JP6914284B2 - Ｐｄｇｆおよびｖｅｇｆ結合アプタマー、および、ｐｄｇｆおよびｖｅｇｆが介在する病気の治療へのそれらの使用 - Google Patents

Ｐｄｇｆおよびｖｅｇｆ結合アプタマー、および、ｐｄｇｆおよびｖｅｇｆが介在する病気の治療へのそれらの使用 Download PDF

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Description

本開示は概して核酸に関し、特に血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）に結合する能力のあるアプタマーおよび血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）に結合する能力のあるアプタマーに関する。いくつかの態様において、このようなアプタマーはアテローム性動脈硬化、線維症、黄斑変性症、ガン、および他のＰＤＧＦおよび／またはＶＥＧＦが関与する疾患を含むがこれらに限定されない増殖性の疾患の予防、治療および／または回復の薬物療法として有用である。いくつかの態様において、本開示は同時にまたは相互排他的にＶＥＧＦおよびＰＤＧＦに結合することができるアプタマー構築物に関し、これらは薬物療法として有用である。
下記明細書は情報の概要を提供し、本開示で提供される情報または言及された刊行物が先行技術である事を認めるものではない。
血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ−A、−B、−Cおよび−D）は広く存在する有糸分裂促進因子であり多くの結合組織細胞の走化性因子である（非特許文献１）。ＰＤＧＦはジスルフィド結合した二量体で存在し、細胞表面のＰＤＧＦ受容体αおよびβに結合する機能を持つ、システインで結ばれた成長因子領域を含む（非特許文献２）。ＰＤＧＦの結合は受容体の二量化を誘導し、細胞内チロシン残基での自己リン酸化を引き起こす（非特許文献３）。ＰＤＧＦ−ＢＢはアテローム性動脈硬化、線維症、黄斑変性症、およびガンを含むいくつかの増殖性疾患に関与している（非特許文献４−１１）。
ＶＥＧＦは分泌されたジスルフィド結合されたホモ二量体であり内皮細胞を選択的に刺激して増殖、移動させマトリックス分解酵素を生産させる。これらは全て新しい血管を作るために要求されるプロセスである（非特許文献１２−１６）。知られている唯一の内皮細胞特異的有糸分裂促進因子である事に加え、ＶＥＧＦは血管新生成長因子の中でも高分子に対する血管の透過性の一過性増加を引き起こす能力において独特である（非特許文献１７−１９）。増加した血管の透過性と結果としての血漿タンパク質の血管外スペースでの堆積は、内皮細胞の移動のための暫定的なマトリックスを供給することにより新しい血管の形成を促進する。透過性亢進は実際新しい血管特有の特徴である（非特許文献２０）。さらに、組織低酸素により引き起こされる代償性血管新生もまたＶＥＧＦにより仲介される（非特許文献２１−２２）。低酸素誘導タンパク質としてのＶＥＧＦの同定は、低酸素はＶＥＧＦ発現の抑制を引き起こすという補完的な観察とともに、酸素要求と血管供給を整合する魅力的なメカニズムを提供する（非特許文献２３−２４）。
ＶＥＧＦタンパク質のいくつかのアイソフォームはＶＥＧＦをコードする遺伝子の８つのエキソンの選択的スプライシングの結果として発生する（非特許文献２５）。最も広く存在するアイソフォームはＶＥＧＦ−１２１、ＶＥＧＦ−１６５およびＶＥＧＦ−１８９である。ＶＥＧＦのタンパク質分解の工程で追加のアイソフォームが産生され得る。ＶＥＧＦ−１６５はプラスミンによりＡｒｇ−１１０とＡｌａ−１１１の間で切断され得てＶＥＧＦ−１１０を産生する、このＶＥＧＦ−１１０はＶＥＧＦ−１２１と機能的に同等である（非特許文献２６）。ＶＥＧＦ−１８９はウロキナーゼによりエキソン６領域内で切断され得、そして更にプラスミンにより切断され得てＶＥＧＦ−１１０を産生する（非特許文献２７）。さらに、ＭＭＰ−３、−７、−９および−１９を含むマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）のサブセットはＶＥＧＦ−１６５およびＶＥＧＦ−１８９を逐次段階的に切断して、ＶＥＧＦ−１１０と機能的に同等であるＶＥＧＦ−１１３を生じる能
力がある。よって、与えられた組織内のマトリックスに結合したＶＥＧＦとジスルフィド型のＶＥＧＦの相対的な存在比は、組織の細胞内で起こる選択的スプライシングおよびタンパク質分解の組み合わせにより決定される（非特許文献２８）。
加齢に関連する黄斑変性症（ＡＭＤ）は依然として５５歳を超える人々の失明の主な原因である。この病気はドルーゼと呼ばれる不溶性物質が黄斑に堆積することが特徴である。黄斑は網膜の一部分であり、光受容体が最も高い密度で存在して中心視野に関与している。ＡＭＤの最初の段階では堆積物に血管がなく病気は一般的に進行が遅い。しかしながら、患者の１０％はいわゆる“乾燥”型のＡＭＤが血管形成されて“湿った”型のＡＭＤになり、病気がより進行性になってより速い速度で視力が低下する。多くの事例で、中心視野のぼやけから実質的な失明までの進行は２年よりも短い期間で起こる。この病気、滲出性または湿った型のＡＭＤの進行した段階では、新生血管が脈絡毛細管から網膜の中央部分（黄斑）に中央視野を塞ぎながら貫入する。アメリカ合衆国では滲出型ＡＭＤの患者数は約１８０万人であり２０２０年までに３００万人近くにまで増加すると予想されている。アメリカ合衆国における滲出型ＡＭＤの発生率は毎年約２１００００人である。
最近ＡＭＤは、ＶＥＧＦに結合する拮抗薬を目に直接注入することで、ＶＥＧＦの内皮細胞が細胞表面受容体と相互作用するのを阻止してＶＥＧＦが介在する血管新生と血管の漏出の誘導を遮断することで治療されてきている。
新しい血管の退縮に加えて、ＶＥＧＦとＰＤＧＦ−Ｂの信号の二重阻害は血管新生のより効果的な遮断につながる証拠がある。例えば、臨床的証拠はＶＥＧＦとＰＤＧＦ−Ｂの二重阻害がＡＭＤ患者における眼血管新生のより完全な阻害を達成できる事を示唆する。最初にネクスターファーマスティカルズ(NeXstar Pharmaceuticals)で発見された（非特
許文献２９、特許文献１−４）ＰＤＧＦ−Ｂのアプタマー阻害剤（Ｅ１００３０）は、ＡＭＤの治療薬としてオプトテックコーポレーション(Ophthotech Corporation)により開発されている。Ｅ１００３０（Ｆｏｖｉｓｔａ（登録商標））は、およそ１００ｐＭのＫd
でＰＤＧＦ−ＡＢまたはＰＤＧＦ−ＢＢに結合しＰＤＧＦ―Ｂの機能をｉｎ ｖｉｔｒｏとｉｎ ｖｉｖｏの両方で阻害する、ＤＮＡに基づく修飾されたアプタマーである。
第１相試験において、Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）抗ＶＥＧＦ療法との組み合わせで試験されたＥ１００３０による抗ＰＤＧＦ療法で、１２週間の治療後患者の５９％は３行列視力(vision gain of three lines)が向上した。これは視力が改善した患者の割合として、Ｌｕｃｅｎｔｉｓだけで過去に観察された３４−４０％と比較し相当に高い。さらに、この組み合わせの療法は全ての被験者で顕著な新生血管の退縮を伴った。組み合わせ療法の改善された有効性は、最近滲出型ＡＭＤを持つ患者４４９人の第２相試験で裏付けられた。Ｆｏｖｉｓｔａ（１．５ｍｇ）とＬｕｃｅｎｔｉｓの組み合わせの投与を受けている患者は２４週間で平均１０．６文字視力が向上し、Ｌｕｃｅｎｔｉｓ単独の療法を受けた患者の６．５文字と比較して（ｐ＝０．０１９）６２％の更なる視力の改善を示した。
米国特許第6207816号 米国特許第5731144号 米国特許第5731424号 米国特許第6124449号
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本開示は血小板由来成長因子Ｂ（ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ−ＢＢおよびＰＤＧＦ−ＡＢを含む）に結合するアプタマー、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−１２１およびＶＥＧＦ−１６５を含む）に結合するアプタマー、および、ＰＤＧＦ−Ｂに結合するアプタマーおよびＶＥＧＦに結合するアプタマーを含むアプタマー構築物を提供する。開示されるアプタマーとアプタマー構築物は、アテローム性動脈硬化、黄斑変性症、線維症、糖尿病性網膜症およびガンを含むがこれらに限定されないＰＤＧＦおよび／またはＶＥＧＦが関与する増殖性の病気または疾患の予防、治療および／または回復の薬物療法として有用である。いくつかの態様において、アプタマー構築物はＶＥＧＦおよびＰＤＧＦ−Ｂのそれぞれに独立して、および／またはＶＥＧＦとＰＤＧＦ−Ｂに同時に結合することができる。ＰＤＧＦアプタマー、ＶＥＧＦアプタマー、またはＶＥＧＦ／ＰＤＧＦ−Ｂアプタマー構築物、または前述のいずれかの薬剤的に許容できる塩、および少なくとも一つの薬
剤的に許容できる担体を含む医薬組成物または製剤がこれらに含まれる。このような組成物は、薬剤的に許容できる適切な剤形で調製できる。
他の側面において、本開示はＰＤＧＦおよび／またはＶＥＧＦが介在する病気または疾患の予防、治療および／または回復させる方法を提供する。いくつかの態様において、方法はＰＤＧＦアプタマー、ＶＥＧＦアプタマー、および／またはＶＥＧＦ／ＰＤＧＦ−Ｂアプタマー構築物、または前述のいずれかを含む医薬組成物をほ乳類のような対象に投与することを含む。いくつかの態様において、対象はヒトである。特に、線維症、アテローム性動脈硬化、黄斑変性症、糖尿病性網膜症および／またはガンの治療、予防および／または回復の方法が提供される。いくつかの態様において、ＰＤＧＦおよび／またはＶＥＧＦが介在する病気または疾患は、その中においてＰＤＧＦおよび／またはＶＥＧＦ活性が直接的にまたは間接的に病気または疾患に寄与する。これらの病気または疾患は線維症、アテローム性動脈硬化、黄斑変性症、糖尿病性網膜症およびガンを含むがこれらに限定されない。いくつかの態様において、治療、予防および／または回復される病気または疾患は加齢に関連する黄斑変性症（ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症、または緑内障、慢性ドライアイ、エイズに関連した視力喪失、弱視、半盲、網膜静脈閉塞症、トラコーマ、円錐角膜、脈絡網膜炎、中心性漿液性網膜症、ぶどう膜炎、網膜炎、高血圧性網膜症、網膜ジストロフィーなどの他の眼疾患である。いくつかの態様において、治療、予防および／または回復される病気または疾患は腎線維症または腎臓がんである。
いくつかの態様において、本明細書で開示されるアプタマーおよびアプタマー構築物はバイオマーカーの発見および診断(Ostroff, R.M., et al. (2010) PLoS One 5:e15003; Mehan, M., et al. (2012) PLoS One 7:e35157)から組織化学およびイメージング(Gupta, S., et al. (2011) Appl. Immunohistochem. Mol. Morphol. 19:273)にわたる潜在用途を持っている。
いくつかの態様において、治療効果（例えば線維症、アテローム性動脈硬化、黄斑変性症またはガンなどの治療、予防および／または回復）はＰＤＧＦアプタマー、ＶＥＧＦアプタマーおよび／またはＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアプタマー構築物を投与することにより達成され得る。これらのアプタマーまたはアプタマー構築物はＰＤＧＦおよび／またはＶＥＧＦに曝露され、結合できるようなアプタマーまたはアプタマー構築物である。いくつかの態様において、このような結合は治療の対象へのアプタマーの送達の方法にかかわらず起こる。いくつかの態様において、治療効果は、ＰＤＧＦおよび／またはＶＥＧＦに曝露され結合し、ＰＤＧＦおよび／またはＶＥＧＦの一つまたはそれより多い細胞受容体への結合を予防または減少させるＰＤＧＦアプタマー、ＶＥＧＦアプタマー、またはＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアプタマー構築物を投与することにより達成され得る。
いくつかの態様において、ＰＤＧＦアプタマーのＰＤＧＦ−ＢＢまたはＰＤＧＦ−ＡＢへの結合は、ＰＤＧＦ−ＢＢまたはＰＤＧＦ−ＡＢのＰＤＧＦ−α受容体への結合を阻害する。いくつかの態様において、ＰＤＧＦアプタマーのＰＤＧＦ−ＢＢまたはＰＤＧＦ−ＡＢへの結合はＰＤＧＦ−ＢＢまたはＰＤＧＦ−ＡＢのＰＤＧＦ−β受容体への結合を阻害する。いくつかの態様において、ＰＤＧＦ−ＢＢまたはＰＤＧＦ−ＡＢに対するＰＤＧＦアプタマーは（ＰＤＧＦ−α受容体またはＰＤＧＦ−β受容体のような）ＰＤＧＦ受容体のリン酸化を減少させる。
いくつかの態様において、ＶＥＧＦアプタマーの、ＶＥＧＦ−１２１、ＶＥＧＦ−１１０、ＶＥＧＦ−１６５、ＶＥＧＦ−１８９、または、他の選択的にスプライシングされたまたは機能的に活性なＶＥＧＦのタンパク質分解フラグメントへの結合は成長因子のＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）への結合を阻害する。いくつかの態様において、ＶＥＧＦアプタマーの、ＶＥＧＦ−１２１、ＶＥＧＦ−１１０、ＶＥＧＦ−１６５、ＶＥＧＦ−１８９
、または、他の選択的にスプライシングされたまたは機能的に活性なＶＥＧＦのタンパク質分解フラグメントへの結合は成長因子のＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ）への結合を阻害する。いくつかの態様において、ＶＥＧＦアプタマーは（ＶＥＧＦ−１受容体および／またはＶＥＧＦ−１受容体のような）ＶＥＧＦ受容体のリン酸化を減少させる。
いくつかの態様において、ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアプタマー構築物は（ＰＤＧＦ−α受容体および/またはＰＤＧＦ−β受容体のような）ＰＤＧＦ受容体のリン酸化のレベルを減
少させ、（ＶＥＧＦＲ−１および/またはＶＥＧＦＲ−１のような）ＶＥＧＦ受容体のリ
ン酸化のレベルを減少させる。いくつかの態様において、ＰＤＧＦアプタマー、ＶＥＧＦアプタマー、またはＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアプタマー構築物は、ＰＤＧＦ受容体および／またはＶＥＧＦ受容体のシグナル伝達経路に沿った信号を減少させる。
いくつかの態様において、ＰＤＧＦアプタマー、ＶＥＧＦアプタマー、またはＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアプタマー構築物は１または２以上の付加的な活性物質と共に投与される。このような投与は逐次的でも組み合わせでも良い。
いくつかの態様において、ｉｎ ｖｉｔｒｏの診断法はＰＤＧＦアプタマーをＰＤＧＦを含むと疑われる試料に接触させることを含む。いくつかの態様において、ｉｎ ｖｉｔｒｏの診断法は、適切に標識されたＰＤＧＦアプタマーをＰＤＧＦが介在する病気または疾患を持つと疑われる個体に投与することを含む。標識されたＰＤＧＦアプタマーは個体の健康状態の診断または評価の目的のために検出される。使用される標識は、用いられる画像診断法に従って選択される。
いくつかの態様において、ｉｎ ｖｉｔｒｏの診断法は、ＶＥＧＦアプタマーをＶＥＧＦを含むと疑われる試料に接触させることを含む。いくつかの態様において、ｉｎ ｖｉｔｒｏの診断法は、適切に標識されたＶＥＧＦアプタマーをＶＥＧＦが介在する病気または疾患を持つと疑われる個体に投与することを含む。標識されたＶＥＧＦアプタマーは個体の健康状態の診断または評価の目的のために検出される。使用される標識は、用いられる画像診断法に従って選択される。
いくつかの態様において、ｉｎ ｖｉｔｒｏの診断法は、ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアプタマーをＰＤＧＦ／ＶＥＧＦを含むと疑われる試料に接触させることを含む。
他の側面において、本開示は適切に標識されたＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアプタマー構築物を得、標識されたＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアプタマー構築物をＰＤＧＦ／ＶＥＧＦが介在する病気または疾患を持つと疑われる個体に注射し、標識されたＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアプタマー構築物を個体の健康状態の診断または評価の目的のために検出することを含むｉｎ ｖｉｔｒｏの診断法を提供する。使用される標識は、用いられる画像診断法に従って選択される。
いくつかの態様において、本発明はＰＤＧＦアプタマーおよびＶＥＧＦアプタマーを含むアプタマー構築物を提供する。
いくつかの態様において、本開示は、２．２Åおよび２．３Åの解像度で解析され、それぞれがＰＤＧＦ―ＢＢに結合したアプタマーの２つの複製物を含む２つの別々の共結晶構造を提供する。
いくつかの態様において、本開示は、疎水性相互作用を通して主にタンパク質に効率的に結合するアプタマーを提供する。
いくつかの態様において、本開示は、アプタマーが実質的に疎水性相互作用を通してタ
ンパク質に結合するアプタマー−タンパク質複合体を提供する。
いくつかの態様において、本開示は、複合体は７よりも少ない水素結合を含み、タンパク質標的と共結晶複合体を形成する能力を持つアプタマーを提供する。
いくつかの態様において、本開示は、１６かそれよりも少ないヌクレオチドを含むシュードノット領域を含み、タンパク質標的と共結晶複合体を形成する能力を持つアプタマーを提供する。
いくつかの態様において、本開示は、タンパク質標的と界面面積１００Å2あたり１に
等しいかそれよりも少ない有極接点で結合し、タンパク質標的と共結晶複合体を形成する能力を持つアプタマーを提供する。有極接点は１かそれより多い水素結合および１かそれより多い電荷−電荷相互作用を含み、界面面積はアプタマーで占められたタンパク質表面範囲の部分である。
図１（Ａ）は３つの低解離定数修飾型アプタマーおよびアプタマーＥ１００３０のＫd値の測定を示し、（Ｂ）は本明細書で開示される３つのＰＤＧＦアプタマーおよびスクランブルされた対照オリゴヌクレオチドによるＰＤＧＦ−ＢＢ刺激されたＰＤＧＦＲβのリン酸化阻害を示し、（Ｃ）は修飾されたアプタマーの、特定のＢｎ−ｄＵ核酸塩基が別の修飾されたｄＵ核酸塩基に置き換えられた親アプタマー４１４９−８＿１３０に対するＫd比を、親アプタマーに対する相対値（１の値は修飾されたアプタマーが親と同等にＰＤＧＦＲβのリン酸化を阻害することを示し、＞１の値は修飾されたアプタマーが親と比べて低い阻害活性を示す）で示す。 同上。 図２は、実施例２に述べられる（Ａ）アプタマー４１４９−８＿２６０の分子内接触とアプタマー−ＰＤＧＦ接触の表、（Ｂ）非極性分子内接触およびアプタマー−ＰＤＧＦ接触の描写、（Ｃ）極性分子内接触およびアプタマー−ＰＤＧＦ接触の描写を示す。疎水性（非極性）相互作用はπ−π相互作用（面−面(face-to-face)および端−面(edge-to-face)両方の芳香族相互作用）およびファンデルワールス接触（ｖＷ）を含む。極性相互作用は水素結合（破線）および電荷−電荷相互作用（実線）を含む。ＢおよびＣに示されるように、あるアプタマー残基（例えばｄＣ４、ｄＧ６、ｄＡ９、ｄＣ１０、ｄＣ１２、ｄＧ１３、ｄＣ１４、ｄＧ１５、ｄＧ２２、ｄＣ２３および２’−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌＧ２４）は標準塩基対形成および塩基のスタッキングに関与し、２’−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌＡ１１は押し出されている。 同上。 図３は、実施例１に述べられる、（Ａ）それぞれの位置での４５４パイロシークエンシングおよびヌクレオチドの出現頻度により決定されたＳＥＬＥＸプールからのクローンのセットのコンセンサス配列、および６つのクローンの配列、（Ｂ）示されている通り修飾された親アプタマー４１４９−８に基づいて修飾されたアプタマーのＫd値を示す。 図４は、実施例２に述べられるＰＤＧＦ−ＢＢ、４１４９−８＿２６０複合体のある立体像を示す。 図５は、実施例３に述べられる（Ａ）２００ｎＭのｔＲＮＡの存在下と非存在下における、異なるＰＤＧＦ二量アイソフォームに対する様々なアプタマーの結合親和性、（Ｂ）ＰＤＧＦ−Ａ、−Ｂ、−Ｃおよび−Ｄの成熟型のアミノ酸配列の配列比較を示す。太字で示されるＰＤＧＦ−Ａに対するアミノ酸残基はプロペプチド結合に関与する、太字で示されるＰＤＧＦ―Ｂに対するアミノ酸残基はＰＤＧＦＲβ結合に関与する(Shim et al, (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107(25):11307)。影付きの四角はアプタマー４１４９−８＿２６０のＰＤＧＦ−Ｂ鎖１（濃い影付き）への結合およびＰＤＧＦ−Ｂ鎖２（薄い影付き）への結合に関与する残基を示す。 図６は、実施例１に述べられる、（Ａ）アプタマー４１４９−８＿３８（配列番号３８）におけるそれぞれの示された位置を３つの炭素Ｃ−３リンカーで置換して作られた、修飾されたアプタマーのＫd比、およびＰＤＧＦ−ＢＢ結合、ＰＤＧＦ−ＡＢ結合のＫd値、を親アプタマー４１４９−８に基づいて修飾された５つのアプタマーの細胞のＩＣ50とともに示し、（Ｂ）特定のＢｎ−ｄＵ核酸塩基が別の修飾されたｄＵ核酸塩基で置換されている、親アプタマー４１４９−８＿１３０（配列番号１３０）に基づいて修飾されたアプタマーのＫd比を親アプタマーに対する相対値で示す（＜１の数字は修飾されたアプタマーが親アプタマーよりも高い親和性を持つことを示し、＞１の数字は修飾されたアプタマーが親アプタマーよりも低い親和性を持つことを示す）。 図７は、実施例２に述べられる（Ａ）アプタマー４１４９−８＿２６０（配列番号２１１）に結合したＰＤＧＦ−ＢＢホモ二量体のリボンダイアグラム、および（Ｂ）ＰＤＧＦ−Ｂサブユニットに結合したときのアプタマー立体構造の配置図および構造図を示す。非標準塩基対はLeontisおよびWesthofの命名法に基づいてコードされる(Leontis N.B. et al. (2003) Curr. Opin. Struct. Biol. 13(3):300)。濃い灰色＝ＰＤＧＦ−Ｂ鎖１、薄い灰色＝ＰＤＧＦ−Ｂ鎖２、Ｂｎ＝Ｂｎ−ｄＵ、Ｐｅ＝Ｐｅ−ｄＵ、Ｔｈ＝Ｔｈ−ｄＵである。 同上。 図８Ａ−Ｌは、実施例２に述べられる、ＰＤＧＦ−ＢＢ：４１４９−８＿２６０アプタマー複合体の結晶構造からのＰＤＧＦアプタマーのある構造の特徴を示す。図８Ａはアプタマー構造の領域、塩基対形成およびスタッキング相互作用を示す。ミニノットのステムはかなりの折込みおよびプロペラ角度、またらせん状の弛緩れじれ(helical underwinding)により、Ｂ型ＤＮＡから明らかに逸脱している。Ｂｎ２０はヒンジ部でありＵ８とのスタッキングを通して５’ステムと相互作用する。図８Ｂはステム１（Ｓ１）の端面像を示す。図８ＣはＳ１およびＬ２の側面像を示す。修飾されたヌクレオチドは、ミニノットからのＢｎ１６、Ｐｅ１７、Ｔｈ１８およびＢｎ２０と相互作用しながら５’ステムからのＢｎ２、Ｂｎ７およびＢｎ８と疎水性クラスターを形成する。Ｂｎ８はＢｎ１６およびＢｎ２０と端−面のπ−π相互作用を作る。非標準ｄＵ−ｄＵ塩基対は水素結合をＢｎ２０のアミドリンカーとして利用する。図８ＤはＰｅ−ｄＵ１７とＢｎ−ｄＵ２０間の非標準塩基対の詳細を示す。図８ＥはミニノットＳ１の塩基を安定化する芳香族相互作用を示す。図８ＦはＳ１におけるＣ１０−Ｇ１５Watson-Crick対とＬ２ヌクレオチドＡ２１の間に形成された塩基トリプルを示す。この塩基トリプルのLeontis-Westhof分類はシスWatson-Crick/Watson-Crick、トランス糖端/フーグスティーンである(Leontis N.B. et al. (2003) Curr. Opin. Struct. Biol. 13:300)。この塩基トリプルは平面ではなくＡ２１とＧ１５の間に３４°プロペラねじれ角度、またWatson-Crick塩基対の間にかなりの折込とプロペラねじれがある（表５）。図８ＧはＬ１中単一の押し出された塩基である残基ｍＡ１１と骨格回転を示す。図８ＨはＳ２の軸方向像を示す。図８Ｉは５’ステムモチーフの軸方向像を示し、Ｂ型ＤＮＡからの明らかな逸脱を強調している。包括的Ｃ１’−Ｃ１’らせんパラメータは、ｄＵ−ｄＵ対は過度にねじれており（４０°）、結果としてＢｎ−ｄＵ１とＢｎ−ｄＵ２の間でリニア近くまで（〜１７２°）平板化する骨格において〜１２４°屈曲することを示す。Ｂｎ−ｄＵ７−Ｂｎ−ｄＵ８間の明らかな放射状の置換およびＢｎ−ｄＵ２−ｄＡ３間のゼロに近い置換は塩基２−４と６−７間のより大きなスタッキングオーバーラップをもたらす。図８ＪはＢｎ−ｄＵ２とＢｎ−ｄＵ８間の非標準塩基対を示す。図８Ｋは修飾されたヌクレオチドにより形成された領域間の接合部を示す。図８Ｌは、領域間接合部のトポロジーを定義するＢｎ１６およびＢｎ２０と端−面π−π相互作用を作るＢｎ８を示す。アプタマー４１４９−８＿２６０（配列番号２１１）の位置８のＢｎ−ｄＵをｉＢ−ｄＵ（配列番号２５５）に置き換えることの有害な影響は図８Ｍと図８Ｎに示された空間充填像に明らかである。Ｂｎ８（８Ｍ）は近接する芳香族基とエネルギー的に起こりやすいπ−π相互作用を作る能力がありＳＯＭＡｍｅｒをより密に充填させる。一方ｉＢ８（８Ｎ）は芳香族でなく、よって近接する芳香族基とのπ−スタッキング能力がない。さらに、ｉＢ基はそれほど大きくなく疎水性クラスターの中間に穴を残す。 図９は、実施例２に述べられるあるタンパク質−アプタマー相互作用を示す。図９Ａにおいて、Ｂｎ−ｄＵ１はホモ二量体界面の塩橋下のポケットを占める。ベンジル環はＡｒｇ５６の脂肪族側鎖とＣｙｓ４３−Ｃｙｓ５２のジスルフィド結合の間に挟まれているのに対し、Ｕ１塩基はＶａｌ３９においてタンパク質骨格と水素結合を形成する。図９Ｂにおいて、Ｂｎ２はＴｒｐ４０と沿層方向の相互作用をもちＡｓｎ５５のメチレン側鎖とＬｅｕ３８の間に位置する。図９ＣはＢｎ７の芳香環がＡｓｎ５４の脂肪族部分とＡｓｎ５５側鎖に対してたすき掛けしている様子を示す。図９DはＬｅｕ３８とＩｌｅ７５の側鎖がＢｎ−ｄＵ８のベンジル環に対して疎水性表面を表しタンパク質に接触している様子を示す。図９Ｅは、Ｂｎ１６がＴｒｐ４０と端−面π−スタッキングを、Ａｒｇ７３の脂肪族部分とファンデルワールス接触を持つ様子を示す。図９ＦはＰｅ１７がＬｅｕ３８、Ｔｒｐ４０、Ａｒｇ７３およびＩｌｅ７５の疎水性側鎖に囲まれている様子を示す。Ａｒｇ７３はＰｅ−ｄＵ１７のアミドリンカーと水素結合を、アプタマー骨格と電荷−電荷相互作用を形成する。図９ＧはＡｒｇ７３、Ｉｌｅ７５およびＰｈｅ８４の疎水性側鎖に囲まれたＴｈ１８を示す。図９Ｈはタンパク質とアプタマー間のスタッキング相互作用がＰｒｏ８２とＢｎ２０とＵ８の間に存在すること、またＰｈｅ８４がＵ２０とｅｄｇｅ−ｔｏ−ｆａｃｅ接触を形成する様子を示す。Ｂｎ２０はＩｌｅ７７およびＬｙｓ８０と更なる疎水性接触を形成する。 図１０は極性接触（水素結合プラス電荷−電荷相互作用）の数と接触表面積のために解析された、従来のアプタマー（ＰＤＢ ＩＤｓ：ｖＷＦ、３ＨＸＯ；Ｔｈｒｏｍｂｉｎ、３ＱＬＰ；ＧｌｎＲｓｔＲＮＡ、１ＥＸＤ； Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ， ３ＡＧＶ；ＭＳ２ｃｏａｔｐｒｏｔｅｉｎ、６ＭＳＦ；ＮＦ−ｋＢ、１ＯＯＡ）の６つの共結晶構造を示す。結果は、報告されたこれらの６つのアプタマー−標的複合体（濃灰棒）および、ＰＤＧＦ−ＳＬ５（４１４９−８＿２６０）と２つの未発表のＳＯＭＡｍｅｒ−標的構造を含むＳＯＭＡｍｅｒ（薄灰棒）への結合親和性に対してプロットされた。６つの従来のアプタマーの極性接触の数と接触表面積の間の関係は線形回帰により分析され、９９％信頼区間は図の底上に灰色の影として示されている。図１０BはＰｅ−ｄＵ１７およびＴｈ−ｄＵ１８として示されたＰＤＧＦ−ＳＯＭＡｍｅｒ複合体の形状相補性を表す。左、ＰＤＧＦ鎖１は濃灰表面として示されており、Ｐｅ−ｄＵ１７およびＴｈ−ｄＵ１８は空間を充填する描写として示されている。右、Ｐｅ−ｄＵ１７が棒描写として示されている以外は左のパネルと同じ図。図１０ＣはＢｎ−ｄＵ１とＰＤＧＦ鎖１の相互作用の詳細を濃灰表面で、ＰＤＧＦ鎖２との相互作用の詳細を薄灰表面で示し、Ｂｎ−ｄＵ１は空間を充填する描写として表されている。 図１１はＰＤＧＦ−ＢＢに結合したＳＬ５およびＰＤＧＦＲβの比較を示す。（Ａ）ＰＤＧＦホモ二量体（鎖１：中程度の灰色、鎖２：薄灰色）および濃灰色で色づけられた受容体の細胞外領域を示す、受容体の共結晶(from Shim, A.H., et al. (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107(25):11307)。（Ｂ）ＰＤＧＦホモ二量体（鎖１：中程度の灰色、鎖２：薄灰色）およびＳＬ５（濃灰色）の複合体。（Ｃ）ＰＤＧＦ−Ｂ成熟型のアミノ酸配列。四角の影付きは４１４９−８＿２６０、ＰＤＧＦＲβまたは両方への接触残基を示す。４１４９−８＿２６０と４Å接触を形成するがＰＤＧＦＲβとは接触しないＰＤＧＦ残基は影なしで囲まれている。ＰＤＧＦＲβと４Å接触を形成するが４１４９−８＿２６０とは接触しないＰＤＧＦ残基は濃灰色の影付きで囲まれている。４１４９−８＿２６０およびＰＤＧＦＲβの両方と４Å接触を形成するＰＤＧＦ残基は中程度の灰色の影付きで囲まれている。 図１２は、遅い解離速度定数をもつアプタマーのようなアプタマーに組み入れられても良い、ある典型的なＣ−５ピリミジン修飾を示す。 同上。 同上。 図１３は、実施例４に述べられる通り、ＳＯＭＥｍｅｒ４１４９−８＿３７９（ＯＨ−４１４９−８＿３７９として標識）または５’アミノリンカーで修飾されたＳＯＭＡｍｅｒ４１４９−８＿３７９（Ｎ−４１４９−８＿３７９として標識）による、Ｈｓ２７線維芽細胞における、ＰＤＧＦ−ＢＢが誘導するＰＤＧＦＲβリン酸化阻害の代表的なプロットを示す。 図１４は、実施例５に述べられる通り、４５４パイロシークエンシングおよびそれぞれの位置でのヌクレオチド出現頻度により決定されたＳＥＬＥＸプールからのＰＤＧＦ結合クローンのセットのコンセンサス配列を示す。 図１５は、実施例７に述べられる通り、親アプタマー４８６７−３１＿１４３に基づいて修飾されたアプタマーで特定のＮａｐ−ｄＵ核酸塩基が他の修飾されたｄＵ核酸塩基に置き換えられているアプタマーのＫd比を、親アプタマーとの相対で示す（＜１の数字は修飾されたアプタマーが親アプタマーよりも高い親和性を有することを示し、＞１の数字は修飾されたアプタマーが親アプタマーよりも低い親和性を有することを示す）。 同上。 図１６は、実施例７で述べられる通り、４５４パイロシークエンシングおよびそれぞれの位置でのヌクレオチド出現頻度により決定されたＳＥＬＥＸプールからのＶＥＧＦ結合クローンのセットのコンセンサス配列を示す。 図１７は、実施例９に述べられる通り、ＶＥＧＦ−１２１またはＶＥＧＦ−１６５、およびＶＥＧＦアプタマー４８６７−３１＿４３および４８６７−３１＿１９２で刺激されたヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣｓ）におけるＶＥＧＦＲ２のリン酸化率を示す。 図１８は、実施例１１に述べられる通り、（Ａ）Ｈｓ２７線維芽細胞における、ＰＤＧＦアプタマ４１４９−８＿３７９（白丸）およびＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアプタマー構築物４１４９−８＿４０１（黒丸）による、ＰＤＧＦが誘導するＰＤＧＦＲβのリン酸化阻害、（Ｂ）ＨＵＶＥＣｓにおける、ＶＥＧＦアプタマー４８６７−３１＿１９２（白丸）およびＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアプタマー構築物４１４９−８＿４０１による、ＶＥＧＦが誘導するＶＥＧＦＲ２のリン酸化阻害を示す。 図１９は、実施例１２に述べられる通り、ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアプタマー構築物ＳＬ１０１２（２０ｋＤａＰＥＧ−Ｎ−４１４９−８＿４０１）による、（Ａ）ビオチン標識されたＰＤＧＦを加えた、ＶＥＧＦでコートされたマイクロタイタープレート、および（Ｂ）ビオチン標識されたＶＥＧＦを加えた、ＰＤＧＦでコートされたマイクロタイタープレート上のＰＤＧＦおよびＶＥＧＦの同時結合を示す。 図２０は、実施例１２に述べられる通り、ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアプタマー構築物（Ａ）ＳＬ１０１２（２０ｋＤａＰＥＧ−Ｎ−４１４９−８＿４０１）および（Ｂ）ＳＬ１０１３（４０ｋＤＡＰＥＧ−Ｎ−４１４９−８−４０１）による、ビオチン標識されたＶＥＧＦを加えた、ＰＤＧＦでコートされたマイクロタイタープレート上のＰＤＧＦおよびＶＥＧＦの同時結合を示す。 図２１は、実施例１２で述べられる通り、様々なＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアプタマー構築物による、（Ａ）ビオチン標識されたＰＤＧＦを加えた、ＶＥＧＦでコートされたマイクロタイタープレート、および（Ｂ）ビオチン標識されたＶＥＧＦを加えた、ＰＤＧＦでコートされたマイクロタイタープレート上のＰＤＧＦおよびＶＥＧＦの同時結合を示す。 図２２は、実施例２に述べられる（Ａ）極性接触（水素結合と電荷―電荷相互作用の合計として定義される）対従来のアプタマー（ひし形）およびＳＯＭＡｍｅｒ（丸）の界面面積のプロット（線形回帰フィットは傾き０．０１６のＲ2＝０．９１であり、破線はこの傾向の９９％信頼区間を表し、ＳＯＭＥｍｅｒはこれらの境界の外にある）、（Ｂ）自由エネルギー結合対従来のアプタマー（ひし形）およびＳＯＭＡｍｅｒ（丸）の極性接触のプロット（線形回帰フィットは傾き０．０７３のＲ2＝０．６４である）、（Ｃ）６つの従来のアプタマー−タンパク質結晶構造およびＰＤＧＦ−ＢＢ：４１４９−８＿２６０を含む３つのＳＯＭＡｍｅｒ−タンパク質結晶構造の様々な熱力学的特性および接触特徴を示す表、を示す。（Ｃ）タンパク質標的に結合したアプタマーおよびＳＯＭＡｍｅｒの相互作用の特徴（図の参照：(a) Convery et al. (1998) Nat. Struct. Biol. 5(2):133; (b) Nomura et al. (2010) Nucleic Acids Res. 38(21): 7822; (c) Pagano et al. (2008) Biophys. J. 94(2):562; (d) Huang et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100(16):9268; (e) Huang et al. (2009) Structure 17(11):1476; (f) Bullock et al. (2000) Nat. Struct. Biol. 7(6):497）。自由エネルギーの計算は測定されたＳＯＭＡｍｅｒの結合親和性、または公開されたＫd値から決定された。次の温度を用いた。ＭＳ２、トロンビン、ＮＦｋＢ、ｖＷＦおよびＧｌｎＲｓ，室温（２９６Ｋ）；ＩｇＧ，２９８Ｋ；ＳＯＭＡｍｅｒ，３１０Ｋ。ＳＯＭＡｍｅｒは結合親和性が高くなる傾向を示し、平均の結合自由エネルギーまたは−ΔＧ値は、６つのアプタマーに対して１１．４±１．３ｋｃａｌ／ｍｏｌであり３つのＳＯＭＡｍｅｒに対して１４．３ｋｃａｌ／ｍｏｌ±０．８ｋｃａｌ／ｍｏｌである。それぞれのリガンドの４Å以内のタンパク質接触原子はＰｙＭＯＬで決定された。界面面積の計算はＰＩＳＡ（アプタマー）(Krissinel et al. (2007) J. Mol. Biol. 372(3):774)またはＰｙＭＯＬ（ＳＯＭＡｍｅｒ）(DeLano (2002) The Pymol Molecular Graphics System, Delano Scientific, San Carlos, CA)で行われた。この比較的小さな結晶学的に評価された相互作用のデータセット内で、アプタマーは非水素接触原子あたり０．２１±０．１４ｋｃａｌ／ｍｏｌの平均リガンド効率で標的と結合している。一方ＳＯＭＡｍｅｒは非水素接触原子あたり０．１６±０．０４ｋｃａｌ／ｍｏｌである。界面面積あたりの結合自由エネルギーもまた似ており、平均値はアプタマー０．０１７±０．００９ｋｃａｌ・ｍｏｌ−1・Å−2、ＳＯＭＡｍｅｒ０．０１２±０．００１ｋｃａｌ・ｍｏｌ−1・Å−2である。表中の値から計算された極性接触あたりの結合自由エネルギーの値は、ＳＯＭＡｍｅｒ（極性接触あたり平均１．７５±０．３６ｋｃａｌ／ｍｏｌ）がアプタマー（極性接触あたり０．８９±０．５６ｋｃａｌ／ｍｏｌ）よりも約２倍大きい。 同上。
以下に、本発明の代表的な態様を詳細に記載する。本発明を列挙した態様との関連にて説明するが、当然のことながら、本発明はそれらの態様に限定されるものではない。それどころか本発明は、特許請求の範囲で定義する本発明の範囲に含まれ得る全ての変異態様、修正態様、および均等物を含むものである。
当業者であれば、本発明の実践の範囲で使用できる、および本発明の実践の範囲である方法および材料と、同様のまたは等価のたくさんの方法および材料を認識するだろう。本発明は、記載の方法および材料に少しも限定されるものではない。
別段の規定のない限り、本明細書で使用される技術的な用語および科学的な用語は、本発明が属する分野の当業者が、通常理解するものと同じ意味を有する。本発明の実践または試験においては、本明細書に記載の方法、装置および材料と同様のまたは等価な、任意の方法、装置および材料を使用することが可能であるが、好ましい方法、装置および材料を以下で説明する。
本開示で引用する全ての出版物、公開された特許文書、および特許出願は、本開示に関連する、当該分野の技術レベルの指標である。本明細書で引用する全ての出版物、公開された特許文書、および特許出願は、あたかも個々の出版物、公開された特許文書、および特許出願が具体的に、かつ個別に参照により組み込まれるのと同様に、ここで参照により組み込まれる。
添付の請求項を含めて本開示で使用する場合、単数形「１つ」、「１個の」および「その」は、文脈からそうでないことが明かでない限り、複数形を含み、かつ、「少なくとも
１つの」および「１つ以上」と同じ意味で使用される。従って、「１つのアプタマー」に関する記載は、アプタマーの混合物などを含む。
本明細書で使用する場合、用語「約」は、ある数値が関連している事項の基本機能が変化しないような、その数値の僅かな修正または変動を表す。
本明細書で使用する場合、用語「含む」、「含んでいる」、「含有する」、「含有している」、「包含する」、「包含している」、およびその全ての変異型は包括的な含有を表し、構成要素または構成要素の一覧を含む、含有する、または包含する対象のプロセス、方法、プロセスによる産物（ｐｒｏｄｕｃｔ−ｂｙ−ｐｒｏｃｅｓｓ）または組成物は、それらの構成要素のみを含むのではなく、明示されていない他の構成要素、または、そのようなプロセス、方法、プロセスによる産物または組成物に付随する他の構成要素を含み得る。
本明細書で使用する場合、用語「ヌクレオチド」は、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチド、またはその修飾形態、ならびにその類似体を指す。ヌクレオチドは、プリン（例えば、アデニン、ヒポキサンチン、グアニン、およびそれらの誘導体および類似体）ならびにピリミジン（例えば、シトシン、ウラシル、チミン、およびそれらの誘導体および類似体）を含む種を含有する。
本明細書で使用する場合、「核酸」、「オリゴヌクレオチド」、および「ポリヌクレオチド」は同じ意味で用いられ、ヌクレオチドの重合体を指し、かつ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡのハイブリッドおよびこれらの種の核酸、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの修飾形態を含み、様々な実体または部分とヌクレオチド単位との結合がいかなる位置のものも含まれる。用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、および「核酸」は、二本鎖分子または一本鎖分子ならびに三重らせん分子を含む。核酸、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドは、用語アプタマーよりも広義であり、そのため、用語核酸、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドは、アプタマーであるヌクレオチドの重合体を含むが、用語核酸、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドはアプタマーには限定されない。
本明細書で使用する場合、用語「修飾する」、「修飾した」、「修飾」、およびその全ての変異型は、オリゴヌクレオチドに関して使用される場合、そのオリゴヌクレオチドの４つの構成ヌクレオチド塩基（すなわち、Ａ、Ｇ、Ｔ／Ｕ、およびＣ）の少なくとも１つが、天然に存在するヌクレオチドの類似体またはエステルであることを意味する。いくつかの態様では、修飾されたヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性に寄与する。いくつかの態様では、修飾されたヌクレオチドは主に、アプタマーとタンパク質標的との疎水性相互作用を誘導し、その結果、高い結合効率と安定な共結晶複合体（ｃｏ−ｃｒｙｓｔａｌ ｃｏｍｐｌｅｘ）を生じる。修飾されたヌクレオチドの例としては、Ｃ５位に置換の生じたピリミジンが挙げられる。修飾には、主鎖の修飾、メチル化、イソ塩基として（例えばイソシチジンとイソグアニンなどとして）の通常とは異なる塩基の対合などが含まれ得る。修飾には、カッピングなどの３’修飾および５’修飾が含まれる場合もある。他の修飾としては、１つ以上の天然に存在するヌクレオチドを類似体、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホン酸、ホスホトリエステラーゼ、ホスホアミデート、カルバミン酸など）、荷電結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）、干渉物質（例えば、アクリジン、ソラレンなど）、キレート剤（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など）、アルキル化剤、および修飾された結合（例えば、αアノマー核酸など）を含む類似体と置き換えることなどのヌクレオチド間修飾が含まれ得る。さらに、ヌクレオチドの糖部分に通常見られるヒドロキシル基のいずれかが、ホスホン酸基またはリン酸基で置換されていても；標準的な保護基で保護されていても；または
追加のヌクレオチドまたは固相支持体への追加の結合を準備するために活性化されていてもよい。５’および３’末端のＯＨ基をリン酸化することも、またはアミン類、炭素原子がおよそ１〜およそ２０個の有機カッピング基部分、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）重合体（いくつかの態様では約１０〜約８０ｋＤａの範囲）、ＰＥＧ重合体（いくつかの態様では約２０〜約６０ｋＤａの範囲）、または他の親水性もしくは疎水性の生体ポリマーまたは合成ポリマーで置換することも可能である。いくつかの態様において修飾は、ピリミジンのＣ-５位での修飾である。これらの修飾は、直接Ｃ-５位のアミド結合によって、または他の種の結合によって生じる可能性がある。
ポリヌクレオチドは、当該分野において一般的に知られているリボース糖またはデオキシリボース糖の類似形態（例えば２’−Ｏ−メチル−、２’−Ｏ−アリル、２’−フルオロ−または２’−アジド−リボース）、炭素環糖の類似体、α−アノマー糖、エピマー糖（例えばアラビノース、キシロースまたはリキソース）、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、アクリル酸類似体および脱塩基ヌクレオシド類似体（例えばメチルリボシド）も含み得る。上述したように、１つ以上のホスホジエステル結合を、別の結合基で置き換えてもよい。これらの別の結合基としては、リン酸塩がＰ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、（Ｏ）ＮＲ2（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）
Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＨ2（「ホルムアセタール」）で置換されており、こ
こでＲまたはＲ’がそれぞれ独立してＨまたは置換もしくは非置換アルキル（１−２０Ｃ）（必要に応じてエーテル（−Ｏ−）結合、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルまたはアラルジル（araldyl）を含む）である態様が含まれる。ポリヌク
レオチドに含まれる全ての結合が同じである必要はない。類似形態の糖、プリン、およびピリミジンの置換は、例えば、ポリアミド主鎖のような別の主鎖構造をとることができるため、最終産物の設計の点で有利になる場合がある。
本明細書で使用する場合、用語「ヌクレアーゼ」とは、あるオリゴヌクレオチドのヌクレオチドサブユニット間のホスホジエステル結合を切断する酵素を指す。本明細書で使用する場合、用語「エンドヌクレアーゼ」とは、オリゴヌクレオチド内部にあるホスホジエステル結合を切断する酵素を指す。本明細書で使用する場合、用語「エキソヌクレアーゼ」とは、あるオリゴヌクレオチドの末端にあるヌクレオチドを繋いでいるホスホジエステル結合を切断する酵素を指す。体液は通常、エンドヌクレアーゼとエキソヌクレアーゼ両方の混合物を含む。
本明細書で使用する場合、用語「ヌクレアーゼ耐性」および「ヌクレアーゼ抵抗性」は、あるオリゴヌクレオチドに関し、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼの基質となる能力が低下していることを指す。そのため、そのオリゴヌクレオチドはそのような酵素と接触した場合、分解されないか、または未修飾のヌクレオチドから構成されているオリゴヌクレオチドよりもゆっくりと分解される。
本明細書で使用する場合、用語「Ｃ-５修飾されたピリミジン」は、Ｃ-５位に修飾を有するピリミジンを指し、その例としては、図１２に図示する部分が挙げられるがこれらには限定されない。Ｃ-５修飾されたピリミジンの例としては、米国特許第５，７１９，２
７３号および同第５，９４５，５２７号に記載されているものなどが挙げられる。Ｃ-５
修飾の例としては、Ｃ-５位のデオキシウリジンを、すぐ下で説明するように、ベンジル
カルボキシアミド（あるいはベンジルアミノカルボキシ）（Ｂｎ）、ナフチルメチルカルボキシアミド（あるいはナフチルメチルアミノカルボキシ）（Ｎａｐ）、トリプトアミノカルボキシアミド（あるいはトリプトアミノカルボニル）（Ｔｒｐ）、フェネチルカルボキシアミド（あるいはフェネチルアミノカルボニル）（Ｐｅ）、チオフェニルメチルカルボキシアミド（あるいはチオフェニルメチルアミノカルボニル）（Ｔｈ）およびイソブチルカルボキシアミド（あるいはイソブチルアミノカルボニル）（ｉＢｕ）から独立して選
択される置換基と置換することが含まれる。
Figure 0006914284
Ｃ-５修飾されたピリミジンの化学修飾は、単独でまたはいずれの組み合わせにおいて
も、２’−位の糖修飾、環外アミンの修飾、および４−チオウリジンの置換などと組み合わせることが可能である。
代表的なＣ-５修飾されたピリミジンとしては、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド
）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−フェネチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＰｅｄＵ）、５−（Ｎ−チオフェニルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｈｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−トリプトアミノカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、５−（Ｎ−トリプトアミノカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−トリプトアミノカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジンクロリド、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジンまたは５−（Ｎ−［１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン）が挙げられる。
オリゴヌクレオチドを合成する前にまたは合成した後に、ヌクレオチドを修飾することができる。オリゴヌクレオチドに含まれるヌクレオチドの配列は、１つ以上の非ヌクレオチド成分によって分断されていてもよい。修飾されたオリゴヌクレオチドを重合化の後に
、例えば、好適な標識成分と連結することによって、さらに修飾してもよい。
本明細書で使用する場合、用語「少なくとも１つのピリミジン」とは、核酸の修飾に言及する場合、核酸に含まれる１つ、複数、または全てのピリミジンを指し、核酸に含まれるいくつかまたは全てのＣ、Ｔ、またはＵのいずれかまたは全てを修飾しても修飾しなくてもよいことを表している。
別段の規定のない限り、本明細書で使用するＡ、Ｃ、Ｇ、ＵおよびＴはそれぞれ、ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、ｄＵおよびｄＴを意味する。
本明細書で使用する場合、「核酸リガンド」、「アプタマー」、および「クローン」は同じ意味で用いられ、標的分子に望ましい作用をもたらす天然には存在しない核酸を指す。望ましい作用としては、これらに限定されるものではないが、標的を結合させること、標的を触媒的に変化させること、標的もしくは標的の機能活性を修飾もしくは変化させるように標的と反応すること、標的と共有結合すること（自殺型阻害剤と同様に）、および標的と別の分子との反応を促進すること、が挙げられる。いくつかの態様においてこの作用は、標的分子に関する特定の結合親和性であり、そのような標的分子は、ワトソン／クリックの塩基対合または三重らせんの形成とは独立した機構を介して核酸リガンドに結合するポリヌクレオチド以外の三次元化学構造であり、ここでこのアプタマーは、標的分子が結合する、既知の生理学的な機能を有する核酸ではない。所与の標的に対するアプタマーとしては、このアプタマーが標的のリガンドである場合には、（ａ）候補混合物を標的と接触させること、ここで、候補混合物に含まれている他の核酸よりも標的に対して高い親和性を有する核酸を、候補混合物のその他の部分から分けることができ；（ｂ）候補混合物のその他の部分から、親和性の高い核酸を分けること；および（ｃ）親和性の高い核酸を増幅してリガンドに富む核酸混合物を得て、それにより、標的分子のアプタマーを同定すること、を含む方法によって、候補核酸混合物から同定された核酸が含まれる。親和性相互作用とは程度の問題だと認識されるが、本明細書中においては、アプタマーのその標的に対する「特定の結合親和性」とは、通常、アプタマーがその標的に、混合物または試料に含まれているその他の非標的、成分に結合するよりも非常に高い程度の親和性おいて結合することを意味する。「アプタマー」または「核酸リガンド」とは、特定のヌクレオチド配列を有する、１つの型または種の核酸分子のコピーの組みである。アプタマーは、任意の好適な数のヌクレオチドを含み得る。「アプタマー」とは、２以上の、そのような分子の組みを指す。別種のアプタマーは、同じ数または異なる数のヌクレオチドを有していてもよい。アプタマーはＤＮＡであってもまたはＲＮＡであってもよく、また、一本鎖であっても、二本鎖であっても、または二本鎖領域または三本差領域を含んでいてもよい。
本明細書で使用する場合、「ＳＯＭＡｍｅｒ」または低解離定数修飾型アプタマーは、解離定数（ｔ1/2）が≧３０分、≧６０分、≧９０分、≧１２０分、≧１５０分、≧１８
０分、≧２１０分、または≧２４０分のアプタマー（疎水性修飾された少なくとも１つのヌクレオチドを含むアプタマーなど）を指す。いくつかの態様では、「改善された解離定数を有するアプタマーの生成方法（Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ Ａｐｔａｍｅｒｓ ｗｉｔｈ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｏｆｆ−Ｒａｔｅｓ）」という名称の米国特許第７，９４７，４４７号に記載されている、改良型ＳＥＬＥＸ法によって、ＳＯＭＡｍｅｒを生成する。
本明細書で使用する場合、「タンパク質」は、「ペプチド」、「ポリペプチド」、または「ペプチド断片」と同じ意味で用いられる。「精製した」ポリペプチド、タンパク質、ペプチド、またはペプチド断片は、細胞成分、またはそのアミノ酸配列を得た細胞、組織、もしくは無細胞供給源に由来する他の混入タンパク質を実質的に含まないか、または化
学的に合成する場合には、化学的な前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない。
本明細書で使用する場合、「共結晶構造」または「共結晶複合体」とは、２つ以上の相互作用している分子を含む、結晶構造である。
本明細書で使用する場合、「心血管の状態または疾患」とは、心臓およびその血管系に関連する状態または疾患を意味する。そのような状態または疾患のいくつかの例としては、瘤、アンギナ、不整脈、アテローム性動脈硬化症、心房細動、うっ血性心不全、心筋症、冠動脈性心疾患、再狭窄、虚血、左室肥大、末梢血管病、心筋梗塞、高血圧、心臓弁膜症および拘束性心臓疾患がある。
本明細書で使用する場合、「線維症」は、器官内に、過剰量かつ異常な量の線維性の結合組織が形成され、その結果、結合組織に肥大や瘢痕が生じ、その器官の機能不全が引き起こされるという疾患または状態を意味する。そのような疾患および状態の例としては、肺線維症、腎臓線維症、肝臓線維症および嚢胞性線維症がある。
本明細書で使用する場合、「ＡＭＤ」または「加齢黄斑変性」または「黄斑変性」は、網膜の損傷によって引き起こされ、黄斑と呼ばれる、視野中心部における視力低下が生じる、眼の状態を意味する。ＡＭＤには、「滲出型」と「萎縮型」の２つの形態がある。「滲出型」ＡＭＤでは、網膜裏側の脈絡膜から血管が生じる。「萎縮型」ＡＭＤでは、細胞残渣（ドルーゼン）が網膜と脈絡膜の間に蓄積する。いずれの型においても、網膜剥離が起こり得る。
本明細書で使用する場合、「眼科疾患」もしくは「眼科状態」または「眼疾患」もしくは「眼状態」は、眼の血管新生障害に影響を及ぼすまたはそれらに伴う全ての疾患または状態を指し、眼の血管新生障害としては例えば、黄斑変性（「滲出型」および「萎縮型」）、未熟網膜症、糖尿病性網膜症、血管新生緑内障、角膜血管新生、増殖性糖尿病性網膜症（糖尿病性網膜症の最も重篤な段階）、ブドウ膜炎（黄斑浮腫を引き起こす場合が多い、眼の炎症状態）、白内障手術後の嚢胞性黄斑浮腫、近視性変性（非常に近眼な患者において、脈絡膜新生血管が発症する状態）、炎症性黄斑変性（感染または他の原因によって黄斑領域に炎症を生じた患者が脈絡膜新生血管を発症する状態）、および虹彩血管新生（虹彩表面に新しい血管の発生を伴う、糖尿病性網膜症または網膜静脈閉塞の重篤な合併症）が挙げられる。
本明細書で使用する場合、「腎臓疾患」または「腎臓状態」とは、増殖性腎臓障害に影響を及ぼすまたはそれらに伴う全ての疾患または状態を指し、増殖性腎臓障害としては例えば、糸球体腎炎、メサンギウム増殖性腎臓疾患、多嚢胞性腎疾患、腎臓癌、急性腎不全、腎障害、アミロイドーシス、浮腫、線維症、糸球体疾患、腎臓梗塞および腎炎が挙げられる。
本明細書で使用する場合「癌」とは、制御できない、かつ、異常な細胞増殖を伴う疾患または状態を意味する。一般的な癌の数例としては、膀胱癌、肺癌、乳癌、黒色腫、結腸および直腸癌、リンパ腫、子宮内膜癌、膵癌、肝臓癌、腎臓癌、前立腺癌、白血病および甲状腺癌が挙げられる。
本明細書で使用する場合、「調節する」とは、高めるまたは低下させることによって、ペプチドもしくはポリペプチドのレベルを変化させること、または高めるもしくは低下させることによって、ペプチドもしくはポリペプチドの安定性もしくは活性を変化させることを意味する。用語「阻害する」は、ペプチドもしくはポリペプチドのレベルを低下させること、またはペプチドもしくはポリペプチドの安定性もしくは活性を低下させることを
意味する。本明細書に記載したように、調節されるまたは阻害されるタンパク質はＰＤＧＦである。
本明細書で使用する場合、用語「生理活性」とは、生理学的な過程または病態生理学的な過程に影響を及ぼる可能性のある、１つ以上の細胞内もしくは細胞外プロセスに対する効果（例えば、結合、シグナル伝達などを介した）を表す。
本明細書で使用する場合、用語「血小板由来成長因子」および「ＰＤＧＦ」は、ＰＤＧＦのＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤイソ型ならびにそれらのホモ二量体またはヘテロ二量体であるＡＡ、ＢＢ、ＡＢ、ＣＣおよびＤＤを指す。ある場合には、文脈によって、ＰＤＧＦのどのイソ型および／またはヘテロ二量体を指しているかが決定される。例えばいくつかの態様では、ＰＤＧＦに結合するものとしてアプタマーを記載し得るが、本明細書に記載のＰＤＧＦアプタマーはＰＤＧＦ−Ｂイソ型、ならびにそのイソ型を含むホモ二量体およびヘテロ二量体に結合する。この定義に特に含まれるものは、天然に存在するヒトＰＤＧＦのＡＡ、ＡＢ、およびＢＢイソ型および変異体である。本明細書で使用する場合、ＰＤＧＦには、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、霊長類、ウマ、およびウシなどの、全ての哺乳類の種のＰＤＧＦが含まれる。ヒトＰＤＧＦ−Ｂイソ型前駆体の非限定的な例は、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔの受入番号Ｐ０１１２７．１に示される配列を有する。ヒトＰＤＧＦ−Ｂイソ型成熟タンパク質の非限定的な例は、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｐ０１１２７．１の８２〜２４１番目または８２〜１９０番目のアミノ酸の配列を有し得る（本明細書においては、ＰＤＧＦ−Ｂの１〜１６０番目または１〜１０９番目のアミノ酸と呼ぶ）。
本明細書で使用する場合、「ＰＤＧＦ受容体」は、ＰＤＧＦが結合し、ＰＤＧＦによって活性化される受容体、例えばＰＤＧＦ受容体αおよびＰＤＧＦ受容体β、を指す。ＰＤＧＦ受容体には、全ての哺乳類の種、これらには限定されないが、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ウマ、霊長類、およびウシ、の受容体が含まれる。ヒトＰＤＧＦＲβ前駆体の非限定的な例は、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｐ０９６１９．１に示される配列を有する。ヒトＰＤＧＦＲβ成熟タンパク質の非限定的な例は、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｐ０９６１９．１の３３〜１１０６番目のアミノ酸の配列を有する。ヒトＰＤＧＦＲα前駆体の非限定的な例は、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｐ１６２３４．１に示す配列を有する。ヒトＰＤＧＦＲα成熟タンパク質の非限定的な例は、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｐ１６２３４．１の２４〜１０８９番目のアミノ酸の配列を有する。
「ＰＤＧＦアプタマー」とは、ＰＤＧＦに結合可能な、または、ＰＤＧＦの活性を調節可能なアプタマーである。いくつかの態様では、ＰＤＧＦアプタマーはＰＤＧＦの活性をインビトロで阻害する。いくつかの態様では、ＰＤＧＦアプタマーはＰＤＧＦの活性をインビボで阻害する。ＰＤＧＦの非限定的な活性例としては、ＰＤＧＦ介在性のＰＤＧＦ受容体（例えばＰＤＧＦ受容体α（ＰＤＧＦ Ｒα）またはＰＤＧＦ受容体β（ＰＤＧＦ Ｒβ））のリン酸化がある。
いくつかの態様では、本明細書で定義する「ＶＥＧＦアプタマー」は、単量体、二量体または多量体の構築物であり、場合により、リンカーによって連結されている。
本明細書で使用する場合、用語「血管内皮成長因子」および「ＶＥＧＦ」は、イソ型および変異体を含む天然に存在するＶＥＧＦ、例えばＶＥＧＦ−１２１、ＶＥＧＦ−１４５、ＶＥＧＦ−１６５、ＶＥＧＦ−１８３、ＶＥＧＦ−１８９、およびＶＥＧＦ−２０６を指す。本明細書で使用する場合ＶＥＧＦは、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、霊長類、ウマ、およびウシを含む哺乳類の全ての種のＶＥＧＦを含む。ヒトＶＥＧＦ前駆体の非限定的な例は、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｐ１５６９２．２に示す配列を有する。ＶＥＧＦ−１２１は例えば、Ｔｅｅ ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ３５
９：２１９； Ｂｏｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ． （２００４） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７９：１８７１７に記載されている。
本明細書で使用する場合、「ＶＥＧＦ受容体」は、ＶＥＧＦが結合し、ＶＥＧＦによって活性化される受容体、例えばＶＥＧＦＲ−１およびＶＥＧＦＲ−２を指す。ＶＥＧＦ受容体には、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ウマ、霊長類、およびウシを含むがこれらには限定されない哺乳類の任意の種の受容体が含まれる。ヒトＶＥＧＦＲ−１前駆体の非限定的な例は、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｐ１７９４８．２に示す配列を有し得る。ヒトＶＥＧＦＲ−１成熟タンパク質の非限定的な例は、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｐ１７９４８．２の２７〜１３３８番目のアミノ酸の配列を有する。ヒトＶＥＧＦＲ−２前駆体の非限定的な例は、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｐ３５９６８．２に示す配列を有する。ヒトＶＥＧＦＲ−２成熟タンパク質の非限定的な例は、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｐ３５９６８．２の２０〜１３５６番目のアミノ酸の配列を有する。
「ＶＥＧＦアプタマー」とは、ＶＥＧＦに結合可能で、かつ、ＶＥＧＦの活性を調節可能なアプタマーである。いくつかの態様では、ＶＥＧＦアプタマーはＶＥＧＦの活性をインビトロで阻害する。いくつかの態様では、ＶＥＧＦアプタマーはＶＥＧＦの活性をインビボで阻害する。ＶＥＧＦの活性の非限定的な例としては、ＶＥＧＦ介在性のＶＥＧＦ受容体、例えばＶＥＧＦＲ−１またはＶＥＧＦＲ−２、のリン酸化が挙げられる。いくつかの態様では、ＶＥＧＦ−１２１とアプタマー４８６７−３１＿１８３の結合を競合するＶＥＧＦアプタマーが提供される。
いくつかの態様では、本明細書で定義する「ＶＥＧＦアプタマー」は単量体、二量体または多量体の構築物であって、場合により、リンカーによって連結されている。
用語「ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアプタマー構築物」および「ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアプタマー構築物」は同じ意味で用いられ、ＰＤＧＦアプタマーとＶＥＧＦアプタマーを含む構築物を指す。「ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアプタマー構築物」および「ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアプタマー構築物」における語「ＰＤＧＦ」と「ＶＥＧＦ」の順序は、アプタマー同士がどのように繋がれているかを表すものではない。例えば、その順序は、どのアプタマーがアプタマー構築物の最も５’側に位置しているかを示すものでも、どのアプタマーがアプタマー構築物の最も３’側に位置しているかを示すものでもない。いくつかの態様では、ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアプタマー構築物はＰＤＧＦとＶＥＧＦに同時に結合することができる。いくつかの態様では、ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアプタマー構築物はＰＤＧＦとＶＥＧＦのそれぞれに、個別に結合することができる。ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアプタマー構築物では、ＰＤＧＦアプタマーとＶＥＧＦアプタマーは共有結合していても、または非共有結合していても、例えば、ストレプトアビジンおよびビオチンなどの結合対を介して結合していてもよい。ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアプタマー構築物は、ＰＤＧＦアプタマーとＶＥＧＦアプタマーとの間にリンカーを含んでいてもよい。
本明細書で使用する場合、「ＰＤＧＦ介在性の疾患または状態」は、ＰＤＧＦ活性が直接または間接的にその疾患または状態を誘導し得る疾患または状態を指す。ＰＤＧＦ介在性の疾患または状態の非限定的な例としては、心血管疾患、例えばアテローム性動脈硬化症、再狭窄、心肥大に関連する状態、および血管障害；眼科疾患、例えば黄斑変性；線維症；ならびに癌が挙げられる。
本明細書で使用する場合、「ＶＥＧＦ介在性の疾患または状態」は、ＶＥＧＦ活性が直接または間接的にその疾患または状態を誘導し得る疾患または状態を指す。ＶＥＧＦ介在性の疾患または状態の非限定的な例としては、心血管疾患、自己免疫疾患、炎症性リウマチ性疾患、眼科疾患、および疾患過程の様々な期における癌が挙げられる。心血管疾患の
非限定的な例としては、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、心肥大に関連する状態、および血管障害がある。眼科疾患の非限定的な例としては、網膜炎、黄斑変性、脈絡膜炎、網膜症、浮腫、緑内障、および白内障がある。
本明細書で使用する場合、用語「薬学上許容可能な」とは、動物に、より具体的にはヒトに使用することが、連邦または州政府の規制当局によって認可されているか、あるいは米国薬局方でまたは他の一般的に知られている薬局方で定められていることを意味する。用語「担体」は、それらと共に治療が投与される希釈剤、助剤、賦形剤、または媒体を指し、担体には、水や油などの無菌的な液が含まれるがこれらには限定されない。
本明細書で使用する場合、用語「薬学上許容可能な塩」またはＰＤＧＦアプタマー、ＶＥＧＦアプタマーまたはＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアプタマー構築物の「塩」とは、イオン結合を含む、本開示の化合物の産物であり、一般的には本開示の化合物を、酸または塩基と反応させることによって生産される、患者に投与するのに適した産物である。薬学上許容可能な塩には、これらには限定されないが、酸付加塩（塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、アルキルスルホン酸塩、アリールスルホン酸塩、アリールアルキルスルホン酸塩、酢酸塩、安息香酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、乳酸塩、および酒石酸塩など）；アルカリ金属カチオン（例えばＬｉ、Ｎａ、Ｋ、ＭｇまたはＣａなどのアルカリ土類金属塩）、または有機アミン塩が挙げられる。
本明細書で使用する場合、用語「医薬組成物」とは、ＰＤＧＦアプタマー、ＶＥＧＦアプタマー、またはＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアプタマー構築物を、患者に投与するのに適した形状で含んでいる製剤である。医薬組成物は一般的に、予定される投与経路に適合するように製剤化される。投与経路の例としては、これらには限定されないが、経口および非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、吸入、局所、経皮、経粘膜、および直腸投与が挙げられる。
本明細書で使用する場合、用語「治療上有効量」とは通常、本明細書に記載の予防、抑制、または治療される障害または状態の少なくとも１つの症状を回復するのに必要な量を意味する。本開示のＰＤＧＦアプタマー、ＶＥＧＦアプタマー、またはＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアプタマー構築物に関する句「治療上有効量」とは、アプタマーが投与される、そのような治療を必要とする相当数の患者に関し、特定の薬理学的反応を生じるアプタマーの用量を意味する。特定の症例において特定の個人に投与される治療上有効量のアプタマーが、本明細書に記載状態／疾患の治療に常に有効である訳では無いが、それでもなおそのような用量が、当業者によって治療上有効量と見なされることが強調される。
用語「ＳＥＬＥＸ」および「ＳＥＬＥＸ過程」は、本明細書においては同じ意味で用いられ、通常、（１）標的分子と望ましい様式で（例えばタンパク質との高い親和性による結合）相互作用する核酸の選抜、と（２）選抜した核酸の増幅、との組み合わせを指す。ＳＥＬＥＸ過程を利用して、特定の標的分子に対して高い親和性を有するアプタマーを同定することができる。
ＳＥＬＥＸには通常、核酸の候補混合物を調製すること、候補混合物を所望の標的分子に結合させて親和性複合体を形成させること、親和性複合体を結合しなかった候補核酸から分離すること、親和性複合体から核酸を分離・単離すること、核酸を精製すること、および特定のアプタマー配列を同定すること、が含まれる。この過程には、選抜したアプタマーの親和性をより向上させるために、一連の操作を複数回実施すること、を含めてもよい。この過程は、過程の１つ以上の時点で、増幅する工程を含む場合もある。例えば、「核酸リガンド（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ）」という名称の、米国特許第５，４７５，０９６号を参照のこと。ＳＥＬＥＸ過程を利用して、標的と共有結合する
アプタマー、ならびに標的と非共有結合するアプタマーを生成することができる。例えば、「核酸の試験管内進化法：Ｃｈｅｍｉ−ＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ： Ｃｈｅｍｉ−ＳＥＬＥＸ）」という名称の、米国特許第５，７０５，３３７号を参照のこと。
ＳＥＬＥＸ過程を利用して、アプタマーによりよい特徴を、例えば高いインビボでの安定性またはより良い送達性のような特徴を付与する修飾されたヌクレオチドを含む、高親和性アプタマーを同定することができる。そのような修飾の例としては、リボースおよび／またはリン酸塩および／または塩基の位置における化学置換がある。ＳＥＬＥＸ過程によって同定された、修飾されたヌクレオチドを含むアプタマーについては「修飾されたヌクレオチドを含む高親和性核酸リガンド（Ｈｉｇｈ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）」という名称の米国特許第５，６６０，９８５号に記載されており、ここでは、ピリミジンのＣ５位および／または２’位を化学的に修飾したヌクレオチド誘導体を含むオリゴヌクレオチドが説明されている。米国特許第５、５８０、７３７号（上記引用文献参照）では、２’−アミノ（２’−ＮＨ2）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）、および
／または２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）で修飾したヌクレオチドを１つ以上含む、高度に特異的なアプタマーが説明されている。「ＳＥＬＥＸおよびＰＨＯＴＯＳＥＬＥＸ（ＳＥＬＥＸ ａｎｄ ｐｈｏｔｏＳＥＬＥＸ）」という名称の米国特許公開公報第２００９００９８５４９号も参照のこと。ここでは、多様な物理的および化学的特性を有する核酸ライブラリーと、それらのＳＥＬＥＸおよびｐｈｏｔｏＳＥＬＥＸにおける使用が記載されている。
ＳＥＬＥＸを利用して、所望の解離定数を特徴として有するアプタマーを同定することもできる。「改善された解離定数を有するアプタマーの生成方法（Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ
Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ Ａｐｔａｍｅｒｓ ｗｉｔｈ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｏｆｆ−Ｒａｔｅｓ）」という名称の米国特許第７，９４７，４４７号を参照のこと。ここでは、標的分子に結合することが可能なアプタマーを生成するための、改良されたＳＥＬＥＸ法が記載されている。それぞれの対応する標的分子からの解離定数が低いアプタマーとフォトアプタマーの生産方法が記載されている。この方法は、候補混合物と標的分子を接触させて、核酸−標的複合体の形成を起こすこと、および低解離定数濃縮過程を実施することを含み、この低解離定数濃縮過程では、高い解離定数を有する核酸−標的複合体は解離し、かつ、再構成されないが、低解離定数の複合体は完全な状態で維持される。加えて、この方法には、改善された解離定数を有するアプタマーを生成するための候補核酸混合物を生産する時点における、修飾されたヌクレオチドの使用も含まれる（ＳＥＬＥＸおよびＰＨＯＴＯＳＥＬＥＸ（ＳＥＬＥＸ ａｎｄ ｐｈｏｔｏＳＥＬＥＸ）という名称の米国特許公開公報第２００９／００９８５４９号を参照のこと）。（また、米国特許第７，８５５，０５４号および米国特許公開公報第２００７／０１６６７４０号も参照のこと）。これらの出願はそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの態様では、（ａ）核酸の候補混合物を調製すること、ここで、候補混合物は、候補混合物の核酸の少なくとも１つまたはそれぞれに含まれる少なくとも１つのピリミジンがＣ５位で化学的に修飾されている修飾された核酸を含み；（ｂ）候補混合物と標的分子とを接触させること、ここで、候補混合物中の他の核酸よりも標的分子に対して高い親和性を有する核酸が標的分子に結合して核酸−標的分子複合体を形成し；（ｃ）候補混合物のその他の部分から、高い親和性を有する核酸を分けること；および（ｄ）高い親和性の核酸を増幅して、標的分子に高い親和性で結合することが可能な核酸配列に富んだ核酸混合物を得て、それによって標的分子に対するアプタマーを同定すること、を含む、標的分子に結合するアプタマーの選抜方法を提供する。一定の態様においてこの方法は、さ
らに、低解離定数濃縮過程を実施することを含む。
「標的」または「標的分子」または「標的」は本明細書では、それらに対して、核酸が所望の様式で作用することが可能な全ての化合物を指す。標的分子は、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、脂質、多糖、糖タンパク質、ホルモン、受容体、抗原、抗体、ウイルス、病原体、有毒物質、基質、代謝産物、移行期類似体、補因子、阻害剤、薬剤、色素、栄養分、成長因子、細胞、組織、前述したものの任意の部分または断片などであってよいが、これらには限定されない。実際には、任意の化学的または生物学的なエフェクターが好適な標的であってよい。どのような大きさの分子も標的となり得る。標的と核酸との相互作用の効率や強度を高めるために、特定の方法で、標的を修飾することもできる。標的は、特定の化合物または分子に任意の僅かな変異を含む場合もある。例えばタンパク質の場合には例えば、アミノ酸配列、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質付加、アセチル化、リン酸化、または、標識成分（分子の同一性に実質的な変化を及ぼさない）との結合などの任意の他の操作もしくは修飾に、僅かな変異を含み得る。「標的分子」または「標的」は、アプタマーに結合可能な分子もしくは多分子構造の１つの型もしくは１つの種のコピーの組みである。「標的分子」または「標的」は、２つ以上のそのような分子の組みを指す。標的がペプチドであるＳＥＬＥＸ過程の態様が、「精製したタンパク質を伴わない改善ＳＥＬＥＸ過程（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＳＥＬＥＸ Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ Ｗｉｔｈｏｕｔ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ）」という名称の米国特許第６，３７６，１９０号に記載されている。
ＰＤＧＦアプタマーの例
本開示のＰＤＧＦアプタマーを、実施例１に記載したように、低解離定数を有するアプタマーを同定するための改良ＳＥＬＥＸ法によって同定した。実施例１では、低解離定数でＰＤＧＦに結合するアプタマーの選抜と生産に関する代表的な方法を記載した。選抜には、ベンジル−ｄＵ（Ｂｎ−ｄＵ）、ｄＡ、ｄＣおよびｄＧから構成したランダムＤＮＡライブラリーを使用した。この方法により、アプタマー４１４９−８＿１（配列番号１）と命名した、ＰＤＧＦ−ＢＢに対するＤＮＡアプタマーを同定した。
アプタマー４１４９−８＿１（配列番号１）を用い、ＰＤＧＦに対する強い親和性を維持するのに必要とされる最少の長さの配列を同定するための試験を実施した。５’および３’末端から切断型を合成し、それにより、２９個のヌクレオチド（４１４９−８＿３８；配列番号３８）を含むコアモチーフが同定された。アプタマー４１４９−８＿３８は、ＰＤＧＦ−ＢＢに対する高い結合親和性を示した（Ｋd値：２０ｐＭ；図６）。
アプタマー４１４９−８＿１（配列番号１）を選抜した配列プールに対し、配列決定試験を追加して行った。並列ピロシークエンシングを利用した大規模・高処理法である４５４配列決定では偏りのない試料が調製され、非常に正確な配列解析が行われる。図３に示すように、配列決定のデータを使用して、ＰＤＧＦアプタマーに対する保存配列を同定した。さらに、図６に示したヌクレオチド置換試験により、ＰＤＧＦとの結合には、保存配列中の６番目と８番目のＢｎｄＵが望まれるが、４番目のＢｎｄＵはｄＴと置換しても結合活性への影響は小さいかまたはなかった。保存配列を図３Ａに示す。同時に、それぞれの位置のヌクレオチド頻度をアプタマー４１４９−８＿１（配列番号１）と比較したグラフを示した。
いくつかの態様においてＰＤＧＦアプタマーは、
５’−ＮＺＶＳＬnＳ’Ｖ’ＺＡＣＮＮmＧＣＧＺＺＺＡＺＡＧＣＧ−３’（配列番号５００）
の配列を含み、
式中、
ＶはＡ、ＣまたはＧから選択され；
Ｖ’はＣ、ＧまたはＺから選択され、ここでＶ’はＶに相補的であり；
ＳおよびＳ’はＣまたはＧから独立して選択され、ここでＳとＳ’は互いに相補的であり；
Ｎはそれぞれ、任意の天然に存在するまたは修飾されたヌクレオチドから独立して選択され；
Ｚはそれぞれ、修飾されたピリミジンから独立して選択され；
Ｌは、任意の天然に存在するまたは修飾されたヌクレオチド、炭化水素リンカー、ポリエチレングリコールリンカーまたはそれらの組み合わせから選択され；
ｎは０〜２０であり；かつ、ｍは０〜２０であり；および、場合により１つ以上ヌクレオチドの挿入が含まれる。
いくつかの態様においてＰＤＧＦアプタマーは、
５’−ＺＺＶＳＬnＳ’Ｖ’ＺＡＣＮＮmＧＣＧＺＺＺＡＺＡＧＣＧ−３’（配列番号５０１）
の配列を含み、式中、Ｖ、Ｖ’、Ｎ、Ｓ、Ｓ’、Ｚ、Ｌ、ｎ、およびｍは上で定義したのと同様である。
いくつかの態様においてＰＤＧＦアプタマーは、
５’−ＺＺＶＣＬnＧＶ’ＺＡＣＮＭＧＣＧＺＺＺＡＺＡＧＣＧ−３’（配列番号５０２
）
の配列を含み、
式中、Ｚ、Ｖ、Ｖ’、Ｎ、Ｚ、Ｌ、およびｎは上で定義したのと同様であり、ＭはＣおよびＡから選択される。
いくつかの態様においてＰＤＧＦアプタマーは、
５’−ＺＺＡＣＬnＧＺＺＡＣＡＣＧＣＧＺＺＺＡＺＡＧＣＧ−３’（配列番号５０３）
の配列を含み、
式中、Ｚ、Ｌ、およびｎは上で定義したのと同様である。
いくつかの態様においてＰＤＧＦアプタマーは、
５’−ＺＺＡＣＧＡＣＺＡＣＧＺＺＡＣＡＣＧＣＧＺＺＺＡＺＡＧＣＧ−３’（配列番号５０４）の配列を含み、
式中、Ｚは上で定義したのと同様である。
いくつかの態様においてＰＤＧＦアプタマーは、
５’−ＺＶＳＬnＳ’Ｖ’ＺＡＣＮＮmＧＣＧＺＺＺＡＺＡＧ−３’（配列番号５０７）
の配列を含み、
式中、
ＶはＡ、ＣまたはＧから選択され；
Ｖ’はＣ、ＧまたはＺから選択され、ここでＶ’はＶに相補的であり；
ＳおよびＳ’はＣまたはＧから独立して選択され、ここでＳとＳ’は互いに相補的であり；
Ｎはそれぞれ、修飾されたまたは未修飾のヌクレオチドから独立して選択され；
Ｚはそれぞれ、修飾されたピリミジンから独立して選択され；
Ｌは置換されたまたは未置換のＣ2−Ｃ20リンカーおよび修飾されたまたは未修飾のヌク
レオチドから選択され；
ｎは１〜５０であり；かつ、ｍは０〜５０であり；および
場合により、１つ以上のヌクレオチドの挿入が含まれる。
いくつかの態様においてＰＤＧＦアプタマーは、
５’-Ｚ’ＺＶＳＬnＳ’Ｖ’ＺＡＣＮＮmＧＣＧＺＺＺＡＺＡＧＣ−３’（配列番号５０
８）
の配列を含み、
式中、Ｚ’は修飾されたピリミジンまたはｄＴであり；およびＶ、Ｖ’、Ｎ、Ｓ、Ｓ’、Ｚ、Ｌ、ｎ、およびｍは上で定義したのと同様である。
いくつかの態様においてＰＤＧＦアプタマーは、
５’Ｚ’ＺＶＣＬnＧＶ’ＺＡＣＮＭＧＣＧＺＺＺＡＺＡＧＣ−３’（配列番号５０９）
の配列を含み、
式中、Ｚ、Ｚ’、Ｖ、Ｖ’、Ｎ、Ｚ、Ｌ、およびｎは上で定義したのと同様であり、かつ、ＭはＣおよびＡから選択される。
いくつかの態様においてＰＤＧＦアプタマーは、
５’Ｚ’ＺＡＣＬnＧＺＺＡＣＡＣＧＣＧＺＺＺＡＺＡＧＣ−３’（配列番号５１０）
の配列を含み、
式中、Ｚ、Ｚ’、Ｌ、およびｎは上で定義したのと同様である。
いくつかの態様においてＰＤＧＦアプタマーは、
５’-Ｚ’ＺＡＣＧＡＣＺＡＣＧＺＺＡＣＡＣＧＣＧＺＺＺＡＺＡＧＣ−３’（配列番号
５１１）
の配列を含み、
式中、ＺおよびＺ’は上で定義したのと同様である。
いくつかの態様においてＰＤＧＦアプタマーは、
５’−ＺＡＢＬpＧＹＺＡＢＫqＧＣＧＺＺＹＤＹＡＧ−３’（配列番号５０５）
の配列を含み
式中、Ｚはそれぞれ独立して修飾されたピリミジンであり；
ＢはそれぞれＣおよび置換されたまたは未置換のＣ2−Ｃ10リンカーから独立して選択さ
れ；
Ｌはそれぞれ独立して置換されたまたは未置換のＣ2−Ｃ10リンカー、ヘキサエチレング
リコールリンカー、および修飾されたまたは未修飾のヌクレオチドから選択され、ここでｐは１〜１０であり；
Ｙはそれぞれ独立して修飾されたまたは未修飾のピリミジンから選択され；
Ｋはそれぞれ独立して置換されたまたは未置換のＣ2−Ｃ10リンカー、ヘキサエチレング
リコールリンカー、および置換されたまたは未置換のヌクレオチドから選択され、ここでｑは１〜５であり；および
ＤはＡおよび置換されたまたは未置換のＣ2−Ｃ10リンカーから選択される。
いくつかの態様においてＰＤＧＦアプタマーは、
５’−ＸＺＡＢＬnＧＹＺＡＢＬnＧＣＧＺＺＹＤＹＡＧＢＥ−３’（配列番号５０６）
の配列を含み、
式中、Ｘは修飾されたまたは未修飾のピリミジンおよび置換されたまたは未置換のＣ2−
Ｃ10リンカーから選択されるかあるいは欠損しており；およびＥはＧおよび置換されたまたは未置換のＣ2−Ｃ10リンカーから選択されるか、あるいは欠損している。
配列ＮＺＶＳ（配列番号７６１）とＳ’Ｖ’ＺＡＣＮＮmＧＣＧＺＺＺＡＺＡＧＣＧ（
配列番号７６２）を含み、
式中、
ＶはＡ、ＣまたはＧから選択され；Ｖ’はＣ、ＧまたはＺから選択され、ここでＶ’はＣ
、ＧまたはＺから選択され、ここでＶ’はＶに相補的であり；
ＳおよびＳ’はＣまたはＧから独立して選択され、ここでＳとＳ’は互いに相補的であり；
Ｎは任意の天然に存在するまたは修飾されたヌクレオチドから独立して選択され；
Ｚは修飾されたピリミジンから独立して選択され；
ｍは１〜２０であり；および
場合により、１つ以上のヌクレオチドの挿入が含まれる、
アプタマー構築物。
いくつかの態様では、Ｚは修飾されたウリジンである。いくつかの態様では、Ｚはそれぞれ独立して、本明細書で定義したＣ-５が修飾されたピリミジンから選択される。いく
つかの態様では、Ｚはそれぞれ独立して、
５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、
５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−フェネチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＰＥｄＵ）、
５−（Ｎ−チオフェニルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｈｄＵ）、
５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、
５−（Ｎ−チロシルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｙｒｄＵ）、
５−（Ｎ−３，４−メチレンジオキシベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＭＢｎｄＵ）、
５−（Ｎ−４−フルオロベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＦＢｎｄＵ）、
５−（Ｎ−３−フェニルプロピルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＰＰｄＵ）、
５−（Ｎ−イミジゾリルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＩｍｄＵ）、
５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−トリプトアミノカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、
５−（Ｎ−Ｒ−トレオニニルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｈｒｄＵ）、
５−（Ｎ−トリプトアミノカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−トリプトアミノカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジンクロリド、
５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、
５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−［１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン）、
５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（２ＮａｐｄＵ）、
５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮＥｄＵ）、
５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（２ＮＥｄＵ）、
５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢＦｄＵ）、
５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢＴｄＵ）、
５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、および
５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジンから選択される。
一定の態様では、ＰＤＧＦおよび／またはＶＥＧＦアプタマーの一部分（Ｙ）は結合を維持するのに必要ではない場合があり、また、連続したＰＤＧＦおよび／またはＶＥＧＦアプタマーの特定の部分を、例えばスペーサーまたはリンカー部分との置き換えを含むがこれらには限定されない修飾によって、修飾することができる。これらの態様では例えば、ＹをＹ’−Ｑ−Ｙ’’−Ｑ’−Ｙ’’’と表すことができ、ここでＹ’、Ｙ’’およびＹ’’’はＰＤＧＦおよび／またはＶＥＧＦアプタマーの一部分であるか、または異なるＰＤＧＦおよび／またはＶＥＧＦアプタマーのセグメントであり、Ｑおよび／またはＱ’は、もとのＰＤＧＦおよび／またはＶＥＧＦアプタマーの特定の核酸特性を修正するスペーサーまたはリンカー分子である。ＱおよびＱ’が存在しない場合には、Ｙ’、Ｙ’’、およびＹ’’’は１つの連続したＰＤＧＦおよび／またはＶＥＧＦアプタマー（Ｙ）を表す。
本明細書で使用する場合「リンカー」とは、２つ以上の分子実体を共有結合または非共有相互作用で接続する分子実体であり、１つ以上の分子実体の機能特性を保存する様式で、分子実体同士を空間的に隔てることもできる。リンカーはスペーサーとしても知られている。当業者は本開示に基づいて、適切なリンカー配列を容易に確認できる。
本明細書で使用する場合、リンカーは、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチド核酸、ロックド核酸、オリゴ糖、多糖、抗体、アフィボディ、抗体模倣物、脂肪族、芳香族もしくは複素環式芳香族炭素分子、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子、細胞受容体、リガンド、脂質、これらの構造の任意の断片または誘導体、前述したものの任意の組み合わせ、または任意の他の化学構造または要素を含むがこれらには限定されない群から選択される、１つ以上の分子またはサブコンポーネントを含み得る。
いくつかの態様では、少なくとも１つのＬはポリエチレングリコールリンカーである。いくつかの態様では、少なくとも１つのＬはヘキサエチレングリコールリンカーである。いくつかの態様では、Ｌは置換されたまたは未置換のＣ2−Ｃ10リンカーである。いくつ
かの態様では、ｐは１、２、３、４、５、６、７、または８である。いくつかの態様では、ｐは１、２、または３である。いくつかの態様では、少なくとも１つのＫはポリエチレングリコールリンカーである。いくつかの態様では、少なくとも１つのＫはヘキサエチレングリコールリンカーである。いくつかの態様では、Ｋは置換されたまたは未置換のＣ2
−Ｃ10リンカーである。いくつかの態様では、ｑは１または２である。いくつかの態様では、ｑは１である。
種々の態様において、ｍは０〜２０、０〜１９、０〜１８、０〜１７、０〜１６、０〜１５、０〜１５、０〜１４、０〜１３、０〜１２、０〜１１、０〜１０、０〜９、０〜８、０〜７、０〜６、０〜５、０〜４、または０〜３であってよい。
いくつかの態様では、Ｌはリンカー、例えば１８−原子ヘキサエチレングリコールリンカーであってよい。いくつかの態様では、Ｌはヌクレオチドとリンカーの組み合わせであってよい。非限定的な例として、以下のアプタマー（配列番号６７および６９）は、ヘキサエチレングリコール（Ｈｅｇ）リンカーを含み：
（配列番号６７）５’Ｂｎ−Ｂｎ−Ａ−Ｃ−Ｈｅｇ−Ｇ−Ｂｎ−Ｂｎ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｂｎ−Ｂｎ−Ｂｎ−Ａ−Ｂｎ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−３’
（配列番号６９）５’Ｂｎ−Ｂｎ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｈｅｇ−Ｃ−Ｇ−Ｂｎ−Ｂｎ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｂｎ−Ｂｎ−Ｂｎ−Ａ−Ｂｎ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−３’
式中、Ｂｎはベンジル−ｄＵであり、Ｈｅｇはヘキサエチレングリコールリンカーである。
いくつかの態様では、Ｎを、以下のアプタマーでのように、リンカーで置き換えてもよい：
（配列番号３２９）５’Ｂｎ−Ｂｎ−Ａ−Ｃ−Ｈｅｇ−Ｇ−Ｂｎ−Ｂｎ−Ａ−Ｃ−Ｃ３−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｂｎ−Ｂｎ−Ｂｎ−Ａ−Ｂｎ−Ａ−Ｇ−Ｃ−３’
（配列番号４０８）５’Ｂｎ−Ｂｎ−Ａ−Ｃ−Ｈｅｇ−Ｇ−Ｂｎ−Ｂｎ−Ａ−Ｃ−Ｃ３−Ｃ−Ｇ−Ｂｎ−Ｂｎ−Ｂｎ−Ａ−Ｂｎ−Ａ−Ｇ−３’
式中、Ｂｎはベンジル−ｄＵであり、Ｈｅｇはヘキサエチレングリコールリンカーであり、Ｃ３は３炭素リンカーである。
さらなるＰＤＧＦアプタマーを実施例５に記載したように、低解離定数を有するアプタマーを同定するための改良ＳＥＬＥＸ法によって同定した。実施例５では、低解離定数でＰＤＧＦに結合するアプタマーの選抜・生産に関する代表的な方法を記載した。選抜には、ナフチル−ｄＵ（Ｎａｐ−ｄＵ）、ｄＡ、ｄＣおよびｄＧから構成したランダムＤＮＡライブラリーを使用した。スクリーニングから、ＰＤＧＦアプタマー５１６９−４＿２６を同定した。
いくつかの態様ではＰＤＧＦに特異的に結合するアプタマーを提供し、ここでこのアプタマーは、ＰＤＧＦへの結合に関し、ＰＤＧＦアプタマー５１６９−４＿２６と競合する。そのような態様のいくつかにおいては、アプタマーは、疎水性の核酸塩基修飾を含有する少なくとも１つの修飾されたヌクレオシドを含む。さらにそのような態様のいくつかでは、疎水性の核酸塩基修飾は、修飾されたピリミジンである。いくつかの態様では、修飾されたピリミジンはそれぞれ独立して、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−フェネチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＰｅｄＵ）、５−（Ｎ−チオフェニルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｈｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−トリプトアミノカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、５−（Ｎ−トリプトアミノカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−トリプトアミノカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジンクロリド、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−ナフチルメチルカ
ルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、および５−（Ｎ−［１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン）から選択することができる。
いくつかの態様ではＰＤＧＦに特異的に結合するアプタマーを提供し、ここでアプタマーは、
５’−ＡＣＡＬnＺＧＺＡＺＧＬmＺＬＺ−３’（配列番号５１２）
の配列を含み、
式中、Ｚはそれぞれ独立して修飾されたピリミジンであり；Ｌはそれぞれ独立して置換されたまたは未置換のＣ2−Ｃ50リンカー、ポリエチレングリコールリンカー、および置換
されたまたは未置換のヌクレオチドから選択され；ｎは１〜５であり；およびｍは１〜１０である。
いくつかの態様では、それぞれ、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−フェネチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＰｅｄＵ）、５−（Ｎ−チオフェニルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｈｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−トリプトアミノカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、５−（Ｎ−トリプトアミノカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−トリプトアミノカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジンクロリド、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、および５−（Ｎ−［１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン）から独立して選択される。いくつかの態様では、少なくとも１つの、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、またはそれぞれのＺは５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）である。いくつかの態様では、ｎは１、２、３、４、または５である。いくつかの態様では、ｍは１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。いくつかの態様では、ｎは３である。いくつかの態様では、ｍは４である。そのような態様のいくつかでは、Ｌはそれぞれ独立して、修飾されたヌクレオチド、未修飾のヌクレオチド、およびＣ3リンカーから選択される。
Ｃ2−Ｃ50リンカーまたはスペーサーは、２〜５０個の炭素原子（Ｃ2−Ｃ50）（置換、非置換、直鎖、分岐鎖または環状）、０〜１０個のアリール基、０〜１０個のヘテロアリール基、および０〜１０個の複素環基の鎖を含む主鎖であってよく、場合により、エーテル（−Ｏ−）結合、（例えば、１つ以上のエチレングリコール単位−Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）−を含むがこれらには限定されない、１つ以上アルキレングリコール単位；１つ以上の１，３−プロパンジオール単位−Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）−など）；アミン（−ＮＨ
−）結合；アミド（−ＮＣ（Ｏ）−）結合；およびチオエーテル（−Ｓ−）結合などを含み、ここで各骨格に含まれる炭素原子は独立して置換されていなくても（つまり−Ｈ置換基を含む）または、Ｃ1〜Ｃ3アルキル、−ＯＨ、−ＮＨ2、−ＳＨ、−Ｏ−（Ｃ1−Ｃ6ア
ルキル）、−Ｓ−（Ｃ1−Ｃ6アルキル）、ハロゲン、−ＯＣ（Ｏ）（Ｃ1−Ｃ6アルキル）、−ＮＨ−（Ｃ1−Ｃ6アルキル）から選択される１つ以上の基などで置換されていてもよい。いくつかの態様においてＣ2−Ｃ50リンカーは、Ｃ2−Ｃ20リンカー、Ｃ2−Ｃ10リン
カー、Ｃ2−Ｃ8リンカー、Ｃ2−Ｃ6リンカー、Ｃ2−Ｃ5リンカー、Ｃ2−Ｃ4リンカー、ま
たはＣ3リンカーであり、ここでそれぞれの炭素は独立して、上述したように置換されて
いてもよい。
いくつかの態様では、ＰＤＧＦアプタマーの１つ以上のヌクレオシドは、２位の糖修飾（２’−アミノ（２’−ＮＨ2）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）、または２’−Ｏ−メチ
ル（２’−ＯＭｅ）など）、シトシン環外アミンの修飾、ヌクレオシド間結合の修飾、および５−メチル−シトシンから選択される修飾を含む。いくつかの態様では、ＰＤＧＦアプタマーは、３’キャップ、５’キャップ、および／または３’末端に逆位のデオキシチミジンを含む。
いくつかの態様においてＰＤＧＦアプタマーは、少なくとも１つの修飾されたヌクレオシド間結合を含む。いくつかの態様では、少なくとも１つの、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、または少なくとも５つのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。
いくつかの態様においてＰＤＧＦアプタマーは、表１、２および６〜９に示す配列から選択される配列を有する（配列番号１〜４９９および５１７〜５４５）。いくつかの態様では、ＰＤＧＦアプタマーは、ＰＤＧＦに１０ｎＭ未満の親和性（Ｋd）で結合する表１
に示す配列および表６〜９に示す配列から選択される配列を有する。いくつかの態様では、ＰＤＧＦアプタマーは、表１、２、および６〜９に示す配列（配列番号：１から１〜４９９および５１７〜５４５）と、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一の配列を有する。いくつかの態様では、ＰＤＧＦアプタマーは、ＰＤＧＦに１０ｎＭ未満の親和性（Ｋd）で結合する表１に示す配列および表６〜９に示す配列と少なくとも９０％、少なくと
も９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一の配列を有する。
用語「配列同一性」、「パーセントの配列同一性」、「パーセントの同一性」、「％同一な」、「％同一」、およびそれらの変異型は、２つの核酸配列に関して使用される場合、同じ意味で用いられ、最大一致に関して参照核酸と比較・整列し、（１）最も５’側の対応する（すなわち整列した）ヌクレオチド塩基と最も３’側の対応する（すなわち整列した）ヌクレオチド塩基の間であって、かつ、これらを含めた、目的の配列に含まれるヌクレオチド塩基の数か、または（２）参照配列の全長、のいずれか大きい方で割った場合に、目的の核酸または目的の核酸の一部に含まれる同じヌクレオチド塩基の数を指す。比較するための配列アライメントの例は例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ （１９８１） Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２：４８２の局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ （１９７０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３の相同性整列アルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ （１９８８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：２４４４の相同性検索法、これらのアルゴリズムのコンピューターへの実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＰａｃｋａｇｅのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ。Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， ５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、マジソン、ウィスコンシン）または目視による確認によって実施することができる（基本的に、Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ． ｅｔ ａｌ． （１９８７）， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ． ａｎｄ
Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅを参照のこと）。
配列同一性（％）を決定するのに適したアルゴリズムの一例としては、ベーシック・ローカル・アライメント・ツール（ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ、以降「ＢＬＡＳＴ」とする）に用いられているアルゴリズムがある。例えばＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３およびＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １５：３３８９を参照のこと。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、以降「ＮＣＢＩ」とする）で公開されている。ＮＣＢＩから入手可能なソフトウェア、例えばヌクレオチド配列用のＢＬＡＳＴＮ、を利用した配列同一性の決定で使用されているデフォルトの指標については、ＭｃＧｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ． （２００４） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３２：Ｗ２０に記載されている。
本明細書で使用する場合、ある核酸、例えばＰＤＧＦアプタマーの配列が参照のヌクレオチド配列と、少なくとも、例えば、約９５％同一であるとは、その核酸配列が、参照核酸配列の１００個のヌクレオチドあたり５つまでの点突然変異を含み得るということを除いて、参照配列と同一であるということを意図している。言い換えると、参照核酸配列と少なくとも約９５％同一の所望の核酸配列を得るためには、参照配列に含まれるヌクレオチドの５％までを欠損させてもよいか、または別のヌクレオチドで置換してもよい、あるいは参照配列に含まれているヌクレオチドの数の５％までの数のヌクレオチドを挿入してもよいことを意図している（本明細書では挿入と呼ぶ）。所望の配列を生成するための、参照配列へのこのような突然変異は、参照ヌクレオチド配列の５’もしくは３’末端で、または末それら端の間にあるいずれかの位置で生じていても、あるいは参照配列のヌクレオチドに散在していても、または参照配列の１つ以上の連続した群の中にあってもよい。さらに、ヌクレオチド塩基が、（１）参照配列のヌクレオチド塩基と同じである、または（２）参照配列中のヌクレオチド塩基に由来するものである、または（３）参照配列中のヌクレオチド塩基の由来となったのと同じヌクレオチド塩基に由来するものである場合、パーセント同一性を決定する目的において、そのヌクレオチド塩基は「同一である」と見なされる。例えば、パーセント同一性を計算する目的においては、５−メチルシトシンはシトシンと「同一である」と見なされる。同様に、図１２に示す修飾されたウリジンは、パーセント同一性を計算する目的においては、互いに同一であると見なされる。参照配列は配列番号１〜４３７に示すヌクレオチド配列のいずれか１つであってよい。
いくつかの態様において本開示は、ＰＤＧＦに結合するとＰＤＧＦの機能を調節するＰＤＧＦアプタマーを提供する。いくつかの態様では、本明細書に記載のＰＤＧＦアプタマーは、ＰＤＧＦ受容体、例えばＰＤＧＦ ＲαまたはＰＤＧＦ Ｒβの、ＰＤＧＦ介在性リン酸化を阻害する。いくつかの態様では、本明細書に記載のＰＤＧＦアプタマーは、ＰＤＧＦ ＲβのＰＤＧＦ介在性リン酸化を阻害する。様々な態様では、ＰＤＧＦアプタマーはインビボでのＰＤＧＦの機能、例えばインビボでのＰＤＧＦ介在性受容体リン酸化の阻害、を調節する。様々な態様では、ＰＤＧＦアプタマーは、配列番号１〜４３７の配列から選択される配列を有する。様々な態様では、ＰＤＧＦアプタマーは、表１および２で示すアプタマーから選択される。様々な態様では、ＰＤＧＦアプタマーは、表１で示すアプタマーから選択される。いくつかの態様では、ＰＤＧＦアプタマーは、配列番号１から１〜４９９および５１７〜５４５から選択される配列の、少なくとも１２の、少なくとも１３の、少なくとも１４の、少なくとも１５の、少なくとも１６の、少なくとも１７の、少なくとも１８の、少なくとも１９の、少なくとも２０の、少なくとも２１の、少なくとも２１の、少なくとも２２の、少なくとも２３の、少なくとも２４の、少なくとも２５の、少なくとも２６の、少なくとも２７の、少なくとも２８の、少なくとも２９の、または少なくとも３０の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、ＰＤＧＦアプタマーは、配列番号１から１〜４９９および５１７〜５４５から選択される配列と核酸配列が
同一の、少なくとも１２の、少なくとも１３の、少なくとも１４の、少なくとも１５の、少なくとも１６の、少なくとも１７の、少なくとも１８の、少なくとも１９の、少なくとも２０の、少なくとも２１の、少なくとも２１の、少なくとも２２の、少なくとも２３の、少なくとも２４の、少なくとも２５の、少なくとも２６の、少なくとも２７の、少なくとも２８の、少なくとも２９の、または少なくとも３０の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、ＰＤＧＦアプタマーは、表１、２、６、７、８または９に示すアプタマーの、少なくとも１２の、少なくとも１３の、少なくとも１４の、少なくとも１５の、少なくとも１６の、少なくとも１７の、少なくとも１８の、少なくとも１９の、少なくとも２０の、少なくとも２１の、少なくとも２１の、少なくとも２２の、少なくとも２３の、少なくとも２４の、少なくとも２５の、少なくとも２６の、少なくとも２７の、少なくとも２８の、少なくとも２９の、または少なくとも３０の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、ＰＤＧＦアプタマーは、表１に示すアプタマーまたは、ＰＤＧＦに１０ｎＭ未満の親和性（Ｋd）で結合する表６〜９のいずれか１つに示すアプタマーの
、少なくとも１２の、少なくとも１３の、少なくとも１４の、少なくとも１５の、少なくとも１６の、少なくとも１７の、少なくとも１８の、少なくとも１９の、少なくとも２０の、少なくとも２１の、少なくとも２１の、少なくとも２２の、少なくとも２３の、少なくとも２４の、少なくとも２５の、少なくとも２６の、少なくとも２７の、少なくとも２８の、少なくとも２９の、または少なくとも３０の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、ＰＤＧＦアプタマーは、表１、２、６、７、８または９に示すアプタマーの、少なくとも１２の、少なくとも１３の、少なくとも１４の、少なくとも１５の、少なくとも１６の、少なくとも１７の、少なくとも１８の、少なくとも１９の、少なくとも２０の、少なくとも２１の、少なくとも２１の、少なくとも２２の、少なくとも２３の、少なくとも２４の、少なくとも２５の、少なくとも２６の、少なくとも２７の、少なくとも２８の、少なくとも２９の、または少なくとも３０の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、ＰＤＧＦアプタマーは、表１に示すアプタマーまたは、ＰＤＧＦに１０ｎＭ未満の親和性（Ｋd）で結合する表６〜９のいずれか１つに示すアプタマーの、少な
くとも１２の、少なくとも１３の、少なくとも１４の、少なくとも１５の、少なくとも１６の、少なくとも１７の、少なくとも１８の、少なくとも１９の、少なくとも２０の、少なくとも２１の、少なくとも２１の、少なくとも２２の、少なくとも２３の、少なくとも２４の、少なくとも２５の、少なくとも２６の、少なくとも２７の、少なくとも２８の、少なくとも２９の、または少なくとも３０の連続したヌクレオチドを含む。
いくつかの態様では、ＰＤＧＦアプタマーは、配列番号５００〜５１２、７６１および７６２の配列から選択される核酸塩基配列を有する。いくつかの態様では、ＰＤＧＦアプタマーは、配列番号１から１〜４９９および５１７〜５４５のいずれか１つの配列を有する。いくつかの態様では、ＰＤＧＦアプタマーは、配列番号１から１〜４９９および５１７〜５４５のいずれか１つと、少なくとも９５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８０％同一、または少なくとも７５％同一である。本明細書の態様のいずれか１つでは、ＰＤＧＦアプタマーは、アプタマーの５’末端、３’末端、または５’末端と３’末端の両方に、追加のヌクレオチドまたは他の化学部分を含んでいてもよい。
ＰＤＧＦアプタマーは、ＰＤＧＦ結合領域に加えて、いかなる数のヌクレオチドを含んでいてもよい。様々な態様では、ＰＤＧＦアプタマーは、約１００までのヌクレオチド、約９５までのヌクレオチド、約９０までのヌクレオチド、約８５までのヌクレオチド、約８０までのヌクレオチド、約７５までのヌクレオチド、約７０までのヌクレオチド、約６５までのヌクレオチド、約６０までのヌクレオチド、約５５までのヌクレオチド、約５０までのヌクレオチド、約４５までのヌクレオチド、約４０までのヌクレオチド、約３５までのヌクレオチド、約３０までのヌクレオチド、約２５までのヌクレオチド、または約２０までのヌクレオチドを含み得る。
いくつかの態様では、ＰＤＧＦアプタマーは、配列番号１から１〜４９９および５１７〜５４５から選択されるアプタマーと同様の結合特徴、ならびに配列番号１から１〜４９９および５１７〜５４５から選択されるアプタマーと同様の、ＰＤＧＦ関連性アテローム性動脈硬化症、黄斑変性、線維症、または癌の状態を治療するための能力を有するアプタマーから選択される。いくつかの態様では、ＰＤＧＦアプタマーは、表１、２、および６〜９に示すアプタマーから選択されるアプタマーと同様に、ＰＤＧＦ−Ｂ単量体の同じ領域に結合する（ＰＤＧＦ−ＢＢまたはＰＤＧＦ−ＡＢ二量体の場合）。いくつかの態様では、ＰＤＧＦアプタマーは、表１に示すアプタマーから選択されるアプタマーと同様に、ＰＤＧＦ−Ｂ単量体の同じ領域に結合する（ＰＤＧＦ−ＢＢまたはＰＤＧＦ−ＡＢ二量体の場合）。いくつかの態様では、ＰＤＧＦアプタマーは、表６に示すアプタマーから選択されるアプタマーと同様に、ＰＤＧＦ−Ｂ単量体の同じ領域に結合する（ＰＤＧＦ−ＢＢまたはＰＤＧＦ−ＡＢ二量体の場合）。いくつかの態様では、ＰＤＧＦアプタマーは、ＰＤＧＦアプタマー４１４９−８＿２６０と同様に、ＰＤＧＦ−Ｂ単量体の同じ領域に結合する（ＰＤＧＦ−ＢＢまたはＰＤＧＦ−ＡＢ二量体の場合）。いくつかの態様では、ＰＤＧＦアプタマーは、ＰＤＧＦ−Ｂの２４〜８６番目のアミノ酸を含むＰＤＧＦ−Ｂの領域に結合する。そのような態様のいくつかでは、ＰＤＧＦアプタマーはＰＤＧＦへの結合に関してＰＤＧＦアプタマー４１４９−８＿２６０と競合する。いくつかの態様では、ＰＤＧＦアプタマーはＰＤＧＦ−Ｂと、１５％未満、１４％未満、１３％未満、１２％未満、１１％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、または６％未満のタンパク質間の接触している原子に対する極性結合で結合する。極性結合とは、水素結合と電荷間相互作用の和として定義される。いくつかの態様では、ＰＤＧＦアプタマーはＰＤＧＦ−Ｂと、境界面領域に対する極性結合の比が０．０１未満、０．００９未満、０．００８未満、０．００７未満、または０．００６未満で結合する。いくつかの態様では、ＰＤＧＦアプタマーは、ＰＤＧＦアプタマー５１６９−４＿２６と同様に、ＰＤＧＦ−Ｂ単量体の同じ領域に結合する（ＰＤＧＦ−ＢＢまたはＰＤＧＦ−ＡＢ二量体の場合）。
いくつかの態様では、ＰＤＧＦアプタマーは、以下の特徴を任意の組み合わせで有する：
（ａ）ＰＤＧＦ−Ｂの２４〜８６番目のアミノ酸を含むＰＤＧＦ−Ｂの領域に結合する；（ｂ）ＰＤＧＦへの結合に関してＰＤＧＦアプタマー４１４９−８＿２６０と競合する；（ｃ）ＰＤＧＦへの結合に関してＰＤＧＦアプタマー５１６９−４＿２６と競合する；
（ｄ）ＰＤＧＦ−Ｂと、境界面領域に対する極性結合の比が０．０１未満、０．００９未満、０．００８未満、０．００７未満、または０．００６未満で結合する；および／または
（ｅ）ＰＤＧＦ−Ｂと、１５％未満、１４％未満、１３％未満、１２％未満、１１％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、または６％未満のタンパク質間の接触している原子に対する極性結合で結合する。
ＰＤＧＦアプタマーは、ＰＤＧＦに関するいかなる好適な解離定数（Ｋd）をも有する
ように選択することができる。いくつかの態様では、ＰＤＧＦアプタマーが有するＰＤＧＦへの解離定数（Ｋd）は、３０ｎＭ未満、２５ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、１５ｎＭ未満
、１０ｎＭ未満、９ｎＭ未満、８ｎＭ未満、７ｎＭ未満、６ｎＭ未満、５ｎＭ未満、４ｎＭ未満、３ｎＭ未満、２ｎＭ未満、または１ｎＭ未満である。解離定数は下記実施例３に記載したように、多点での力価測定を用いた結合アッセイを行い、式：ｙ＝（最大−最少）（タンパク質）／（Ｋd＋タンパク質）＋最少、に当てはめることで決定し得る。いく
つかの態様では、ＰＤＧＦアプタマーは、表１、２または６〜９のいずれか１つに示すアプタマーのＫdに満たないまたは同じＫdを有するアプタマーである。いくつかの態様では、ＰＤＧＦアプタマーは、表１または表６に示すアプタマーのＫdに満たないまたは同じ
Ｋdを有するアプタマーである。
アプタマー４１４９−８＿１はＰＤＧＦ単量体と１：１の化学量論で結合する。ＰＤＧＦがその標的受容体と反応するのに必要とされる密なホモ二量体を形成するため、二量体または他の多量体の形態のアプタマー４１４９−８＿１を用いることで、より効率的にＰＤＧＦ活性を阻害することができると考えられる。従っていくつかの態様では、ＰＤＧＦアプタマーは、アプタマー４１４９−８＿１、４１４９−８＿３７９、および配列番号５００〜５１２の任意の組み合わせによる多量体である。いくつかの態様では、アプタマー構築物は、本明細書に記載のＰＤＧＦアプタマーのいずれかから選択される第一のアプタマーと、本明細書に記載のＰＤＧＦアプタマーのいずれかを含む第二のアプタマーとを含み、ここで第一のアプタマーと第二のアプタマーは同じであってもまたは異なっていてもよい。ＰＤＧＦアプタマー構築物の第一のアプタマーと第二のアプタマーは共有的に結合していても、または非共有的に結合していてもよい。結合の非限定的な例は当該分野において知られており、および／または本明細書に記載されている。いくつかの態様では、ＰＤＧＦアプタマー構築物は２つのＰＤＧＦ単量体に同時に結合することができ得る。いくつかの態様では、ＰＤＧＦアプタマー構築物は、ＰＤＧＦに１０ｎＭ未満の親和性（Ｋd
）で結合する。
ＶＥＧＦアプタマーの例
本開示のＶＥＧＦアプタマーを、実施例７に記載したように、低解離定数を有するアプタマーを同定するための改良ＳＥＬＥＸ法によって同定した。実施例７では、低解離定数でＶＥＧＦに結合するアプタマーの選抜と生産に関する代表的な方法を記載した。
Ｎａｐ−ｄＵ ＶＥＧＦ−１２１ ＳＥＬＥＸ実験からのクローンを、２９個のヌクレオチドの最少配列へと切断した。このＳＯＭＡｍｅｒはＶＥＧＦ−１２１とＶＥＧＦ−１６５の両方に、高い親和性（Ｋd値はそれぞれ、９０ｐＭおよび２０ｐＭ）で結合する。
ＳＯＭＡｍｅｒはまた、ヒト臍帯静脈内皮細胞においてインビトロでは、ＶＥＧＦＲ２のリン酸化を誘導するＶＥＧＦの両イソ型の能力を阻害する可能性があり（実施例９を参照のこと）、このことは、ＳＯＭＡｍｅｒが、ＶＥＧＦの受容体−結合ドメインに結合し、遮断するという概念を支持している。
本開示では最初に、ＶＥＧＦ−１２１に対する阻害型アプタマーの同定を提供する。従って本発明のＶＥＧＦアプタマーは、ベバシズマブ（アバスチン（登録商標））、ラニビズマブ（ルセンティス（登録商標））およびアフリベルセプト（アイリーア（登録商標））（Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ． （２０１２） Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ １５：１７１； Ｙｕ ｅｔ ａｌ． （２０１１） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ４０８：２７６などのタンパク質ベースの薬剤と同様に、ＶＥＧＦの広範な阻害剤となる。従って本発明のＶＥＧＦアプタマーは、ＶＥＧＦ−１６５の選択的阻害剤であるマクジェン（登録商標）よりも効率的にＶＥＧＦのシグナル伝達を阻害する可能性がある。
成功したＮａｐ−ｄＵ ＶＥＧＦ−１２１ ＳＥＬＥＸ実験に由来する切断型クローンから、２９ヌクレオチドの配列が得られた。このアプタマー（またはＳＯＭＡｍｅｒ）４８６７−３１は、ＶＥＧＦ−１２１とＶＥＧＦ−１６５の両方に、高い親和性（Ｋd値は
それぞれ９０ｐＭおよび２０ｐＭ）で結合する。このＳＯＭＡｍｅｒはまた、ヒト臍帯静脈内皮細胞においてインビトロでは、ＶＥＧＦＲ２のリン酸化を誘導するＶＥＧＦの両イソ型の能力を阻害する可能性があり、このことは、ＳＯＭＡｍｅｒが、ＶＥＧＦの受容体−結合ドメインに結合し、遮断するという概念を支持している。
アプタマー４８６７−３１＿１９２はＶＥＧＦ単量体と１：１の化学量論で結合する。ＶＥＧＦがその標的受容体と反応するのに必要とされる密なホモ二量体を形成するため、
二量体または他の多量体の形態のアプタマー４８６７−３１＿１９２を用いることで、より効率的にＶＥＧＦ活性を阻害することができると考えられる。従っていくつかの態様では、ＶＥＧＦアプタマーは、アプタマー４８６７−３１＿１９２、配列番号５１３〜５１６の配列の任意の組み合わせによる多量体である。いくつかの態様では、アプタマー構築物は、本明細書に記載のＶＥＧＦアプタマーのいずれかから選択される第一のアプタマーと、本明細書に記載のＶＥＧＦアプタマーのいずれかを含む第二のアプタマーとを含み、ここで第一のアプタマーと第二のアプタマーは同じであってもまたは異なっていてもよい。ＶＥＧＦアプタマー構築物の第一のアプタマーと第二のアプタマーは共有的に結合していても、または非共有的に結合していてもよい。結合の非限定的な例は当該分野において知られており、および／または本明細書に記載されている。いくつかの態様では、ＶＥＧＦアプタマー構築物は２つのＶＥＧＦ単量体に同時に結合することができ得る。いくつかの態様では、ＶＥＧＦアプタマー構築物は、ＶＥＧＦに１０ｎＭ未満の親和性（Ｋd）で
結合する。
いくつかの態様では、ＶＥＧＦアプタマーはＶＥＧＦ−１２１と１０ｎＭ未満のＫdで
結合する。いくつかの態様では、ＶＥＧＦアプタマーは、１つ以上の修飾されたヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、ＶＥＧＦアプタマーは、疎水性修飾を含有する１つ以上の修飾されたヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、ＶＥＧＦアプタマーは、１つ以上の修飾されたピリミジンを含む。いくつかの態様では、ＶＥＧＦアプタマーは、１つ以上の、図１２に示す修飾されたピリミジンを含む。いくつかの態様では、ＶＥＧＦアプタマーは、１つ以上の、図１２のＩＩ〜Ｖ群に示す修飾されたピリミジンを含む。いくつかの態様では、ＶＥＧＦアプタマーは、１つ以上の、図１２のＩＩＩ〜Ｖ群に示す修飾されたピリミジンを含む。いくつかの態様では、ＶＥＧＦアプタマーは、１つ以上の、図１２のＩＩＩおよびＩＶ群に示す修飾されたピリミジンを含む。いくつかの態様では、ＶＥＧＦアプタマーは、１つ以上（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵｓ）を含む。
いくつかの態様では、ＶＥＧＦアプタマーは、
５’−ＧＺＺＱＡＡＥＺＥＣＺＺＥＺＤＲＧＡＺＺＺＡＡＡＺＧＧ−３’（配列番号５１３）
の配列を含み、
式中、Ｚはそれぞれ修飾されたピリミジンであり；
Ｑは置換されたまたは未置換のヌクレオチドおよび置換されたまたは未置換のＣ2−Ｃ50
リンカーのいずれかから選択されるか、または欠損しており；
Ｅはそれぞれ独立してＧおよび置換されたまたは未置換のＣ2−Ｃ50リンカーから選択さ
れ；
ＤはＡおよび置換されたまたは未置換のＣ2−Ｃ50リンカーから選択され；および
Ｒは置換されたまたは未置換のヌクレオチドおよび置換されたまたは未置換のＣ2−Ｃ50
リンカーのいずれかから選択される。
いくつかの態様では、ＶＥＧＦアプタマーは、
５’−ＣＧＺＺＱＡＡＥＺＥＣＺＺＥＺＤＲＧＡＺＺＺＡＡＡＺＧ−３’（配列番号５１４）；
５’−ＧＺＺＱＡＡＥＺＥＣＺＺＥＺＤＲＧＡＺＺＺＡＡＡＺＧＧ−３’（配列番号５１３）；
５’−ＣＧＺＺＱＡＡＥＺＥＣＺＺＥＺＤＲＧＡＺＺＺＡＡＡＺＧＧ−３’（配列番号５１５）；および
５’−ＣＣＧＺＺＱＡＡＥＺＥＣＺＺＥＺＤＲＧＡＺＺＺＡＡＡＺＧＧ−３’（配列番号５１６）；
から選択される配列を含み、
式中、Ｚ、Ｑ、Ｅ、Ｄ、およびＲは上で定義したのと同様である。
いくつかの態様では、Ｚは修飾されたウリジンである。いくつかの態様では、Ｚはそれぞれ独立して、本明細書で定義したＣ-５が修飾されたピリミジンから選択される。いく
つかの態様では、Ｚはそれぞれ独立して、
５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、
５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−フェネチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＰＥｄＵ）、
５−（Ｎ−チオフェニルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｈｄＵ）、
５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、
５−（Ｎ−チロシルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｙｒｄＵ）、
５−（Ｎ−３，４−メチレンジオキシベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＭＢｎｄＵ）、
５−（Ｎ−４−フルオロベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＦＢｎｄＵ）、
５−（Ｎ−３−フェニルプロピルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＰＰｄＵ）、
５−（Ｎ−イミジゾリルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＩｍｄＵ）、
５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−トリプトアミノカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、
５−（Ｎ−Ｒ−トレオニニルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｈｒｄＵ）、
５−（Ｎ−トリプトアミノカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−トリプトアミノカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジンクロリド、
５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、
５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−［１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン）、
５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（２ＮａｐｄＵ）、
５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮＥｄＵ）、
５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（２ＮＥｄＵ）、
５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（Ｂ
ＦｄＵ）、
５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢＴｄＵ）、
５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、および
５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジンから選択される。
いくつかの態様では、Ｚはそれぞれ独立して、図１２のＩＩ〜Ｖ群に示す修飾されたピリミジンから選択される。いくつかの態様では、Ｚはそれぞれ独立して、図１２のＩＩＩ〜Ｖ群に示す修飾されたピリミジンから選択される。いくつかの態様では、少なくとも１つの、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つの、少なくとも６つの、少なくとも７つの、または少なくとも８つのＺは５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）である。いくつかの態様では、Ｚはそれぞれ独立して、図１２のＩＩＩ〜ＩＶ群に示す修飾されたピリミジンから選択される。いくつかの態様では、Ｚはそれぞれ、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）である。
Ｃ2−Ｃ50リンカーまたはスペーサーは、２〜５０個の炭素原子（Ｃ2−Ｃ50）（置換、非置換、直鎖、分岐鎖または環状）、０〜１０個のアリール基、０〜１０個のヘテロアリール基、および０〜１０個の複素環基の鎖を含む主鎖であってよく、場合により、エーテル（−Ｏ−）結合、（例えば、１つ以上のエチレングリコール単位−Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）−を含むがこれらには限定されない、１つ以上アルキレングリコール単位；１つ以上の１，３−プロパンジオール単位−Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）−など）；アミン（−ＮＨ
−）結合；アミド（−ＮＣ（Ｏ）−）結合；およびチオエーテル（−Ｓ−）結合などを含み、ここで各骨格に含まれる炭素原子は独立して置換されていなくても（つまり−Ｈ置換基を含む）または、Ｃ1−Ｃ3アルキル、−ＯＨ、−ＮＨ2、−ＳＨ、−Ｏ−（Ｃ1−Ｃ6ア
ルキル）、−Ｓ−（Ｃ1−Ｃ6アルキル）、ハロゲン、−ＯＣ（Ｏ）（Ｃ1−Ｃ6アルキル）、−ＮＨ−（Ｃ1−Ｃ6アルキル）から選択される１つ以上の基などで置換されていてもよい。いくつかの態様においてＣ2−Ｃ50リンカーは、Ｃ2−Ｃ20リンカー、Ｃ2−Ｃ10リン
カー、Ｃ2−Ｃ8リンカー、Ｃ2−Ｃ6リンカー、Ｃ2−Ｃ5リンカー、Ｃ2−Ｃ4リンカー、またはＣ3リンカーであり、ここでそれぞれの炭素は独立して上述したように置換されてい
てもよい。
いくつかの態様では、置換されたまたは未置換のＣ2−Ｃ50リンカーはそれぞれ独立し
て、置換されたまたは未置換のＣ2−Ｃ20リンカー、置換されたまたは未置換のＣ2−Ｃ10リンカー置換されたまたは未置換のＣ2−Ｃ8リンカー、置換されたまたは未置換のＣ2−
Ｃ6リンカー、置換されたまたは未置換のＣ2−Ｃ5リンカー、置換されたまたは未置換の
Ｃ2−Ｃ4リンカー、および置換されたまたは未置換のＣ3リンカーから選択される。いく
つかの態様では、置換されたまたは未置換のＣ2−Ｃ50リンカーはそれぞれ、置換された
または未置換のＣ2−Ｃ10リンカーである。そのような態様のいくつかでは、置換された
または未置換のＣ2−Ｃ10リンカーはそれぞれ、置換されたまたは未置換のＣ2−Ｃ8リン
カー、置換されたまたは未置換のＣ2−Ｃ6リンカー、置換されたまたは未置換のＣ2−Ｃ5リンカー、置換されたまたは未置換のＣ2−Ｃ4リンカー、または置換されたまたは未置換のＣ3リンカーである。
いくつかの態様では、ＶＥＧＦアプタマーの１つ以上のヌクレオシドは、２位の糖修飾（２’−アミノ（２’−ＮＨ2）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）、または２’−Ｏ−メチ
ル（２’−ＯＭｅ）など）、シトシン環外アミンの修飾、ヌクレオシド間結合の修飾、および５−メチル−シトシンから選択される修飾を含む。いくつかの態様では、ＶＥＧＦアプタマーは、３’キャップ、５’キャップ、および／または３’末端に逆位のデオキシチミジンを含む。
いくつかの態様では、ＶＥＧＦアプタマーは、少なくとも１つの修飾されたヌクレオシド間結合を含む。いくつかの態様では、少なくとも１つの、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、または少なくとも５つのヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合である。
いくつかの態様では、ＶＥＧＦアプタマーは、表１０〜１４に示す配列から選択される配列を有する。いくつかの態様では、ＶＥＧＦアプタマーは、Ｋdが１０ｎＭ未満の、表
１０〜１４に示す配列から選択される配列を有する。いくつかの態様では、ＶＥＧＦアプタマーは、表１０〜１４に示す配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一の配列を有する。いくつかの態様では、ＶＥＧＦアプタマーは、Ｋdが１０ｎＭ未満の、表１０〜
１４に示す配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一の配列を有する。パーセント同一性は、参照配列がＫdが１０ｎＭ未満の、表１０〜１４に示すＶＥＧＦアプタマー配
列である以外は、上でＰＤＧＦアプタマーに関して定義したのと同様に決定される。
いくつかの態様において本開示は、ＶＥＧＦと結合するとＶＥＧＦの機能を調節するＶＥＧＦアプタマーを提供する。いくつかの態様では、ＶＥＧＦアプタマーはＶＥＧＦ受容体、例えばＶＥＧＦＲ１またはＶＥＧＦＲ２の、ＶＥＧＦ介在性リン酸化を阻害する。いくつかの態様では、ＶＥＧＦアプタマーは、ＶＥＧＦ受容体のＶＥＧＦ介在性リン酸化を阻害する。様々な態様では、ＶＥＧＦアプタマーは、ＶＥＧＦのインビボでの機能、例えばインビボにおけるＶＥＧＦ介在性の受容体のリン酸化の阻害、を調節する。様々な態様では、ＶＥＧＦアプタマーは、表１０〜１４に示す配列から選択される配列を有する。様々な態様では、ＶＥＧＦアプタマーは、Ｋdが１０ｎＭ未満の、表１０〜１４に示すアプ
タマーから選択される。様々な態様では、ＶＥＧＦアプタマーは、表１０〜１４に示すアプタマーから選択される。いくつかの態様では、ＶＥＧＦアプタマーは、Ｋdが１０ｎＭ
未満の、配列表１０〜１４に示す少なくとも１２の、少なくとも１３の、少なくとも１４の、少なくとも１５の、少なくとも１６の、少なくとも１７の、少なくとも１８の、少なくとも１９の、少なくとも２０の、少なくとも２１の、少なくとも２１の、少なくとも２２の、少なくとも２３の、少なくとも２４の、少なくとも２５の、少なくとも２６の、少なくとも２７の、少なくとも２８の、少なくとも２９の、または少なくとも３０の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、ＶＥＧＦアプタマーは、Ｋdが１０ｎＭ未
満の、表１０〜１４に示す配列と核酸塩基配列が同一の、少なくとも１２の、少なくとも１３の、少なくとも１４の、少なくとも１５の、少なくとも１６の、少なくとも１７の、少なくとも１８の、少なくとも１９の、少なくとも２０の、少なくとも２１の、少なくとも２１の、少なくとも２２の、少なくとも２３の、少なくとも２４の、少なくとも２５の、少なくとも２６の、少なくとも２７の、少なくとも２８の、少なくとも２９の、または少なくとも３０の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、ＶＥＧＦアプタマーは、表１０〜１４に示すアプタマーの、少なくとも１２の、少なくとも１３の、少なくとも１４の、少なくとも１５の、少なくとも１６の、少なくとも１７の、少なくとも１８の、少なくとも１９の、少なくとも２０の、少なくとも２１の、少なくとも２１の、少なくとも２２の、少なくとも２３の、少なくとも２４の、少なくとも２５の、少なくとも２６の、少なくとも２７の、少なくとも２８の、少なくとも２９の、または少なくとも３０
の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、ＶＥＧＦアプタマーは、Ｋdが１
０ｎＭ未満の、表１０〜１４に示すアプタマーの少なくとも１２の、少なくとも１３の、少なくとも１４の、少なくとも１５の、少なくとも１６の、少なくとも１７の、少なくとも１８の、少なくとも１９の、少なくとも２０の、少なくとも２１の、少なくとも２１の、少なくとも２２の、少なくとも２３の、少なくとも２４の、少なくとも２５の、少なくとも２６の、少なくとも２７の、少なくとも２８の、少なくとも２９の、または少なくとも３０の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、ＶＥＧＦアプタマーは、表１０〜１４に示すアプタマーの、少なくとも１２の、少なくとも１３の、少なくとも１４の、少なくとも１５の、少なくとも１６の、少なくとも１７の、少なくとも１８の、少なくとも１９の、少なくとも２０の、少なくとも２１の、少なくとも２１の、少なくとも２２の、少なくとも２３の、少なくとも２４の、少なくとも２５の、少なくとも２６の、少なくとも２７の、少なくとも２８の、少なくとも２９の、または少なくとも３０の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、ＶＥＧＦアプタマーは、Ｋdが１０ｎＭ未
満の、表１０〜１４に示すアプタマーの少なくとも１２の、少なくとも１３の、少なくとも１４の、少なくとも１５の、少なくとも１６の、少なくとも１７の、少なくとも１８の、少なくとも１９の、少なくとも２０の、少なくとも２１の、少なくとも２１の、少なくとも２２の、少なくとも２３の、少なくとも２４の、少なくとも２５の、少なくとも２６の、少なくとも２７の、少なくとも２８の、少なくとも２９の、または少なくとも３０の連続したヌクレオチドを含む。
本明細書に記載の態様のいずれか１つでは、ＶＥＧＦアプタマーは、アプタマーの５’末端、３’末端、または５’末端と３’末端の両方に、追加のヌクレオチドまたは他の化学部分を含んでいてもよい。
ＶＥＧＦアプタマーは、ＶＥＧＦ結合領域に加えて、いかなる数のヌクレオチドを含んでいてもよい。様々な態様では、ＶＥＧＦアプタマーは、約１００までのヌクレオチド、約９５までのヌクレオチド、約９０までのヌクレオチド、約８５までのヌクレオチド、約８０までのヌクレオチド、約７５までのヌクレオチド、約７０までのヌクレオチド、約６５までのヌクレオチド、約６０までのヌクレオチド、約５５までのヌクレオチド、約５０までのヌクレオチド、約４５までのヌクレオチド、約４０までのヌクレオチド、約３５までのヌクレオチド、約３０までのヌクレオチド、約２５までのヌクレオチド、または約２０までのヌクレオチドを含み得る。
いくつかの態様では、ＶＥＧＦアプタマーは、Ｋdが１０ｎＭ未満の、表１０〜１４に
示すアプタマーと同様の結合特徴、ならびにＫdが１０ｎＭ未満の、表１０〜１４に示す
アプタマーと同様のＶＥＧＦ関連性アテローム性動脈硬化症、黄斑変性、線維症、および癌の状態を治療する能力を有するアプタマーから選択される。いくつかの態様では、ＶＥＧＦアプタマーは、Ｋdが１０ｎＭ未満の、表１０〜１４に示すアプタマーから選択され
るアプタマーと同様に、ＶＥＧＦ−１２１の同じ領域に結合する。いくつかの態様では、ＶＥＧＦアプタマーは、Ｋdが１０ｎＭ未満の、表１０、１１、１２、１３または１４に
示すＶＥＧＦアプタマーと同様に、ＶＥＧＦ−１２１の同じ領域に結合する。いくつかの態様では、ＶＥＧＦアプタマーは、ＶＥＧＦアプタマー４８６７−３１＿１８３と同様に、ＶＥＧＦ−１２１の同じ領域に結合する。
ＶＥＧＦアプタマーがＶＥＧＦに対して、いかなる好適な解離定数（Ｋd）を有するよ
うに選択することができる。いくつかの態様では、ＶＥＧＦアプタマーのＶＥＧＦ−１２１に対する解離定数（Ｋd）は、３０ｎＭ未満、２５ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、１５ｎＭ
未満、１０ｎＭ未満、９ｎＭ未満、８ｎＭ未満、７ｎＭ未満、６ｎＭ未満、５ｎＭ未満、４ｎＭ未満、３ｎＭ未満、２ｎＭ未満、または１ｎＭ未満である。解離定数は下記実施例３に記載したように、多点での力価測定を用いた結合アッセイを行い、式：ｙ＝（最大−
最少）（タンパク質）／（Ｋd＋タンパク質）＋最少、に当てはめることで決定し得る。
いくつかの態様では、アプタマー構築物は、本明細書に記載のＶＥＧＦアプタマーのいずれかから選択される第一のアプタマーと、本明細書に記載のＶＥＧＦアプタマーのいずれかを含む第二のアプタマーを含み、ここで第一のアプタマーと第二のアプタマーは同じであってもまたは異なっていてもよい。ＶＥＧＦアプタマー構築物の第一のアプタマーと第二のアプタマーは、共有的に結合していても、または非共有的に結合していてもよい。結合の非限定的な例は当該分野において知られており、および／または本明細書に記載されている。いくつかの態様では、ＶＥＧＦアプタマー構築物は２つのＶＥＧＦ単量体に同時に結合することができ得る。いくつかの態様では、ＶＥＧＦアプタマー構築物は、ＶＥＧＦに１０ｎＭ未満の親和性（Ｋd）で結合する。
ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアプタマー構築物の例
ＶＥＧＦとＰＤＧＦ−Ｂのシグナル伝達経路を併せて阻害することで、新しい血管の退行を伴って、腫瘍関連性のおよび眼の血管新生をより効率的に遮断できるということの証拠が多くある（Ｂｅｒｇｅｒｓ， Ｇ．， ｅｔ ａｌ． （２００３） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １１１：１２８７； Ｊｏ， Ｎ．， ｅｔ ａｌ． （２００６） Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． １６８：２０３６）。この効果は、内皮細胞の密な細胞同士の関連を破壊することによって仲介され、それによって最初の毛細血管や外膜細胞（または周細胞）が形成され、これらは成熟に伴って新しい血管を取り囲み、血管のＶＥＧＦ阻害剤に対する感受性を弱める（Ｂｅｎｊａｍｉｎ， Ｌ． Ｅ．， ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２５：１５９１； Ｂｅｎｊａｍｉｎ， Ｌ． Ｅ．， ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １０３：１５９）。本明細書に記載のアプタマーはそのような二重阻害剤の基礎となる可能性がある。
いくつかの態様では、ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアプタマー構築物は、本明細書に記載のＶＥＧＦアプタマーのいずれかに連結された、本明細書に記載のＰＤＧＦアプタマーのいずれかを含む。いくつかの態様では、ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアプタマー構築物は、Ｋdが１０ｎ
Ｍ未満の、表１０〜１４に示すＶＥＧＦアプタマーのいずれかに連結された、表１に示すＰＤＧＦアプタマーのいずれかを含む。結合は共有結合であっても非共有結合であってもよい。
ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアプタマー構築物は、ＰＤＧＦアプタマーとＶＥＧＦアプタマーをどのような向きで含んでいてもよい。例えば、ＰＤＧＦアプタマーは３’末端でもしくは３’末端の付近で、ＶＥＧＦアプタマーの５’末端もしくは５’末端付近の位置で連結されていても、またはＶＥＧＦアプタマーは３’末端もしくは３’末端の付近で、ＰＤＧＦアプタマーの５’末端もしくは５’末端の付近で連結されていても、または構築物のそれぞれのアプタマーの結合特性を保存する他のいかなる向きで連結されていてもよい。
結合が共有結合であるいくつかの態様では、ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアプタマー構築物はリン酸結合またはホスホロチオエート結合を介して連結されていてもよい。他の多くの共有結合、例えば種々のリンカー部分（ヘキサエチレングリコールリンカー、ポリエチレングリコールリンカー、置換されたまたは未置換の炭化水素リンカーなどを含むがこれらには限定されない）を介した結合が想定される。当業者であれば、ＰＤＧＦアプタマーをＶＥＧＦアプタマーに連結するために適した共有結合を選択することができる。
いくつかの態様では、ＰＤＧＦアプタマーとＶＥＧＦアプタマーは非共有結合で連結されている。非共有結合には、これらには限定されないが、ビオチン／ストレプトアビジン；金属結合性ペプチド／金属；ハイブリダイズ可能な修飾されたおよび／または未修飾の
オリゴヌクレオチド；など、が挙げられる。当業者であれば、ＰＤＧＦアプタマーをＶＥＧＦアプタマーに連結させるための、適した非共有結合を選択することができる。
アプタマーおよびアプタマー構築物を含む医薬組成物
いくつかの態様では、本明細書に記載のアプタマーまたはアプタマー構築物を少なくとも１つと、少なくとも１つの薬学上許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。好適な担体は、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓから出版されている「レミントンの薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ）第２１版」に記載されており、この文献は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に記載のアプタマーまたはアプタマー構築物を少なくとも１つと、少なくとも１つの薬学上許容可能な担体を含む医薬組成物は、ＰＤＧＦまたはＶＥＧＦ阻害剤ではない１つ以上活性薬剤を含んでいてもよい。
本明細書に記載のアプタマーを、薬学上許容可能な剤形のいずれにおいて使用してもよく、そのような剤形には、注入可能な剤形、分散液、ゲル、エアロゾル、軟膏、クリーム、凍結乾燥製剤、乾燥粉末、錠剤、カプセル、制御放出性製剤、易溶性製剤、遅延放出性製剤、持続放出性製剤、律動的放出性製剤、即時放出性製剤と制御放出性製剤の組み合わせ、などが挙げられるがこれらには限定されない。具体的には、本明細書に記載のアプタマーは、（ａ）経口、経肺、静脈内、動脈内、鞘内、関節内、直腸内、眼内、結腸内、非経口、槽内、膣内、腹腔内、局部、頬内、経鼻、および局所投与のいずれかから選択される投与用；（ｂ）分散液、ゲル、エアロゾル、軟膏、クリーム、錠剤、サシェおよびカプセルのいずれかから選択される剤形；（ｃ）凍結乾燥製剤、乾燥粉末、易溶性製剤、制御放出性製剤、遅延放出性製剤、持続放出性製剤、律動的放出性製剤、および即時放出性製剤と制御放出性製剤の組み合わせのいずれかから選択される剤形；または（ｄ）それらの任意の組み合わせ、として製剤化することができる。
非経口、皮内、または皮下に用いるための溶液または懸濁液は、以下の成分を１つ以上含む場合がある：（１）無菌的な希釈剤（例えば、注射用の水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒）；（２）抗菌剤（例えばベンジルアルコールまたはメチルパラベン）；（３）酸化防止剤（例えばアスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム）；（４）キレート剤（例えばエチレンジアミン四酢酸）；（５）緩衝剤（例えば酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩）；および（５）浸透圧調節剤（例えば塩化ナトリウムまたはデキストロース）。ｐＨは、酸または塩、例えば塩酸または水酸化ナトリウムで調整することができる。非経口用製剤は、アンプル、使い捨てのシリンジまたは複数回投与用のガラス製もしくはプラスチック製のバイアルに封入することができる。
注入に適した医薬組成物は、無菌的な水溶液（水溶性の場合）または分散剤と、無菌的な注射用溶液または分散系を即時調製するための無菌的な粉末とを含んでいてもよい。静脈内投与に好適な担体としたは、生理食塩水、静菌性の水、クレモフォールＥＬ（ＢＡＳＦ、パーシッパニー、ニュージャージー）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての例において、組成物は無菌的、かつ、容易に注入できる程度の液性を有していなければならない。医薬組成物は、製造と保存の条件で安定でなくてはならず、かつ、細菌や真菌などの微生物の汚染作用から保護されていなくてはならない。用語「安定な」とは、本明細書で使用する場合、対象に投与するのに適した段階または状態に維持されていることを意味する。
担体は例えば、水、エタノール、多価アルコール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール、など）、およびそれらの好適な混合物を含む、溶媒または分散媒であってよい。例えば、レシチンなどのコーティングを使用す
ること、分散液の場合には、要求される粒子サイズを維持すること、および界面活性剤を使用することにより、適した液性が維持され得る。微生物による作用の予防は、種々の抗菌剤や抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどの使用によって達成され得る。多くの場合、等張剤、例えば糖類、多価アルコール類（マンニトールまたはソルビトールなど）、および無機塩（塩化ナトリウムなど）が組成物中に含まれることが好ましい。吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムやゼラチンを組成物に加えることによって、注入可能な組成物の吸収を長引かせることができる。
無菌的な注入可能な溶液は、活性薬剤（例えば、アプタマー、および／またはアプタマー構築物）を、必要に応じて、上に挙げた成分のうちの１つまたは成分の組み合わせと共に、適切な量の適切な溶媒に加え、その後、濾過滅菌することで調製することができる。分散液は通常、少なくとも１つのアプタマー、および／またはアプタマー構築物を、基礎となる分散媒と他の任意の必要とされる成分とを含む、無菌的な媒体に加えることによって調製される。無菌的で注入可能な溶液を調製するための、無菌的な粉末の場合の調製方法の例としては、アプタマーおよび／またはアプタマー構築物と任意の所望の付加的な成分とを含む溶液を予め濾過滅菌しておき、それを真空乾燥および凍結乾燥することが挙げられ、いずれによっても粉末が得られる。
いくつかの態様では、アプタマーおよび／またはアプタマー構築物は、硝子体内注入用に製剤化される。硝子体内投与に好適な製剤については、例えば、に記載されている。眼への薬剤送達については、例えば、Ｒａｗａｓ−Ｑａｌａｊｉ ｅｔ ａｌ． （２０１２） Ｃｕｒｒ． Ｅｙｅ Ｒｅｓ． ３７： ３４５； Ｂｏｃｈｏｔ ｅｔ ａｌ．
（２０１２） Ｊ． Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ １６１：６２８； Ｙａｓｕｋａｗａ ｅｔ ａｌ． （２０１１） Ｒｅｃｅｎｔ Ｐａｔ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ． Ｆｏｒｍｕｌ． ５：１；およびＤｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ． （２０１１） Ｓｅｍｉｎ． Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ． ２６：１０４で議論されている。いくつかの態様では、アプタマーおよび／またはアプタマー構築物を含む医薬組成物は、硝子体内注入により、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、５週間に１回、６週間に１回、７週間に１回、８週間に１回、９週間に１回、１０週間に１回、１１週間に１回、１２週間に１回、または１２週間に１回より少ない頻度で投与される。
経口投与用の組成物は通常、不活性な希釈剤または食用に適した担体を含んでいる。それらを、例えばゼラチンカプセルの中に封入するか、または錠剤として打錠することができる。経口治療用投与の目的では、アプタマーおよび／またはアプタマー構築物を賦形剤と混合し、錠剤、トローチ、またはカプセルの剤形として使用することができる。経口用組成物はまた、洗口剤として使用するための液体担体を使用して調製することができ、この場合液体担体に含まれている化合物は、口に入れられ、音をたててすすぐようにして使用され、その後、吐き出されるかまたは飲み込まれる。組成物の一部として、薬学上適合な結合剤および／または補助的な成分が含まれる場合もある。
吸入による投与では、化合物は、好適な噴射剤、例えば、二酸化炭素などのガス、好適な装置に由来する霧状になった液体、または乾燥粉末を含む加圧容器から、エアロゾルスプレーの形態で送達される。経粘膜または経皮的投与の場合には、製剤中に、浸透する障壁に適した浸透剤が使用される。そのような浸透剤は当該分野において一般的に知られており、また、例えば、経粘膜投与用には、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は鼻スプレーまたは座剤で達成することができる。経皮的投与用には、活性薬剤は、当該分野で一般的に知られているように、軟膏、膏薬、ゲル、またはクリームに製剤化される。また、薬剤は、座剤（例えば、ココア脂や多のグリセリドなどの標準的な座剤基剤と共に）または直腸送達用の浣腸の形態に調製することもできる
。
いくつかの態様では、アプタマーおよび／またはアプタマー構築物は、身体からの迅速な排出に抵抗する担体とともに調製される。例えば、植込錠や被包性マイクロカプセル送達系などの制御放出性製剤を用いることができる。生分解性の、生体適合性ポリマー、例えばエチレン酢酸ビニル、ポリアンヒドリド、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸、を使用することができる。そのような製剤の調製方法は当業者には明かである。材料はまた、Ａｌｚａ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎやＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃから市販されているものを購入することもできる。
リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を用いた、感染した細胞を標的としたリポソームを含む）を薬学上許容可能な担体として使用することもできる。これらは、例えば米国特許第４，５２２，８１１号に記載されている、当業者に知られている方法に従って調製することができる。
加えて、アプタマーおよび／またはアプタマー構築物の懸濁液は、適した油性の注入用懸濁液として調製してもよい。好適な親油性溶媒または媒体としては、脂肪油（例えばゴマ油）、または合成の脂肪酸エステル（例えばオレイン酸エチル）、トリグリセリド、またはリポソームが挙げられる。非脂質ポリカチオンアミノポリマーを送達のために使用してもよい。場合により懸濁液は、化合物の溶解度を高め、かつ、高濃度の溶液の調製を可能にするのに好適な安定剤または薬剤を含み得る。
いくつかの例では、投与を容易にし、かつ、用量を均一にするため、経口または非経口組成物を単位用量形態に製剤化することが特に有効である。本明細書で使用する場合、単位用量形態とは、治療する対象に対する単位用量として適した物理的に別個の単位を指し、それぞれの単位は、必要とされる医薬担体と共に、所望の治療効果を生じるように計算された、予め決められた量のアプタマーおよび／またはアプタマー構築物を含んでいる。本明細書に記載のアプタマーおよび／または構築物の単位容量形態の仕様は、特定のアプタマーおよび／またはアプタマー構築物の特徴および達成される特定の治療効果ならびに患者の治療の目的で、そのような活性薬剤を配合する分野に固有の制限によって規定され、かつ、それらに直接依存する。
アプタマーおよび／またはアプタマー構築物を少なくとも１つ含む医薬組成物は、１つ以上医薬賦形剤を含む場合がある。そのような賦形剤の例としては、これらには限定されないが、結合剤、増量剤、滑沢剤、沈殿防止剤、甘味料、矯味剤、防腐剤、緩衝剤、湿潤剤、崩壊剤、起泡剤、および他の賦形剤が挙げられる。そのような賦形剤は当該分野において知られている。賦形剤の例としては、（１）結合剤、例えば種々のセルロースおよび架橋ポリビニルピロリドン、微結晶セルロース、例えばアビセル（Ａｖｉｃｅｌ）（登録商標）ＰＨ１０１およびアビセル（登録商標）ＰＨ１０２、ケイ化微結晶セルロース（ＰｒｏＳｏｌｖ ＳＭＣＣ（登録商標））、トラガカントゴムおよびゼラチンなど；（２）増量剤、例えば種々のデンプン、乳糖、乳糖一水和物、および無水乳糖など；（３）崩壊剤、例えばアルギン酸、プリモジェル（Ｐｒｉｍｏｇｅｌ）、コーンスターチ、弱く架橋したポリビニルピロリドン、馬鈴薯デンプン、トウモロコシデンプン、および加工デンプン類、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、デンプングリコール酸ナトリウム、およびそれらの混合物；（４）滑沢剤、例えば打錠する粉末の流動性に影響を及ぼす薬剤や、ステアリン酸マグネシウム、コロイド二酸化ケイ素、例えばエアロジル（Ａｅｒｏｓｉｌ）（登録商標）２００、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、およびシリカゲルなど；（５）流動促進剤、例えばコロイド二酸化ケイ素など；（６）防腐剤、例えばソルビン酸カリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸およびその塩、パラヒドロキシ安息香酸の他のエステル、例えばブチルパラベン、アルコール類、例
えばエチルアルコールまたはベンジルアルコール、フェノール化合物、例えばフェノール、または第四級化合物、例えば塩化ベンザルコニウム；（７）希釈剤、例えば薬学上許容可能な不活性な充填剤、例えば微結晶セルロース、乳糖、リン酸二水素カルシウム、糖類、および／または前述したものの任意の混合物；希釈剤例は、微結晶セルロース、例えばアビセル（登録商標）ＰＨ１０１とアビセル（登録商標）ＰＨ１０２を含む；乳糖、例えば乳糖一水和物、無水乳糖、およびファルマトース（Ｐｈａｒｍａｔｏｓｅ）（登録商標）ＤＣＬ２１；リン酸二水素カルシウム、例えばエンコンプレス（Ｅｍｃｏｍｐｒｅｓｓ）（登録商標）；マンニトール；デンプン；ソルビトール；ショ糖；およびグルコース；（８）甘味料、例えばショ糖、サッカリン、キシリトール、サッカリンナトリウム、シクラメート、アスパルテーム、およびアセスルファムなどの、天然の甘味料または人工甘味料のいずれをも含む；（９）矯味剤、例えばペパーミント、サリチル酸メチル、オレンジ香料、マグナスイート（Ｍａｇｎａｓｗｅｅｔ）（登録商標）（ＭＡＦＣＯの商標）、風船ガム香料、果実香料など；および（１０）起泡剤、例えば有機酸と炭酸塩または重炭酸塩などの起泡性の組み合わせ。好適な有機酸としては、例えば、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、フマル酸、アジピン酸、コハク酸、およびアルギン酸ならびに無水物および酸性塩が挙げられる。好適な炭酸塩および重炭酸塩としては、例えば、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、炭酸マグネシウム、グリシン炭酸塩、Ｌ−リシン炭酸塩、および炭酸アルギニンが挙げられる。あるいは、起泡剤混合物の重炭酸ナトリウム成分だけが存在してもよい。
様々な態様では、本明細書に記載の製剤は実質的に純粋である。本明細書で使用する場合、「実質的に純粋」とは、活性成分（例えば、アプタマーおよび／またはアプタマー構築物）が、存在する主な種であること（すなわち、モルを基準として、組成物中に含まれる他のいずれの個々の種よりも多量に含まれていること）を意味している。いくつかの態様では、実質的に精製した画分が組成物であり、この場合、活性成分が、存在する全ての高分子種の少なくとも約５０パーセント（モルを基準として）を構成している。実質的に純粋な組成物は通常、組織物中に存在する全ての高分子種の少なくとも約８０％を上回る。様々な態様において実質的に純粋な組成物は、組織物中に存在する全ての高分子種の少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％を構成する。様々な態様では、活性成分は均一になるまで精製され（標準的な検出法では、組成物中に汚染物質種は検出されない）、この場合、組成物は本質的に単一の高分子種を含む。
アプタマーおよびアプタマー構築物を含むキット
本開示は、本明細書に記載のアプタマーおよび／またはアプタマー構築物のいずれかを含むキットを提供する。そのようなキットは例えば、（１）少なくとも１つのアプタマーおよび／またはアプタマー構築物；および（２）少なくとも１つの薬学上許容可能な担体、例えば溶媒または溶液、を含む場合がある。付加的なキットの構成要素は場合により、例えば（１）本明細書で同定した薬学上許容可能な賦形剤、例えば安定剤、希釈剤など、のいずれか；（２）少なくとも１つの容器、バイアルまたはキットの構成要素を保持するおよび／または混合するための同様の装置；および（３）送達器具、を含む場合がある。
治療方法
本開示は、ＰＤＧＦアプタマーまたはアプタマー構築物、ＶＥＧＦアプタマーまたはアプタマー構築物および／またはＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアプタマー構築物の使用を介した、病状の予防法または治療法（例えば、１つ以上症状を緩和する方法）を提供する。この方法は、治療上有効量のそのようなアプタマーおよび／またはアプタマー構築物を、それを必要とする対象に投与することを含む。記載のアプタマーはまた、予防的治療にも使用できる。いくつかの態様では、アプタマーおよび／またはアプタマー構築物経口的にまたは静脈内に投与される。
方法に用いられるアプタマーおよび／またはアプタマー構築物は、本明細書に記載のＰＤＧＦアプタマーまたはアプタマー構築物、ＶＥＧＦアプタマーまたはアプタマー構築物および／またはＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアプタマー構築物、あるいはその薬学上許容可能な塩、またはそのプロドラッグである可能性がある。
患者または対象は、いかなる動物であってよく（ペット、家畜または野生の）、これらには限定されないが、ネコ、イヌ、ウマ、ブタおよびウシが含まれ、好ましくはヒトである。本明細書で使用する場合、患者、個人、および対象という用語は同じ意味で用いられ得る。
本明細書で使用する場合、「治療する」とは、疾患、状態、または障害を治療する目的で、患者を管理・看護することであり、かつ、疾患、状態または障害の症状または合併症の発症を予防するために；疾患、状態、または障害の症状または合併症を緩和するために；あるいは疾患、状態または障害の存在を排除するために、アプタマーおよび／またはアプタマー構築物を患者に投与することを含む。より具体的には、「治療する」には、疾患（障害）の状態、疾患の進行、疾患の原因または他の異常な状態の少なくとも１つの有害な症状または影響を反転させること、和らげること、緩和すること、最小限にすること、抑制することまたは停止させることが含まれる。治療は通常、症状および／または病理が回復する間にわたって継続される。
本明細書で使用する場合、「予防する」とは、全体的にもしくは部分的に予防すること；緩和するもしくは制御すること；抑える、小さくする、もしくは低下させること；または遅らせるもしくは停止させることを意味する。
様々な態様では、本開示の組成物および方法は、心血管疾患、癌、線維症、腎臓疾患または眼科疾患の治療に用いられる。
いくつかの態様では、本開示の化合物もしくはその薬学上許容可能な塩、またはプロドラッグを、上述した疾患状態を改善または根治する治療と組み合わせて投与することができる。本開示のアプタマーおよび／またはアプタマー構築物を含有する組成物は、例えば、１を上回るアプタマーを含み得る。いくつかの例においては、１つ以上のアプタマーを含有する組成物を、別の有用な心血管治療薬または抗癌剤または線維症治療薬などと併用して投与する。一般的には、そのような併用が知られている治療薬の、現在利用可能な剤形が好適である。
「併用療法」（または「併用治療」）は、アプタマーおよび／またはアプタマー構築物組成物と少なくとも１つの第二の薬剤を、これら治療薬の相互作用に由来する有益な効果をもたらすことを意図した特定の治療計画の一環として、投与することを含む。併用の有益な効果としては、これらには限定されないが、治療薬の併用によって生じる、薬物動態学的なまたは薬力学的な相互作用が挙げられる。これら治療薬の併用投与は通常、決められた期間（選択される併用によって、一般に、分、時間、日または週にわたる）にかけて行われる。
「併用療法」は、２種類以上のこれら治療薬を、偶然におよび人為的に本開示の併用をもたらす別個の単一療法の一貫として投与することを包含し得るが、これは一般的ではない。「併用療法」とは、これらの治療薬を順次投与することを包含することを意図している。つまりこの場合、それぞれの治療薬は、異なる時点で投与され、ならびにこれらの治療薬、つまり少なくとも２種類の治療薬は実質的に同時の様式で投与される。実質的に同時の投与は、例えば、それぞれの治療薬を決まった割合で含む単一用量、またはそれぞれ
の治療薬の単回用量を複数、対象に投与することで達成することができる。
アプタマーおよび／またはアプタマー構築物を使用する投与計画は、様々な要因、例えば、対象の型、種、年齢、体重、ジェンダーおよび医学的状態、など；治療する状態の重篤度；投与経路；対象の腎臓および肝臓の機能；ならびに使用される具体的なアプタマーおよび／またはアプタマー構築物もしくはその塩に従って選択される。標準的な技能を有する医師または獣医師は、状態を予防する、対抗する、または状態の進行を停止させるのに必要とされる組成物の有効量を容易に決定・指示することができる。
用量、すなわち治療上有効量は通常、１日あたり、治療を受ける患者の体重１キログラムに対して約１μｇ〜約１００ｍｇの範囲である。
以下の実施例は例証目的のみで提供され、添付の請求項で定義される本発明の範囲を限定するものではない。本明細書で述べられる全ての実施例は、当業者にとって周知で通常的である標準の技術を用いて行われた。下記の実施例で述べられる通常の分子生物学的技術は、Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd. ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)のような標準の実験
説明書で述べられている通り行うことができる。
実施例１ ＰＤＧＦアプタマーの選択と配列
候補混合物の調製：部分的にランダム化されたｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドの候補混合物はビオチン標識されたＤＮＡテンプレートにアニールされたｓｓＤＮＡプライマーのポリメラーゼ伸長により調製された。
ＳＥＬＥＸ条件：ＰＤＧＦ−ＢＢタンパク質に対するアプタマーは、(Gold et al. (2010) PLoS One 5:e15004)に述べられている通り、Ｂｎ−ｄＵがｄＴに置換されている４０−ヌクレオチドランダム領域を含むライブラリからソマロジック社(SomaLogic Inc)によ
り選択された。順方向プライマーは５’ＣＧＣＣＣＴＣＧＴＣＣＣＡＴＣＴＣ、逆方向プライマーは５’ＣＧＴＴＣＴＣＧＧＴＴＧＧＴＧＴＴＣである。ＰＤＧＦ−ＢＢタンパク質はビオチン標識されストレプトアビジンＭｙＯｎｅ−ＳＡ（Ｄｙｎａｌ）ビーズ上に分割された。遅い解離速度をもつアプタマーの優先的選択は動力学的検証を用いてなされた。この動力学的検証ではタンパク質−ＤＮＡ複合体は１０ｍＭ硫酸デキストランの存在下３７°Ｃでインキュベートされ、連続したラウンドでインキュベーション時間を増加させタンパク質濃度を低下させた。動力学的検証は選択のラウンド４で始められ、最後の８回目のラウンドまで続けられた。インキュベーション時間はラウンド４は５分、ラウンド５−７は１５分、ラウンド８は３０分であった。
プール配列決定：８回目のラウンドプールからのオリゴヌクレオチド配列はクローン化されいくつかのクローンは配列決定された。これは４１４９−８＿１に例示されるように、関連する配列のファミリーの同定につながった。
ＰＤＧＦ ＳＥＬＥＸプールのディープ配列決定：４１４９−８＿１アプタマーファミ
リー内配列のより完全な評価を行うため、８回目のラウンドプールは４５４パイロシークエンシング技術を用いて配列決定された。プールＤＮＡは４５４プライマーで増幅されＰＣＲの生成物は精製されＳｅｑｕａｌ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ ｐｌａｔｅ（インビトロジェン(Invitrogen)カタログ番号A10510-01)）を用いて標準化された。溶出液はそれぞれの増幅産物の大きさと純度を確かめるためにゲル上に流された。精製されたＰＣＲ生成物はコロラド州オーロラのコロラド大学ヘルスサイエンスセンター(University of Colorado Health Science Center in Aurora CO)の４５４パイロシークエンシング設備で
配列決定された。
４５４配列はＣＬＵＳＴＡＬ分析により４１４９−８＿１と配列比較された。プールからの配列のデータセットは１０，８０３の完全長配列（すなわち両方のプライマー配列を含むこれらの配列）を含み、そのうち３，８３９が独特であった。これら３，８３９の独特な配列は、“５’ＺＡＣＮＣＧＣＧＺＺＺＡＺＡＧＣＧ”（同一性＝０．６５）、そしてここよりも上流で“ＺＺ”（同一性＝１．０）についてモチーフ検索された。これらのモチーフの両方を含む配列が４３６あった。さらに、５８の他の配列が最初のパターンを含んでいたが、概して低い同一性であり上流に明らかなヘアピン構造をもたなかった。４３６の配列はそして次のように配列比較された。（１）“ＺＺ”に対して、（２）ループの中心に対して、（３）“ＺＡＣＮＣＧＣＧＺＺＺＡＺＡＧＣＧ”に対して。全ての配列について、４１４９−８＿１とのそれぞれの位置での同一性率は図３Ａに記載された通り計算された。
表１および２は配列の４１４９−８＿１アプタマーファミリーの代表的な配列の数を記載する。
アプタマー合成：固相合成に用いられた、修飾されたデオキシウリジン−５−カルボキサミドアミダイト試薬は以下のように調製された。５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−５−トリフルオロエトキシカルボニル−２’−デオキシウリジン (Nomura et al. (1997) Nucl. Acids Res. 25:2784)を適切な一級アミンと濃縮し（ＲＮＨ2、１．２
当量、Ｅｔ3Ｎ、３当量、アセトニトリル中６０°Ｃ、４時間）、２−シアノエチル−Ｎ
，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホラミダイトと３’−Ｏ−ホスホフィチジル化し（１．２当量、ｉＰｒ2ＥｔＮ、３当量、ＣＨ2Ｃｌ2、−１０から０°Ｃ、４時間）、中性シリ
カゲルでのフラッシュクロマトグラフィーで精製した (Still, et al. (1978) J. Org. Chem. 43:2923)。アプタマーはホスホラミダイトメソッド(Beaucage and Caruthers (1981) Tetrahedron Lett. 22:1859)を用いた固相合成により調製された。本明細書で開示される独特の塩基修飾のためプロトコールをいくらか修正した。脱トリチル化はトルエン中１０％ジクロロ酢酸で４５秒行われた。カップリングは１：１アセトニトリル：ジクロロメタン０．１Ｍ中で５−ベンジルメルカプトテトラゾールにより活性化され、３回５分間反応させることで行われた。キャッピングおよび酸化は装置ベンダーの推奨に従って行われた。脱保護はｔ−ブチルアミン：メタノール：水１：１：２(Mullah 1998)で摂氏３７度
にて２４時間反応させて行われた。アプタマーは２００ｎｍolスケールで合成され、既述のＵＶシャドウウィングを用いて(Fitzwater and Polisky (1996) Methods Enzymol. 267:275)、 Ｃｏｓｔａｒ Ｓｐｉｎ−Ｘ （シリコン処理したグラスウールまたは紡いだポ
リプロピレンプレフィルターを含まない）およびメーカーの推奨あたりのアミコンＹＭ３
濃縮でポリアクリルアミドゲルから精製された。
修飾されたヌクレオチド構造の活性関係および親和性成熟化。８つのベンジル側鎖それぞれの結合への寄与を調べるため、特別に作成した、修飾されたｄＵホスホラミダイトのライブラリーを用いて５位変異体を化学的に合成することにより、別の系統的なポイント置換を連続的に行った。この目的のために、大きさ、極性、水素結合ドナーおよびアクセプターの配置、リンカー長さおよび５位置換基の配向性を変えることによりそれぞれの位置の微環境を調べることができるライブラリーがデザインされた。この分析に用いる官能基を選択するにあたり、もともとの修飾（この場合ベンジル基）、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）で大きな比率を占めるアミノ酸側鎖（トリプトファン及びチロシンのような）(Mian, IS, et al. (1991) J. Mol. Biol. 217:133; Ramaraj T. et al. (2012) Biochim. Biophys. Acta. 1824:520)、および低分子薬物の“特権を持つ”断片 (Welsch et al. (2010) Curr. Opin. Chem. Biol. 14:347)、をテーマに変異体を含もうと試みた。ある意味で、我々は抗体における親和性成熟化の要素と構造−活性関係（ＳＡＲ）の最適化を医薬品化学において組み合わせようと努力した。ＳＥＬＥＸの間は単一の修飾されたヌク
レオチドを利用したが、ＳＥＬＥＸ後の最適化は修飾された単量体の合成のしやすさと固相合成との適合性にのみ制約された。
５位における１４の代替部によるベンジル基の置換の効果は、解離定数として表された相対的な親和性とホスホ−ＰＤＧＦＲβ比で表された相対的なＰＤＧＦＲβリン酸化とともに図１Ｃ、Ｄおよび図６Ｂに要約されている。５位にメチル基だけを有するｄＴによる置換は最も強い変化を表し、その意味でタンパク質のアラニン系統的変異導入法(Cunningham, B.C. et al. (1989) Science 243:1330)に匹敵する。予想通り、これは修飾された
ヌクレオチドの８つの位置のうち６つで最も耐性のない置換であった。例外はヌクレオチド１および７で、この位置で置換は良い耐性があった。これら２つの位置は他の多くの置換でも耐性があり、いくつかの置換では最高５倍までの結合親和性向上が得られた（図６Ｂ）。対照的に、ヌクレオチド８、１７および１８は変化に対し最も高い感受性を示した。最も良い単一の置換が組み合わせられ、４１４９−８＿２５５および４１４９−８＿２６０を含む追加の変異体が得られた（図６B）。ヌクレオチド１７のフェネチル−ｄＵ（
Ｐｅ−ｄＵ）およびヌクレオチド１８のチオフェン−ｄＵ（Ｔｈ−ｄＵ）を組み合わせたアプタマー４１４９−８＿２６０はＰＤＧＦ−ＢＢとＰＤＧＦ−ＡＢの両方に優れた結合を示した（図６Ｂ）。最初に選択されたＳＯＭＡｍｅｒの親和性が既に高く（Ｋd＝２０
ｐＭ）結合試験の検出限界に達し、よって結合の向上程度が過小評価されている可能性があるという事は特筆に値する。我々は類似したＳＥＬＥＸ後の最適化ストラテジーを、より弱い最初の結合で（例えばＫd値１００ｐＭから１０ｎＭの範囲）他のＳＯＭＡｍｅｒ
にあてはめたところ、最高１００倍までの親和性の向上が観察された。
ＰＤＧＦアプタマー４１４９−８＿２６０（ＳＬ５）ホモ二量体：ＰＤＧＦは共有結合したホモ二量体を形成し、２つのＳＯＭＡｍｅｒがそれぞれのＰＤＧＦホモ二量体に結合することから、我々はホモ二量化したＳＯＭＡｍｅｒの結合に対する影響を測定した。ＰＤＧＦアプタマーホモ二量体の親和性は結合活性効果により、対応するモノマーの親和性と比較して実質的に向上した。結晶構造はＳＯＭＡｍｅｒの５’末端は３８Å離れている一方、３’末端は７４Å離れていることを示した。２つの地点の最も短いパスはタンパク質を二等分しているので、５’末端を３’末端に結合させるには少なくとも６３Å必要である。容易に利用できる化学に基づいて２つの型のホモ二量体が注文された。１）Ｈｅｇあたり~２０Åの距離を提供する２つから６つのＨｅｇリンカーに結合した頭−尾(頭−尾)ホモ二量体、２）１つから３つのＨｅｇと組み合わせられた、合成のダブラーサポート
を介して結合した３’−３’ホモ二量体である。４１４９−８＿２６０のホモ二量体はＰＤＧＦ−ＢＢ Ｚｏｒｂａｘ結合試験法でテストされた。結合試験は限られた量のＳＯＭＡｍｅｒを用いて行われ、タンパク質二量体あたり１つのＳＯＭＡｍｅｒの結合とタンパク質二量体あたり２つのＳＯＭＡｍｅｒの結合を区別しない。ホモ二量体の構造を表１（配列４１４９−８＿３３４から４１４９−８＿３４２）に示す。表１ａに示す通り、Ｚｏｒｂａｘ試験で得られたＫd値は、５’から３’の立体配置において、より長いリンカー
が望ましく、結合親和性が最高１０倍まで向上することを示した。３’−３’結合したホモ二量体では、より短いリンカーが実は長いリンカーよりも良く働いた。これは細胞のリン酸化の結果により裏付けられた。表１ａを参照。
これらの配列に基づいた典型的なコンセンサス配列は次の通り。
５’−ＺＺＶＣＬnＧＶ’ＺＡＣＮＭＧＣＧＺＺＺＡＺＡＧＣＧ−３’（配列番号５０２
），
配列中、
ＶはＡ、ＣまたはＧから選ばれ、
Ｖ’はＣ、ＧまたはＺから選ばれ、Ｖ’はＶに相補的であり、
Ｎは独立して任意の天然に存在するまたは修飾されたヌクレオチドから選ばれ、
ＭはＣまたはＡから選ばれ、
Ｚは独立して修飾されたピリミジンから選ばれ、Ｌは任意の天然に存在するまたは修飾されたヌクレオチド、炭化水素リンカー、ポリエチレングリコールリンカーまたはそれらの組み合わせから選ばれるスペーサーであり、
ｎは０から２０であり、
１つまたは２つ以上のヌクレオチド挿入を含んでも良い。
配列切断試験
表３に示される通り、ヒトＰＤＧＦ−ＢＢへのアプタマーの完全な結合活性を維持するのに必要な最長の長さを定義するため、４１４９−８＿１の５’および３’末端からの系統的な切断が行われた。切断のサブセットのＫd値が示されている。Ｚ＝ベンジル−デオキ
シウリジン（Ｂｎ−ｄＵ）、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴはデオキシリボヌクレオチドである。
タンパク質発現と精製およびアプタマー複合体形成
結晶試験のため、組換えヒトＰＤＧＦ−ＢＢタンパク質がクリエイティブバイオマート(Creative BioMart (Shirley, NY))から購入された。組換えタンパク質はE.coli細胞内に発現された。アプタマー溶液は解凍され９５°Ｃまで５分加熱することでアニールされ、５分間４０°Ｃでインキュベートされた後、室温まで冷まされた。アニールされたアプタマー溶液はタンパク質とＤＮＡ対タンパク質１．１：１で混合された。複合体は２０ｍＭのリン酸Ｎａ／Ｋ（ｐＨ７）および１００ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液で５倍希釈された。得られた混合物は、アミコン１．５ｍＬ遠心フィルター内でタンパク質中〜４ｍｇ／ｍＬに濃縮された。最終濃度は最終残余量から推定された。
実施例２ ＰＤＧＦアプタマー複合体の結晶化および構造
結晶はコンパクトジュニアプレート(Emerald BioSystems, WA)中シッティングドロップ蒸気拡散法結晶で１６oＣで成長した。データ収集のための結晶は一次選別(ProPlex, Molecular Dimensions)から得られた。ＰＤＧＦ−ＢＢ：４１４９−８＿２５５複合体の結晶は１００ｍＭ酢酸マグネシウム、１００ｍＭ酢酸ナトリウム、（ｐＨ４．５）および８％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ８０００から得られた。ＰＤＧＦ−ＢＢ：４１４９−８＿２６０複合体の結晶は１００ｍＭ酢酸マグネシウム、１００ｍＭ酢酸ナトリウム、（ｐＨ６．５）および１５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ６０００から得られた。結晶はＬｉｔｈｏ Ｌｏｏｐｓで採取され、３３％（ｖ／ｖ）エチレングリコールを含む貯蔵液に素早く移して凍結保護され、液体窒素に直接漬けて瞬間冷却された。
データ収集と構造決定：両方の構造データはＡｄｖａｎｃｅｄ Ｐｈｏｔｏｎ Ｓｏｕｒｃｅ（アルゴン、イリノイ(Argonne, IL)）のビームライン１９−ＩＤに集められた。
データセットはＸＤＳ（Ｋａｂｓｃｈ２０１０）を用いて処理された。ＰＤＧＦ−ＢＢ：４１４９−８＿２６０複合体の構造は最初ＣＣＰ４の一揃いのソフトウェア（ＣＣＰ４，１９９４）からＰｈａｓｅｒを用いた分子置換によりサーチモデルとしてＰＤＧＦ−ＢＢベータ型ＰＤＧＦ受容体複合体（ＰＤＢ ｅｎｔｒｙ ３ＭＪＧ）からＰＤＧＦのタンパク質モデルを使って相分析された。分子置換は非対称ユニットあたり単一のタンパク質単量体の位置を定めた。ＲＥＦＭＡＣにおける抑制されたリファインメントの最初のラウンドに続く電子密度マップを調べたところタンパク質モデルに隣接する核酸と一致する特徴を示した。続いて“不正コピー”、すなわち部分的なモデルが反復したリファインメントのラウンドにかけられ、プロセスを通じてアプタマーのモデルが構築され、結果としてわずかに改良されたマップとなって、それにより更なるモデルが構築された。最初に、リン酸イオンが核酸骨格密度中に構築された。二番目に、リン酸がｄＴ残基に置き換えられた。リファインメントの後、修飾された残基は正の差分電子密度の突出により識別されることができた。修飾された残基の同定はアプタマーの配列登録の決定を促進し、最後の段階でｄＴ残基は正しい核酸塩基に置き換えられた。全てのマニュアル構築はＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ Ｏｂｊｅｃｔ−Ｏｒｉｅｎｔｅｄ Ｔｏｏｌｋｉｔ （Ｃｏｏｔ）
(Emsley & Cowtan, 2004)を用いて行われた。ＰＤＧＦ−ＢＢ：４１４９−８＿２５５の構造は４１４９−８＿２６０複合体の完成したモデルを用いた分子置換により解析された。
それぞれの構造において、電子密度の突出がＴｈｒ８８およびＴｈｒ９０残基のＯγ原子の電子密度に隣接して観察された。酵母中ＰＤＧＦ−Ｂの発現について、これらの部位においてＯ−マンノシル化が報告されたが(Settineri, et al., (1990))、E.coli中に発
現されたＰＤＧＦ−Ｂに類似の翻訳後の修飾を予想する理由はあまりない。観察された電子密度は完全占有よりも低いことを示唆したので、スレオニン残基は翻訳後の修飾なしにモデルされた。
表４はデータ収集統計とリファインメントおよび４１４９−８＿２６０（配列番号２１１）と４１４９−８＿２５５（配列番号２０７）との２つのアプタマーリガンドをそれぞれ開示している。
表５はＢ型ＤＮＡと比較したＰＤＧＦＢＢアプタマー塩基対パラメーターを示す。ＰＤＧＦＢＢアプタマーは５’ステムループ領域およびミニノットの両方のステムで偏位したＢ型立体構造をとる。必要に応じて、平均値および標準偏差（かっこ内）が与えられている。アプタマーの値はｗｅｂ３ＤＮＡ(Zheng et al. (2009) Nucleic. Acids Res. 37:W240)を用いた分析に基づいており、Ｂ−ＤＮＡ値（高分解能結晶構造で見られた）はOlson, et al. (2001) J. Mol. Biol. 313(1): 229に記述報告されている通り３ＤＮＡを用い
て決定された。
ＰＤＧＦ−ＢＢの単量体のサブユニットはねじれβシートを形成し、ねじれβシートはタンパク質のシスチンノットファミリーに特徴的な逆平衡の配向で(Oefner et al. (1992) EMBO J. 11:3921)二量化する。ＳＬ５（４１４９−８＿２６０）は２つの相同部位を
長軸のどちらかの末端で結合し、ホモ二量体の界面を交差して３つのＰＤＧＦループのそれぞれに接触する（図７Ａ）。ＳＯＭＡｍｅｒは疎水性の芳香族相互作用のネットワークで繋がれた２つの領域を含む（図７Ｂ）。５’末端において、短いステムはＨｅｇループでキャップされている（結晶構造中無秩序である）が、分子の残りの部分は非常に小さいＨ型のシュードノットの中に折りたたまれており(Aalberts, D.P. et al. (2005) Nucleic Acids Res. 33:2210)、修飾されたヌクレオチドはステムループ／シュードノット接合
部でクラスター化している。珍しいことに、８つの全ての修飾されたヌクレオチドはＰＤＧＦと接触している。７つの修飾されたヌクレオチドはタンパク質上の疎水性の溝に沿って一緒にクラスター化する一方、Ｂｎ−ｄＵ１は伸長した立体構造の形をとり、ＰＤＧＦホモ二量体界面のチャネルに追従する。２つの天然のヌクレオチドもまたＰＤＧＦに接触し、残りの天然のヌクレオチドは内部構造に寄与する（図２および図７）。ＳＬ５の二次構造の要素であるステムループおよびシュードノットは良く知られた核酸の構造モチーフである。しかしながら、修飾されたヌクレオチドを持つある従来の塩基は別の相互作用をする新しい官能基を提供する。ＳＬ５のこの際立った特徴により、基準および修飾されたヌクレオチド間の独特な分子内接触とタンパク質結合のための広範な疎水性表面がもたらされる。
ＳＬ５の３’末端はＨ型シュードノットの顕著な特徴を表すが(Staple, D.W. et al. (2005) PLoS Biol. 3:e213)、この分類はこの特徴的な“ミニノット”モチーフの特殊な性質を控えめに表現している。構造として報告された最も小さいＨ型シュードノットは２１のヌクレオチドを必要とするのに比べて (Nonin-Lecomte S. et al. (2006) Nucleic Acids Res. 34:1847)、ＳＬ５ミニノットはたった１６のヌクレオチドである（図７Ｂ）。さらに、ステム２（S２）の末端のｍＧ２４：ｄＣ１２塩基対の消去により結合親和性は低
下しない（図3）。これは１４ヌクレオチドミニノットの機能的完全性を示している。前
例のない骨格のねじれおよびスタッキング相互作用により、ミニノットは、修飾されたヌクレオチドの疎水性部分の充填により安定化されることで著しく小さいサイズを達成した新しいシュードノットの変異体を表している。
ミニノットステム１（S１）が正式にはたった２つのWatson-Crick塩基対を含む（図８
Ａ）一方、Ｌｏｏｐ２（Ｌ２）は通常Ｐｅ−ｄＵ１７、Ｔｈ−ｄＵ１８、ｄＡ１９、Ｂｎ−ｄＵ２０およびｍＡ２１の５つの塩基を含む。Ｌ２とＳ１間の相互作用はシュードノットの決定的な特徴であるが、それらは典型的に水素結合に限られている。対照的に、ＳＯＭＡｍｅｒミニノットは一般的ではない塩基対に支えられた特殊なループ−ステムスタッキング相互作用を形成する。特に、Ｓ１はＬ２に由来するＢｎ−ｄＵ１７：Ｂｎ−ｄＵ２０非標準塩基対とのスタッキングにより安定化し、効果的に新しい骨格不連続を持つ３つの塩基対Ｓ１を作る（図８Ｃおよび図８Ｂ）。前述のＵ：Ｕイミノカルボニル塩基対とは対照的に、Ｐｅ−ｄＵ１７：Ｂｎ−ｄＵ２０塩基対はＢｎ−ｄＵ１７のＮ３とＢｎ−ｄＵ２０のアミドリンカー中カルボニル酸素の間の単一の水素結合を利用する（図８Ｄ）。Ｂｎ−ｄＵ２０のグリコシル結合についてのシン構造はＢｎ−ｄＵ１７との水素結合を妨げるが、Ｂｎ−ｄＵ８の糖と立体的な衝突なくＢｎ２０をＢｎ−ｄＵ８塩基とスタックさせる。一般的でないＰｅ−ｄＵ１７：Ｂｎ−ｄＵ２０塩基対はヌクレオチド１８および２０間の骨格を２８０°回転させることにより可能になる（図８Ｃ）。この劇的な鎖の逆転はＢｎ−ｄＵ２０塩基をｄＡ９の糖にスタックさせＰｅ−ｄＵ１７と水素結合を形成する。重要なことに、Ｐｅ−ｄＵ１７：Ｂｎ−ｄＵ２０塩基対は修飾されたヌクレオチドに与えられた疎水性相互作用を通して更なる安定化を得る。Ｐｅ−ｄＵ１７側鎖のエチレン（リンカー）部分はＢｎ１６（ＣＨ：：π）に向かっており、そのベンジル基はπ−π端−面相互作用でＢｎ２およびＴｈ１８とスタックしている（図８Ｅ）。Ｌ２とＳ１間の更なるもう１つの相互作用は塩基トリプル（ｍＡ２１：ｄＧ１５：ｄＣ１０；図８Ｆ）であり、シュードノットにおける反復性のモチーフである(Chen, G. et al. (2009) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106:12706)。これはＳＬ５中唯一の修飾されたヌクレオチドに関与しな
い長距離三次相互作用である。
Ｌｏｏｐ１（Ｌ１）は単一の逸脱したヌクレオチドｍＡ１１を含む。ｍＡ１１はｍＡ１１とｄＣ１２間の鎖内のリン酸距離をたった５．９Åに圧縮しながら骨格を急な９４°回転させる（図８Ｇ）。Ｈ型シュードノットはしばしばＬ１に１つか２つのヌクレオチドを持つ。これはＳ２と水素結合を形成してらせん接合部にスタックする(Nonin-Lecomte, S.
et al. (2006) Nucleic Acids Res. 34:1847; Michiels, P.J. et al. (2001) J. Mol. Biol. 310:1109)。押し出されたＬ１ヌクレオチドは５’ステム領域が修飾されたヌクレ
オチドの疎水性部分を通してミニノットと相互作用するために凝縮された構造を保つために必要である。予想通り、押し出された塩基は保存されず（図３）単一のＣ３スペーサーで置換され得る（図６Ａ）。しかし、この消去は、おそらくミニノットの形成との干渉により、結合を抑制する。
ミニノットＳ１（ｄＡ９：Ｂｎ−ｄＵ１６、ｄＣ１０：ｄＧ１５）のWatson-Crick塩基対はＳ２の鎖１が直接Ｓ１の鎖２に入る有利なＨ型シュードノットの配置により集合し、効率的なステムのスタッキングを提供する(Klein, D.J. et al. (2009) Nat. Struct. Mol. Biol. 16:343)。Ｓ２の３つの塩基対は完全にWatson-Crick相互作用を含み、わずかに弛緩ねじれのＢ型らせんを形成する（図８Ｈ）。この弛緩ねじれの結果、シュードノットトポロジーに予想されるA型らせんにより似たらせん状のパラメータになる。しかしこの
構造中のらせんは距離が短くこれらの計算の関連性は不確かである。Ｓ１のｄＣ１０：ｄＧ１５およびＳ２のｄＣ１４：ｄＧ２２により形成された、接合部の激しいらせん状の過度のねじれにより(ねじれ角度７０°)、Ｓ２はＳ１と従来の同軸性スタックを形成しない。ステムの連続したスタッキングはそれでも維持されｄＣ１４はｄＧ１５と、ｄＧ２２は塩基トリプルからのｍＡ２１とスタックする（図８Ｈ）。この接合部の広範ならせん状ね
じれは塩基トリプルの形成のために少数の溝を広くする一方でｍＡ２１をＳ２の主要な溝に架橋させるのに必要である。この立体配置はＬ１に１つまたは２つのヌクレオチドを持つシュードノットに典型的である(Nonin-Lecomte, S. et al. (2006) Nucleic Acids Res. 34:1847; Michiels, P.J. et al. (2001) J. Mol. Biol. 310:1109)。
ＳＬ５５’ステムは２つのWatson-Crick塩基対（ｍＡ３：Ｂｎ−ｄＵ７およびｄＣ４：ｄＧ６）およびステムの基部の非標準Ｂｎ−ｄＵ２：Ｂｎ−ｄＵ８塩基対を含む（図８Ｉ）。Ｂｎ−ｄＵ２：Ｂｎ−ｄＵ８塩基対は二つの水素結合を含む。典型的な４−カルボニル−Ｎ３およびＢｎ−ｄＵ２塩基からＢｎ−ｄＵ８結合のアミドリンカーへの独特の４−カルボニルである（図８Ｊ）。親和性を向上させたプール中の関連する配列の分析により、ステム基部の不変のＢｎ−ｄＵ：Ｂｎ−ｄＵブレースという注目すべき例外を持ちながら５’ステムの長さと塩基構成は可変であることが示された（図３ＡよびＢ）。全体構造とＳＬ５の機能におけるこの非標準塩基対の重要性を強調している。５’ステムらせんの安定性はＰＤＧＦのｄＵ８、Ｂｎ２０およびＰｒｏ８２のスタッキングにより更に支持された（図９Ｈ）。５’ステムループおよびＳＬ５のミニノット領域は集合し、そこで骨格は鋭く１１１°に曲がる。５’ステムにおける塩基対の明らかなねじれ角度と放射状の置換は従来のＢ型らせんより大きなスタッキングの重なりを持つ（アンダーツイスティング(undertwisting)のため）塩基２−4および６−７をもたらす一方、Ｂｎ−ｄＵ８塩基は外側に出てＢｎ−ｄＵ７塩基はＢｎ−ｄＵ８のアミドリンカーとスタックする（図８Ｉ）。この特殊ならせんはＳＬ５の残りの部分およびＰＤＧＦとの決定的な相互作用を促進する。Ｂｎ−ｄＵ８塩基はＢｎ２０とスタックする一方、Ｂｎ８は連続したπ−π端−面相互作用においてＢｎ１６とＢｎ２０の環の間に垂直に位置する。これらの長距離三次相互作用はミニノットとステムループ領域間の精密なヒンジを定義する（図８Ｌおよび８Ｋ）。最初の２つのヌクレオチドに湾曲が欠如していることで環のスタッキングが増大し、Ｂｎ−ｄＵ１塩基がＢｎ２と衝突することを防いでいる（図８Ｉ）。Ｂｎ２はＢｎ７およびＢｎ８（５’ステムから）およびＢｎ１６、Ｐｅ１７およびＢｎ２０（ミニノットから）により作られた疎水性集合の中央部に位置している（図７Ｂ、図８Ｉおよび図８Ｋ）。この疎水性集合はＳＯＭＡｍｅｒの安定化に寄与する。これはＳＬ５が、修飾されたヌクレオチドのないＳＬ５類似体よりも３０°Ｃを超えて高い６４°ＣのＴmを示すことで裏付け
られた。
ＳＬ５に加えて、Ｂｎ−ｄＵ８がイソブチル−ｄＵ（ｉＢ−ｄＵ）で置換された以外はＳＬ５と同一であるＳＬ４（４１４９−８＿２５５）の構造も解明した。異なるＳＬ４内でｉＢ−ｄＵ８はＰｅ−ｄＵ１７およびＴｈ−ｄＵ１８を組み合わせたとき、ＳＯＭＡｍｅｒは相当により弱い結合（ＳＬ５に対し〜２０−５０−倍）と７５−倍低いｉｎ ｖｉｔｒｏでの阻害活性を示した（図１Ａ、図１Ｂおよび図６Ｂ）。より小さい非芳香族イソブチル側鎖は、ＳＬ５のＢｎ−ｄＵ２０、Ｂｎ−ｄＵ８およびＢｎ−ｄＵ１６のベンジル側鎖で見られるエネルギー的に有利なπ−π端−面スタッキングを形成することができない（図８Ｍおよび図８Ｎ）。これはタンパク質界面における疎水性集合の中心に穴を形成し、５’ステムとミニノット領域の間のヒンジを効果的に開放する。この置換の構造的な効果はタンパク質の疎水性核におけるＰｈｅからＬｅｕの変異に直接類似している。このようなタンパク質の変異はきちんと説明されており(Kadonosono, T. et al. (2003) Biochemistry 42:10651; Lin, H.J. et al. (2003) Biochim. Biophys. Acta. 1649:16; Baase, W.A. et al. (2010) Protein Sci. 19:631)、通常明らかな不安定化効果を有する。二次構造モチーフ間の接合部は核酸の三次構造の決定に重要な役割を果たすことが良く知られている(Pyle, A.M. et al. (2011) Curr. Opin. Struct. Biol. 21:293)。
著しく弱い標的―結合親和性にも関わらず、ＳＬ４はリガンドの非存在下ＳＬ５に類似した熱融解特性を示す(それぞれＴm値６２oＣと６４oＣ)。これはＳＬ４のｉＢ−ｄＵ８
の置換により形成された空洞と変化した接合部トポロジーがタンパク質―結合界面を非安
定化させる一方、ＳＯＭＡｍｅｒの内部領域構造をそのまま残すという概念と一致する。溶液中のフリーなＳＯＭＡｍｅｒの立体構造はタンパク質との複合体のものとは非常に異なるかもしれず、Ｔmと結合親和性の間の関係も消えるかもしれない。実際、ＳＯＭＡｍ
ｅｒの大きな疎水性表面を溶媒和するエネルギーコストは相当であると考えられ、我々は複合化していないＳＯＭＡｍｅｒが疎水性の側鎖の周囲で崩壊し疎水性の側鎖が部分的に溶媒から守られている立体構造をとると予想する。
前述のタンパク質：アプタマー複合物と対照的に疎水性相互作用はＳＬ５とＰＤＧＦの間の界面を支配する（図２、図４および図９）。ＰＤＧＦ−ＢＢへの結合はＳＯＭＡｍｅｒあたり〜１２２５Å2の埋もれた表面領域を形成する。ＳＬ５の８つの修飾されたヌク
レオチドは広範な疎水性界面を形成し、この界面はＰＤＧＦの１３の非極性アミノ酸（Ａｌａ３５、Ｐｈｅ３７、Ｌｅｕ３８、Ｖａｌ３９、Ｔｒｐ４０、Ｐｒｏ４２、Ｃｙｓ５２、Ｃｙｓ５３、Ｉｌｅ７５、Ｉｌｅ７７、Ｐｒｏ８２、Ｉｌｅ８３およびＰｈｅ８４）と相互作用する。これは全体の非極性接触のおよそ半分を占め、残りはＧｌｕ２４、Ａｒｇ２７、Ａｓｎ３６、Ａｓｎ５４、Ａｓｎ５５、Ａｒｇ５６、Ａｒｇ７３、Ｌｙｓ７４、Ｌｙｓ８０、Ｌｙｓ８５およびＬｙｓ８６のような（図９）、極性のまたは荷電したアミノ酸の脂肪族の領域を含む。完全に非極性の残基と荷電したアミノ酸の非極性部分の間の類似した相互作用がタンパク質でしばしば観察される。よって、ＳＯＭＡｍｅｒの修飾されたヌクレオチドがもたらす構造多様性はそれらがタンパク質に届きやすい相互作用の豊富なレパートリーを模倣することを可能にする。ＳＯＭＡｍｅｒに作られた疎水性接触の程度を従来のアプタマーと比べたときの著しい違いは、界面の原子が標的のタンパク質表面に呈示されたときに明白である。ＳＬ５は塩基性アミノ酸に近接しているにも関わらず著しく少ない極性接触を示し、ＰＤＧＦとたった６つの水素結合と１つの電荷−電荷相互作用しか持たない（図４）。接触表面積と比較して、これは明らかにアプタマーに典型的なものより低い。６つの従来のアプタマーの水素結合および電荷−電荷相互作用の総数（これが極性接触）は相関係数０．９１、１００Å2の界面面積あたり平均１．９±０．４の
極性接触で界面の面積に正比例してほぼ直線的に増加する（図１０Ａ、図２２Ａ）。他の共結晶構造における２つの追加のＳＯＭＡｍｅｒと同様、ＳＬ５は界面面積あたり半分より少ない数の極性接触で（１００Å2界面面積あたり平均０．７±０．２）明らかにこの
傾向の９９％信頼区間から外れている一方、標的への結合親和性は高くなる傾向を示す（図２２Ｃ）。リガンド効率（非水素接触原子あたりの結合自由エネルギー） (Kuntz, I.D. et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:9997)の観点では、アプタマーとＳＯ
ＭＡｍｅｒに違いは見られず（図２２Ｃ）、タンパク質に基づいたリガンドおよび低分子に基づいたリガンドで観察された値の範囲を包含する(Wells, J.A. et al. (2007) Nature 450:1001)。界面面積あたりの結合の自由エネルギーもまた類似している（図２２Ｃ）
。しかしながら極性接触あたりの結合自由エネルギーの値が異なり、ＳＯＭＡｍｅｒがアプタマーよりも約２倍大きい（図２２ＢおよびＣ）。これはＳＯＭＡｍｅｒが疎水性相互作用よりも結合に大きく寄与するという概念と一致する。
電荷−電荷相互作用はしばしば折りたたまれたタンパク質の安定性に０．２ｋｃａｌ／ｍｏｌよりも小さく寄与する(Sali, D. et al. (1991) J. Mol. Biol. 220:779)。対照的に、単一のメチレン基１つだけを埋め込むと球状のタンパク質の安定性および／または結合相互作用に〜１−１．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ寄与すると見積もられている(Kellis, J.T.,
Jr. et al. (1988) Nature 333:784; Pace, C.N. et al. (2011) Mol. Biol. 408:514)
。ＳＯＭＡｍｅｒ構造は疎水性相互作用に強く依存していることを明らかにしており、この意味では、それらのタンパク質への結合は典型的なタンパク質−タンパク質相互作用により類似している。この観察に一致して、ＰＤＧＦに対するＳＬ５の親和性は広範囲の塩濃度（０．１から１．０ＭＮａＣｌ）またはｐＨ値（５．０から８．８）にわたって事実上減少しないことを示し、従来のアプタマーに見られる効果(Ahmad, K.M. et al. (2011)
PLoS ONE 6:e27051; Tang, Q. et al. (2007) J. Colloid. Interface. Sci. 315:99)と
対照的である。
ＳＥＬＥＸ後の最適化は形状相補性の微調整と疎水性充填相互作用を促進する。例えば、タンパク質界面の例外的なＰｅ−ｄＵ１７およびＴｈ−ｄＵ１８の形状相補性（図１０Ｂ）は構造−活性の関係により裏付けられる（図６Ｂ）。Ｂｎ−ｄＵ１もまた、Ｃｙｓ４３−Ｃｙｓ５２ジスルフィド結合、およびＰＤＧＦ鎖１のＧｌｕ２４および鎖２のＡｒｇ５６間の塩架橋により形成されたトンネル内に位置するベンジル環（図１０Ｃ）でＰＤＧＦ−ＢＢと独特の相互作用を形成する。結晶構造は結合ポケットがより大きい二環性置換基を含む様々な側鎖を収容でき、よってこの部分のタンパク質との接触を強くすることを示唆している。実際、我々は５から１０倍結合親和性を強化するこの部分のいくつかの修飾されたヌクレオチド置換基を同定した（図６Ｂ）。
ＰＤＧＦ−ＢＢ：ＳＬ５構造の注目すべき特徴はＳＯＭＡｍｅｒがＰＤＧＦＲβを模倣する程度である。受容体はＰＤＧＦ界面の７つの疎水性アミノ酸を含む疎水性相互作用を通して主にＰＤＧＦに結合する(Shim, A.H. et al. (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
107:11307)。ＳＬ５結合部位はタンパク質上の同じ疎水性の溝を占めるＢｎ−ｄＵ芳香
族環を持つ受容体のそれと大きく重なっている（図１１）。ＰＤＧＦの受容体およびＳＬ５の両方との接触は２４残基のうち１０が共有されている。これらの共有されたまたは“入り交じった”残基はＰＤＧＦ表面の結合エネルギーのホットスポットを表すと考えられる(Wells, J.A. et al. (2007) Nature 450:1001; Clackson, T. et al. (1994) Science
267:383)。しかしながら、ＰＤＧＦＲβと比較して、ＳＬ５はＰＤＧＦ−ＢＢに対し１
０倍高い親和性を表す(Lokker, N.A. et al. (1997) J. Biol. Chem. 272: 33037)。これらの観察に一致して、ＳＬ５はＰＤＧＦ−ＢＢの阻害剤である（図１Ｂおよび図６Ｂ）。
実施例３ 結合親和性試験
標的結合親和性の測定のために、ＳＯＭＡｍｅｒはＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ニューイングランドバイオラボ(New England Biolabs)）およびγ−32Ｐ−ＡＴＰ（パーキ
ンエルマー(Perkin Elmer)）を用いて５’末端標識された。結合試験は放射性標識されたＳＯＭＡｍｅｒ（〜２０，０００ｃ．ｐ．ｍ）を〜０．０３−０．０５ｎＭの濃度で、また標的タンパク質を１０-7から１０-12Ｍの濃度で１ＸＳＢ１８Ｔ緩衝液（４０ｍＭのＨ
ＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１２０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ2お
よび０．０１％ＴＷＥＥＮ−２０） 中３７°Ｃで３０分間インキュベートして行われた
。結合した複合体はＺｏｒｂａｘ樹脂と混合されＤｕｒａｐｏｒｅフィルタープレートで捕獲された。ＳＯＭＡｍｅｒが結合した画分はＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（ＦＵＪＩ
ＦＬＡ−３０００）で定量された。生の結合データは放射性標識されたＳＯＭＡｍｅｒのＺｏｒｂａｘ樹脂への非特異的なバックグラウンド結合について補正された。平衡解離定数（Ｋｄ）は既述の通り測定された(Jellinek et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci.
91:11227)。図５に示される通り、２００ｎＭの濃度の競合ｔＲＮＡがアイソフォーム特異性試験に含まれた。ＰＤＧＦ−ＢＢ／ＳＯＭＡｍｅｒとＥ１００３０の相互作用への塩依存を測定するために、結合親和性試験が４０ｍＭＨｅｐｅｓｐＨ７．５、０．０１％ＴＷＥＥＮ−２０および、１００ｍＭ、２５０ｍＭ、５００ｍＭ、７５０ｍＭまたは１．０Ｍのいずれかの濃度のＮａＣｌの存在下で、前述の通り行われ分析された。塩濃度対解離定数のｌｏｇ−ｌｏｇ プロットは単純な線形回帰を用いてあてはめられた。Manning, G.S. (1969) J. Chem. Phys. 51:924でカウンターイオン凝縮理論に説明されている通り、
プロットの傾きはタンパク質結合の際ＤＮＡから遊離したカウンターイオンの数を表す。従来のアプタマーでみられた効果(Ahmad, K.M. et al. (2011) PLoS One 6:e27051; Tang, Q. et al. (2007) J. Colloid. Interface Sci. 315: 99)と対照的に、アプタマー４１４９−８＿２６０（配列番号２１１）のＰＤＧＦに対する親和性は広範囲の塩濃度（０．１から１．０ＭＮａＣｌ）またはｐＨ値（５．０から８．８）にわたりほとんど変化を示さなかった。
実施例４ ＰＤＧＦ−ＢＢ細胞リン酸化試験
ＰＤＧＦ−ＢＢ活性：ＰＤＧＦ−ＢＢＳＯＭＡｍｅｒのＰＤＧＦＲβ活性阻害能力を試験するため、Ｈｓ２７ヒト包皮線維芽細胞（アメリカンタイプカルチャーコレクション(American Type Culture Collection)）は９６ウェルプレートに５０００細胞／ウェルで播種され、２４時間血清飢餓培養された。ＳＯＭＡｍｅｒ（図に示された通りの異なる濃度）はＰＤＧＦ−ＢＢ（２０ｎｇ／ｍＬ）（クリエイティブマイオマート(Creative BioMart)）と血清を含まない培地中３０分間３７°Ｃでインキュベートされ、血清飢餓培養されたＨｓ２７に複合体が加えられた。５分間の刺激の後、上清は捨てられ細胞は氷上で５分間溶解緩衝液＃９（アールアンドディーシステムズ(R&D Systems): １％ＮＰ−４０代替
品、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ （ｐＨ８．０）、１３７ｍＭ ＮａＣｌ, １０％グリセロール、
２ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ活性化オルトバナジウム酸ナトリウム、１０μｇ／ｍＬアプロ
チニン、および１０μｇ／ｍＬロイペプチン)に溶解された。リン酸−ＰＤＧＦＲβのイ
ライザ検出はＤｕｏＳｅｔ Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＰＤＧＦ Ｒβ ｋｉｔ（アールアンドディーシステムズ(R&D Systems)）を用いてメーカーの説明に従って行われた。リン酸−Ｐ
ＤＧＦＲβの割合はＯＤ４５０で測定され、刺激物質の対照なしにプレートの吸収とバックグラウンドの信号について補正された。実験は通常２連または３連で行われた。データはＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ３．０でプロットされ線形回帰を用いて一部位競合曲線にあてはめられた。ＳＯＭＡｍｅｒ４１４９−８＿３７９およびアミノリンカーで修飾されたＳＯＭＡｍｅｒ４１４９−８＿３７９のＩＣ50測定の代表的なプロットを図１３に示す。ＩＣ50値はそれぞれ１．６ｎＭおよび１．７ｎＭである。
クローン４１４９−８の変異体の活性スクリーニングとして、Ｈｓ２７線維芽細胞のＰＤＧＦ−ＢＢ誘導ＰＤＧＦＲβリン酸化の阻害率が、ＳＯＭＡｍｅｒ変異体の単一の濃度（通常２０ｎＭ）以外は上述したものと同じ条件で評価された。
実施例５ Ｎａｐ−ｄＵ修飾に基づいた追加のＰＤＧＦリガンド
ＰＤＧＦ−ＢＢに高い親和性で結合する追加のアプタマーを同定するため、我々はＮａｐ−ｄＵ修飾されたヌクレオチドを含むライブラリで別のＳＥＬＥＸ実験を行った。選別は実施例１で前述されたものと実質的に類似したやり方で行われ、Ｎａｐ−ｄＵアプタマークローン５１６９−４を得た。
ＰＤＧＦＮａｐ−ｄＵ ＳＥＬＥＸプールのディープシークエンシング：５１６９−４
＿１アプタマーファミリー内の配列をより完全に評価するため、７回目のラウンドプールが４５４パイロシークエンシング技術を用いてシークエンスされた。プールＤＮＡは４５４プライマーで増幅されＰＣＲ生成物は精製されＳｅｑｕａｌ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ ｐｌａｔｅ （インビトロジェン(Invitrogen)カタログ番号A10510-01)）を用いて標準化された溶出液はそれぞれの増幅産物の大きさと純度を確かめるためゲルに流された。精製されたＰＣＲ生成物は、コロラド州オーロラのコロラド大学ヘルスサイエンスセンター(University of Colorado Health Sciences Center in Aurora, CO)の４５４パイロ
シークエンシング設備で配列決定された。
プールからのシークエンスのデータセットは８２７３の全長の配列を含んでおり（すなわちこれらの配列は両方のプライマーの配列を含む）、そのうち１６２９は独特であった。これらの１６２９の独特の配列は、４−ｍｅｒから３０−ｍｅｒまで全ての有り得るｎ−ｍｅｒを数えることにより統計的に有意なｎ−ｍｅｒパターンを探すのに使われた。それぞれの同定されたｎ−ｍｅｒの数と、同じ構成のプールからのｎ−ｍｅｒとして無作為に予想された数を比較することにより、統計的に有意なパターンが見つかった。この配列セットで２つの主要なパターンが同定され、１１の配列に見つかった保存されている配列モチーフ“ＡＰＧＰＡＰＧＣＡＣＡＰＣＰ”により定義された２つのパターン内で５１６
９−４＿１が整列しているのが見つかった。このモチーフ（同一性＝０．７５）の全ての独特の配列の探索により５１の配列が見つかり、モチーフにより整列された。全ての配列に対して、整列のそれぞれの位置における小部分の同一性は図１４に記載された通り示されたコンセンサス配列を用いて計算された。
配列切断試験：表６に示される通り、アプタマーのヒトＰＤＧＦ−ＢＢへの完全な結合活性を保持するのに必要な最短の長さを定義するため、５０ヌクレオチド５１６９−４クローンの５’および３’末端からの系統的な切断が行われた。これらの切断のＫｄ値が示されている（Ｐ＝ナフチルデオキシウリジン（Ｎａｐ−ｄＵ）；Ａ、Ｃ、ＧおよびＴはデオキシリボヌクレオチド）。５１６９−４クローンは切断にかなり適していることを証明し５０−ｍｅｒと比べて向上した結合親和性でＰＤＧＦ−ＢＢに結合する２１−ヌクレオチド配列（それぞれ１７ｐＭと２９ｐＭ)が同定された（５１６９−４＿２６）。５１６
９−４＿２６２１−ｍｅｒは５Ｎａｐ−ｄＵ修飾されたヌクレオチドを含んでいたのに対し５０―ｍｅｒは９Ｎａｐ−ｄＵ修飾されたヌクレオチドを含んでいた。
５１６９−４＿２６（２１−ｍｅｒ）におけるＣ３スペーサー単一置換
Ｎａｐ−ｄＵ ＰＤＧＦ−ＢＢアプタマーのＳＥＬＥＸ後の修飾最初のラウンドは、２１−ｍｅｒ５１６９−４＿２６中全ての位置にＣ３スペーサー歩行(walk)を含んでいた。Ｃ３スペーサー歩行は、潜在的に一斉に除くことができＣ３スペーサーやヘキサエチレングリコール（Ｈｅｇ）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のようなリンカーに置換される、高い親和性結合に必要でない塩基を同定することを意図されている。Ｃ３スペーサー置換の結果は表７に示されている。この表中、“Ｐ”はＮａｐ−ｄＵ、“Ｃ３”はＣ３スペーサー、Ａ，ＣおよびＧはデオキシリボヌクレオチド、そして“ＮＢ”は最高１００ｎＭＰＤＧＦ−ＢＢまで結合がないことを表す。３つのサイトが結合親和性のわずかな減少を伴いながらＣ３置換を許容した。Ｃ１，Ｇ６およびＣ７である（番号付けは下記に示す通り２１−ｍｅｒを参照している）。１つの位置、Ｃ１５は５１６９−４＿２６と比較して結合親和性に影響なくＣ３スペーサー置換を許容した。
５１６９−４＿２６（２１−ｍｅｒ）中の２’−Ｏ−メチル単一置換。このヌクレアーゼ−抵抗性置換を許容できる位置を同定するため、全ての天然塩基において２’−Ｏ−メチル置換がなされた。我々の研究所で合成された２’Ｏ−メチルＮａｐホスホラミダイト（Ｎａｐ−ｍＵ）を用いて、我々はＮａｐ−ｍＵ単一置換を許容するであろうＮａｐ−ｄＵの位置も評価した。加えて、それぞれのＮａｐ−ｄＵの重要性を評価するためデオキシチミジン（Ｔ）がＮａｐ−ｄＵに置換された。結合親和性の結果は表８に示され、全ての位置は異なる程度で２’−Ｏ−メチル置換を許容したことを実証する。結合親和性が最高２倍まで減少した５１６９−４＿２６に比べ、それぞれのデオキシシチジン位置（Ｃ）における２’−Ｏ−メチル置換の影響は結合親和性に変化をもたらさなかった。４つのデオキシグアノシン位置（Ｃ）は２’−Ｏ−メチルで置換されたとき、５１６９−４＿２６と比較して、Ｇ１４における２．５倍の親和性の増加からＧ１０における５．５倍の親和性の減少まで異なる結果を示した。６つのデオキシアデノシン位置（Ａ）における２’−Ｏ−メチル置換はゼロから５０倍よりも大きい結合親和性への有害作用を示した。最も２’−Ｏ−メチル置換に感受性が高かったのはアプタマーの５’末端に向かうデオキシアデノシン（Ａ３，Ａ５およびＡ８）の３つであった。位置１１におけるＮａｐ−ｍＵ置換が５１６９−４＿２６と比較して２．５倍の結合親和性の減少を示した一方、位置２１のＮａｐ−ｄＵだけが結合親和性に影響することなくＮａｐ−ｍＵ置換を完全に許容した。残りのＮａｐ−ｍＵ置換は１５から３０倍の結合親和性の減少をもたらした。完全に結合を除去した（ＰＤＧＦ−ＢＢ濃度最高１００ｎＭまでにおいて）唯一の置換は位置１２と２１におけるデオキシチミジン置換で、残りのデオキシチミジン置換は結合親和性に明らかなネガティブ作用（＞４００倍）を示した。表８において、Ｐ＝５ナフタレン修飾されたｄＵ, 上付き文字１は２’−Ｏ−メチル修飾されたヌクレオシドを示す。Ａ、Ｃ、Ｇおよび
Ｔは天然に存在するデオキシリボヌクレオチドを表し“ＮＢ”は最高１００ｎＭＰＤＧＦ−ＢＢまで結合がなかったことを示す。
５１６９−４＿２６（２１−ｍｅｒ）における複数の２’−Ｏ−メチル置換。５１６９−４＿２６における２’−Ｏ−メチル置換の組み合わされた効果は、向上した結合親和性をもついくつかの変異体の同定につながった。この２１−ｍｅｒは２’−Ｏ−メチルでヌクレアーゼ保護され結合親和性が親切断５１６９−４＿２６より少なくとも２０倍大きい（それぞれ０．６０ｐＭ対１７ｐＭ）１１位置を持つ。多くの他の変異体もまた、３から１０の２’−Ｏ−メチルにより明らかな結合親和性の向上（およそ３倍）を示す。表９中、Ｐ＝５−ナフタレン修飾されたｄＵ，上付き文字１は２’−Ｏ−メチル修飾されたヌクレオシドを示し、Ａ，Ｃ，ＧおよびＴは天然に存在するデオキシリボヌクレオチドを表し“ＮＢ”は最高３．２ｎＭＰＤＧＦ−ＢＢまで結合がなかったことを示す。
実施例６ ＰＤＧＦＮａｐ−ｄＵアプタマー活性試験
ＰＤＧＦＮａｐ−ｄＵアプタマーのＰＤＧＦＲβ活性化に対する阻害的影響を分析するため、細胞リン酸化阻害試験が実施例４に述べられた通り行われた。テストされた４つのアプタマー配列はＰＤＧＦＲβ活性化を阻害した。ＩＣ５０値は次の通り：５１６９−４＿２６，ＩＣ５０＝１．６ｎＭ；５１６９−４＿８４，ＩＣ５０＝３．３ｎＭ；５１６９−４＿８５，ＩＣ５０＝７．３ｎＭ；５１６９−４＿１１２，ＩＣ５０＝１．０ｎＭ。
実施例７ ＶＥＧＦアプタマーの選択と配列
候補混合物の調製：部分的にランダム化されたｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドの候補混合物は、ビオチン標識されたｓｓＤＮＡテンプレートにアニールされたＤＮＡプライマーのポリメラーゼ伸長により調製された。
ＶＥＧＦＳＥＬＥＸ条件：組換えヒトＶＥＧＦ−１２１タンパク質に対するアプタマー（どちらもアールアンドディーシステムズ(R&D Systems)）はソマロジック社(SomaLogic Inc)により既述の通り(Gold et al. (2010) PloS One 5:e15004)、Ｎａｐ−ｄＵがｄＴに置換された４０ヌクレオチドランダム領域を含むライブラリから選択された。ＶＥＧＦ−１２１について、順方向プライマーは５’−ＧＣＣＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＴＣ−３’、逆方向プライマーは５’−ＧＡＧＧＡＣＡＣＡＧＡＣＡＧＡＣＡＣ−３’であった。ＶＥＧＦ−１２１タンパク質はビオチン標識されストレプトアビジンＭｙＯｎｅ−ＳＡ（Ｄｙｎａｌ）ビーズ上に分割された。遅い解離速度を持つアプタマーの優先的選択は動力学的検証を用いて達成された。タンパク質−ＤＮＡ複合体が１０ｍＭデキストラン硫酸の存在下３７°Ｃで、連続的なラウンドでインキュベーション時間を増加させタンパク質濃度を減少させてインキュベートされた。ＶＥＧＦ−１２１ ＳＥＬＥＸ中、ラウンド４および
５は１５分間の動力学的検証を含み、ラウンド６および７（最終ラウンド）は３０分間の動力学的検証を含んだ。
最も小さな血管内皮成長因子の選択的にスプライシングされた型であるＶＥＧＦ−１２１はＳＥＬＥＸにとって難しいタンパク質標的である。天然に存在するＤＮＡまたはＲＮＡのライブラリを用いて、または２’位置で修飾された核酸ライブラリを用いて、我々は以前わずかな程度の親和性の向上すら得ることができなかった。これは２つの理由から注目すべきである。最初に、シスチンノットスーパーファミリーのメンバーの中でＶＥＧＦ−１２１は１２４Ｃα原子に対し平均二乗偏差１．９Å (Muller et al., 1997)という最も高いＰＤＧＦ−ＢＢとの構造的類似性を持つ。二番目に、より大きく最も蔓延しているＶＥＧＦアイソフォームであるＶＥＧＦ−１６５はＳＥＬＥＸの良い標的であることを証明した。例えば、今までで規制認可を受けた唯一のアプタマーに基づく治療薬（黄斑変性症の治療）であるｐｅｇａｐｔａｎｉｂ （Ｍａｃｕｇｅｎ）は、ＶＥＧＦ−１２１(Lee et al., 2005; Ruckman et al., 1998)にはない、ヘパリンに結合しているエキソン７が
エンコードする領域を通してＶＥＧＦ−１６５にのみ結合する。ＶＥＧＦ−１２１，ＶＥＧＦ−１６５およびＰＤＧＦ−ＢＢの１つの違いは全体の電荷でありｐＩ値はそれぞれ５．８，８．５および１０．１である。これはアプタマー結合における極性相互作用の重要性を指摘する。成功したＶＥＧＦ−１２１の親和性の強化は最終的にＳＥＬＥＸＮａｐ−ｄＵライブラリで達成された。
ＶＥＧＦ−１２１Ｎａｐ−ｄＵアプタマー配列：単一の位置が異なる２つの関連した高親和性変異体（４８６７−１５および４８６７−３１）が上述の通り行われたＮａｐ−ｄＵＳＥＬＥＸ実験から同定された。クローン４８６７−３１は一連の欠失実験で２９−ｍｅｒに切断された（表７）。単一のヌクレオチドの違いは最小配列の５’境界の外側であるため、両方の高親和性クローン（４８６７−１５および４８６７−３１）の切断は結果として同じ２９−ｍｅｒになったことは注目に値する。高い親和性結合でより短い配列を囲む、切断された変異体２９−ｍｅｒ４８６７−３１＿１４３（５’−ＣＣＧＰＰＣＡＡＧＰＧＣＰＰＧＰＡＧＧＡＰＰＰＡＡＡＰＧＧ−３’；“Ｐ”はＮａｐ−ｄＵを一文字で表す記号）およびそれに近い変異体は、０．１−１ｎＭ（表１０）の範囲の同程度の親和性で、ヒトＶＥＧＦ−１２１、ヒトＶＥＧＦ−１６５、マウスＶＥＧＦ−１２０およびラットＶＥＧＦ−１６４と結合する。この表中、“Ｐ”はＮａｐ−ｄＵを示し、Ａ，ＣおよびＧは天然に存在するデオキシリボヌクレオチドを表し“ＮＢ”は最高１００ｎＭＶＥＧＦまで結合がなかったことを示す。
４８６７−１５＿２（５０−ｍｅｒ）におけるＣ３スペーサー単一置換。ＶＥＧＦ−１２１アプタマーのＳＥＬＥＸ後の修飾の最初のラウンドは５０ｍｅｒ４８６７−１５＿２（切断された５０ｍｅｒ）の全ての位置でのＣ３スペーサー歩行であった。Ｃ３スペーサー歩行は潜在的に一斉に除くことができＣ３スペーサーやヘキサエチレングリコール（Ｈｅｇ）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような他のリンカーに置換される、高い親和性結合に必要でない塩基を同定することを意図されている。Ｃ３スペーサー置換の結果は表１１に示されている。この表中、“Ｐ”はＮａｐ−ｄＵを示し、“Ｖ”はＣ３スペーサーを示し、Ａ，ＣおよびＧは天然に存在するデオキシリボヌクレオチドを表し“ＮＢ”は最高１００ｎＭＶＥＧＦまで結合がなかったことを示す。少なくとも３つの内部部位がＣ３置換を許容した。Ｃ１７，Ｇ２６およびＧ２９である（下記に示す通り番号付けは５０−ｍｅｒを参照）。
４８６７−３１＿４３（３２−ｍｅｒ）における２’−Ｏ−メチル単一置換。ヌクレオチド耐性置換を許容する位置を同定するため、天然の塩基に２’−Ｏ−メチル置換がなされた。さらに、それぞれのＮａｐ−ｄＵの重要性を評価するため２’−ＯＭｅ−ウリジン（ＯＭｅＵ）がＮａｐ−ｄＵに置換された。さらに、Ｃ３スペーサーが、現在３２ｍｅｒのコンテキスト(context)中で、押し出された塩基であると仮定された内部の位置でテス
トされた。内部欠失および替わりの塩基も３つのそれぞれの位置でテストされた。選ばれたＳＯＭＡｍｅｒ（単一濃度２０ｎＭ）の結合親和性および細胞培養阻害データは以下に示されている。結果は表１２に示され、Ｃ８（表１１中のＣ１７）はより短い切断のコンテキスト中でＣ３への置換を完全には許容しなかったことを表す。このコンテキスト中、他の２つの推定上の押し出された塩基（Ｇ１７およびＧ２０）は、Ｃ３または替わりの塩基置換の際良好な結合および機能的活性を保持する。これらの位置での内部欠失は許容されなかった。この実験において２’ＯＭｅ−Ｕ置換され得るＮａｐ−ｄＵ修飾はなかった。しかしいくつかの内部部位が２’ＯＭｅ修飾を許容した。表１２中、Ｐ＝５−ナフタレン修飾されたｄＵ，上付き文字１は２’−Ｏ−メチル修飾されたヌクレオシド、Ｖ３＝炭素スペーサー，および空の四角はヌクレオシドの欠失を示す。Ａ，Ｃ，ＧおよびＴは天然に存在するデオキシリボヌクレオチドを表す。
４８６７−３１＿１４３（２９−ｍｅｒ）の２’−Ｏ−メチルＮａｐ−ｄＵ置換と複数
の２’−Ｏ−メチル置換。我々の研究所で合成された２’−Ｏ−メチルＮａｐホスホラミダイト（Ｎａｐ−ｍＵ）を用いて、我々はＮａｐ−ｍＵ単一置換を許容するであろうＮａｐ−ｄＵ位置を評価した。さらに、天然塩基のそれぞれにおいて２’ＯＭｅとＣ３リンカー置換の組み合わせをテストした。選択されたＳＯＭＡｍｅｒ（単一濃度２０ｎＭ）の結合親和性と細胞培養阻害データを以下に示す。Ｎａｐ−ｄＵ残基のほとんどはＯＭｅ置換を許容しなかったが、位置２２でのＮａｐ−ｍＵのＮａｐ−ｄＵ残基への置換は１０倍親和性と阻害活性が素晴らしく向上した。この表中上付き文字１は２’−Ｏ−メチル置換、“Ｖ”はＣ３スペーサーを表す。２’−ＯＭｅの組み合わせは親和性に基づいてほとんど良く許容されたが、いくつかの組み合わせでは著しく阻害活性が失われた。
２’−Ｏ−メチルとＣ３置換の組み合わされた効果は、変異体４８６７−３１＿１８８を含むいくつかの結合親和性が向上した変異体の同定につながった。この２９−ｍｅｒは２’ＯＭｅまたはＣ３でヌクレアーゼ保護され結合親和性は親切断４８６７−３１＿１４３よりも３倍高い（それぞれ３８ｐＭ対１４０ｐＭ）１０位置を持つ。変異体４８６７−３１＿１８８は親ＳＯＭＡｍｅｒに匹敵する阻害活性を保持する。表１３参照のこと。
Ｎａｐ−ｍＵを許容した唯一の位置はヌクレオチド２２（４８６７−３１＿１４３切断を親配列として使用）であった。このＮａｐ−ｍＵ置換は次に、最もよい２’ＯＭｅ Ｓ
ＯＭＡｍｅｒの組み合わせである４８６７−３１＿１８８のバックグランドに入れられた。さらに、Ｃ３スペーサーを持つ位置１５におけるもともとのｄＧの置換はその位置で２’ＯＭｅ置換と比較された。ヌクレアーゼ保護された塩基が分子に強剛性を与え、それにより結合が強くなる可能性を検証するためである。最も良い凝集結果は４８６７−３１＿１９２で得られた。２９−ｍｅｒに切断された親変異体４８６７−３１＿１４３と比較して、４８６７−３１＿１９２は９つの保護された位置を持つ（下記表１４参照、上付き文字１は２’−Ｏ−メチル置換、“Ｖ”はＣ３スペーサーを表す）。
修飾されたヌクレオチド構造と活性の関係および親和性成熟：結合に対する１０のナフチル側鎖それぞれの寄与を調べるため、我々は、特別に作成した修飾されたｄUホスホラ
ミダイトのライブラリとともに化学的に合成した５−位置変異体により他の一連の系統的なポイント置換を行った。この目的のため、我々は大きさ、極性、水素結合ドナーおよびアクセプターの配置、リンカーの長さ、および５−位置置換を変化させることによりそれぞれの位置の微小環境を実証するライブラリをデザインした。この分析のための官能基を選択するうえで我々は、もともとの修飾（この場合ナフチル基）、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）において大きな比率を占めるアミノ酸側鎖(Mian, I.S. et al. (1991) J. Mol. Biol. 217:133; Ramaraj, T. et al. (2012) Biochim. Biophys. Acta. 1824:520) （
トリプトファンおよびチロシンのような）、および低分子薬物の“特権を持つ”断片（１７）、というテーマの変異体を含むことを目的とした。図１５はこれらの置換の結果を示す。結果はＫｄ値の比（置換された／置換されていない）として表される。１０のＮａｐ−ｄＵpositionそれぞれテストされた１７の異なる修飾置換のうち、４つの置換（Ｔｒｐ−ｄＵ２７，ＮＥ−ｄＵ１６，ＭＢｎ−ｄＵ１０およびＢＴ−ｄＵ１６）だけが結合親和親和性に殆どまたは全く影響しなかった。すべての他の置換は様々な程度で結合親和性を弱めた。
ＶＥＧＦ ＳＥＬＥＸのディープシークエンシング：４１４９−８＿１アプタマーファミリー中の配列をより完全に評価するため、濃縮されたプールは４５４パイロシークエンシング技術を用いて配列決定された。プールＤＮＡは４５４プライマーで増幅されＰＣＲ生成物は精製されＳｅｑｕａｌ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ ｐｌａｔｅ（インビトロジェン(Invitrogen)カタログ番号A10510-01)）を用いて標準化された。溶出液は増幅産物の大きさと純度を確かめるためにゲル上に流された。精製されたＰＣＲ生成物はコロラド州オーロラのコロラド大学ヘルスサイエンスセンター(University of Colorado Health S
ciences Center in Aurora, CO)の４５４パイロシークエンシング設備でシークエンスさ
れた。
４５４配列はＣＬＵＳＴＡＬ分析により４８６７−３１と配列比較された。プールからのシークエンスのデータセットは１３，１３９の全長の配列を含んでおり（すなわちこれらの配列は両方のプライマー配列を含む）、そのうち２，２３５は独特であった。これら２，２３５の独特の配列は５’−ＣＣＧＰＰ ＣＡＡＧＰ ＧＣＰＰＧ ＰＡＧＧＡ ＰＰＰＡＡ ＡＰＧＧ−３’についてモチーフ検索された。このモチーフを含む８６の配列が見つかった。すべての配列について、４８６７−３１を持つそれぞれの位置における同一性率は図１６に記載されている通り計算された。
実施例８ ＶＥＧＦ結合親和性試験
標的結合親和性の決定のため、ＳＯＭＡｍｅｒはＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ニューイングランドバイオラボ(New England Biolabs)）およびγ−32Ｐ−ＡＴＰ（パーキン
エルマー (Perkin Elmer)）を用いて５’末端標識された。結合試験は、〜０．０３−０
．０５ｎＭの濃度の放射性標識されたＳＯＭＡｍｅｒ（〜２０，０００ｃ．ｐ．ｍ）および１０-7から１０-12Ｍの範囲の濃度の標的タンパク質を１ＸＳＢ１８Ｔ緩衝液 （４０ｍＭＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５；１２０ｍＭＮａＣｌ；５ｍＭＫＣｌ；５ｍＭＭｇＣｌ2およ
び０．０１％ＴＷＥＥＮ−２０）中 ３７°Ｃで３０分間インキュベートすることにより
行われた。結合した複合体はＺｏｒｂａｘ樹脂と混合されＤｕｒａｐｏｒｅフィルタープレートに捕獲された。ＳＯＭＡｍｅｒが結合した画分はＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（ＦＵＪＩ ＦＬＡ−３０００）で定量された。生の結合データは放射性標識されたＳＯＭＡｍｅｒのＺｏｒｂａｘ樹脂への非特異的なバックグラウンド結合について補正された。平衡解離定数（Ｋd）は既述の通り測定された(Jellinek et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 91:11227)。
実施例９ ＶＥＧＦ活性試験
ＶＥＧＦ−Ｒ２（血管内皮成長因子受容体２）の細胞キナーゼ活性に対するＶＥＧＦ１２１ＳＯＭＡｍｅｒの阻害的影響を分析するため、我々は内因的にＶＥＧＦ−Ｒ２を高いレベルで発現するヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）（ロンザ(Lonza)、番号CC-2519)
を用いた。ＨＵＶＥＣ細胞は２％ＦＢＳを含むＥＧＭ−２ ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ(番号CC-3162)、成長因子（ｈＥＧＦ、Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ、ＶＥＧＦ、ＨＦＧＦ−Ｂ、Ｒ３−ＩＧＦ−１）、ヘパリン、アスコルビン酸およびＧＡ−１０００ （ゲンタマイシ
ン、アンフォテリシン−Ｂ）が加えられたＥＧＭ−２（内皮細胞増殖培地）に蒔かれた。ＨＵＶＥＣが７０から８０％のコンフルエンスに達したとき、２４ウェルプレート（１０５細胞／ウェル）に蒔かれ血清を含まない培地中で一晩飢餓培養された。
ＳＯＭＡｍｅｒ（単一濃度２０ｎＭまたは濃度の範囲）が、１％ＢＳＡを含む２０ｎｇ／ｍＬ（１ｎＭ）のＶＥＧＦ−１２１（アールアンドディーシステム(R&D System)番号4464-VS）の培養液に３７°Ｃで３０分間加えられた。細胞はＰＢＳで２回洗浄され、プレ
インキュベートされたＶＥＧＦ−１２１／ＳＯＭＡｍｅｒ複合体で５分間刺激された。処理された細胞は再度ＰＢＳで２回洗浄され、Ｈａｌｔ脱リン酸化酵素阻害剤（サーモサイエンティフィック (Thermo Scientific)番号78428) が添加された氷冷の溶解緩衝液（１
％ＮＰ−４０代替品、２０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）、１３７ｍＭＮａＣｌ、１０％グリセロール、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ活性化オルトバナジウム酸ナトリウム、１０μｇ／
ｍＬ アプロチニンおよび１０μｇ／ｍＬロイペプチン）が加えられた。ヒトホスホ−Ｖ
ＥＧＦＲ２／ＫＤＲキット (R&D, DYC 1766-2)を用いて細胞溶解物のＶＥＧＦ−Ｒ２リン酸化を測定した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏの機能活性実験で、スクリーニング濃度２０ｎMでのクローン４８６
７−３１の様々な切断された変異体は、不死化または初代ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）においてＶＥＧＦ−１２１またはＶＥＧＦ−１６５（１−４ｎＭ）に誘導されるＶＥＧＦＲ２のリン酸化を本質的に完全に阻害する能力がある。
ＶＥＧＦアプタマー４８６７−３１＿４３および４８６７−３１＿１９２のＩＣ50測定の代表的なプロットを図１７に示す。ＩＣ５０の値はそれぞれ２．２ｎＭおよび２．１ｎＭである。
クローン４８６７−３１の変異体の活性スクリーニングのため、我々はＳＯＭＡｍｅｒ変異体の単一濃度（通常２０ｎM）以外は上述したものと同じ条件下で、ＨＵＶＥＣにお
けるＶＥＧＦに誘導されるＶＥＧＦＲ２リン酸化の阻害率を評価した。
実施例１０ ＰＤＧＦおよびＶＥＧＦアプタマーのホモ二量体構築物
ＰＤＧＦ−ＢＢおよびＶＥＧＦはどちらもジスルフィドで連結したホモ二量体であり、チロシンキナーゼ受容体の二量化が受容体の自己リン酸化とシグナル伝達につながってそれらの生物学的作用を発揮する。もし１つよりも多いアプタマーがそのタンパク質標的に結合できると、ＰＤＧＦ−ＢＢアプタマー４１４９−８＿２６０（結晶構造に基づく）の場合のように、このようなアプタマーは多量体構築物において共有結合でき、いわば個々のアプタマーサブユニットのタンパク質への同時結合を可能にする。これは結合活性作用を通して親和性の向上につながる。容易に利用できる化学に基づいて２つの型のホモ二量体が合成された。これらは１）ゼロから６のＨｅｇリンカーで結合しＨｅｇあたり〜２０Åの距離を提供する頭−尾ホモ二量体、および２）合成のダブラーサポートを介して結合し、それぞれの側で１つから３つのＨｅｇと組み合わされた（二量体中の総数２、４または６つのＨｅｇ）３’−３’ホモ二量体、である。４１４９−８＿３７９、５１６９−４＿２６および４８６７−３１＿１９２のホモ二量体は競合結合試験でテストされた。競合物の結合親性測定のため、アプタマーリガンドはＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ニューイングランドバイオラボ(New England Biolabs)）およびγ−３２Ｐ−ＡＴＰ （パーキンエルマー(Perkin Elmer)）で５’末端標識された。競合試験は固定した濃度の放射性標識されたリガンド（１．０ｎＭ）と変動させた濃度の競合アプタマー（１０−１１から１０−６Ｍ）を前もって混合することで行われた。リガンドと競合物は標的タンパク質（１００ｐＭ）と１ＸＳＢ１８Ｔ緩衝液（４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５；１２０ｍＭＮａＣｌ；５ｍＭＫＣｌ；５ｍＭＭｇＣｌ2および０．０１％ＴＷＥＥＮ−２０）中で３７°
Ｃ６０分間インキュベートされた。結合した複合体はＺｏｒｂａｘ樹脂と混合されＤｕｒａｐｏｒｅフィルタープレートに捕獲された。リガンド結合した画分はＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（ＦＵＪＩ ＦＬＡ−３０００）で定量された。生の結合データは競合物の添加なしの結合に標準化された。競合アプタマー（Ｋi）の平衡解離定数を決定するため
、データはＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ３．０でプロットされ非線形回帰を用いて一部位競合曲線にあてはめられた。ＰＤＧＦホモ二量体：配列４１４９−８＿３７９ （配
列４１４９−８＿４３８から４１４９−８＿４４７）および５１６９−４＿２６（配列５１６９−４＿１３４から５１６９−４＿１４３）のＰＤＧＦホモ二量体の構造を表１５に示す。４１４９−８＿３７９に基づいたホモ二量体について、競合試験で得られたＫi値
は、Ｈｅｇリンカーなしと比較して、５つのＨｅｇリンカーで結合親和性が１０倍よりも高く向上する（それぞれ０．２５ｐＭ対４．２ｐＭ）ため、５’から３’の立体配置においてより長いリンカーが望ましいことを示唆した。３’から３’結合した４１４９−８＿３７９ホモ二量体において、より長い４つおよび６つのＨｅｇリンカーもまた、リンカーなしより少なくとも１０倍良く、２つのＨｅｇリンカーより２倍良く機能した。５１６９−４＿２６に基づいたホモ二量体では、ＫiがＨｅｇリンカーなしの２８ｐＭから６つの
Ｈｅｇリンカーの３．６ｐＭに向上したため、Ｋi値はより長いＨｅｇリンカーは５’か
ら３’立体配置において有利であることを示した。５’から３’立体配置において５つおよび６つのＨｅｇリンカーについてＫi値に違いがなかった。３’から３’結合した５１
６９−４＿２６に基づいたホモ二量体において、Ｈｅｇリンカーが長くなるに従ってＫi
が向上するという同じパターンが観察された。６つのＨｅｇリンカーはＨｅｇリンカーなしと比べて５倍のＫiの向上を示した（それぞれ２．０ｐＭ対１１ｐＭ）。表１５および
１６中で、Ｚ＝ベンジル−デオキシウリジン（Ｂｎ−ｄＵ），Ｐ＝５−ナフタレン修飾されたｄＵ（Ｎａｐ−ｄＵ）、Ｍ＝メチレンジオキシベンジル−ｄＵ（ＭＢｎ−ｄＵ）、上付き文字１は２’−Ｏ−メチル修飾されたヌクレオシドを表し、上付き文字なしはデオキシリボヌクレオチドを表し、“Ｃ３”は３炭素リンカーを表し、“Ｈ”はヘキサエチレングリコールリンカーを表す。
実施例１１ ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦヘテロ二量体アプタマー構築物
ＰＤＧＦアプタマー４１４９−８およびＶＥＧＦアプタマー４８６７−３１に基づいたヘテロ二量体。ＰＤＧＦおよびＶＥＧＦに対する特異性をもつ構築物を開発するという目的で、我々はＰＤＧＦアプタマーに結合したＶＥＧＦアプタマーを含む様々なアプタマー構築物をデザインし試験した。最初のアプタマー構築物は組み合わされたＰＤＧＦ変異体４１４９−８＿２７３およびＶＥＧＦ４８６７−３１＿１８３をテストした。アプタマー構築物は頭−尾合成され、ゼロから３のヘキサエチレングリコール（Ｈｅｇ）リンカーで両方の配向（５’末端にＰＤＧＦアプタマーもしくは５’末端にＶＥＧＦアプタマー）で結合された。結果を下記表１７と１８に示す。表１７中“Ｚ”はＢｎ−ｄＵを表し、“Ｐ”はＮａｐ−ｄＵを表し、上付き文字s“１”は２’−Ｏ−メチル置換を表し、上付き文
字なしはデオキシリボヌクレオチドを示し、“Ｖ”はＣ３スペーサーを表し、“Ｈ”はヘキサエチレングリコール（Ｈｅｇ）を表す。表１８中、残存活性率は２０ｎＭアプタマー存在下コントロール（アプタマーなし）と比較したＨｓ２７線維芽細胞における分画のＰＤＧＦβＲリン酸化レベルを表す。
ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＶＥＧＦ−１２１およびＶＥＧＦ−１６５に対する結合親和性に基づいて、アプタマー構築物４１４９−８＿３２０がこの実験において最も良い結果を与えた。表１８に示す通り、我々はＰＤＧＦ細胞リン酸化試験でもアプタマー構築物をテストした。機能的試験データに基づいて、テストされた全てのアプタマー構築物はＨｓ２７線維芽細胞におけるＰＤＧＦ−ＢＢが誘導するＰＤＧＦβＲリン酸化を阻害した。アプタマー構築物４１４９−８＿３１３，４１４９−８＿３１４，４１４９−８＿３１５，４１４９−８＿３１６，４１４９−８＿３１９および４１４９−８＿３２０はＰＤＧＦ−ＢＢが誘導するＰＤＧＦβＲリン酸化をＩＣ５０値＜２０ｎＭで阻害した。アプタマー構築物４１４９−８＿３１７および４１４９−８＿３１８のＩＣ５０値は〜２０ｎＭであった。
我々は４１４９−８＿３２０（５’ＰＤＧＦ−３Ｈｅｇ−ＶＥＧＦ３’）の立体配置に基づいて、ＰＤＧＦアプタマー４１４９−８＿３７９およびＶＥＧＦアプタマー４８６７−３１＿１９２を含む４１４９−８＿４０１を合成した。表１９を参照のこと。この表中、“Ｚ”はＢｎ−ｄＵを表し、“Ｐ”はＮａｐ−ｄＵを表し、ＭはＭＢｎ−ｄＵを表し、上付き文字s“１”は２’−Ｏ−メチル置換を表し、上付き文字なしはデオキシリボヌク
レオチドを示し、“Ｃ３”はＣ３スペーサーを表し、“Ｈ”はヘキサエチレングリコール（Ｈｅｇ）を表す。アプタマー構築物４１４９−８＿４０１はプリカーサーアプタマー構築物４１４９−８＿３２０の結合親和性と同等かより良いＰＤＧＦ−ＢＢおよびＶＥＧＦ１２１への結合親和性を示した。表２０を参照のこと。
アプタマー構築物４１４９−８＿３２０および４１４９−８＿４０１は、Ｈｓ２７線維芽細胞におけるＰＤＧＦ−ＢＢが誘導するＰＤＧＦβＲリン酸化をそれぞれＩＣ50値１ｎＭと５ｎＭで阻害した。さらに、２０ｋＤａもしくは４０ｋＤａのＰＥＧに結合した５’アミノリンカーを含むアプタマー構築物４１４９−８＿４０１は、Ｈｓ２７線維芽細胞におけるＰＤＧＦ−ＢＢが誘導するＰＤＧＦβＲリン酸化をＩＣ50値約１ｎＭで阻害する能力を維持した。これらの結果はこの試験の全てのＰＤＧＦ（１ｎＭモノマー）の化学量論的滴定／阻害に一致する。
総合的なリンカーの長さとＰＤＧＦおよびＶＥＧＦアプタマーの配向の影響を決定するため、我々はアプタマー４１４９−８＿３７９および４８６７−３１＿１９２を含む別のアプタマー構築物のセットをテストした。下記表２１を参照のこと。
５’末端のＶＥＧＦで、我々は１つから６つのＨｅｇリンカーをテストした。５’末端のＰＤＧＦで、我々は３つのＨｅｇリンカーを持つ４１４９−８＿４０１を含む２つから６つのＨｅｇリンカーをテストした。１つのＨｅｇリンカー変異体は関連する変異体４１４９−８＿３１８においてやや減少した結合を示したため、この配向ではテストされなかった。結合データを表１６に示す。ＰＤＧＦ−ＢＢに対しやや弱い親和性を示した４１４９−８＿４０８および４１４９−８＿４０９以外、アプタマー構築物のほとんどは良く機能した。ＯｐｈｔｈｏｔｅｃｈアプタマーＥ１００３０（フォビスタ(Fovista)）の結合親
和性が比較のため含まれた。
アプタマー構築物４１４９−８＿４０１がｉｎ ｖｉｔｒｏでＰＤＧＦおよびＶＥＧＦの両方の活性を阻害する能力が、上述の通り受容体リン酸化実験によりテストされた。アプタマー構築物４１４９−８＿４０１はＨｓ２７線維芽細胞におけるＰＤＧＦが誘導するＰＤＧＦβＲリン酸化をＰＤＧＦ単量体４１４９−８＿３７９に匹敵する強さで阻害した（それぞれＩＣ50値２．４ｎＭおよび１．７ｎＭ）。同様に、アプタマー構築物４１４９−８＿４０１はＨＵＶＥＣ細胞におけるＶＥＧＦが誘導するＶＥＧＦＲ２リン酸化をＶＥＧＦ単量体４８６７−３１＿１９２に匹敵する強さで阻害した（それぞれＩＣ５０値０．７ｎＭおよび２．１ｎＭ）。図１８は実験の結果を示す。図１８Ａは（Ａ）ＰＤＧＦアプタマー４１４９−８＿３７９（白丸）およびＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアプタマー構築物４１４９−８＿４０１（黒丸）による、Ｈｓ２７線維芽細胞におけるＰＤＧＦが誘導するＰＤＧＦβＲリン酸化阻害、（Ｂ）ＶＥＧＦアプタマー４８６７−３１＿１９２（白丸）およびＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアプタマー構築物４１４９−８＿４０１（黒丸）による、ＨＵＶＥＣにおけるＶＥＧＦが誘導するＶＥＧＦＲ２リン酸化阻害を示す。
ＰＤＧＦアプタマー５１６９−４およびＶＥＧＦアプタマー４８６７−３１に基づくヘテロ二量体。我々はＰＤＧＦアプタマー５１６９−４＿２６およびＶＥＧＦアプタマー４８６７−３１＿１９２の変異体に基づく更なるヘテロ二量体構築物をデザインしテストした。アプタマー構築物は頭−尾で合成され、ゼロから３のヘキサエチレングリコール（Ｈｅｇ）リンカーで両方の配向（５’末端にＰＤＧＦアプタマーもしくは５’末端にＶＥＧＦアプタマー）で結合された。結果を表２２に示す。５’末端のＶＥＧＦに対し、３つから６つの間のＨｅｇリンカーが最も高い親和性を示した。通常親和性はＶＥＧＦ−１２１アプタマー配列が３’末端にあるときわずかに低く、Ｋd５６ｐＭだった５つのＨｅｇリ
ンカー配列を除いてほとんどのＫd値は１００−３００ｐＭの範囲に入った。５’末端の
ＰＤＧＦに対しては、Ｋd値は３つのＨｅｇリンカーの１１ｐＭから４つのＨｅｇリンカ
ーの０．５４ｐＭの範囲であり、残りのＫd値は他の全てのＨｅｇリンカーの長さの間に
入った。ＰＤＧＦが３’末端にあるとき、リンカーの長さが増すにつれて結合親和性が高くなる傾向があり、１つのＨｅｇリンカーのＫｄが５．３ｐＭで６つのＨｅｇリンカーのＫdが０．２０ｐＭであった。表２２中、“Ｐ”はＮａｐ−ｄＵを表し、上付き文字“１
”は２’−Ｏ−メチル置換を表し、上付き文字なしはデオキシリボヌクレオチドを表し、
“Ｈ”はヘキサエチレングリコール（Ｈｅｇ）を表す。
実施例１２ ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアプタマー構築物のＶＥＧＦおよびＰＤＧＦへの同時結合
ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアプタマー構築物がＶＥＧＦおよびＰＤＧＦに同時に結合する能力を実証するため、サンドイッチ試験が開発された。簡潔にいうと、Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ（登録商標）はヒトＰＤＧＦ−ＢＢもしくはヒトＶＥＧＦ−１２１（20ng/mL）で
コートされた。１％ＢＳＡ溶液でウェルをブロッキングした後、ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアプ
タマー構築物を加え（１０ｎＭ）、吸着されたタンパク質標的と結合させた。洗浄後、ビオチン標識された補体タンパク質（ＶＥＧＦ−１２１でコートされたプレートに２ｎＭのＰＤＧＦ−ＢＢ、およびＰＤＧＦ−ＢＢでコートされたプレートに２ｎＭのＶＥＧＦ−１２１）を三元複合体の形成のため結合させた。もう一度洗浄した後、西洋わさびペルオキシダーゼが結合したストレプトアビジン（ＨＲＰ−ＳＡ）が加えられ、四元複合体が形成された。最終の洗浄の後、発色西洋わさびペルオキシダーゼ基質がメーカーの説明（サーモサイエンティフィックＴＭＢ(Thermo Scientific TMB) ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｋｉｔ ３４０２１）に従って加えられ、反応は適切な時に１．６ＭのＨ2ＳＯ4を加えて停止された。ウェルあたりの４５０ｎｍにおける吸収がＳｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｍ５プレートリーダーを用いてオートチェックオンで測定された。上述の方法と並行して、四元複合体を形成する４つの構成成分のうち１つが除かれている４つのコントロール実験が行われた。
図１９に示す通り、ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアプタマー構築物ＳＬ１０１２（２０ｋＤａＰＥＧ−Ｎ−４１４９−８＿４０１）はヒトＶＥＧＦ−１２１およびＰＤＧＦ−ＢＢに同時に結合することができた。四元複合体のすべての構成成分が加えられたとき（完全）強い信号が観察され、一方４つの構成成分のいずれか１つが存在しないとバックグラウンドまたはバックグラウンドに近い信号になった。ＰＤＧＦおよびＶＥＧＦでコートされたプレートで同様の結果が得られ、アプタマー構築物へのタンパク質添加の順番は重要でないことを示した。図１９に示す通り、ＳＬ１０１２はヒトＶＥＧＦ−１６５およびＰＤＧＦ−ＢＢに同時に結合することができた。図１９Ａは、ビオチン標識されたＰＤＧＦを加えた、ＶＥＧＦでコートされたマイクロタイタープレートを示す。１９Ｂは、ビオチン標識されたＶＥＧＦを加えた、ＰＤＧＦでコートされたマイクロタイタープレートを示す。データは平均＋９５％信頼区間（ｎ＝３）で表される。四元複合体のすべての構成成分が加えられたとき（完全）強い信号が観察され、一方４つの構成成分のいずれか１つが存在しないとバックグラウンドまたはバックグラウンドに近い信号になった。データはアプタマー構築物の５’末端へのＰＥＧ部分の付加は同時結合活性を妨げないことを実証する。
ヒトＶＥＧＦ−１６５およびヒトＰＤＧＦ−ＢＢの（Ａ）ＳＬ１０１２又は及び（Ｂ）ＳＬ１０１３（４０ｋＤＡ ＰＥＧ−Ｎ−４１４９−８−４０１）への同時結合は図２０に示される。マイクロタイタープレートはＰＤＧＦでコートされビオチン標識されたＶＥＧＦが加えられた。完全は四元複合体のすべての構成成分の添加を意味し、４つの構成成分のうち１つがないそれぞれの条件はグラフに示される。データは平均＋９５％信頼区間（ｎ＝３）で表される。
ＰＥＧ部分を含まない様々なアプタマー構築物で同様の実験が行われた。先の結果で複合体の他の要素に関しては信号を生じるのに必要であることが実証されたので、この実験ではアプタマーのないコントロールだけが含まれた。図２１に示すように、アプタマー構築物４１４９−８＿３１７，４１４９−８＿３１８，４１４９−８＿３２０，４１４９−８＿４０１および４１４９−８＿４１４が、タンパク質添加の順番に関わらずＰＤＧＦとＶＥＧＦに同時結合した。図２１（A）はビオチン標識されたＰＤＧＦを加えた、ＶＥＧ
Ｆでコートされたマイクロタイタープレートを示し、図２１（Ｂ）はビオチン標識されたＰＤＧＦを加えた、ＰＤＧＦでコートされたマイクロタイタープレートを示す。ＰＤＧＦアプタマー５１６９−４およびＶＥＧＦアプタマー４８６７−３１の変異体に基づいたヘテロ二量体構築物の同時結合のデータを加えた。
実施例１３ 硝子体内薬物動態試験
アプタマーおよびアプタマー構築物が眼内でどのような振る舞いをするか理解するために最初の眼内薬物動態試験が行われた。表２３に示す通り、４つのアプタマー構築物がテストされた。
アプタマーまたはアプタマー構築物に対して、ニュージーランド白ウサギの両方の眼（１０眼）に単一硝子体内注射が行われた。動物は０．５ｍｇ／眼の投与（ＳＬ１０１０およびＳＬ１０１１）もしくは１．０ｍｇ／眼の投与（ＳＬ１０１２およびＳＬ１０１３）のいずれかを受けた。これらの投与量はアプタマーまたはアプタマー構築物のみの重量を表す（ＰＥＧ重量は計算から除外されている）。すべての試験物はリン酸緩衝生理食塩水中で調製された。それぞれのアプタマーまたはアプタマー構築物の試験物に対し、投与後２、２４、４８、９６または１９２時間で、硝子体液試料が動物１個体の両方の眼から集められた。硝子体液試料は分析されるまで凍結保存された。
アプタマーまたはアプタマー構築物の硝子体液濃度は超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）分析法により２６０ナノメーター（ｎｍ）での吸収による検出で測定された。簡潔に言うと、硝子体のヒドロゲルは２０ゲージの針に数回通すことで剪断された。硝子体のタンパク質は２倍量の２−エトキシエタノールを加えて沈殿させられた。遠心分離後、上清は回収されAcquity（登録商標）Ｃ１８カラム（０．２ｘ１００ｍｍ）に注入され
た。カラム温度は８０°Ｃで流速は０．２ｍＬ／ｍｉｎに保たれた。緩衝液ＡはＴＥＡＡｐＨ７．０および５％アセトニトリルを含む。緩衝液Ｂは１００％アセトニトリルを含む。プログラムはサンプル注入後１分間５０％の緩衝液Ｂを維持し、その後緩衝液Ｂは４分間かけて直線的に７０％まで増やされた。検出は２６０ｎｍにおける吸収で行われた。硝子体液中のアプタマーまたはアプタマー構築物の濃度（遊離酸当量）は未知のサンプル試料のピーク吸収ユニットを既知の濃度のアプタマーまたはアプタマー構築物で作成された検量線に内挿することで決定された。
この実験の結果を表２４に示す。
硝子体濃度対時間の自然対数の通常の線形回帰フィットにより硝子体の半減期が推定された。ＳＬ１０１０、ＳＬ１０１１、ＳＬ１０１２、およびＳＬ１０１３に対してそれぞれ１０５、４７、６９および９２時間であった。表２５は結果を９５％信頼区間とともに示す。
これらの硝子体の半減期は、Ｍａｃｕｇｅｎ (８３時間、Eyetech Study Group (2002)
Retina 22:143)およびＬｕｃｅｎｔｉｓ (７０時間、Gaudreault et al. (2007) Retina
27:1260)のような同様の大きさの治療用ＶＥＧＦ阻害剤の、ＮＺＷウサギでの半減期と
比べて遜色がない。よって、これらのアプタマーおよびアプタマー構築物はＡＭＤおよび糖尿病性網膜症のような眼疾患の治療に役立つ。
出願時の請求の範囲
〔請求項１〕
配列５’−ＮＺＶＳＬ ｎ Ｓ’Ｖ’ＺＡＣＮＮ ｍ ＧＣＧＺＺＺＡＺＡＧＣＧ−３’（配列番号５００）を含むアプタマーであって、
ＶはＡ、ＣまたはＧから選ばれ、
Ｖ’ はＣ、ＧまたはＺから選ばれ、Ｖ’はＶに相補的であり、
ＳおよびＳ’は独立してＣまたはＧから選ばれ、ＳおよびＳ’は互いに相補的であり、
Ｎは独立して、任意の天然に存在するまたは修飾されたヌクレオチドから選ばれ、
Ｚは独立して修飾されたピリミジンから選ばれ、
Ｌは任意の天然に存在するまたは修飾されたヌクレオチド、炭化水素リンカー、ポリエチレングリコールリンカー、またはこれらの組み合わせから選ばれるスペーサーであり、
ｎは０から２０であり、
ｍは０から２０であり、
必要に応じて１つまたは２つ以上のヌクレオチド挿入が含まれても良い、前記アプタマー。
〔請求項２〕
配列５’−ＺＺＶＳＬ ｎ Ｓ’Ｖ’ＺＡＣＮＮ ｍ ＧＣＧＺＺＺＡＺＡＧＣＧ−３’（配列番号５０１）を含み、
ＶはＡ、ＣまたはＧから選ばれ、
Ｖ’ はＣ、ＧまたはＺから選ばれ、Ｖ’はＶに相補的であり、
ＳおよびＳ’は独立してＣまたはＧから選ばれ、ＳおよびＳ’は互いに相補的であり、
Ｎは独立して、任意の天然に存在するまたは修飾されたヌクレオチドから選ばれ、
Ｚは独立して修飾されたピリミジンから選ばれ、
Ｌは任意の天然に存在するまたは修飾されたヌクレオチド、炭化水素リンカー、ポリエチレングリコールリンカー、またはこれらの組み合わせから選ばれるスペーサーであり、
ｎは０から２０であり、
ｍは０から２０であり、
必要に応じて１つまたは２つ以上のヌクレオチド挿入が含まれても良い、
請求項１に記載のアプタマー。
〔請求項３〕
配列５’−ＺＺＶＣＬ ｎ ＧＶ’ＺＡＣＮＭＧＣＧＺＺＺＡＺＡＧＣＧ−３’（配列番号５０２）を含み、
ＶはＡ、ＣまたはＧから選ばれ、
Ｖ’ はＣ、ＧまたはＺから選ばれ、Ｖ’はＶに相補的であり、
Ｎは独立して、任意の天然に存在するまたは修飾されたヌクレオチドから選ばれ、
ＭはＣまたはＡから選択され、
Ｚは独立して修飾されたピリミジンから選ばれ、
Ｌは置換されたまたは未置換のＣ ２ −Ｃ ２０ リンカーと修飾されたまたは未修飾のヌクレオチド、任意の天然に存在するまたは修飾されたヌクレオチド、炭化水素リンカー、ポリエチレングリコールリンカー、またはこれらの組み合わせから選ばれるスペーサーであり、
ｎは０から２０であり、
必要に応じて１つまたは２つ以上のヌクレオチド挿入が含まれても良い、
請求項１に記載のアプタマー。
〔請求項４〕
配列５’−ＺＺＡＣＬ ｎ ＧＺＺＡＣＡＣＧＣＧＺＺＺＡＺＡＧＣＧ−３’（配列番号５０３）を含み、
Ｚは独立して修飾されたピリミジンから選ばれ、
Ｌは任意の天然に存在するまたは修飾されたヌクレオチド、炭化水素リンカー、ポリエチレングリコールリンカー、またはこれらの組み合わせから選ばれるスペーサーであり、
ｎは０から２０であり、
必要に応じて１つまたは２つ以上のヌクレオチド挿入が含まれても良い、
請求項３に記載のアプタマー。
〔請求項５〕
配列５’−ＺＺＡＣＧＡＣＺＡＣＧＺＺＡＣＡＣＧＣＧＺＺＺＡＺＡＧＣＧ−３’（配列番号５０４）を含み、
Ｚは独立して修飾されたピリミジンから選ばれ、
必要に応じて１つまたは２つ以上のヌクレオチド挿入が含まれても良い、
請求項４に記載のアプタマー。
〔請求項６〕
ＰＤＧＦに特異的に結合するアプタマーであって、疎水性核酸塩基修飾を含む少なくとも１つの修飾されたヌクレオシドを含み、１０ｎＭよりも小さい親和性でＰＤＧＦと結合し、ＰＤＧＦへの結合についてＰＤＧＦアプタマー４１４９−８＿２６０（配列番号２１１）と競合する、前記アプタマー。
〔請求項７〕
疎水性核酸塩基修飾は修飾されたピリミジンである、請求項６に記載のアプタマー。
〔請求項８〕
アプタマーは少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つの、または少なくとも６つの修飾されたピリミジンを含む、請求項７に記載のアプタマー
。
〔請求項９〕
それぞれの修飾されたピリミジンは独立して５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−フェネチルカルボキシアミド−２’−デオキシウリジン（ＰｅｄＵ）、５−（Ｎ−チオフェニルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｈｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジンクロライド、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、および５−（Ｎ−［１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン）から選ばれる、
請求項７または８に記載のアプタマー。
〔請求項１０〕
配列５’−ＺＡＢＬｐＧＹＺＡＢＫｑＧＣＧＺＺＹＤＹＡＧ−３’（配列番号５０５）を含み、
それぞれのＺは、独立して、修飾されたピリミジンであり、
それぞれのＢは独立してＣおよび、置換されたまたは未置換のＣ ２ −Ｃ １０ リンカーから選ばれ、
それぞれのＬは独立して置換されたまたは未置換のＣ ２ −Ｃ １０ リンカー、ポリエチレングリコールリンカー、および、修飾されたまたは未修飾のヌクレオチドから選ばれ、ｐは１から１０であり、
それぞれのＹは独立して修飾されたまたは未修飾のピリミジンから選ばれ、
それぞれのＫは独立して置換されたまたは未置換のＣ ２ −Ｃ １０ リンカー、ポリエチレングリコールリンカー、および、修飾されたまたは未修飾のヌクレオチドから選ばれ、ｑは１から５であり、
ＤはＡおよび、置換されたまたは未置換のＣ ２ −Ｃ １０ リンカーから選ばれる、
請求項６から９のいずれか一項に記載のアプタマー。
〔請求項１１〕
配列５’−ＸＺＡＢＬｐＧＹＺＡＢＫｑＧＣＧＺＺＹＤＹＡＧＢＥ−３’（配列番号５０６）を含み、
Ｘは修飾されたまたは未修飾のピリミジン、および、置換されたまたは未置換のＣ ２ −Ｃ １０ リンカーから選ばれるか不在であり、
ＥはＧおよび置換されたまたは未置換のＣ ２ −Ｃ １０ リンカーから選ばれるか不在である、
請求項１０に記載のアプタマー。
〔請求項１２〕
それぞれの修飾されたピリミジンは独立して５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−フェネチルカルボキシアミド−２’−デオキシウリジン（ＰｅｄＵ）、５−（Ｎ−チオフェニルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｈｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−イソブチ
ルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジンクロライド、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、および５−（Ｎ−［１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン）から選ばれる、
請求項１０または請求項１１に記載のアプタマー。
〔請求項１３〕
それぞれの置換されたまたは未置換のＣ ２ −Ｃ １０ リンカーは、置換されたまたは未置換のＣ ２ −Ｃ ８ リンカー、置換されたまたは未置換のＣ ２ −Ｃ ６ リンカー、置換されたまたは未置換のＣ ２ −Ｃ ５ リンカー、置換されたまたは未置換のＣ ２ −Ｃ ４ リンカー、または、置換されたまたは未置換のＣ ３ リンカーである、
請求項１０から１２のいずれか一項に記載のアプタマー。
〔請求項１４〕
少なくとも１つのＬはポリエチレングリコールリンカーでありｐは１、２、３、４、５または６である、
請求項１０から１３のいずれか一項に記載のアプタマー。
〔請求項１５〕
少なくとも１つのＬはヘキサエチレングリコールリンカーである、
請求項１０から１４のいずれか一項に記載のアプタマー。
〔請求項１６〕
ｐは１、２または３である、
請求項１４または１５のいずれか一項に記載のアプタマー。
〔請求項１７〕
少なくとも１つのＫはポリエチレングリコールリンカーでありｑは１または２である、請求項１０から１６のいずれか一項に記載のアプタマー。
〔請求項１８〕
少なくとも１つのＫはヘキサエチレングリコールリンカーである、請求項１０から１７のいずれか一項に記載のアプタマー。
〔請求項２０〕〔請求項１９〕
ｑは１である、請求項１０から１８のいずれか一項に記載のアプタマー。 少なくとも１
つのＫは置換されたまたは未置換のＣ ２ −Ｃ １０ リンカーでありｑは１または２である、請求項１０から１８のいずれか一項に記載のアプタマー。
〔請求項２１〕
前記置換されたまたは未置換のＣ ２ −Ｃ １０ リンカーは、置換されたまたは未置換のＣ ２ −Ｃ ８ リンカー、置換されたまたは未置換のＣ ２ −Ｃ ６ リンカー、置換されたまたは未置換のＣ ２ −Ｃ ５ リンカー、置換されたまたは未置換のＣ ２ −Ｃ ４ リンカー、または、置換されたまたは未置換のＣ ３ リンカーである、請求項２０に記載のアプタマー。
〔請求項２２〕
少なくとも１つのＬは置換されたまたは未置換のＣ ２ −Ｃ １０ リンカーでありｐは１、２、３、４、５、６、７または８である、請求項１０から２１のいずれか一項に記載のアプタマー。
〔請求項２３〕
前記置換されたまたは未置換のＣ ２ −Ｃ １０ リンカーは、置換されたまたは未置換のＣ ２ −Ｃ ８ リンカー、置換されたまたは未置換のＣ ２ −Ｃ ６ リンカー、置換されたまたは未置換のＣ ２ −Ｃ ５ リンカー、置換されたまたは未置換のＣ ２ −Ｃ ４ リンカー、または、置換されたまたは未置換のＣ ３ リンカーである、請求項２２に記載のアプタマー。
〔請求項２４〕
ＰＤＧＦに特異的に結合するアプタマーであって、
配列５’−ＡＣＡＬｎＺＧＺＡＺＧＬｍＺＬＺ−３’（配列番号５１２）を含み、
それぞれのＺは、独立して、修飾されたピリミジンであり、
それぞれのＬは独立して置換されたまたは未置換のＣ ２ −Ｃ ５０ リンカー、ポリエチレングリコールリンカー、および、修飾されたまたは未修飾のヌクレオチドから選ばれ、
ｎは１から５であり、
ｍは１から１０である、前記アプタマー。
〔請求項２５〕
それぞれのＺは独立して５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−フェネチルカルボキシアミド−２’−デオキシウリジン（ＰｅｄＵ）、５−（Ｎ−チオフェニルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｈｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジンクロライド、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、および５−（Ｎ−［１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン）から選ばれる、
請求項２４に記載のアプタマー。
〔請求項２６〕
少なくとも１つの、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、またはそれぞれのＺは、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）である、請求項２５に記載のアプタマー。
〔請求項２７〕
ｎは１、２、３、または４であり、
ｍは１、２、３、４、５、６、７、８または９である、
請求項２４から２６のいずれか一項に記載のアプタマー。
〔請求項２８〕
少なくとも１つの、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、または少なくとも５つのヌクレオシドは２’−ＯＭｅを含む、請求項１から２７のいずれか一項に記載のアプタマー。
〔請求項２９〕
少なくとも１つの、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、または少なくとも５つのヌクレオシド間の結合はホスホロチオエート結合である、請求項１から２８のいずれか一項に記載のアプタマー。
〔請求項３０〕
前記アプタマーは１０ｎＭよりも小さい、５ｎＭよりも小さい、２ｎＭよりも小さい、または１ｎＭよりも小さい親和性でＰＤＧＦに結合する、請求項１から２９のいずれか一項に記載のアプタマー。
〔請求項３１〕
前記アプタマーはＰＤＧＦが介在するＰＤＧＦ受容体のリン酸化を阻害する、請求項１から３０のいずれか一項に記載のアプタマー。
〔請求項３２〕
１０ｎＭよりも小さい、５ｎＭよりも小さい、２ｎＭよりも小さい、または１ｎＭよりも小さい親和性でＶＥＧＦ−１２１に結合するアプタマーであって、少なくとも１つの、疎水性核酸塩基修飾を含む修飾されたヌクレオシドを含む、前記アプタマー。
〔請求項３３〕
前記疎水性核酸塩基修飾は修飾されたピリミジンである、請求項３２に記載のアプタマー。
〔請求項３４〕
少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つの、または少なくとも６つの修飾されたピリミジンを含む、請求項３３に記載のアプタマー。
〔請求項３５〕
それぞれの修飾されたピリミジンは独立して５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−フェネチルカルボキシアミド−２’−デオキシウリジン（ＰｅｄＵ）、５−（Ｎ−チオフェニルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｈｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジンクロライド、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、および５−（Ｎ−［１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン）から選ばれる、
請求項３３または請求項３４に記載のアプタマー。
〔請求項３６〕
少なくとも１つの、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つの、または少なくとも６つの修飾されたピリミジンは５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）である、請求項３３から３５のいずれか一項に記載のアプタマー。
〔請求項３７〕
ＶＥＧＦ−１２１への結合についてアプタマー４８６７−３１＿１９２と競合する、請求項３２から３６のいずれか一項に記載のアプタマー。
〔請求項３８〕
配列５’−ＧＺＺＱＡＡＥＺＥＣＺＺＥＺＤＲＧＡＺＺＺＡＡＡＺＧ−３’を含み、
それぞれのＺは修飾されたピリミジンであり、
Ｑは任意の修飾されたまたは未修飾のヌクレオチド、および、置換されたまたは未置換のＣ ２ −Ｃ ５０ リンカーから選ばれるかまたは不在であり、
それぞれのＥは独立してＧおよび置換されたまたは未置換のＣ ２ −Ｃ ５０ リンカーから選ばれ、
ＤはＡおよび置換されたまたは未置換のＣ ２ −Ｃ ５０ リンカーから選ばれ、
Ｒは任意の修飾されたまたは未修飾のヌクレオチド、および、置換されたまたは未置換のＣ ２ −Ｃ ５０ リンカーから選ばれる、
請求項３２から３７のいずれか一項に記載のアプタマー。
〔請求項３９〕
５’−ＣＧＺＺＱＡＡＥＺＥＣＺＺＥＺＤＲＧＡＺＺＺＡＡＡＺＧ−３’、
５’−ＧＺＺＱＡＡＥＺＥＣＺＺＥＺＤＲＧＡＺＺＺＡＡＡＺＧＧ−３’、
５’-ＣＧＺＺＱＡＡＥＺＥＣＺＺＥＺＤＲＧＡＺＺＺＡＡＡＺＧＧ-３’、および
５’−ＣＣＧＺＺＱＡＡＥＺＥＣＺＺＥＺＤＲＧＡＺＺＺＡＡＡＺＧＧ−３’
から選ばれる配列を含む、請求項３７に記載のアプタマー。
〔請求項４０〕
それぞれのＺは独立して５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−フェネチルカルボキシアミド−２’−デオキシウリジン（ＰｅｄＵ）、５−（Ｎ−チオフェニルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｈｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジンクロライド、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、および５−（Ｎ−［１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン）から選ばれる、
請求項３７または請求項３８に記載のアプタマー。
〔請求項４１〕
少なくとも１つの、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つの、少なくとも６つの、少なくとも７つの、または少なくとも８つのＺは５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）である、請求項３７から請求項３９のいずれか一項に記載のアプタマー。
〔請求項４２〕
それぞれの置換されたまたは未置換のＣ ２ −Ｃ ５０ リンカーは独立して、置換されたまたは未置換のＣ ２ −Ｃ ２０ リンカー、置換されたまたは未置換のＣ ２ −Ｃ １０ リンカー、置換されたまたは未置換のＣ ２ −Ｃ ８ リンカー、置換されたまたは未置換のＣ ２ −Ｃ ６ リンカー、置換されたまたは未置換のＣ ２ −Ｃ ５ リンカー、置換されたまたは未置換のＣ ２ −Ｃ ４ リンカー、および、置換されたまたは未置換のＣ ３ リンカーから選ばれる、請求項３７から請求項４０のいずれか一項に記載のアプタマー。
〔請求項４３〕
それぞれの置換されたまたは未置換のＣ ２ −Ｃ ５０ リンカーは、置換されたまたは未置換のＣ ２ −Ｃ １０ リンカーである、請求項４２に記載のアプタマー。
〔請求項４４〕
それぞれの置換されたまたは未置換のＣ ２ −Ｃ １０ リンカーは、置換されたまたは未置換のＣ ２ −Ｃ ８ リンカー、置換されたまたは未置換のＣ ２ −Ｃ ６ リンカー、置換されたまたは未置換のＣ ２ −Ｃ ５ リンカー、置換されたまたは未置換のＣ ２ −Ｃ ４ リンカー、または、置換されたまたは未置換のＣ ３ リンカーである、請求項４３に記載のアプタマー。
〔請求項４５〕
少なくとも１つの、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、または少なくとも５つのヌクレオシドは２’−ＯＭｅを含む、請求項３２から請求項３９のいずれか一項に記載のアプタマー。
〔請求項４６〕
少なくとも１つの、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、または少なくとも５つのヌクレオシド間の結合はホスホロチオエート結合である、請求項３２から請求項４５のいずれか一項に記載のアプタマー。
〔請求項４７〕
前記アプタマーは１０ｎＭよりも小さい、５ｎＭよりも小さい、２ｎＭよりも小さい、ま
たは１ｎＭよりも小さい親和性でＶＥＧＦ−１２１に結合する、請求項３２から請求項４６のいずれか一項に記載のアプタマー。
〔請求項４８〕
前記アプタマーはＶＥＧＦ−１２１が介在するＶＥＧＦ受容体のリン酸化を阻害する、請求項３２から請求項４７のいずれか一項に記載のアプタマー。
〔請求項４９〕
１０ｎＭよりも小さい親和性でＶＥＧＦ−１２１に結合する、表１０から１４のいずれかに示されるアプタマー。
〔請求項５０〕
請求項１から３１のいずれかのアプタマーから選ばれる第一のアプタマーを含むアプタマーと請求項３２から４９のいずれかのアプタマーから選ばれる第二のアプタマーを含む、アプタマー構築物。
〔請求項５１〕
前記第一のアプタマーと第二のアプタマーは非共有的に結合されている、請求項５０に記載のアプタマー構築物。
〔請求項５２〕
前記第一のアプタマーと第二のアプタマーは共有結合されている、請求項５０に記載のアプタマー構築物。
〔請求項５３〕
前記アプタマー構築物はＰＤＧＦおよびＶＥＧＦ−１２１に同時に結合する能力を持つ、請求項５０から５２のいずれか一項に記載のアプタマー構築物。
〔請求項５４〕
前記アプタマー構築物は１０ｎＭより小さい親和性でＰＤＧＦに結合する、請求項５０から５３のいずれか一項に記載のアプタマー構築物。
〔請求項５５〕
前記アプタマー構築物は１０ｎＭより小さい親和性でＶＥＧＦ−１２１に結合する、
請求項５０から５３のいずれか一項に記載のアプタマー構築物。
〔請求項５６〕
第一のアプタマーと第二のアプタマーを含むアプタマー構築物であって、前記第一のアプタマーと第二のアプタマーはそれぞれ独立して請求項１から３１のいずれか一項に記載のアプタマーから選ばれる、前記アプタマー構築物。
〔請求項５７〕
前記第一のアプタマーと第二のアプタマーは同じである、請求項５６に記載のアプタマー構築物。
〔請求項５８〕
前記第一のアプタマーと第二のアプタマーは異なる、請求項５６に記載のアプタマー構築物。
〔請求項５９〕
前記第一のアプタマーと第二のアプタマーは非共有的に結合されている、請求項５６から５８のいずれか一項に記載のアプタマー構築物。
〔請求項６０〕
前記第一のアプタマーと第二のアプタマーは共有結合されている、請求項５６から５８のいずれか一項に記載のアプタマー構築物。
〔請求項６１〕
前記アプタマー構築物は２つのＰＤＧＦ単量体に同時に結合する能力を持つ、請求項５６から６０のいずれか一項に記載のアプタマー構築物。
〔請求項６２〕
前記アプタマー構築物は１０ｎMより小さい親和性でＰＤＧＦに結合する、請求項５６か
ら６１のいずれか一項に記載のアプタマー構築物。
〔請求項６３〕
第一のアプタマーと第二のアプタマーを含むアプタマー構築物であって、前記第一のアプタマーと第二のアプタマーはそれぞれ独立して請求項３２から４９のいずれか一項に記載のアプタマーから選ばれる、前記アプタマー構築物。
〔請求項６４〕
前記第一のアプタマーと第二のアプタマーは同じである、請求項６３に記載のアプタマー構築物。
〔請求項６５〕
前記第一のアプタマーと第二のアプタマーは異なる、請求項６３に記載のアプタマー構築物。
〔請求項６６〕
前記第一のアプタマーと第二のアプタマーは非共有的に結合されている、請求項６３から６５のいずれか一項に記載のアプタマー構築物。
〔請求項６７〕
前記第一のアプタマーと第二のアプタマーは共有結合されている、請求項６３から６５のいずれか一項に記載のアプタマー構築物。
〔請求項６８〕
前記アプタマー構築物は２つのＶＥＧＦ単量体に同時に結合する能力を持つ、請求項６３から６７のいずれか一項に記載のアプタマー構築物。
〔請求項６９〕
前記アプタマー構築物は１０ｎMより小さい親和性でＶＥＧＦに結合する、請求項６３か
ら６８のいずれか一項に記載のアプタマー構築物。
〔請求項７０〕
少なくとも１つの請求項１から４９のいずれか一項に記載のアプタマーおよび薬剤的に許容できる担体を含む医薬組成物。
〔請求項７１〕
請求項１から３１のいずれか一項に記載の第一のアプタマーと、請求項３２から４９のいずれかの第二のアプタマーを含む、請求項７０に記載の医薬組成物。
〔請求項７２〕
請求項４９から６９のいずれか一項に記載のアプタマー構築物および薬剤的に許容できる担体を含む医薬組成物。
〔請求項７３〕
前記医薬組成物は硝子体内注射のためのものである、請求項６９から７２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
〔請求項７４〕
治療有効量の請求項６９から７２のいずれか一項に記載の医薬組成物を、黄斑変性症を患う対象に投与することを含む、黄斑変性症を治療する方法。
〔請求項７５〕
治療有効量の請求項６９から７２のいずれか一項に記載の医薬組成物を、黄斑変性症にかかるリスクがある対象に投与することを含む、黄斑変性症を予防する方法。
〔請求項７６〕
治療有効量の請求項６９から７２のいずれか一項に記載の医薬組成物を、眼疾患を患う対象に投与することを含む、眼疾患を治療する方法。
〔請求項７７〕
前記眼疾患は、網膜炎、黄斑変性症、脈絡膜炎、網膜症、高血圧性網膜症、糖尿病性網膜症、慢性ドライアイ、エイズに関連した視力喪失、弱視、半盲、網膜静脈閉塞症、トラコーマ、円錐角膜、脈絡網膜炎、中心性漿液性網膜症、ぶどう膜炎、網膜ジストロフィー、浮腫、緑内障、および白内障から選ばれる、請求項７６に記載の方法。
〔請求項７８〕
前記黄斑変性症は加齢に関連する黄斑変性症である、請求項７４または請求項７５に記載の方法。
〔請求項７９〕
前記黄斑変性症は乾燥型の加齢に関連する黄斑変性症または滲出性の加齢に関連する黄斑変性症である、請求項７８に記載の方法。
〔請求項８０〕
治療有効量の請求項７０から７２のいずれか一項に記載の医薬組成物を、線維症を患う対象に投与することを含む、線維症を治療する方法。
〔請求項８１〕
前記線維症は肺線維症、腎線維症、および嚢胞性線維症から選ばれる、請求項８０に記載の方法。
〔請求項８２〕
治療有効量の請求項６９から７２のいずれか一項に記載の医薬組成物を、循環器疾患を患う対象に投与することを含む、循環器疾患を治療する方法。
〔請求項８３〕
前記循環器疾患はアテローム性動脈硬化、再狭窄、心肥大に関連する病気、および血管障害から選ばれる、請求項８２に記載の方法。
〔請求項８４〕
治療有効量の請求項６９から７２のいずれか一項に記載の医薬組成物を、ガンを患う対象に投与することを含む、ガンを治療する方法。
〔請求項８５〕
前記ガンは膀胱ガン、肺ガン、乳ガン、メラノーマ、結腸および直腸ガン、リンパ腫、子宮内膜ガン、膵臓ガン、肝臓ガン、腎臓ガン、前立腺ガン、白血病、および甲状腺ガンから選ばれる、請求項８４に記載の方法。
前述の態様および実施例は例示のみを意図する。いかなる特定の態様、実施例、または特定の態様または実施例の要素も、どの請求項の決定的な、必須である、または不可欠の要素または特徴としても解釈されない。添付の請求項により定義される発明の範囲から離れず、開示された態様に様々な代替、修正、置換または他の変動がなされても良い。図および実施例を含む明細書は限定されるものでなく実例様式と見なされ、このような修正または置換は本発明の範囲内であると意図される。従って、本発明の範囲は上に挙げた実施例によってでなく添付の請求項およびそれらの法的な等価物で決定されるべきである。例えば、いずれかの方法または方法の請求項で列挙された段階はいかなる実行可能な順番で実行されても良く、いずれかの態様、実施例、請求項で表された順番に限定されない。
表１ ＰＤＧＦに対して１０ｎMまたはそれより少ないＫｄ値を持つ、４１４９−８＿
１および切断された変異体の配列代表
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 上付き文字なしはデオキシリボースを表す
上付き文字ｏは２’−フルオロを表す。
上付き文字１は２’−Ｏ−メチルを表す。
上付き文字２はホスホロチオエート（デオキシリボース）を表す。
Ｃ３＝３炭素リンカー
Ｈｅｇ＝ヘキサエチレングリコールリンカー
Ｎａｐ＝ナフチル−ｄＵ
Ｐｅ＝フェネチル−ｄＵ
ＢＴ＝ベンゾチオフェニル−ｄＵ
Ｔｈ＝チオフェニル−ｄＵ
Ｉｂ＝イソブチル−ｄＵ
Ｔｒｐ＝トリプタミニル−ｄＵ
２Ｎａｐ＝２−ナフチル−ｄＵ
２ＮＥ＝２−ナフチルエチル−ｄＵ
ＮＥ＝ナフチルエチル−ｄＵ
ＭＢｎ＝メチレンジオキシベンジル−ｄＵ
ＰＰ＝フェンプロピル−ｄＵ
Ｔｙｒ＝チロシル−ｄＵ
ＦＢｎ＝フルオロベンジル−ｄＵ
Ｂｎ＝ベンジル−ｄＵ
３’−ダブラー＝シンメトリックダブラーホスホラミダイト（グレンリサーチ(Glen Research)カタログ番号10-1920-02）
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 上付き文字なしはデオキシリボースを表す
上付き文字ｏは２’−フルオロを表す。
上付き文字１は２’−Ｏ−メチルを表す。
上付き文字２はホスホロチオエート（デオキシリボース）を表す。

Ｃ３＝３炭素リンカー
Ｈｅｇ＝ヘキサエチレングリコールリンカー
Ｎａｐ＝ナフチル−ｄＵ
Ｐｅ＝フェネチル−ｄＵ
ＢＴ＝ベンゾチオフェニル−ｄＵ
Ｔｈ＝チオフェニル−ｄＵ
Ｉｂ＝イソブチル−ｄＵ
Ｔｒｐ＝トリプタミニル−ｄＵ
２Ｎａｐ＝２−ナフチル−ｄＵ
２ＮＥ＝２−ナフチルエチル−ｄＵ
ＮＥ＝ナフチルエチル−ｄＵ
ＭＢｎ＝メチレンジオキシベンジル−ｄＵ
ＰＰ＝フェンプロピル−ｄＵ
Ｔｙｒ＝チロシル−ｄＵ
ＦＢｎ＝フルオロベンジル−ｄＵ
Ｂｎ＝ベンジル−ｄＵ
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 フリーＲファクターはリファインメントから除かれた反射の５％を用いて計算された。（ＣＣＰ４ｓｕｉｔｅ：タンパク質結晶学のためのプログラム，１９９４）.
*リガンドＢファクターはタンパク質単量体の活性部位のリガンドのものである。溶媒（
ＰＥＧ、グリセロールなど）からのリガンドは計算に含まれない。
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Claims (10)

  1. 配列番号５４６〜７０６および７２９〜７３９からなる群から選択される配列を含む、ＶＥＧＦに結合可能なアプタマー。
  2. ＶＥＧＦに結合可能な第一のアプタマーとＶＥＧＦに結合可能な第二のアプタマーを含むアプタマー構築物であって、前記第一のアプタマーと第二のアプタマーは独立して配列番号５４６〜７０６からなる群から選ばれ、前記第一のアプタマーと第二のアプタマーは同じであるかまたは異なる、前記アプタマー構築物。
  3. 前記第一のアプタマーと第二のアプタマーは共有結合されている、請求項２に記載のアプタマー構築物。
  4. ＶＥＧＦに結合可能な第一のアプタマーとＰＤＧＦに結合可能な第二のアプタマーを含むアプタマー構築物であって、前記第一のアプタマーは配列番号５４６〜７０６からなる群から選ばれ、第二のアプタマーは配列番号４１０〜４９９および５１７〜５４５からなる群から選ばれる、前記アプタマー構築物。
  5. 前記第一のアプタマーと第二のアプタマーは共有結合されている、請求項４に記載のアプタマー構築物。
  6. 配列番号７４９〜７６０からなる群から選択される配列を含む、ＰＤＧＦとＶＥＧＦに結合可能なアプタマー。
  7. ＰＤＧＦに結合可能な第一のアプタマーとＶＥＧＦに結合可能な第二のアプタマーを含むアプタマー構築物であって、前記第一のアプタマーは配列番号１〜４０９からなる群から選ばれ、第二のアプタマーは配列番号５４６〜７０６および７４０〜７４８からなる群から選ばれる、前記アプタマー構築物。
  8. 前記第一のアプタマーと第二のアプタマーは共有結合されている、請求項７に記載のアプタマー構築物。
  9. 配列番号７０７〜７２８からなる群から選択される配列を含む、ＰＤＧＦに結合可能なアプタマー。
  10. 黄斑変性症を治療するおよび／または予防するために使用される、治療有効量の請求項１〜９のいずれか１項に記載のアプタマーを含む、医薬。
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