ES2533711T3 - Aptámeros con uridinas 5-(N-naftil)-sustituidas - Google Patents

Aptámeros con uridinas 5-(N-naftil)-sustituidas Download PDF

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Abstract

Un aptámero oligonucleótido que comprende al menos un nucleótido de uridina de base modificada, teniendo el nucleótido de uridina de base modificada la siguiente estructura:**Fórmula** y Z >= R más grupo conector (CH2)n, donde n >= 1, 2 o 3, y**Fórmula**

Description

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aminoácidos no naturales etc.), así como otras modificaciones conocidas en la técnica. Los polipéptidos pueden ser de cadenas sencillas o cadenas asociadas.
Como se usa en el presente documento, “nucleótido fotorreactivo” significa cualquier nucleótido modificado que es
5 capaz de fotorreticularse con una diana, tal como una proteína, tras la irradiación con determinadas longitudes de onda de luz. Por ejemplo, los fotoaptámeros producidos mediante el proceso photoSELEX pueden incluir un grupo fotorreactivo seleccionado de los siguientes: 5-bromouracilo (BrU), 5-yodouracilo (IU), 5-bromoviniluracilo, 5yodoviniluracilo, 5-azidouracilo, 4-tiouracilo, 5-bromocitosina, 5-yodocitosina, 5-bromovinilcitosina, 5yodovinilcitosina, 5-azidocitosina, 8-azidoadenina, 8-bromoadenina, 8-yodoadenina, 8-azidoguanina, 8
10 bromoguanina, 8-yodoguanina, 8-azidohipoxantina, 8-bromohipoxantina, 8-yodohipoxantina, 8-azidoxantina, 8bromoxantina, 8-yodoxantina, 5-bromodesoxiuridina, 8-bromo-2'-desoxiadenina, 5-yodo-2'-desoxiuracilo, 5-yodo-2'desoxicitosina, 5-[(4-azidofenacil)tio]citosina, 5-[(4-azidofenacil)tio]uracilo, 7-deaza-7-yodoadenina, 7-deaza-7yodoguanina, 7-deaza-7-bromoadenina y 7-deaza-7-bromoguanina. Una “pirimidina fotorreactiva” significa cualquier pirimidina modificada que es capaz de fotorreticularse con una diana tras irradiación de determinadas longitudes de
15 onda. Pirimidinas fotorreactivas de ejemplo incluyen 5-bromo-uracilo (BrdU), 5-bromo-citosina (BrdC), 5-yodo-uracilo (IdU), y 5-yodo-citosina (IdC). En varias realizaciones, el grupo funcional fotorreactivo absorberá en longitudes de onda de luz que no son absorbidas por la diana o las porciones no modificadas del oligonucleótido.
“SELEX” se refiere a un proceso que combina la selección de ácidos nucleicos que interaccionan con una diana de
20 un modo deseable (por ejemplo, unión a una proteína) con la amplificación de los ácidos nucleicos seleccionados. El ciclado repetido opcional de las etapas de selección/amplificación permite la selección de uno o un número pequeño de ácidos nucleicos que interaccionan más fuertemente con la diana de un conjunto que contiene un número muy grande de ácidos nucleicos. El ciclado del procedimiento de selección/amplificación continúa hasta conseguir un objetivo determinado. La metodología SELEX se describe en las patentes SELEX. En algunas realizaciones del
25 proceso SELEX se generan aptámeros que se unen de forma no covalente a sus dianas. En otras realizaciones del proceso SELEX se generan aptámeros que se unen de forma covalente a sus dianas.
Como se usa en el presente documento, el término “amplificación” o “amplificar” significa un proceso o combinación de etapas del proceso que aumenta la cantidad o el número de copias de una molécula o clase de moléculas.
30 “Diana SELEX” o “molécula diana” o “diana” hace referencia en el presente documento a cualquier compuesto sobre el cual un ácido nucleico puede actuar de un modo deseable. Una molécula diana SELEX puede ser una proteína, péptido, ácido nucleico, hidrato de carbono, lípido, polisacárido, glicoproteína, hormona, receptor, antígeno, anticuerpo, virus, patógeno, sustancia tóxica, sustrato, metabolito, análogo del estado de transición, cofactor,
35 inhibidor, fármaco, pigmento, nutriente, factor de crecimiento, célula, tejido, cualquier porción o fragmento de cualquiera de los anteriores etc., sin limitaciones. En una realización, una diana SELEX no incluye moléculas que se sabe que se unen a ácidos nucleicos, tales como, por ejemplo, proteínas conocidas que se unen a ácidos nucleicos
(p. ej., factores de transcripción). Casi cualquier efector químico o biológico puede ser una diana SELEX adecuada. Moléculas de cualquier tamaño pueden servir como dianas SELEX. Una diana también se puede modificar de ciertos 40 modos para potenciar la probabilidad o la fuerza de una interacción entre la diana y el ácido nucleico. Una diana también puede incluir cualquier variación minoritaria de un compuesto o molécula concreto, tal como, en el caso de una proteína, por ejemplo variaciones minoritarias en la secuencia de aminoácidos, formación de puentes disulfuro, glicosilación, lapidación, acetilación, fosforilación, o cualquier otra manipulación o modificación, tal como conjugación con un componente marcador, que o altera sustancialmente la identidad de la molécula. Una “molécula diana” o
45 “diana” es un conjunto de copias de uno tipo o especie de molécula o estructura multimolecular que es capaz de unirse a un aptámero. “Moléculas diana” o “dianas” hacen referencia a más de uno de estos conjuntos de moléculas. Realizaciones del proceso SELEX en el que la diana es un péptido se describen en la patente de EE.UU. Nº 6.376.190, titulada “Procesos SELEX modificados sin proteína purificada”. La Figura 7 enumera más de 500 dianas para las que se han producido aptámeros que incluyen diversos aptámeros de velocidad de disociación lenta.
50 Como se usa en el presente documento, “molécula competidora” y “competidor” se usan de forma intercambiable para hacer referencia a cualquier molécula que puede formar un complejo inespecífico con una molécula no diana. En este contexto, las moléculas no diana incluyen aptámeros libres, en los que, por ejemplo, se puede usar un competidor para inhibir la unión del aptámero (reunión), no específica, a otra molécula no diana. Una “molécula
55 competidora” o “competidor” es un conjunto de copias de un tipo o especie de molécula. “Moléculas competidoras” o “competidores” hacen referencia a más de uno de estos conjuntos de moléculas. Las moléculas competidoras incluyen, entre otras, oligonucleótidos, polianiones (por ejemplo, heparina, ADN de esperma de arenque, ADN de esperma de salmón, ARNt, sulfato de dextrano, polidextrano, polímeros de fosfodiéster abásicos, dNTP y pirofosfato). En varias realizaciones se puede usar una combinación de uno o más competidores.
60 Como se usa en el presente documento, “complejo no específico” hace referencia a una asociación no covalente entre dos o más moléculas distintas a un aptámero y su molécula diana. Un complejo no específico representa una interacción entre clases de moléculas. Complejos no específicos incluyen complejos formados entre un aptámero y una molécula no diana, un competidor y una molécula no diana, un competidor y una molécula diana, y una
65 molécula diana y una molécula no diana.
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Por tanto, se proporciona un proceso SELEX modificado para la identificación o producción de aptámeros que tengan velocidades de disociación lentas (prolongadas) en las que la molécula diana y la mezcla candidata entran en contacto y se incuban juntas durante un periodo de tiempo suficiente para que se produzca la unión en equilibrio entre la molécula diana y los ácidos nucleicos contenidos en la mezcla candidata. Tras la unión en equilibrio se 5 añade a la mezcla un exceso de molécula competidora, por ejemplo un polianión competidor, y la mezcla se incuba junto con el exceso de molécula competidora durante un periodo de tiempo predeterminado. Una proporción significativa de aptámeros que tienen velocidades de disociación que son inferiores a este periodo de incubación predeterminado se disociarán de la diana durante el periodo de incubación predeterminado. La reasociación de estos aptámeros de velocidad de disociación “rápida” con la diana se minimiza por el exceso de la molécula competidora que puede unirse de forma no específica a la diana y ocupar los sitios de unión diana. Una proporción significativa de aptámeros que tienen velocidades de disociación más largas permanecerán en complejo con la diana durante el periodo de incubación predeterminado. Al final del periodo de incubación, el reparto de los complejos de ácido nucleico-diana del resto de la mezcla permite la separación de una población de aptámeros de velocidad de disociación lenta de los que tienen velocidades de disociación rápidas. Se puede usar una etapa de disociación para
15 disociar los aptámeros de velocidad de disociación lenta de su diana y permite el aislamiento, identificación, secuenciación, síntesis y amplificación de aptámeros de velocidad de disociación lenta (bien de aptámeros individuales o de un grupo de aptámeros de velocidad de disociación lenta) que tienen una afinidad y especificidad altas por la molécula diana. Como con el SELEX convencional, las secuencias de los aptámeros identificadas a partir de una ronda del proceso SELEX modificado se pueden usar en la síntesis de una nueva mezcla candidata de forma que las etapas de contacto, unión en equilibrio, adición de la molécula competidora, incubación con la molécula competidora y reparto de aptámeros de velocidad de disociación lenta se pueden iterar/repetir cuantas veces se desee.
La combinación de permitir la unión en equilibrio de la mezcla candidata con la diana antes de la adición del
25 competidor, seguido de la adición de un exceso de competidor e incubación con el competidor durante un periodo predeterminado de tiempo permite la selección de una población de aptámeros que tienen velocidades de disociación que son mucho mayores que las alcanzadas previamente.
Con el fin de alcanzar la unión en equilibrio, la mezcla candidata se puede incubar con la diana durante al menos aproximadamente 5 minutos o al menos aproximadamente 15 minutos, aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 45 minutos, aproximadamente1 hora, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 5 horas o aproximadamente 6 horas.
El periodo de incubación predeterminado de la molécula competidora con la mezcla de la mezcla candidata y la
35 molécula diana se puede seleccionar según se desee, teniendo en cuenta los factores tales como la naturaleza de la diana y las velocidades de disociación conocidas (si existen) de aptámeros conocidos por la diana. Los periodos de incubación predeterminados se pueden elegir de: al menos aproximadamente 5 minutos, al menos aproximadamente 10 minutos, al menos aproximadamente 20 minutos, al menos aproximadamente 30 minutos, al menos aproximadamente minutos, al menos aproximadamente 1 hora, al menos aproximadamente 2 horas, al menos aproximadamente 3 horas, al menos aproximadamente 4 horas, al menos aproximadamente 5 horas, al menos aproximadamente 6 horas.
En otras disposiciones se usa una dilución como un proceso de potenciación de la velocidad de disociación e incubación de la mezcla candidata diluida, el complejo molécula diana/aptámero se puede someter a un periodo de
45 tiempo predeterminado, que se puede seleccionar de: al menos aproximadamente 5 minutos, al menos aproximadamente 10 minutos, al menos aproximadamente 20 minutos, al menos aproximadamente 30 minutos, al menos aproximadamente minutos, al menos aproximadamente 1 hora, al menos aproximadamente 2 horas, al menos aproximadamente 3 horas, al menos aproximadamente 4 horas, al menos aproximadamente 5 horas, al menos aproximadamente 6 horas.
Las realizaciones de la presente divulgación se refieren a la identificación, producción, síntesis y uso de aptámeros de velocidad de disociación lenta. Estos son aptámeros que tienen una velocidad de disociación (t1/2) de un complejo no covalente aptámero-diana que es superior a la de los aptámeros obtenidos normalmente mediante SELEX convencional. Para una mezcla que contiene complejos no covalentes de aptámero y diana, la t1/2 representa el
55 tiempo requerido por la mitad de los aptámeros para disociarse de los complejos aptámero-diana. El t1/2 de los aptámeros de velocidad de disociación lenta de acuerdo con la presente divulgación se elige de uno de: más de o igual a aproximadamente 30 minutos; entre aproximadamente 30 minutos y aproximadamente 240 minutos; entre aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 60 minutos; entre aproximadamente 60 minutos a aproximadamente 90 minutos, entre aproximadamente 90 minutos a aproximadamente 120 minutos; entre aproximadamente 120 minutos a aproximadamente 150 minutos; entre aproximadamente 150 minutos a aproximadamente 180 minutos; entre aproximadamente 180 minutos a aproximadamente 210 minutos; entre aproximadamente 210 minutos a aproximadamente 240 minutos.
Un rasgo que caracteriza un aptámero identificado por un procedimiento SELEX es su elevada afinidad por su diana.
65 Un aptámero tendrá una constante de disociación (kd) por su diana que se elige de uno de: menos de aproximadamente 1µM, menos de aproximadamente 100nM, menos de aproximadamente 10nM, menos de
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fotorreactivo.
Grupos funcionales fotorreactivos de ejemplo que se pueden incorporar mediante un fotoaptámero incluyen 5bromouracilo, 5-yodouracilo, 5-bromoviniluracilo, 5-yodoviniluracilo, 5-azidouracilo, 4-tiouracilo, 5-tiouracilo, 4
5 tiocitosina, 5-bromocitosina, 5-yodocitosina, 5-bromovinilcitosina, 5-yodovinilcitosina, 5-azidocitosina, 8azidoadenina, 8-bromoadenina, 8-yodoadenina, 8-azidodoguanina, 8-bromoguanina, 8-yodoguanina, 8azidohipoxantina, 8-bromohipoxantina, 8-yodohipoxantina, 8-azidoxantina, 8-bromoxantina, 8-yodoxantina, 5-[(4azidofenacil)tio]citosina, 5-[(4-azidofenacil)tio]uracilo, 7-deaza-7-yodoadenina, 7-deaza-7-yodoguanina, 7-deaza-7bromoadenina y 7-deaza-7-bromoguanina.
Además de estos grupos funcionales fotorreactivos basados en nucleósidos de ejemplo, también se pueden usar otros grupos funcionales fotorreactivos que se pueden añadir a un extremo terminal de un aptámero usando una molécula enlazadora adecuada. Dichos grupos funcionales fotorreactivos incluyen benzofenona, antraquinona, 4azido-2-nitroanilina, psoraleno, derivados de cualquiera de estos, y similares.
15 Un grupo funcional fotorreactivo incorporado mediante un fotoaptámero puede activarse mediante cualquier método adecuado. En una realización, un fotoaptámero que contiene un grupo funcional fotorreactivo se puede reticular con su diana mediante exposición del fotoaptámero y su molécula diana unida a una fuente de radiación electromagnética. Tipos adecuados de radiación electromagnética incluyen luz ultravioleta, luz visible, rayos X y rayos gamma. Fuentes de radiación adecuadas incluyen fuentes que usan luz monocromática o luz policromática filtrada.
Como se usa en el presente documento, la expresión “el proceso SELEX de afinidad" hace referencia a realizaciones del proceso SELEX en as que se generan aptámeros no fotorreticulantes por dianas. En algunas 25 realizaciones del proceso SELEX de afinidad, la diana se inmoviliza en un soporte sólido antes o después de que la diana entre en contacto con la mezcla candidata de ácidos nucleicos. La asociación de la diana con el soporte sólido permite que los ácidos nucleicos en la mezcla candidata que están unidos y en el caso en el que se use un proceso de enriquecimiento de velocidad de disociación lenta, permanezcan unidos a la diana para su separación del resto de la mezcla candidata. La expresión "proceso SELEX de afinidad en esferas" hace referencia a realizaciones concretas del proceso SELEX de afinidad en las que la diana se inmoviliza sobre una esfera, por ejemplo, antes del contacto con la mezcla candidata de ácidos nucleicos. En algunas realizaciones, las esferas son esferas paramagnéticas. La expresión “proceso SELEX de afinidad con filtro” hace referencia a realizaciones en las que los complejos de ácido nucleico –diana se separan de la mezcla candidata en virtud de su asociación con un filtro, tal como un filtro de nitrocelulosa. Esto incluye realizaciones en las que la diana y ácidos nucleicos se ponen en
35 contacto inicialmente en solución y en contacto con el filtro, y también incluye realizaciones en las que los ácidos nucleicos entran en contacto con la diana que está previamente inmovilizada sobre el filtro. La expresión “proceso SELEX de afinidad en placa” hace referencia a realizaciones en las que la diana está inmovilizada sobre la superficie de una placa, tal como, por ejemplo, una placa de microtitulación en múltiples pocillos. En algunas realizaciones, la placa está compuesta por poliestireno. En algunas realizaciones, la diana está unida a la placa en el proceso SELEX de afinidad en placa a través de interacciones hidrofóbicas.
La presente divulgación describe métodos SELEX mejorados para generar aptámeros que son capaces de unirse a moléculas diana. Más específicamente, la presente divulgación describe métodos para identificar aptámeros y/o fotoaptámeros que tienen velocidades de disociación más lentas de sus respectivas moléculas diana que los
45 aptámeros obtenidos con los métodos SELEX anteriores. La divulgación describe además aptámeros y/o fotoaptámeros obtenidos usando los métodos descritos en el presente documento y métodos de usar los mismos.
Se proporciona un método para identificar un aptámero que tiene una velocidad de disociación lenta de su molécula diana, comprendiendo el método (a) preparar una mezcla candidata de secuencias de ácido nucleico; (b) poner en contacto la mezcla candidata con una molécula diana en la que los ácidos nucleicos con las afinidades relativas más altas por la molécula diana se unen preferentemente a la molécula diana, formando complejos ácido nucleicomolécula diana; (c) aplicar un proceso de enriquecimiento de velocidad de disociación lenta para permitir la disociación de los complejos ácido nucleico-molécula diana con velocidades de disociación relativamente rápidas;
(d) repartir los complejos de ácido nucleico-molécula diana restantes de los ácidos nucleicos libres y las moléculas
55 no diana en la mezcla candidata; y (e) identificar un aptámero de la molécula diana. El proceso puede además incluir la etapa repetida de amplificar los ácidos nucleicos que se unen a la molécula diana para dar una mezcla de ácidos nucleicos enriquecida en secuencias que pueden unirse a la molécula diana y producir todavía complejos de ácido nucleico-molécula diana que tienen velocidades de disociación lentas. Como se ha definido anteriormente, el proceso de enriquecimiento de velocidad de disociación lenta se puede seleccionar de dilución de la mezcla candidata que contiene los complejos de ácido nucleico-molécula diana, adición de al menos un competidor a la mezcla candidata que contiene los complejos de ácido nucleico-molécula diana y dilución de la mezcla candidata que contiene los complejos de ácido nucleico-molécula diana y adición de al menos un competidor a la mezcla candidata que contiene los complejos de ácido nucleico-molécula diana.
65 Se proporciona un método para identificar un aptámero que tiene una velocidad de disociación lenta de su molécula diana, comprendiendo el método: (a) preparar una mezcla candidata de ácidos nucleicos; (b) poner en contacto la
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en los ácidos nucleicos son compatibles con la amplificación enzimática. Las modificaciones que no son compatibles con la amplificación se pueden realizar tras cada ronda amplificación, en caso necesario.
La mezcla candidata de ácidos nucleicos se puede modificar de varias formas para aumentar la probabilidad de que
5 los ácidos nucleicos tengan propiedades de facilitación u otras propiedades deseables, en particular aquellas que potencian la interacción entre el ácido nucleico y la diana. Las modificaciones contempladas incluyen modificaciones que introducen otros grupos químicos que tienen la carga, la polarizabilidad, la unión de hidrógeno o la interacción electrostática correctas para potenciar las interacciones ligando-diana deseadas. Las modificaciones que pueden mejorar las propiedades de unión, incluyendo las tasas de afinidad y/o de disociación, del ácido nucleico, por
10 ejemplo, incluyen restos hidrófilos, restos hidrófobos, estructuras rígidas, grupos funcionales encontrados en las proteínas, tales como imidazoles, alcoholes primarios, carboxilatos, grupos guanidinio, grupos amino, tioles y similares. Las modificaciones también pueden usarse para aumentar la supervivencia de los complejos aptámerodiana en condiciones de selección rigurosas que se pueden aplicar para producir aptámeros de velocidad de disociación lenta a una amplia gama de dianas. En una realización, Bz-dU (bencil-dU) se utiliza en la generación de
15 las mezclas candidatas usadas para producir aptámeros de velocidad de disociación lenta, aunque otros nucleótidos modificados son muy adecuados para la producción de tales aptámeros. Otros nucleótidos modificados se muestran en la FIG. 14.
Mezclas candidatas de nucleótidos modificados para el propósito de esta solicitud es cualquier mezcla candidata de
20 ARN o ADN que incluya nucleótidos tanto de origen natural como de origen distinto al natural. Modificaciones adecuadas incluyen modificaciones en cada residuo del ácido nucleico, en un único residuo del ácido nucleico, en residuos aleatorios, en todas las pirimidinas o purinas, todos en todas las apariciones de una base específica (es decir, G, C, A, T o U) en el ácido nucleico, o cualquier otro esquema de modificación que puede ser adecuado para una aplicación particular. Se reconoce que la modificación no es un requisito previo para facilitar la actividad o la
25 capacidad de unión de los aptámeros. Los aptámeros pueden incluir residuos dUTP y dCTP modificados.
Las mezclas candidatas para aptámeros de velocidad de disociación lenta pueden comprender un conjunto de pirimidinas que tienen una modificación diferente en la posición de la base C-5. La modificación en C-5 puede introducirse a través de un enlace amida, directamente, o indirectamente a través de otro tipo de enlace. Estas
30 mezclas candidatas se utilizan en un proceso SELEX para identificar aptámeros de velocidad de disociación lenta. Este proceso también puede incluir el uso del proceso de enriquecimiento de velocidad de disociación lenta. Las mezclas candidatas se pueden producir enzimáticamente o sintéticamente.
Como se ha descrito anteriormente, los nucleótidos pueden modificarse de muchos modos, incluyendo
35 modificaciones en las posiciones de la ribosa y/o el fosfato y/o la base. Determinadas modificaciones se describen en la patente de EE.UU. Nº 5.660.985 titulada "High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides", la patente de EE.UU. Nº 5.428.149 titulada Method for Palladium Catalyzed Carbon-Carbon Coupling and Products," la patente de EE.UU. Nº 5.580.972 titulada "Purine Nucleoside Modifications by Palladium Catalyzed Methods. En una realización, las modificaciones son aquellas en las que otro grupo químico se une en la posición 5 de una
40 pirimidina, la posición 8 de una purina o la posición 2 'de un azúcar. No existen limitaciones en el tipo de otro grupo químico que se puede incorporar en los nucleótidos individuales. En algunas realizaciones, el nucleótido modificado resultante es amplificable o se puede modificar con posterioridad a las etapas de amplificación (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. Nº 300.074 titulada "Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: Chemi-SELEX".
45 En otras disposiciones más, ciertos nucleótidos se modifican de tal manera que un método para producir aptámeros que se unan y formen una reticulación covalente con su molécula diana tras la fotoactivación del complejo de afinidad. Este método abarca aptámeros que se unen, fotorreticulan y/o fotoactivan moléculas diana. En diversas disposiciones, los aptámeros contienen grupos fotorreactivos que son capaces de fotorreticularse con la molécula
50 diana tras la irradiación con luz. En otras disposiciones, los aptámeros son capaces de formar enlaces con la diana en ausencia de irradiación.
Un grupo fotorreactivo puede ser cualquier estructura química que contenga un fotocromóforo y que sea capaz de fotorreticularse con una molécula diana. Aunque en el presente documento se denominan grupos fotorreactivos, en
55 algunos casos, como se describe a continuación, la irradiación no es necesaria para que ocurra la unión covalente entre el aptámero y la diana. En algunas realizaciones, el grupo fotorreactivo absorberá la luz de una longitud de onda que no es absorbida por la diana o las porciones no modificadas del oligonucleótido. Los grupos fotorreactivos incluyen 5-halo-uridinas, 5-halo-citosinas, 7-halo-adenosinas, 2-nitro-5-azidobenzoilos, diazirinas, azidas de arilo, azidas de arilo fluoradas, benzofenonas, amino-benzofenonas, psoralenos, antraquinonas, etc.
60 Los grupos fotorreactivos generalmente forman enlaces con la diana tras la irradiación del par ácido nucleico -diana asociado. En algunos casos, la irradiación no es necesaria para que se produzca la formación del enlace. El fotorreticulación que se produce normalmente será la formación de un enlace covalente entre el aptámero asociado y la diana. Sin embargo, también puede producirse una interacción iónica estrecha entre el aptámero y la diana tras
65 la irradiación.
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