JP6949916B2 - 安定性が向上したpdgf及びvegfアプタマー並びにpdgf及びvegf媒介性の疾患及び障害の治療におけるそれらの使用 - Google Patents
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Description
本出願は、2013年9月9日に出願されたU.S.特許仮出願第61/875,660号に対して優先権を主張するものであり、この出願は、その全体が参照により組み込まれる。
Rev.15(4):197)。PDGFはジスルフィド結合した二量体として存在し、細胞表面上のPDGF受容体α及びβに対する結合を介して機能するシステインノットフォールド増殖因子ドメインを含む(Claesson−Welsh,L.,et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:4917)。PDGFの結合は受容体の二量体化を誘導し、これによって、細胞内のチロシン残基での自己リン酸化が起こる(Claesson−Welsh,J.(1994)Biol.Chem.269:32023)。PDGF−BBは、アテローム性動脈硬化症、線維症、黄斑変性症及び癌を含めた、いくつかの増殖性障害に関与する(Ostman,A.,et
al.(2001)Adv.Cancer Res.80:1;Appelmann,I.,et al.(2010)Recent Results Cancer Res.180:51;Trojanowska,M.,et al.(2008)Rheumatology(Oxford)47(Suppl 5):2;Rutherford et al.(1997)Atherosclerosis 130:45;Smits et al.(1992)Am.J.Pathol.140:639;Heldin et al.(1991)Endocrinology 129:2187;Floege and Johnson(1995)Miner.Electrolyte Metab.21:271;Raines et al.(1990)Experimental Pharmacology,Peptide Growth Factors an
d Their Receptors,Sporn & Roberts,pp.173−262,Springer,Heidelberg)。
al.(2006)Retina 26:859)。
防する、治療する及び/または改善するための治療剤として有用である。様々な実施形態では、アプタマー構築物は、VEGF及びPDGF−Bのそれぞれに独立に、並びに/またはVEGF及びPDGF−Bに同時に結合することができる。PDGFアプタマー、VEGFアプタマーもしくはVEGF/PDGF−Bアプタマー構築物または前述のいずれかの医薬的に許容可能な塩及び少なくとも1つの医薬的に許容可能な担体を含む、医薬組成物または製剤が含まれる。そうした組成物は、任意の適切な医薬的に許容可能な剤形で調製することができる。
たは1nM未満の結合親和性で、PDGFタンパク質に結合する。
ド)−2’−デオキシウリジン(iBudU)、5−(N−イソブチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、5−(N−イソブチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、5−(N−トリプタミノカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(TrpdU)、5−(N−トリプタミノカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、5−(N−トリプタミノカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、5−(N−[1−(3−トリメチルアンモニウム)プロピル]カルボキシアミド)−2’−デオキシウリジンクロリド、5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)、5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン及び5−(N−[1−(2,3−ジヒドロキシプロピル)]カルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン)から成る群から選択される。関連した態様では、C−5修飾ピリミジンは5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)である。
からの最初のヌクレオシドであり、H及びVは核酸分子の位置を数えるための単一の位置とみなされる。関連した態様では、核酸分子の位置3、7、12、13、18、19、21及び24の少なくとも2、3、4、5、6、7または8個は2’−O−メチル修飾を含み、位置1は核酸分子の5’末端からの最初のヌクレオシドであり、H及びVは核酸分子の位置を数えるための単一の位置とみなされる。
apdU)から成る群から選択され;Z2は、独立に、それぞれの出現について、ウリジン、ホスホロチオエート結合を含むウリジン、デオキシウリジン、ホスホロチオエート結合を含むデオキシウリジン、5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)及びホスホロチオエート結合を含む5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)から成る群から選択され;A1は、独立に、それぞれの出現について、アデノシン、デオキシアデノシン及び2’−O−メチルアデノシンから成る群から選択され;A2は、独立に、それぞれの出現について、アデノシン、ホスホロチオエート結合を含むアデノシン、デオキシアデノシン及びホスホロチオエート結合を含むデオキシアデノシンから成る群から選択され;ここでは、核酸分子は、少なくとも1、2、3、4または5個のホスホロチオエート結合を含む。
Z−A2−A2−A2−Z−G1−G1−3’(配列番号834)を含む核酸分子を提供し、ここでは、C1は、独立に、それぞれの出現について、シチジン、デオキシシチジン及び2’−O−メチルシチジンから成る群から選択され;G1は、独立に、それぞれの出現について、グアノシン、デオキシグアノシン及び2’−O−メチルグアノシンから成る群から選択され;G1は、独立に、それぞれの出現について、グアノシン、デオキシグアノシン及び2’−O−メチルグアノシンから成る群から選択され;Zは、独立に、それぞれの出現について、ウリジン、デオキシウリジン及び5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)から成る群から選択され;Z1は、独立に、それぞれの出現について、ウリジン、デオキシウリジン、2’−O−メチルウリジン、5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)及び2’−O−メチル基を含む5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)から成る群から選択され;A1は、独立に、それぞれの出現について、アデノシン、デオキシアデノシン及び2’−O−メチルアデノシンから成る群から選択され;A2は、独立に、それぞれの出現について、アデノシン、ホスホロチオエート結合を含むアデノシン、デオキシアデノシン及びホスホロチオエート結合を含むデオキシアデノシンから成る群から選択され;ここでは、核酸分子は、少なくとも1、2、3、4または5個のホスホロチオエート結合を含む。
た態様では、G1は、2’−O−メチルグアノシンである。関連した態様では、G2は、ホスホロチオエート結合を含むデオキシグアノシンである。関連した態様では、Zは、5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(BndU)である。関連した態様では、Z’2は、ホスホロチオエート結合を含む5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)である。関連した態様では、関連した態様では、Z1は、2’−O−メチル基を含む5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(BndU)である。関連した態様では、Z2は、ホスホロチオエート結合を含む5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(BndU)である。関連した態様では、A1は、2’−O−メチルアデノシンである。関連した態様では、A2は、ホスホロチオエート結合を含むデオキシアデノシンである。
ある試料にVEGFアプタマーを接触させることを含む。いくつかの実施形態では、インビボ診断法は、適切に標識されたVEGFアプタマーをVEGF媒介性の疾患または障害を有する疑いがある個体に投与することを含み、ここでは、標識されたVEGFアプタマーは、個体の健康状態を診断または評価する目的で検出される。使用されるイメージング様式に従って、使用される標識を選択することができる。
Z−A2−A2−A2−Z−G1−G1−3’(配列番号836)を含む核酸分子を提供し、ここでは、C1は、独立に、それぞれの出現について、シチジン、デオキシシチジン及び2’−O−メチルシチジンから成る群から選択され;G1は、独立に、それぞれの出現について、グアノシン、デオキシグアノシン及び2’−O−メチルグアノシンから成る群から選択され;Zは、独立に、それぞれの出現について、ウリジン、デオキシウリジン及び5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)から成る群から選択され;Z1は、独立に、それぞれの出現について、ウリジン、デオキシウリジン、2’−O−メチルウリジン、5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)及び2’−O−メチル基を含む5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)から成る群
から選択され;A1は、独立に、それぞれの出現について、アデノシン、デオキシアデノシン及び2’−O−メチルアデノシンから成る群から選択され;A2は、独立に、それぞれの出現について、アデノシン、ホスホロチオエート結合を含むアデノシン、デオキシアデノシン及びホスホロチオエート結合を含むデオキシアデノシンから成る群から選択され;ここでは、核酸分子は、少なくとも1、2、3、4または5個のホスホロチオエート結合を含む。
形態とともに本発明を説明するが、本発明がそれらの実施形態に限定されることを意図す
るものではないことを理解されたい。それどころか、本発明は、特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内に含まれ得るすべての代替物、変更及び均等物をカバーすることが意図される。
細書に記載のものと同様または均等な多くの方法及び材料を、当業者なら認識するであろう。本発明は、記載される方法及び材料に決して限定されるものではない。
、本発明が属する分野(複数可)の当業者が通常理解するものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様または均等ないかなる方法、装置及び材料も本発明の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法、装置及び材料を次に記載する。
示が関係する分野(複数可)の技術レベルの指標となる。本明細書で引用されるすべての刊行物、公開特許文献及び特許出願は、あたかも、それぞれ個々の刊行物、公開特許文献または特許出願が参照により組み込まれると具体的に及び個々に示されたのと同じ程度で、参照により本明細書に組み込まれる。
「an」及び「the」は、文脈において特に明記しない限り、複数形の意味を含み、「少なくとも1つの」及び「1つまたは複数の」と互換的に使用される。したがって、「1つのアプタマー」に対する言及は、アプタマーの混合物などを含む。
能が変化しないような、数値のわずかな修正または変動を表す。
こと(comprising)」、「含む(includes)」、「含むこと(including)」、「含む(contains)」、「含むこと(containing)」及びそれらの任意の変形は、非排他的包含をカバーすることが意図され、したがって、要素または要素のリストを含む(comprises)、含む(includes)または含む(contains)プロセス、方法、プロセスによる生成物、または物質の組成物は、それらの要素のみを含むのではなく、明確に列挙されない他の要素、またはそうしたプロセス、方法、プロセスによる生成物または物質の組成物に固有の他の要素を含むことができる。
しくはデオキシリボヌクレオチドまたはそれらの修飾型及びそれらの類似体を指す。ヌクレオチドは、プリン(例えば、アデニン、ヒポキサンチン、グアニン、及びそれらの誘導体及び類似体)並びにピリミジン(例えば、シトシン、ウラシル、チミン及びそれらの誘導体及び類似体)を含む種を含有する。
ヌクレオチド」は、互換的に使用されて、ヌクレオチドのポリマーを指し、DNA、RNA、DNA/RNAハイブリッド並びにこれらの種類の核酸、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの修飾体を含み、ここでは、任意の位置でのヌクレオチドユニットへの様々な実体または部分の給合が含まれる。用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」及び「核酸」は、二本鎖分子または一本鎖分子及び三重らせん分子を含む。核酸、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドは、アプタマーという用語よりも広義の用語であり、したがって、核酸、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドという用語は、アプタマーである、ヌクレオチドのポリマーを含むが、核酸、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドという用語は、アプタマーに限定されない。
及びそれらの任意の変形は、オリゴヌクレオチドに関連して使用される場合、オリゴヌクレオチドの4つの構成ヌクレオチド塩基(すなわち、A、G、T/U及びC)の少なくとも1つが天然に存在するヌクレオチドの類似体またはエステルであることを意味する。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドにヌクレアーゼ抵抗性を与える。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、主にタンパク質標的とのアプタマーの疎水性相互作用を導き、その結果、高い結合効率及び安定な共結晶複合体をもたらす。C−5位に置換を有するピリミジンは、修飾ヌクレオチドの例である。修飾には、骨格修飾、メチル化、イソ塩基のイソシチジン及びイソグアニジンなどの異例な塩基対合の組み合わせなどが含まれ得る。修飾には、キャップ形成などの3’及び5’修飾も含まれ得る。他の修飾としては、類似体との天然に存在するヌクレオチドの1つまたは複数の置換、ヌクレオチド間修飾、例えば非荷電結合(例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバミン酸など)を有するもの及び荷電結合(例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど)を有するもの、インターカレーター(例えばアクリジン、ソラレンなど)を有するもの、キレート剤(例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など)を含むもの、アルキル化剤を含むもの、並びに修飾結合(例えばαアノマー核酸など)を有するものを挙げることができる。さらに、ヌクレオチドの糖に通常存在するヒドロキシル基のいずれかを、ホスホネート基もしくはリン酸基に置き換えることができ;標準的な保護基で保護することができ;またはさらなるヌクレオチドもしくは固体支持体へのさらなる結合を調製するように活性化することができる。5’末端及び3’末端のOH基をリン酸化することができ、またはアミン、約1から約20炭素原子の有機キャップ形成基部分、いくつかの実施形態では約10から約80kDaにおよぶポリエチレングリコール(PEG)ポリマー、いくつかの実施形態では約20から約60kDaにおよぶPEGポリマー、もしくは他の親水性もしくは疎水性の生物学的ポリマーもしくは合成ポリマーで置換することができる。いくつかの実施形態では、修飾は、ピリミジンのC−5位のものである。これらの修飾は、C−5位での直接的なアミド結合を介して、または他のタイプの結合によって生成することができる。
ルオロ−または2’−アジド−リボース、炭素環糖類似体、α−アノマー糖、エピマー糖、例えばアラビノース、キシロースまたはリキソース、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体及び脱塩基ヌクレオシド類似体、例えばメチルリボシドを含めた、一般に当技術分野で既知であるリボース糖またはデオキシリボース糖の類似型を含むこともできる。上記のように、1つまたは複数のホスホジエステル結合を代替の連結基に置き換えることができる。これらの代替の連結基としては、リン酸が、P(O)S(「チオエート」)、P(S)S(「ジチオエート」)、(O)NR2(「アミデート」)、P(O)R、P(O)OR’、COまたはCH2(「ホルムアセタール」)に置き換えられ、ここでは、各RまたはR’が、独立に、Hまたはエーテル(−O−)結合を任意に含む置換もしくは無置換のアルキル(1〜20C)、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルもしくはアラルキルである実施形態が挙げられる。ポリヌクレオチド中のすべての結合が同一である必要はない。例えばポリアミド骨格のような代替の骨格構造と同様に、糖、プリン及びピリミジンの類似型の置換は、最終生成物の設計において有利であり得る。
のヌクレオチドサブユニット間のホスホジエステル結合を切断することができる酵素を指
す。本明細書で使用する場合、用語「エンドヌクレアーゼ」は、オリゴヌクレオチドの内部の部位でホスホジエステル結合(複数可)を切断する酵素を指す。本明細書で使用する場合、用語「エキソヌクレアーゼ」は、オリゴヌクレオチドの末端ヌクレオチドを結合するホスホジエステル結合(複数可)を切断する酵素を指す。生体液は、一般的には、エンドヌクレアーゼとエキソヌクレアーゼの両方の混合物を含む。
ーゼ抵抗性」は、オリゴヌクレオチドがエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼの基質として働く能力が低減し、その結果、そうした酵素と接触した場合に、オリゴヌクレオチドが分解されないか、未修飾ヌクレオチドから成るオリゴヌクレオチドよりもゆっくりと分解されることを指す。
いが、図12に図示される部分を含めた、C−5位に修飾を有するピリミジンを指す。C−5修飾ピリミジンの例としては、U.S.特許第5,719,273号及び第5,945,527号に記載されているものが挙げられる。C−5修飾の例としては、以下から独立に選択される置換基とのC−5位におけるデオキシウリジンの置換が挙げられる:真下に図示するような、ベンジルカルボキシアミド(あるいは、ベンジルアミノカルボニル)(Bn)、ナフチルメチルカルボキシアミド(あるいは、ナフチルメチルアミノカルボニル)(Nap)、トリプタミノカルボキシアミド(あるいは、トリプタミノカルボニル)(Trp)、フェネチルカルボキシアミド(あるいは、フェネチルアミノカルボニル)(Pe)、チオフェニルメチルカルボキシアミド(あるいは、チオフェニルメチルアミノカルボニル)(Th)及びイソブチルカルボキシアミド(あるいは、イソブチルアミノカルボニル)(iBu)。
飾及び4−チオウリジンの置換などと、単独でまたは任意の組み合わせで組み合わせるこ
ともできる。
ベンジルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(BndU)、5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、5−(N−イソブチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(iBudU)、5−(N−イソブチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、5−(N−フェネチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(PedU)、5−(N−チオフェニルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(ThdU)、5−(N−イソブチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、5−(N−トリプタミノカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(TrpdU)、5−(N−トリプタミノカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、5−(N−トリプタミノカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、5−(N−[1−(3−トリメチルアンモニウム)プロピル]カルボキシアミド)−2’−デオキシウリジンクロリド、5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)、5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジンまたは5−(N−[1−(2,3−ジヒドロキシプロピル)]カルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン)。
することができる。オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列は、1つまたは複数の非ヌクレオチド成分で中断されてもよい。修飾オリゴヌクレオチドを、例えば、任意の適切な標識成分とコンジュゲートさせることなどによって、重合の後にさらに修飾することができる。
の修飾に言及する場合、核酸中の1つの、いくつかの、またはすべてのピリミジンを指し、核酸中のC、TまたはUのいずれかまたはすべての、いずれかまたはすべての出現が修飾されていても、されていなくてもよいことを示す。
は、それぞれ、dA、dC、dG、dU及びdTを示す。
ーン」は互換的に使用されて、標的分子に対して望ましい作用を有する、天然に存在しない核酸を指す。望ましい作用としては、限定されないが、標的の結合、標的を触媒的に変化させること、標的または標的の機能活性を修飾または変更する方法で標的と反応すること、標的に共有結合すること(自殺インヒビターと同様)、及び標的と別の分子の間の反応を促進することが挙げられる。いくつかの実施形態では、作用は標的分子に対する特異的結合親和性であり、そうした標的分子は、ワトソン/クリック塩基対合または三重らせん形成と無関係なメカニズムを介して核酸リガンドに結合するポリヌクレオチド以外の三次元化学構造であり、ここでは、アプタマーは、標的分子が結合するという既知の生理機能を有する核酸ではない。所与の標的に対するアプタマーは、アプタマーが標的のリガンドである場合、(a)候補混合物を標的に接触させること(ここでは、候補混合物の他の核酸と比べて標的に対して親和性が増大した核酸を候補混合物の残部から分割することができる);(b)親和性が増大した核酸を候補混合物の残部から分割すること;及び(c)親和性が増大した核酸を増幅して、リガンドが豊富な核酸混合物を得て、それによって、標的分子のアプタマーを同定すること、を含む方法によって、核酸の候補混合物から同定される核酸を含む。親和性相互作用は程度の問題であることが認識されるが、この文脈では、標的に対するアプタマーの「特異的結合親和性」は、アプタマーが、一般に、混合物または試料中の他の非標的成分に結合するよりもはるかに高い親和性度で、標的に結合することを意味する。「アプタマー」または「核酸リガンド」は、特定のヌクレオチド配列を有する1つのタイプまたは種の核酸分子のコピーのセットである。アプタマーは、任意の適切な数のヌクレオチドを含むことができる。「アプタマー」は、1を超えるそのような分子のセットを指す。異なるアプタマーは、同じまたは異なる数のヌクレオチドを有することができる。アプタマーはDNAでもRNAでもよく、一本鎖でも二本鎖でも、二本鎖または3本鎖領域を含んでいてもよい。
タマーは、30分以上、60分以上、90分以上、120分以上、150分以上、180分以上、210分以上または240分以上のオフ速度(t1/2)を有するアプタマー(疎水性修飾を有する、少なくとも1つのヌクレオチドを含むアプタマーを含める)を指す。いくつかの実施形態では、SOMAmerは、「Method for Generating Aptamers with Improved Off−Rates」と題するU.S.特許第7,947,447号に記載されている、改良SELEX方法を使用して生成される。
チド」または「ペプチド断片」と同義に使用される。「精製された」ポリペプチド、タンパク質、ペプチドまたはペプチド断片は、アミノ酸配列が得られる細胞、組織もしくは無細胞の供給源からの細胞性物質もしくは他の夾雑タンパク質を実質的に含まないか、または化学的に合成される場合、化学的な前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない。
つ以上の相互作用分子を含む結晶構造である。
血管系に関する病気または疾患を意味する。そうした病気または疾患のいくつかの例は、動脈瘤、アンギナ、不整脈、アテローム性動脈硬化症、心房細動、うっ血性心不全、心筋症、冠動脈心疾患、再狭窄、虚血、左室肥大、末梢血管疾患、心筋梗塞、高血圧、心臓弁膜症及び拘束性心疾患である。
らし、それが器官の機能不全につながる、器官における過剰及び異常な量の線維性結合組織の形成によって引き起こされる、疾患または病気を意味する。そうした疾患及び病気の例は、肺線維症、腎線維症、肝線維症及び嚢胞性線維症である。
「黄斑変性症」は、網膜への損傷によって引き起こされ、黄班と呼ばれる視野の中心において視力喪失をもたらす、眼の病気を意味する。AMDは、「ウェット」及び「ドライ」型で生じる。「ウェット」AMDでは、血管は、網膜の後ろの脈絡膜から増殖する。「ドライ」AMDでは、細胞の残骸(ドルーゼン)が網膜と脈絡膜の間に蓄積する。いずれの型においても、網膜は剥離し得る。
疾患」または「眼部の病気」は、眼部の血管新生障害、例えば、黄斑変性症(「ウェット」及び「ドライ」)、未熟児網膜症、糖尿病性網膜症、血管新生緑内障、角膜血管新生、増殖性糖尿病性網膜症(糖尿病性網膜症の最も重度の段階)、ブドウ膜炎(黄斑浮腫につながることが多い眼の炎症状態)、白内障手術後の嚢胞様黄斑浮腫、近視性変性(強度の近視を有する患者が脈絡膜血管新生を発症する状態)、炎症性黄斑変性症(感染または他の原因により黄斑領域に炎症を有する患者が脈絡膜血管新生を発症する状態)、及び虹彩血管新生(虹彩表面の新しい血管増殖に関与する、糖尿病性網膜症または網膜静脈閉塞症の重篤な合併症)に影響を及ぼすまたは関与する、任意の疾患または病気を指す。
の腎臓障害、例えば、糸球体腎炎、メサンギウム増殖性腎臓疾患、多発性嚢胞腎疾患、腎臓癌、急性腎不全、腎障害、アミロイド症、浮腫、線維症、糸球体疾患、腎梗塞及び腎炎に影響を及ぼすまたは関与する、任意の疾患または病気を指す。
る疾患または病気を意味する。一般的な癌のいくつかの例は、膀胱癌、肺癌、乳癌、黒色腫、結腸及び直腸癌、リンパ腫、子宮内膜癌、膵臓癌、肝臓癌、腎臓癌、前立腺癌、白血病並びに甲状腺癌である。
ることによって、ペプチドもしくはポリペプチドのレベルを変更すること、または増大させるもしくは低下させることによって、ペプチドもしくはポリペプチドの安定性または活性を変更することを意味する。用語「阻害する」は、ペプチドもしくはポリペプチドのレベルを低下させること、またはペプチドもしくはポリペプチドの安定性もしくは活性を低下させることを意味する。一実施形態では、調節または阻害されるタンパク質はPDGFである。
学的プロセスに影響を与えることができる(例えば、結合、シグナリングなどを介する)1つまたは複数の細胞内または細胞外のプロセスに対する効果を示す。
は、PDGF A、B、C及びDアイソフォーム並びにそれらのホモまたはヘテロ二量体AA、BB、AB、CC及びDDを指す。場合によっては、文脈によって、PDGFのどのアイソフォーム及び/またはヘテロ二量体が意味されるかが決まる。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載のPDGFアプタマーは、PDGF−Bアイソフォーム並びにそのアイソフォームを含むホモ及びヘテロ二量体に結合するが、アプタマーは、PDGFへ結合すると記載される場合がある。天然に存在するヒトPDGF AA、AB及びBBアイソフォーム並びに変異体が、定義に特に含まれる。本明細書で使用する場合、PDGFには、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、霊長類、ウマ及びウシを含めた、すべての哺乳類種のPDGFが含まれる。非限定的な例示的ヒトPDGF−Bアイソフォーム前駆体は、Swiss−Prot受託番号P01127.1に示される配列を有する。非限定的な例示的ヒトPDGF−Bアイソフォーム成熟タンパク質は、Swiss−Prot受託番号P01127.1のアミノ酸82から241または82から190の配列を有し得る(PDGF−Bのアミノ酸1から160または1から109として、本明細書で言及される)。
DGFによって活性化される受容体、例えば、PDGF受容体α及びPDGF受容体βを指す。PDGF受容体には、限定されないが、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ウマ、霊長類及びウシを含めた、任意の哺乳類種の受容体が含まれる。非限定的な例示的ヒトPDGFRβ前駆体は、Swiss−Prot受託番号P09619.1に示される配列を有する。非限定的な例示的ヒトPDGFRβ成熟タンパク質は、Swiss−Prot受託番号P09619.1のアミノ酸33から1106の配列を有する。非限定的な例示的ヒトPDGFRα前駆体は、Swiss−Prot受託番号P16234.1に示される配列を有する。非限定的な例示的ヒトPDGFRα成熟タンパク質は、Swiss−Prot受託番号P16234.1のアミノ酸24から1089の配列を有する。
活性を修正することができるアプタマーである。いくつかの実施形態では、PDGFアプタマーは、PDGFの活性をインビトロで阻害する。いくつかの実施形態では、PDGFアプタマーは、PDGFの活性をインビボで阻害する。PDGFの非限定的な例示的活性は、PDGF受容体、例えば、PDGF受容体α(PDGF Rα)またはPDGF受容体β(PDGF Rβ)のPDGF媒介性リン酸化である。
は、任意にリンカーによって結合した、単量体、二量体または多量体構築物である。
、アイソフォーム及び変異体、例えば、VEGF−121、VEGF−145、VEGF−165、VEGF−183、VEGF−189及びVEGF−206を含めた、天然に存在するVEGFを指す。本明細書で使用する場合、VEGFには、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、霊長類、ウマ及びウシを含めた、すべての哺乳類種のVEGFが含まれる。非限定的な例示的ヒトVEGF前駆体は、Swiss−Prot受託番号P15692.2に示される配列を有する。VEGF−121は、例えば、Tee et al.(2001)Biochem.J.359:219;Bornes et al.(2004)J.Biol.Chem.279:18717に記載されている。
EGFによって活性化される受容体、例えば、VEGFR−1及びVEGFR−2を指す。VEGF受容体には、限定されないが、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ウマ、霊長類及びウシを含めた、任意の哺乳類種の受容体が含まれる。非限定的な例示的ヒトVEGFR−1前駆体は、Swiss−Prot受託番号P17948.2に示される配列を有する。非限定的な例示的ヒトVEGFR−1成熟タンパク質は、Swiss−Prot受託番号P17948.2のアミノ酸27から1338の配列を有する。非限定的な例示的ヒトVEGFR−2前駆体は、Swiss−Prot受託番号P35968.2に示される配列を有する。非限定的な例示的ヒトVEGFR−2成熟タンパク質は、Swiss−Prot受託番号P35968.2のアミノ酸20から1356の配列を有する。
活性を修正することができるアプタマーである。いくつかの実施形態では、VEGFアプタマーは、VEGFの活性をインビトロで阻害する。いくつかの実施形態では、VEGFアプタマーは、VEGFの活性をインビボで阻害する。VEGFの非限定的な例示的活性としては、VEGF受容体、例えば、VEGFR−1またはVEGFR−2のVEGF媒介性リン酸化が挙げられる。いくつかの実施形態では、VEGF−121への結合についてアプタマー4867−31_183と競合するVEGFアプタマーが提供される。
は、任意にリンカーによって結合した、単量体、二量体または多量体構築物である。
アプタマー構築物」は、互換的に使用されて、PDGFアプタマーとVEGFアプタマーを含む構築物を指す。「PDGF/VEGFアプタマー構築物」及び「VEGF/PDGFアプタマー構築物」における単語「PDGF」及び「VEGF」の順序は、どのようにアプタマーが結合されるかの指標とならず、例えば、順序は、どちらのアプタマーがアプ
タマー構築物の最も5’側の位置にあるか、及びどちらのアプタマーがアプタマー構築物の最も3’側の位置にあるかを示さない。いくつかの実施形態では、PDGF/VEGFアプタマー構築物は、PDGFとVEGFに同時に結合することがきる。いくつかの実施形態では、PDGF/VEGFアプタマー構築物は、PDGF及びVEGFのそれぞれに別々に結合することができる。PDGF/VEGFアプタマー構築物では、PDGFアプタマーとVEGFアプタマーは、例えばストレプトアビジン及びビオチンなどの結合対を介して、共有結合的または非共有結合的に結合され得る。PDGF/VEGFアプタマー構築物は、PDGFアプタマーとVEGFアプタマーの間にリンカーを含むことができる。
」は、PDGF活性が疾患または病気に直接的または間接的につながり得る疾患または病気を指す。非限定の例示的な、PDGFによって媒介される疾患または病気としては、心血管疾患、例えば、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、心肥大関連状態及び血管障害;眼科疾患、例えば、黄斑変性症;線維症;並びに癌が挙げられる。
VEGF活性が疾患または病気に直接的または間接的につながり得る疾患または病気を指す。非限定の例示的な、VEGFに媒介される疾患または病気としては、心血管疾患、自己免疫疾患、炎症性リウマチ疾患、眼科疾患及び疾患プロセスの様々な段階での癌が挙げられる。心血管疾患の非限定例は、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、心肥大関連状態及び血管障害である。眼科疾患の非限定例は、網膜炎、黄斑変性症、脈絡膜炎、網膜症、浮腫、緑内障及び白内障である。
細には、ヒトにおける使用について、連邦または州政府の規制当局によって承認されていること、または米国薬局方もしくは他の一般に認識される薬局方に列挙されていることを意味する。用語「担体」は、それとともに治療剤が投与される希釈剤、補助剤、賦形剤またはビヒクルを指し、限定されないが、水及び油などの滅菌した液体が挙げられる。
はPDGF/VEGFアプタマー構築物の「医薬的に許容可能な塩」または「塩」という用語は、イオン結合を含み、一般的には、開示される化合物を酸または塩基と反応させることによって生成される、個体への投与に適した開示される化合物の生成物である。医薬的に許容可能な塩としては、限定されないが、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、アルキルスルホン酸塩、アリールスルホン酸塩、アリールアルキルスルホン酸塩、酢酸塩、安息香酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、乳酸塩及び酒石酸塩を含めた酸付加塩;Li、Na、Kなどのアルカリ金属カチオン、MgもしくはCaなどのアルカリ土類金属塩または有機アミン塩を挙げることができる。
形態でPDGFアプタマー、VEGFアプタマーまたはPDGF/VEGFアプタマー構築物を含む製剤である。医薬組成物は、一般的には、意図された投与経路に適合するように製剤化される。投与経路の例としては、限定されないが、経口及び非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、吸入、局所、経皮、経粘膜及び直腸内投与が挙げられる。
載のように予防、軽減、または治療される障害または病気の少なくとも1つの症状を改善するのに必要な量を意味する。本開示のPDGFアプタマー、VEGFアプタマーまたはPDGF/VEGFアプタマー構築物に関する場合、語句「治療有効量」は、そうした治
療を必要としている有意な数の個体においてアプタマーが投与されることに対して、特定の薬理学的応答を与えるアプタマー投薬量を意味する。特定の場合の特定の個体に投与される治療有効量のアプタマーは、当業者によってそうした投薬量が治療有効量であるとしても、本明細書に記載の病気/疾患の治療において必ずしも有効とは限らないことを強調する。
使用されて、一般に、(1)望ましい方法で、例えば高親和性でタンパク質と結合することによって、標的分子と相互作用する核酸の選択と(2)それら選択された核酸の増幅との組み合わせを指す。SELEXプロセスは、特定の標的分子に高親和性であるアプタマーを同定するのに使用することができる。
子に候補混合物を結合させて、親和性複合体を形成すること、未結合の候補核酸から親和性複合体を分離すること、親和性複合体から核酸を分離及び単離すること、核酸を精製すること、並びに特異的なアプタマー配列を同定することを含む。このプロセスは、選択されたアプタマーの親和性をさらに洗練させるために、複数ラウンドを含むことができる。このプロセスは、プロセスの1または複数の箇所で増幅ステップを含むことができる。例えば、「Nucleic Acid Ligands」と題するU.S.特許第5,475,096号を参照されたい。SELEXプロセスは、標的に共有結合するアプタマー及び標的に非共有結合するアプタマーを生成するのに使用することができる。例えば、「Systematic Evolution of Nucleic Acid Ligands by Exponential Enrichment:Chemi−SELEX」と題するU.S.特許第5,705,337号を参照されたい。
または向上した送達特性などをアプタマーに与える修飾ヌクレオチドを含む高親和性アプタマーを同定するのに使用することができる。そうした修飾の例としては、リボース及び/またはリン酸及び/または塩基の位置での化学的置換が挙げられる。修飾ヌクレオチドを含む、SELEXプロセスにより同定されたアプタマーは、「High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides」と題するU.S.特許第5,660,985号に記載されており、これは、ピリミジンのC5及び/または2’位で化学的に修飾されたヌクレオチド誘導体を含むオリゴヌクレオチドを記載している。U.S.特許第5,580,737号(上記を参照されたい)は、2’−アミノ(2’−NH2)、2’−フルオロ(2’−F)及び/または2’−O−メチル(2’−OMe)で修飾された1つまたは複数のヌクレオチドを含む、非常に特異的なアプタマーを記載している。物理的及び化学的特質が拡大した核酸ライブラリー並びにSELEX及びフォトSELEXにおけるその使用を記載する、「SELEX and PHOTOSELEX」と題するU.S.特許公開第20090098549号も参照されたい。
使用することもできる。標的分子に結合することができるアプタマーを生成するための改良SELEX方法を記載する、「Method for Generating Aptamers with Improved Off−Rates」と題するU.S.特許第7,947,447号を参照されたい。それぞれの標的分子からの解離速度がより低いアプタマー及びフォトアプタマーを生成する方法が記載されている。この方法は、候補混合物を標的分子に接触させること、核酸−標的複合体の形成を起こさせること、及び低オフ速度強化プロセスを実施することを含み、ここでは、速い解離速度を有する核酸−標的複合体が解離し、再形成しないが、一方で、低解離速度を有する複合体は、インタクトな
ままである。さらに、この方法は、オフ速度性能が向上したアプタマーを生成するために、候補核酸混合物の生成における修飾ヌクレオチドの使用を含む(「SELEX及びPhotoSELEX」と題するU.S.特許公開第2009/0098549号を参照されたい)。(U.S.特許第7,855,054号及びU.S.特許公開第2007/0166740号も参照されたい。)。これらの出願のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
選択する方法が提供される:(a)核酸の候補混合物を調製すること(ここでは、候補混合物は、候補混合物の少なくとも1つのまたはそれぞれの核酸の少なくとも1つのピリミジンがC5位で化学的に修飾されている修飾核酸を含む);(b)候補混合物を標的分子と接触させること(ここでは、候補混合物の他の核酸と比べて標的分子に対する親和性が増大した核酸が標的分子に結合し、核酸−標的分子複合体を形成する);(c)親和性が増大した核酸を候補混合物の残部から分割すること;及び(d)親和性が増大した核酸を増幅して、親和性が増大した標的分子に結合することができる核酸配列が富化された核酸混合物を得て、これによって、標的分子に対するアプタマーを同定すること。ある種の実施形態では、この方法は、低オフ速度強化プロセスを実施することをさらに含む。
的(target)」は、核酸が望ましい方法で作用することができる任意の化合物を指す。標的分子は、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、脂質、多糖、糖タンパク質、ホルモン、受容体、抗原、抗体、ウイルス、病原体、有害物質、基質、代謝物、遷移状態類似体、補助因子、インヒビター、薬物、色素、栄養素、増殖因子、細胞、組織、前述のいずれかの任意の部分または断片であり得るが、これらに限定されない。事実上、任意の化学的または生物学的エフェクターは、適切な標的であり得る。任意のサイズの分子が標的として働くことができる。標的と核酸の間の相互作用の可能性または強さを増強するために、標的をある種の方法で修飾することもできる。標的は、特定の化合物または分子の任意の軽微な変形、例えばタンパク質の場合には、例えば、アミノ酸配列、ジスルフィド結合形成、糖鎖付加、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは修飾、例えば標識成分とのコンジュゲーションにおける軽微な変形を含むこともでき、これらは、分子の同一性を実質的に変更しない。「1つの標的分子」または「1つの標的」は、アプタマーに結合することができる分子または多分子性構造体の1つのタイプまたは種のコピーのセットである。「複数の標的分子」または「複数の標的」は、1つを超える、そうした分子のセットを指す。標的がペプチドであるSELEXプロセスの実施形態は、「Modified SELEX Processes Without Purified Protein」と題する、U.S.特許第6,376,190号に記載されている。
〔00185〕 本開示のPDGFアプタマーは、低解離速度でPDGFに結合するアプタマ
ーの選択及び生成のための代表的な方法を記載する実施例1に記載されているように、低オフ速度を有するアプタマーを同定するための改良SELEX方法を使用して同定した。ベンジル−dU(Bn−dU)、dA、dC及びdGから成るランダムDNAライブラリーを使用して選択した。この方法を使用して、アプタマー4149−8_1(配列番号1)と命名された、PDGF−BBに対するDNAアプタマーを同定した。
て強い親和性を維持するのに必要とされる最小配列長を同定するために研究を行った。5’末端及び3’末端からの体系的なトランケーションにより、29ヌクレオチド(4149−8_38;配列番号38)から成るコアモチーフを同定した。アプタマー4149−
8_38は、PDGF−BBに対して高親和性結合を示した(20pMのKd値;図6)。
て、さらなるシーケンシング研究を行った。並行ピロシーケンシングを使用する大規模なハイスループット法である454シーケンシングは、偏りのない試料調製及び非常に正確な配列解析を提供する。図3で示すように、このシーケンシングデータを使用して、PDGFアプタマーに対するコンセンサス配列を同定した。さらに、図6に図示するヌクレオチド置換研究によって、コンセンサス配列におけるBndUの8個の位置のうちの6個がPDGF結合にとって望ましいが、BndUの4個の位置は、結合活性をほとんどまたは全く失うことなくdTで置き換えることができることが発見された。アプタマー4149−8_1(配列番号1)に対する各位置でのヌクレオチドの出現頻度のグラフィック描写とともに、コンセンサス配列を図3Aに示す。
5’−NZVSLnS’V’ZACNNmGCGZZZAZAGCG−3’(配列番号500)を含み、
ここでは、
Vは、A、CまたはGから選択され;
V’は、C、GまたはZから選択され、V’はVに相補的であり;
S及びS’は、CまたはGから独立に選択され、SとS’は互いに相補的であり;
各Nは、任意の天然に存在するヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドから独立に選択され;
各Zは、修飾ピリミジンから独立に選択され;
Lは、任意の天然に存在するヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチド、炭化水素リンカー、ポリエチレングリコールリンカーまたはそれらの組み合わせから選択され;
nは0から20であり;mは0から20であり;ここでは、1つまたは複数のヌクレオチド挿入が任意に含まれる。
5’−ZZVSLnS’V’ZACNNmGCGZZZAZAGCG−3’(配列番号501)を含み、ここでは、V、V’、N、S、S’、Z、L、n及びmは上記で定義された通りである。
5’−ZZVCLnGV’ZACNMGCGZZZAZAGCG−3’(配列番号502)を含み、
ここでは、Z、V、V’、N、Z、L及びnは、上記で定義された通りであり、MはC及びAから選択される。
5’−ZZACLnGZZACACGCGZZZAZAGCG−3’(配列番号503)を含み、ここでは、Z、L及びnは上記で定義された通りである。
GACZACGZZACACGCGZZZAZAGCG−3’(配列番号504)を含み、ここでは、Zは上記で定義された通りである。
5’−ZVSLnS’V’ZACNNmGCGZZZAZAG−3’(配列番号507
)を含み、
ここでは、
Vは、A、CまたはGから選択され;
V’は、C、GまたはZから選択され、V’はVに相補的であり;
S及びS’は、CまたはGから独立に選択され、SとS’は他方と相補的であり;
各Nは、修飾または未修飾ヌクレオチドから独立に選択され;
各Zは、修飾ピリミジンから独立に選択され;
Lは、置換または無置換のC2〜C20リンカー及び修飾または未修飾ヌクレオチドから選択され;
nは1から50であり;mは0から50であり;
ここでは、1つまたは複数のヌクレオチド挿入が任意に含まれる。
5’−Z’ZVSLnS’V’ZACNNmGCGZZZAZAGC−3’(配列番号508)を含み、ここでは、Z’は修飾ピリミジンまたはdTであり;V、V’、N、S、S’、Z、L、n及びmは上記で定義された通りである。
5’−Z’ZVCLnGV’ZACNMGCGZZZAZAGC−3’(配列番号509)を含み、
ここでは、Z、Z’、V、V’、Z、L及びnは、上記で定義された通りであり、MはC及びAから選択される。
5’−Z’ZACLnGZZACACGCGZZZAZAGC−3’(配列番号510)を含み、ここでは、Z、Z’、L及びnは上記で定義された通りである。
5’−Z’ZACGACZACGZZACACGCGZZZAZAGC−3’(配列番号511)を含み、ここでは、Z及びZ’は上記で定義された通りである。
5’−ZABLpGYZABKqGCGZZYDYAG−3’(配列番号505)を含み、
ここでは、各Zは独立に、修飾ピリミジンであり;
各Bは、C及び置換または無置換のC2〜C10リンカーから独立に選択され;
各Lは、置換または無置換のC2〜C10リンカー、ヘキサエチレングリコールリンカー及び修飾または未修飾ヌクレオチドから独立に選択され、ここでは、pは1から10であり;
各Yは、修飾または未修飾ピリミジンから独立に選択され;
各Kは、置換または無置換のC2〜C10リンカー、ヘキサエチレングリコールリンカー及び修飾または未修飾ヌクレオチドから独立に選択され、ここでは、qは1から5であり;
Dは、A及び置換または無置換のC2〜C10リンカーから選択される。
5’−XZABLnGYZABLnGCGZZYDYAGBE−3’(配列番号506)を含み、
ここでは、Xは、修飾または未修飾ピリミジン及び置換または無置換のC2〜C10リンカーから選択されるか、存在せず;Eは、G及び置換または無置換のC2〜C10リン
カーから選択されるか、存在しない。
AZAGCG(配列番号762)含むをアプタマー構築物
ここでは、
Vは、A、CまたはGから選択され;V’は、C、GまたはZから選択され、V’は、C、GまたはZから選択され、V’はVに相補的であり;
S及びS’は、CまたはGから独立に選択され、SとS’は互いに相補的であり;
Nは、任意の天然に存在するヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドから独立に選択され;
Zは、修飾ピリミジンから独立に選択され;
mは1から20であり;
1つまたは複数のヌクレオチド挿入が任意に含まれる)。
では、各Zは、本明細書で定義されるC−5修飾ピリミジンから独立に選択される。いくつかの実施形態では、各Zは、以下から独立に選択される:
5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(BndU)、
5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−フェネチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(PEdU)、
5−(N−チオフェニルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(ThdU)、
5−(N−イソブチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(iBudU)、
5−(N−チロシルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(TyrdU)、
5−(N−3,4−メチレンジオキシベンジルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(MBndU)、
5−(N−4−フルオロベンジルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(FBndU)、
5−(N−3−フェニルプロピルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(PPdU)、
5−(N−イミジゾリルエチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(ImdU)、
5−(N−イソブチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−イソブチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−トリプタミノカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(TrpdU)、
5−(N−R−スレオニンイルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(ThrdU)、
5−(N−トリプタミノカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−トリプタミノカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−[1−(3−トリメチルアンモニウム)プロピル]カルボキシアミド)−2’−デオキシウリジンクロリド、
5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)、
5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−[1−(2,3−ジヒドロキシプロピル)]カルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン)、
5−(N−2−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(2Na
pdU)、
5−(N−2−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−2−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−1−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NEdU)、
5−(N−1−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−1−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−2−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(2NEdU)、
5−(N−2−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−2−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−3−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(BFdU)、
5−(N−3−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−3−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−3−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(BTdU)、
5−(N−3−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、及び
5−(N−3−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン。
(Y)は、結合を維持するのに必要でない可能性があり、連続したPDGF及び/またはVEGFアプタマーのある部分は修飾され得、限定されないが、スペーサーまたはリンカー部分との置き換えが含まれる。これらの実施形態では、例えば、YをY’−Q−Y’’−Q’−Y’’’と表すことができ、ここでは、Y’、Y’’及びY’’’は、PDGF及び/またはVEGFアプタマーの一部であるか、異なるPDGF及び/またはVEGFアプタマーのセグメントであり、Q及び/またはQ’は、元のPDGF及び/またはVEGFアプタマーのある種の核酸の特徴を修正するスペーサーまたはリンカー分子である。Q及びQ’が存在しない場合は、Y’、Y’’及びY’’’は、1つの連続したPDGF及び/またはVEGFアプタマー(Y)を表す。
的相互作用を介して2つ以上の分子実体を結合し、1つまたは複数の分子実体の機能的特質を保存する方法で分子実体の空間的な分離を可能にし得る、分子実体である。リンカーは、スペーサーとしても知られ得る。適切なリンカー配列は、本開示に基づいて、当業者によって容易に確認される。
ド、ポリペプチド、ペプチド核酸、ロックド核酸、オリゴ糖、多糖、抗体、アフィボディ、抗体模倣物、脂肪族、芳香族もしくは複素芳香族炭素分子、ポリエチレングリコール(PEG)分子、細胞受容体、リガンド、脂質、これらの構築体の任意の断片または誘導体、前述の任意の組み合わせ、または任意の他の化学構造もしくは成分を含む群から選択される、1つまたは複数の分子または副成分を含むことができる。
リンカーである。いくつかの実施形態では、少なくとも1つのLはヘキサエチレングリコールリンカーである。いくつかの実施形態では、Lは置換または無置換のC2〜C10リンカーである。いくつかの実施形態では、pは1、2、3、4、5、6、7または8である。いくつかの実施形態では、pは1、2または3である。いくつかの実施形態では、少なくとも1つのKはポリエチレングリコールリンカーである。いくつかの実施形態では、少なくとも1つのKはヘキサエチレングリコールリンカーである。いくつかの実施形態では、Kは置換または無置換のC2〜C10リンカーである。いくつかの実施形態では、qは1または2である。いくつかの実施形態では、qは1である。
ら17、0から16、0から15、0から15、0から14、0から13、0から12、0から11、0から10、0から9、0から8、0から7、0から6、0から5、0から4または0から3でもよい。
カーなどのリンカーでもよい。いくつかの実施形態では、Lは、ヌクレオチドとリンカーの組み合わせでもよい。非限定例として、以下のアプタマー(配列番号67及び69)は、ヘキサエチレングリコール(Heg)リンカーを含む:
(配列番号67)5’−Bn−Bn−A−C−Heg−G−Bn−Bn−A−C−A−C−G−C−G−Bn−Bn−Bn−A−Bn−A−G−C−G−3’
(配列番号69)5’−Bn−Bn−A−C−G−Heg−C−G−Bn−Bn−A−C−A−C−G−C−G−Bn−Bn−Bn−A−Bn−A−G−C−G−3’
ここでは、Bnはベンジル−dUであり、Hegはヘキサエチレングリコールリンカーである。
き換えることができる:
(配列番号329)5’−Bn−Bn−A−C−Heg−G−Bn−Bn−A−C−C3−G−C−G−Bn−Bn−Bn−A−Bn−A−G−C−3’
(配列番号408)5’−Bn−Bn−A−C−Heg−G−Bn−Bn−A−C−C3−C−G−Bn−Bn−Bn−A−Bn−A−G−3’
ここでは、Bnはベンジル−dUであり、Hegはヘキサエチレングリコールリンカーであり、C3は3炭素リンカーである。
マーの選択及び生成のための代表的な方法を記載する実施例5に記載されているように、低オフ速度を有するアプタマーを同定するための改良SELEX方法を使用して同定した。ナフチル−dU(Nap−dU)、dA、dC及びdGから成るランダムDNAライブラリーを使用して選択した。このスクリーニングで、PDGFアプタマー5169−4_26を同定した。
され、ここでは、アプタマーは、PDGFへの結合についてPDGFアプタマー5169−4_26と競合する。いくつかのそのような実施形態では、アプタマーは、疎水性核酸塩基修飾を含む少なくとも1つの修飾ヌクレオシドを含む。さらに、いくつかのそのような実施形態では、疎水性核酸塩基修飾は修飾ピリミジンである。いくつかの実施形態では、各修飾ピリミジンは、5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(BndU)、5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、5−(N−フェネチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(PedU)、5−(N−チオフェニルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(ThdU)、5−(N−イソブチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(iBudU)、5−(N−イソブチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、5−(N−イソブチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、5−(N−トリプタミノカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(TrpdU)、5−(N−トリプタミノカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、5−(N−トリプタミノカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、5−(N−[1−(3−トリメチルアンモニウム)プロピル]カルボキシアミド)−2’−デオキシウリジンクロリド、5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)、5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン及び5−(N−[1−(2,3−ジヒドロキシプロピル)]カルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン)から独立に選択され得る。
され、ここでは、アプタマーは、配列:
5’−ACALnZGZAZGLmZLZ−3’(配列番号512)を含み;
ここでは、各Zは独立に、修飾ピリミジンであり;各Lは、置換または無置換のC2〜C50リンカー、ポリエチレングリコールリンカー及び修飾または未修飾ヌクレオチドから独立に選択され;nは1から5であり;mは1から10である。
ド)−2’−デオキシウリジン(BndU)、5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、5−(N−フェネチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(PedU)、5−(N−チオフェニルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(ThdU)、5−(N−イソブチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(iBudU)、5−(N−イソブチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、5−(N−イソブチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、5−(N−トリプタミノカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(TrpdU)、5−(N−トリプタミノカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、5−(N−トリプタミノカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、5−(N−[1−(3−トリメチルアンモニウム)プロピル]カルボキシアミド)−2’−デオキシウリジンクロリド、5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)、5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン及び5−(N−[1−(2,3−ジヒドロキシプロピル)]カルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン)から独立に選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも1つの、少なくとも2つの、少なくとも3つの、少なくとも4つの、または各Zは、5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)である。いくつかの実施形態では、nは1、2、3、4または5である。いくつかの実施形態では、mは1、2、3、4、5、6、7、8、9または10である。いくつかの実施形態では、nは3である。いくつかの実施形態では、mは4である。いくつかのそのような実施形態では、各Lは、修飾ヌクレオチド、未修飾ヌクレオチド及びC3リンカーから独立に選択される。
C2〜C50)(飽和、不飽和、直鎖、分枝または環状)、0から10個のアリール基、0から10のヘテロアリール基及び0から10個の複素環基の含む骨格でもよく、これは、任意に、エーテル(−O−)結合(例えば、限定されないが、1つまたは複数のエチレングリコールユニット−O−(CH2CH2O)−を含めた、1つまたは複数のアルキレングリコールユニット;1つまたは複数の1,3−プロパンジオールユニット−O−(CH2CH2CH2O)−など);アミン(−NH−)結合;アミド(−NC(O)−)結合;及びチオエーテル(−S−)結合などを含み;ここでは、各骨格炭素原子は独立に、無置換(すなわち、−H置換基を含む)でもよく、またはC1〜C3アルキル、−OH、−NH2、−SH、−O−(C1〜C6アルキル)、−S−(C1〜C6アルキル)、ハロゲン、−OC(O)(C1〜C6アルキル)、−NH−(C1〜C6アルキル)などから選択される1つまたは複数の基で置換されていてもよい。いくつかの実施形態では、C2〜C50リンカーは、C2〜C20リンカー、C2〜C10リンカー、C2〜C8リンカー、C2〜C6リンカー、C2〜C5リンカー、C2〜C4リンカーまたはC3リンカーであり、ここでは、各炭素は、上記のように、独立に置換されていてもよい。
オシドは、2’位の糖修飾(2’−アミノ(2’−NH2)、2’−フルオロ(2’−F)または2’−O−メチル(2’−OMe)など)、シトシン環外アミンでの修飾、ヌクレオシド間結合の修飾及び5−メチル−シトシンから選択される修飾を含む。いくつかの実施形態では、PDGFアプタマーは、3’キャップ、5’キャップ及び/または3’末端での逆位デオキシチミジンを含む。
ヌクレオシド間結合を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも1つの、少なくとも2つの、少なくとも3つの、少なくとも4つの、または少なくとも5つのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。
(配列番号1から499及び517から545)に示される配列から選択される配列を有する。いくつかの実施形態では、PDGFアプタマーは、10nM未満の親和性(Kd)でPDGFに結合する、表1に示される配列及び表6から9に示される配列から選択される配列を有する。いくつかの実施形態では、PDGFアプタマーは、表1、2及び6から9に示される配列(配列番号1から1から499及び517から545)と、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一の配列を有する。いくつかの実施形態では、PDGFアプタマーは、10nM未満の親和性(Kd)でPDGFに結合する、表1に示される配列及び表6から9に示される配列と少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一の配列を有する。
、「%同一な」、「同一性%」、及びそれらの変形は、2つの核酸配列と関連して使用される場合、互換的に使用されて、最大一致について参照核酸と比較し、整列させ、(1)最も5’側の対応する(すなわち整列した)ヌクレオチド塩基と最も3’側の対応する(すなわち整列した)ヌクレオチド塩基を含むこれらのヌクレオチド塩基の間の、クエリー配列のヌクレオチド塩基の数、または(2)参照配列の全体の長さのいずれかのどちらか長い方で割った場合に、クエリー核酸またはクエリー核酸の一部のものと同じヌクレオチド塩基の数を指す。比較のための例示的配列アライメントは、例えば、Smith and Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2:482の局地的相同性アルゴリズム、Needleman and Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443の相同性アライメントアルゴリズム、Pearson and Lipman(1988)Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85:2444の類似性検索法、コンピュータによるこれらのアルゴリズムの実行(Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,Wis.のGAP、BESTFIT、FASTA及びTFASTA)、または目視検査によって行うことができる(一般に、Ausubel,F.M.et al.(1987),Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Assoc.and Wiley−Interscienceを参照されたい)。
シック・ローカル・アライメント・検索ツール(basic local alignment search tool)(以下「BLAST」)で使用されるアルゴリズムである。例えば、Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215:403及びAltschul et al.(1997)Nucleic Acids Res.15:3389を参照されたい。BLAST解析を実施するためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センター(以下「NCBI」)を通して公的に入手可能である。NCBIから入手可能なソフトウェア、例えばBLASTN(ヌクレオチド配列用)を使用して配列同一性を決定するのに使用されるデフォルトパラメーターは、McGinnis et al.(2004)Nucleic Acids Res.32:W20に記載されている。
ントを記載する際に、その配列は、少なくとも、例えば、参照ヌクレオチド配列と約95%同一であるとは、核酸配列が参照核酸配列の100ヌクレオチドのそれぞれにつき5つの点変異まで含み得ることを除いて、核酸配列が参照配列と同一であることが意図される。換言すれば、参照核酸配列と少なくともに約95%同一である所望の核酸配列を得るために、参照配列中のヌクレオチドの5%までは、欠損されてもよいし、別のヌクレオチドで置換されてもよいし、または参照配列中のヌクレオチドの総数の5%までのいくらかの数のヌクレオチドは、参照配列に挿入されてもよい(本明細書で挿入と言及する)。所望の配列を生成するための参照配列のこれらの変異は、参照ヌクレオチド配列の5’もしくは3’末端の位置で生じてもよく、またはこれらの末端位置の間の任意の位置で、参照配列中のヌクレオチドの間に個々に分散して、もしくは参照配列内の1つもしくは複数の連続した群として分散して、これらの末端位置の間の任意の位置で生じてもよい。さらに、ヌクレオチド塩基が、(1)参照配列のヌクレオチド塩基と同じである、または(2)参照配列のヌクレオチド塩基に由来する、または(3)参照配列のヌクレオチド塩基の由来となったのと同じヌクレオチド塩基に由来する場合、同一性パーセントを決定する目的で、ヌクレオチド塩基は「同一」であるとみなされることが意図される。例えば、同一性パーセント計算する目的で、5−メチルシトシンは、シトシンと「同一」であるとみなされる。同様に、同一性パーセントを決定する目的で、図12に示す修飾ウリジンは互いに同一であるとみなされる。参照配列は、配列番号1から437に示すヌクレオチド配列のうちのいずれか1つでもよい。
機能を調節するPDGFアプタマーを提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のPDGFアプタマーは、PDGF受容体、例えば、PDGF RαまたはPDGF RβのPDGF媒介性リン酸化を阻害する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のPDGFアプタマーは、PDGF RβのPDGF媒介性リン酸化を阻害する。様々な実施形態では、PDGFアプタマーは、インビボでのPDGF媒介性受容体リン酸化の阻害など、PDGFの機能をインビボで調節する。様々な実施形態では、PDGFアプタマーは、配列番号1から437の配列から選択される配列を有する。様々な実施形態では、PDGFアプタマーは、表1及び2に示すアプタマーから選択される。様々な実施形態では、PDGFアプタマーは、表1に示すアプタマーから選択される。いくつかの実施形態では、PDGFアプタマーは、配列番号1から1から499及び517から545から選択される配列の少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも26、少なくとも27、少なくとも28、少なくとも29、または少なくとも30個の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、PDGFアプタマーは、配列番号1から1から499及び517から545から選択される配列と核酸塩基配列が同一である、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも26、少なくとも27、少なくとも28、少なくとも29、または少なくとも30個の連続したヌクレオチドから成る。いくつかの実施形態では、PDGFアプタマーは、表1、2、6、7、8または9に示すアプタマーの少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも26、少なくとも27、少なくとも28、少なくとも29、または少なくとも30個の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、PDGFアプタマーは、10nM未満の親和性(Kd)でPDGFに結合する、表1に示すアプタマーまたは表6から9の1つに示すアプタマーの、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも26、少なくとも27、少なくとも28、少なくとも29、または少なくとも30個の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、PDGFアプタマーは、表1、2、6、7、8または9に示すアプタマーの少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも26、少なくとも27、少なくとも28、少なくとも29、または少なくとも30個の連続したヌクレオチドから成る。いくつかの実施形態では、PDGFアプタマーは、10nM未満の親和性(Kd)でPDGFに結合する、表1に示すアプタマーまたは表6から9の1つに示すアプタマーの、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも26、少なくとも27、少なくとも28、少なくとも29、または少なくとも30個の連続したヌクレオチドから成る。
12;761及び762の配列から選択される核酸塩基配列を有する。いくつかの実施形態では、PDGFアプタマーは、配列番号1から1から499及び517から545のいずれか1つの配列を有する。いくつかの実施形態では、PDGFアプタマーは、配列番号1から499及び517から545のいずれか1つと少なくとも95%同一、少なくとも90%同一、少なくとも85%同一、少なくとも80%同一、または少なくとも75%同一である。本明細書の実施形態のいずれかでは、PDGFアプタマーは、アプタマーの5’末端、3’末端または5’末端と3’末端の両方に、さらなるヌクレオチドまたは他の化学的な部分を含むことができる。
チドを含むことができる。様々な実施形態では、PDGFアプタマーは、約100ヌクレオチドまで、約95ヌクレオチドまで、約90ヌクレオチドまで、約85ヌクレオチドまで、約80ヌクレオチドまで、約75ヌクレオチドまで、約70ヌクレオチドまで、約6
5ヌクレオチドまで、約60ヌクレオチドまで、約55ヌクレオチドまで、約50ヌクレオチドまで、約45ヌクレオチドまで、約40ヌクレオチドまで、約35ヌクレオチドまで、約30ヌクレオチドまで、約25ヌクレオチドまで、または約20ヌクレオチドまで含むことができる。
及び517から545から選択されるアプタマーと同様の結合特性を有する、及びPDGFに関連するアテローム性動脈硬化症、黄斑変性症、線維症または癌状態を治療する能力を有するアプタマーから選択される。いくつかの実施形態では、PDGFアプタマーは、(PDGF−BBまたはPDGF−AB二量体に関連して)、表1、2及び6から9に示すアプタマーから選択されるアプタマーと同じ、PDGF−B単量体の領域に結合する。いくつかの実施形態では、PDGFアプタマーは、(PDGF−BBまたはPDGF−AB二量体に関連して)、表1に示すアプタマーから選択されるアプタマーと同じ、PDGF−B単量体の領域に結合する。いくつかの実施形態では、PDGFアプタマーは、(PDGF−BBまたはPDGF−AB二量体に関連して)、表6に示すアプタマーから選択されるアプタマーと同じ、PDGF−B単量体の領域に結合する。いくつかの実施形態では、PDGFアプタマーは、(PDGF−BBまたはPDGF−AB二量体に関連して)、PDGFアプタマー4149−8_260と同じ、PDGF−B単量体の領域に結合する。いくつかの実施形態では、PDGFアプタマーは、PDGF−Bのアミノ酸24から86を含むPDGF−Bの領域に結合する。いくつかのそのような実施形態では、PDGFアプタマーは、PDGFへの結合について、PDGFアプタマー4149−8_260と競合する。いくつかの実施形態では、PDGFアプタマーは、15%未満、14%未満、13%未満、12%未満、11%未満、10%未満、9%未満、8%未満、7%未満または6%未満の、タンパク質接触原子に対する極性接触で、PDGF−Bに結合する。極性接触は、水素結合と電荷−電荷相互作用の合計と定義される。いくつかの実施形態では、PDGFアプタマーは、0.01未満、0.009未満、0.008未満、0.007未満または0.006未満の、界面面積に対する極性接触の比で、PDGF−Bに結合する。いくつかの実施形態では、PDGFアプタマーは、(PDGF−BBまたはPDGF−AB二量体に関連して)、PDGFアプタマー5169−4_26と同じ、PDGF−B単量体の領域に結合する。
合わせを有する:
(a)PDGF−Bのアミノ酸24から86を含むPDGF−Bの領域に結合する;
(b)PDGFへの結合について、PDGFアプタマー4149−8_260と競合する;
(c)PDGFへの結合について、PDGFアプタマー5169−4_26と競合する;
(d)0.01未満、0.009未満、0.008未満、0.007未満もしくは0.006未満の、界面面積に対する極性接触の比で、PDGF−Bに結合する;及び/または
(e)15%未満、14%未満、13%未満、12%未満、11%未満、10%未満、9%未満、8%未満、7%未満または6%未満の、タンパク質接触原子に対する極性接触で、PDGF−Bに結合する。
Fアプタマーを選択することができる。いくつかの実施形態では、PDGFアプタマーは、PDGFに対して、30nM未満、25nM未満、20nM未満、15nM未満、10nM未満、9nM未満、8nM未満、7nM未満、6nM未満、5nM未満、4nM未満、3nM未満、2nM未満または1nM未満の解離定数(Kd)を有する。解離定数は、以下の実施例3に記載されているように、多点タイトレーションを使用して結合アッセイを行い、式y=(最大−最少)(タンパク質)/(Kd+タンパク質)+最少、に当てはめて、決定することができる。いくつかの実施形態では、PDGFアプタマーは、表1、2または6から9のいずれか1つに示すアプタマーのKd以下のKdを有するアプタマーである。いくつかの実施形態では、PDGFアプタマーは、表1または表6に示すアプタマーのKd以下のKdを有するアプタマーである。
合する。PDGFは、その標的受容体との反応に必要とされる、密接なホモ二量体を形成するので、アプタマー4149−8_1の二量体または他の多量体型を使用して、より効率的なPDGF活性阻害が達成される可能性がある。したがって、いくつかの実施形態では、PDGFアプタマーは、アプタマー4149−8_1、4149−8_379及び配列番号500から512の配列の任意の組み合わせの多量体化物である。いくつかの実施形態では、アプタマー構築物は、本明細書に記載のPDGFアプタマーのいずれかから選択される第1のアプタマーと本明細書に記載のPDGFアプタマーのいずれかを含む第2のアプタマーとを含み、ここでは、第1のアプタマーと第2のアプタマーは、同じでも異なっていてもよい。PDGFアプタマー構築物の第1のアプタマーと第2のアプタマーは、共有結合的または非共有結合的に結合され得る。非限定的な例示的結合は当技術分野で既知であり、及び/または本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、PDGFアプタマー構築物は、2つのPDGF単量体に同時に結合できる可能性がある。いくつかの実施形態では、PDGFアプタマー構築物は、10nM未満の親和性(Kd)でPDGFに結合する。
〔00227〕本開示のVEGFアプタマーは、低解離速度を有するVEGFに結合するアプ
タマーの選択及び生成のための代表的な方法を記載する実施例7に記載されるように、低オフ速度を有するアプタマーを同定するための改良SELEX方法を使用して同定した。
ンケートして、29ヌクレオチドの最小配列にした。このSOMAmerは、高親和性(それぞれ、90pM及び20pMのKd値)でVEGF−121とVEGF−165の両方に結合する。SOMAmerはまた、両方のVEGFアイソフォームがヒト臍帯静脈内皮細胞でのVEGFR2のリン酸化をインビトロで誘導する能力を強力に阻害し(実施例9を参照されたい)、これは、SOMAmerがVEGFの受容体結合ドメインに結合し、ブロックするという考えを支持する。
供する。したがって、本発明のVEGFアプタマーは、ベバシズマブ(Avastin(登録商標))、ラニビズマブ(Lucentis(登録商標))及びアフリベルセプト(Eylea(登録商標))(Papadopoulos et al.(2012)Angiogenesis 15:171;Yu et al.(2011)Biochem.Biophys.Res.Commun.408:276のようなタンパク質ベースの薬物と同様の、VEGFの広範なインヒビターに相当する。したがって、本発明のVEGFアプタマーは、VEGF−165の選択的インヒビターであるMacugen(登録商標)よりもVEGFシグナリングを効果的に阻害することができる。
ケートされたクローンは、29ヌクレオチドの配列を提供した。このアプタマー(またはSOMAmer)(4867−31は、高親和性(それぞれ、90pM及び20pMのKd値)でVEGF−121とVEGF−165の両方に結合する。このSOMAmerは
また、両方のVEGFアイソフォームがヒト臍帯静脈内皮細胞でのVEGFR2のリン酸化をインビトロで誘導する能力を強力に阻害し、これは、SOMAmerがVEGFの受容体結合ドメインに結合し、ブロックするという概念を支持する。
体と結合する。VEGFは、その標的受容体との反応に必要とされる、密接なホモ二量体を形成するので、アプタマー4867−31_192の二量体または他の多量体型を使用して、より効率的なVEGF活性阻害が達成される可能性がある。したがって、いくつかの実施形態では、VEGFアプタマーは、アプタマー4867−31_192、配列番号513から516の配列の任意の組み合わせの多量体化物である。いくつかの実施形態では、アプタマー構築物は、本明細書に記載のVEGFアプタマーのいずれかから選択される第1のアプタマーと本明細書に記載のVEGFアプタマーのいずれかを含む第2のアプタマーとを含み、ここでは、第1のアプタマーと第2のアプタマーは、同じでも異なっていてもよい。VEGFアプタマー構築物の第1のアプタマーと第2のアプタマーは、共有結合的または非共有結合的に結合され得る。非限定的な例示的結合は当技術分野で既知であり、及び/または本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、VEGFアプタマー構築物は、2つのVEGF単量体に同時に結合できる可能性がある。いくつかの実施形態では、VEGFアプタマー構築物は、10nM未満の親和性(Kd)でVEGFに結合する。
VEGF−121に結合する。いくつかの実施形態では、VEGFアプタマーは、1つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、VEGFアプタマーは、疎水性修飾を含む1つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、VEGFアプタマーは、1つまたは複数の修飾ピリミジンを含む。いくつかの実施形態では、VEGFアプタマーは、1つまたは複数の、図12に示す修飾ピリミジンを含む。いくつかの実施形態では、VEGFアプタマーは、1つまたは複数の、図12の群IIからVに示す修飾ピリミジンを含む。いくつかの実施形態では、VEGFアプタマーは、1つまたは複数の、図12の群IIIからvに示す修飾ピリミジンを含む。いくつかの実施形態では、VEGFアプタマーは、1つまたは複数の、図12群のIII及びIVに示す修飾ピリミジンを含む。いくつかの実施形態では、VEGFアプタマーは、1つまたは複数の(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)を含む。
5’−GZZQAAEZECZZEZDRGAZZZAAAZGG−3’(配列番号513)を含み、
ここでは、各Zは修飾ピリミジンであり;
Qは、任意の修飾または未修飾ヌクレオチド及び置換または無置換のC2〜C50リンカーから選択されるか、存在せず;
各Eは、G及び置換または無置換のC2〜C50リンカーから独立に選択され;
Dは、A及び置換または無置換のC2〜C50リンカーから選択され;
Rは、任意の修飾または未修飾ヌクレオチド及び置換または無置換のC2〜C50リンカーから選択される。
を含み:
5’−CGZZQAAEZECZZEZDRGAZZZAAAZG−3’(配列番号514);
5’−GZZQAAEZECZZEZDRGAZZZAAAZGG−3’(配列番号5
13);
5’−CGZZQAAEZECZZEZDRGAZZZAAAZGG−3’(配列番号515);及び
5’−CCGZZQAAEZECZZEZDRGAZZZAAAZGG−3’(配列番号516);
ここでは、Z、Q、E、D及びRは上記で定義された通りである。
では、各Zは、本明細書で定義されるC−5修飾ピリミジンから独立に選択される。いくつかの実施形態では、各Zは、以下から独立に選択される:
5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(BndU)、
5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−フェネチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(PEdU)、
5−(N−チオフェニルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(ThdU)、
5−(N−イソブチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(iBudU)、
5−(N−チロシルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(TyrdU)、
5−(N−3,4−メチレンジオキシベンジルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(MBndU)、
5−(N−4−フルオロベンジルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(FBndU)、
5−(N−3−フェニルプロピルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(PPdU)、
5−(N−イミジゾリルエチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(ImdU)、
5−(N−イソブチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−イソブチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−トリプタミノカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(TrpdU)、
5−(N−R−スレオニンイルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(ThrdU)、
5−(N−トリプタミノカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−トリプタミノカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−[1−(3−トリメチルアンモニウム)プロピル]カルボキシアミド)−2’−デオキシウリジンクロリド、
5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)、
5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−[1−(2,3−ジヒドロキシプロピル)]カルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン)、
5−(N−2−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(2NapdU)、
5−(N−2−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−2−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−1−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NEdU)、
5−(N−1−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−1−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−2−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(2NEdU)、
5−(N−2−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−2−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−3−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(BFdU)、
5−(N−3−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−3−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−3−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(BTdU)、
5−(N−3−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、及び
5−(N−3−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン。
ミジンから独立に選択される。いくつかの実施形態では、各Zは、図12の群IIIからVに示す修飾ピリミジンから独立に選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも1つの、少なくとも2つの、少なくとも3つの、少なくとも4つの、少なくとも5つの、少なくとも6つの、少なくとも7つのまたは少なくとも8つのZは、5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)である。いくつかの実施形態では、各Zは、図12の群IIIからIVに示す修飾ピリミジンから独立に選択される。いくつかの実施形態では、各Zは、5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)である。
2〜C50)(飽和、不飽和、直鎖、分枝または環状)、0から10個のアリール基、0から10個のヘテロアリール基及び0から10個の複素環基の鎖を含む骨格でもよく、これは、エーテル(−O−)結合(例えば、限定されないが、1つまたは複数のエチレングリコールユニット−O−(CH2CH2O)−を含めた、1つまたは複数のアルキレングリコールユニット;1つまたは複数の1,3−プロパンジオールユニット−O−(CH2CH2CH2O)−など);アミン(−NH−)結合;アミド(−NC(O)−)結合;及びチオエーテル(−S−)結合などを任意に含み;ここでは、各骨格炭素原子は独立に、無置換(すなわち、−H置換基を含む)でもよく、またはC1〜C3アルキル、−OH、−NH2、−SH、−O−(C1〜C6アルキル)、−S−(C1〜C6アルキル)、ハロゲン、−OC(O)(C1〜C6アルキル)、−NH−(C1〜C6アルキル)などから選択される1つまたは複数の基で置換されていてもよい。いくつかの実施形態では、C2〜C50リンカーは、C2〜C20リンカー、C2〜C10リンカー、C2〜C8リンカー、C2〜C6リンカー、C2〜C5リンカー、C2〜C4リンカーまたはC3リンカーであり、ここでは、各炭素は、上記のように、独立に置換されていてもよい。
、置換または無置換のC2〜C20リンカー、置換または無置換のC2〜C10リンカー、置換または無置換のC2〜C8リンカー、置換または無置換のC2〜C6リンカー、置換または無置換のC2〜C5リンカー、置換または無置換のC2〜C4リンカー及び置換または無置換のC3リンカーから独立に選択される。いくつかの実施形態では、各置換または無置換のC2〜C50リンカーは、置換または無置換のC2〜C10リンカーである。いくつかのそのような実施形態では、各置換または無置換のC2〜C10リンカーは、置換または無置換のC2〜C8リンカー、置換または無置換のC2〜C6リンカー、置換
または無置換のC2〜C5リンカー、置換または無置換のC2〜C4リンカーまたは置換または無置換のC3リンカーである。
オシドは、2’位の糖修飾(2’−アミノ(2’−NH2)、2’−フルオロ(2’−F)または2’−O−メチル(2’−OMe)など)、シトシン環外アミンでの修飾、ヌクレオシド間結合の修飾及び5−メチル−シトシンから選択される修飾を含む。いくつかの実施形態では、VEGFアプタマーは、3’キャップ、5’キャップ及び/または3’末端での逆位デオキシチミジンを含む。
ヌクレオシド間結合を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも1つの、少なくとも2つの、少なくとも3つの、少なくとも4つの、または少なくとも5つのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。
配列から選択される配列を有する。いくつかの実施形態では、VEGFアプタマーは、10nM未満のKdを有する表10から14に示す配列から選択される配列を有する。いくつかの実施形態では、VEGFアプタマーは、表10から14に示す配列と少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一の配列を有する。いくつかの実施形態では、VEGFアプタマーは、10nM未満のKdを有する表10から14に示す配列と少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一の配列を有する。同一性パーセントは、参照配列が、10nM未満のKdを有する配列のような、表10から14に示すVEGFアプタマー配列であることを除いて、PDGFアプタマーについて上で記載したように決定される。
の機能を調節するVEGFアプタマーを提供する。いくつかの実施形態では、VEGFアプタマーは、VEGF受容体、例えば、VEGFR1またはVEGFR2のVEGF媒介性リン酸化を阻害する。いくつかの実施形態では、VEGFアプタマーは、VEGF受容体のVEGF媒介性リン酸化を阻害する。様々な実施形態では、VEGFアプタマーは、インビボでのVEGF媒介性受容体リン酸化の阻害など、VEGFの機能をインビボで調節する。様々な実施形態では、VEGFアプタマーは、表10から14に示す配列から選択される配列を有する。様々な実施形態では、VEGFアプタマーは10nM未満のKdを有する表10から14に示すアプタマーから選択される。様々な実施形態では、VEGFアプタマーは表10から14に示すアプタマーから選択される。いくつかの実施形態では、VEGFアプタマーは、10nM未満のKdを有する表10から14に示す配列の少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも26、少なくとも27、少なくとも28、少なくとも29、または少なくとも30個の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、VEGFアプタマーは、10nM未満のKdを有する表10から14に示す配列と核酸塩基配列が同一である、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも26、少なくとも27、少なくとも28、少なくとも29、または少なくとも30個の連続したヌクレオチドから成る。いくつかの実施形態では、VEGFアプタマーは、表10から14に示すアプタマーの少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも26、少なくとも27、少なくとも28、少なくとも29、または少なくとも30個の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、VEGFアプタマーは、10nM未満のKdを有する表10から14に示すアプタマーの少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも26、少なくとも27、少なくとも28、少なくとも29、または少なくとも30個の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、VEGFアプタマーは、表10から14に示すアプタマーの少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも26、少なくとも27、少なくとも28、少なくとも29、または少なくとも30個の連続したヌクレオチドから成る。いくつかの実施形態では、VEGFアプタマーは、10nM未満のKdを有する表10から14に示すアプタマーの少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも26、少なくとも27、少なくとも28、少なくとも29、または少なくとも30個の連続したヌクレオチドから成る。
の5’末端、3’末端または5’末端と3’末端の両方に、さらなるヌクレオチドまたは他の化学的な部分を含むことができる。
チドを含むことができる。様々な実施形態では、VEGFアプタマーは、約100ヌクレオチドまで、約95ヌクレオチドまで、約90ヌクレオチドまで、約85ヌクレオチドまで、約80ヌクレオチドまで、約75ヌクレオチドまで、約70ヌクレオチドまで、約65ヌクレオチドまで、約60ヌクレオチドまで、約55ヌクレオチドまで、約50ヌクレオチドまで、約45ヌクレオチドまで、約40ヌクレオチドまで、約35ヌクレオチドまで、約30ヌクレオチドまで、約25ヌクレオチドまで、または約20ヌクレオチドまで含むことができる。
有する表10から14に示すアプタマーと同様の結合特性を有する、及びこうしたアプタマーと同様の、VEGFに関連するアテローム性動脈硬化症、黄斑変性症、線維症及び癌状態を治療する能力を有するアプタマーから選択される。いくつかの実施形態では、VEGFアプタマーは、10nM未満のKdを有する表10から14に示すアプタマーから選択されるアプタマーと同じ、VEGF−121の領域に結合する。いくつかの実施形態では、VEGFアプタマーは、10nM未満のKdを有する表10、11、12、13または14に示すVEGFアプタマーと同じVEGF−121の領域に結合する。いくつかの実施形態では、VEGFアプタマーは、VEGFアプタマー4867−31_183と同じ、VEGF−121の領域に結合する。
を有するように選択することができる。いくつかの実施形態では、VEGFアプタマーは
、VEGF−121に対して、30nM未満、25nM未満、20nM未満、15nM未満、10nM未満、9nM未満、8nM未満、7nM未満、6nM未満、5nM未満、4nM未満、3nM未満、2nM未満または1nM未満の解離定数(Kd)を有する。解離定数は、以下の実施例3に記載されているように、多点タイトレーションを使用する結合アッセイを行い、式y=(最大−最少)(タンパク質)/(Kd+タンパク質)+最少、に当てはめて、決定することができる。
Fアプタマーのいずれかから選択される第1のアプタマー及び本明細書に記載のVEGFアプタマーのいずれかを含む第2のアプタマーを含み、ここでは、第1のアプタマーと第2のアプタマーは、同じでも異なっていてもよい。VEGFアプタマー構築物の第1のアプタマー及び第2のアプタマーは、共有結合的または非共有結合的に結合され得る。非限定的な例示的結合は当技術分野で既知であり、及び/または本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、VEGFアプタマー構築物は、2つのVEGF単量体に同時に結合できる可能性がある。いくつかの実施形態では、VEGFアプタマー構築物は、10nM未満の親和性(Kd)でVEGFに結合する。
〔00248〕 腫瘍関連及び眼部の血管新生のより効率的なブロックが、新しい血管の退縮
と相まって、VEGFとPDGF−Bのシグナリング経路を併せて阻害することによって可能であるというかなりの証拠がある(Bergers,G.,et al.(2003)J.Clin.Invest.111:1287;Jo,N.,et al.(2006)Am.J.Pathol.168:2036)。この効果は、内皮細胞間の密接な細胞間会合を破壊することによって媒介され、これによって、初期の毛細血管の出芽及び周囲内皮細胞(または周皮細胞)が形成され、これらは、成熟するにつれて新しい血管を取り囲み、VEGFインヒビターに対して血管を低感受性にする(Benjamin,L.E.,et al.(1998)Development 125:1591;Benjamin,L.E.,et al.(1999)J.Clin.Invest.103:159)。本明細書に記載のアプタマーは、そうした二重インヒビターの基礎を築き得る。
細書に記載のVEGFアプタマーのいずれかに結合した、本明細書に記載のPDGFアプタマーのいずれかを含む。いくつかの実施形態では、PDGF/VEGFアプタマー構築物は、10nM未満のKdを有する表10から14に示すVEGFアプタマーのいずれかに結合した、表1に示すPDGFアプタマーのいずれかを含む。結合は、共有結合でもよく、共有結合でもよい。
近くで、PDGFアプタマーであって、VEGFアプタマーの5’末端もしくは5’末端近くの箇所に結合している、PDGFアプタマー、またはVEGFアプタマーであって、その3’末端もしくは3’末端近くで、PDGFアプタマーの5’末端もしくは5’末端近くの箇所に結合している、VEGFアプタマー、または構築物の各アプタマーの結合特質を保存する任意の他の配向などの、任意の配向でPDGFアプタマー及びVEGFアプタマーを含むことができる。
タマー構築物は、リン酸またはホスホロチオエート結合を介して結合することができる。限定されないが、ヘキサエチレングリコールリンカー、ポリエチレングリコールリンカー、置換または無置換の炭化水素リンカーなどを含めた、様々なリンカー部分を介する結合などの、多くの他の共有結合も意図される。当業者なら、VEGFアプタマーにPDGFアプタマーを結合させるための適切な共有結合を選択することができる。
非共有結合を介して結合する。非共有結合としては、限定されないが、ビオチン/ストレプトアビジン;金属結合ペプチド/金属;ハイブリダイズ可能な修飾及び/または未修飾のオリゴヌクレオチドなどが挙げられる。当業者なら、VEGFアプタマーにPDGFアプタマーを結合させるための適切な非共有結合を選択することができる。
〔00253〕いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも1つのアプタマーまた
はアプタマー構築物及び少なくとも1つの医薬的に許容可能な担体を含む医薬組成物が提供される。適切な担体は、Lippincott Williams & Wilkinsによって出版された「Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Twenty−first Edition」に記載されており、これは、参照によって本明細書に組み込まれる。本明細書に記載の少なくとも1つのアプタマーまたはアプタマー構築物及び少なくとも1つの医薬的に許容可能な担体を含む医薬組成物は、PDGFまたはVEGFインヒビターではない1種または複数の活性薬剤を含むこともできる。
、ゲル剤、エアロゾル剤、軟膏剤、クリーム剤、凍結乾燥製剤、乾燥散剤、錠剤、カプセル剤、制御放出製剤、速溶性製剤、遅延放出製剤、持続放出製剤、パルス放出製剤、即時放出と制御放出の混合製剤などを含む、任意の医薬的に許容可能な剤形で利用可能である。特に、本明細書に記載のアプタマーは:(a)経口、肺、静脈内、動脈内、髄腔内、関節内、直腸、眼、結腸、非経口、大槽内、腟内、腹腔内、局部、頬側、経鼻及び局所投与のいずれかから選択される投与用に;(b)分散液剤、ゲル剤、エアロゾル剤、軟膏剤、クリーム剤、錠剤、サシェ剤及びカプセル剤のいずれかから選択される剤形に;(c)凍結乾燥製剤、乾燥散剤、速溶性製剤、制御放出製剤、遅延放出製剤、持続放出製剤、パルス放出製剤及び即時放出と制御放出の混合製剤のいずれかから選択される剤形に;または(d)それらの任意の組み合わせで、製剤化することができる。
以下の1つまたは複数の成分を含むことができる:(1)注射用水、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒などの滅菌した希釈剤;(2)ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤;(3)アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤;(4)エチレンジアミンテトラ酢酸などのキレート剤;(5)酢酸、クエン酸またはリン酸などのバッファー;及び(5)塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの浸透圧調整用の薬剤。pHは、酸または塩基、例えば塩酸または水酸化ナトリウムで調整することができる。非経口調製物は、アンプル、使い捨て注射器またはガラスもしくはプラスチック製の多回投与バイアルに封入することができる。
るための、滅菌水溶液(水溶性の場合)または分散剤及び滅菌粉末を含むことができる。静脈内投与については、適切な担体としては、生理食塩水、静菌水、Cremophor
EL(BASF、Parsippany、N.J.)またはリン酸緩衝食塩水(PBS)が挙げられる。すべての場合において、組成物は滅菌である必要があり、容易に注射できる程度に流体である必要がある。医薬組成物は、製造及び貯蔵条件下で安定的である必要があり、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用から保護される必要がある。本明細書で使用する場合、用語「安定的」は、対象への投与に適した状況または状態のままであることを意味する。
プロピレングリコール及び液状ポリエチレングリコールなど)、並びにそれらの適切な混合物を含めた、溶媒でも、分散媒でもよい。例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散体の場合には必要とされる粒径の維持、及び界面活性剤の使用によって、適切な流動性を維持することができる。様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって、微生物作用の防止を達成することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、マンニトールまたはソルビトールなどのポリアルコール及び塩化ナトリウムなどの無機塩を組成物に含むことが好ましい。吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物に含めることによって、注射用組成物の長期吸収をもたらすことができる。
築物)を、必要に応じて、上に列挙した成分の1つまたは組み合わせとともに、適切な量で適切な溶媒中に組み入れ、続いて濾過滅菌することによって、調製することができる。一般に、分散体は、基本的な分散媒及び任意の他の所望の成分を含む滅菌したビヒクルに、少なくとも1つのアプタマー及び/またはアプタマー構築物を組み入れることによって調製される。滅菌注射液調製用の滅菌粉末の場合には、例示的調製方法としては、真空乾燥及び凍結乾燥が挙げられ、これらの両方によって、アプタマー及び/またはアプタマー構築物プラス任意のさらなる所望の成分の粉末が、前もって滅菌濾過したそれらの溶液から得られる。
硝子体内注射用に製剤化される。硝子体内投与用の適切な製剤は、例えば、に記載されている。眼部薬物送達は、例えば、Rawas−Qalaji et al.(2012)Curr.Eye Res.37:345;Bochot et al.(2012)J.Control Release 161:628;Yasukawa et al.(2011)Recent Pat.Drug Deliv.Formul.5:1;及びDoshi et al.(2011)Semin.Ophthalmol.26:104に記載されている。いくつかの実施形態では、アプタマー及び/またはアプタマー構築物を含む医薬組成物は、1週に1回、2週に1回、3週に1回、4週に1回、5週に1回、6週に1回、7週に1回、8週に1回、9週に1回、10週に1回、11週に1回、12週に1回、または12週に1回より少ない頻度で、硝子体内注射によって投与される。
、例えばゼラチンカプセルに封入されるか、錠剤に圧縮され得る。治療的経口投与の目的で、アプタマー及び/またはアプタマー構築物を賦形剤と併合することができ、錠剤、トローチ剤またはカプセル剤の形で使用することができる。経口組成物はまた、口腔洗浄薬として使用するための液体担体として調製することができ、ここでは、液体担体中の化合物は、経口的に適用され、口の中で動かされ、吐き出されるか、飲み込まれる。医薬的に適合性の結合剤及び/または補助剤物質を、組成物の一部として含むことができる。
素などのガス)を含む加圧容器もしくはディスペンサーからのエアゾールスプレー、噴霧化液剤、または適切な装置からの乾燥散剤の形で送達される。経粘膜または経皮投与については、浸透すべきバリアに適切な浸透剤が、製剤中に使用される。そうした浸透剤は、一般に当技術分野で既知であり、例えば、経粘膜投与については、界面活性剤、胆汁酸塩
及びフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、経鼻噴霧剤または坐剤を使用して達成することができる。経皮投与については、活性試薬は、一般に当技術分野で既知のように、軟膏剤、膏薬、ゲル剤またはクリーム剤に製剤化される。試薬は、(例えば、ココアバター及び他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を用いる)坐剤または直腸送達用の停留浣腸の形で調製することもできる。
体からの急速な排除を防ぐ担体とともに調製される。例えば、埋め込み及びマイクロカプセル化送達系を含む、制御放出製剤を使用することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル及びポリ乳酸などの生分解性の生体適合性ポリマーを使用することができる。そうした製剤の調製方法は当業者には明白である。材料は、Alza Corporation及びOva Pharmaceuticals,Incから市販品として入手することもできる。
感染細胞を標的にするリポソームを含む)も医薬的に許容可能な担体として使用することができる。これらは、例えば、U.S.特許第4,522,811号に記載されているような、当業者に知られている方法に従って、調製することができる。
性の注射懸濁液として調製することができる。適切な親油性溶媒またはビヒクルとしては、脂肪油、例えばゴマ油、または合成脂肪酸エステル、例えばオレイン酸エチル、トリグリセリド、またはリポソームが挙げられる。非脂質ポリカチオン性アミノポリマーを、送達のために使用することもできる。任意に、懸濁液は、化合物の溶解度を増大させ、高濃度の溶液の調製を可能にするのに適切な安定化剤または薬剤を含むこともできる。
形で経口または非経口組成物を製剤化するのが特に有利であり得る。本明細書で使用する場合、投薬単位剤形は、治療される対象に対する単位投薬量として適する、物理的に別々の単位を指し;各単位は、必要とされる医薬担体とともに、所望の治療効果をもたらすように計算された所定量のアプタマー及び/またはアプタマー構築物を含む。本明細書に記載のアプタマー及び/または構築物の投薬単位剤形に関する仕様は、特定のアプタマー及び/またはアプタマー構築物の特性並びに達成すべき特定の治療効果並びに個体を治療するためのそうした活性薬剤を調合する分野に固有の制限によって決まり、これらに直接依存する。
成物は、1種または複数の医薬品賦形剤を含むことができる。そうした賦形剤の例としては、限定されないが、結合剤、充填剤、潤滑剤、懸濁化剤、甘味剤、着香剤、防腐剤、緩衝剤、湿潤剤、崩壊剤、発泡剤及び他の賦形剤が挙げられる。そうした賦形剤は当技術分野で既知である。例示的賦形剤としては、以下が挙げられる:(1)様々なセルロース及び架橋型ポリビニルピロリドン、微結晶セルロース、例えばAvicel(登録商標)PH101及びAvicel(登録商標)PH102、ケイ化微結晶セルロース(ProSolv SMCC(商標))、トラガカントゴム及びゼラチンを含めた結合剤;(2)充填剤、例えば、様々なデンプン、ラクトース、ラクトース一水和物及び無水ラクトース;(3)崩解剤、例えば、アルギン酸、プリモゲル(Primogel)、コーンスターチ、軽度に架橋結合したポリビニルピロリドン、ジャガイモデンプン、トウモロコシデンプン及び修飾デンプン、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、デンプングリコール酸ナトリウム並びにそれらの混合物;(4)圧縮される粉末の流動性に作用する薬剤並びにステアリン酸マグネシウム、コロイド状二酸化ケイ素、例えばAerosil(登録商標)200、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム及びシリカゲルを含めた、潤滑剤;(5)流動促進剤、例えばコロイド状二酸化ケイ素;(6)防腐剤、例えば、ソルビン酸カリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸及びその塩、パラヒドロキシ安息香酸の他のエステル、例えばブチルパラベン、アルコール、例えばエチルアルコールまたはベンジルアルコール、フェノール化合物、例えばフェノール、または四級化合物、例えば塩化ベンザルコニウム;(7)希釈剤、例えば医薬的に許容可能な不活性なフィラー、例えば、微結晶セルロース、ラクトース、第2リン酸カルシウム、サッカリド及び/または前述のいずれかの混合物;希釈剤の例としては、微結晶セルロース、例えばAvicel(登録商標)PH101及びAvicel(登録商標)PH102が挙げられる;ラクトース、例えば、ラクトース一水和物、無水ラクトース及びPharmatose(登録商標)DCL21;第2リン酸カルシウム、例えばEmcompress(登録商標);マンニトール;デンプン;ソルビトール;スクロース;及びグルコース;(8)任意の天然または人工の甘味剤、例えば、スクロース、サッカリンスクロース、キシリトール、サッカリンナトリウム、シクラメート、アスパルテーム及びアセスルファムを含めた甘味剤;(9)着香剤、例えば、ペパーミント、サリチル酸メチル、オレンジ香料、Magnasweet(登録商標)(MAFCOの商標)、風船ガム香料、果実香料など;並びに(10)有機酸と炭酸または炭酸水素塩などの発泡性カップル(effervescent couple)を含めた発泡剤。適切な有機酸としては、例えば、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、フマル酸、アジピン酸、コハク酸及びアルギン酸並びに無水物及び酸性塩が挙げられる。適切な炭酸及び炭酸水素塩としては、例えば、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム、炭酸マグネシウム、グリシン炭酸ナトリウム、L−リジン炭酸塩及びアルギニン炭酸塩が挙げられる。あるいは、発泡性カップルの炭酸水素ナトリウム成分のみが存在し得る。
細書で使用する場合、「実質的に純粋」は、活性成分(例えば、アプタマー及び/またはアプタマー構築物)が存在する主な種である(すなわち、モル基準で、これらは、組成物中の任意の他の個々の種よりも豊富である)ことを意味する。いくつかの実施形態では、実質的に精製された画分は、活性成分が、存在するすべての高分子種の少なくとも約50パーセント(モル基準)を占める組成物である。一般に、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在するすべての高分子種の約80%より多くを含む。様々な実施形態では、実質的に純粋な組成物は、組成物中の存在するすべての高分子種の少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%または少なくとも約99%を含む。様々な実施形態では、活性成分は、均一になるまで精製され(従来の検出方法によって組成物中に夾雑種が検出され得ない)、ここでは、組成物は、本質的に、単一の高分子種から成る。
〔00268〕 本開示は、本明細書に記載のアプタマー及び/またはアプタマー構築物のい
ずれかを含むキットを提供する。そうしたキットは、例えば、(1)少なくとも1つのアプタマー及び/またはアプタマー構築物;並びに(2)少なくとも1つの医薬的に許容可能な担体、例えば、溶媒または溶液を含むことができる。さらなるキットの構成要素は、例えば、(1)本明細書で特定した医薬的に許容可能な適切な賦形剤、例えば、安定化剤、緩衝剤などのいずれか、(2)キットの成分を保持及び/または混合するための少なくとも1つの容器、バイアルまたは同様の器具、並びに(3)送達用器具を任意に含むことができる。
〔00269〕本開示は、PDGFアプタマーもしくはアプタマー構築物、VEGFアプタマ
ーもしくはアプタマー構築物及び/またはVEGF/PDGFアプタマー構築物の使用を介して医学的状態を予防または治療する(例えば、医学的状態の1つまたは複数の症状を
緩和する)方法を提供する。この方法は、治療有効量のそうしたアプタマー及び/またはアプタマー構築物をそれらを必要とする対象に投与することを含む。記載されるアプタマーは、予防的療法に使用することもできる。いくつかの実施形態では、アプタマー及び/またはアプタマー構築物は、経口的にまたは静脈内に投与される。
細書に記載のPDGFアプタマーもしくはアプタマー構築物、VEGFアプタマーもしくはアプタマー構築物及び/またはVEGF/PDGFアプタマー構築物または医薬的に許容可能なそれらの塩またはそれらのプロドラッグでもよい。
含めたいかなる動物(飼育動物、家畜または野生動物)でもよく、好ましくはヒトである。本明細書で使用する場合、患者、個体及び対象という用語は、互換的に使用され得る。
するための患者の管理及びケアを説明し、患者において、疾患、病気もしくは障害の症状もしくは合併症の発症を予防するため;疾患、病気もしくは障害の症状もしくは合併症を緩和するため;または疾患、病気もしくは障害の存在を排除するために、アプタマー及び/またはアプタマー構築物を投与することを含む。より具体的には、「治療する」は、疾患(障害)状況の少なくとも1つの有害な症状または影響、疾患の進行、疾患の原因因子または他の異常な状態を、回復させること、減弱させること、緩和すること、最小限にすること、抑制することまたは停止させることを含む。治療は、一般に、症状及び/または病態が改善する限りにおいて継続される。
ること;改善することもしくは管理すること;低減させることもしくは低下させること;または遅延させることもしくは停止させることを意味する。
維症、腎臓疾患または眼科疾患を治療するのに使用される。
その塩またはプロドラッグを、上記のような疾患状態を向上させるまたは根絶する他の治療と組み合わせて投与することができる。開示されるアプタマー及び/またはアプタマー構築物を含む組成物は、例えば1種を超えるアプタマーを含むことができる。いくつかの例では、1種または複数のアプタマーを含む組成物は、別の有用な心血管系薬剤または抗癌剤または抗線維化剤などと組み合わせて投与される。一般に、そうした組み合わせでの使用について知られている治療剤の現在利用可能な剤形が適切である。
アプタマー構築物組成物と少なくとも1種の第2の薬剤を、これらの治療剤の共作用から有益効果をもたらすことが意図される特定の治療レジメンの一部として、投与することを含む。組み合わせの有益効果としては、限定されないが、治療剤の組み合わせから生じる、薬物動態的または薬力学的な共作用が挙げられる。これらの治療剤を組み合わせて投与することは、一般的に、規定された期間(選択される組み合わせに応じて、通常、数分、数時間、数日または数週)にわたって行われる。
す別々の単独療法レジメンの一部として、2種以上のこれらの治療剤の投与を包含することが意図され得るが、一般的ではない。「組み合わせ療法」は、連続的な方法でのこれら
の治療剤の投与(すなわち、各治療剤は異なる時間に投与される)、及び実質的に同時の方法での、これらの治療剤または治療剤の少なくとも2つの投与を含むことが意図される。実質的に同時の投与は、例えば、固定比率の各治療剤を有する単回用量を、または各治療剤に対する単回用量を複数で対象に投与することによって、達成することができる。
えば、対象のタイプ、種、年齢、体重、性別及び医学的状態;治療すべき病気の重症度;投与経路;対象の腎臓及び肝臓の機能;並びに用いられる特定のアプタマー及び/もしくはアプタマー構築物またはそれらの塩を含めた、様々な因子に従って選択される。通常の技術を有する医師または獣医師ならば、病気の進行を予防する、病気の進行に逆らう、または病気の進行を停止させるのに必要とされる組成物の有効量を容易に決定し、処方することができる。
の体重1kgあたり約1μgから約100mgの範囲にわたる。
される本発明の範囲を限定することを意図するものではない。本明細書に記載のすべての実施例は、当業者にとって周知であり、慣例的である標準的な技法を使用して行われた。以下の実施例に記載されている慣例的な分子生物学的技法は、Sambrook et al.(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd.ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.)などの標準的な実験マニュアルに記載されているように行うことができる。
〔00281〕候補混合物の調製: ビオチン標識されたssDNA鋳型にアニールしたDN
Aプライマーのポリメラーゼ伸長によって、部分的にランダム化されたssDNAオリゴヌクレオチドの候補混合物を調製した。
〔00282〕SELEX条件: PDGF−BBタンパク質に対するアプタマー(R&D
Systems)は、Bn−dUでdTを置換した40ヌクレオチドのランダム領域を含むライブラリーから、記載されているように(Gold et al.(2010)PLoS One 5:e15004)、SomaLogic Incによって選択された。フォワードプライマーは5’−CGCCCTCGTCCCATCTC(配列番号837)であり、リバースプライマーは5’−CGTTCTCGGTTGGTGTTC(配列番号838)であった。PDGF−BBタンパク質をビオチン標識し、ストレプトアビジンMyOne−SA(Dynal)ビーズ上に分割した。動力学的負荷(kinetic challenge)を使用して低解離速度を有するアプタマーの優先的な選択を達成し、ここでは、逐次的なラウンドにおいて、インキュベーション時間を延ばし、タンパク質濃度を低下させて、タンパク質−DNA複合体を10mMデキストラン硫酸の存在下で37℃でインキュベートした。動力学的負荷は、以下のインキュベーション時間:ラウンド4は5分、ラウンド5〜7は15分、ラウンド8は30分を用いて、選択のラウンド4で開始し、最終的な第8ラウンドまで継続した。
〔00283〕プールシーケンシング: 第8ラウンドのプールからのオリゴヌクレオチド配
列をクローニングし、いくつかのクローンをシーケンスした。これによって、4149−8_1で例示されるような、関連した配列のファミリーが同定された。
〔00284〕PDGF SELEXプールのディープシーケンシング: 4149−8_1
アプタマーファミリー内の配列をより完全に評価するために、第8ラウンドプールを45
4ピロシーケンシング技術を使用してシーケンスした。454プライマーを用いてプールDNAを増幅し、PCR産物を精製し、Sequal標準化プレート(Invitrogen、カタログ番号A10510−01)を使用して標準化した。溶出液をゲル上で泳動して、各増幅産物のサイズ及び純度を確認した。精製したPCR産物を454ピロシーケンシング施設(University of Colorado Health Science Center in Aurora CO)でシーケンスした。
〔00285〕 CLUSTAL解析によって、454シーケンスを4149−8_1と整列
させた。プール由来の配列データセットは10,803個の全長配列(すなわち、両方のプライマー配列を含むそうした配列)を含んでおり、そのうちの3,839個がユニークであった。これら3,839個のユニークな配列を、モチーフ「5’−ZACNCGCGZZZAZAGCG」(同一性=0.65)(配列番号839)について検索し、次いでこれから上流にある「ZZ」(同一性=1.0)について検索した。これらのモチーフの両方を含む436個の配列が見つかった。加えて、58個の他の配列は、最初のパターンのみを含んでいたが、概して同一性が低く、上流に明らかなヘアピン構造がなかった。次いで、この436個の配列を以下のように整列させた。(1)「ZZ」に対して、(2)ループの中心に対して、及び(3)「ZACNCGCGZZZAZAGCG」(配列番号839)に対して。図3Aに列挙するように、すべての配列について、各位置での4149−8_1との同一性パーセンテージを計算した。表1及び2は、4149−8_1アプタマーファミリーの配列を代表する多数の配列を列挙する。
〔00286〕アプタマー合成: 固相合成に使用される修飾デオキシウリジン−5−カルボ
キサミドアミダイト試薬は、5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−5−トリフルオロエトキシカルボニル−2’−デオキシウリジン((Nomura et al.(1997)Nucl.Acids Res.25:2784)の適切な一級アミンとの縮合(RNH2、1.2当量;Et3N、3当量;アセトニトリル;60℃;4時間);2−シアノエチル−N,N−ジイソプロピルクロロホスホラミダイトとの3’−O−ホスホフィチジル化(phophitidylation)(1.2当量;iPr2EtN、3当量;CH2Cl2;−10から0℃;4時間);及び中性シリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィーによる精製(Still,et al.(1978)J.Org.Chem.43:2923)によって、調製した。アプタマーは、本明細書に記載のユニークな塩基修飾をもたらすようにプロトコールにいくらか調整を加えたホスホラミダイト法(Beaucage and Caruthers(1981)Tetrahedron Lett.22:1859)を使用して、固相合成によって調製した。トルエン中10%ジクロロ酢酸を用いて45秒間脱トリチル化を行い;5−ベンジルメルカプトテトラゾールによって活性化された1:1アセトニトリル:ジクロロメタン中0.1Mホスホラミダイトを用いて、3回5分間反応させて、カップリングを達成し、;機器供給業者の推奨に従って、キャップ形成及び酸化を行った。脱保護は、1:1:2のt−ブチルアミン:メタノール:水(Mullah 1998)を用いて、24時間摂氏37度で反応させて、行った。200nmolスケールでアプタマーを合成し、記載(Fitzwater and Polisky(1996)Methods Enzymol.267:275)されているようにUVシャドウイングを使用して、製造者の推奨に従ってCostar Spin−X(シリコン処理したガラスウールまたはスパンポリプロピレンプレフィルターを含まない)及びAmicon YM3濃度を用いて、ポリアクリルアミドゲルから精製した。
〔00287〕修飾ヌクレオチドの構造活性相関及び親和性成熟: 8つのベンジル側鎖のそ
れぞれの、結合への寄与を検討するために、修飾dUホスホラミダイトの特注ライブラリーを用いて、5位変異体を化学的に合成することによって、別の一連の体系的な点置換を行った。この目的のために、サイズ、極性、H結合のドナー及びアクセプターの配置、リンカーの長さ及び5位置換基の配向を変えることによって各位置の微小環境を探ることが可能になるライブラリーを設計した。この解析のための官能基を選択する際に、元の修飾(この場合ベンジル基)、(トリプトファン及びチロシンのような)抗体の相補性決定領
域(CDR)で大きな比率を占めるアミノ酸側鎖(Mian,IS,et al.(1991)J.Mol.Biol.217:133;Ramaraj T.et al.(2012)Biochim.Biophys.Acta.1824:520)、及び小分子薬物の「プリビレッジド(privileged)」断片(Welsch et al.(2010)Curr.Opin.Chem.Biol.14:347)というテーマに基づいて変異を含むことを目的とした。ある意味で、本発明者らは、医薬品化学において、抗体における親和性成熟の要素と構造活性相関(SAR)の最適化を組み合わせようと努力した。SELEXの間、単一修飾ヌクレオチドを利用したが、SELEX後の最適化は、修飾単量体の合成の容易さ及び固相合成との適合性のみに制約される。
定数比として表される相対的親和性及びホスホ−PDGF Rβ比パーセントとして表される相対的PDGF Rβリン酸化とともに、図1C及びD並びに図6Bにまとめる。5位にメチル基のみを有するdTでの置換は、最も激しい変化を示し、その意味で、タンパク質のアラニンスキャニング変異誘発(Cunningham,B.C.et al.(1989)Science 243:1330)に匹敵する。驚くことではないが、これは、8個の修飾ヌクレオチド位置のうちの6個において、最も許容されない置換であった。例外はヌクレオチド1及び7であり、この場所で、この置換は十分に許容された。これら2つの位置はまた、多くの他の置換を許容し、いくつかの置き換えは、結合親和性を5倍まで向上させた(図6B)。これに対して、ヌクレオチド8、17及び18は、変化に対して最も高い感受性を示した。次いで、最もよい単一の置換を組み合わせて、4149−8_255及び4149−8_260を含めたさらなる変異体を得た(図6B)。ヌクレオチド17のフェネチル−dU(Pe−dU)とヌクレオチド18のチオフェン−dU(Th−dU)を組み合わせたアプタマー4149−8_260は、PDGF−BB及びPDGF−ABの両方に対して優れた結合を示した(図6B)。最初に選択されたSOMAmerの親和性が既に非常に高かった(Kd=20pM)ので、親和性が結合アッセイの検出限界に近づき、そのため、親和性の向上度が過小評価される可能性があるということは注目すべきである。本発明者らは、初期結合がより弱い(例えば100pMから10nM超に及ぶKd値)他のSOMAmerに同様のSELEX後の最適化ストラテジーを適用し、100倍までの親和性の向上を観察した。
DGFは共有結合性ホモ二量体を形成し、2つのSOMAmerは各PDGFホモ二量体に結合するので、ホモ二量体化したSOMAmerの結合に対する効果を測定した。結合活性効果の理由から、PDGFアプタマーのホモ二量体の親和性は、対応する単量体の親和性と比較して、実質的に向上することができた。結晶構造によって、SOMAmerの5’末端は38Å離れており、一方で3’末端は74Å離れていることが示された。2箇所の間の最も短いパスがタンパク質を二分するので、3’末端へ5’末端を結合させるには、少なくとも63Åを必要とすると思われる。容易に利用可能な化学反応に基づいて、2タイプのホモ二量体を配列した。これらは、1)Hegあたり約20Åの距離を与える2つから6つのHegリンカーによって結合した頭−尾のホモ二量体、及び2)1つから3つのHegと組み合わせられた、合成ダブラーサポートを介して結合した、3’−3’ホモ二量体であった。4149−8_260のホモ二量体を、PDGF−BB Zorbax結合アッセイで試験した。結合アッセイは限られた量のSOMAmerを用いて行い、タンパク質二量体あたり1つのSOMAmerの結合とタンパク質二量体あたり2つのSOMAmerの結合を区別しないと思われる。ホモ二量体の構造を表1(配列4149−8_334から4149−8_342まで)に示す。表1aで示すように、Zorbaxアッセイで得られたKd値によって、5’−3’の立体配置において、より長いリンカーが望ましく、結合親和性を10倍まで向上させることが示唆された。3’−3’結合したホモ二量体では、より短いリンカーが、実際は長いリンカーよりもよく機能すると思われた。このことは、細胞性リン酸化の結果によって確証された。表1aを参照されたい。
5’−ZZVCLnGV’ZACNMGCGZZZAZAGCG−3’(配列番号502)であり、
ここでは
Vは、A、CまたはGから選択され;
V’は、C、GまたはZから選択され、V’はVに相補的であり;
Nは、任意の天然に存在するヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドから独立に選択され;
Mは、CまたはAから選択され;
Zは、修飾ピリミジンから独立に選択され;Lは、任意の天然に存在するヌクレオチドもしくは修飾ヌクレオチド、炭化水素リンカー、ポリエチレングリコールリンカーまたはそれらの組み合わせから選択されるスペーサーであり;
nは0から20であり;
ここでは、1つまたは複数のヌクレオチド挿入が任意に含まれる。
’末端及び3’末端からの体系的なトランケーションを行って、ヒトPDGF−BBに対するアプタマーの完全な結合活性を保持するのに必要とされる最小の長さを定めた。トランケーションのサブセットに関するKd値を示す。Z=ベンジル−デオキシウリジン(Bn−dU);A、C、G及びTはデオキシリボヌクレオチドである。
〔00292〕結晶学的研究のために、組換えヒトPDGF−BBタンパク質をCreati
ve BioMart(Shirley、NY)から購入した。組換えタンパク質は大腸菌(E.coli)細胞で発現された。アプタマー溶液を解凍し、次いで、約95℃まで5分間加熱し、次いで40℃で5分間インキュベートし、次いで室温まで冷却して、アニールさせた。アニールさせたアプタマー溶液を、1.1:1のDNA対タンパク質比でタンパク質と混合した。この複合体を、20mMリン酸Na/K(pH7)及び100mM NaClを含むバッファーで5倍希釈した。得られた混合物を、1.5mLのAmicon遠心濾過器中で、約4mg/mLのタンパク質に濃縮した。終濃度を最終的な保持液量から推定した。
〔00293〕 16oCに設定したCompact,Jr.プレート(Emerald BioSystems、WA)中で、シッティングドロップ蒸気拡散法を使用して結晶を成長させた。データ収集用の結晶は、一次スクリーン(ProPlex、Molecular Dimensions)から得た。PDGF−BB:4149−8_255複合体の結晶は、100mM酢酸マグネシウム、100mM酢酸ナトリウム(pH4.5)及び8%(w/v)PEG8000から成長させた。PDGF−BB:4149−8_260複合体の結晶は、100mM酢酸マグネシウム、100mMカコジル酸ナトリウム(pH6.5)及び15%(w/v)PEG6000から成長させた。結晶をLitho Loopsを用いて回収し、33%(v/v)エチレングリコールを含む貯蔵液に素早く移して凍結保護してから、液体窒素中に直接沈めることによって瞬間冷却した。
e(Argonne、IL)のビームライン19−IDで、両方の構造に関するデータを収集した。XDS(Kabsch 2010)を使用してこのデータセットを処理した。
PDGF−BB:4149−8_260複合体の構造は、検索モデルとしてPDGF−BB:βタイプPDGF受容体複合体(PDBエントリー 3MJG)の構造由来のPDGFのタンパク質モデルを用いて、CCP4ソフトウェアスイート(CCP4,1994)のPhaserを使用した分子置換によって、最初に位相決定した。分子置換によって、非対称ユニットあたりの単一タンパク質単量体の位置を特定した。REFMACでの制限された精密化(restrained refinement)の初期ラウンドの後の電子密度マップを調べることによって、タンパク質モデルに隣接する核酸と一致した特徴が示された。続いてアプタマーのモデルを、「ブートストラッピング」のプロセス(すなわち部分的なモデルを精密化の反復ラウンドにかけた)を通して構築し;その結果、さらなるモデル構築を可能にするわずかに向上したマップが得られた。最初に、核酸骨格密度においてリン酸イオンを構築した。次に、リン酸をdT残基で置き換えた。精密化に続いて、修飾された残基を、正の差分電子密度の突出によって識別することができた。修飾された残基の同定は、アプタマーの配列登録の決定を促進し、最終ステップにおいて、dT残基を正しい核酸塩基と置き換えた。すべてのマニュアル構築は、Crystallographic Object−Oriented Toolkit(Coot)(Emsley & Cowtan,2004)を使用して行った。PDGF−BB:4149−8_255構造体の構造は、4149−8_260複合体の完成モデルを使用した分子置換により解明した。
して、電子密度の突出が観察された。酵母で発現させた組換えPDGF−Bについて、これらの部位でO−マンノシル化報告されているが(Settineri,et al.,(1990))、大腸菌で発現させたPDGF−Bにおいて同様の翻訳後修飾を予想する理由はほとんどない。観察された電子密度によって完全な占有に満たないことが示唆されたので、スレオニン残基は、いかなる翻訳後修飾もなしでモデル化した。
−8_255(配列番号207)との2つのアプタマーリガンドのデータ収集の統計及び精密化およびモデル統計を開示する。
基対パラメーターを示す。PDGF BBアプタマーは、5’ステムループドメイン及びミニノットの両方のステムにおいて逸脱したB型コンフォメーションをとる。必要に応じて、平均値及び標準偏差(括弧内)を示す。アプタマーの値は、web3DNA(Zheng et al.(2009)Nucleic.Acids Res.37:W240)を使用した解析に基づき、(高分解能結晶構造で見られた)B−DNAの値は、Olson,et al.(2001)J.Mol.Biol.313(1):229で記載及び報告されているように、3DNAを使用して決定した。
ァミリーに特有の逆平行の配向で二量体化する、ねじれたβシートを形成する(Oefner et al.(1992)EMBO J.11:3921)。SL5(4149−8_260)は、長軸の両端で2つの相同部位に結合し、ホモ二量体界面を交差し、3つのPDGFループのそれぞれに接触する(図7A)。SOMAmerは、疎水性芳香族相互作用のネットワークによって結合した2つのドメインから成る(図7B)。5’末端では、短いステムはHegループでキャップされている(結晶構造中で無秩序である)が、分子の残部は、異常に小さなHタイプシュードノットに折りたたまれ(Aalberts,D.P.et al.(2005)Nucleic Acids Res.33:2210)、修飾ヌクレオチドは、ステムループ/シュードノット接合部でクラスター化している。注目すべきことに、8つすべての修飾ヌクレオチドがPDGFと接触している。7つの修飾ヌクレオチドクラスターは、タンパク質上の疎水性の溝に沿って一緒にクラスター化しているが、Bn−dU1は、PDGFホモ二量体界面のチャネルに続いて、伸長したコンフォメーションをとる。2つの天然ヌクレオチドもPDGFに接触し、残りの天然ヌクレオチドは、内部構造に寄与する(図2及び図7)。SL5の二次構造要素であるステムループ及びシュードノットは、周知の核酸構造モチーフである。しかし、修飾ヌクレオチドとのある種の従来の塩基の置き換えは、別の相互作用のための新規な官能基を提供する。SL5のこの際立った特徴によって、タンパク質結合及び標準ヌクレオチドと修飾ヌクレオチドの間のユニークな分子内接触のための、広域な疎水性面がをもたらされる。
aple,D.W.et al.(2005)PLoS Biol.3:e213)、この分類は、この特徴的な「ミニノット」モチーフの特殊な性質を軽視している。21ヌクレオチドを必要とする、構造的に報告された最小のHタイプシュードノット(Nonin−Lecomte S.et al.(2006)Nucleic Acids Res.34:1847)と比較して、SL5のミニノットは、わずか16ヌクレオチドから成る(図7B)。さらに、ステム2(S2)の末端mG24:dC12塩基対の欠損は、結合親和性を低下させず(図3)、これは、14ヌクレオチドのミニノットの機能的完全性を示すものである。前例のない骨格のねじれ及びスタッキング相互作用とともに、このミニノットは、修飾ヌクレオチドの疎水性部分の充填による安定化を介して著しく小さなサイズを獲得した、新規なシュードノット変異体を示す。
塩基対から成るが(図8A)、ループ2(L2)は、名目上5塩基、すなわちPe−dU17、Th−dU18、dA19、Bn−dU20及びmA21から成る。L2とS1の間の相互作用はシュードノットの決定的な特徴であるが、これは、一般的にはH結合に限定される。これに対して、SOMAmerのミニノットは、特殊な塩基対合に支持された、非定型のループ−ステムスタッキング相互作用を行う。特に、S1は、L2に由来する非標準Bn−dU17:Bn−dU20塩基対とのスタッキングによって安定化し(図8C及び図8B)、新規な骨格不連続性を有する3つの塩基対S1を効果的に作出する。以前に記載されたU:Uイミノカルボニル塩基対と対照的に、Pe−dU17:Bn−dU20塩基対は、Bn−dU17のN3とBn−dU20のアミドリンカーのカルボニル酸素との間の単一のH結合を利用する(図8D)。Bn−dU20のグリコシル結合についてのシンコンホーメーションは、Bn−dU17とのH結合を妨害するするが、Bn−dU8の糖との立体的衝突なしで、Bn20がBn−dU8塩基とスタックできるようにする。特殊なPe−dU17:Bn−dU20塩基対は、ヌクレオチド18及び20の間の骨格を280°回転させることによって可能となる(図8C)。この劇的な鎖の逆転によって、Bn−dU20塩基がdA9の糖とスタックできるようになり、Pe−dU17と水素結合を形成できるようになる。重要なことに、Pe−dU17:Bn−dU20塩基対は、修飾ヌクレオチドによって与えられる疎水性相互作用を介してさらなる安定化を引き出し;Pe−dU17側鎖のエチレン(リンカー)部分はBn16(CH::π)に向けられているが、そのベンジル基は、π−π端−面相互作用でBn2及びTh18とスタックされている(図8E)。1つのさらなるL2とS1の間の相互作用は、塩基トリプル(mA21:dG15:dC10;図8F)、すなわちシュードノット中の反復性モチーフである(Chen,G.et al.(2009)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 106:12706)。これは、修飾ヌクレオチドを含まない、SL5における唯一の長距離三次相互作用である。
んの5.9Åに圧縮して、骨格を急な94°回転させる単一の押し出されたヌクレオチド、mA11から成る(図8G)。Hタイプシュードノットは、1つまたは2つのヌクレオチドをL1に有することが多く、これは、一般的には、S2と水素結合を形成し、らせん状の接合部にスタックする(Nonin−Lecomte,S.et al.(2006)Nucleic Acids Res.34:1847;Michiels,P.J.et al.(2001)J.Mol.Biol.310:1109)。押し出されたL1ヌクレオチドは、5’ステムドメインが修飾ヌクレオチドの疎水性部分を介してミニノットとの界面を有することができるように凝集された構造を保つのに必要である。予想通り、押し出された塩基は保存されておらず(図3)、単一のC3スペーサーで置き換えることができる(図6A)が、おそらくミニノット形成への干渉の理由から、その欠損は結合を抑止する。
dC10:dG15)は、S2の鎖1がS1の鎖2に直接的につながる好ましいHタイプシュードノット配置によって集まり、効率的なステムのスタッキングをもたらす(Klein,D.J.et al.(2009)Nat.Struct.Mol.Biol.16:343)。S2の3つの塩基対は、完全にワトソン‐クリック相互作用から成り、わずかにねじれが少ない(undertwisted)B型らせん(図8H)を形成する。このねじれが少ないことは、シュードノットトポロジーについて予想されるような、A型らせんにより酷似しているらせんパラメーターをもたらす。しかし、この構造のらせんの長さが短いことを考えると、これらの計算の関連性は不確かである。S2は、S1と従来の同軸スタックを形成せず、これは、S1のdC10:dG15及びS2のdC14:dG22によって形成される接合部での極度ならせん状の巻過ぎ(70°のねじり角度)が理由である。それにもかかわらず、ステムの連続的なスタッキングは維持され、これは、dC14がdG15とスタックし、dG22が塩基トリプルのmA21とスタックするからである(図8H)。この接合部での広域ならせん状のねじれは、塩基トリプル形成のために副溝を広幅化すると同時に、mA21をS2の主溝に架橋させるのに必要である。この立体配置は、1つまたは2つのヌクレオチドをL1に有するシュードノットに典型的である(Nonin−Lecomte,S.et al.(2006)Nucleic Acids Res.34:1847;Michiels,P.J.et al.(2001)J.Mol.Biol.310:1109)。
−dU7及びdC4:dG6)並びにステムの基部の非標準Bn−dU2:Bn−dU8塩基対から成る(図8I)。Bn−dU2:Bn−dU8塩基対は、2つの水素結合、すなわち典型的な4−カルボニル−N3及びBn−dU2塩基からBn−dU8結合のアミドリンカーへのユニークな4−カルボニルを含む(図8J)。親和性が強化されたプールにおける関連した配列の解析は、ステムの基部における不変のBn−dU:Bn−dUブレースという注目すべき例外はあるが、5’ステムの長さ及び塩基組成は可変であることを示し(図3A及びB)、これは、SL5の全体的な構造及び機能におけるこの非標準塩基対の重要性を強調するものである。5’ステムらせんの安定性は、DU8、Bn20及びPDGFのPro82のスタッキングによってさらに強化される(図9H)。SL5の5’ステムループ及びミニノットドメインは収束し、ここで、骨格は鋭く111°に曲がる。5’ステムの塩基対の著しいねじり角度及び半径方向変位によって、従来のB型らせんよりも大きなスタッキングの重複を有する塩基2−4及び6−7が生じる(らせんのねじれが少ないことが原因)が、Bn−dU8塩基は外側に出て、Bn−dU7塩基はBn−dU8のアミドリンカーとスタックする(図8I)。この非定型のらせんは、SL5の残りの部分及びPDGFとの重要な相互作用を促進し;Bn−dU8塩基はBn20とスタックするが、Bn8は、連続したπ−π端−面相互作用におけるBn16とBn20の環の間に垂直に存在する。こうした長距離三次相互作用は、ミニノットとステムループドメインの間に正確なヒンジを規定する(図8L及び8K)。最初の2つのヌクレオチドの間の湾曲の欠如は、Bn2とのBn−dU1塩基の衝突を防止し、環のスタッキングを増
大する(図8I)。Bn2は、Bn7及びBn8(5’ステム由来)並びにBn16、Pe17及びBn20(ミニノット由来)によって作出された疎水性クラスターの中央に位置する(図7B、図8I及び図8K)。この疎水性クラスターはSOMAmerの安定化に寄与し、これは、SL5が、修飾ヌクレオチドを欠くその類似体よりも30℃超高い64℃というTmを示すという知見により支持された。
き換えを除いてはSL5と同一であるSL4(4149−8_255)の構造も解明した。変異体SL4においてiB−dU8をPe−dU17及びTh−dU18と組み合わせた場合、SOMAmerは、大幅に弱い結合(SL5に対して約20〜50倍)及び75倍低いインビトロ阻害活性を示した(図1A、図1B及び図6B)。より小さな非芳香族のイソブチル側鎖は、SL5のBn−dU20、Bn−dU8及びBn−dU16のベンジル側鎖で見られるエネルギー的に有利なπ−π端−面スタッキングを形成することができない(図8M及び図8N)。これは、タンパク質界面における疎水性クラスターの中心に孔を作出し、5’ステムとミニノットドメインの間のヒンジを効果的に開放する。この置換の構造的な影響は、タンパク質の疎水性コアにおけるPheからLeuへの変異にまったく類似している。そうしたタンパク質変異は十分に説明されており(Kadonosono,T.et al.(2003) Biochemistry 42:10651;Lin,H.J.et al.(2003)Biochim.Biophys.Acta.1649:16;Baase,W.A.et al.(2010)Protein Sci.19:631)、通常、著しい不安定化作用がある。二次構造モチーフ間の接合部は、核酸の3次構造の決定において重要な役割を果たすことが知られている(Pyle,A.M.et al.(2011)Curr.Opin.Struct.Biol.21:293)。
下でSL5と同様の熱融解プロファイルを示す(それぞれ62oC及び64oCのTm値)。これは、SL4におけるiB−dU8置換によって作出された、空洞及び変化した接合部トポロジーは、タンパク質結合界面を不安定化するが、SOMAmerのドメイン内構造をインタクトなままにするという考えと一致する。溶液中の遊離SOMAmerのコンフォメーションは、タンパク質との複合体におけるものと非常に異なる可能性が高く、これは、Tmと結合親和性の間の関連性を減らし得る。実際、SOMAmerの大きな疎水性面を溶媒和させるエネルギーコストはかなりのものである可能性が高いので、複合体化していないSOMAmerが疎水性側鎖の周囲で崩壊し、疎水性側鎖が溶媒から部分的に保護されたコンフォメーションをとることが予想される。
作用が、SL5とPDGFの間の界面を支配する(図2、図4及び図9)。PDGF−BBへの結合は、SOMAmerあたり約1225Å2の埋もれた表面領域を作出する。SL5の8つの修飾ヌクレオチドは、PDGFの13個の非極性アミノ酸(Ala35、Phe37、Leu38、Val39、Trp40、Pro42、Cys52、Cys53、Ile75、Ile77、Pro82、Ile83及びPhe84)と相互作用する広域な疎水性界面を作出し、これは、全非極性接触の約半分を占め、残部は、極性アミノ酸または荷電アミノ酸、例えば、Glu24、Arg27、Asn36、Asn54、Asn55、Arg56、Arg73、Lys74、Lys80、Lys85及びLys86の脂肪族領域を含む(図9)。完全に非極性の残基と荷電アミノ酸の非極性部分の間の同様の相互作用は、タンパク質で観察されることが多い。したがって、SOMAmerの修飾ヌクレオチドによって与えられる構造的多様性により、これらが、タンパク質に接近しやすい相互作用の豊富なレパートリーを模倣することが可能になる。従来のアプタマーと比較した際の、SOMAmerによって作られる疎水性接触の程度の著しい違いは、界面の原子が標的タンパク質の表面に提示される場合に明らかである。SL5は、塩基性アミノ酸に近接しているにもかかわらず、著しく少ない極性相互作用を示し、PDGFとほんの6つのH結合及び1つの電荷−電荷相互作用しか有さない(図4)。接触表面領域と比較して、これは、アプタマーに典型的なものよりも著しく低い。6つの従来のアプタマーに関するH結合及び電荷−電荷相互作用(すなわち極性接触)の総数は、0.91の相関係数及び100Å2界面面積あたり平均1.9±0.4の極性接触で、界面面積に正比例してほぼ直線的に増加する(図10A、図22A)。SL5及び他の共結晶構造の2つのさらなるSOMAmerは、界面面積あたり半分未満の極性接触の数(100Å2界面面積あたり平均0.7±0.2)で、このトレンドの99%信頼区間から明らかに外れるが、その標的に対するより高い結合親和性へのトレンドを示す(図22C)。リガンド効率(非水素接触原子あたりの結合の自由エネルギー)(Kuntz,I.D.et al.(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:9997)の観点では、アプタマーとSOMAmerは異なるように思われず(図22C)、タンパク質ベース及び少分子ベースのリガンドを用いて観察された様々な値(Wells,J.A.et al.(2007)Nature 450:1001)を包含する。界面面積あたりの結合の自由エネルギーも同様である(図22C)。しかし、異なる点は、極性接触あたりの結合の自由エネルギーの値であり、これは、SOMAmerがアプタマーよりも約2倍大きく(図22B及びC)、これは、SOMAmerは、結合へのより大きな助力を疎水性相互作用から引き出すという考えと一致する。
al/mol未満を寄与することが多い(Sali,D.et al.(1991)J.Mol.Biol.220:779。これに対して、単一のメチレン基だけを埋めると、球状タンパク質の安定性及び/または結合相互作用に約1〜1.5kcal/molが寄与されると推定される(Kellis,J.T.,Jr.et al.(1988)Nature 333:784;Pace,C.N.et al.(2011)Mol.Biol.408:514)。SOMAmerの構造によって、疎水性相互作用に強く依存していることが明らかになり、この意味で、タンパク質へのその結合は、典型的なタンパク質−タンパク質相互作用により酷似している。この知見に一致して、PDGFに対するSL5の親和性は、幅広い塩濃度(0.1から1.0M NaCl)またはpH値(5.0から8.8)にわたって事実上低下しないことを示し、これは、従来のアプタマーで見られる効果(Ahmad,K.M.et al.(2011)PLoS ONE 6:e27051;Tang,Q.et al.(2007)J.Colloid.Interface.Sci.315:99)と対照的である。
促進する。例えば、タンパク質界面における例外的なPe−dU17及びTh−dU18の形状相補性(図10B)は、構造活性相関で確証される(図6B)。Bn−dU1はまた、PDGF−BBとユニークな相互作用を形成し、ベンジル環が、Cys43−Cys52ジスルフィド結合及びPDGFの鎖1のGlu24と鎖2のArg56の間の塩橋によって形成されるトンネル内に位置する(図10C)。結晶構造によって、結合ポケットは、より大きな二環式置換基を含めた様々な側鎖を収容することができ、それによって、タンパク質と接触するこの箇所を増強することが示唆される。実際、本発明者らは、結合親和性を5から10倍増強する、いくつかの修飾ヌクレオチド置換をこの位置で同定した(図6B)。
GFRβを模倣する程度である。受容体は、PDGF界面の7つの疎水性アミノ酸を含む疎水性相互作用を主に介してPDGFに結合する(Shim,A.H.et al.(2010)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 107:11307)。SL5の結合部位は、タンパク質上の同じ疎水性の溝を占有するBn−dU芳香族環を有する受容体のものと大きく重複する(図11)。PDGFは受容体と24残基を有するSL5の両方に接触し、24残基のうちの10は共有されている。これらの共有されたまたは「プロミスキャスな(promiscuous)」残基は、PDGFの表面の結合エネルギーのホットスポットに相当する可能性がある(Wells,J.A.et al.(2007)Nature 450:1001;Clackson,T.et al.(1994)Science 267:383。しかし、PDGF Rβと比較して、SL5は、PDGF−BBに対して10倍高い親和性を示す(Lokker,N.A.et al.(1997)J.Biol.Chem.272:33037)。これらの知見に一致して、SL5はPDGF−BBの強力なインヒビターである(図1B及び図6B)。
〔00310〕 標的結合親和性を決定するために、T4ポリヌクレオチドキナーゼ(New
England Biolabs)及びγ−32P−ATP(Perkin Elmer)を使用して、SOMAmerを5’末端標識した。結合アッセイは、約0.03〜0.05nMの濃度の放射標識されたSOMAmer(約20,000c.p.m)及び10−7から10−12Mに及ぶ濃度の標的タンパク質を、1×SB18Tバッファー(40mM HEPES、pH7.5;120mM NaCl;5mM KCl;5mM MgCl2及び0.01%TWEEN−20)中で37℃で30分間インキュベートすることによって行った。結合した複合体を、Zorbax樹脂と混合し、Duraporeフィルタープレートで捕獲した。結合したSOMAmerの画分をPhosphorImager(FUJI FLA−3000)で定量化した。生の結合データをZorbax樹脂への放射標識されたSOMAmerの非特異的なバックグラウンド結合に対して補正した。平衡解離定数(Kd)を、以前に記載されたように(Jellinek et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.91:11227)決定した。図5で示すように、200nMの濃度の競合物のtRNAをアイソフォームの特異性研究に含む。PDGF−BB/SOMAmerとE10030の相互作用に対する塩依存性を測定するために、結合親和性アッセイを、40mM Hepes pH7.5、0.01%TWEEN−20及び100mM、250mM、500mM、750mMまたは1.0MのいずれかのNaCl)の存在下で、上記のように行い、解析した。単純線形回帰を使用して、塩濃度対解離定数の両対数プロットを適合させた。プロットの傾きは、(Manning,G.S.(1969)J.Chem.Phys.51:924)の対イオン凝集理論によって説明されているように、タンパク質結合の際にDNAから遊離した対イオンの数を表す。PDGFに対するアプタマー4149−8_260(配列番号211)の親和性は、幅広い塩濃度(0.1から1.0M NaCl)またはpH値(5.0から8.8)にわたってほとんど変化を示さず、これは、従来のアプタマーで見られる効果(Ahmad,K.M.et al.(2011)PLoS One 6:e27051;Tang,Q.et al.(2007)J.Colloid.Interface Sci.315:99)と対照的である。
〔00311〕PDGF−BB活性。PDGF−BB SOMAmerがPDGF Rβの
活性化を阻害する能力を試験するために、Hs27ヒト包皮線維芽細胞(アメリカ培養細胞系統保存機関)を5000細胞/ウェルで96ウェルプレートに播種し、24時間血清飢餓させた。SOMAmer(図で示す様々な濃度)を、PDGF−BB(20ng/mL)(Creative BioMart)とともに血清フリー培地において30分間37°Cでインキュベートし、次いで、血清飢餓させたHs27細胞にこの複合体を加えた。刺激してから5分後に、上清を捨て、溶解バッファー#9(R&D Systems:1%NP−40代替品、20mM Tris(pH8.0)、137mM NaCl、10%グリセロール、2mM EDTA、1mM活性化オルトバナジウム酸ナトリウム、10μg/mLアプロチニン及び10μg/mLロイペプチン)中で、細胞を氷上で5分間溶解した。製造者の指示書に従ってDuoSetホスホ−PDGF Rβキット(R&D
Systems)を使用して、ホスホ−PDGF Rβのエライザ検出を行った。ホスホ−PDGF RβパーセントをOD450で測定し、刺激なしの対照で、プレートの吸光度及びバックグラウンドシグナルについて補正した。実験は、一般に、2連または3連で行った。データをGraphPad Prism3.0でプロットし、非線形回帰を使用して一部位競合曲線に当てはめた。SOMAmer4149−8_379及び5’アミノリンカー修飾されたSOMAmer4149−8_379についてIC50測定の代表的なプロットを図13に示し、それぞれ1.6nM及び1.7nMのIC50値である。
じ条件下であるが、単一濃度(一般に20nM)のSOMAmer変異体において、Hs27線維芽細胞におけるPDGF−BB誘導性PDGF Rβリン酸化の阻害パーセントを評価した。
〔00313〕 高親和性でPDGF−BBに結合するアプタマーを同定するために、Na
p−dU修飾ヌクレオチドを含むライブラリーを用いて別のSELEX実験を行った。選択は、上記の実施例1に記載されているものと実質的に類似した方法で行い、その結果、Nap−dUアプタマークローン5169−4を同定した。
5169−4_1アプタマーファミリー内の配列をより完全に評価するために、454ピロシーケンシング技術を使用して第7ラウンドのプールをシーケンスした。454プライマーを用いてプールDNAを増幅し、PCR産物を精製し、Sequal標準化プレート(Invitrogen、カタログ番号A10510−01)を使用して標準化した。溶出液をゲル上で泳動して、各増幅産物のサイズ及び純度を確認した。精製したPCR産物を、454ピロシーケンシング施設(University of Colorado
Health Sciences Center in Aurora,CO)でシーケンスした。
、両方のプライマー配列を含むそうした配列)を含んでおり、そのうちの1,629がユニークであった。これら1,629ユニークな配列を使用して、配列セットにおいて、4−merから30−merまでのすべてのあり得るn−merを数えることによって、統計学的に有意なn−merパターンを見つけた。同定された各n−merの数を同じ組成のプールからランダムに予想される数と比較することによって、統計学的に有意なパターンが見つかった。この配列セット中で2つの主要なパターンを同定し、5169−4_1が、11個の配列で見つかった保存配列モチーフ「APGPAPGCACAPCP」によって定義された第2のパターン内に整列していることが分かった。このモチーフに対する、すべてのユニークな配列の検索(同一性=0.75)によって、51個の配列が見つかり、次いで、これらをモチーフによって整列させた。図14に列挙するように、すべての配列について、アライメントの各位置での部分同一性(fractional identity)を計算し、コンセンサス配列を示した。
69−4クローンの5’末端及び3’末端からの体系的なトランケーションを行って、ア
プタマーのヒトPDGF−BBに対する完全な結合活性を保持するのに必要とされる最小の長さを定めた。これらのトランケーションに対するKd値を示す(P=ナフチル−デオキシウリジン(Nap−dU);A、C、G及びTはデオキシリボヌクレオチド)。5169−4クローンは、トランケーションに非常に適していることが判明し、50−merと比較して向上した結合親和性(それぞれ17pM及び29pM)でPDGF−BBに結合する21ヌクレオチド配列を同定した(5169−4_26)。5169−4_26の21−merは、50−merの9個のNap−dU修飾ヌクレオチドと対比して、5つのNap−dU修飾ヌクレオチドを含んでいた。
Nap−dU PDGF−BBアプタマーのSELEX修飾後の第1ラウンドは、21−merの5169−4_26のすべての位置でのC3スペーサーウォークを含んでいた。C3スペーサーウォークは、完全に除去できる可能性があり、C3スペーサーまたは他のリンカー、例えばヘキサエチレングリコール(Heg)またはポリエチレングリコール(PEG)リンカーで置き換えることができる、高親和性結合に必要とされない塩基を同定することを意図する。C3スペーサー置換についての結果を表7に示す。この表では、「P」はNap−dUを示し、「C3」はC3スペーサーを示し;A、C及びGはデオキシリボヌクレオチドを示し、「NB」は100nM PDGF−BBまで結合がないことを示す。以下の3部位は、わずかな結合親和性の低下でC3置換を許容した:C1、G6及びC7(以下に示すように、番号付けは21−merを参照する)。1つの位置、C15は、5169−4_26と比較して結合親和性に影響を及ぼさずに、C3スペーサー置換を許容した。
: このヌクレアーゼ抵抗性置換を許容することができる位置を同定するために、すべての天然塩基において2’O−メチル置換を行った。本発明者らの実験室で合成した2’O−メチルNapホスホラミダイト(Nap−mU)を用いて、Nap−mU単一置換を許容すると思われるNap−dUの位置も評価した。加えて、各Nap−dUの重要性を評価するために、デオキシチミジン(T)でNap−dUを置換した。結合親和性の結果を表8に示し、これは、すべての位置が様々な程度に2’O−メチル置換を許容したことを示す。各デオキシシチジンの位置(C)での2’O−メチル置換の影響は、結合親和性の2倍の低下までの5169−4_26と比較して、、結合親和性に変化をもたらさなかった。4つのデオキシグアノシン位置(G)は、2’O−メチルで置換した場合、5169−4_26と比較して、G14における5.5倍の結合親和性の増大からG10における5.5倍の結合親和性の低下まで変動する結果を示した。6つのデオキシアデノシン位置(A)における2’O−メチル置換は、結合親和性に対して0から50倍を越える悪影響があった。2’O−メチル置換に最も感受性である3つは、アプタマーの5’末端に向かうデオキシアデノシン(A3、A5及びA8)であった。位置21のNap−dUのみ、結合親和性に影響を及ぼさずにNap−mU置換を完全に許容したが、位置11のNap−mU置換は、5169−4_26と比較して、2.5倍の結合親和性の低下を示した。残りのNap−mU置換は、15から30倍の結合親和性の低下をもたらした。(100nMまでのPDGF−BBの濃度で)結合を完全に排除した唯一の置換は、位置12及び21でのデオキシチミジン置換であり、残りのデオキシチミジン置換は、結合親和性に対して著しい負の効果(400倍超)があった。表8では、P=5−ナフタレン修飾dUであり、上付きの1は2’−O−メチル修飾ヌクレオシドを示す。A、C、G及びTは天然に存在するデオキシリボヌクレオチドを表し、「NB」は100nM PDGF−BBまで結合がないことを示す。
換。5169−4_26における2’−O−メチル置換の組合せ効果は、変異体5169
−4_146を含めた、結合親和性が向上したいくつかの変異体の同定につながる。この21−merは2’O−メチルによってヌクレアーゼ保護された11の位置を有し、その結合親和性は親トランケート体、5169−4_26よりも少なくとも20倍大きい(それぞれ0.60pM対17pM)。多くの他の変異体も、3から10個の2’O−メチルの組み合わせにより、著しい結合親和性の向上(約3倍)を有していた。表9では、P=5−ナフタレン修飾dUであり、上付きの1は2’−O−メチル修飾ヌクレオシドを示し、A、C及びGは天然に存在するデオキシリボヌクレオチドを表し、「NB」は3.2nMのPDGF−BBまで結合がないことを示す。
〔00320〕 PDGF Rβの活性化に対するPDGF Nap−dUアプタマーの阻
害的影響を解析するために、実施例4に記載されるように細胞性リン酸化阻害アッセイを行った。試験した4つのアプタマー配列は、以下のIC50値でPDGF Rβの活性化を阻害した:5169−4_26、IC50=1.6nM;5169−4_84、IC50=3.3nM;5169−4_85、IC50=7.3nM;5169−4_112、IC50=1.0nM。
〔00321〕 候補混合物の調製: ビオチン標識されたssDNA鋳型にアニールした
DNAプライマーのポリメラーゼ伸長によって、部分的にランダム化されたssDNAオリゴヌクレオチドの候補混合物を調製した。
に対するアプタマー(両方ともR&D Systems製)は、Nap−dUでdTを置換した40ヌクレオチドのランダム領域を含むライブラリーから、記載されているように(Gold et al.(2010)PloS One 5:e15004)SomaLogic Incによって選択された。VEGF−121に対して、フォワードプライマーは5’−GCCACACCCTGCCCTC−3’であり、リバースプライマーは5’−GAGGACACAGACAGACAC−3’であった。VEGF−121タンパク質をビオチン標識し、ストレプトアビジンMyOne−SA(Dynal)ビーズ上に分割した。動力学的負荷を使用して低解離速度を有するアプタマーの優先的な選択を達成し、ここでは、逐次的なラウンドにおいて、インキュベーション時間を延ばし、タンパク質濃度を低下させて、タンパク質−DNA複合体を10mMデキストラン硫酸の存在下で37℃でインキュベートした。VEGF−121 SELEXでは、ラウンド4及び5は、15分の動力学的負荷を含むが、ラウンド6及び7(最終ラウンド)は30分の動力学的負荷を含んでいた。
、SELEXにとって難しいタンパク質標的である。本発明者らは、天然に存在するDNAまたはRNAのライブラリーまたはリボースの2’位で修飾された核酸ライブラリーを用いて、わずかな程度の親和性度の向上さえも以前に得ることができなかった。これは、2つの理由で注目すべきことである。第1に、シスチンノットスーパーファミリーのメンバーの中で、VEGF−121は、124Cα原子について1.9Åの平均二乗偏差で、PDGF−BBに対して最も高い構造的類似性を有する(Muller et al.,1997)。第2に、より大きく、最も広く認められるVEGFアイソフォーム、VEGF−165は、SELEXの優れた標的であることが証明されている。例えば、(黄斑変性症治療のために)今までに規制当局の承認を受けた唯一のアプタマーベースの治療剤であるペガプタニブ(Macugen)は、ヘパリン結合性のエクソン7にコードされるド
メイン(VEGF−121で欠けている)を介してVEGF−165のみに結合する(Lee et al.,2005;Ruckman et al.,1998)。VEGF−121、VEGF−165とPDGF−BBの間の1つの相違点は全体の電荷であり、それぞれ5.8、8.5及び10.1というpI値を有する。これは、アプタマー結合における極性相互作用の重要性を指摘する。成功したVEGF−121に対する親和性強化は、SELEX Nap−dUライブラリーで最終的に達成された。
行ったNap−dU SELEX実験から、単一の位置が異なる非常に関連した2つの高親和性変異体(4867−15及び4867−31)を同定した。クローン4867−31は、一連の欠損実験で29−merにトランケートされていた(表7)。単一のヌクレオチドの違いは最小配列の5’境界の外側であるので、両方の高親和性クローン(4867−15及び4867−31)のトランケーションが、同じ29−merをもたらすことは注目すべきである。高親和性結合を有するより短い配列を含むトランケート変異体、すなわち29−merの4867−31_143(5’−CCGPP CAAGP GCPPG PAGGA PPPAA APGG−3’;「P」はNap−dUの一文字記号である))及びそれに近い変異体は、0.1〜1nMに及ぶ互角の親和性で、ヒトVEGF−121、ヒトVEGF−165、マウスVEGF−120及びラットVEGF−164に結合する(表10)。この表では、「P」はNap−dUを示し;A、C及びGは天然に存在するデオキシリボヌクレオチドを示し、「NB」は100nMのVEGFまで結合がないことを示す。
VEGF−121アプタマーのSELEX修飾後の第1ラウンドは、50merの4867−15_2(トランケートされた50−mer)のすべての位置でのC3スペーサーウォークであった。C3スペーサーウォークは、完全に除去できる可能性があり、C3スペーサーまたは他のリンカー、例えばヘキサエチレングリコール(Heg)またはポリエチレングリコール(PEG)リンカーで置き換えることができる、高親和性結合に必要とされない塩基を同定することを意図する。C3スペーサー置換についての結果を表11に示す。この表では、「P」はNap−dUを示し、「V」はC3スペーサーを示し;A、C及びGは、天然に存在するデオキシリボヌクレオチドを示し、「NB」は100nMのVEGFまで結合がないことを示す。以下の少なくとも3つの内部部位はC3置換を許容した:C17、G26及びG29(以下に示すように、番号付けは50−merを参照する)。
換。2’O−メチル置換を、このヌクレアーゼ抵抗性置換を許容することができる位置を同定するために、天然塩基において行った。加えて、各Nap−dUの重要性を評価するために、2’−OMe−ウリジン(2’−OMeU)でNap−dUを置換した。加えて、次に、この32merに関して、押し出された塩基であると仮定されたある内部位置でC3スペーサーを試験した。内部欠損及び代替塩基も、3つの位置のそれぞれで試験した。選択したSOMAmer(20nMの単一濃度)についての結合親和性及び細胞培養阻害データを以下に示す。結果を表12に示し、これは、C8(表11のC17)は、より短いトランケートにおいてC3への置換を完全に許容しなかったことを示す。他の2つの推定上の押し出された塩基(G17及びG20)は、この文脈におけるC3または代替塩基置換として、優れた結合及び機能活性を保持する。それらの位置での内部欠損は許容されなかった。この実験では、Nap−dU修飾のどれも2’OMe−Uで置き換えることができなかった。しかし、いくつかの内部部位は2’OMe修飾を許容した。表12では、P=5−ナフタレン修飾dUであり、上付きの1は2’−OMe修飾ヌクレオシドを示し、V=3炭素スペーサーであり、空のボックスはヌクレオシド欠損を示す。A、C、G及びUは天然に存在するデオキシリボヌクレオチドを表す。
p−dU置換及び複数の2’−O−メチル置換。本発明者らの実験室で合成した2’O−メチルNapホスホラミダイト(Nap−mU)を用いて、Nap−mU単一置換を許容すると思われるNap−dUの位置を評価した。加えて、各天然塩基において、2’OMeとC3リンカー置換の組み合わせを試験した。選択したSOMAmer(20nMの単一濃度)についての結合親和性及び細胞培養阻害データを以下に示す。以下の表13で示すように、Nap−dU残基の大部分はOMe置換を許容しなかったが、位置22でのNap−dUに対するNap−mUの置換は、親和性を10倍増大させ、優れた阻害活性を与えた。この表では、上付きの「1」は2’−O−メチル置換を示し、「V」はC3スペーサーを示す。2’−OMeの組み合わせは、親和性に基づいて大部分は許容性に優れるが、ある種の組み合わせは著しい阻害活性の低下を示した。
1_188を含めた、結合親和性が向上したいくつかの変異体が同定された。この29−merは、2’OMeまたはC3のいずれかによってヌクレアーゼ保護された10個の位置を有し、その結合親和性は、親トランケート体、4867−31_143よりも約3倍密接である(それぞれ38pM対140pM)。変異体4867−31_188は、親SOMAmerと比較して、互角の細胞性阻害活性を保持する。表13を参照されたい。
867−31_143トランケート体を使用)であった。このNap−mU置換は、次に、最もよく組み合わされた2’OMe SOMAmer、4867−31_188のバックグラウンドに入れられた。加えて、ヌクレアーゼ保護された塩基が分子に強剛性を与え、それによって結合が増大し得るという可能性を検討するために、位置15でのC3スペーサーとの元のdGの置換をその位置での2’−OMe置換と比較した。最もよい集計結果は、親の29−merトランケート変異体4867−31_143と比較して今や9個の保護された位置を有する変異体、4867−31_192で得られた(以下の表14を参照されたい;上付きの「1」は2’−O−メチル置換を示し、「V」はC3スペーサーを示す)。
鎖のそれぞれの、結合に対する寄与を検討するために、修飾dUホスホラミダイトの特注ライブラリーを用いて5位変異体を化学的に合成することによって、別の一連の体系的な点置換を行った。この目的のために、サイズ、極性、H結合のドナー及びアクセプターの配置、リンカーの長さ及び5位置換基の配向を変えることによって各位置の微小環境を探ることが可能になるライブラリーを設計した。この解析のための官能基を選択する際に、元の修飾(この場合ナフチル基)、(トリプトファン及びチロシンのような)抗体の相補性決定領域(CDR)で大きな比率を占めるアミノ酸側鎖(Mian,I.S.et al.(1991)J.Mol.Biol.217:133;Ramaraj,T.et al.(2012)Biochim.Biophys.Acta.1824:520)、及び小分子薬物の「プリビレッジド」断片(17)というテーマに基づいて変異を含むことを目的とした。図15は、Kd値の比(置換/無置換)として表される、これらの置換の結果を示す。10個のNap−dUの位置のそれぞれを試験した17個の異なる修飾置換のうち、4つの置換(Trp−dU27、NE−dU16、MBn−dU10及びBT−dU16)だけが、ほとんどまたは全く結合親和性の影響がなかった。すべての他の置換は、様々な程度に結合親和性を弱くした。
_1アプタマーファミリー内の配列をより完全に評価するために、454ピロシーケンシング技術を使用して、富化されたプールをシーケンスした。454プライマーを用いてプールDNAを増幅し、PCR産物を精製し、Sequal標準化プレート(Invitrogen、カタログ番号A10510−01)を使用して標準化した。溶出液をゲル上で泳動して、各増幅産物のサイズ及び純度を確認した。精製したPCR産物を、454ピロシーケンシング施設(University of Colorado Health Sciences Center in AurorA、CO)でシーケンスした。
せた。プールからの配列データセットは、13,139個の全長配列(すなわち、両方のプライマー配列を含むそうした配列)を含んでおり、そのうちの2,235個がユニークであった。これら2,235個のユニークな配列を、モチーフ5’−CCGPP CAAGP GCPPG PAGGA PPPAA APGG−3’について検索した。このモチーフを含む86個の配列が見つかった。図16に列挙するように、すべての配列について、各位置での4867−31との同一性パーセンテージを計算した。
〔00333〕 標的結合親和性を決定するために、T4ポリヌクレオチドキナーゼ(Ne
w England Biolabs)及びγ−32P−ATP(Perkin Elmer)を使用して、SOMAmerを5’末端標識した。結合アッセイは、約0.03〜0.05nMの濃度の放射標識されたSOMAmer(約20,000c.p.m)及び10−7から10−12Mに及ぶ濃度の標的タンパク質を、1XSB18Tバッファー(40mM HEPES、pH7.5;120mM NaCl;5mM KCl;5mM MgCl2及び0.01%TWEEN−20)中で、37℃で30分間インキュベートすることによって行った。結合した複合体を、Zorbax樹脂と混合し、Duraporeフィルタープレートで捕獲した。結合したSOMAmerの画分をPhosphorImager(FUJI FLA−3000)で定量化した。生の結合データをZorbax樹脂への放射標識されたSOMAmerの非特異的なバックグラウンド結合に対して補正した。平衡解離定数(Kd)を以前に記載されたように(Jellinek et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.90:11227)決定した。
〔00334〕 VEGFの−R2(血管内皮増殖因子受容体2)の細胞性キナーゼ活性に
対するVEGF121 SOMAmerの阻害的影響を解析するために、内生的に高レベルのVEGF R2を発現するヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)(Lonza、#CC−2519)を使用した。HUVEC細胞を、2%FBS、増殖因子(hEGF、ヒドロコルチゾン、VEGF、HFGF−B、R3−IGF−1)、ヘパリン、アスコルビン酸及びGA−1000(ゲンタマイシン、アンホテリシン−B)を含むEGM−2 BulletKit(#CC−3162)を補充したEGM−2(内皮細胞増殖培地)に蒔いた。HUVEC細胞が70から80%コンフルエンスに達したら、この細胞を24ウェルプレートに蒔き(105細胞/ウェル)、血清フリー培地で一晩飢餓させた。
Aを含む20ng/mL(1nM)のVEGF−121(R&D System、#4464−VS)を有する培養物に、37℃で30分間加えた。細胞をPBS中で2回洗浄し、プレインキュベートしたVEGF−121/SOMAmer複合体で5分間刺激した。処理した細胞をPBSで2回再び洗浄し、Haltホスファターゼインヒビター(Thermo Scientific、#78428)を補充した氷冷の溶解バッファー(1%NP−40代替品、20mM Tris(pH8.0)、137mM NaCl、10%グリセロール、2mM EDTA、1mM活性化オルトバナジウム酸ナトリウム、10μg/mLアプロチニン及び10μg/mLロイペプチンを加えた。ヒトホスホ−VEGF R2/KDRキット(R&D、DYC1766−2)を使用して、VEGF R2のリン酸化について細胞可溶化物を測定した。
ローン4867−31の様々なトランケート変異体は、不死化したまたは初代のヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)においてVEGF−121またはVEGF−165(1〜4nM)によって誘導されるVEGFR2のリン酸化を、本質的に完全に阻害することができる。VEGFアプタマー4867−31_43及び4867−31_192について、IC50測定の代表的なプロットを図17に示し、それぞれ2.2nM及び2.1nMのIC50値を有する。
度(一般に20nM)のSOMAmer変異体以外は上記と同じ条件下で、HUVECにおけるVEGF誘導性VEGF R2リン酸化の阻害パーセントを評価した。
〔00338〕 PDGF−BBとVEGFの両方とも、チロシンキナーゼ受容体を二量体
させて受容体の自己リン酸化及びシグナル伝達を導くことによって生物学的効果を発揮する、ジスルフィド結合したホモ二量体である。PDGF−BBアプタマー4149−8_260の場合のように(結晶構造に基づく)、1つを超えるアプタマーがそのタンパク質標的に結合することができる場合、そうしたアプタマーは、タンパク質への個々のアプタマーサブユニットの同時結合を可能にするように、多量体構築物において共有結合され得る。これは、結合活性効果を介して親和性の向上につながり得る。容易に利用可能な化学反応に基づいて、2つのタイプのホモ二量体を合成した。これらは、1)Hegあたり約20Åの距離を与える0から6つのHegリンカーによって結合した頭−尾のホモ二量体、及び2)それぞれの側で1つから3つのHeg(すなわち、二量体において2つ、4つまたは6つのHeg総数)と組み合わせられた、合成ダブラーサポートを介して結合した、3’−3’ホモ二量体。4149−8_379、5169−4_26及び4867−31_192のホモ二量体を競合結合アッセイで試験した。競合物の結合親和性の決定のために、T4ポリヌクレオチドキナーゼ(New England Biolabs)及びγ−32P−ATP(Perkin Elmer)を使用して、アプタマーリガンドを5’末端標識した。競合アッセイは、固定濃度の放射標識されたリガンド(1.0nM)を様々な濃度の競合物のアプタマー(10−11から10−6M)と前もって混合することによって行った。リガンドと競合物の希釈物を、標的タンパク質(100pM)とともに、1XSB18Tバッファー(40mM HEPES、pH7.5;120mM NaCl;5mM KCl;5mM MgCl2及び0.01%TWEEN−20)中で、37℃で60分間インキュベートした。結合した複合体を、Zorbax樹脂と混合し、Duraporeフィルタープレートで捕獲した。結合したリガンドの画分をPhosphorImager(FUJI FLA−3000)で定量化した。生の結合データを、競合物の添加なしの結合に対して標準化した。データをGraphPad Prism3.0でプロットし、非線形回帰を使用して一部位競合曲線に当てはめて、競合物のアプタマー(Ki)について平衡解離定数を決定した。
PDGFホモ二量体:配列4149−8_379(配列4149−8_438から4149−8_447まで)及び5169−4_26(配列5169−4_134から5169−4_143まで)のPDGFホモ二量体の構造を表15に示す。4149−8_379ベースのホモ二量体については、競合アッセイで得られたKi値によって、5’−3’の立体配置において、より長いリンカーが望ましいことが示唆され、これは、Hegリンカーなしと比較して、5つのHegリンカーで10倍を越える結合親和性の向上が測定された(それぞれ0.25pM対4.2pM)ためである。3’−3’結合した4149−8_379ホモ二量体では、より長い4つ及び6つのHegリンカーも、リンカーなしより少なくとも10倍よく、2つのHegリンカーよりも約2倍よく機能した。5169−4_26ベースのホモ二量体については、Ki値によって、より長いHegリンカーは5’−3’の立体配置において有利であることが示され、これは、Kiが、Hegリンカーなしについての28pMから6つのHegリンカーについての3.6pMへ向上したからである。5’−3’の立体配置において、5つと6つのHegリンカーについてのKi値の違いはなかった。3’−3’結合した5169−4_26ベースのホモ二量体では、同じパターンが観察され、Hegリンカーの長さが伸びるに従ってKiが向上した。これら6つのHegリンカーは、Hegリンカーなしと比較して5倍のKiの向上を示した(それぞれ2.0pM対11pM)。表15及び16では、Z=ベンジル−デオキシウリジン(Bn−dU)であり、P=5−ナフタレン修飾dU(Nap−dU)であり、M=メチレンジオキシベンジル−dU(MBn−dU)であり、上付きの1は2’−O−メチル修飾ヌクレオシドを示し、上付なしはデオキシリボヌクレオチドを示し、「C3」は3炭素リンカーを示し、「H」はヘキサエチレングリコールリンカーを示す。
〔00339〕 PDGFアプタマー4149−8及びVEGFアプタマー4867−31
に基づくヘテロ二量体。
PDGF及びVEGFに対して特異性を有する構築物を開発することを目的として、PDGFアプタマーに結合したVEGFアプタマーを含む様々なアプタマー構築物を設計し、試験した。試験した第1のアプタマー構築物は、PDGF変異体4149−8_273とVEGF 4867−31_183を組み合わせた。アプタマー構築物を頭−尾で合成し、両方の配向(5’末端にPDGFアプタマーまたは5’末端にVEGFアプタマーのいずれかを有する)で、0から3つのヘキサエチレングリコール(Heg)リンカーによって結合した。結果を以下の表17及び18に示す。表17では、「Z」はBn−dUを示し、「P」はNap−dUを示し、上付きの「1」は2’−O−メチル置換を示し、上付なしはデオキシリボヌクレオチドを示し、「V」はC3スペーサーを示し、「H」はヘキサエチレングリコール(Heg)リンカーを示す。表18では、残存活性パーセントは、対照(アプタマーなし)と比較した、20nMアプタマーの存在下でのHs27線維芽細胞における分画のPDGF βRリン酸化レベルを示す。
る結合親和性に基づくと、アプタマー構築物4149−8_320は、この実験において最もよい結果をもたらすように思えた。表18で示すように、PDGF細胞性リン酸化アッセイでもアプタマー構築物を試験した。機能的アッセイのデータに基づくと、試験したすべてのアプタマー構築物は、Hs27線維芽細胞において、PDGF−BB誘導性PDGF βRリン酸化を阻害した。アプタマー構築物4149−8_313、4149−8_314、4149−8_315、4149−8_316、4149−8_319及び4149−8_320は、PDGF−BB誘導性PDGF βRリン酸化を20nM未満のIC50値で阻害した。アプタマー構築物4149−8_317及び4149−8_318は、約20nMのIC50値を有していた。
配置に基づいて、PDGFアプタマー4149−8_379及びVEGFアプタマー4867−31_192を含む4149−8_401を合成した。表19を参照されたい。こ
の表では、「Z」はBn−dUを示し、「P」はNap−dUを示し、MはMBn−dUを示し、上付きの「1」は2’−O−メチル置換を示し、上付なしはデオキシリボヌクレオチドを示し、「C3」はC3スペーサーを示し、「H」はヘキサエチレングリコール(Heg)リンカーを示す。アプタマー構築物4149−8_401は、その前駆体アプタマー構築物、4149−8_320と同等以上の、PDGF−BB及びVEGF121に対する結合親和性を示した。表20を参照されたい。
s27線維芽細胞において、それぞれ約1nM及び5nMのIC50値でPDGF−BB誘導性PDGF−Rβリン酸化を阻害した。さらに、20kDaまたは40kDaのPEGのいずれかにコンジュゲートした5’アミノリンカーを含むアプタマー構築物4149−8_401は、Hs27線維芽細胞において、約1nMのIC50値でPDGF−BB誘導性PDGF−Rβリン酸化を阻害する能力を維持した。これらの結果は、アッセイにおけるすべてのPDGF(1nMの単量体)の化学量論的タイトレーション/阻害と一致する。
セットのアプタマー構築物を試験して、全体的なリンカーの長さ並びにPDGF及びVEGFアプタマーの配向の影響を決定した。以下の表21を参照されたい。5’末端にVEGFを用いて、1つから6つのHegリンカーを試験した。5’末端にPDGFを用いて、3つのHegリンカーを有する4149−8_401を含めて、2つから6つのHegリンカーを試験した。1つのHegリンカー変異体は、関連した変異体である4149−8_318において、やや低減した結合を示したので、この配向で試験しなかった。結合データを表16に示す。PDGF−BBに対してやや弱い親和性を示した4149−8_408及び4149−8_409を除いて、アプタマー構築物の大部分はよく機能した。比較のために、OphthotechのアプタマーE10030(Fovista)の結合親和性を含める。
GFの両方の活性を阻害する能力を、上記の受容体リン酸化実験で試験した。アプタマー構築物4149−8_401は、PDGF単量体4149−8_379のものに匹敵する効力で(それぞれ2.4nM及び1.7nMのIC50値)、Hs27線維芽細胞においてPDGF誘導性PDGFRβリン酸化を阻害した。同様に、アプタマー構築物4149−8_401は、VEGF単量体4867−31_192のものに匹敵する効力で(それぞれ0.7nM及び2.1nMのIC50値)、HUVEC細胞においてVEGF誘導性VEGFR2リン酸化を阻害した。図18は、この実験の結果を示す。図18Aは、(A)PDGFアプタマー4149−8_379(白丸)及びPDGF/VEGFアプタマー構築物4149−8_401(黒丸)を用いた、Hs27線維芽細胞におけるPDGF誘導性PDGF Rβリン酸化の阻害、並びに(B)VEGFアプタマー4867−31_192(白丸)及びPDGF/VEGFアプタマー構築物4149−8_401(黒丸)を用いた、HUVECにおけるVEGF誘導性VEGF R2リン酸化の阻害を示す。
に基づくヘテロ二量体。
PDGFアプタマー5169−4_26及びVEGFアプタマー4867−31_192の変異体に基づくさらなるヘテロ二量体構築物を設計し、試験した。アプタマー構築物を頭−尾で合成し、両方の配向(5’末端にPDGFアプタマーまたは5’末端にVEGFアプタマーのいずれかを有する)で、1つから6つのヘキサエチレングリコール(Heg)リンカーによって結合した。表22に結果を示す。5’末端にVEGFを用いると、3つから6つの間のHegリンカーが最も高い親和性をもたらした。VEGF−121アプタマー配列が3’末端にある時は一般に親和性はわずかに低く、56pMのKdを有していた5つのHegリンカー配列を除いて、大部分のKd値は100〜300pMの範囲に入った。5’末端にPDGFを用いると、Kd値は、3つのHegリンカーに対する11pMから4つのHegリンカーに対する0.54pMまでに及び、残りのKd値は、すべての他のHegリンカーの長さの間に入った。PDGFが3’末端にある場合は、リンカーの長さが伸びるに従って、より高い結合親和性に向かうトレンドがあり、1つのHegリンカーは5.3pMのKdを有し、6つのHegリンカーは0.20pMのKdを有していた。表22では、「P」はNap−dUを示し、上付きの「1」は2’−O−メチル置換を示し、上付なしはデオキシリボヌクレオチドを示し、「H」はヘキサエチレングリコール(Heg)リンカーを示す。
〔00346〕 PDGF/VEGFアプタマー構築物が同時にVEGF及びPDGFに結
合する能力を実証するために、サンドイッチアッセイを開発した。手短に言えば、Nunc Maxisorp(登録商標)プレートをヒトPDGF−BBまたはヒトVEGF−121(20ng/mL)のいずれかでコーティングした。1%BSA溶液でウェルをブロッキングしてから、PDGF/VEGFアプタマー構築物を加え(10nM)、吸着したタンパク質標的に結合させた。洗浄してから、ビオチン標識された相補的タンパク質(VEGF−121をコーティングしたプレートに対して2nMのPDGF−BB及びPDGF−BBをコーティングしたプレートに対して2nMのVEGF−121またはVEGF−165)を結合させて、3元複合体を形成した。さらに洗浄してから、西洋ワサビペルオキシダーゼをコンジュゲートしたストレプトアビジン(HRP−SA)を加えて、4元複合体を形成させた。最終的な洗浄の後、製造業者の指示に従って(Thermo Scientific TMB基質キット34021)発色性の西洋ワサビペルオキシダーゼ基質を加え、適切な時に1.6M H2SO4を添加して反応を停止した。ウェルあたりの450nmでの吸光度を、Spectramax M5プレートリーダーを用いて自動検査(auto check on)で測定した。上記の方法と並行して、4元複合体を構成する4成分のうちの1つを除いた、一連の4つの対照実験を行った。
(20kDa PEG−N−4149−8_401)は、ヒトVEGF−121及びPDGF−BBに同時に結合することができた。4元複合体のすべての成分が加えられた(完全)場合に強いシグナルが観察されたが、4成分のうちのいずれか1つを欠くと、バックグラウンドまたはバックグラウンド近くのシグナルになった。PDGFをコーティングしたプレート及びVEGFをコーティングしたプレートで同様の結果が得られ、これは、アプタマー構築物へのタンパク質添加の順序は問題とならなかったことを示す。図19で示すように、SL1012はヒトVEGF−165及びPDGF−BBに同時に結合することができた。図19Aは、ビオチン標識PDGFを加えた、VEGFでコーティングされたマイクロタイタープレートを示す。図19Bは、ビオチン標識VEGFを加えた、PDGFでコーティングされたマイクロタイタープレートを示す。データは、平均+95%信頼区間(n=3)として示す。4元複合体のすべての成分が加えられた(完全)場合に強いシグナルが観察されたが、成分のうちのいずれかを除くと、バックグラウンドまたはバックグラウンド近くのシグナルになった。データは、アプタマー構築物の5’末端へのPEG部分の付加は、同時結合活性を妨げないことも示す。
−N−4149−8−401)へのヒトVEGF−165及びヒトPDGF−BBの同時結合を図20に示す。マイクロタイタープレートを、ビオチン標識VEGFを加えてPDGFでコーティングした。完全は、4元複合体のすべての成分の添加を意味し、4成分の
うちの1つがない各条件をグラフに示す。データは、平均+95%信頼区間(n=3)として示す。
った。先の結果によって、シグナルを生成するのに複合体の他の成分が必要であることが示されたので、この実験では、アプタマーなしの対照のみを含む。図21で示すように、アプタマー構築物4149−8_317、4149−8_318、4149−8_320、4149−8_401及び4149−8_414は、タンパク質添加の順序にかかわらず、PDGFとVEGFに同時に結合した。図21(A)は、ビオチン標識PDGFを加えた、VEGFでコーティングされたマイクロタイタープレートを示し、図21(B)は、ビオチン標識PDGFを加えた、PDGFでコーティングされたマイクロタイタープレートを示す。
PDGFアプタマー5169−4及びVEGFアプタマー4867−31の変異体に基づくヘテロ二量体構築物の同時結合に関するデータを加える。
〔00350〕 アプタマー及びアプタマー構築物が眼の中でどのように挙動するかを理解
するために、最初の眼薬物動態試験を行った。表23で示すように、4つのアプタマー及びアプタマー構築物を試験した。
ホワイトウサギの両眼(10個の眼)に単回の硝子体内注射を行った。0.5mg/眼の用量(SL1010及びSL1011)または1.0mg/眼の用量(SL1012及びSL1013)のいずれかを動物に与えた。これらの用量は、アプタマーまたはアプタマー構築物の重量のみに相当する(PEGの重量は計算から除外した)。すべての試験物は、リン酸緩衝食塩水に製剤化した。各アプタマーまたはアプタマー構築物の試験物について、投与後2、24、48、96または192時間目に1動物の両眼から硝子体液試料を収集した。硝子体液試料は、アッセイするまで凍結保存した。
ル(nm)の吸光度による検出で、超高速液体クロマトグラフィー(UPLC)アッセイ法によって測定した。手短に言えば、硝子体ヒドロゲルを、20ゲージの針を数回通過させることによって剪断した。2倍量の2−エトキシエタノールを添加することによって、硝子体タンパク質を沈殿させた。遠心分離に続いて、上清を回収し、Acquity(登録商標)C18カラム(0.2×100mm)に注入した。カラム温度は80℃であり、流速は0.2mL/分で維持した。バッファーAは、TEAA pH7.0及び5%アセトニトリルから成っていた。バッファーBは、100%アセトニトリルから成っていた。プログラムは試料注入後1分間50%バッファーBを保持し、次いで、バッファーBを4分にわたり直線的に70%まで増大させた。260nMの吸光度によって検出した。既知の濃度のアプタマーまたはアプタマー構築物で作成された検量線によって得られたものに対して未知試料のピーク吸光度ユニットを補間することによって、硝子体液中のアプタマーまたはアプタマー構築物の濃度(遊離酸当量)を決定した。
10、SL1011、SL1012及びSL1013についてそれぞれ105、47、69及び92時間の硝子体半減期が推定された。表25は、結果を95%信頼区間とともに示す。
例えば、Macugen(83時間、Eyetech Study Group(2002)Retina 22:143)及びLucentis(70時間、Gaudreault et al.(2007)Retina 27:1260)のNZWウサギにおける半減期に引けを取らない。したがって、これらのアプタマー及びアプタマー構築物は、AMD及び糖尿病性網膜症などの眼部疾患の治療に有用であり得る。
〔00356〕本実施例は、続行する実施例で使用される一般的な方法及び材料の概要を提供
する。
〔00357〕 質量分析(LCMS)に連結した液体クロマトグラフィーによるヌクレアー
ゼ感受性部位の決定: DNase Iによる消化のために、ポリアクリルアミドゲル精製したアプタマー(500nMの終濃度)を、150μLの全反応量で、ヌクレアーゼバッファー(510mM Tris HCl pH7.6、2.5mM MgCl2、0.5mM CaCl2)において37℃で、組換えヒトDNase I(Cell Sciences、カタログ番号CSI10719)(4149−8_379に対して0.3ユニット及び5169−4_146に対して3ユニット)とともにインキュベートした。0、30及び60分にアリコート(50μL)を収集し、95℃で5分間インキュベートして反応を終了した。DNase IIでの消化のために、500nMのゲル精製されたアプタマーを、150μLの全反応量で、ヌクレアーゼバッファー(100mM酢酸ナトリウムpH4.6、2mM MgCl2、15mM NaCl)において37℃で、ブタDNase II(Worthington Biochemical Corporation)(4867−31_192に対して18ユニット、4149−8_379に対して1ユニット)とともにインキュベートした。アリコートを収集し、上記のように反応を停止した。4867−31_192及び4149−8_379の5’−アミンを含むバージョン及び5169−4_146の5’−OHを含むバージョンをこれらの実験に利用した。
フィーによって分離し、紫外吸光度及び質量分析(LCMS)で検出した。手短に言えば、真空脱ガス装置(型番G1322A)、オートサンプラー(型番G1313A)、バイナリーポンプモジュール(型番G1312A)、温度コントロールを有するカラムマネージャー(型番G1316A)及び可変波長検出器(型番G1314A))を備えた、Bruker Esquire 3000イオントラップ質量分析計に連結されたAgilent 1100 HPLCから成るLCMSシステムで試料を解析した。LCMSの実施は、Agilent Chemstation(登録商標)ソフトウェア(バージョンB.01.03)を用いて行った。クロマトグラフィーは、Hamilton PRP−3、2.1×150mmカラムを使用して80℃で行った。移動相Aは、10mMピペリジン及び10mMイミダゾール、pH約10(調整されていない)を含んでおり;移動相Bは、75/25のアセトニトリル/水中に10mMピペリジン及び10mMイミダゾールを含んでいた。流速は0.25mL/分であり、傾斜容出は0〜1分:0%B;1〜20分:0〜53%Bであった。試料(20μL)を注入し、吸光度を254nMで測定した。典型的な質量分析検出のソース条件は以下のようであった:負イオンエレクトロスプレーイオン化モード、50psiでのネブライザー圧力、7L/分での乾燥ガス、ソース温度を325℃に設定、及びキャピラリー電圧を3000Vに設定。トラップ条件は、スキャン範囲200から2200m/z、蓄積時間50ミリ秒、トラップドライブ92、平均化25スペクトルであった。
用してデータを処理した。TICにおいて観察されたピークの全域にわたって合計し、Svitsky−Golayアルゴリズム(スムージング幅=0.8m/z、サイクル=2)を使用してスムージングすることによって、マススペクトルを得た。Daltonicsソフトウェア内のアルゴリズムを使用して、スペクトルをデコンヴォルーションした。パラメーターは、2000〜30000Daの間の質量範囲、10%の存在量カットオフ(abundance cutoff)、3の成分の最小ピーク(minimum peaks in component of 3)及び0.05%の分子量の一致(molecular weight agreement)を含んでいた。
リアクリルアミドゲル精製アプタマーを、100μLの全反応量で、ヌクレアーゼバッファー(10mM Tris HCl pH7.6、2.5mM MgCl2、0.5mM CaCl2)において37℃で、2または10ユニット/mLの組換えヒトDNase I(Cell Sciences、カタログ番号CSI10719)とともにインキュベートした。様々な時間で、20μLのアリコートを収集し、等量の2×ゲルローディングバッファー(93.85%ホルムアミド、0.03%SDS、20mM Na2EDTA、0.01%キシレンシラノール及び0.01%オレンジG)を加えて反応を停止し、95℃で2分間加熱した。試料を15%TBEポリアクリルアミド変性ゲル(8M尿素)にロードし、200Vで20分間電気泳動を行った。約2μMのSYBR(登録商標)Gold(Molecular Probes、カタログ番号S11494)で10分間ゲルを染色して、バンドを可視化た。FlourChem(登録商標)Q解析ソフトウェア(Alpha Innotech)を使用して、各時点での残存全長アプタマーの量を定量化した。必要に応じて、バックグラウンド除去の後に各バンドの強度を測定し、データを、0時点での全長投入DNAの残存パーセンテージとして示す。5’末端アミンを持つアプタマー4149−8_379を除いて、5’末端にヒドロキシルを有するアプタマーをこれらの実験に利用した。
ポリアクリルアミドゲル精製アプタマーを、100μLの全反応量で、ヌクレアーゼバッファー(0.1M NaOAc pH4.6、2.0mM MgCl2、15mM NaCl2)において37℃で、120ユニット/mLまたは240ユニット/mLのブタDNase II(Worthington Biochemical Corporation)とともにインキュベートした。様々な時間で、20μLのアリコートを収集し、等量の2×ゲルローディングバッファー(93.85%ホルムアミド、0.03%SDS、20mM Na2EDTA、0.01%キシレンシラノール及び0.01%オレンジG)を加えて反応を停止し、95℃で2分間加熱した。試料を15%TBEポリアクリルアミド変性ゲル(8M尿素)にロードし、200Vで20分間電気泳動を行った。約2μMのSYBR(登録商標)Gold((Molecular Probes、カタログ番号S11494)で10分間ゲルを染色して、バンドを可視化した。FlourChem(登録商標)Q解析ソフトウェア(Alpha Innotech)を使用して、各時点での残存全長SOMAmerの量を、定量化した。必要に応じて、バックグラウンド除去後に各バンドの強度を測定し、データを、0時点での全長投入DNAの残存パーセンテージとして示す。5’末端アミンを持つアプタマー4149−8_379を除いて、5’末端にヒドロキシルを有するアプタマーをこれらの実験に利用した。
ンドホワイトウサギ由来の90%のプールされた硝子体液(Bioreclamation IIC、カタログ番号RAB−VITHUM中で、500nMの終濃度のポリアクリルアミドゲル精製アプタマーをインキュベートした。試料を、200μLの全反応量で、
37℃でインキュベートした(試料は、0.067%の終濃度のリン酸緩衝食塩水も含んでいた)。様々な時点で、20μLのアリコートを収集し、等量の2×ゲルローディングバッファー(93.85%ホルムアミド、0.03%SDS、20mM Na2EDTA、0.01%キシレンシラノール及び0.01%オレンジG)を加えて、反応を停止した。処理するまで試料を−20℃で貯蔵した。各試料に100μLの水を加え、続いて、150μLの25:24:1フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール(AMRESCO)を加えた。試料を混合し、16,100×gで15分間遠心分離した。水相を収集し、ゲル解析まで−20℃で凍結した。試料(15μL)を15%TBEポリアクリルアミド変性ゲル(8M尿素)にロードし、電気泳動を約20分間200Vで行った。約2μMのSYBR(登録商標)Gold((Molecular Probes、カタログ番号S11494)で10分間ゲルを染色して、バンドを可視化した。FlourChem(登録商標)Q解析ソフトウェア(Alpha Innotech)を使用して、各時点での残存全長SOMAmerの量を定量化した。必要に応じて、バックグラウンド除去後に各バンドの強度を測定し、データを、0時点での全長投入DNAの残存パーセンテージとして示す。
land Biolabs)及びγ−[32P]ATP(Perkin Elmer)を使用して、競合結合アッセイでリガンドとして使用されるアプタマーを5’末端標識した。非標識競合物(10−6から10−11Mに及ぶ濃度)と等量の2nMのリガンドとを1×SB18Tバッファー[40mM Hepes(pH7.5)、120mM NaCl、5mM KCl、5mM MgCl2及び0.01%TWEEN−20]中で混ぜることによって、競合アッセイを行った。1×SB18Tバッファーに入れた200pMの濃度のヒトPDGF−BB(Creative Biomart)をリガンド/競合物の混合物に加え、反応物を37℃で40分間インキュベートした。結合した複合体を、Zorbax(登録商標)樹脂(Agilent Technologies)と混合し、Durapore(登録商標)フィルタープレートで捕獲した。各ウェルのシグナルをPhosphorImager(FUJI FLA−3000)で定量化した。生の結合データをバックグラウンドシグナルに対して補正し、競合物なしに関する結合画分に対して標準化した。阻害定数(Ki)を決定するために、GraphPad Prism(登録商標)6でデータをプロットし、一部位競合曲線に当てはめた。
〔00364〕 本実施例は、アプタマーのヌクレアーゼ安定性を向上する、VEGFアプ
タマーに適用される化学修飾を提供する。本実施例では、アプタマーに関して以下の省略形を使用する:PはNapdUであり、2’−OMeは2’−O−メチルヌクレオチドである。ヒト血管内皮増殖因子(VEGF)に結合するように選択されたNapdU含有低オフ速度修飾アプタマー(SOMAmer)のヌクレアーゼ抵抗性を増強するために、VEGFタンパク質への結合が顕著に影響されないヌクレオチドの位置に2’−O−メチル(2’−OMe)基を付加した。これらの試みによって、29ヌクレオチド配列内に9個の2’−OMe基を含むアプタマー4867−31_192が発見された。4867−31_192におけるNap−dU ヌクレオチド、2’−OMe置換及び3’末端での逆位デオキシチミジンの付加の使用は、共に、未修飾DNAと比較してかなりの程度のヌクレアーゼ保護を与える。それにもかかわらず、いくつかのヌクレアーゼの存在下で、4867−31_192はまだ十分に安定的でない。例えば、ヒト組換えDNase Iに対して安定的である一方(図23A)、4867−31_192はブタDNase IIによって消化される(図23B)。図23Bで示すように、全長アプタマーの量の経時的低下は、DNase IIによる消化に対する感受性を示す。
I感受性切断部位の位置(複数可)を、実施例14に記載されているようにブタDNase IIとともにインキュベーションした後に、質量分析によって同定した(データ非表示)。アプタマー4867−31_192(3’末端での逆位デオキシチミジンの付加を有する)については、2つの主な断片を同定した。断片1はヌクレオチド1から24までを含んでいたが、断片2はヌクレオチド1から25までを含んでいた。したがって、表27で示すように、ヌクレオチド位置24及び25、25及び26並びに26及び27の間の様々な組み合わせでホスホロチオエート結合でホスホジエステル結合を置換した一連のアプタマーを作出した。顕著に影響を受けた結合がないので、これらの位置の3つすべてにおける置換は受け入れられた(表26)。位置1での2’−OMeシトシンの付加の有無にかかわらず、ホスホロチオエート置換を試験した(表27)。ヌクレアーゼ安定性実験については、その後のすべてのアプタマーは、3’末端の逆位デオキシチミジンを含めて、研究した。
討し、図24にデータを示す。位置24及び25並びに25及び26の間にホスホロチオエート結合を有する、試験したすべてのアプタマーは、これら2つの位置で修飾されていないアプタマーよりも、このアッセイで安定的であった。このトレンドは、位置1の2’−OMeを有するまたは有さないアプタマーについて観察された。
エート結合を有するアプタマーのサブセットを、90%ウサギ硝子体液中での安定性について次に試験した(図25)。本発明者らは、眼部障害を治療するための、VEGF及びPDGFに対するアプタマーベースのアンタゴニストの開発を考えているので、硝子体液における安定性は、その治療的有効性と関係がある。残存全長アプタマーのパーセント対インキュベーション時間のプロット(図25)に例示するように、ホスホロチオエート結合で修飾されたすべてのアプタマーは、4867−31_192(ホスホロチオエート結合を有さない)よりも、この生体マトリックスにおいて安定的(192時間)であった。
実験を行って、ヒトVEGF121タンパク質への結合について各アプタマーを試験した。試験したすべての配列は、標的への高親和性結合を保持していた。この実験で得られた解離定数(Kd値)を表27に示す。
テージ対DNase IIでのインキュベーション時間を示す。アプタマー識別番号(アプタマーID番号)で示されるアプタマー(すべて250nM)を、指定の時間数にわたって37℃で、0.24ユニット/μLのDNase IIとともにインキュベートし、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって消化産物を分離した。デンシトメトリーで測定して、残存全長アプタマーのパーセンテージ対インキュベーション時間をプロットした。図24のアプタマーID番号4867−31_192に対するプロットは、図23Bで示すものと同じプロットである。
テージ対硝子体液におけるインキュベーション時間を示す。アプタマー識別番号(アプタマーID番号)で示されるアプタマー(すべて500nM)をニュージーランドホワイトウサギから得られた90%硝子体液において、指定の時間数にわたって37℃でインキュベートした。アプタマーをポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離した。図25は、デンシトメトリーで測定した、各全長アプタマーバンドの残存パーセント対時間を示す。
可)を有する4867−31アプタマーは、4867−31アプタマーホスホロチオエート結合(複数可)なしよりもヌクレアーゼ消化に対する感受性が低く、さらに、ホスホロチオエート結合(複数可)を有する4867−31アプタマーは、VEGFタンパク質標的に対する結合親和性を保持することを示す。
〔00373〕 本実施例は、アプタマーのヌクレアーゼ安定性を向上する、PDGFアプ
タマー(例えば5169−4)に適用される化学修飾を提供する。本実施例では、アプタマーに関して以下の省略形を使用する:PはNapdUであり、2’−OMeは2’−O−メチルヌクレオチドである。
NapdU含有低オフ速度修飾アプタマー(SOMAmer)のヌクレアーゼ抵抗性を増強するために、2’−O−メチル基(2’−OMe)を、PDGFタンパク質への結合が影響を受けないか、最小限の影響しか受けないヌクレオチド位置に付加した。これらの試みによって、21ヌクレオチド配列内に11個の2’−OMe基を含むアプタマー5169−4_146が発見された。これらの11個の2’−OMe修飾及び3’末端の逆位デオキシチミジンを用いると、5169−4_146はDNase IIに対して安定的であるが、DNAse Iに対しては安定的でない(図26)。したがって、DNase IよりもDNase IIに対して感受性である、実施例15に記載されているVEGFアプタマー4867−31_192と対照的に、PDGF−BBアプタマー5169−4_146は、DNase IIと比較してDNase Iに対してより高い感受性を示す。換言すれば、DNase IIではなくDNase Iに対する5169−4_146の感受性は、実施例15で見つかった結果と逆であり、ヌクレアーゼに対するアプタマーの感受性が予測不可能であることを示す。これは、特定のヌクレアーゼによる分解への固有の感受性を予測することができず、実験的に決定しなければらなないことを示唆する。一旦特定のヌクレアーゼに対するこの感受性が決定されれば、残りの感受性の位置でのさらなるホスホロチオエート置換によって、さらなる安定性が達成される可能性がある。図26Aで示すように、全長アプタマーの経時的低下は、DNase Iによる消化に対す
る感受性を示す。
、実施例14に記載されているように、指定の時間数にわたって37℃で、0.01ユニット/μLのDNase I(図26A)または0.12ユニット/μLのDNase II(図26B)とともにインキュベートし、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって消化産物を分離した。デンシトメトリーで測定して、残存全長アプタマーのパーセンテージ対インキュベーション時間をプロットした。
の実現可能性を判定するために、どの位置がアプタマーPDGFへの結合に顕著に影響を与えることなくホスホロチオエートを受容することができるを決定する目的で、「ホスホロチオエートウォーク」実験を5169−4_146について行った。このウォークの結果を表28に示す。試験したすべてのアプタマーは、3’末端に逆位デオキシチミジンを含んでいた。ホスホロチオエート置換は、5169−4_146配列のすべての位置で許容性に優れていた。PDGFへの結合の最大の悪化は1.8倍の親和性の低減であった(5169−4_154)。
ミジンを有する)のDNase Iによる切断に対して感受性であるヌクレオチドの位置を質量分析によって同定し、これらの最も感受性の「ヌクレアーゼ部位」は、天然の3’−ホスホジエステル結合の代わりの3’−ホスホロチオエート結合の置換によって保護されていた。
の消化後にいくつかの断片を同定した。これらの断片によって、ヌクレオチド位置9及び10;10及び11;11及び12;並びに12及び13の間の、DNase I感受性部位が明らかとなった。したがって、これらの4つの位置でホスホジエステルをホスホロチオエート結合で置換し、アプタマー5169−4_182と称されるアプタマーを作出した(表29)。これらのアプタマーを、3’末端での逆位デオキシチミジンを含めて、ヌクレアーゼ抵抗性について試験した。前の場合と同様に、DNase Iに対する感受性を検討した(図27)。ホスホロチオエート含有アプタマーは、5169−4_146よりも明らかに安定的であった。
、実施例14に記載されているように、指定の時間数にわたって37℃で、0.01ユニット/μLのDNase Iとともにインキュベートし、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって消化産物を分離した。SYBR goldでバンドを可視化し、デンシトメトリーで測定して、残存全長アプタマーのパーセンテージ対インキュベーション時間をプロットした。
た(図28)。残存全長アプタマーのパーセント対インキュベーション時間のプロット(図28)に図示するように、アプタマー5169−4_182(ホスホロチオエート結合を有する)は、5169−4_146(ホスホロチオエート結合を有さない)よりも、この生体マトリックスにおいて安定的であった。
ンドホワイトウサギから得られた90%硝子体液において、示されたアプタマー(500nM)を指定の時間数にわたって37℃でインキュベートした。ポリアクリルアミドゲル
電気泳動によってアプタマーを可視化した。図28は、デンシトメトリーで測定した、各全長アプタマーバンドの残存パーセント(SOMAmer)対時間を示す。
たが、5169−4_182のDNase I消化産物は、はっきりと見えた(データ非表示)。実施例14に記載されている質量分析を使用して、この主な消化産物の切断部位をヌクレオチド位置4と5の間として同定した。ヌクレオチドの位置4は2’−OMe部分によって既に保護されていたので、これは驚くべきことであった(表29)。この結果は、2’−OMe置換されたヌクレオチドに隣接するホスホジエステル結合を切断することができるヌクレアーゼが存在するという事実を示す。それにもかかわらず、3’−ホスホロチオエート結合で、5169−4_182のヌクレオチド位置4と5の間の天然のホスホジエステル結合を置換して、アプタマー5169−4_188が作出された(表29)。前の場合と同様に、DNase Iに対する感受性を検討した(図29)。アプタマー5169−4_182及び5169−4_188は、5169−4_146より安定的であった。5169−4_188のヌクレオチド4と5の間のホスホロチオエート結合の付加によって、5169−4_182(データ非表示)について観察された安定的消化産物の出現が排除され、これによって、DNase Iに対してより安定になった(図29)。
れるアプタマーを、実施例14に記載されているように、指定の時間数にわたって37℃で0.01ユニット/μLのDNase Iとともにインキュベートし、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって消化産物を分離した。SYBR goldでバンドを可視化し、デンシトメトリーで測定して、残存全長アプタマーのパーセンテージ対インキュベーション時間をプロットした。
実験を行って、ヒトPDGFBBタンパク質に対する各アプタマーの親和性を決定した。試験したすべての配列は、標的への高親和性結合を保持していた。この実験で得られた解離定数(Kd値)を表29に示す。
可)を有する5169−4アプタマーは、ホスホロチオエート結合(複数可)を有さない5169−4アプタマーよりもヌクレアーゼ消化に対する感受性が低く、さらに、ホスホロチオエート結合(複数可)を有する5169−4アプタマーは、PDGFタンパク質標的に対する結合親和性を保持することを示す。
〔00386〕 本実施例は、アプタマーのヌクレアーゼ安定性を向上する、PDGFアプ
タマー(例えば、4149−8)に適用される化学修飾を提供する。本実施例では、アプタマーに関して以下の省略形を使用する:PはNapdUであり;2’−OMeは2’−O−メチルヌクレオチドであり;BnはベンジルdU(BndU)であり;Mはメトキシベンジル(MBndU)であり;Vは3炭素スペーサーであり;iはiBudUである。
ndU含有低オフ速度修飾アプタマー(SOMAmer)のヌクレアーゼ抵抗性を増強するために、2’−O−メチル(2’−OMe)基を、PDGFタンパク質への結合が顕著に影響されないヌクレオチド位置に付加した。これらの試みによって、24ヌクレオチド配列内に7個の2’−OMe基を含むアプタマー4149−8_379が発見された。こ
れら7個の2’−OMe修飾を用いてさえも、4149−8_379は、まだヌクレアーゼ消化に耐性でない。例えば、組換えヒトDNase I(データ非表示)及びブタDNase II(図30)で4149−8_379を消化することができる。図30で示すように、全長アプタマーの経時的低下は、DNase IIによる消化に対する感受性を示す。4149−8_379についての、DNase I及びDNase IIの両方に対するこの感受性は、実施例15及び16に関して見られたものと異なり、これは、再びアプタマーのヌクレアーゼ安定性が予測不可能であることを示すものである。
、実施例14に記載されているように、指定の時間数にわたって37℃で、0.12ユニット/μLのDNase IIとともにインキュベートし、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって消化産物を分離した。SYBR Goldでバンドを可視化し、デンシトメトリーで測定して、残存全長アプタマーのパーセンテージ対インキュベーション時間をプロットした。
e I及びDNase IIの作用に対する感受性ヌクレオチドの位置を、実施例14に記載されている方法によって質量分析により同定した。ヌクレオチド位置15と16の間及びヌクレオチド位置16及の17間にDNase I感受性部位を同定した。ヌクレオチド位置9と10の間にDNase II感受性の部位を同定した。したがって、これらの3つの位置で、ホスホジエステル結合をホスホロチオエート結合で置換した。加えて、ホスホロチオエート結合でヌクレオチド17と18の間のホスホジエステル結合を置換した。最後に、位置2の3,4メチレンジオキシベンジル−dUヌクレオチド(すなわちMBndU;表30及び31においてMで表される)をBndUで置き換え、位置16のBndUをNapdUで置き換えた。このアプタマーを4149−8_454と称した(表30)。4149−8_454の修飾に加えて、アプタマー4149−8_455を作出し、これはまた、位置13として2’−OMe Gを、及びヌクレオチド8と9の間の天然のホスホジエステル結合の代わりにホスホロチオエート結合を含んでいた(表30)。完全なホスホロチオエートウォークは行わなかったが、いくつかの配列を作出し、PDGFBBに対する親和性について試験した(表31)。アプタマーを作出するためのガイドとして働いたこれらの配列のいくつかを表31に示す。
に、前の場合と同様に、DNase IIに対する感受性を検討した(図31)。結果は、アプタマー4149−8_455が、4149−8_379よりも安定的である4149−8_454よりも安定的であったことを示す。
付加を有する4149−8_454を、90%ウサギ硝子体液における安定性について試験した(データ非表示)。しかし、この生体マトリックスにおいて、4149−8_379と比較して、さらなる安定性は4149−8_454で得られなかった。
実験を行って、ヒトPDGFBBタンパク質に対する各アプタマーの親和性を決定した。試験したすべての配列は、標的に対する結合親和性を保持していた。この実験で得られた解離定数(Kd値)を表30に示す。
79;4149−8_454及び4149−8_455)で示したアプタマーを、指定の時間数にわたって37℃でDNase IIとともにインキュベートし、ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動によって消化産物を分離した。ゲル画像からデンシトメトリーで測定して、全長アプタマーのパーセント対インキュベーション時間をプロットした。図31のアプタマーID番号4149−8_379に対するプロットは、図30で示すものと同じプロットである。
国際出願時の特許請求の範囲(請求項1〜66)
〔項1〕
核酸配列
5’−C−G−A−C−A−G−C−A−Z−G−Z−A−Z−G−C−A−C−A−Z−C−Z−3’(配列番号830)を含む核酸分子であって、
ZがC−5修飾ピリミジンであり、前記核酸分子の位置4、9、10、11及び12の少なくとも1個がホスホロチオエート結合または部分を含み、位置1が前記核酸分子の5’末端からの最初のヌクレオシドである、前記核酸分子。
〔項2〕
前記核酸分子の位置4、9、10、11及び12の少なくとも2、3、4または5個がホスホロチオエート結合または部分を含み、位置1が前記核酸分子の5’末端からの最初のヌクレオシドである、請求項1に記載の核酸分子。
〔項3〕
前記核酸分子の位置1、4、6、7、14、15、16、17、18、20及び21の少なくとも1個が2’−O−メチル修飾を含み、位置1が前記核酸分子の5’末端からの最初のヌクレオシドである、請求項1に記載の核酸分子。
〔項4〕
前記核酸分子の位置1、4、6、7、14、15、16、17、18、20及び21の少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10または11個が2’−O−メチル修飾を含み、位置1が前記核酸分子の5’末端からの最初のヌクレオシドである、請求項1に記載の核酸分子。
〔項5〕
前記核酸分子が配列番号545及び800〜821から成る群から選択される、請求項1に記載の核酸分子。
〔項6〕
前記核酸分子が、11個の2’−O−メチルヌクレオシド及び4または5個のホスホロチオエート結合または部分を含む、請求項1に記載の核酸分子。
〔項7〕
核酸配列
5’−C−C−G−Z−Z−C−A−A−G−Z−G−C−Z−Z−G−Z−A−G−G−A−Z−Z−Z−A−A−A−Z−G−G−3’(配列番号831)を含む核酸分子であって、
ZがC−5修飾ピリミジンであり、前記核酸分子の位置24、25及び26の少なくとも1個がホスホロチオエート結合または部分を含み、位置1が前記核酸分子の5’末端からの最初のヌクレオシドである、前記核酸分子。
〔項8〕
位置24、25及び26の少なくとも2または3個がホスホロチオエート結合または部分を含み、位置1が前記核酸分子の5’末端からの最初のヌクレオシドである、請求項7に記載の核酸分子。
〔項9〕
前記核酸分子の位置1、6、9、12、15、17、18、22、28及び29の少なくとも1個が2’−O−メチル修飾を含み、位置1が前記核酸分子の5’末端からの最初のヌクレオシドである、請求項7に記載の核酸分子。
〔項10〕
前記核酸分子の位置1、6、9、12、15、17、18、22、28及び29の少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9または10個が2’−O−メチル修飾を含み、位置1が前記核酸分子の5’末端からの最初のヌクレオシドである、請求項7に記載の核酸分子。
〔項11〕
前記C−5修飾ピリミジンが、独立に、それぞれの出現について、5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(BndU)、5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、5−(N−フェネチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(PedU)、5−(N−チオフェニルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(ThdU)、5−(N−イソブチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(iBudU)、5−(N−イソブチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、5−(N−イソブチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、5−(N−トリプタミノカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(TrpdU)、5−(N−トリプタミノカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、5−(N−トリプタミノカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、5−(N−[1−(3−トリメチルアンモニウム)プロピル]カルボキシアミド)−2’−デオキシウリジンクロリド、5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)、5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、5−(N−2−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(2NapdU)、5−(N−2−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン及び5−(N−[1−(2,3−ジヒドロキシプロピル)]カルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン)から成る群から選択される、請求項1〜10のいずれか1項に記載の核酸分子。
〔項12〕
前記C−5修飾ピリミジンが5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)である、請求項1〜10のいずれか1項に記載の核酸分子。
〔項13〕
前記核酸分子が配列番号706及び763〜799から成る群から選択される、請求項7に記載の核酸分子。
〔項14〕
前記核酸分子が、9または10個の2’−O−メチルヌクレオシド及び1、2または3個のホスホロチオエート結合または部分を含む、請求項7に記載の核酸分子。
〔項15〕
核酸配列
5’−Z−Z’’−A−C−H−G−Z−Z−A−C−V−C−G−C−G−Z’−Z−Z−A−Z−A−G−C−G−3’(配列番号832)を含む核酸分子であって、
Z、Z’及びZ’’が、独立に、それぞれの出現について、5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(BndU)、5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、5−(N−フェネチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(PedU)、5−(N−チオフェニルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(ThdU)、5−(N−イソブチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(iBudU)、5−(N−イソブチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、5−(N−イソブチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、5−(N−トリプタミノカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(TrpdU)、5−(N−トリプタミノカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、5−(N−トリプタミノカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、5−(N−[1−(3−トリメチルアンモニウム)プロピル]カルボキシアミド)−2’−デオキシウリジンクロリド、5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)、5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、5−(N−2−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(2NapdU)、5−(N−2−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、5−(N−3,4−メチレンジオキシベンジルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(MBndU)及び5−(N−[1−(2,3−ジヒドロキシプロピル)]カルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン)から成る群から選択され;Vが3炭素リンカーであり、Hがヘキサエチレングリコールリンカーであり;
前記核酸分子の位置8、9、15、16及び17の少なくとも1個がホスホロチオエート結合または部分を含み、位置1が前記核酸分子の5’末端からの最初のヌクレオシドであり、H及びVが前記核酸分子の位置を数えるための単一の位置とみなされる、前記核酸分子。
〔項16〕
位置8、9、15、16及び17の少なくとも2、3、4または5個がホスホロチオエート結合または部分を含み、位置1が前記核酸分子の5’末端からの最初のヌクレオシドであり、H及びVが前記核酸分子の位置を数えるための単一の位置とみなされる、請求項15に記載の核酸分子。
〔項17〕
前記核酸分子の位置3、7、12、13、18、19、21及び24の少なくとも1個が2’−O−メチル修飾を含み、位置1が前記核酸分子の5’末端からの最初のヌクレオシドであり、H及びVが前記核酸分子の位置を数えるための単一の位置とみなされる、請求項15に記載の核酸分子。
〔項18〕
前記核酸分子の位置3、7、12、13、18、19、21及び24の少なくとも2、3、4、5、6、7または8個が2’−O−メチル修飾を含み、位置1が前記核酸分子の5’末端からの最初のヌクレオシドであり、H及びVが前記核酸分子の位置を数えるための単一の位置とみなされる、請求項15に記載の核酸分子。
〔項19〕
Zが5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(BndU)であり、Z’’が、独立に、それぞれの出現について、5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(BndU)または5−(N−3,4−メチレンジオキシベンジルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(MBndU)であり、Z’が5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)または5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(BndU)である、請求項15に記載の核酸分子。
〔項20〕
核酸分子が配列番号306、317、330〜344、409及び822〜828から成る群から選択される、請求項15に記載の核酸分子。
〔項21〕
前記核酸分子が、10nM未満、5nM未満、2nM未満、1nM未満または0.1nM未満の結合親和性でPDGFタンパク質に結合する、請求項1〜4、6、11、12、14または15〜19に記載の核酸分子。
〔項22〕
前記核酸分子が、10nM未満、5nM未満、2nM未満、1nM未満または0.1nM未満の結合親和性でVEGFタンパク質に結合する、請求項7〜12または14のいずれか1項に記載の核酸分子。
〔項23〕
前記核酸分子が、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8または9個の2’−O−メチルヌクレオシドを含む、請求項1、2、7、8、11、12、15、16、19、21または22に記載の核酸分子。
〔項24〕
前記核酸分子が、DNA、RNAまたはそれらの組み合わせを含む、請求項1〜23のいずれか1項に記載の核酸分子。
〔項25〕
前記核酸分子の3’末端に逆位デオキシヌクレオチドをさらに含む、請求項1〜24のいずれか1項に記載の核酸分子。
〔項26〕
前記デオキシヌクレオチドがデオキシチミジンである、請求項25に記載の核酸分子。
〔項27〕
核酸分子が、ホスホロチオエート結合または部分を有さない同じ核酸分子と比較して、ヌクレアーゼに対する感受性が低い、請求項1〜26のいずれか1項に記載の核酸分子。
〔項28〕
前記ヌクレアーゼがDNase酵素である、請求項27に記載の核酸分子。
〔項29〕
前記DNase酵素がDNase IまたはDNase II酵素である、請求項28に記載の核酸分子。
〔項30〕
核酸分子が、ホスホロチオエート結合または部分を有さない同じ核酸分子と比較して、ニュージーランドホワイトウサギの硝子体液中でより安定的である、請求項1〜29のいずれか1項に記載の核酸分子。
〔項31〕
核酸配列
5’−C1−G−A−C1,2−A−G1−C1−A−Z2−G2−Z2−A2−Z−G1−C1−A1−C1−A1−Z−C1−Z1−3’(配列番号833)を含む核酸分子であって、
C1が、独立に、それぞれの出現について、シチジン、デオキシシチジン及び2’−O−メチルシチジンから成る群から選択され;
C1,2が、独立に、それぞれの出現について、シチジン、ホスホロチオエート結合を含むシチジン、デオキシシチジン、ホスホロチオエート結合を含むデオキシシチジン、2’−O−メチルシチジン及びホスホロチオエート結合を含む2’−O−メチルシチジンから成る群から選択され;
G1が、独立に、それぞれの出現について、グアノシン、デオキシグアノシン及び2’−O−メチルグアノシンから成る群から選択され;
G2が、独立に、それぞれの出現について、グアノシン、ホスホロチオエート結合を含むグアノシン、デオキシグアノシン及びホスホロチオエート結合を含むデオキシグアノシンから成る群から選択され;
Z1が、独立に、それぞれの出現について、ウリジン、デオキシウリジン、2’−O−メチルウリジン、5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)及び2’−O−メチル基を含む5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)から成る群から選択され;
Z2が、独立に、それぞれの出現について、ウリジン、ホスホロチオエート結合を含むウリジン、デオキシウリジン、ホスホロチオエート結合を含むデオキシウリジン、5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)及びホスホロチオエート結合を含む5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)から成る群から選択され;
Zが、独立に、それぞれの出現について、ウリジン、デオキシウリジン及び5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)から成る群から選択され;
A1が、独立に、それぞれの出現について、アデノシン、デオキシアデノシン及び2’−O−メチルアデノシンから成る群から選択され;
A2が、独立に、それぞれの出現について、アデノシン、ホスホロチオエート結合を含むアデノシン、デオキシアデノシン及びホスホロチオエート結合を含むデオキシアデノシンから成る群から選択され;
少なくとも1、2、3、4または5個のホスホロチオエート結合を含む、前記核酸分子。
〔項32〕
C1,2が、ホスホロチオエート結合を含む2’−O−メチルシチジンである、請求項31に記載の核酸分子。
〔項33〕
Z1が、2’−O−メチル基を含む5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)である、請求項72に記載の核酸分子。
〔項34〕
Z2が、ホスホロチオエート結合を含む5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)である、請求項31に記載の核酸分子。
〔項35〕
核酸配列
5’−C1−C−G−Z−Z−C1−A−A−G1−Z−G−C1−Z−Z−G1−Z−A1−G1−G−A−Z−Z1−Z−A2−A2−A2−Z−G1−G1−3’(配列番号834)を含む核酸分子であって、
C1が、独立に、それぞれの出現について、シチジン、デオキシシチジン及び2’−O−メチルシチジンから成る群から選択され;
G1が、独立に、それぞれの出現について、グアノシン、デオキシグアノシン及び2’−O−メチルグアノシンから成る群から選択され;
Zが、独立に、それぞれの出現について、ウリジン、デオキシウリジン及び5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)から成る群から選択され;
Z1が、独立に、それぞれの出現について、ウリジン、デオキシウリジン、2’−O−メチルウリジン、5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)及び2’−O−メチル基を含む5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)から成る群から選択され;
A1が、独立に、それぞれの出現について、アデノシン、デオキシアデノシン及び2’−O−メチルアデノシンから成る群から選択され;
A2が、独立に、それぞれの出現について、アデノシン、ホスホロチオエート結合を含むアデノシン、デオキシアデノシン及びホスホロチオエート結合を含むデオキシアデノシンから成る群から選択され;
少なくとも1、2、3、4または5個のホスホロチオエート結合を含む、前記核酸分子。
〔項36〕
Zが、5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)である、請求項31または35に記載の核酸分子。
〔項37〕
Z1が、2’−O−メチル基を含む5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)である、請求項35に記載の核酸分子。
〔項38〕
核酸配列
5’−Z−Z’’−A1−C−H−G−Z1−Z2−A2−C−V−C1−G1−C−G2−Z’2−Z2−Z1−A1−Z−A1−G−C−G1−3’(配列番号835)を含む核酸分子であって、
C1が、独立に、それぞれの出現について、シチジン、デオキシシチジン及び2’−O−メチルシチジンから成る群から選択され;
G1が、独立に、それぞれの出現について、グアノシン、デオキシグアノシン及び2’−O−メチルグアノシンから成る群から選択され;
G2が、独立に、それぞれの出現について、グアノシン、ホスホロチオエート結合を含むグアノシン、デオキシグアノシン及びホスホロチオエート結合を含むデオキシグアノシンから成る群から選択され;
Zが、独立に、それぞれの出現について、ウリジン、デオキシウリジン、5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)、5−(N−2−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(2NapdU)、5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(BndU)及び5−(N−3,4−メチレンジオキシベンジルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(MBndU)から成る群から選択され;
Z’’が、独立に、それぞれの出現について、ウリジン、デオキシウリジン、5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(BndU)及び5−(N−3,4−メチレンジオキシベンジルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(MBndU)から成る群から選択され;
Z’2が、独立に、それぞれの出現について、ウリジン、ホスホロチオエート結合を含むウリジン、デオキシウリジン、ホスホロチオエート結合を含むデオキシウリジン、5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(BndU)、ホスホロチオエート結合を含む5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(BndU)、5−(N−2−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(2NapdU)、ホスホロチオエート結合を含む5−(N−2−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(2NapdU)、5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)及びホスホロチオエート結合を含む5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)から成る群から選択され;
Z1が、独立に、それぞれの出現について、ウリジン、デオキシウリジン、2’−O−メチルウリジン、5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)、2’−O−メチル基を含む5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)、5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(BndU)、2’−O−メチル基を含む5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(BndU)、メチレンジオキシベンジル−dU及び2’−O−メチル基を含むメチレンジオキシベンジル−dUから成る群から選択され;
Z2が、独立に、それぞれの出現について、ウリジン、ホスホロチオエート結合を含むウリジン、デオキシウリジン、ホスホロチオエート結合を含むデオキシウリジン、5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)及びホスホロチオエート結合を含む5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)、5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(BndU)、ホスホロチオエート結合を含む5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(BndU)、メチレンジオキシベンジル−dU(MBndU)及びホスホロチオエート結合を含むメチレンジオキシベンジル−dU(MBndU)から成る群から選択され;
A1が、独立に、それぞれの出現について、アデノシン、デオキシアデノシン及び2’−O−メチルアデノシンから成る群から選択され;
A2が、独立に、それぞれの出現について、アデノシン、ホスホロチオエート結合を含むアデノシン、デオキシアデノシン及びホスホロチオエート結合を含むデオキシアデノシンから成る群から選択され
Vが3炭素リンカーであり;
Hがヘキサエチレングリコールリンカーであり;
少なくとも1、2、3、4または5個のホスホロチオエート結合を含む、前記核酸配列。
〔項39〕
C1が2’−O−メチルシチジンである、請求項31、35または38に記載の核酸分子。
〔項40〕
G1が2’−O−メチルグアノシンである、請求項31、35または38に記載の核酸分子。
〔項41〕
G2が、ホスホロチオエート結合を含むデオキシグアノシンである、請求項31または38に記載の核酸分子。
〔項42〕
Zが5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(BndU)である、請求項38に記載の核酸分子。
〔項43〕
Z’2が、ホスホロチオエート結合を含む5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)である、請求項38に記載の核酸分子。
〔項44〕
Z1が、2’−O−メチル基を含む5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(BndU)である、請求項38に記載の核酸分子。
〔項45〕
Z2が、ホスホロチオエート結合を含む5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(BndU)である、請求項38に記載の核酸分子。
〔項46〕
A1が2’−O−メチルアデノシンである、請求項31、35または38に記載の核酸分子。
〔項47〕
A2が、ホスホロチオエート結合を含むデオキシアデノシンである、請求項31、35または38に記載の核酸分子。
〔項48〕
請求項1〜47のいずれか1項に記載の核酸分子から成る群から選択される2つの核酸分子を含む組成物。
〔項49〕
溶液、粉末、ゲル及び乳濁液から選択される群から選択される形態である、請求項48に記載の組成物。
〔項50〕
前記2つの核酸分子が共有結合または非共有結合している、請求項48に記載の組成物。
〔項51〕
前記核酸分子がPDGF受容体のPDGF媒介性リン酸化を阻害する、請求項1〜6、15〜21、31〜34、38または41〜45のいずれか1項に記載の核分子。
〔項52〕
請求項1〜51のいずれか1項に記載の少なくとも1つの核酸分子及び医薬的に許容可能な担体を含む医薬組成物。
〔項53〕
前記医薬組成物が硝子体内注射用である、請求項52に記載の医薬組成物。
〔項54〕
黄斑変性症を有する対象に治療有効量の請求項52に記載の医薬組成物を投与することを含む、黄斑変性症の治療方法
〔項55〕
黄斑変性症を発症する危険性がある対象に治療有効量の請求項52に記載の医薬組成物を投与することを含む、黄斑変性症の予防方法。
〔項56〕
眼の病気を有する対象に治療有効量の請求項52に記載の医薬組成物を投与することを含む、眼の病気の治療方法。
〔項57〕
前記眼の病気が、網膜炎、黄斑変性症、脈絡膜炎、網膜症、高血圧性網膜症、糖尿病性網膜症、慢性ドライアイ、エイズ関連視力喪失、弱視、半盲、網膜静脈閉塞症、トラコーマ、円錐角膜、脈絡網膜の炎症、中心性漿液性網膜症、ブドウ膜炎、網膜ジストロフィー、浮腫、緑内障及び白内障から成る群から選択される、請求項56に記載の方法。
〔項58〕
前記黄斑変性症が加齢性黄斑変性症である、請求項54または55に記載の方法。
〔項59〕
前記黄斑変性症がドライ加齢性黄斑変性症またはウェット加齢性黄斑変性症である、請求項58に記載の方法。
〔項60〕
線維症を有する対象に治療有効量の請求項52に記載の医薬組成物を投与することを含む、線維症の治療方法。
〔項61〕
前記線維症が、肺線維症、腎線維症、眼部線維症、角膜線維症、後眼部線維化眼疾患、血管結合組織網膜瘢痕及び嚢胞性線維症から選択される、請求項60に記載の方法。
〔項62〕
心血管疾患を有する対象に治療有効量の請求項52に記載の医薬組成物を投与することを含む、心血管疾患の治療方法。
〔項63〕
前記心血管疾患が、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、心肥大関連状態及び血管障害から選択される、請求項62に記載の方法。
〔項64〕
癌を有する対象に治療有効量の請求項52に記載の医薬組成物を投与することを含む、癌の治療方法。
〔項65〕
前記癌が、膀胱癌、肺癌、乳癌、黒色腫、結腸癌、直腸癌、眼部の癌、リンパ腫、子宮内膜癌、膵臓癌、肝臓癌、腎臓癌、前立腺癌、白血病並びに甲状腺癌から選択される、請求項64に記載の方法。
〔項66〕
アプタマーである、先行する請求項のいずれか1項に記載の核酸分子。
上付きのoは2’−フルオロを示す
上付きの1は2’−O−メチルを示す
上付きの2はホスホロチオエート(デオキシリボース)を示す
C3=3炭素リンカー
Heg=ヘキサエチレングリコールリンカー
Nap=ナフチル−dU
Pe=フェネチル−dU
BT=ベンゾチオフェニル−dU
Th=チオフェニル−dU
Ib=イソブチル−dU
Trp=トリプタミニル−dU
2Nap=2−ナフチル−dU
2NE=2−ナフチルエチル−dU
NE=ナフチルエチル−dU
MBn=メチレンジオキシベンジル−dU
PP=フェンプロピル−dU
Tyr=チロシル−dU
FBn=フルオロベンジル−dU
Bn=ベンジル−dU
3’−ダブラー=シンメトリックダブラーホスホラミダイト(Glen Research、カタログ番号10−1920−02)
表1a.PDGFアプタマー4149−8_260(SL5)のホモ二量体:
上付きのoは2’−フルオロを示す
上付きの1は2’−O−メチルを示す
上付きの2はホスホロチオエート(デオキシリボース)を示す
C3=3炭素リンカー
Heg=ヘキサエチレングリコールリンカー
Nap=ナフチル−dU
Pe=フェネチル−dU
BT=ベンゾチオフェニル−dU
Th=チオフェニル−dU
Ib=イソブチル−dU
Trp=トリプタミニル−dU
2Nap=2−ナフチル−dU
2NE=2−ナフチルエチル−dU
NE=ナフチルエチル−dU
MBn=メチレンジオキシベンジル−dU
PP=フェンプロピル−dU
Tyr=チロシル−dU
FBn=フルオロベンジル−dU
Bn=ベンジル−dU
表3.PDGFアプタマークローン4149−8_1のトランケーション
Claims (33)
- 核酸配列
5’−C−C−G−Z−Z−C−A−A−G−Z−G−C−Z−Z−G−Z−A−G−G−A−Z−Z−Z−A−A−A−Z−G−G−3’(配列番号831)を含む核酸分子であって、
ZがC−5修飾ピリミジンであり、前記核酸分子の位置24、25及び26の少なくとも1個がホスホロチオエート結合またはホスホロチオエート基を含み、位置1が前記核酸分子の5’末端からの最初のヌクレオシドである、前記核酸分子。 - 位置24、25及び26の少なくとも2または3個がホスホロチオエート結合またはホスホロチオエート基を含み、位置1が前記核酸分子の5’末端からの最初のヌクレオシドである、請求項1に記載の核酸分子。
- 前記核酸分子の位置1、6、9、12、15、17、18、22、28及び29の少なくとも1個が2’−O−メチル修飾を含み、位置1が前記核酸分子の5’末端からの最初のヌクレオシドである、請求項1に記載の核酸分子。
- 前記核酸分子の位置1、6、9、12、15、17、18、22、28及び29の少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9または10個が2’−O−メチル修飾を含み、位置1が前記核酸分子の5’末端からの最初のヌクレオシドである、請求項1に記載の核酸分子。
- 前記C−5修飾ピリミジンが、独立に、それぞれの出現について、5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(BndU)、5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、5−(N−フェネチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(PedU)、5−(N−チオフェニルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(ThdU)、5−(N−イソブチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(iBudU)、5−(N−イソブチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、5−(N−イソブチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、5−(N−トリプタミノカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(TrpdU)、5−(N−トリプタミノカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、5−(N−トリプタミノカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、5−(N−[1−(3−トリメチルアンモニウム)プロピル]カルボキシアミド)−2’−デオキシウリジンクロリド、5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)、5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、5−(N−2−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(2NapdU)、5−(N−2−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、及び5−(N−[1−(2,3−ジヒドロキシプロピル)]カルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン)から成る群から選択される、請求項1〜4のいずれか1項に記載の核酸分子。
- 前記C−5修飾ピリミジンが5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の核酸分子。
- 前記核酸分子が配列番号763〜799から成る群から選択される、請求項1に記載の核酸分子。
- 前記核酸分子が、9または10個の2’−O−メチルヌクレオシド及び1、2または3個のホスホロチオエート結合またはホスホロチオエート基を含む、請求項1に記載の核酸分子。
- 前記核酸分子が、10nM未満、5nM未満、2nM未満、1nM未満または0.1nM未満の結合親和性でVEGFタンパク質に結合する、請求項1〜8のいずれか1項に記載の核酸分子。
- 前記核酸分子が、DNA、RNAまたはそれらの組み合わせを含む、請求項1〜9のいずれか1項に記載の核酸分子。
- 前記核酸分子の3’末端に逆位デオキシヌクレオチドをさらに含む、請求項1〜9のいずれか1項に記載の核酸分子。
- 核酸分子が、ホスホロチオエート結合またはホスホロチオエート基を有さない同じ核酸分子と比較して、ヌクレアーゼに対する感受性が低い、請求項1〜11のいずれか1項に記載の核酸分子。
- 前記ヌクレアーゼがDNase酵素である、請求項12に記載の核酸分子。
- 前記DNase酵素がDNase IまたはDNase II酵素である、請求項13に記載の核酸分子。
- 核酸分子が、ホスホロチオエート結合またはホスホロチオエート基を有さない同じ核酸分子と比較して、ニュージーランドホワイトウサギの硝子体液中でより安定的である、請求項1〜11のいずれか1項に記載の核酸分子。
- 請求項1〜15のいずれか1項に記載の核酸分子から成る群から選択される2つの核酸分子を含む組成物。
- 溶液、粉末、ゲル及び乳濁液から選択される群から選択される形態である、請求項16に記載の組成物。
- 前記2つの核酸分子が共有結合または非共有結合している、請求項16に記載の組成物。
- 請求項1〜15のいずれか1項に記載の少なくとも1つの核酸分子及び医薬的に許容可能な担体を含む医薬組成物。
- 前記医薬組成物が硝子体内注射用である、請求項19に記載の医薬組成物。
- 黄斑変性症の治療用である、請求項19に記載の医薬組成物。
- 黄斑変性症の予防用である、請求項19に記載の医薬組成物。
- 眼の病気の治療用である、請求項19に記載の医薬組成物。
- 前記眼の病気が、網膜炎、黄斑変性症、脈絡膜炎、網膜症、高血圧性網膜症、糖尿病性網膜症、慢性ドライアイ、エイズ関連視力喪失、弱視、半盲、網膜静脈閉塞症、トラコーマ、円錐角膜、脈絡網膜の炎症、中心性漿液性網膜症、ブドウ膜炎、網膜ジストロフィー、浮腫、緑内障及び白内障から成る群から選択される、請求項23に記載の医薬組成物。
- 前記黄斑変性症が加齢性黄斑変性症である、請求項24に記載の医薬組成物。
- 前記黄斑変性症がドライ加齢性黄斑変性症またはウェット加齢性黄斑変性症である、請求項24に記載の医薬組成物。
- 線維症の治療用である、請求項19に記載の医薬組成物。
- 前記線維症が、肺線維症、腎線維症、眼部線維症、角膜線維症、後眼部線維化眼疾患、血管結合組織網膜瘢痕及び嚢胞性線維症から選択される、請求項27に記載の医薬組成物。
- 心血管疾患の治療用である、請求項19に記載の医薬組成物。
- 前記心血管疾患が、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、心肥大関連状態及び血管障害から選択される、請求項29に記載の医薬組成物。
- 癌の治療用である、請求項19に記載の医薬組成物。
- 前記癌が、膀胱癌、肺癌、乳癌、黒色腫、結腸癌、直腸癌、眼部の癌、リンパ腫、子宮内膜癌、膵臓癌、肝臓癌、腎臓癌、前立腺癌、白血病並びに甲状腺癌から選択される、請求項31に記載の医薬組成物。
- アプタマーである、請求項1〜15のいずれか1項に記載の核酸分子。
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