realizaciones, el aptámero de PDGF comprende al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24, al menos 25, al menos 26, al menos 27, al menos 28, al menos 29, o al menos 30 nucleótidos contiguos de un aptámero que se indica en la Tabla 1,2, 6, 7, 8 o 9. En algunas realizaciones, el aptámero de PDGF comprende al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24 , al menos 25, al menos 26, al menos 27, al menos 28, al menos 29, o al menos 30 nucleótidos contiguos de un aptámero que se indica en la Tabla 1 o un aptámero que se indica en una de las Tablas 6 a 9 que se une PDGF con una afinidad (Kd) de menos de 10 nM. En algunas realizaciones, un aptámero de PDGF consiste en al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24, al menos 25, al menos 26, al menos 27, al menos 28, al menos 29, o al menos 30 nucleótidos contiguos de un aptámero que se muestra en la Tabla 1, 2 , 6, 7, 8 o 9. En algunas realizaciones, un aptámero de PDGF consiste en al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24, al menos 25, al menos 26, al menos 27, al menos 28, al menos 29, o al menos 30 nucleótidos contiguos de un aptámero que se indica en la Tabla 1 o un aptámero que se indica en una de las Tablas 6 a 9 que se une a PDGF con una afinidad (Kd) de menos de 10 nM.
[0124] En algunas realizaciones, un aptámero de PDGF tiene una secuencia de nucleobases seleccionada de las secuencias de SEQ ID NOS. 500-512; 761 y 762. En algunas realizaciones, un aptámero de PDGF tiene la secuencia de una cualquiera de SEQ ID NOS: 1 a 1 a 499 y 517 a 545. En algunas realizaciones, un aptámero de PDGF es al menos 95% idéntica, al menos 90% idéntica, al menos 85% idéntica, al menos 80% idéntica, o al menos 75% idéntica a una cualquiera de SEQ ID NOS: 1 a 1 a 499 y 517 a 545. En cualquiera de las realizaciones del presente documento, un aptámero de PDGF puede comprender nucleótidos adicionales u otros restos químicos en el extremo 5', el extremo 3', o ambos extremos 5' y 3' del aptámero.
[0125] El aptámero de PDGF puede contener cualquier número de nucleótidos, además de la región de unión a PDGF. En diversas realizaciones, el aptámero de PDGF puede incluir hasta aproximadamente 100 nucleótidos, hasta aproximadamente 95 nucleótidos, hasta aproximadamente 90 nucleótidos, hasta aproximadamente 85 nucleótidos, hasta aproximadamente 80 nucleótidos, hasta aproximadamente 75 nucleótidos, hasta aproximadamente 70 nucleótidos, hasta aproximadamente 65 nucleótidos, hasta aproximadamente 60 nucleótidos, hasta aproximadamente 55 nucleótidos, hasta aproximadamente 50 nucleótidos, hasta aproximadamente 45 nucleótidos, hasta aproximadamente 40 nucleótidos, hasta aproximadamente 35 nucleótidos, hasta aproximadamente 30 nucleótidos, hasta aproximadamente 25 nucleótidos, o hasta aproximadamente 20 nucleótidos.
[0126] En algunos aspectos, el aptámero de PDGF descrito se selecciona de un aptámero que tiene características similares de unión y capacidad para tratar aterosclerosis, degeneración macular, fibrosis o afecciones cancerosas asociadas con PDGf que un aptámero seleccionado de las SEQ ID NOS: 1 a 1 a 499 y 517 a 545. En algunas realizaciones, un aptámero de PDGF se une a la misma región de un monómero de PDGF-B (en el contexto de un dímero PDGF-BB o PDGF-AB) que un aptámero seleccionado de los aptámeros que se muestran en las Tablas 1, 2, y 6 a 9. En algunas realizaciones, un aptámero de PDGF se une a la misma región de un monómero de PDGF-B (en el contexto de un dímero PDGF-BB o PDGF-AB) que un aptámero seleccionado de los aptámeros que se muestran en Tabla 1. En algunas realizaciones, un aptámero de PDGF se une a la misma región de un monómero de PDGF-B (en el contexto de un dímero PDGF-BB o PDGF-AB) que un aptámero seleccionado de los aptámeros que se muestran en la Tabla 6. En algunas realizaciones, un aptámero de PDGf se une a la misma región de un monómero de PDGF-B (en el contexto de un dímero PDGF-BB o PDGF-AB ) que un aptámero de PDGF 4149-8_260. En algunas realizaciones, un aptámero de PDGF se une a una región de PDGF-B que comprende los aminoácidos 24 a 86 de PDGF-B. En algunas de tales realizaciones, el aptámero de PDGF compite por la unión a PDGF con el aptámero de PDGF 4149-8_260. En algunas realizaciones, un aptámero de PDGF se une a PDGF-B con menos de 15%, menos de 14%, menos de 13%, leass que 12%, menos de 11%, menos de 10%, menos del 9%, menos de 8%, menos del 7%, o menos de 6% de contactos polares a los átomos de contacto de la proteína. Los contactos polares se definen como la suma de enlaces de hidrógeno e interacciones carga-carga. En algunas realizaciones, un aptámero de PDGF se une a PDGF-B con una relación de contactos polares con respecto al área de la interfase de menos de 0,01, menos de 0,009, menos de 0,008, menos de 0,007 o menos de 0,006. En algunas realizaciones, un aptámero de PDGF se une a la misma región de un monómero de PDGF-B (en el contexto de un dímero PDGF-BB o PDGF-AB) que un aptámero de PDGF 5169-4_26.
[0127] En algunas realizaciones, un aptámero de PDGF tiene cualquier combinación de las siguientes características: (a) se une a una región de PDGF-B que comprende los aminoácidos 24 a 86 de PDGF-B;
(b) compite por la unión a PDGF con el aptámero de PDGF 4149-8_260;
(c) compite por la unión a PDGF con el aptámero de PDGF 5169-4_26;
(d) se une a PDGF-B con una relación de los contactos polares con respecto al área de interfase de menos de 0,01, menos de 0,009, menos de 0,008, menos de 0,007 o menos de 0,006; y/o
(e) se une a PDGF-B con menos de 15%, menos de 14%, menos de 13%, leass que 12%, menos de 11%, menos de 10%, menos del 9%, menos de 8 %, menos del 7%, o menos de 6% de contactos polares a los átomos de contacto de la proteína.
[0128] El aptámero de PDGF se puede seleccionar para que tenga cualquier constante de disociación adecuada (Kd) para PDGF. En algunas realizaciones, un aptámero de PDGF tiene una constante de disociación (Kd) para PDGF de menos de 30 nM, menos de 25 nM, menos de 20 nM, menos de 15 nM, menos de 10 nM, menos de 9 nM, menos de 8 nM, menos de 7 nM, menos de 6 nM, menos de 5 nM, menos de 4 nM, menos de 3 nM, menos de 2 nM, o menos de 1 nM. Las constantes de disociación se pueden determinar con un ensayo de unión utilizando una titulación de múltiples puntos y ajustando la ecuación y = (max - min)(proteína)/(Kd + Proteína) min como se describe en el Ejemplo 3, a continuación. En algunas realizaciones, el aptámero de PDGF es un aptámero con una Kd que es menor que o igual a la Kd de un aptámero que se indica en cualquiera de las Tablas 1, 2 o 6 a 9. En algunas realizaciones, el aptámero de PDGF es un aptámero con una Kd que es menor que o igual a la Kd de un aptámero que se indica en la Tabla 1 o la Tabla 6.
[0129] El aptámero 4149-8_1 se une en una estequiometría 1:1 con un monómero de PDGF. Dado que el PDGF forma un homodímero fuerte que se requiere para la reacción con sus receptores diana, una inhibición más eficiente de la actividad de PDGF podría lograrse mediante el uso de una forma dimérica o multimérica del aptámero 4149-8_1. Por lo tanto, en algunas realizaciones, el aptámero de PDGF es un multimerización de cualquier combinación de las secuencias de aptámero 4149-8_1, 4149-8_379, y las SEQ ID NOS 500 a 512. En algunas realizaciones, una construcción de aptámeros comprende un primer aptámero seleccionado de cualquiera de los aptámeros de PDGF descritos en este documento, y un segundo aptámero que comprende cualquiera de los aptámeros de PDGF descritos en este documento, en el que el primer aptámero y el segundo aptámero pueden ser el mismo o diferente. El primer aptámero y el segundo aptámero de la construcción de aptámeros de PDGF pueden estar unidos de forma covalente o no covalente. Las uniones de ejemplo no limitantes son conocidas en la técnica y/o se describen en este documento. En algunas realizaciones, una construcción de aptámeros de PDGF puede ser capaz de unir dos monómeros de PDGF simultáneamente. En algunas realizaciones, una construcción de aptámeros de PDGF se une a PDGF con una afinidad (Kd) de menos de 10 nM.
APTÁMEROS DE VEGF DE EJEMPLO
[0130] Se identificaron los aptámeros de VEGF de la presente descripción usando el procedimiento SELEX mejorado para identificar aptámeros que tienen velocidades de disociación lentas, tal como se describe en el Ejemplo 7, que describe un procedimiento representativo para la selección y producción de un aptámero que se une a VEGF con una velocidad de disociación lenta.
[0131] Se truncó un clon de un experimento SELEX con VEGF-121 Nap-dU a una secuencia mínima de 29 nucleótidos. Este SOMAmer se une tanto a VEGF-121 como a VEGF-165 con alta afinidad (valores de Kd de 90 pM y 20 pM, respectivamente). El SOMAmer también inhibe potentemente la capacidad de ambas isoformas de VEGF para inducir la fosforilación de VEGFR2 en células endoteliales de vena umbilical humana in vitro (véase el Ejemplo 9), apoyando el concepto de que se une a y bloquea el dominio de unión al receptor de VEGF.
[0132] La presente descripción proporciona la primera identificación de un aptámero inhibidor de VEGF-121. Por lo tanto, los presentes aptámeros de VEGF representan amplios inhibidores de VEGF, similar a fármacos basados en proteínas como bevacizumab (Avastin®), ranibizumab (Lucentis®) y aflibercept (Eylea®) (Papadopoulos et al (2012) Angiogenesis. 15: 171; Yu et al (2011) Biochem Biophys Res Commun 408: 276 Por lo tanto, los presentes aptámeros de VEGF pueden inhibir más eficazmente la señalización de VEGF que Macugen®, que es un inhibidor selectivo de VEGF-165.
[0133] Un clon truncado del exitoso experimento SELEX con VEGF-121 Nap-dU proporciona una secuencia de 29 nucleótidos. Este aptámero (o SOMAmer) (4867-31 se une tanto a VEGF-121 como a VEGF-165 con alta afinidad (valores de Kd de 90 pM y 20 pM, respectivamente). Este SOMAmer también inhibe potentemente la capacidad de ambas isoformas de VEGF para inducir fosforilación VEGFR2 en células endoteliales de vena umbilical humana in vitro, apoyando el concepto de que se une a y bloquea el dominio de unión al receptor de VEGF.
[0134] El aptámero 4867-31_192 se une en una estequiometría 1:1 con un monómero de VEGF. Dado que el VEGF forma un homodímero fuerte que se requiere para la reacción con sus receptores diana, una inhibición más eficiente de la actividad de VEGF podría lograrse mediante el uso de una forma dimérica o multimérica del aptámero 4867-31_192. Por lo tanto, en algunas realizaciones, el aptámero de VEGF es un multimerización de cualquier combinación de las secuencias de aptámero 4867-31_192, SEQ ID NOS 513 a 516. En algunas realizaciones, una construcción de aptámeros comprende un primer aptámero seleccionado de cualquiera de los aptámeros de VEGF descritos en este documento, y un segundo aptámero que comprende cualquiera de los aptámeros de VEGF descritos en este documento, en el que el primer aptámero y el segundo aptámero pueden ser el mismo o diferente. El primer aptámero y el segundo aptámero de la construcción de aptámeros de VEGF pueden estar unidos de forma covalente o no covalente. Las uniones de ejemplo no limitantes son conocidas en la técnica y/o se describen en este documento. En algunas realizaciones, una construcción de aptámeros de VEGF puede ser capaz de unir dos monómeros de VEGF simultáneamente. En algunas realizaciones, una construcción de aptámeros de VEGF se une a VEGF con una afinidad (Kd) de menos de 10 nM.
[0135] En algunas realizaciones, un aptámero de VEGF se une a VEGF-121 con una Kd de menos de 10 nM. En algunas realizaciones, el aptámero de VEGF comprende uno o más nucleótidos modificados. En algunas realizaciones, el aptámero de VEGF comprende uno o más nucleótidos modificados que comprenden una modificación hidrófoba. En algunas realizaciones, el aptámero de VEGF comprende una o más pirimidinas modificadas. En algunas realizaciones, el aptámero de VEGF comprende una o más pirimidinas modificadas mostradas en la figura. 12. En algunas realizaciones, el aptámero de VEGF comprende una o más pirimidinas modificadas mostradas en la figura 12, los grupos II a V. En algunas realizaciones, el aptámero de VEGF comprende una o más pirimidinas modificadas mostradas en la figura 12, los grupos III a V. En algunas realizaciones, el aptámero de VEGF comprende una o más pirimidinas modificadas mostradas en la figura 12, los grupos III y IV. En algunas realizaciones, el aptámero de VEGF comprende una o más (N-naftilmetilcarboxamida)-2'-desoxiuridinas (NapdUs).
[0136] En algunas realizaciones, un aptámero de VEGF comprende la secuencia:
5'-GZZQAAEZECZZEZDRGAZZZAAAZGG-3' (SEQ ID NO 513)
en la que cada Z es una pirimidina modificada;
Q se selecciona de cualquier nucleótido modificado o sin modificar y un enlazador C2-C50 sustituido o no sustituido, o está ausente;
cada E se selecciona independientemente de G y un enlazador C2-C50 sustituido o no sustituido;
D se selecciona de A y un enlazador C2-C50 sustituido o no sustituido; y
R se selecciona de cualquier nucleótido modificado o sin modificar y un enlazador C2-C50 sustituido o no sustituido.
[0137] En algunas realizaciones, un aptámero de VEGF comprende una secuencia seleccionada de:
5'-CGZZQAAEZECZZEZDRGAZZZAAAZG-3' (SEQ ID NO 514.);
5'-GZZQAAEZECZZEZDRGAZZZAAAZGG-3' (SEQ ID NO 513.);
5'-CGZZQAAEZECZZEZDRGAZZZAAAZGG-3' (SEQ ID NO 515.); y
5'-CCGZZQAAEZECZZEZDRGAZZZAAAZGG-3' (SEQ ID NO 516.);
en las que Z, Q, E, D y R son como se definen anteriormente.
[0138] En algunas realizaciones, Z es una uridina modificada. En algunas realizaciones, cada Z se selecciona independientemente de las pirimidinas modificadas en C-5 como se definen en el presente documento. En algunas realizaciones, cada Z se selecciona independientemente de
5-(N-bencilcarboxamida)-2'-desoxiuridina (BndU),
5-(N-bencilcarboxamida)-2'-O-metiluridina,
5-(N-bencilcarboxamida)-2'-fluorouridina,
5-(N-fenetilcarboxamida)-2'-desoxiuridina (Pedu),
5-(N-tiofenilmetilcarboxamida)-2'-desoxiuridina (THDU),
5-(N-isobutilcarboxamida)-2'-desoxiuridina (iBudU),
5-(N-tirosilcarboxamida)-2'-desoxiuridina (TyrdU),
5-(N-3,4-metilendioxibencilcarboxamida)-2'-desoxiuridina (MBndU),
5-(N-4-fluorobencilcarboxamida)-2'-dseoxiuridina (FBndU),
5-(N-3-fenilpropilcarboxamida)-2'-desoxiuridina (PPdU),
5-(N-imidizoliletilcarboxamida)-2'-desoxiuridina (ImdU),
5-(N-isobutilcarboxamida)-2' -O-metiluridina,
5-(N-isobutilcarboxamida)-2'-fluorouridina,
5-(N-triptaminocarboxamida)-2'-desoxiuridina (TrpdU),
5-(N-R-treoninilcarboxamida)-2'-desoxiuridina (ThrdU),
5-(N-triptaminocarboxamida)-2'-O-metiluridina,
5-(N-triptaminocarboxamida)-2'-fluorouridina,
Cloruro de 5-(N-[1-(3-trimetilamonio)propil] carboxamida)-2'-desoxiuridina,
5-(N-naftilmetilcarboxamida)-2'-desoxiuridina (NapdU),
5-(N-naftilmetilcarboxamida)-2'-O-metiluridina,
5-(N-naftilmetilcarboxamida)-2'-fluorouridina,
5-(N-[1 -(2,3-dihidroxipropil)] carboxamida)-2'-desoxiuridina),
5-(N-2-naftilmetilcarboxamida)-2'-desoxiuridina (2NapdU),
5-(N-2-naftilmetilcarboxamida)-2'-O-metiluridina,
5-(N-2-naftilmetilcarboxamida)-2'-fluorouridina,
5-(N-1-naftiletilcarboxamida)-2'-desoxiuridina (NEdU),
5-(N-1-naftiletilcarboxamida)-2'-O-metiluridina,
5-(N-1-naftiletilcarboxamida)-2'-fluorouridina,
5-(N-2-naftiletilcarboxamida)-2'-desoxiuridina (2NEdU),
5-(N-2-naftiletilcarboxamida)-2'-O-metiluridina,
5-(N-2-naftiletilcarboxamida)-2'-fluorouridina,
5-(N-3-benzofuraniletilcarboxamida)-2'-desoxiuridina (BFdU),
5-(N-3-benzofuraniletilcarboxamida)-2'-O-metiluridina,
5-(N-3-benzofuraniletilcarboxamida)-2'-fluorouridina,
5-(N-3-benzotiofeniletilcarboxamida)-2'-desoxiuridina (BTdU),
5-(N-3-benzotiofeniletilcarboxamida)-2'-O-metiluridina, y
5-(N-3-benzotiofeniletilcarboxamida)-2'-fluorouridina.
[0139] En algunas realizaciones, cada Z se selecciona independientemente de las pirimidinas modificadas mostradas en la figura 12, los grupos II a V. En algunas realizaciones, cada Z se selecciona independientemente de las pirimidinas modificadas mostradas en la figura 12, los grupos III a V. En algunas realizaciones, al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, o al menos ocho Z son 5-(N-naftilmetilcarboxamida)-2'-desoxiuridina (NapdU). En algunas realizaciones, cada Z se selecciona independientemente de las pirimidinas modificadas mostradas en la figura 12, los grupos III a IV. En algunas realizaciones, cada Z es 5-(N-naftilmetilcarboxamida)-2'-desoxiuridina (NapdU).
[0140] Un enlazador o separador C2-C50 puede ser una cadena principal que comprende una cadena de 2 a 50 átomos de carbono (C2-C50) (saturada, insaturada, de cadena lineal, ramificada o cíclica), 0 a 10 grupos arilo, 0 a 10 grupos heteroarilo y 0 a 10 grupos heterocíclicos, que comprende opcionalmente un enlace éter (-O-), (por ejemplo, una o más unidades de alquilenglicol, incluyendo, pero no limitado a, una o más unidades de etilenglicol -O-(CH2CH2O)-;
una o más unidades de 1,3-propanodiol -O-(CH2CH2CH2O)-, etc.); un enlace amina (-NH-); un enlace amida (-NC(O)-); y un enlace tioéter (-S-); etc.; en el que cada átomo del esqueleto de carbono puede estar independientemente sin sustituir (es decir, que comprende sustituyentes -H) o puede estar sustituido con uno o más grupos seleccionados de un alquilo C1 a C3 , -OH, -NH2 , -SH, -O-(alquilo C1 a C6), -S-(alquilo C1 a C6), halógeno, -OC(O)(alquilo C1 (alquilo C1 a C6), y similares. En algunas realizaciones, un enlazador C2-C50 es un enlazador C2-C20, un enlazador C2-C10, un enlazador C2-C8 , un enlazador C2-C6 , un enlazador C2-C5 , un enlazador C2-C4 o un enlazad cada carbono puede estar independientemente sustituido como se describe anteriormente.
[0141] En algunas realizaciones, cada enlazador C2-C50 sustituido o no sustituido se selecciona independientemente de un enlazador C2-C20 sustituido o no sustituido, un enlazador C2-C10 sustituido o no sustituido, un enlazador C2-C8 sustituido o no sustituido, un enlazador C2-C6 sustituido o no sustituido, un enlazador C2-C5 sustituido o no sustituido, un enlazador C2-C4 sustituido o no sustituido y un enlazador C3 sustituido o no sustituido. En algunas realizaciones, cada enlazador C2-C50 sustituido o no sustituido es un enlazador C2-C10 sustituido o no sustituido. En algunas de tales realizaciones, cada enlazador C2-C10 sustituido o no sustituido es un enlazador C2-C8 sustituido o no sustituido, un enlazador C2-C6 sustituido o no sustituido, un enlazador C2-C5 sustituido o no sustituido, un enlazador
C2-C4 sustituido o no sustituido, o un enlazador C3 sustituido o no sustituido.
[0142] En algunas realizaciones, uno o más nucleósidos de un aptámero de VEGF comprenden una modificación seleccionada de una modificación de azúcar en la posición 2' (tal como un 2'-amino (2-NH2), un 2'-fluoro (2'-F), o un
2'-O-metil (2'-OMe)), una modificación en una amina exocíclica de citosina, una modificación en el enlace internucleosídico y una 5-metil-citosina. En algunas realizaciones, un aptámero de VEGF comprende un tope, una caperuza 5', una caperuza 3' y/o una desoxitimidina invertida en el extremo 3'.
[0143] En algunas realizaciones, un aptámero de VEGF comprende al menos un enlace internucleosídico modificado. En algunas realizaciones, al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o al menos cinco enlaces internucleosídicos son enlaces fosforotioato.
[0144] En algunas realizaciones, un aptámero de VEGF tiene una secuencia seleccionada de las secuencias mostradas en las Tablas 10 a 14. En algunas realizaciones, un aptámero de VEGF tiene una secuencia seleccionada de las secuencias mostradas en las Tablas 10 a 14 que tienen una Kd de menos de 10 nM. En algunas realizaciones, un aptámero de VEGF tiene una secuencia que es al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97 %, al menos 98%, al menos 99%, o 100% idéntica a las secuencias mostradas en las Tablas 10 a 14. En algunas realizaciones, un aptámero de VEGF tiene una secuencia que es al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%, o 100% idéntica a las secuencias mostradas en las Tablas 10 a 14 que tienen una Kd de menos de 10 nM. El porcentaje de identidad se determina como se ha descrito anteriormente para los aptámeros de PDGF, excepto que las secuencias de referencia son las secuencias de aptámero de VEGF mostradas en las Tablas 10 a 14, tales como las secuencias que tienen una Kd de menos de 10 nM.
[0145] En algunas realizaciones, la presente descripción proporciona un aptámero de VEGF que, tras la unión a VEGF, modula una función de VEGF. En algunas realizaciones, un aptámero de VEGF inhibe la fosforilación de un receptor de VEGF, tal como VEGFR1 o VEGFR2, mediada por VEGF. En algunas realizaciones, un aptámero de VEGF inhibe la fosforilación mediada por VEGF del receptor de VEGF. En diversas realizaciones, el aptámero de VEGF modula una función de VEGF in vivo, tal como la inhibición de la fosforilación del receptor mediada por VEGF in vivo. En diversas realizaciones, el aptámero de VEGF tiene una secuencia seleccionada de las secuencias mostradas en las Tablas 10 a 14. En diversas realizaciones, el aptámero de VEGF se selecciona de los aptámeros que se muestran en las Tablas 10 a 14 que tienen una Kd de menos de 10 nM. En diversas realizaciones, el aptámero de VEGF se selecciona de los aptámeros que se muestran en las Tablas 10 a 14. En algunas realizaciones, el aptámero de VEGF comprende al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24, al menos 25, al menos 26, al menos 27, al menos 28, al por lo menos 29, o al menos 30 nucleótidos contiguos de una secuencia que se muestra en las Tablas 10 a 14 que tienen una Kd de menos de 10 nM. En algunas realizaciones, un aptámero de VEGF consiste en al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24, al menos 25, al menos 26, al menos 27, al menos 28, al menos 29, o al menos 30 nucleótidos contiguos que son idénticos en la secuencia de nucleobases a una secuencia que se muestra en las Tablas 10 a 14 que tiene una Kd de menos de 10 nM. En algunas realizaciones, el aptámero de VEGF comprende al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24, al menos 25, al menos 26, al menos 27, al menos 28, al menos 29, o al menos 30 nucleótidos contiguos de un aptámero que se muestra en las Tablas 10 a 14. En algunas realizaciones, el aptámero de VEGF comprende al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24, al menos 25, al menos 26, al menos 27, al menos 28, al menos 29, o al menos 30 nucleótidos contiguos de un aptámero que se muestra en las Tablas 10 a 14 que tienen una Kd de menos de 10 nM. En algunas realizaciones, un aptámero de VEGF consiste en al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24, al menos 25, al menos 26, al menos 27, al menos 28, al menos 29, o al menos 30 nucleótidos contiguos de un aptámero que se muestra en las Tablas 10 a 14. En algunas realizaciones, un aptámero de VEGF consiste en al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24, al menos 25, al menos 26, al menos 27, al menos 28, al menos 29, o al menos 30 nucleótidos contiguos de un aptámero que se muestra en las Tablas 10 a 14 que tienen una Kd de menos de 10 nM.
[0146] En cualquiera de las realizaciones del presente documento, un aptámero de VEGF puede comprender nucleótidos adicionales u otros restos químicos en el extremo 5', el extremo 3', o ambos el extemo 5' y el extremo 3' del aptámero.
[0147] El aptámero de VEGF puede contener cualquier número de nucleótidos, además de la región de unión a VEGF. En diversas realizaciones, el aptámero de VEGF puede incluir hasta aproximadamente 100 nucleótidos, hasta aproximadamente 95 nucleótidos, hasta aproximadamente 90 nucleótidos, hasta aproximadamente 85 nucleótidos, hasta aproximadamente 80 nucleótidos, hasta aproximadamente 75 nucleótidos, hasta aproximadamente 70 nucleótidos, hasta aproximadamente 65 nucleótidos, hasta aproximadamente 60 nucleótidos, hasta aproximadamente 55 nucleótidos, hasta aproximadamente 50 nucleótidos, hasta aproximadamente 45 nucleótidos, hasta aproximadamente 40 nucleótidos, hasta aproximadamente 35 nucleótidos, hasta aproximadamente 30 nucleótidos, hasta aproximadamente 25 nucleótidos, o hasta aproximadamente 20 nucleótidos.
[0148] En algunos aspectos, el aptámero de VEGF descrito se selecciona de un aptámero que tiene características similares de unión y capacidad para tratar aterosclerosis, degeneración macular, fibrosis y afecciones cancerosas asociadas con VEGF que un aptámero que se indica en las Tablas 10 a 14, tiene una Kd de menos de 10 nM. En algunas realizaciones, un aptámero de VEGF se une a la misma región de VEGF-121 como un aptámero seleccionado de los aptámeros que se muestran en las Tablas 10 a 14 que tienen una Kd de menos de 10 nM. En algunas realizaciones, un aptámero de VEGF se une a la misma región de un VEGF-121 que un aptámero de VEGF que se muestra en la Tabla 10, 11, 12, 13 o 14 que tiene una Kd de menos de 10 nM. En algunas realizaciones, un aptámero de VEGF se une a la misma región de v Eg F-121 que el aptámero de VEGF 4867-31_183.
[0149] El aptámero de VEGF puede seleccionarse para que tenga cualquier constante de disociación adecuada (Kd) para VEGF. En algunas realizaciones, un aptámero de VEGF tiene una constante de disociación (Kd) para VEGF-121 de menos de 30 nM, menos de 25 nM, menos de 20 nM, menos de 15 nM, menos de 10 nM, menos de 9 nM, menos de 8 nM, menos de 7 nM, menos de 6 nM, menos de 5 nM, menos de 4 nM, menos de 3 nM, menos de 2 nM, o menos de 1 nM. Las constantes de disociación se pueden determinar con un ensayo de unión utilizando una titulación de múltiples puntos y ajustando la ecuación y = (max - min) (proteína)/(Kd + proteína) min, tal como se describe en el Ejemplo 3 a continuación.
[0150] En algunas realizaciones, una construcción de aptámeros comprende un primer aptámero seleccionado de cualquiera de los aptámeros de VEGF descritos en el presente documento, y un segundo aptámero que comprende cualquiera de los aptámeros de VEGF descritos en el presente documento, en el que el primer aptámero y el segundo aptámero puede ser el mismo o diferente. El primer aptámero y el segundo aptámero de la construcción de aptámeros de VEGF pueden estar unidos de forma covalente o no covalente. Las uniones de ejemplo no limitantes son conocidas en la técnica y/o se describen en este documento. En algunas realizaciones, una construcción de aptámeros de VEGF puede ser capaz de unir dos monómeros de VEGF de forma simultánea. En algunas realizaciones, una construcción de aptámero de VEGF se une a VEGF con una afinidad (Kd) de menos de 10 nM.
CONSTRUCCIONES DE APTÁMEROS DE PDGF/VEGF DE EJEMPLO
[0151] Existe una evidencia considerable que un bloqueo más eficaz de angiogénesis asociada a tumor y angiogénesis ocular, junto con una nueva regresión de los vasos sanguíneos, es posible con la inhibición combinada de las rutas de señalización de VEGF y PDGF-B (Bergers, G., et al. (2003) J. Clin Invest 111: 1287; Jo, N., et al (2006) Am J. Pathol 168: 2036). Este efecto está mediado por la alteración de la asociación estrecha de célula-célula entre las células endoteliales, que forman brotes capilares iniciales y células periendoteliales (o pericitos), que rodean los nuevos vasos sanguíneos a medida que maduran, lo que hace que los vasos sanguíneos sean menos susceptibles a los inhibidores de VEGF (Benjamin, LE, et al (1998) Development 125: 1591; Benjamin, LE, et al (1999) J. Clin Invest 103: 159.). Los aptámeros descritos en este documento pueden formar la base de dicho inhibidor de tipo dual.
[0152] En algunas realizaciones, una construcción de aptámeros de PDGF/VEGF comprende cualquiera de los aptámeros de PDGF descritos en el presente documento unidos a cualquiera de los aptámeros de VEGF descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, una construcción de aptámeros de PDGF/VEGF comprende cualquiera de los aptámeros de PDGF mostrados en la Tabla 1 unido a cualquiera de los aptámeros de VEGF mostrados en las Tabla 10 a 14 que tienen una d de menos de 10 nM. La unión puede ser covalente o no covalente.
[0153] La construcción de aptámeros de PDGF/VEGF puede comprender un aptámero de PDGF y un aptámero de VEGF en cualquier orientación, tal como un aptámero de PDGF unido en o cerca de su extremo 3' a un punto en o cerca del extremo 5' de un aptámero de VEGF, o un aptámero VEGF unido en o cerca de su extremo 3' a un punto en o cerca del extremo 5' de un aptámero de PDGF, o cualquier otra orientación que conserve las propiedades de unión de cada aptámero de la construcción.
[0154] En algunas realizaciones en las que el enlace es covalente, la construcción de aptámeros de PDGF/VEGF puede estar unida a través de un enlace fosfato o fosforotioato. También se contemplan muchos otros enlaces covalentes, tales como enlaces a través de diversos restos enlazadores, incluyendo, pero no limitado a, enlazadores de hexaetilenglicol, enlazadores de polietilenglicol, enlazadores de hidrocarburos sustituidos o no sustituidos, etc. Un experto en la técnica puede seleccionar un enlace covalente adecuado para la unión de un aptámero de PDGF a un aptámero VEGF.
[0155] En algunas realizaciones, el aptámero de PDGF y el aptámero de VEGF están unidos mediante un enlace no covalente. Los enlaces no covalentes incluyen, pero no se limitan a, biotina/estreptavidina; péptidosde unión a metales/metales; oligonucleótidos modificados hibridables y/o no modificados; etc. Un experto en la técnica puede seleccionar un enlace no covalente adecuado para la unón de un aptámero de PDGF a un aptámero VEGF.
Composiciones farmacéuticas que comprenden aptámeros y construcciones de aptámeros
[0156] En algunas realizaciones, se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden al menos un aptámero o construcción de aptámeros descritos en este documento y al menos un portador farmacéuticamente aceptable. Los portadores adecuados se describen en "Remington: The Science y Practice of Pharmacy, vigésimo primera edición", publicado por Lippincott Williams & Wilkins. Las composiciones farmacéuticas que incluyen al menos un aptámero o construcción de aptámeros descritos en este documento y al menos un portador farmacéuticamente aceptable también pueden incluir uno o más agentes activos que no sean un inhibidor de PDGF o VEGF.
[0157] Los aptámeros descritos en este documento se pueden utilizar en cualquier forma de dosificación farmacéuticamente aceptable, incluyendo, pero no limitado a, formas de dosificación inyectables, dispersiones líquidas, geles, aerosoles, pomadas, cremas, formulaciones liofilizadas, polvos secos, comprimidos, cápsulas, formulaciones de liberación controlada, formulaciones de fusión rápida, formulaciones de liberación retardada, formulaciones de liberación prolongada, formulaciones de liberación pulsátil, formulaciones mixtas de liberación inmediata y liberación controlada, etc. Específicamente, los aptámeros descritos en este documento pueden formularse: (a) para la administración seleccionada de cualquiera de administración oral, pulmonar, intravenosa, intraarterial, intratecal, intra-articular, rectal, oftálmica, colónica, parenteral, intracisternal, intravaginal, intraperitoneal, local, bucal, nasal y tópica; (b) en una forma de dosificación seleccionada de cualquiera de dispersiones líquidas, geles, aerosoles, ungüentos, cremas, comprimidos, sobres y cápsulas; (c) en una forma de dosificación seleccionada de cualquiera de las formulaciones liofilizadas, polvos secos, formulaciones de fusión rápida, formulaciones de liberación controlada, formulaciones de liberación retardada, formulaciones de liberación prolongada, formulaciones de liberación pulsátil y formulaciones mixtas de liberación inmediata y liberación controlada; o (d) cualquier combinación de los mismos.
[0158] Las soluciones o suspensiones usadas para aplicación parenteral, intradérmica o subcutánea pueden comprender uno o más de los siguientes componentes: (1) un diluyente estéril, tal como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; (2) agentes antibacterianos, tales como alcohol bencílico o metil parabenos; (3) antioxidantes, tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; (4) agentes quelantes, tales como ácido etilendiaminotetraacético; (5) tampones, tales como acetatos, citratos o fosfatos; y (5) agentes para el ajuste de la tonicidad, tales como cloruro sódico o dextrosa. El pH se puede ajustar con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. Una preparación parenteral puede contenerse en ampollas, jeringas desechables o viales de múltiples dosis fabricados de vidrio o plástico.
[0159] Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable pueden incluir soluciones acuosas estériles (solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. Para la administración intravenosa, los portadores adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EL (BASF, Parsippany, NJ) o solución salina tamponada con fosfato (PBS). En todos los casos, la composición debe ser estéril y debe ser fluida en la medida en que exista una fácil inyectabilidad. La composición farmacéutica debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe conservarse contra la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. El término "estable", como se usa en el presente documento, significa que permanece en un estado o condición que es adecuada para la administración a un sujeto.
[0160] El portador puede ser un disolvente o medio de dispersión, incluyendo, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos puede conseguirse mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, será preferible incluir en la composición agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes, tales como manitol o sorbitol, y sales inorgánicas, tales como cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede provocarse incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
[0161] Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar incorporando el reactivo activo (por ejemplo, un aptámero y/o una construcción de aptámeros) en una cantidad apropiada en un disolvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, según se desee, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando al menos un aptámero y/o construcción de aptámeros en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y cualquier otro ingrediente deseado. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los procedimientos de ejemplo de preparación incluyen secado al vacío y liofilización, ambos de los cuales darán lugar a un polvo de un aptámero y/o una construcción de aptámeros más cualquier ingrediente deseado adicional de una solución filtrada previamente estéril del mismo.
[0162] En algunas realizaciones, un aptámero, y/o una construcción de aptámeros se formula para inyección intravítrea. Las formulaciones adecuadas para la administración intravítrea se describen, por ejemplo, en Ocular drug delivery en, por ejemplo, Rawas-Qalaji et al. (2012) Curr. Eye Res. 37: 345; Bochot et al. (2012) J. Control Release 161: 628; Yasukawa et al. (2011) Recent Pat. Drug Deliv. Formul. 5: 1; y Doshi et al. (2011) Semin. Ophthalmol. 26: 104. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que comprende un aptámero y/o una construcción de aptámeros se administra por inyección intravítrea una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez por cada cuatro semanas, una vez cada cinco semanas, una vez cada seis semanas, una vez cada siete semanas, una vez cada ocho semanas, una vez cada nueve semanas, una vez cada 10 semanas, una vez cada 11 semanas, una vez cada 12 semanas o menos de una vez cada 12 semanas.
[0163] Las composiciones orales generalmente incluyen un diluyente inerte o un portador comestible. Se pueden contener, por ejemplo, en cápsulas de gelatina o comprimirse en comprimidos. Para el propósito de la administración oral terapéutica, el aptámero, y/o construcción de aptámeros puede incorporarse con excipientes y usarse en forma de comprimidos, trociscos o cápsulas. Las composiciones orales también se pueden preparar usando un portador fluido para su uso como un enjuague bucal, en el que el compuesto en el portador fluido se aplica por vía oral y se enjuaga y se expectora o se traga. Pueden incluirse como parte de la composición agentes de unión farmacéuticamente compatibles y/o materiales adyuvantes.
[0164] Para la administración por inhalación, los compuestos se suministran en forma de una pulverización de aerosol desde un recipiente o dispensador presurizado que contiene un propulsor adecuado, por ejemplo, un gas, tal como dióxido de carbono, un líquido nebulizado, o un polvo seco a partir de una dispositivo adecuado. Para administración transmucosal o transdérmica, se utilizan en la formulación penetrantes apropiados para la barrera a permear. Tales penetrantes son generalmente conocidos en la técnica, e incluyen, por ejemplo, para la administración transmucosal, detergentes, sales biliares y derivados de ácido fusídico. La administración transmucosal puede lograrse a través del uso de pulverizaciones nasales o supositorios. Para la administración transdérmica, los reactivos activos se formulan en pomadas, bálsamos, geles o cremas, tal como se conoce generalmente en la técnica. Los reactivos se pueden preparar también en forma de supositorios (por ejemplo, con bases de supositorio convencionales, tales como manteca de cacao y otros glicéridos) o enemas de retención para la administración rectal.
[0165] En algunas realizaciones, un aptámero, y/o una construcción de aptámeros se prepara con un portador que protegerá contra la eliminación rápida del cuerpo. Por ejemplo, se puede utilizar una formulación de liberación controlada, que incluye implantes y sistemas de liberación microencapsulados. Se pueden usar polímeros biodegradables, biocompatibles, tales como etileno-acetato de vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Los procedimientos para la preparación de tales formulaciones serán evidentes para los expertos en la técnica. Los materiales también pueden obtenerse comercialmente de Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc.
[0166] Las suspensiones liposomales (incluyendo liposomas dirigidos a células infectadas con anticuerpos monoclonales para antígenos virales) también se pueden utilizar como portadores farmacéuticamente aceptables. Estos se pueden preparar según procedimientos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, tal como se describe en la Patente de Estados Unidos N° 4.522.811.
[0167] Adicionalmente, las suspensiones de un aptámero y/o una construcción de aptámeros se pueden preparar como suspensiones de inyección oleosas apropiadas. Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos, tales como aceite de sésamo, o ésteres de ácidos grasos sintéticos, tales como oleato de etilo, triglicéridos, o liposomas. También se pueden usar para la liberación polímeros amino policatiónicos no lipídicos. Opcionalmente, la suspensión también puede incluir estabilizantes o agentes adecuados para aumentar la solubilidad de los compuestos y permitir la preparación de soluciones altamente concentradas.
[0168] En algunos casos, puede ser especialmente ventajoso formular composiciones orales o parenterales en forma de dosificación unitaria para facilidad de administración y uniformidad de dosificación. La forma unitaria de dosificación como se usa en el presente documento se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para el sujeto a tratar; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de un aptámero y/o construcción de aptámero calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico requerido. La especificación para las formas de dosificación unitaria de aptámeros y/o construcciones descritas en este documento están dictadas por y dependen directamente de las características del aptámero particular y/o construcción de aptámeros particulares y el efecto terapéutico particular a conseguir, y las limitaciones inherentes en la técnica de la combinación de dicho agente activo para el tratamiento de individuos.
[0169] Las composiciones farmacéuticas que comprenden al menos un aptámero y/o construcción de aptámeros pueden incluir uno o más excipientes farmacéuticos. Ejemplos de tales excipientes incluyen, pero no se limitan a, agentes aglutinantes, agentes de relleno, agentes lubricantes, agentes de suspensión, edulcorantes, agentes aromatizantes, conservantes, tampones, agentes humectantes, disgregantes, agentes efervescentes y otros excipientes. Tales excipientes son conocidos en la técnica. Excipientes de ejemplo incluyen: (1) agentes aglutinantes, que incluyen diversas celulosas y polivinilpirrolidona reticulada, celulosa microcristalina, tal como Avicel® PH101 y Avicel® PH102, celulosa microcristalina silicificada (ProSolv SMCC™), goma tragacanto y gelatina; (2) agentes de relleno, tales como diversos almidones, lactosa, lactosa monohidratada y lactosa anhidra; (3) agentes disgregantes, tales como ácido algínico, Primogel, almidón de maíz, polivinilpirrolidona ligeramente reticulada, almidón de patata, almidón de maíz y almidones modificados, croscarmelosa sódica, crospovidona, glicolato sódico de almidón, y mezclas de los mismos; (4) lubricantes, incluyendo agentes que actúan sobre la fluidez de un polvo a comprimir, y que incluye estearato de magnesio, dióxido de silicio coloidal, tal como Aerosil® 200, talco, ácido esteárico, estearato de calcio, y gel de sílice; (5) deslizantes, tales como dióxido de silicio coloidal; (6) conservantes, tales como sorbato de potasio, metilparabeno, propilparabeno, ácido benzoico y sus sales, otros ésteres de ácido parahidroxibenzoico, tales como butilparabeno, alcoholes, tales como alcohol etílico o bencílico, compuestos fenólicos, tales como fenol, o compuestos cuaternarios tales como cloruro de benzalconio; (7) diluyentes, tales como cargas inertes farmacéuticamente aceptables, tales como celulosa microcristalina, lactosa, fosfato de calcio dibásico, sacáridos, y/o mezclas de cualquiera de los anteriores; ejemplos de diluyentes incluyen celulosa microcristalina, tal como Avicel® PH101 y Avicel® PH102; lactosa, tal como lactosa monohidratada, lactosa anhidra, y Pharmatose® DCL21; fosfato de calcio dibásico, tal como Emcompress®; manitol; almidón; sorbitol; sacarosa; y glucosa; (8) agentes edulcorantes, incluyendo cualquier edulcorante natural o artificial, tal como sacarosa, sacarosa sacarina, xilitol, sacarina sódica, ciclamato, aspartamo, y acesulfamo; (9) agentes aromatizantes, tal como menta, salicilato de metilo, aroma de naranja, Magnasweet® (marca comercial de MAFCO), sabor de chicle, aromas de frutas y similares; y (10) agentes efervescentes, incluyendo parejas efervescentes, tales como un ácido orgánico y un carbonato o bicarbonato. Los ácidos orgánicos adecuados incluyen, por ejemplo, ácido cítrico, tartárico, málico, fumárico, adípico, succínico y algínico y anhídridos y sales de ácido. Los carbonatos y bicarbonatos adecuados incluyen, por ejemplo, carbonato de sodio, bicarbonato de sodio, carbonato de potasio, bicarbonato de potasio, carbonato de magnesio, carbonato de glicina sódica, carbonato de L-lisina y carbonato de arginina. Alternativamente, sólo puede estar presente el componente de bicarbonato sódico de la pareja efervescente.
[0170] En diversas realizaciones, las formulaciones descritas en el presente documento son sustancialmente puras. Tal como se usa en el presente documento, "sustancialmente pura" significa que el principio activo (por ejemplo, un aptámero y/o una construcción de aptámero) es la especie predominante presente (es decir, sobre una base molar es más abundante que cualquier otra especie individual en la composición). En algunas realizaciones, una fracción sustancialmente purificada es una composición en la que el principio activo comprende al menos aproximadamente 50 por ciento (sobre una base molar) de todas las especies macromoleculares presentes. Generalmente, una composición sustancialmente pura comprenderá más de aproximadamente el 80% de todas las especies macromoleculares presentes en la composición. En diversas realizaciones, una composición sustancialmente pura comprenderá al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, o al menos aproximadamente 99% de todas las especies macromoleculares presentes en la composición. En diversas realizaciones, el principio activo se purifica hasta la homogeneidad (las especies contaminantes no pueden detectarse en la composición mediante procedimientos de detección convencionales) donde la composición consiste esencialmente en una única especie macromolecular.
Kits que comprenden aptámeros y construcciones de aptámeros
[0171] La presente descripción proporciona kits que comprenden cualquiera de los aptámeros, y/o construcciones de aptámeros descritos en este documento. Tales kits pueden comprender, por ejemplo, (1) al menos un aptámero y/o construcciones de aptámeros; y (2) al menos un portador farmacéuticamente aceptable, tal como un disolvente o solución. Los componentes adicionales del kit pueden incluir opcionalmente, por ejemplo: (1) cualquiera de los excipientes farmacéuticamente aceptables identificados en este documento, tales como estabilizantes, tampones, etc., (2) al menos un recipiente, frasco o aparato similar para sujetar y/o mezclar los componentes del kit; y (3) aparato de suministro.
Procedimientos de Tratamiento
[0172] La presente descripción proporciona procedimientos de prevención o tratamiento (por ejemplo, el alivio de uno o más síntomas de) afecciones médicas a través del uso de un aptámero o construcción aptámeros de PDGF, un aptámero o construcción de aptámeros de VEGF, y/o una construcción de aptámeros de VEGF/PDGF. Los procedimientos comprenden administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de tales aptámeros y/o construcciones de aptámeros a un sujeto en necesidad del mismo. Los aptámeros descritos también se pueden utilizar para terapia profiláctica. En algunas realizaciones, el aptámero y/o la construcción de aptámeros se administran por vía oral o por vía intravenosa.
[0173] El aptámero y/o construcción de aptámeros usados en procedimientos de tratamiento pueden ser: un aptámero o construcción de aptámeros de PDGF, aptámero o construcción de aptámeros de VEGF y/o una construcción de aptámeros de VEGF/PDGF descritos en este documento, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, o un profármaco de los mismos.
[0174] El individuo o sujeto puede ser cualquier animal (doméstico, animales de granja o salvajes), incluyendo, pero no limitado a, gatos, perros, caballos, cerdos y ganado, y preferiblemente seres humanos. Tal como se utiliza en el presente documento, los términos paciente, individuo y sujeto pueden usarse indistintamente.
[0175] Tal como se usa en el presente documento, "tratar", describe el manejo y cuidado de un paciente con el propósito de tratar una enfermedad, afección o trastorno e incluye la administración de un aptámero y/o una construcción de aptámeros para prevenir la aparición de los síntomas o complicaciones de una enfermedad, afección o trastorno; para aliviar los síntomas o complicaciones de la enfermedad, afección, o trastorno; o para eliminar la presencia de la enfermedad, afección o trastorno en el paciente. Más específicamente, "tratar" incluye invertir, atenuar, aliviar, minimizar, suprimir o detener al menos un síntoma perjudicial o el efecto de un estado patológico (trastorno), progresión de la enfermedad, agente causal de la enfermedad u otra afección anormal. El tratamiento se continúa generalmente, siempre y cuando los síntomas y/o la patología mejoren.
[0176] Tal como se usa en el presente documento, "prevenir" significa la prevención en su totalidad o en parte; mejorar o controlar; reducir, disminuir o decrecer; o retardar o detener.
[0177] En diversas realizaciones, las composiciones y procedimientos descritos se usan para tratar enfermedades cardiovasculares, cánceres, fibrosis, enfermedades renales o enfermedades oftálmicas.
[0178] En algunas realizaciones, los compuestos descritos o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, o profármacos, se pueden administrar en combinación con otros tratamientos que mejoran o erradican las condiciones de la enfermedad como se describe anteriormente. Las composiciones que incluyen aptámeros y/o construcciones de aptámeros descritos pueden contener, por ejemplo, más de un aptámero. En algunos ejemplos, una composición que contiene uno o más aptámeros se administra en combinación con otro agente cardiovascular o agente anticanceroso o agente antifibrótico etc útiles. En general, serán adecuadas las formas de dosificación actualmente disponibles de los agentes terapéuticos conocidos para uso en tales combinaciones.
[0179] "Terapia de combinación" (o "coterapia") incluye la administración de una composición de aptámeros y/o construcción de aptámeros y al menos un segundo agente como parte de un régimen de tratamiento específico destinado a proporcionar el efecto beneficioso de la coacción de estos agentes terapéuticos. El efecto beneficioso de la combinación incluye, pero no se limita a, la coacción farmacocinética o farmacodinámica resultante de la combinación de agentes terapéuticos. La administración de estos agentes terapéuticos en combinación normalmente se lleva a cabo durante un período de tiempo definido (normalmente minutos, horas, días o semanas dependiendo de la combinación seleccionada).
[0180] "Terapia de combinación" puede pretender abarcar, pero generalmente no, la administración de dos o más de estos agentes terapéuticos como parte de regímenes de monoterapia separados que incidental y arbitrariamente dan como resultado las combinaciones de la presente descripción. "Terapia de combinación" pretende abarcar la administración de estos agentes terapéuticos de una manera secuencial, es decir, en el que cada agente terapéutico se administra en un momento diferente, así como la administración de estos agentes terapéuticos, o al menos dos de los agentes terapéuticos, de una manera sustancialmente simultánea. La administración sustancialmente simultánea se puede lograr, por ejemplo, mediante administración al sujeto de una dosis única que tiene una relación fija de cada agente terapéutico o en múltiples dosis individuales para cada uno de los agentes terapéuticos.
[0181] El régimen de dosificación utilizando los aptámeros y/o construcciones de aptámeros se selecciona de acuerdo con una variedad de factores, incluyendo, por ejemplo, el tipo, especie, edad, peso, sexo y estado médico del sujeto; la gravedad de la afección a tratar; la vía de administración; la función renal y hepática del sujeto; y el aptámero y/o construcciones de aptámeros o sales de los mismos particulares empleados. Un médico o veterinario experto puede determinar fácilmente y prescribir la cantidad eficaz de la composición requerida para prevenir, contrarrestar o detener el progreso de la afección.
[0182] En general, la dosificación, es decir, la cantidad terapéuticamente efectiva, varía de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal del sujeto a tratar, por día.
EJEMPLOS
[0183] Los siguientes ejemplos se proporcionan con fines ilustrativos solamente y no pretenden limitar el alcance de la invención, tal como se define por las reivindicaciones adjuntas. Todos los ejemplos descritos en el presente documento se llevaron a cabo usando técnicas estándar, que son bien conocidas y rutinarias para los expertos en la técnica. Las técnicas de biología molecular de rutina descritas en los siguientes ejemplos pueden llevarse a cabo como se describe en manuales de laboratorio estándar, tales como Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, tercera. ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York).
Ejemplo 1. Selección y secuencias de aptámero de PDGF
[0184] Preparación de mezclas de candidatos: Una mezcla de candidatos de oligonucleótidos ssADN parcialmente aleatorizados se preparó mediante extensión por la polimerasa de un cebador de ADN hibridado con una plantilla de ssADN biotinilada.
[0185] Condiciones de SELEX: Los aptámeros para la proteína PDGF-BB (R & D Systems) fueron seleccionados por SomaLogic Inc, tal como se ha descrito (Gold et al (2010) PLoS One 5:e 15004), a partir de una biblioteca que contenía una región aleatoria de 40 nucleótidos en la que Bn-dU fue sustituido por dT. El cebador directo fue 5'-CGCCCTCGTCCCATCTC, y el cebador inverso fue 5'-CGTTCTCGGTTGGTGTTC. La proteína de PDGF-BB se biotiniló y se repartió en partículas de estreptavidina MyOne-SA (Dynal). La selección preferencial de aptámeros con velocidades de disociación lentas se consiguió usando una estimulación cinética en el que los complejos de proteína-ADN se incubaron en presencia de 10 mM de sulfato de dextrano a 37°C con un aumento de los tiempos de incubación y disminución de las concentraciones de proteína en rondas sucesivas. La estimulación cinética se inició en la ronda 4 de la selección y se continuó a través de la 8° ronda final con los siguientes tiempos de incubación: ronda 4 de 5 minutos, rondas 5-7 de 15 minutos, ronda 8 de 30 minutos.
[0186] Secuenciación de grupos : Se clonaron secuencias de oligonucleótidos del grupo de la 8' ronda y se secuenciaron varios clones. Esto condujo a la identificación de una familia de secuencias relacionadas, como se ejemplifica por el 4149-8_1.
[0187] Secuenciación profunda de grupo de PDGF por SELEX: Para evaluar más completamente las secuencias dentro de la familia de aptámeros 4149-8_1, el grupo de la 8 ' ronda se secuenció utilizando la tecnología de pirosecuenciación 454. El ADN del grupo se amplificó con 454 cebadores y el producto de PCR se purificó y se normalizó utilizando una placa de normalización Sequal (Invitrogen, Cat # A10510-01). El eluato se desarrolló en un gel para confirmar el tamaño y la pureza de cada amplicón. El producto de PCR purificado se secuenció en la instalación de pirosecuenciación 454 en la Universidad de Colorado Health Science Center en Aurora CO.
[0188] Las 454 secuencias fueron alineadas con 4149-8_1 mediante análisis de CLUSTAL. El conjunto de datos de secuencia del grupo contenía 10.803 secuencias de longitud completa (es decir, aquellas secuencias que contienen las secuencias de los cebadores) de las cuales 3.839 eran únicas. Estas 3.839 secuencias únicas se analizaron para el motivo "5-ZACNCGCGZZZAZAGCG" (identidad = 0,65) y a continuación "ZZ" (identidad = 1,0) en dirección 5' de esta. Se hallaron 436 secuencias que contenían estos motivos. Además, otras 58 secuencias contenían sólo el primer patrón, pero con una identidad generalmente baja y sin estructura de horquilla evidente en dirección 5'. Las 436 secuencias fueron alineadas de la siguiente manera, (1) con respecto a "ZZ", (2) con respecto al centro del bucle, y (3) con respecto a "ZACNCGCGZZZAZAGCG". Para todas las secuencias, el porcentaje de identidad en cada posición con 4149-8_1 se calculó como se indica en la figura 3A. Las Tablas 1 y 2 enumeran un número de secuencias representativas de la familia de secuencias del aptámero 4149-8_1.
[0189] Síntesis de aptámeros: Los reactivos de desoxiuridina-5-carboxamida amidita modificados utilizados para la síntesis en fase sólida se prepararon mediante: condensación de 5'-O-(4,4'-dimetoxitritilo)-5-trifluoroetoxicarbonil-2'-desoxiuridina (Nomura et al (1997) Nucl Acids Res. 25:. 2784) con la amina primaria apropiada (RNH2 , 1,2 eq; Et3N, 3 eq.; acetonitrilo; 60°C; 4H); 3'-O-fosfitidilación con 2-cianoetil-N, N-diisopropilclorofosforamidita (1,2 eq.; iPr2EtN, 3 eq.; CH2O 2 ; -10 hasta 0°C; 4 h); y la purificación por cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice neutro (Still, et al (1978) J. Org Chem. 43: 2923). Los aptámeros se prepararon mediante síntesis en fase sólida utilizando el procedimiento de la fosforamidita (Beaucage y Caruthers (1981) Tetrahedron Lett. 22: 1859) con algunos ajustes en el protocolo para tener en cuenta las modificaciones de bases únicas descritas en el presente documento. La destritilación se realizó con ácido dicloroacético al 10% en tolueno durante 45 segundos; se consiguió el acoplamiento con 0,1 M de fosforamiditas en 1:1 de acetonitrilo:diclorometano activadas por 5-bencilmercaptotetrazol y se dejó reaccionar 3 veces durante 5 minutos; se realizaron el bloqueo y oxidación de acuerdo a las recomendaciones de los proveedores de los instrumentos. La desprotección se efectuó con 1:1:2 de t-butilamina: metanol: agua (Mullah 1998), se hizo reaccionar durante 24 horas a 37 grados centígrados. Los aptámeros se sintetizaron a una escala de 200 nmol y se purificaron a partir de un gel de poliacrilamida utilizando sombreado UV tal como se ha descrito (Fitzwater y Polisky (1996) Methods Enzymol. 267: 275) con Costar Spin-X (sin incluir lana de vidrio siliconada o prefiltro de polipropileno hilado) y concentración de Amicon YM3 según las recomendaciones del fabricante.
[0190] Relación estructura-actividad de nucleótidos m odificados y maduración por afinidad : Para examinar la contribución de cada una de las ocho cadenas laterales de bencilo a la unión, se realizó otra serie de sustituciones puntuales sistemáticas sintetizando químicamente variantes en la posición 5 con una biblioteca a medida de fosforamiditas dU modificadas. Para este fin, se diseñó una biblioteca que nos permita sondar el microentorno de cada una de las posiciones mediante la variación del tamaño, polaridad, la disposición de los donantes y aceptores de enlaces de H, longitud de enlazador y orientación de los sustituyentes en la posición 5. En la elección de los grupos funcionales para este análisis, se pretendieron incluir variaciones sobre un objetivo de la modificación original (en este caso, el grupo bencilo), cadenas laterales de aminoácidos sobrerrepresentadas en las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de anticuerpos (como triptófano y tirosina) (Mian, IS, et al (1991). J. Mol Biol 217: 133; Ramaraj T. et al (2012) Biochim Biophys Acta 1824: 520), y fragmentos "privilegiados" de fármacos de moléculas pequeñas (Welsch et al (2010) Curr Opin Chem Biol. 14: 347). En un sentido, se han tratado de combinar elementos de la maduración por afinidad en anticuerpos y la optimización de la relación estructura-actividad (SAR) en la química medicinal. Aunque se utilizó un solo nucleótido modificado durante SELEX, la optimización post-SELEX se ve limitada sólo por la accesibilidad sintética de los monómeros modificados y la compatibilidad con la síntesis en fase sólida.
[0191] El efecto de las sustituciones individuales del grupo bencilo con catorce restos alternativos en la posición 5 se resume en las figuras 1C y D, y la figura 6B, con afinidades relativas expresadas como proporciones de la constante de disociación y fosforilación relativa de PDGF Rp expresada como porcentaje de las proporciones de fosfo-PDGF Rp. La sustitución con dT, que sólo tiene un grupo metilo en la posición 5, representa el cambio más drástico, y en ese sentido, es comparable con la mutagénesis de barrido de alanina en las proteínas (Cunningham, BC et al (1989) Science 243: 1330). No es sorprendente que esta fue la sustitución menos tolerada en seis de las ocho posiciones de nucleótidos modificados. Las excepciones fueron los nucleótidos 1 y 7, donde fue bien tolerada esta sustitución. Estas dos posiciones también toleraron muchas otras sustituciones, con algunos reemplazos produciendo una mejora de hasta 5 veces en la afinidad de unión (Figura 6B). En cambio, los nucleótidos 8, 17 y 18 mostraron la mayor sensibilidad a los cambios. Los mejores sustituciones individuales se combinaron después produciendo variantes adicionales incluyendo 4149-8_255 y 4149-8_260 (Figura 6B). El aptámero 4149-8_260, que combinó fenetil-dU (Pe-dU) en el nucleótido 17 y tiofeno-dU (Th-dU) en el nucleótido 18, mostró una excelente unión tanto a PDGF-BB como a PDGF-AB (Figura 6B). Vale la pena señalar que la afinidad del SOMAmer seleccionado originalmente era ya tan alta (Kd = 20 pM) que se aproximaba al límite de detección del ensayo de unión, por lo que es posible que el grado de mejora de afinidad esté subestimado. Hemos aplicado estrategias similares de optimización post-SELEX para otros SOMAmers con una unión inicial más débil (por ejemplo, valores de Kd que van de 100 pM a > 10 nM), y hemos observado mejoras de afinidad de hasta 100 veces.
[0192] Homodímeros de aptámero de PDGF 4149-8_260 (SL5): Dado que el PDGF forma un homodímero unido por enlace covalente y dos SOMAmers se unen a cada homodímero de PDGF, se determinó el efecto sobre la unión de SOMAmers homodimerizados. La afinidad de los homodímeros del aptámero de PDGF podría mejorarse sustancialmente en comparación con la afinidad de los monómeros correspondientes, debido a los efectos de avidez. La estructura cristalina mostró que los extremos 5' del SOMAmer estaban separados 38 Á, mientras que los extremos 3' estaban separados 74 Á. La conexión del extremo 5' a 3' requeriría al menos 63 Á desde el camino más corto entre los dos puntos bisectados de la proteína. Se ordenaron dos tipos de homodímeros basados en la química fácilmente disponible. Estos fueron 1) homodímeros de cabeza a cola conectados por de dos a seis enlazadores de HEG, que proporcionan una distancia de ~ 20 Á por Heg, y 2) homodímeros 3'-3' conectados a través de un soporte doblador sintética, combinado con de una a tres HEG. Los homodímeros de 4149-8_260 se ensayaron en el ensayo de unión a PDGF-BB de Zorbax. El ensayo de unión se realizó con la limitación de la cantidad de SOMAmer y no distinguiría la unión de un SOMAmer por dímero de proteína frente a la unión de dos SOMAmers por dímero de proteína. La estructura de los homodímeros se muestra en la Tabla 1 (secuencias 4149-8_334 a 4149-8_342). Los valores de Kd obtenidos en el ensayo de Zorbax sugirieron que en la configuración 5' a 3', era deseable un enlazador más largo, y produjeron una mejora de hasta 10 veces en la afinidad de unión, como se muestra en la Tabla 1a. En homodímeros ligados la 3'-3', el enlazador más corto en realidad parecía funcionar mejor que el enlazador más largo. Esto fue corroborado por los resultados de fosforilación celular, véase la Tabla 1a.
[0193] Basándose en estas secuencias, una secuencia consenso de ejemplo es:
5'-ZZVCLnGV'ZACNMGCGZZZAZAGCG-3' (SEQ ID NO: 502),
en la que
V se selecciona de A, C o G;
V' se selecciona de C, G o Z, en la que V' es complementaria a V;
N se selecciona independientemente de cualquier nucleótido natural o modificado;
M se selecciona de C o A;
Z se selecciona independientemente de una pirimidina modificada; L es un separador seleccionado de cualquier nucleótido natural o modificado, un enlazador de hidrocarburo, un enlazador de polietilenglicol o una combinación de los mismos; y
n es de 0 a 20;
en el que una o más inserciones de nucleótidos se incluyen opcionalmente.
[0194] Estudios de truncamiento de las secuencias: El truncamiento sistemático de los extremos 5' y 3' de 4149-8_1 se realizó para definir una longitud mínima requerida para retener la actividad de unión completa del aptámero a PDGF-BB humano, como se muestra en la Tabla 3. Se muestran los valores de Kd para un subconjunto de los truncamientos. Z = bencil-desoxiuridina (Bn-dU); A, C, G y T son desoxirribonucleótidos.
Expresión y purificación de proteínas, y formación de complejos de aptámeros
[0195] Para los estudios de cristalografía, la proteína PDGF-BB humana recombinante se adquirió de Creative BioMart (Shirley, NY). La proteína recombinante se expresó en células de E. coli. Se descongelaron soluciones de aptámeros y a continuación se hibridaron mediante calentamiento a ~ 95 °C durante 5 minutos, a continuación, incubación a 40°C durante 5 minutos, a continuación, enfriamiento a temperatura ambiente. La solución de aptámero hibridada se mezcló con proteína en una proporción 1,1:1 de ADN a proteína. El complejo se diluyó 5 veces en tampón que contenía 20 mM de fosfato de Na/K (pH 7) y NaCl 100 mM. La mezcla resultante se concentró a ~ 4 mg/ml en proteína en un filtro centrífugo Amicon de 1,5 ml. La concentración final se estimó a partir del volumen final del producto retenido.
Ejemplo 2. Cristalización y estructura de complejo de aptámero de PDGF
[0196] Los cristales fueron cultivados mediante el procedimiento de difusión de vapor de gota posada en placas Compact Jr. (Emerald Biosystems, WA) fijado a 16°C. Los cristales para la recogida de datos se obtuvieron de un cribado primario (ProPlex, Molecular Dimensions). El cristal para el complejo PDGF-BB:4149-8_255 se cultivó a partir de acetato de magnesio 100 mM, acetato de sodio 100 mM (pH 4,5) y PEG 8000 al 8% (p/v). El cristal para el complejo PDGF-BB: 4149-8_260 se cultivó a partir de acetato de magnesio 100 mM, cacodilato de sodio 100 mM (pH 6,5) y PEG 6000 15% (p/v). Los cristales se recogieron con Litho Loops y se crioprotegieron por transferencia rápida para guardar la solución que contenía etilenglicol al 33% (v/v) antes de enfriamiento rápido al sumergirse directamente en nitrógeno líquido.
[0197] Recogida de datos y determinación de la estructura : Los datos de ambas estructuras se recogieron en la línea de luz 19-ID de Advanced Photon Source (Argonne, IL). Los conjuntos de datos se procesaron utilizando XDS (Kabsch 2010). La estructura del complejo PDGF-BB: 4149-8_260 se sincronizó inicialmente por reemplazo molecular usando Phaser de la suite de software c CP4 (CCP4, 1994) con el modelo de proteína de PDGF a partir de la estructura del complejo PDGF-BB: receptor de PDGF de tipo beta (PDB entrada 3MJG) como modelo de búsqueda. El reemplazo molecular localizó un único monómero de proteína por unidad asimétrica. La inspección de los mapas de densidad electrónica después de una ronda inicial de refinamiento controlado en REFMAC mostró características consistentes con ácido nucleico adyacente a la proteína modelo. El modelo del aptámero se construyó posteriormente a través de un proceso de "bootstrapping", es decir, los modelos parciales fueron sometidos a rondas iterativas de refinamiento; resultando en mapas marginalmente mejorados que permitieron la construcción posterior del modelo. En primer lugar, se construyeron iones fosfato en la densidad del esqueleto de ácido nucleico. En segundo lugar, los fosfatos fueron reemplazados por residuos de dT. Después del refinamiento, los residuos modificados se podían discernir mediante las protuberancias de densidad electrónica de diferencia positiva. La identificación de los residuos modificados facilitó la determinación del registro de secuencias del aptámero, y en los pasos finales los residuos de dT fueron reemplazados por las nucleobases correctas. Todo la construcción manual se realizó utilizando el kit Crystallographic Object-Oriented Toolkit (Fulica) (Emsley y Cowtan, 2004). La estructura de la estructura PDGF-BB: 4149-8_255 se resolvió por reemplazo molecular utilizando el modelo terminado del complejo 4149-8_260.
[0198] En cada estructura, se observó una protuberancia de la densidad eletrónica contigua con la densidad electrónica de átomo de Oy de los residuos Thr88 y Thr90. Aunque se ha descrito la O-manosilación en estos sitios para PDGF-B recombinante expresada en levadura (Settineri, et al., (1990)), hay pocas razones para esperar modificaciones post-traduccionales similares en la PDGF-B expresada en E. coli. Como la densidad electrónica observada sugirió menos de la ocupación completa, los residuos de treonina se modelaron sin ninguna modificación post-traduccional.
[0199] La Tabla 4 da a conocer estadísticas de recopilación de datos y el refinamiento y modelos estadísticos de dos ligandos de aptámero con 4149-8_260 (SEQ ID. NO. 211) y 4149-8_255 (SEQ ID. NO. 207), respectivamente.
[0200] La Tabla 5 ilustra los parámetros de pares de bases para el aptámero de PDGF BB en comparación con ADN en forma B. El aptámero de PDGF BB adopta conformaciones de forma B desviadas en el dominio de tallo bucle 5' y en ambos tallos de miniknot. Cuando sea apropiado, se proporcion los valores medios y las desviaciones estándar (entre paréntesis). Los valores de aptámeros se basan en el análisis utilizando web3DNA (Zheng et al (2009) Nucleic Acids Res. 37: W240) y los valores de ADN-B (como se encuentra en las estructuras cristalinas de alta resolución) se determinaron utilizando 3DNA tal como se describe y se informa en Olson, et al. (2001) J. Mol. Biol. 313 (1): 229.
[0201] Las subunidades monoméricas de PDGF-BB forman láminas 13 torsionadas que dimerizan en una característica de orientación anti-paralela de la familia de nudos de cistina de proteínas (Oefner et al (1992) EMBO J. 11:. 3921). SL5 (4149-8_260) se une a dos sitios homólogos en cualquier extremo del eje largo, cruzando la interfase del homodímero y en contacto con cada uno de los tres bucles de PDGF (Figura 7A). El SOMAmer se compone de dos dominios unidos por una red de interacciones aromáticas hidrófobas (Figura 7B). En el extremo 5', un tallo corto se bloquea con un bucle de Heg (desorganizado en la estructura cristalina), mientras que el resto de la molécula se pliega en un pseudonudo extraordinariamente pequeño de tipo H (Aalberts, DP et al. (2005) Nucleic Acids Res. 33: 2210), agrupándose los nucleótidos modificados en la unión del bucle del tallo/pseudonudo. De forma destacada, los ocho nucleótidos modificados están en contacto con PDGF. Los siete nucleótidos modificados se agrupan a lo largo de un surco hidrofóbico en la proteína, mientras que Bn-DU1 adopta una conformación extendida, siguiendo un canal en la interfase del homodímero de PDGF. Dos nucleótidos naturales también están en contacto con PDGF, contribuyendo los nucleótidos naturales restantes a la estructura interna (Figura 2 y Figura 7). Los elementos de estructura secundaria de SL5, un tallo-bucle y un pseudonudo son motivos estructurales de ácido nucleico bien conocidos. Sin embargo, la sustitución de ciertas bases convencionales por nucleótidos modificados ofrece nuevos grupos funcionales para las interacciones alternativas. Esta característica distintiva de SL5 da lugar a una superficie hidrófoba extensa para la unión de proteínas, así como contactos intramoleculares únicas entre los nucleótidos canónicos y modificados.
[0202] A pesar de que el extremo 3' de SL5 exhibe características distintivas de un pseudonudo de tipo H (Staple, DW et al (2005) PLoS Biol. 3: e213), esta categorización subestima la naturaleza poco convencional de este motivo "miniknot" del patrón. En comparación con el pseudonudo de tipo H más pequeño estructuralmente descrito que requiere 21 nucleótidos (Nonin-Lecomte S. et al (2006) Nucleic Acids Res. 34: 1847), el miniknot SL5 consiste en una estructura de 16 nucleótidos (figura 7B). Además, la supresión del par de bases terminal mG24:dC12 del tallo 2 (S2) da como resultado una afinidad de unión no disminuida (Figura 3), lo que demuestra la integridad funcional de un miniknot de 14 nucleótidos. Con torsiones de la cadena principal sin precedentes y las interacciones de apilamiento, el miniknot representa una nueva variante de pseudonudo en la que se alcanza un tamaño inusualmente pequeño a través de la estabilización contribuida por el empaquetamiento de los restos hidrófobos de los nucleótidos modificados.
[0203] El tallo 1 de minknot (S1) formalmente consiste en sólo dos pares de bases de Watson-Crick (Figura 8A), mientras que el bucle 2 (L2) está compuesta nominalmente de 5 bases, Pe-dU17, Th-dU18, dA19, Bn-dU20 y mA21. Aunque las interacciones entre L2 y S1 son una característica de definición de los pseudonudos, están típicamente limitados a enlaces de H. En cambio, el miniknot de SOMAmer produce interacciones atípicas de apilamiento de bucle a tallo, apoyado por el apareamiento no convencional de bases. En particular, S1 se estabiliza por apilamiento con un par de bases no canónicas Bn-dU17:Bn-dU20 derivadas de L2 (figura 8C y figura 8B), creando efectivamente un S1 de tres pares de bases con una nueva discontinuidad del esqueleto. En contraste con los pares de bases U:U imino carbonilo descritas anteriormente, el par de bases Pe-dU17:Bn-dU20 utiliza un único enlace de H entre N3 de BN-dU17 y el oxígeno del carbonilo en el enlazador amida de Bn-dU20 (Figura 8D). La conformación syn sobre el enlace glicosilo de Bn-dU20 impide el enlace de H con BN-dU17, pero permite que Bn20 se apile con la base Bn-DU8 sin choque estérico con el azúcar de Bn-DU8. El par de bases poco convencional Pe-dU17:Bn-dU20 se hace posible mediante un giro de 280° en la cadena principal entre los nucleótidos 18 y 20 (figura 8C). Esta inversión de cadena drástica permite la apilación de la base Bn-dU20 con el azúcar de dA9 y la formación de un enlace de hidrógeno con Pe-dU17. Es importante destacar que el par de bases Pe-dU17:Bn-dU20 deriva de la estabilización adicional a través de interacciones hidrófobas conferidas por los nucleótidos modificados; la porción de etileno (enlazador) de la cadena lateral de Pe-dU17 se dirige hacia Bn16 (CH::n) mientras que su grupo bencilo se apila en interacciones de borde a cara p-p con Bn2 y Th18 (Figura 8E). Una interacción adicional entre L2 y S1 es una base triple (mA21:dG15: dC10; la figura 8F), un motivo recurrente en pseudonudos (Chen, G. et al (2009) Proc Natl Acad Sci USA. 106: 12706). Esta es la única interacción terciaria de largo alcance en SL5 que no implica los nucleótidos modificados.
[0204] El bucle 1 (L1) consiste en un solo nucleótido extruido, mA11, que permite que el esqueleto haga un giro cerrado de 94°, comprendiendo la distancia de fosfato entre cadenas entre mA11 y dC12 solo 5,9 Á (Figura 8G). Los pseudonudos de tipo H a menudo tienen uno o dos nucleótidos en L1, que normalmente forman enlaces de hidrógeno con S2 y se apilan en la unión helicoidal (Nonin-Lecomte, S. et al (2006) Nucleic Acids Res. 34:. 1847; Michiels, PJ et al (2001) J. Mol Biol 310: 1109). El nucleótido L1 extruido es necesario para mantener la estructura condensada de manera que el dominio del tallo 5' puede interactuar con el miniknot a través de los restos hidrófobos de los nucleótidos modificados. Como era de esperar, la base extruida no se conserva (Figura 3) y puede ser reemplazada con un único separador C3 (Figura 6A), sin embargo, su eliminación abroga la unión, presumiblemente debido a la interferencia con la formación de miniknots.
[0205] Los pares de bases de Watson-Crick de miniknot S1 (dA9:Bn-dU16, dC10:dG15) se ensamblan mediante la disposición de pseudonudos de tipo H favorecida en la que la cadena uno de S2 conduce directamente a la cadena dos de S1, proporcionando un apilamiento eficiente de los tallos (Klein, DJ et al (2009) Nat Struct Mol Biol 16: 343). Los tres pares de bases de S2 se componen enteramente de las interacciones de Watson-Crick y forman una hélice en forma B ligeramente torsionada (Figura 8H). Esta torsión da lugar a parámetros helicoidales que se asemejan más estrechamente a hélices en forma de A, como se esperaba para la topología de pseudonudos; sin embargo, la relevancia de estos cálculos es equívoca dada la corta longitud de las hélices en esta estructura. S2 no forma un apilamiento coaxial convencional con S1 debido a la sobretensión helicoidal severa en la unión (ángulo de torsión de 70 °) formada por dC10:dG15 de S1 y dC14:dG22 de S2. El apilamiento continuo de los tallos sin embargo se mantiene ya que dC14 se apila con dG15 y dG22 se apila con mA21 de la base triple (Figura 8H). La amplia torsión helicoidal en esta unión es necesaria para que mA21 haga un puente con el surco mayor de S2, mientras se amplía el surco menor para la formaciónd e la tripel base. Esta configuración es típica en pseudonudos con uno o dos nucleótidos en L1 (Nonin-Lecomte, S. et al (2006) Nucleic Acids Res. 34: 1847; Michiels, PJ et al (2001) J. Mol Biol 310: 1109).
[0206] El tallo 5' de SL5 se compone de dos pares de bases de Watson-Crick (mA3: Bn-dU7 y dC4:dG6) y un par de bases no canónicas Bn-dU2:Bn-dU8 en la base del tallo (figura 8I). El par de bases Bn-dU2:Bn-dU8 contiene dos enlaces de hidrógeno, un 4-carbonil-N3 típico y un 4-carbonilo único de la base Bn-dU2 al enlazador de amida de la unión Bn-dU8 (figura 8J). El análisis de secuencias relacionadas en el grupo enriquecido por afinidad muestra que la longitud y la composición de bases del tallo 5' puede cambiar, con la notable excepción de la abrazadera invariante Bn-dU:Bn-dU en la base del tallo (figura 3A y B), destacando la importancia de este par de bases no canónicas en la estructura general y la función de SL5. La estabilidad de la hélice del tallo 5' se ve reforzada además por el apilamiento de dU8, Bn20 y Pro82 de PDGF (Figura 9H). Los dominios de tallo-bucle 5' y miniknot de SL5 convergen donde el esqueleto foram una curva brusca de 111°. Los ángulos de torsión y desplazamiento radial significativos de los pares de bases en el tallo 5' da lugar a las bases 2-4 y 6-7 que tienen mayor solapamiento de apilamiento (a causa de la subtorsión de la hélice) que en hélices de forma B convencionales, mientras que la base Bn-dU8 se desplaza hacia fuera y la base Bn-dU7 se apila con el enlazador de amida de Bn-dU8 (Figura 8I). Esta hélice atípica facilita las interacciones críticas con el resto de SL5 y con PDGF; la base Bn-dU8 se apila con Bn20, mientras que Bn8 se encuentra perpendicularmente entre los anillos de Bn16 y Bn20 en interacciones p-p consecutivas de borde a cara. Esta interacción terciaria de largo alcance define una bisagra precisa entre el miniknot y los dominios de tallobucle (Figuras 8L y 8K). La falta de curvatura entre los dos primeros nucleótidos impide choque de la base Bn-dU1 con Bn2, aumentando el apilamiento de los anillos (Figura 8I). Bn2 se encuentra en medio de un grupo hidrófobo creado por Bn7 y Bn8 (del tallo 5') y Bn16, Pe17 y Bn20 (del miniknot) (Figura 7B, Figura 8I y Figura 8K). Este grupo hidrófobo contribuye a la estabilización del SOMAmer, apoyado por la observación de que SL5 exhibe una Tf de 64°C, que es > 30 °C más alta que su análogo que carece de los nucleótidos modificados.
[0207] Además de SL5, también se separó la estructura de SL4 (4149-8_255), que es idéntica a SL5 excepto por la sustitución de Bn-dU8 por isobutil-dU (Ib-dU). Cuando iB-dU8 se combinó con Pe-dU17 y Th-dU18 en la variante SL4, el SOMAmer mostró una unión sustancialmente más débil (~20-50 veces vs. SL5) y una actividad inhibidora 75 veces inferior in vitro (Figura 1A, Figura 1B y Figura 6B). La cadena lateral no aromática más pequeña de isobutilo no puede formar el apilamiento n -n borde a cara energéticamente favorable visto con las cadenas laterales de bencilo de BndU20, Bn-dU8 y Bn-dU16 en SL5 (Figura 8M y Figura 8N). Esto crea un agujero en el centro de la agrupación hidrófoba en la interfase de la proteína, desbloqueando de manera efectiva la bisagra entre el tallo 5' y los dominios miniknot. El efecto estructural de esta sustitución es directamente análoga a una mutación de Phe por Leu en el núcleo hidrófobo de una proteína. Tales mutaciones de proteínas están bien descritas (Kadonosono, T. et al (2003) Biochemistry 42: 10651; Lin, HJ et al (2003) Biochim Biophys Acta 1649: 16; Baase, Wa et al (2010) Protein Sci. 19: 631) y por lo general tienen un efecto desestabilizador significativo. Se conoce que las uniones entre los motivos de estructura secundaria juegan un papel crítico en la determinación de la estructura terciaria de ácido nucleico (Pyle, AM et al (2011) Curr Opin Struct Biol 21: 293).
[0208] A pesar de una afinidad de unión a diana notablemente más débil, SL4 muestra un perfil de fusión térmica similar a SL5 en ausencia de ligando (valores de Tf de 62 °C y 64 °C, respectivamente). Esto es consistente con la idea de que la topología de cavidad y unión alterada creada por la sustitución iB-dU8 en SL4 desestabiliza la interfase de unión a proteínas, mientras que deja las estructuras intradominio del SOMAmer intactas. Las conformaciones de SOMAmers libres en solución pueden ser muy diferentes de las del complejo con la proteína, que también podrían disminuir la relación entre Tf y afinidad de unión. De hecho, puesto que el coste energético de solvatar una superficie hidrófoba grande del SOMAmer es probablemente sustancial, se esperamos que el SOMAmer no complejado se colapse alrededor de las cadenas laterales hidrófobas y adopte una conformación en la que las cadenas laterales hidrofóbicas están protegidas parcialmente del solvente.
[0209] A diferencia de los complejos de proteína:aptámero anteriormente descritos, las interacciones hidrófobas dominan la interfase entre SL5 y p Dg F (figura 2, figura 4 y figura 9). La unión a PDGF-BB crea un área de superficie enterrada de ~1225 Á2 por SOMAmer. Los ocho nucleótidos modificados de SL5 crean una extensa interfase hidrófoba que interactúa con 13 aminoácidos no polares de PDGF (Ala35, Phe37, Leu38, Val39, Trp40, Pro42, Cys52, Cys53, Ile75, Ile77, Pro82, Ile83, y Phe84) , que representan aproximadamente la mitad del total de los contactos no polares, con el resto comprendiendo regiones alifáticas de aminoácidos polares o cargados, tales como Glu24, Arg27, Asn36, Asn54, Asn55, Arg56, Arg73, Lys74, Lys80, Lys85 y Lys86 (Figura 9). A menudo, se observan interacciones similares entre los residuos completamente no polares y restos no polares de aminoácidos cargadosen proteínas. Por lo tanto, la diversidad estructural proporcionada por los nucleótidos modificados en SOMAmers les permite mimetizar el rico repertorio de interacciones accesibles a las proteínas. La notable diferencia en el grado de contactos hidrófobos realizados por el SOMAmer en comparación con aptámeros tradicionales es evidente cuando los átomos de la interfase se muestran en las superficies de las proteínas diana. SL5 muestra notablemente pocas interacciones polares, que tienen sólo seis enlaces de H y una interacción carga-carga con PDGF (Figura 4), a pesar de la proximidad a aminoácidos básicos. En relación con el área de superficie de contacto, esta es significativamente más baja que la que es típica para los aptámeros. El número total de enlaces de H y las interacciones carga-carga (es decir, los contactos polares) para seis aptámeros tradicionales aumenta aproximadamente de forma lineal en proporción directa al área de la interfase (Figura 10A, Figura 22A) con un coeficiente de correlación de 0,91 y un promedio de 1,9 ± 0,4 contactos polares por cada 100 Á2 de área de interfase. SL5, así como dos SOMAmers adicionales en otras estructuras cocristalinas, están claramente fuera de los intervalos de confianza del 99% de esta tendencia, con menos de la mitad del número de contactos polares por área de interfase (promedio de 0,7 ± 0,2 por 100 Á2 de área de interfase), mientras que muestran una tendencia hacia mayores afinidades de unión para sus dianas (Figura 22C). En términos de eficiencia de ligando (energía libre de la unión por átomo de contacto sin hidrógeno) (Kuntz, ID et al (1999) Proc Natl Acad Sci USA 96: 9997), aptámeros y SOMAmers no parecen ser diferentes (Figura 22C), abarcando un intervalo de valores observados con ligandos basados proteínas y en moléculas pequeñas (Wells, JA et al (2007) Nature 450: 1001). Las energías libres de unión por área de interfase también son similares (Figura 22C). Lo que es diferente, sin embargo, es el valor de la energía libre de la unión por contacto polar, que es aproximadamente el doble de grande para SOMAmers que para los aptámeros (Figuras 22 B y C), consistente con la idea de que los SOMAmers derivan una mayor contribución a la unión de las interacciones hidrófobas.
[0210] Las interacciones carga-carga a menudo contribuyen menos de 0,2 kcal/mol a la estabilidad de una proteína plegada (Sali, D. et al (1991) J. Mol Biol 220: 779 En cambio, enterrando un solo grupo metileno se estima que contribuye ~1-1,5 kcal/mol a la estabilidad de la proteína globular y/o interacciones de unión (Kellis, JT, Jr. et al (1988) Nature 333: 784; Pace, CN et al (2011) Mol. Biol. 408: 514). Las estructuras de SOMAmer revelan una fuerte dependencia de las interacciones hidrófobas y, en este sentido, su unión a proteínas se parece más a las interacciones típicas de proteína-proteína. En consonancia con esta observación, la afinidad de SL5 para PDGF no muestra prácticamente ninguna disminución a lo largo de un amplio intervalo de concentraciones de sal (0,1 a 1,0 M de NaCl) o valores de pH (5,0 a 8,8), a diferencia de los efectos observados con aptámeros tradicionales (Ahmad, KM et al (2011) PLoS ONE. 6: e27051; Tang, P et al (2007) J. Colloid Interface Sci 315: 99).
[0211] La optimización post-SELEX facilita el ajuste fino de forma complementaria y las interacciones de empaquetamiento hidrofóbicas. Por ejemplo, la forma complementaria excepcional de Pe-dU17 y Th-dU18 en la interfase de la proteína (Figura 10B) se corrobora con las relaciones estructura-actividad (Figura 6B). Bn-dU1 también forma una interacción única con PDGF-BB, con el anillo de bencilo que se asienta en un túnel formado por el enlace disulfuro de Cys43-Cys52 y un puente salino entre Glu24 de la cadena 1 de PDGF y Arg56 de la cadena 2 (Figura 10C). La estructura cristalina sugiere que el bolsillo de unión puede acomodar una variedad de cadenas laterales, incluyendo sustituyentes bicíclicos más grandes, mejorando de este modo este punto de contacto con la proteína. De hecho, se han identificado varias sustituciones de nucleótidos modificados en esta posición que confieren una mejora de 5 a 10 veces en la afinidad de unión (Figura 6B).
[0212] Una característica notable de la estructura PDGF-BB:SL5 es el grado en el que el SOMAmer mimetiza PDGFR. El receptor se une a PDGF principalmente a través de interacciones hidrófobas, incluyendo siete aminoácidos hidrófobos en la interfase de PDGF (Shim, AH et al (2010) Proc Natl Acad Sci USA. 107: 11 307). El sitio de unión de SL5 se solapa en gran medida el del receptor con los anillos aromáticos Bn-dU ocupando el mismo surco hidrofóbico de la proteína (Figura 11). PDGF contacta el receptor y SL5 con 24 residuos, de los cuales 10 son compartidos. Estos residuos compartidos o "promiscuos" probablemente representan un punto caliente de la energía de unión en la superficie de Pd GF (Wells, JA et al (2007) Nature 450: 1001; Clackson, T. et al (1994) Science 267: 383. Sin embargo, en comparación con PDGF Rp, SL5 muestra una afinidad por PDGF-BB 10 veces mayor (Lokker, NA et al (1997) J. Biol Chem 272: 33037). En concordancia con estas observaciones, SL5 es un inhibidor potente de PDGF-BB (Figura 1B y Figura 6B).
Ejemplo 3 Ensayos de afinidad de unión
[0213] Para la determinación de la afinidad de unión a la diana, los SOMAmers se marcaron en el extremo 5' utilizando T4 polinucleótido quinasa (New England Biolabs) y g-32P-ATP (Perkin Elmer). Los ensayos de unión se realizaron incubando SOMAmer radiomarcado (~20,000 cpm) a una concentración de ~0,03-0,05 nM y proteína diana a concentraciones que varían de 10-7 a 10-12 M en tampón 1XSB18T (HEPES 40 mM, pH 7,5; NaCl 120 mM; KCl 5 mM; MgCl25 mM y Tween-20 al 0,01%) a 37°C durante 30 minutos. Los complejos unidos se mezclaron con resina Zorbax y se capturaron en placas de filtro Durapore. La fracción de SOMAmer unida se cuantificó con un PhosphorImager (FUJI FLA-3000). Los datos de unión originales se corrigieron para la unión no específica de fondo de SOMAmer radiomarcado a la resina Zorbax. Se determinaron las constantes de disociación en equlilbrio (Kd) como se ha descrito previamente (Jellinek et al (1993) Proc Natl Acad Sci 91:11 227). Se incluyó ARNt competidor a una concentración de 200 nM en estudios de especificidad de isoforma, tal como se indica en la figura 5. Para determinar la dependencia de la sal en las interacciones PDGF-BB/SOMAmer y E10030, se realizaron ensayos de unión de afinidad y se analizaron como se ha descrito anteriormente en presencia de Hepes 40 mM pH 7,5, TWEEN-20 al 0,01% y 100 mM, 250 mM , 500 mM, 750 mM o 1,0 M de NaCl). Las representaciones log-log de las concentraciones de sal frente a las constantes de disociación se ajustaron utilizando regresión lineal simple. La pendiente de las representaciones representa el número de contraiones liberados a partir del ADN tras la unión a la proteína, tal como se describe por la teoría de condensación de contraiones de (Manning, GS (1969) J. Chem Phys. 51: 924). La afinidad del aptámero 4149-8_260 (SEQ ID NO. 211) para PDGF mostró poco cambio en un amplio intervalo de concentraciones de sal (0,1 a 1,0 M de NaCl) o valores de pH (5,0 a 8,8), a diferencia de los efectos observados con aptámeros tradicionales (Ahmad, KM et al (2011) PLoS One. 6: e27051; Tang, Q. et al (2007) J. Colloid Interface Sci 315: 99).
Ejemplo 4. Ensayo de fosforilación celular de PDGF-BB
[0214] Actividad de PDGF-BB. Para ensayar la capacidad de SOMAmers de PDGF-BB para inhibir la activación de PDGF Rp, se cultivaron células de fibroblastos de prepucio humano HS27 (American Type Culture Collection) a 5000 células/pocillo en una placa de 96 pocillos y se privaron de suero durante 24 horas. Se incubaron SOMAmers (concentraciones variables tal como se indica en las figuras) con PDGF-BB (20 ng/ml) (Creative BioMart) en medio libre de suero durante 30 minutos a 37 °C, a continuación, el complejo se añadió a las células Hs27 privadas de suero. A los cinco minutos después de la estimulación, se descartó el sobrenadante y las células se lisaron en tampón de lisis # 9 (R & D Systems: 1% NP-40 Alternativa, Tris 20 mM (pH 8,0), NaCl 137 mM, glicerol al 10%, EDTA 2 mM, ortovanadato de sodio activado 1 mM, 10 mg/ml de aprotinina, y 10 mg/ml de leupeptina) en hielo durante 5 minutos. La detección por ELISA de fosfo-PDGF Rp se realizó usando el kit DuoSet fosfo-PDGF Rp (R & D Systems) según las instrucciones del fabricante. El porcentaje de fosfo-PDGF Rp se midió a DO450, corregida para la absorbancia de placa y la señal de fondo con un control no estimulante. Los experimentos se realizaron generalmente por duplicado o triplicado. Los datos se representaron en GraphPad Prism 3.0 y se ajustaron a una curva de competición de un sitio usando regresión no lineal. El gráfico representativo de la determinación de IC50 se muestra en la figura 13 para SOMAmers 4149-8_379 y SOMAmer modificado con enlazador 5'-amino 4149-8_379, con valores de IC50 de 1,6 nM y 1,7 nM, respectivamente.
[0215] Para el cribado de actividad de las variantes del clon 4149-8, se evaluó el porcentaje de inhibición de la fosforilación de PDGF Rp inducida por PDGF-BB en fibroblastos Hs27, en las mismas condiciones descritas anteriormente, pero a una única concentración de variantes SOMAmer (generalmente 20 nM).
Ejemplo 5. Ligandos de PDGF adicionales basados en la modificación Nap-dU
[0216] Para identificar aptámeros adicionales que se unen a PDGF-BB con alta afinidad, se ha realizado otro experimento SELEX con una biblioteca que comprendía nucleótidos modificados con Nap-dU. Las selecciones se llevaron a cabo de una manera sustancialmente análoga a la descrita en el Ejemplo 1 anterior y dio lugar a la identificación del clon de aptámero con Nap-dU 5169-4.
[0217] Secuenciación profunda de grupo de PDGF Nap-dU por SELEX: Para evaluar más completamente las secuencias dentro de la familia de aptámeros 5169-4_1, el grupo de la 7a ronda se secuenció utilizando la tecnología de pirosecuenciación 454. El ADN del grupo se amplificó con 454 cebadores y el producto de PCR se purificó y se normalizó utilizando una placa de normalización Sequal (Invitrogen, Cat # A10510-01). El eluato se desarrolló en un gel para confirmar el tamaño y la pureza de cada amplicón. El producto de PCR purificado se secuenció en la instalación de pirosecuenciación 454 en la Universidad de Colorado Health Science Center en Aurora CO.
[0218] El conjunto de datos de secuencias del grupo contenían 8.273 secuencias de longitud completa (es decir, las secuencias que contenían las secuencias de los cebadores) de las cuales 1.629 eran únicas. Estas 1.629 secuencias únicas se utilizaron para encontrar patrones estadísticamente significativos de n unidades contando todas las posibles n unidades en el conjunto de secuencias, desde 4 unidades a 30 unidades. Mediante la comparación de los recuentos para cada n unidades identificadas con los recuentos esperados al azar para n unidades de un grupo de la misma composición, estadísticamente se encontraron patrones significativos. Se identificaron dos patrones principales en el conjunto de secuencias y se encontró que 5169-4_1 estaba alineado dentro del segundo patrón definido por el motivo de secuencia conservado "APGPAPGCACAPCP" que se encuentra en 11 secuencias. Una búsqueda a través de todas las secuencias únicas para este motivo (identidad = 0,75) encontró 51 secuencias que a continuación fueron alineadas por el motivo. Para todas las secuencias, la identidad fraccional en cada posición en el alineamiento se calculó como se indica en la figura. 14, con la secuencia de consenso indicada.
[0219] Estudios de truncamiento de secuencias: Se realizó un truncamiento sistemático desde los extremos 5' y 3' del clon de 5169-4 de 50 nucleótidos para definir una longitud mínima requerida para retener la actividad de unión completa del aptámero a PDGF-BB humano, tal como se muestra en la Tabla 6. Se muestran los valores de Kd de estos truncamientos (P = naftil-desoxiuridina (Nap-dU); A, C, G y T son desoxirribonucleótidos). El clon 5169-4 resultó ser altamente susceptible a truncamiento y se identificó una secuencia de 21 nucleótidos (5169-4_26) que se unía a PDGF-BB con afinidad de unión mejorada en comparación con la estructura de 50 unidades (17 pM y 29 pM, respectivamente). El 5169-4_26 de 21 unidades contenía 5 nucleótidos modificados con Nap-dU frente a 9 nucleótidos modificados con Nap-dU en la estructura de 50 unidades.
[0220] Sustituciones individuales del separador C3 en 5169-4_26 (21 unidades): La primera ronda de modificaciones post-SELEX del aptámero PDGF-BB con Nap-dU incluyó un tramo separador C3 en todas las posiciones en el 5169-4_26 de 21 unidades. El tramo espaciador C3 pretende identificar bases no requeridas para la unión de alta afinidad que potencialmente podrían eliminarse por completo, sustituirse por el separador C3 u otros enlazadores, tales como enlazadores de hexaetilenglicol (Heg) o enlazadores de polietilenglicol (p Eg ). Los resultados para las sustituciones del espaciador C3 se muestran en la Tabla 7. En esta tabla, "P" indica Nap-dU, "C3" indica espaciador C3; A, C y G indican desoxirribonucleótidos, y "NB" indica sin unión hasta 100 nM de PDGF-BB. Tres sitios toleraron la sustitución de C3 con una modesta disminución en la afinidad de unión: C1, G6 y C7 (la numeración se refiere a la estructura de 21 unidades, tal como se muestra a continuación). Una posición, C15, toleró una sustitución de separador C3 con ningún efecto en la afinidad de unión, en comparación con 5169-4_26.
[0221] Sustituciones individuales con 2'-O-metilo en 5169-4_26 (21 unidades): Las sustituciones con 2'-O-metilo se realizaron en todas las bases naturales con el fin de identificar las posiciones que podrían tolerar esta sustitución resistente a nucleasa. Con la fosforamidita Nap 2'-O-metilo sintetizada en nuestros laboratorios (Nap-mU), también se evaluaron las posiciones de Nap-dU que tolerarían sustituciones individuales de Nap-mU. Además, se sustituyó desoxitimidina (T) por Nap-dU para evaluar la importancia de cada Nap-dU. Los resultados de afinidad de unión se muestran en la Tabla 8 y demuestran que todas las posiciones toleraban sustituciones de 2'-O-metilo en diversos grados. El efecto de las sustituciones de 2'-O-metilo en cada posición de desoxicitidina (C) no dio lugar a ningún cambio en la afinidad de unión, en comparación con 5169-4_26, hasta una disminución de 2 veces en la afinidad de unión. Las cuatro posiciones de desoxiguanosina (G) mostraron resultados variables cuando se sustituyeron por 2'-O-metilo desde 2,5 veces mayor afinidad de unión a G14, a 5,5 veces de disminución de la afinidad de unión a G10, en comparación con 5169-4_26. Las sustituciones con 2'-O-metilo en la seis posiciones de desoxiadenosina (A) tenían de cero a más de 50 veces un efecto adverso sobre la afinidad de unión. Las desoxiadenosinas hacia el extremo 5' del aptámero (A3, A5 y A8) fueron las tres más sensibles a la sustitución con 2'-O-metilo. Sólo Nap-dU en la posición 21 toleró completamente la sustitución con Nap-mU sin ningún efecto en la afinidad de unión mientras que la sustitución con Nap-mU en la posición 11 mostró una disminución de 2,5 veces en la afinidad de unión, en comparación con 5169-4_26. Las sustituciones restantes con Nap-mU dieron lugar a una disminución de 15 a 30 veces en la afinidad de unión. Las únicas sustituciones que eliminaron completamente la unión (en concentraciones de PDGF-BB de hasta 100 nM) fueron las sustituciones con desoxitimidina en las posiciones 12 y 21, teniendo las sustituciones con desoxitimidina restantes un efecto negativo significativo (> 400 veces) en la afinidad de unión. En la Tabla 8, P = dU modificado con 5-naftaleno, un superíndice 1 indica un nucleósido modificado con 2'-O-metilo. A, C, G y T representan los desoxirribonucleótidos de origen natural y "NB" indica ninguna unión hasta 100 nM de PDGF-BB.
[0222] Sustituciones múltiples con 2'-O-metilo en 5169-4_26 (21 unidades). Los efectos combinados de sustituciones con 2'-O-metilo en 5169-4_26 condujeron a la identificación de varias variantes con afinidad de unión mejorada, incluyendo la variante 5169-4_146. Esta estructura de 21 unidades tiene 11 posiciones que están protegidas de la nucleasa por 2'-O-metilo y su afinidad de unión es al menos 20 veces mayor que la forma truncada original, 5169-4_26 (0,60 pM vs 17 pM, respectivamente). Muchas otras variantes también tuvieron una mejoría significativa (aproximadamente 3 veces) en la afinidad de unión con combinaciones de 3 a 102'-O-metilos. En la Tabla 9, P = dU modificado con 5-naftaleno, un superíndice 1 indica un nucleósido modificado con 2'-O-metilo, A, C y G representan los desoxirribonucleótidos de origen natural y "NB" indica ninguna unión hasta 3,2 nM de PDGF-BB.
Ejemplo 6. Ensayo de actividad del aptámero de PDGF Nap-dU
[0223] Para analizar el impacto inhibidor de los aptámeros de PDGF Nap-dU sobre la activación de PDGF Rp , se realizaron ensayos de inhibición de fosforilación celular como se describe en el Ejemplo 4. Las cuatro secuencias de aptámeros ensayadas inhibieron la activación PDGF Rp con valores de IC50 valores tal como se indica a continuación: 5169-4_26, IC50 = 1,6 nM; 5169-4_84, IC50 = 3,3 nM; 5169-4_85, IC50 = 7,3 nM; 5169-4_112, IC50 = 1,0 nM.
Ejemplo 7. Selección y secuencias de aptámeros de VEGF
[0224] Preparación de mezclas de candidatos: Una mezcla de candidatos de oligonucleótidos ssADN parcialmente aleatorizados se preparó mediante extensión por la polimerasa de un cebador de ADN hibridado con una plantilla de ssADN biotinilada.
[0225] Condiciones de SELEX de VEGF: Los aptámeros para la proteína VEGF-121 humana recombinante (ambos de R & D Systems) fueron seleccionados por SomaLogic Inc, tal como se ha descrito (Gold et al (2010) PLoS One 5:e 15004), a partir de una biblioteca que contenía una región aleatoria de 40 nucleótidos en la que Nap-dU fue sustituido por dT. Para VEGF-121 el cebador directo fue 5'-GCCACACCCTGCCCTC-3' y el cebador inverso fue 5'-GAGGACACAGACAGACAC-3'. La proteína VEGF-121 se biotiniló y se repartió en partículas de estreptavidina MyOne-SA (Dynal). La selección preferencial de aptámeros con velocidades de disociación lentas se consiguió usando una estimulación cinética en la que los complejos de proteína-ADN se incubaron en presencia de 10 mM de sulfato de dextrano a 37°C con un aumento de los tiempos de incubación y disminución de las concentraciones de proteína en rondas sucesivas. En el SELEX de VEGF-121, las rondas 4 y 5 incluían una estimulación cinética de 15 minutos mientras que las rondas 6 y 7 (ronda final) incluían una estimulación cinética de 30 minutos.
[0226] La forma alternativamente cortada y empalmada más pequeña del factor de crecimiento endotelial vascular, VEGF-121, es una proteína diana difícil para SELEX. Con las bibliotecas de ADN o ARN de origen natural, o con bibliotecas de ácidos nucleicos modificados en la posición 2' de la ribosa, previamente no se ha conseguido la obtención ni de un grado modesto de mejora de la afinidad. Esto es destacable por dos razones. En primer lugar, entre los miembros de la superfamilia de nudos de cistina, VEGF-121 tiene la mayor similitud estructural con PDGF-BB, con una desviación de raíz cuadrada media de 1,9 Á para 124 átomos Ca (Muller et al., 1997). En segundo lugar, la isoforma VEGF más grande y más prevalente, VEGF-165, ha demostrado ser una buena diana para SELEX. Por ejemplo, pegaptanib (Macugen), el único agente terapéutico que ha recibido la aprobación regulatoria hasta la fecha (para el tratamiento de la degeneración macular), se une sólo a VEGF-165 a través del dominio codificado por el exón 7 de unión a heparina, que está carente de VEGF-121 (Lee et al, 2005; Ruckman et al, 1998). Una diferencia entre VEGF-121, VEGF-165 y PDGF-BB es la carga global, con valores de pl de 5,8, 8,5 y 10,1, respectivamente. Esto apunta a la importancia de las interacciones polares en la unión a aptámeros. El enriquecimiento por afinidad exitoso para VEGF-121 finalmente se consiguió con una biblioteca SELEX Nap-dU.
[0227] Identificación de secuencias de aptámero de VEGF-121: Se identificaron dos variantes de afinidad altas muy relacionadas que difieren en una única posición (4867-15 y 4867-31) a partir de un experimento SELEX de Nap-dU realizado, tal como se describe anteriormente. El clon 4867-31 se ha truncado en una estructura de 29 unidades en una serie de experimentos de deleción (Tabla 7). Vale la pena señalar que el truncamiento de los dos clones de afinidad alta (4867-15 y 4867-31) da lugar a la misma estructura de 29 unidades, ya que la única diferencia de nucleótido está fuera del límite 5' de la secuencia mínima. Variantes truncadas que abarcan la secuencia más corta con alta afinidad de unión, 4867-31_143 de 29 unidades (5'-CCGPP CAAGP GCp Pg PAGGA PPPAA APGG-3'; donde "P" es la designación de una sola letra para Nap-dU) y sus variantes próximas, se unen a VEGF-121 humano, VEGF-165 humano, VEGF-120 de ratón y VEGF-164 de rata con afinidades comparables, que varían de 0,1 a 1 nM (Tabla 10). En esta tabla, "P" indica Nap-dU; A, C, y G indican los desoxirribonucleótidos de origen natural y "NB" indica ninguna unión de hasta 100 nM VEGF.
[0228] Sustituciones individuales del separador C3 en 4867-15_2 (50 unidades). La primera ronda de modificaciones post-SELEX del aptámero de VEGF-121 fue un tramo separador C3 en todas las posiciones en el 4867-15_2 de 50 unidades (50 unidades truncadas). El tramo separador C3 pretende identificar bases no requeridas para la unión de alta afinidad que potencialmente podrían eliminarse por completo, sustituir por el separador C3 u otros enlazadores, tales como enlazadores de hexaetilenglicol (Heg) o polietilenglicol (PEG). Los resultados para las sustituciones de separadores C3 se muestran en la Tabla 11. En esta tabla, "P" indica Nap-dU, "V" indica separador C3; A, C, y G indican los desoxirribonucleótidos de origen natural y "NB" indica ninguna unión de hasta 100 nM VEGF. Al menos tres sitios internos toleraban la sustitución de C3: C17, G26 y G29 (la numeración se refiere a la estructura de 50 unidades, tal como se muestra a continuación).
[0229] Sustituciones individuales de 2'-O-metilo en 4867-31_43 (32 unidades). Se realizaron sustituciones de 2'-O-metilo en bases naturales con el fin de identificar las posiciones que podrían tolerar esta sustitución resistente a nucleasa. Además, 2'-OMe-uridina (2'-OMeU) fue sustituida por Nap-dU para evaluar la importancia de cada NapdU. Además, se ensayaron los separadores C3 en ciertas posiciones internas hipotéticas de ser bases extruidas, ahora en el contexto de la estructura de 32 unidades. Se ensayaron también deleciones internas y bases alternativas a cada una de las tres posiciones. Los datos de afinidad de unión y de inhibición del cultivo de células para ciertos SOMAmers (concentración única de 20 nM) se muestran a continuación. Los resultados se muestran en la Tabla 12, y demuestran que C8 (C17 en la Tabla 11) no toleraba completamente la sustitución a C3 en el contexto del truncado más corto. Las otras dos bases extruidas posibles (G17 y G20) retienen una buena actividad de unión y funcional como C3 o sustituciones de bases alternativas en este contexto. Las deleciones internas en esas posiciones no eran toleradas. Ninguna de las modificaciones de Nap-du pudo sustituirse por 2'OMe-U en este experimento. Sin embargo, varios sitios internos toleraron modificaciones de 2'OMe. En la Tabla 12, P = dU modificado con 5-naftaleno y un superíndice 1 indica un nucleósido modificado con 2'-OMe, V = separador de 3 carbonos, y una caja vacía indica una deleción nucleósido. A, C, G y U representan los desoxirribonucleótidos de origen natural.
[0230] Sustituciones de Nap-dU con 2'-O-metilo y múltiples sustituciones de 2'-O-metilo en 4867-31_143 (29 unidades). Con la fosforamidita Nap con 2'-O-metilo sintetizada en nuestros laboratorios (Nap-mu), se evaluaron las posiciones de Nap-dU que tolerarían sustituciones individuales Nap-mU. Además, se han probado combinaciones de sustituciones con 2'OMe y enlazador C3 en cada una de las bases naturales. Los datos de inhibición de la afinidad de unión y del cultivo celular para ciertos SOMAmers (concentración única de 20 nM) se muestran a continuación. Tal como se muestra en la Tabla 13 a continuación, la mayor parte de los residuos de Nap-dU no toleraban la sustitución con OMe, pero la sustitución de Nap-mU por Nap-dU en la posición 22 produjo un aumento de 10 veces en la afinidad, y una excelente actividad inhibidora. En esta tabla, el superíndice "1" indica sustitución con 2'-O-metilo, "V" indica separador C3. Las combinaciones de 2'-OMe fueron en su mayoría bien toleradas en base a la afinidad, pero ciertas combinaciones mostraron una pérdida notable de actividad inhibidora.
[0231] Los efectos combinados de las sustituciones de 2'-O-metilo y C3 condujeron a la identificación de varias variantes con afinidad de unión mejorada, incluyendo la variante 4867-31_188. Esta estructura de 29 unidades tiene 10 posiciones que están protegidas de nucleasa por cualquiera de 2'OMe o C3 y su afinidad de unión es aproximadamente 3 veces más fuerte que la forma truncada original, 4867-31_143 (38 pM vs 140 pM, respectivamente). La variante 4867-31_188 retiene la actividad de inhibición celular comparable con respecto al SOMAmer original. Véase la Tabla 13.
[0232] La única posición que toleró Nap-mU fue el nucleótido 22 (usando 4867-31_143 truncado como la secuencia original). Esta sustitución de Nap-mU se colocó a continuación en la base del SOMAmer 2'OMe mejor combinado, 4867-31_188. Además, la sustitución de la dG original en la posición 15 por un separador C3 se comparó con la sustitución con 2'OMe en esa posición para examinar la posibilidad de que la base protegida de nucleasa pudiera añadir rigidez a la molécula y por lo tanto aumentar la unión. El mejor resultado agregado se obtuvo con la variante 4867-31_192, que ahora tiene 9 posiciones protegidas en comparación con la variante truncada original de 29 unidades 4867-31_143 (véase la Tabla 14 a continuación; superíndice "1" indica sustitución con 2'-O-metilo y "V" indica separador C3).
[0233] Relación estructura-actividad de nucleótidos modificados y la maduración por afinidad : Para examinar la contribución de cada una de las diez cadenas laterales de naftilo a la unión, se realizó otra serie de sustituciones puntuales sistemáticas sintetizando químicamente variantes de la posición 5' con una biblioteca a medida de fosforamiditas de dU modificadas. Para este fin, se diseñó una biblioteca que permita sondear el microentorno de cada una de las posiciones mediante la variación del tamaño, polaridad, la disposición de los donantes y aceptores de enlaces de H, longitud del enlazador, y la orientación de los sustituyentes en la posición 5. En la elección de los grupos funcionales para este análisis, se pretendió incluir variaciones sobre un punto de la modificación original (en este caso, el grupo naftilo), cadenas laterales de aminoácidos sobrerepresentadas en las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de anticuerpos (como triptófano y tirosina) (Mian, ES et al (1991). J. Mol Biol 217:133; Ramaraj, T. et al (2012) Biochim Biophys Acta 1824: 520), y fragmentos "privilegiados" de fármacos de molécula pequeña (17). La figura 15 muestra los resultados de estas sustituciones, representados como la relación de valores de Kd (sustituido/no sustituido). De las 17 diferentes sustituciones de modificación ensayadas en cada una de las diez posiciones Nap-dU, sólo cuatro sustituciones (Trp-dU 27, NE-dU 16, MBn-dU 10 y BT-dU 16) tenían poco o ningún efecto de la afinidad de unión. Todas las demás sustituciones dieron lugar a una afinidad de unión más débil, en diversos grados.
[0234] Secuenciación profunda de grupo de VEGF por SELEX: Para evaluar más completamente las secuencias dentro de la familia de aptámeros 4149-8_1, el grupo enriquecido se secuenció utilizando la tecnología de pirosecuenciación 454. El ADN del grupo se amplificó con 454 cebadores y el producto de PCR se purificó y se normalizó utilizando una placa de normalización Sequal (Invitrogen, Cat # A10510-01). El eluato se desarrolló en un gel para confirmar el tamaño y la pureza de cada amplicón. El producto de PCR purificado se secuenció en la instalación de pirosecuenciación 454 en la Universidad de Colorado Health Science Center en Aurora CO.
[0235] Las 454 secuencias se alinearon con 4867-31 mediante análisis CLUSTAL. El conjunto de datos de las secuencias del grupo contenía 13.139 secuencias de longitud completa (es decir, aquellas secuencias que contienen ambas secuencias de los cebadores) de las cuales 2.235 eran únicas. En estas 2.235 secuencias únicas se buscó el motivo 5'-CCGPP CAAGP GCPPG PAGGA PPPAA APGG-3'. Se encontraron 86 secuencias que contenían estos motivos. Para todas las secuencias, el porcentaje de identidad en cada posición con 4867-31 se calculó como se indica en la figura 16.
Ejemplo 8. Ensayos de afinidad de unión a VEGF
[0236] Para la determinación de la afinidad de unión a la diana, se marcaron SOMAmers en el extremo 5' utilizando T4 polinucleótido quinasa (New England Biolabs) y g-32P-ATP (Perkin Elmer). Los ensayos de unión se realizaron incubando SOMAmer radiomarcado (-20.000 c.p.m.) a una concentración de -0,03 a 0,05 nM y proteína diana a concentraciones comprendidas entre 10'7 y 10'12 M en tampón 1XSB18T (HEPES 40 mM, pH 7,5; NaCl 120 mM; KCl 5 mM; MgCh 5 mM y Tween-20 al 0,01%) a 37 °C durante 30 minutos. Los complejos unidos se mezclaron con resina Zorbax y capturaron en placas de filtro Durapore. La fracción de SOMAmer unida se cuantificó con un PhosphorImager (FUJI FLA-3000). Se corrigieron los datos de unión iniciales para la unión original no específica de SOMAmer radiomarcado a la resina Zorbax. Se determinaron las constantes de disociación en equilibrio (Kd) como se ha descrito previamente (Jellinek et al (1993) Proc Natl Acad Sci. 90: 11227).
Ejemplo 9. Ensayo de actividad de VEGF
[0237] Para analizar el impacto inhibidor de SOMAmers de VEGF121 en la actividad de la quinasa celular de VEGF-R2 (receptor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular), se utilizaron células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) (Lonza, #CC-2519), que expresa endógenamente un alto nivel de VEGF-R2. Las células HUVEC se sembraron en EGM-2 (medio de crecimiento de células endoteliales) suplementado con EGM-2 BulletKit (# CC-3162) que contenía 2% de FBS, factores de crecimiento (hEGF, hidrocortisona, VEGF, hFGF-B, R3-IGF-1), heparina, ácido ascórbico y GA-1000 (gentamicina, anfotericina-B). Cuando las células HUVEC alcanzaron 70 a 80% de confluencia, se sembraron en placa de 24 pocillos (105 células/pocillo) y se dejaron sin alimento durante la noche con medio libre de suero.
[0238] Se añadieron SOMAmers (una sola concentración a 20 nM o un intervalo de concentraciones) a los cultivos con 20 ng/ml (1 nM) de VEGF-121 (R&D System, # 4464-VS) que contenía 1% de BSA a 37 °C durante 30 minutos. Las células se lavaron en PBS dos veces y se estimularon con el complejo de VEGF-121/SOMAmers preincubado durante 5 minutos. Las células tratadas se lavaron de nuevo con PBS dos veces y se añadió tampón de lisis enfriado con hielo (1% NP-40 Alternativo, Tris 20 mM (pH 8,0), NaCl 137 mM, glicerol al 10%, EDTA 2 mM, 1 mM de ortovanadato de sodio activado, 10 mg/ml de aprotinina y 10 mg/ml de leupeptina suplementada con un inhibidor de fosfatasa Halt (Thermo Scientific, # 78428). Se midieron los lisados celulares para la fosforilación de VEGF-R2 usando el kit fosfo-VEGF R2/KDR humano (R&D, DYC 1766-2).
[0239] En los experimentos de actividad funcional in vitro, diversas variantes truncadas del clon 4867-31 a una concentración de cribado de 20 nM son capaces de inhibir esencialmente completamente la fosforilación de VEGFR2 inducida por VEGF-121 o VEGF-165 (1-4 nM) en células endoteliales de vena umbilical humanas inmortalizadas o primarias (HUVEC). Una gráfica representativa de la determinación de IC50 se muestra en la figura 17 para los aptámeros de VEGF 4867-31_43 y 4867-31_192, con valores de IC50 de 2,2 nM y 2,1 nM, respectivamente.
[0240] Para el cribado de actividad de las variantes del clon 4867-31, hemos evaluado el porcentaje de inhibición de la fosforilación de VEGF R2 inducida por VEGF en HUVEC, en las mismas condiciones que las descritas anteriormente, pero a una única concentración de variantes SOMAmer (generalmente 20 nM).
Ejemplo 10. Construcciones de homodímeros de aptámeros de PDGF y VEGF
[0241] Tanto PDGF-BB como VEGF son homodímeros unidos por disulfuro que ejercen sus efectos biológicos mediante dimerización de sus receptores de tirosina quinasa que conducen a la autofosforilación del receptor y la transducción de señales. Si más de un aptámero puede unirse a su proteína diana, como es el caso con el aptámero de PDGF-BB 4149-8_260 (basado en las estructuras cristalinas), tales aptámeros se pueden enlazar de forma covalente en una construcción multimérica de una manera que permite la unión simultánea de subunidades de aptámero individuales a la proteína. Esto puede llevar a una mejora en la afinidad por efecto de avidez. Se sintetizaron dos tipos de homodímeros basado en la química fácilmente disponible. Estos fueron 1) homodímeros de cabeza a cola unidos por cero a seis enlazadores de HEG, que proporcionan una distancia de ~ 20 Á por Heg, y 2) homodímeros 3'-3' conectados a través de un soporte doblador sintético, combinados con una a tres HEG en cada lado (es decir, dos, cuatro o seis HEG en total en el dímero). Los homodímeros de 4149-8_379, 5169-4_26 y 4867-31_192 se ensayaron en un ensayo de unión competitiva. Para la determinación de las afinidades de unión a competidor, los ligandos de aptámeros se marcaron en el extremo 5' utilizando T4 polinucleótido quinasa (New England Biolabs) y g- 32P-ATP (Perkin Elmer). Los ensayos de competición se llevaron a cabo mediante premezcla de una concentración fija de ligando radiomarcado (1,0 nM) con concentraciones variables de aptámero competidor (10' 11 a 10' 6 M). Las diluciones de ligandos y competidor se incubaron con la proteína diana (100 pM) en tampón 1XSB18T (HEPES 40 mM, pH 7,5; NaCl 120 mM; KCl 5 mM; MgCl25 mM y Tween-20 al 0,01%) a 37 °C durante 60 minutos. Los complejos unidos se mezclaron con resina Zorbax y capturaron en placas de filtro Durapore. La fracción de ligando unido se cuantificó con un PhosphorImager (FUJI FLA-3000). Los datos de unión iniciales se normalizaron a la unión sin adición de competidor. Los datos se representaron en GraphPad Prism 3.0 y ajustaron a una curva de competición de un sitio usando regresión no lineal para determinar las constantes de disociación en equilibrio para los aptámeros competidores (Ki). Homodímeros de PDGF: La estructura de los homodímeros de PDGF de secuencias 4149-8_379 (secuencias 4149-8_438 a 4149-8_447) y 5169-4_26 (secuencias 5169-4_134 a 5169-4_143) se muestran en la Tabla 15. Para los homodímeros basados en 4149-8_379, los valores de Ki obtenidos en el ensayo de competición sugirieron que en la configuración 5' a 3', un enlazador más largo era deseable, ya que se midió una mejora mayor que 10 veces en la afinidad de unión con cinco enlazadores de Heg en comparación con ningún enlazador de Heg (0,25 pM vs 4,2 pM, respectivamente). En los homodímeros 4149-8_379 unidos en 3' a 3', los cuatro y seis enlazadores de Heg más largos también actuaron por lo menos 10 veces mejor que sin enlazador y aproximadamente 2 veces mejor que los dos enlazadores de Heg. Para los homodímeros basados en 5169-4_26, los valores de Ki indicaron que un enlazador de Heg más largo era ventajoso en la configuración 5' a 3', ya que la K¡ mejoró de 28 pM para no enlazador de Heg a 3,6 pM para seis enlazadores de Heg. No hubo diferencia en los valores de K¡ para cinco y seis enlazadores de Heg en la configuración 5' a 3'. En los homodímeros basados en 5169-4_26 unidos de 3' a 3' se observó el mismo patrón, con la Ki que mejora a medidad que aumenta la longitud del enlazador de Heg. El enlazador de seis Heg mostró una mejora de 5 veces en la Ki en comparación con ningún enlazador de Heg (2,0 pM vs. 11 pM, respectivamente). En las Tablas 15 y 16, Z = bencil-desoxiuridina (Bn-dU), P = dU modificado con 5-naftaleno (Nap-dU), M = metilendioxibencildU (MBn-dU), un superíndice 1 indica un nucleósido modificado con 2'-O-metilo, no superíndice indica desoxirribonucleótidos, "C3" indica un enlazador de tres carbonos y "H" indica un enlazador de hexaetilenglicol.
Ejemplo 11. Construcciones de aptámeros de heterodímeros de PDGF/VEGF
[0242] Heterodímeros basados en el aptámero de PDGF 4149-8 y el aptámero de VEGF 4867-31. Con el objetivo de desarrollar construcciones con especificidad por PDGF y VEGF, hemos diseñado y probado una variedad de construcciones de aptámeros que comprenden un aptámero de VEGF unido a un aptámero de PDGF. Las primeras construcciones de aptámeros ensayadas combinaron la variante de PDGF 4149-8_273 y VEGF 4867-31_183. Las construcciones de aptámeros se sintetizaron de cabeza a cola, conectadas por cero a tres enlazadores de hexaetilenglicol (HEG), en ambas orientaciones (con el aptámero de PDGF en el extremo 5' o aptámero de VEGF en el extremo 5'). Los resultados se muestran en la Tabla 17 y 18 a continuación. En la Tabla 17, "Z" indica Bn-dU, "P" indica Nap-dU, superíndice "1" indica sustitución con 2'-O-metilo, no superíndice indica desoxirribonucleótidos, "V" indica separador C3 y "H" indica enlazador de hexaetilenglicol (Heg). En la Tabla 18, el porcentaje de actividad restante indica los niveles de fosforilación de PDGF bR fraccionario en fibroblastos Hs27 en presencia de 20 nM de aptámero con respecto al control (sin aptámero).
[0243] En base a la afinidad de unión por PDGF-BB, -AB, VEGF-121, y VEGF-165, la construcción de aptámero 4149-8_320 pareció dar los mejores resultados en este experimento. También probamos las construcciones de aptámeros en el ensayo de fosforilación celular de PDGF, tal como se muestra en la Tabla 18. Basándose en los datos del ensayo funcional, todas las construcciones de aptámeros probadas inhibieron la fosforilación de PDGF pR inducida por PDGF-BB en fibroblastos Hs27. Las construcciones de aptámeros 4149-8_313, 4149-8_314, 4149-8_315, 4149-8_316, 4149-8_319 y 4149-8_320 inhibieron la fosforilación de PDGF pR inducida por PDGF-BB con valores de IC50 de <20 nM. Las construcciones de aptámeros 4149-8_317 y 4149-8_318 tenían valores de IC50 de -20 nM.
[0244] Se sintetizó 4149-8_401, basado en la configuración de 4149-8_320 (5'PDGF-3Heg-VEGF3'), que comprendía el aptámero de PDGF 4149-8_379 y el aptámero de VEGF 4867-31_192. Véase la Tabla 19. En esta tabla, "Z" indica Bn-dU, "P" indica Nap-dU, M indica MBn-dU, superíndice "1" indica sustitución con 2'-O-metilo, sin superíndice indica desoxirribonucleótidos, "C3" indica separador C3 y '”H” indica enlazador de hexaetilenglicol (Heg). La construcción de aptámeros 4149-8_401 mostró afinidad de unión por PDGF-BB y VEGF121 que era equivalente o mejor que la afinidad de unión de su construcción de aptámeros precursora, 4149-8_320. Véase la Tabla 20.
[0245] Las construcciones de aptámeros 4149-8_320 y 4149-8_401 inhibieron la fosforilación de PDGF-Rp inducida por PDGF-BB en fibroblastos Hs27 con valores de IC50 de aproximadamente 1 nM y 5 nM, respectivamente. Además, la construcción de aptámeros 4149-8_401 que comprende un enlazador 5' amino conjugado a PEG de 20 kDa o 40 kDa, mantuvo la capacidad de inhibir la la fosforilación de PDGF pR inducida por PDGF-BB en fibroblastos Hs27 con valores de IC50 de aproximadamente 1 nM. Estos resultados son consistentes con la titulación/inhibición estequiométrica de todos los PDGF en el ensayo (monómero de 1 nM).
[0246] Se ensayó otro conjunto de construcciones de aptámeros que comprendían los aptámeros 4149-8_379 y 4867-31_192 para determinar el efecto de la longitud total enlazador y la orientación de los aptámeros de PDGF y VEGF. Véase la Tabla 21, a continuación. Con VEGF en el extremo 5', se ensayaron de uno a seis enlazadores de Heg. Con PDGF en el extremo 5', se ensayaron de dos a seis enlazadores de Heg, incluyendo 4149-8_401, que tiene tres enlazadores de Heg. Una variante del enlazador de Heg no se ensayó en esta orientación porque mostró una unión algo reducida en una variante relacionada 4149-8_318. Los datos de unión se muestran en la Tabla 16. La mayor parte de las construcciones de aptámeros tuvieron buen rendimiento, con la excepción de 4149-8_408 y 4149-8_409, que mostraron una afinidad algo más débil para PDGF-BB. La afinidad de unión del aptámero de Ophthotech E10030 (Fovista) se incluye para comparación.
[0247] La capacidad de la construcción de aptámeros 4149-8_401 para inhibir la actividad de PDGF y VEGF in vitro se ensayó en los experimentos de fosforilación del receptor, tal como se ha descrito anteriormente. La construcción de aptámero 4149-8_401 inhibió la fosforilación de PDGF-Rp inducida por PDGF en fibroblastos Hs27 con una potencia comparable a la del monómero de PDGF 4149-8_379 (valores de IC50 de 2,4 nM y 1,7 nM, respectivamente). Del mismo modo, la construcción de aptámeros 4149-8_401 inhibió la fosforilación de VEGFR2 inducida por VEGF en células HUVEC con una potencia comparable a la del monómero de VEGF 4867-31_192 (valores de IC50 de 0,7 nM y 2,1 nM, respectivamente). La figura 18 muestra los resultados de ese experimento. La figura 18A muestra (A) la inhibición de la fosforilación PDGF Rp inducida por PDGF en fibroblastos Hs27 con el aptámero de PDGF 4149-8_379 (círculos abiertos) y la construcción de aptámeros de PDGF/VEGF 4149-8_401 (círculos cerrados), y (B) la inhibición de la fosforilación de VEGFR2 inducida por VEGF en HUVEC con el aptámero de VEGF 4867-31_192 (círculos abiertos) y la construcción de aptámeros de PDGF/VEGF 4149-8_401 (círculos cerrados).
[0248] Heterodímeros basados en el aptámero de PDGF 5169-4 y aptámero de VEGF 4867-31. Se diseñaron y ensayaron construcciones de heterodímero adicionales basados en las variantes del aptámero de PDGF 5169-4_26 y el aptámero de VEGF 4867-31_192. Las construcciones de aptámeros se sintetizaron de cabeza a cola, conectados por uno a seis enlazadores de hexaetilenglicol (Heg), en ambas orientaciones (ya sea con el aptámero de PDGF en el extremo 5' o con el aptámero VEGF en el extremo 5'). Los resultados se muestran en la Tabla 22. Con VEGF en el extremo 5', los enlazadores de Heg entre tres y seis dieron lugar a las más altas afinidades. Las afinidades en general fueron ligeramente inferiores cuando la secuencia del aptámero de VEGF-121 estaba en el extremo 3', con la mayoría de valores de Kd en el intervalo de 100-300 pM, a excepción de la secuencia de cinco enlazadores de Heg que tenía una Kd de 56 pM. Con PDGF en el extremo 5', los valores de Kd variaron de 11 pM para tres enlazadores de Heg a 0,54 pM para cuatro enlazadores de Heg, cayendo los valores restabntes de Kd entre para todas las demás longitudes de enlazadores de Heg. Cuando el PDGF estaba en el extremo 3' hubo una tendencia hacia una mayor afinidad de unión a medida que aumentaba la longitud del enlazador, con un enlazador de Heg que tenía una Kd de 5,3 pM y seis enlazadores de Heg que tenía una Kd de 0,20 pM. En la Tabla 22, "P" indica Nap-dU, el superíndice "1" indica sustitución con 2'-O-metilo, sin superíndice indica desoxirribonucleótidos y "H" indica enlazador de hexaetilenglicol (Heg).
Ejemplo 12. Unión simultánea de construcciones de aptámeros de PDGF/VEGF a VEGF y PDGF
[0249] Para demostrar la capacidad de las construcciones de aptámeros de PDGF/VEGF para unirse a VEGF y PDGF de forma simultánea, se desarrolló un ensayo de tipo sándwich. Brevemente, se recubrieron placas Nunc Maxisorp® con PDGF-BB humano o VEGF-121 humano (20 ng/ml). Después de bloquear los pocillos con una solución de BSA al 1%, se añadió construcción de aptámeros de PDGF/VEGF (10 nM) y se dejó unirse a la diana de proteína adsorbida. Después del lavado, se dejó que la proteína complementaria biotinilada (2 nM de PDGF-BB para placas recubiertas con VEGF-121 y 2 nM de Ve Gf-121 o VEGF-165 para placas recubiertas con PDGF-BB) se uniera para formar un complejo ternario. Después de otro lavado, se añadió peroxidasa de rábano picante conjugada con estreptavidina (HRP-SA) y se dejó formar un complejo cuaternario. Después de un lavado final, se añadió un sustrato de peroxidasa de rábano picante que formaba color de acuerdo a las instrucciones del fabricante (kit de sustrato 34021 de Thermo Scientific TMB) y la reacción se detuvo cuando fue apropiado mediante adición de H2SO4 1,6 M. La absorbancia por pocillo a 450 nm se determinó con el lector de placas Spectramax M5 con comprobación automática. En paralelo al procedimiento descrito anteriormente, se ejecutó un conjunto de cuatro experimentos de control en el que se excluyó uno de los 4 componentes que componen el complejo cuaternario.
[0250] Tal como se muestra en la figura 19, la construcción de aptámero de PDGF/VEGF SL1012 (20 kDa PEG-N-4149-8_401) era capaz de unirse simultáneamente a VEGF-121 y PDGF-BB humanos. Se observó una señal fuerte cuando se añadieron todos los componentes del complejo cuaternario (completa), mientras que la ausencia de uno cualquiera de los 4 componentes dio lugar a una señal de fondo o cerca de la señal de fondo. Se obtuvieron resultados similares con placas recubiertas con PDGF y VEGF, lo que indica que el orden de adición de proteínas a la construcción de aptámero no importaba. Tal como se muestra en la figura 19, SL1012 fue capaz de unirse simultáneamente a VEGF-165 y PDGF-BB humanos. La figura 19A muestra placas de microtitulación recubiertas con VEGF con adición de PDGF biotinilado. La figura 19B muestra placas de microtitulación recubiertas con PDGF con adición de VEGF biotinilado. Los datos se presentan como la media intervalo de confianza del 95% (n = 3). Se observó una señal fuerte cuando se añadieron todos los componentes del complejo cuaternario (completa), mientras que la exclusión de cualquiera de los cuatro componentes dio lugar a una señal de fondo o cerca de la señal de fondo. Los datos también demuestran que la adición de un resto de PEG al extremo 5' de la construcción de aptámero no excluye la actividad de unión simultánea.
[0251] La unión simultánea de VEGF-165 humano y PDGF-BB humano a (A) SL1012 o y (B) SL1013 (40 kDa PEG-N-4149-8-401) se muestra en la figura 20. Las placas de microtitulación se recubrieron con PDGF con la adición de VEGF biotinilado. Completa significa la adición de todos los componentes del complejo cuaternario, mientras que en los gráficos se muestra cada condición sin uno de los cuatro componentes. Los datos se presentan como la media intervalo de confianza del 95% (n = 3)
[0252] Se realizó un experimento similar con diversas construcciones de aptámeros que no contenian el resto de PEG. En este experimento, sólo se incluyó un control sin aptámero porque los resultados anteriores demostraron el requisito de los otros componentes del complejo para generar la señal. Tal como se muestra en la figura 21, las construcciones de aptámeros 4149-8_317, 4149-8_318, 4149-8_320, 4149-8_401 y 4149-8_414 se unieron simultáneamente a PDGF y VEGF, independientemente del orden de adición de proteínas. La figura 21 (A) muestra placas de microtitulación recubiertas con VEGF con adición de PDGF biotinilado y la figura 21 (B) muestra placas de microtitulación recubiertas con PDGF con la adición de PDGF biotinilado. Añadir datos sobre la unión simultánea de las construcciones de heterodímero en base a las variantes del aptámero de PDGF 5169-4 y el aptámero de VEGF 4867-31.
Ejemplo 13. Estudios farmacocinéticos intravítreos
[0253] Se realizaron pruebas farmacocinéticas oculares iniciales para entender cómo los aptámeros y construcciones de aptámeros se comportan en el ojo. Se ensayaron cuatro aptámeros y construcciones de aptámero tal como se muestra en la Tabla 23.
[0254] Para cada aptámero o construcción de aptámeros, se realizó una única inyección intravítrea en ambos ojos de cinco conejos blancos de Nueva Zelanda (10 ojos). Los animales recibieron una dosis de 0,5 mg/ojo (SL1010 y SL1011) o una dosis de 1,0 mg/ojo (SL1012 y SL1013). Estas dosis representan el peso del aptámero o construcción de aptámero solos (el peso de PEG fue excluido de los cálculos). Todos los artículos de ensayo se formularon en solución salina tamponada con fosfato. Para cada artículo de ensayo con aptámero o construcción de aptámeros, se recogieron muestras de humor vítreo de ambos ojos de un animal a las 2, 24, 48, 96 o 192 horas después de la dosis. Las muestras de humor vítreo se almacenaron congeladas hasta que se analizaron.
[0255] Las concentraciones en humor vítreo de los aptámeros o construcciones de aptámeros se determinaron mediante procedimientos de ensayo de ultra cromatografía líquida (UPLC) con detección por absorbancia a 260 nanómetros (nm). Brevemente, se rompió un hidrogel vítreo haciéndolo pasar varias veces a través de una aguja de calibre 20. Se precipitaron proteínas vítreas mediante la adición de 2 volúmenes de 2-etoxietanol. Después de la centrifugación, el sobrenadante se recuperó y se inyectó en una columna de Acquity® C18 (0,2 x 100 mm). La temperatura de la columna fue de 80 °C y el caudal se mantuvo a 0,2 ml/min. El tampón A consistió en TEAA pH 7,0 y 5% de acetonitrilo. El tampón B consistió en 100% de acetonitrilo. El programa mantuvo 50% de tampón B durante 1 minuto después de la inyección de la muestra y, a continuación, el tampón B se incrementó linealmente a 70% durante 4 minutos. La detección se llevó a cabo mediante la absorbancia a 260 nm. Las concentraciones (equivalentes de ácido libre) de aptámero o construcción de aptámeros en el humor vítreo se determinaron por interpolación de las unidades de pico de absorbancia de las muestras desconocidas a las obtenidas por una curva estándar preparada con concentraciones conocidas de aptámero o construcción de aptámeros.
[0256] Los resultados de este experimento se muestran en la Tabla 24.
[0257] Un ajuste de regresión lineal ordinaria del logaritmo natural de la concentración vítrea frente al tiempo dio como resultado estimaciones para las semividas vítreas de 105, 47, 69 y 92 horas para SL1010, SL1011, SL1012 y SL1013, respectivamente. La tabla 25 muestra los resultados junto con el intervalo de confianza del 95%.
[0258] Estas semividas vítreas se comparan favorablemente con las semividas en conejos NZW de inhibidores de VEGF terapéuticos de tamaño similar, tales como Macugen (83 horas, Eyetech Study Group
[0259] (2002) Retina 22: 143) y Lucentis (70 horas, Gaudreault et al (2007). Retina 27: 1260). Por lo tanto, estos aptámeros y construcciones de aptámeros pueden ser útiles para el tratamiento de enfermedades oculares, tales como AMD y la retinopatía diabética.
Tabla 1. Secuencias representativas del 4149-8_1 y variantes truncadas con valores de Kd para PDGF de 10 nM o menos
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Tabla 1a. Homodímeros de aptámero de PDGF 4149_8_260 (SL5):
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Tabla 2. Secuencias representativas de las variantes truncadas con valores de Kd para PDGF de más de 10 nM
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Tabla 3. Truncamientos del clon del aptámero de PDGF 4149-8_1.
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Tabla 4. Recopilación de datos, refinamiento y modelos estadísticos
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Los valores entre paréntesis indican los valores para el más alto de veinte capas de resolución
Rcombinado = XhXi|Ii(h) - <I(h)>|/XhXiIi(h)
Rlibre = XhllF obs| - |F calcll/Xh|F obs|.
El factor R libre se calculó utilizando 5% de las reflexiones omitidas en el refinamiento (The CCP4 suite: programs for protein crystallography, 1994).
*Factores de ligando B son para ligandos en los sitios activos de los monómeros de proteína. Los ligandos de disolvente (PEG, glicerol, etc.) no se incluyeron en el cálculo.
Tabla 5. Parámetros de parejas de bases para el aptámero BB de de PDGF en comparación con el ADN de la forma B
Parámetro
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ADN Tallo bucle 5' M iniknot S1 Miniknot S2 Parámetros de
parejas de bases complementarias
Buckle (grados) 0,5 (6 -5,67 (7,90) 0,32 (22,8) -0,74 (15,3) Propeller (grados) -11,4 -9,84 (6,10) 7,43 (10,4) 2,42 (7,75)
Opening (grados) 0,60 ( -8,13 (25,2) 7,86 (12,5) 0,35 (0,40)
Shear (Á) 0,00 ( 1,12 (1,42) 1,29 (2,52) -0,03 (0,42)
Stretch (Á) -0,15 ( -0,38 (0,66) 1,96 (3,55) -0,12 (0,42)
Stagger (Á) 0,09 (
Figure imgf000069_0002
0,04 (0,61)
Figure imgf000069_0003
-0,45 (0,69) 0,28 (0,05)
Parámetros del
Figure imgf000069_0004
U2, A3, C10, A9 A9 12, G13, escalón con A3/U7, U8 C4/G6, U7 U16, G1 U20/ /C23 14/G22, parejas de bases U1 24 C23 Tilt (grados) -0,1 (2,5) -0,80 -1,45 -4,65 -5,8 ,39 3,86 Roll (grados) 0,6 (5,2) 0,34 0,55 6,12 -5,6 ,19 3,94 Twist (grados) 36 (6,8) 24,1 33,3 25,3 15, 9 33,9 Shift (Á) -0,02 (0,45) 3,20 -0,12 -0,90 -1,4 ,17 0,78 Slide (Á) 0,23 (0,81) 0,25 -0,24 0,27 -4,4 ,21 -0,4 Rise (Á) 3,32 (0,19) 2,68 3,28 2,98 3,5 ,73 3,13 Parámetros helicoidales locales Inclination 2,1 (9,2) 0,81 0,96 13,6 -18, ,28 6,72 (grados) Tip (grados) 0,0 (4,3) 1,92 2,52 10,4 19, ,72 -6,57 Helical twist 36,5 (6,6) 24,1 33,4 26,3 17, 9,4 34,3 (grados) x-displacement 0,05 (1,28) 0,52 -0,5 -0,97 -9,8 ,34 -1,28 (Á) y-displacement 0,02 (0,87) -7,89 -0,03 0,81 -0,1 ,09 -0,73 (Á) Helical rise (Á)
Figure imgf000069_0011
3,29 (0,21)
Figure imgf000069_0008
2,58
Figure imgf000069_0009
3,28
Figure imgf000069_0010
3,07
Figure imgf000069_0006
5,0
Figure imgf000069_0005
,73
Figure imgf000069_0007
3,13
Tabla 6. Truncamientos del clon del aptámero de PDGF 5169-4.
Figure imgf000069_0012
Figure imgf000070_0001
Figure imgf000071_0001
Tabla 7. Sustituciones del separador C3 en todas las posiciones en 5169-4_26.
Figure imgf000071_0002
Figure imgf000072_0001
Tabla 8. Sustituciones de 2'-O-metilo y desoxitim idina en 5169-4_26.
Figure imgf000072_0002
Figure imgf000073_0001
Figure imgf000074_0001
Tabla 9. Múltiples sustituciones de 2'-O-metilo en aptámero de PDGF 5169-4_26.
Figure imgf000074_0002
Figure imgf000075_0001
Figure imgf000076_0001
Figure imgf000077_0001
Figure imgf000078_0001
Figure imgf000079_0001
Figure imgf000080_0001
Figure imgf000081_0001
Figure imgf000082_0001
Figure imgf000083_0001
Figure imgf000084_0001
'2o OJ
oo
Figure imgf000085_0001
Tabla 12: Sustituciones de 2'-O-metilo en aptámero de VEGF 4867-31_43
Figure imgf000086_0001
Figure imgf000087_0001
Figure imgf000088_0001
CD CO u_ OLU> <D "O
(D E
‘ <3 CL
(3
C
<D <ü C
tM (D -O (/) (D c o o 3
(/> CD
‘3 E
> =p ó (3.
CD E
CD TJ
(/) _a¿ (3 3 ■g ’> c </) CD CO
’ü3 '-3 </) 3(/)
-Q (3
Figure imgf000089_0001
Figure imgf000090_0001
Figure imgf000091_0001
Tabla 15. Homodímeros de PDGF de 4149-8_379 y 5169-4_26.
Figure imgf000092_0001
Figure imgf000093_0001
Figure imgf000094_0001
Tabla 16. Homodímeros de VEGF de 4867-31 192.
Figure imgf000094_0002
Figure imgf000095_0001
Figure imgf000096_0001
Figure imgf000096_0002
Figure imgf000097_0001
Tabla 18: Afinidad de unión y la actividad in vitro de construcciones de aptámeros PDGF-VEGF
Figure imgf000098_0001
Tabla 19. Construcción de aptámero de PDGF/VEGF 4149-8_401
Figure imgf000098_0002
Tabla 20. Afinidad de unión de la construcción de aptámero de PDGF/VEGF 4149-8_401
Figure imgf000098_0003
Tabla 21: Afinidades de las construcciones de aptámero de PDGF/VEGF que comprenden 4149-8_379 y 4867­
31 192
Figure imgf000098_0004
Figure imgf000099_0001
Tabla 22. Afinidades de unión de las construcciones de aptámero de PDGF/VEGF que comprenden 5169-4_26 y 4867-31_192.
Figure imgf000099_0002
___________________________
Figure imgf000100_0001
Tabla 23. Aptámeros y construcciones de aptámeros ensayados en estudios PK oculares
Figure imgf000100_0002
Tabla 24. Concentraciones en el humor vítreo para aptámeros y construcciones de aptámeros en los estudios farmacocinéticos oculares
Figure imgf000100_0003
Figure imgf000101_0001
Tabla 25 Semivida del humor vitreo para aptámero y construcciones de aptámero después de una dosis intravítrea bilateral individual a conejos NZW.
Figure imgf000101_0002

Claims (7)

REIVINDICACIONES
1. Un aptámero que comprende la secuencia:
(A) 5-'ACALnZGZAZGLmZLZ-3' (SEQ ID NO 512).
en la que;
el aptámero se une a PDGF;
cada Z es, independientemente, una pirimidina modificada;
cada L se selecciona independientemente de un enlazador C2-C50 sustituido o no sustituido, un enlazador de polietilenglicol, y un nucleótido modificado o no modificado;
n es de 1 a 5; y
m es de 1 a 10;
opcionalmente en la que:
i) n es 1, 2, 3, o 4; y en la que m es 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, o 9;
ii) L independientemente, en cada caso, se selecciona del grupo que consiste en un enlazador C2-C10 sustituido o no sustituido, un enlazador C2-C8 sustituido o no sustituido, un enlazador C2-C6 sustituido o no sustituido, un enlazador C2-C5 sustituido o no sustituido, un enlazador C2-C4 sustituido o no sustituido, y un enlazador C3 sustituido o no sustituido;
iii) el aptámero inhibe la fosforilación mediada por PDGF de un receptor de PDGF; o
iv) el aptámero se une a PDGF con una afinidad de menos de 10 nM, menos de 5 nM, menos de 2 nM o menos de 1 nM;
(B) 5-'GZZQAAEZECZZEZDRGAZZZAAAZG-3'
en la que;
el aptámero se une a VEGF;
el aptámero se une a VEGF-121 con una afinidad de menos de 10 nM, menos de 5 nM, menos de 2 nM, o menos de 1 nM, en el que el aptámero comprende al menos un nucleósido modificado que comprende una modificación de nucleobase hidrófoba;
cada Z es una pirimidina modificada;
Q se selecciona de cualquier nucleótido modificado o no modificado y un enlazador C2-C50 sustituido o no sustituido, o está ausente;
cada E se selecciona independientemente de una G y un enlazador C2-C50 sustituido o no sustituido;
D se selecciona de una A y un enlazador C2-C50 sustituido o no sustituido; y
R se selecciona de cualquier nucleótido modificado o no modificado y un enlazador C2-C50 sustituido o no sustituido; opcionalmente en la que:
(i) E independientemente, en cada caso, se selecciona del grupo que consiste en un enlazador C2-C10 sustituido o no sustituido, un enlazador C2-C8 sustituido o no sustituido, un enlazador C2-C6 sustituido o no sustituido, un enlazador C2-C5 sustituido o no sustituido, un enlazador C2-C4 sustituido o no sustituido, y un enlazador C3 sustituido o no sustituido; y una G;
(ii) R, independientemente, en cada caso, se selecciona del grupo que consiste en un enlazador C2-C10 sustituido o no sustituido, un enlazador C2-C8 sustituido o no sustituido, un enlazador C2-C6 sustituido o no sustituido, un enlazador C2-C5 sustituido o no sustituido, un enlazador C2-C4 sustituido o no sustituido, y un enlazador C3 sustituido o no sustituido;
(iii) D independientemente, en cada caso, se selecciona del grupo que consiste en un enlazador C2-C10 sustituido o no sustituido, un enlazador C2-C8 sustituido o no sustituido, un enlazador C2-C6 sustituido o no sustituido, un enlazador C2-C5 sustituido o no sustituido, un enlazador C2-C4 sustituido o no sustituido, y un enlazador C3 sustituido o no sustituido;
(iv) Q independientemente, en cada caso, se selecciona del grupo que consiste en un enlazador C2-C10 sustituido o no sustituido, un enlazador C2-C8 sustituido o no sustituido, un enlazador C2-C6 sustituido o no sustituido, un enlazador C2-C5 sustituido o no sustituido, un enlazador C2-C4 sustituido o no sustituido, y un enlazador C3 sustituido o no sustituido; o
(v) el aptámero inhibe la fosforilación de un receptor de VEGF mediada por VEGF-121;
(C) 5-'NZVSLnS'V'ZACNNmGCGZZZAZAGCG-3' (SEQ ID NO: 500),
en la que,
el aptámero se une a PDGF;
V se selecciona entre A, C o G;
V' se selecciona entre C, G o Z, en el que V' es complementaria a V;
S y S' se seleccionan independientemente entre C o G, en el que S y S' son complementarias entre sí;
N se selecciona independientemente de cualquier nucleótido que sea natural o modificado;
Z se selecciona independientemente de una pirimidina modificada;
L es un separador seleccionado de cualquier nucleótido natural o modificado, un enlazador de hidrocarburo, un enlazador de polietilenglicol o una combinación de los mismos;
n es de 0 a 20; y
m es de 0 a 20;
(D) seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 410-499 y 517-545, en la que el aptámero se une a PDGF; (E) seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 546-706 y 729-739, en la que el aptámero se une a VEGF; o
(F) seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 749-760, en la que el aptámero se une a VEGF y/o PDGF.
2. Aptámero, según la reivindicación 1(A) o (B), en el que cada Z se selecciona independientemte de 5-(N-bencilcarboxamida)-2'-desoxiuridina (BndU), 5-(N-bencilcarboxamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-bencilcarboxamida)-2'-fluorouridina, 5-(N-fenetilcarboxamida)-2'-desoxiuridina (PedU), 5-(N-tiofenilmetilcarboxamida)-2'-desoxiuridina (ThdU), 5-(N-isobutilcarboxamida)-2'-desoxiuridina (iBudU), 5-(N-isobutilcarboxamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-isobutilcarboxamida)-2'-fluorouridina, 5-(N-triptaminocarboxamida)-2'-desoxiuridina (TrpdU), 5-(N-triptaminocarboxamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-triptaminocarboxamida)-2'-fluorouridina, cloruro de 5-(N-[1-(3-trimetilamonio)propil]carboxamida)-2'-desoxiuridina, 5-(N-naftilmetilcarboxamida)-2'-desoxiuridina (NapdU), 5-(N-naftilmetilcarboxamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-naftilmetilcarboxamida)-2'-fluorouridina y 5-(N-[1-(2,3-dihidroxipropil)]carboxamida)-2'-desoxiuridina).
3. Aptámero, según la reivindicación 1 (A) o (B), que comprende además al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o al menos cinco nucleósidos que comprenden un 2'- OMe.
4. Aptámero, según la reivindicación 1 (A) o (B), que comprende además al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o al menos cinco enlaces internucleósido que son enlaces fosforotioato.
5. Construcción de aptámeros que comprende un primer aptámero y un segundo aptámero, en la que:
(a) el primer aptámero y el segundo aptámero se seleccionan independientemente de los aptámeros de la reivindicación 1 (D), en el que el primer aptámero y el segundo aptámero son los mismos o diferentes;
(b) el primer aptámero y el segundo aptámero se seleccionan independientemente de los aptámeros de la reivindicación 1(E), en el que el primer aptámero y el segundo aptámero son los mismos o diferentes; o
(c) el primer aptámero se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 546-706 y el segundo aptámero se selecciona del grupo que consiste en 410 a 499 y 517 a 545.
6. Construcción de aptámeros, según la reivindicación 5, en la que el primer aptámero y el segundo aptámero están unidos covalentemente.
7. Aptámero de la reivindicación 1, para usar en un procedimiento para tratar y/o prevenir una afección seleccionada del grupo que consiste en la degeneración macular, una afección oftálmica, fibrosis, una enfermedad cardiovascular y un cáncer.
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